特許 7348176 霊長類網膜色素上皮細胞特異的プロモーター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-11

(45)【発行日】2023-09-20

(54)【発明の名称】霊長類網膜色素上皮細胞特異的プロモーター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/864 20060101AFI20230912BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20230912BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230912BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20230912BHJP

   C12N 5/071 20100101ALI20230912BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20230912BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230912BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20230912BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20230912BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20230912BHJP

【ＦＩ】

C12N15/864 100Z

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/12

C12N5/071

C12N7/01

A61K31/7088

A61P27/02

A61K35/76

A61K48/00

【請求項の数】 22

(21)【出願番号】P 2020526394

(86)(22)【出願日】2018-11-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-02-04

(86)【国際出願番号】 IB2018059015

(87)【国際公開番号】W WO2019097454

(87)【国際公開日】2019-05-23

【審査請求日】2021-11-09

(31)【優先権主張番号】17201828.5

(32)【優先日】2017-11-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】518089687

【氏名又は名称】フリードリッヒ ミーシェー インスティトゥート フォー バイオメディカル リサーチ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100149010

【弁理士】

【氏名又は名称】星川 亮

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】ユエットナー，ジョゼフィーヌ

(72)【発明者】

【氏名】クロル，ヤツェク

(72)【発明者】

【氏名】ロスカ，ボトンド

【審査官】白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１５／１１８５０７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／０５１５９９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】The DNA-binding specificity of SOX9 and other SOX proteins，Nucleic Acids Research，1999年，Vol.27, No.5，p.1359-1364

【文献】Transcription Factor SOX9 Plays a Key Role in the Regulation of Visual Cycle Gene Expression in the Retinal Pigment Epithelium，The Journal Biological Chemistry，2014年，Vol.289, No.18，p.12908-12921

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ１５／００－１５／９０

Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

Ｐｕｂｍｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

霊長類の網膜色素上皮の細胞中で外因性遺伝子を発現させるインビトロ又はエクスビボの方法であって、前記方法が、発現カセットを、前記霊長類の前記網膜色素上皮の細胞に送達するステップを含み、前記発現カセットは、配列番号１の核酸配列を含み、又はそれからなる単離核酸分子、及び前記外因性遺伝子をコードする核酸配列を含み、前記単離核酸分子は、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に結合しており、前記単離核酸分子が、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現をドライブするのに効果的である、方法。

【請求項2】

前記単離核酸分子が、最小プロモーターをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記最小プロモーターが、配列番号２の核酸配列を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記発現カセットが、ベクターの一部である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４に記載の方法。

【請求項7】

霊長類の網膜色素上皮の細胞中で特異的に外因性遺伝子を発現させるための発現カセットのインビトロ又はエクスビボでの使用であって、前記発現カセットは、配列番号１の核酸配列を含み、又はそれからなる単離核酸分子、及び前記外因性遺伝子をコードする核酸配列を含み、前記単離核酸分子は、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に結合しており、前記単離核酸分子が、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現をドライブするのに効果的である、使用。

【請求項8】

前記単離核酸分子が、最小プロモーターをさらに含む、請求項７に記載の使用。

【請求項9】

前記最小プロモーターが、配列番号２の核酸配列を含む、請求項８に記載の使用。

【請求項10】

前記発現カセットが、ベクターの一部である、請求項７～９のいずれか１項に記載の使用。

【請求項11】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１０に記載の使用。

【請求項12】

前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１０に記載の使用。

【請求項13】

網膜色素上皮と関連する疾患の治療における使用のための、発現カセットを含む医薬組成物であって、前記発現カセットは、配列番号１の核酸配列を含み、又はそれからなる単離核酸分子、及び外因性遺伝子をコードする核酸配列を含み、前記単離核酸分子は、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列に作動可能に結合しており、前記単離核酸分子が、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現をドライブするのに効果的である、医薬組成物。

【請求項14】

網膜色素上皮と関連する前記疾患は、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症及び網膜色素上皮肥大症からなる群から選択される、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記単離核酸分子が、最小プロモーター配列をさらに含む、請求項１３又は１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記最小プロモーター配列が、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記発現カセットが、ベクターの一部である、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記ベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記外因性遺伝子が、チャネルロドプシンまたはハロロドプシンをコードする、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記外因性遺伝子が、チャネルロドプシンまたはハロロドプシンをコードする、請求項７～１２のいずれか１項に記載の使用。

【請求項22】

前記外因性遺伝子が、チャネルロドプシンまたはハロロドプシンをコードする、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、特に網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞中で特異的に遺伝子の発現をもたらす核酸配列に関する。

【背景技術】

【0002】

発現目的のため、組換え遺伝子は、通常、標的細胞、細胞集団又は組織中に、異種遺伝子の転写を可能とする活性発現カセットの環境下のｃＤＮＡ構築物として形質移入される。ＤＮＡ構築物は、シス制御エレメント、例として、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター及びプロモーター（本明細書においてまとめて「プロモーター」と称される）における多くのトランス作用性転写因子（ＴＦ）の活性を含むプロセスにおける細胞転写機構により認識される。

【0003】

遺伝子プロモーターは、それらの調節のレベルの全てに関与し、ＤＮＡ配列、転写因子結合及びエピジェネティックな特色の影響を組み込むことにより遺伝子転写における決定因子として機能する。これらは、例えば、プラスミドベクターによりコードされる導入遺伝子発現の強度及び前記導入遺伝子が発現される１つ又は複数の細胞タイプを決定する。

【0004】

哺乳動物細胞中の異種遺伝子発現をドライブするために使用される最も一般的なプロモーターは、ヒト及びマウスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーターである。これらは強力な発現を付与し、いくつかの細胞タイプにおいてロバストであることが証明されている。他のウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０最初期プロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターも発現カセット中で高頻度で使用される。

【0005】

ウイルスプロモーターの代わりに、細胞プロモーターを使用することもできる。公知のプロモーターの中には、大量に転写される細胞転写産物、例えば、ベータ－アクチン、伸長因子１－アルファ（ＥＦ－ｌアルファ）、又はユビキチンをコードするハウスキーピング遺伝子からのものがある。ウイルスプロモーターと比較して、真核生物遺伝子発現は複雑であり、多くの異なる因子の正確な協調を要求する。

【0006】

導入遺伝子発現のための内因性調節エレメントの使用に関する態様の１つは、安定なｍＲＮＡの生成であり、発現が、それに応じてトランス作用性転写因子が提供される宿主細胞の天然環境中で生じ得ることである。真核生物遺伝子の発現は、シス及びトランス作用性調節エレメントの複雑な機構により制御されるため、ほとんどの細胞プロモーターは、詳細な機能の特徴付けが欠けている。真核生物プロモーターの一部は、通常、その転写される配列のすぐ上流に位置し、転写開始点として機能する。コアプロモーターは、転写機構により認識されるのに十分である転写開始部位（ＴＳＳ）を直接囲む。近位プロモーターは、コアプロモーターの上流の領域を含み、ＴＳＳ及び転写調節に要求される他の配列特色を含有する。転写因子は、プロモーター及びエンハンサー配列中の調節モチーフに結合し、それにより、ヌクレオソーム構造及び最終的に転写の開始を可能とするその位置を変更するクロマチン及びヒストン修飾酵素を活性化させることにより配列特異的に作用する。機能プロモーターの同定は、主に、関連する上流又は下流のエンハンサーエレメントの存在に依存的である。

【0007】

導入遺伝子発現のための内因性調節エレメントの使用に関する別の重大な態様は、一部のプロモーターが細胞特異的様式で作用し得、規定のタイプの細胞中で、又はプロモーターに依存して特定のサブセットの細胞中で導入遺伝子の発現をもたらすことである。

【0008】

したがって、本発明の１つの課題は、網膜の哺乳動物細胞中で高い発現レベルで、細胞タイプ特異的様式で組換え遺伝子を発現させるのに好適な新たな配列を得ることである。

【0009】

このような配列は、神経変性障害、視力回復、創薬、腫瘍療法及び障害の診断の研究のための系を開発するための網膜細胞特異的プロモーターについての当分野における必要性に対処する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、目下、国際公開第２０１５／１１８５０７号パンフレットに記載のとおりネズミモデルにおいて網膜アマクリン細胞中で特異的に遺伝子発現をドライブすることが公知の人工プロモーターが、霊長類において予想外及び非定型的に全く異なる特異性を有することを偶然に見出した。霊長類において、このプロモーターは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞中の遺伝子発現を特異的にドライブする。この特異性は、例えば、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症又は網膜色素上皮肥大症患者の罹患網膜における網膜色素上皮細胞中の遺伝子発現に対処し、それを標的化するために極端に有用である。

【0011】

このプロモーターの核酸配列は、

【化1】

である。

【0012】

したがって、本発明は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中で特異的に外因性遺伝子を発現させる方法であって、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子を、前記霊長類の網膜色素上皮の細胞に送達するステップを含み、前記単離核酸分子は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす方法を提供する。単離核酸分子は、前記単離核酸分子に作動可能に結合している最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターをさらに含み得る。単離核酸分子は、発現カセットの一部であり得、それはさらにベクター、例えば、ウイルスベクターの一部であり得る。

【0013】

本発明はまた、霊長類の網膜色素上皮の細胞中で特異的に外因性遺伝子を発現させるための、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子の使用であって、前記単離核酸分子は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす使用を提供する。この使用において、単離核酸分子は、最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターをさらに含み得る。単離核酸分子は、発現カセットの一部であり得、それはさらにベクター、例えば、ウイルスベクターの一部であり得る。

【0014】

本発明は、網膜色素上皮と関連する疾患の治療における使用のための、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子であって、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす単離核酸分子をさらに提供する。網膜色素上皮と関連する疾患は、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症及び網膜色素上皮肥大症からなる群から選択することができる。

【0015】

配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記核酸配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子であって、遺伝子をコードする前記核酸配列に作動可能に結合している前記遺伝子の霊長類の網膜色素上皮の細胞中の発現を特異的にもたらす単離核酸分子は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり得、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも８５％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９０％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９５％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１と前記核酸配列と少なくとも９６％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９７％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９８％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９９％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と１００％の全体同一性を有する。

【0016】

本発明の単離核酸分子は、好ましくは、前記単離核酸分子に作動可能に結合している最小プロモーター、例えば、ＳＶ４０最小プロモーター、例えば、ＳＶ４０最小プロモーター

【化2】

を含み得る。

【0017】

本発明のプロモーターに作動可能に結合させることができる典型的な遺伝子は、光受容体をコードする遺伝子である。例えば、これは、光感受性分子、例えば、チャネルロドプシン又はハロロドプシンであり得る。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】配列番号１を含むプロモーターからの霊長類網膜中の網膜色素上皮細胞に対する標的化発現。成体マカク（マカカ・ムラッタ）（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）眼球中のＡＡＶ－ｓｙｎＰ１２－ＣｈＲ２－ＥＧＦＰの網膜下注射の３ヶ月後の配列番号１を含むプロモーターからのＥＧＦＰ発現のレーザー走査型共焦点顕微鏡画像。網膜色素上皮細胞中の誘導発現を観察することができる。緑色＝配列番号３によりドライブされたＥＧＦＰ。白色＝ヘキスト。

【発明を実施するための形態】

【0019】

本発明者らは、目下、国際公開第２０１５／１１８５０７号パンフレットに記載のとおりネズミモデルにおいて網膜アマクリン細胞中で特異的に遺伝子発現をドライブすることが公知の人工プロモーターが、霊長類において予想外及び非定型的に全く異なる特異性を有することを偶然に見出した。霊長類において、このプロモーターは、網膜色素上皮の細胞中の遺伝子発現を特異的にドライブする。この特異性は、例えば、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症又は網膜色素上皮肥大症患者の罹患網膜における網膜色素上皮細胞中の遺伝子発現に対処し、それを標的化するために極端に有用である。

【0020】

このプロモーターの核酸配列は、

【化3】

である。

【0021】

したがって、本発明は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中で特異的に外因性遺伝子を発現させる方法であって、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子を、前記霊長類の網膜色素上皮の細胞に送達するステップを含み、前記単離核酸分子は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす方法を提供する。単離核酸分子は、最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターをさらに含み得る。単離核酸分子は、発現カセットの一部であり得、それはさらにベクター、例えば、ウイルスベクターの一部であり得る。

【0022】

本発明はまた、霊長類の網膜色素上皮の細胞中で特異的に外因性遺伝子を発現させるための、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子の使用であって、前記単離核酸分子は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす使用を提供する。この使用において、単離核酸分子は、最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターをさらに含み得る。単離核酸分子は、発現カセットの一部であり得、それはベクター、例えば、ウイルスベクターの一部であり得る。

【0023】

本発明は、網膜色素上皮と関連する疾患の治療における使用のための、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子であって、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす単離核酸分子をさらに提供する。網膜色素上皮と関連する疾患は、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症及び網膜色素上皮肥大症からなる群から選択することができる。

【0024】

配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記核酸配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子であって、遺伝子をコードする前記核酸配列に作動可能に結合している前記遺伝子の霊長類の網膜色素上皮の細胞中の発現を特異的にもたらす単離核酸分子は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり得、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも８０％の同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも８５％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９０％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９５％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９６％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９７％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９８％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と少なくとも９９％の全体同一性を有する。一部の実施形態において、核酸配列は、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００ｂｐ、少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、又は少なくとも２０００ｂｐであり、配列番号１の前記核酸配列と１００％の全体同一性を有する。

【0025】

本発明の単離核酸分子は、最小プロモーター、例えば、ＳＶ４０最小プロモーター、例えば、ＳＶ４０最小プロモーター

【化4】

を含み得る。

【0026】

本発明のプロモーターに作動可能に結合させることができる典型的な遺伝子は、光受容体をコードする遺伝子である。例えば、これは、光感受性分子、例えば、チャネルロドプシン又はハロロドプシンであり得る。

【0027】

本発明のプロモーターを使用する外因性遺伝子の発現は、インビトロ、インビボ又はエクスビボで行うことができる。

【0028】

本明細書において使用される場合、用語「プロモーター」は、任意のシス調節エレメント、例として、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター及びプロモーターを指す。プロモーターは、転写が必要とされる遺伝子の上流に（５’領域に向かって）一般には位置するＤＮＡの領域である。プロモーターは、それが制御する遺伝子の適切な活性化又は抑制を可能とする。本発明の関連において、プロモーターは、それらに作動可能に結合している遺伝子のインターニューロン中の特異的発現をもたらす。「あるタイプの細胞中でのみの発現」とも称される「特異的発現」は、目的の遺伝子を発現する細胞の少なくとも７５％超が、規定されたタイプ、すなわち、本事例においては網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であることを意味する。

【0029】

網膜の色素層又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、黒色色素としても公知であり、網膜視細胞に栄養供給する神経感覚網膜のすぐ外側の色素細胞層であり、下層の脈絡膜及び上層の網膜視細胞に固着している。ＲＰＥは、色素顆粒が高密度に充填された六角形の細胞の単一層から構成される。鋸状縁において、ＲＰＥは、毛様体上を通過する膜として続き、虹彩の後面として続く。これは、拡張器の線維を生成する。この上皮の真下に、神経上皮（すなわち、桿体視細胞及び錐体視細胞）がＲＰＥと一緒に通る。両方とも、合わせて、胚の毛様体上皮であると理解される。網膜の前端は虹彩後上皮に続いており、それは虹彩に入る場合に色素上に重なる。外表面から見る場合、これらの細胞は平滑であり、形状が六角形である。断面で見る場合、それぞれの細胞は、大型の楕円形の核を含有する外側の非色素部分及び一連の直線の糸状突起として桿体視細胞間に延びる内側の色素部分からなり、これは特に眼球が光に曝露される場合である。ＲＰＥはいくつかの機能、すなわち、光吸収、上皮輸送、空間的イオン緩衝、視覚サイクル、食作用、分泌及び免疫調節を有する。

【0030】

発現カセットは典型的には、宿主細胞中への発現カセットの侵入及び宿主細胞中の発現カセットの維持を促進するベクター中に導入される。このようなベクターは一般に使用されており、当業者に周知である。多数のそのようなベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈなどから市販されており、多数のガイド、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｇｕｔｈｒｉｅ、Ｓｔｒａｔｈｅｍ、又はＢｅｒｇｅｒなどに記載されている（全て前掲）。このようなベクターとしては、典型的には、多重クローニング部位、及び追加のエレメント、例えば、複製起点、選択マーカー遺伝子（例えば、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、ＧＦＰ）、セントロメア配列などと共にプロモーター、ポリアデニル化シグナルなどが挙げられる。

【0031】

ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ、ＰＲＶ又はレンチウイルスは、本発明のプロモーターを使用して遺伝子を網膜色素上皮細胞に標的化し、送達するのに好適である。

【0032】

網膜細胞のアウトプットは、電気的方法、例えば、多電極アレイ若しくはパッチクランプを使用して、又は視覚的方法、例えば、蛍光の検出を使用して計測することができる。

【0033】

本発明の核酸配列を使用する方法であって、本発明のプロモーター下で１つ以上の導入遺伝子を発現する網膜色素上皮細胞と試験化合物を接触させるステップ、及び前記試験化合物の存在下で得られた網膜色素上皮細胞の少なくとも１つのアウトプットを、前記試験化合物の不存在下で得られた同一のアウトプットと比較するステップを含む方法は、ＲＰＥ細胞が関与する神経障害又は網膜障害の治療のための治療剤を同定するために使用することができる。

【0034】

さらに、本発明のプロモーターを使用する方法であって、本発明のプロモーターの制御下で１つ以上の導入遺伝子を発現する網膜色素上皮細胞を薬剤と接触させるステップ、及び前記薬剤との接触後に得られた少なくとも１つのアウトプットを、前記薬剤との前記接触前に得られた同一のアウトプットと比較するステップを含む方法も、視力回復のインビトロ試験に使用することができる。

【0035】

チャネルロドプシンは、光開閉型イオンチャネルとして機能するオプシンタンパク質のサブファミリーである。これらは、単細胞緑藻中で感覚光受容器として機能し、走光性、すなわち、光に応答する運動を制御する。他の生物体の細胞中で発現されると、それらは、細胞内酸性度、カルシウム流入、電気興奮性、及び他の細胞プロセスを制御するための光の使用を可能とする。以下の少なくとも３つの「天然」チャネルロドプシン：チャネルロドプシン－１（ＣｈＲ１）、チャネルロドプシン－２（ＣｈＲ２）、及びボルボックスチャネルロドプシン（ＶＣｈＲ１）が現在公知である。さらに、これらのタンパク質の一部の改変／改善バージョンも存在する。全ての公知のチャネルロドプシンは非特異的陽イオンチャネルであり、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、及びＣａ２＋イオンを伝導する。

【0036】

ハロロドプシンは、塩化物イオンに特異的な光駆動性イオンポンプであり、好塩菌として公知の系統発生的に古代の「細菌」（古細菌）に見出される。これは、レチニリデンタンパク質ファミリーの７回膜貫通型タンパク質であり、光駆動性プロトンポンプバクテリオロドプシンと相同であり、網膜中で光を感知する色素の脊椎動物ロドプシンと三次構造において類似する（しかし、一次配列構造においては類似しない）。ハロロドプシンは、光駆動性イオンチャネルのチャネルロドプシンとも配列類似性を共有する。ハロロドプシンは、必須の光異性化可能ビタミンＡ誘導体オールトランスレチナールを含有する。ハロロドプシンは、結晶構造が公知の数少ない膜タンパク質の１つである。ハロロドプシンアイソフォームは、好塩菌の複数の種、例として、Ｈ．サリナラム（Ｈ．ｓａｌｉｎａｒｕｍ）及びＮ．ファラオニス（Ｎ．ｐｈａｒａｏｎｉｓ）に見出すことができる。非常に進行中の研究はこれらの違いを探究中であり、それらを使用して光周期及びポンプ特性を別個に解析している。バクテリオロドプシンの後に、ハロロドプシンは研究される最良のＩ型（微生物）オプシンであり得る。ハロロドプシンレチナール複合体のピーク吸光度は約５７０ｎｍである。近年、ハロロドプシンは、オプトジェネティクスにおけるツールとなっている。青色光活性化イオンチャネルのチャネルロドプシン－２が、青色光の短いパルスで興奮性細胞（例えば、ニューロン、筋細胞、膵臓細胞、及び免疫細胞）を活性化させる能力を開くように、ハロロドプシンは、黄色光の短いパルスで興奮性細胞を静める能力を開く。このように、ハロロドプシン及びチャネルロドプシンは一緒になって、神経活動の多色光学的な活性化、鎮静、及び脱同期を可能とし、強力な神経工学のツールボックスを作出する。

【0037】

一部の実施形態において、プロモーターは、網膜に標的化されるベクターの一部であり、前記ベクターは、生存網膜色素上皮細胞中で検出可能な少なくとも１つのレポーター遺伝子を発現する。このようなレポーター遺伝子は、機能神経回路を示し得る。このようなベクターの例は、活動センサー又はレインボーウイルス（ｒａｉｎｂｏｗ ｖｉｒｕｓ）である（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６，１２７－１３０（２００９））。このようなウイルスの例は、脳内で空間的に混ざったニューロン間の接続ニューロンの活動を光学的にレポートする遺伝子コードされた活動センサーを有する逆行性経シナプス性偽性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）である。このような活動センサーは、外因性蛍光活動センサーを発現する単離経シナプス性ウイルスであり得る。経シナプス性ウイルスは、ラブドウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、又はヘルペスウイルス、例えば、アルファヘルペスウイルス、例えば、偽性狂犬病ウイルスであり得る。

【0038】

蛍光外因性活動センサーは、蛍光タンパク質Ｃａ^２＋センサー、例えば、イエローカメレオン、カンガルー、Ｇ－ＣａＭＰ／ペリカン、若しくはＴＮ－Ｌ１５、又は蛍光タンパク質電圧センサー、例えば、ＦｌａＳｈ、ＳＰＡＲＣ、若しくはＶＳＰ、好ましくは、ＶＳＰ１であり得る。

【0039】

本発明に好適なウイルスベクターは、当分野において周知である。例えば、ＡＡＶ、ＰＲＶ又はレンチウイルスは、遺伝子を標的化し、網膜色素上皮細胞に送達するのに好適である。

【0040】

単離網膜を用いて作業する場合、光受容体に最適なウイルス送達は、網膜の光受容体側が露出され、したがってより良好に形質移入され得るように神経節細胞側を下方にマウントすることにより達成することができる。別の技術は、送達ウイルスが内膜に浸透し得るように例えば、剃刀により網膜の内側の制限膜をスライスすることである。さらなる手法は、網膜を寒天中に埋め込み、前記網膜をスライスし、スライスの側部から送達ウイルスをアプライすることである。

【0041】

形質移入された細胞のアウトプットは、周知の方法を使用して、例えば、電気的方法、例えば、多電極アレイ若しくはパッチクランプを使用して、又は視覚的方法、例えば、蛍光の検出を使用して計測することができる。一部の場合、内境界膜の顕微手術により内境界膜が除去される。他の場合、記録は、内境界膜に実施されたスライスを通して達成される。

【0042】

本発明に使用することができる網膜細胞源は、霊長類である。本発明の一部の実施形態において、網膜細胞は、ヒト網膜に由来し、又はその中に存在する。他の実施形態において、網膜は、２つの区別される系統、直鼻猿半目及び曲鼻猿半目のいずれかからの別の霊長類からのものである。ヒト網膜は、前記網膜が角膜の切開後に通常廃棄される角膜バンクから容易に得ることができる。成人ヒト網膜は大表面（約１１００ｍｍ^２）を有し、したがって多数の実験的小領域に容易に分離することができる。さらに、網膜は、シナプス伝達についての精巧なモデルとして使用することもできる。それというのも、網膜は、脳の他の部分と同一のシナプスを有するためである。

【0043】

本明細書において使用される場合、用語「動物」は、全ての動物を含むように本明細書において使用される。一部の実施形態において、非ヒト動物は脊椎動物である。動物の例は、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ネコ、イヌなどである。用語「動物」はまた、胚期及び胎生期を含め、全ての発生段階における個々の動物を含む。「遺伝子改変動物」は、細胞下レベルでの意図的な遺伝子操作、例えば、標的化組換え、マイクロインジェクション又は組換えウイルスの感染によるものにより、直接的又は間接的に変更され、又は受け入れられた遺伝子情報を担持する１つ以上の細胞を含有する任意の動物である。用語「遺伝子改変動物」は、古典的な交雑も体外受精も包含するものではなく、むしろ、１つ以上の細胞が組換えＤＮＡ分子により変更され、又はそれを受け入れている動物を包含することを意味する。この組換えＤＮＡ分子は、規定の遺伝子座に特異的に標的化され得、染色体内にランダムに組み込まれ得、又はそれは、染色体外複製ＤＮＡであり得る。用語「生殖細胞系列遺伝子改変動物」は、遺伝子変更又は遺伝子情報が生殖系列細胞中に導入され、それにより、遺伝子情報をその子孫へ伝達する能力が付与された遺伝子改変動物を指す。このような子孫が、実際、その変更又は遺伝子情報の一部又は全部を保有する場合、それらは、同様に遺伝子改変動物である。

【0044】

変更又は遺伝子情報は、レシピエントが属する動物の種にとって外来、若しくは特定の個々のレシピエントにとってのみ外来であり得、又はレシピエントにより既に保有される遺伝子情報であり得る。その最後の場合、変更され、又は導入された遺伝子は、天然遺伝子とは異なって発現され得、又は全く発現され得ない。

【0045】

標的遺伝子を変更するために使用される遺伝子は広範な技術により得ることができ、それとしては、限定されるものではないが、ゲノム資源からの単離、単離ｍＲＮＡテンプレートからのｃＤＮＡの調製、直接的合成、又はそれらの組合せが挙げられる。

【0046】

導入遺伝子導入のための標的細胞のタイプは、ＥＳ細胞である。ＥＳ細胞は、インビトロで培養された着床前胚から得ることができ、胚と融合することができる（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４－１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５－２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：９０６５－９０６９；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５－４４８；Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：４５８２－４５８４）。導入遺伝子は、標準的技術、例えば、エレクトロポレーションを使用するＤＮＡ形質移入により、又はレトロウイルス媒介性形質導入によりＥＳ細胞中に効率的に導入することができる。得られた形質転換ＥＳ細胞は、その後、凝集により桑実胚と組み合わせることができ、又は非ヒト動物からの胚盤胞中に注射することができる。その後、導入ＥＳ細胞は胚をコロニー化し、得られたキメラ動物の生殖細胞系列に寄与する（Ｊａｅｎｉｓｃｈ（１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８－１４７４）。遺伝子標的化された遺伝子改変マウスの生成における遺伝子標的化されたＥＳ細胞の使用は１９８７年に記載され（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｃｅｌｌ ５１：５０３－５１２）、他箇所で概説されている（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｃｅｌｌ ５６：１４５－１４７；Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９），Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ．５：７０－７６；Ｂａｒｉｂａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６：４８１－４９２；Ｗａｇｎｅｒ（１９９０），ＥＭＢＯ Ｊ．９：３０２５－３０３２；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：５３４－５３９）。

【0047】

染色体アレル中に特異的変化を挿入するための標的化相同組換えを使用することにより、任意の遺伝子領域を不活性化させ、又は所望される任意の突然変異に変更する技術が利用可能である。

【0048】

本明細書において使用される場合、「標的化遺伝子」は、ヒトの介入により非ヒト動物の生殖細胞系列中に導入されるＤＮＡ配列であり、それとしては、限定されるものではないが、本明細書に記載の方法が挙げられる。本発明の標的化遺伝子としては、同族の内因性アレルを特異的に変化させるように設計されるＤＮＡ配列が挙げられる。

【0049】

本発明において、「単離」は、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然の環境）から取り出された材料を指し、したがって、その天然状態から「人工的に」変更されている。例えば、単離ポリヌクレオチドは、ベクター若しくは物質の組成物の一部であり得、又は細胞内に含有され得、依然として「単離」されている。それというのも、そのベクター、物質の組成物、又は特定の細胞はそのポリヌクレオチドの元の環境ではないためである。用語「単離」は、ゲノムライブラリーもｃＤＮＡライブラリーも、全細胞トータルＲＮＡ調製物もｍＲＮＡ調製物も、ゲノムＤＮＡ調製物（電気泳動により分離され、ブロット上に転写されたものを含む）も、剪断された全細胞ゲノムＤＮＡ調製物も、当分野が本発明のポリヌクレオチド／配列の区別される特色を実証していない他の組成物も指さない。単離ＤＮＡ分子のさらなる例としては、異種宿主細胞中で維持された組換えＤＮＡ分子又は溶液中の（部分的に、又は実質的に）精製されたＤＮＡ分子が挙げられる。単離ＲＮＡ分子としては、本発明のＤＮＡ分子のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられる。しかしながら、ライブラリーの他のメンバーから単離されていないライブラリー（例えば、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリー）のメンバーであるクローン中に（例えば、ライブラリーのそのクローン及び他のメンバーを含有する均質な溶液の形態で）、あるいは細胞又は細胞溶解物から取り出された染色体（例えば、核型におけるような「染色体スプレッド」）内に、あるいはランダムに剪断されたゲノムＤＮＡの調製物又は１つ以上の制限酵素により切断されたゲノムＤＮＡの調製物内に含有される核酸は、この発明においては、「単離」されていない。本明細書にさらに考察されるとおり、本発明による単離核酸分子は、天然に、組換えにより、又は合成により産生することができる。

【0050】

「ポリヌクレオチド」は、一本鎖ＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ及び二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、又はより典型的には二本鎖、又は一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成され得る。さらに、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の改変塩基又は安定性のために若しくは他の理由のために改変されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ骨格を含有し得る。「改変」塩基としては、例えば、トリチル化塩基及び異常塩基、例えば、イノシンが挙げられる。種々の改変がＤＮＡ及びＲＮＡになされ得；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、又は代謝的に改変された形態を包含する。

【0051】

表現「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、そのポリペプチドについてのコード配列のみを含むポリヌクレオチドならびに追加のコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。

【0052】

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の４２℃における一晩のインキュベーションとそれに続く約５０℃における０．１×ＳＳＣ中のフィルターの洗浄を指す。ハイブリダイゼーション及びシグナル検出のストリンジェンシーの変化は、主に、ホルムアミド濃度（より低い割合のホルムアミドがストリンジェンシーの低下をもたらす）；塩条件、又は温度の操作を通して達成される。例えば、中程度に高いストリンジェンシー条件としては、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３ＭのＮａＣｌ；０．２ＭのＮａＨ_２ＰＯ_４；０．０２ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ブロッキングＤＮＡを含む溶液中の３７℃における一晩のインキュベーションとそれに続く５０℃における１×ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳによる洗浄が挙げられる。さらに、いっそうより低いストリンジェンシーを達成するため、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後に実施される洗浄は、より高い塩濃度（例えば、５×ＳＳＣ）において行うことができる。上記の条件における変法は、ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替ブロッキング試薬の包含及び／又は置換を通して達成することができる。典型的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、及び市販の専売配合物が挙げられる。規定のブロッキング試薬の包含は、適合性についての問題に起因して上記のハイブリダイゼーション条件の改変を要求し得る。

【0053】

ポリペプチドに言及する場合の用語「断片」、「誘導体」及び「アナログ」は、そのようなポリペプチドと実質的に同一の生物学的機能又は活性のいずれかを保持するポリペプチドを意味する。アナログとしては、プロタンパク質部分の開裂により活性化させて活性成熟ポリペプチドを産生することができるプロタンパク質が挙げられる。

【0054】

用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し；それは、コード領域に先行する領域及びその後に続く領域「リーダー及びトレーラー」ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。

【0055】

ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに連結しているアミノ酸又は改変ペプチド結合により互いに連結しているアミノ酸、すなわち、ペプチドイソスターから構成され得、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、天然プロセス、例えば、翻訳後プロセシング、又は当分野において周知の化学修飾技術のいずれかにより修飾することができる。このような修飾は、基礎的な教本及びより詳細なモノグラフ、ならびに膨大な研究論文に十分記載されている。修飾は、ポリペプチド中のいずれの箇所においても生じ得、その箇所としては、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシル末端が挙げられる。同一のタイプの修飾が、所与のポリペプチド中のいくつかの部位において同一又は変動する程度で存在し得ることが認識される。さらに、所与のポリペプチドは、多くのタイプの修飾を含有し得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝鎖であり得、それらは分枝を有し、又は分枝を有さない環状であり得る。環状、分枝鎖、及び分枝鎖環状ポリペプチドは翻訳後の天然プロセスから生じ得、又は合成方法により作製することができる。修飾としては、限定されるものではないが、アセチル化、アシル化、ビオチン化、ＡＤＰ－リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合性付着、ヘム部分の共有結合性付着、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合性付着、脂質又は脂質誘導体の共有結合性付着、ホスホチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合性付着、架橋、環化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ－カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、抗体分子又は他の細胞リガンドへの結合、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング（例えば、開裂）、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介付加、例えば、アルギニル化、及びユビキチン化が挙げられる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ－ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．Ｉ－１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６－６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８－６２（１９９２）参照）。

【0056】

「生物学的活性を有する」ポリペプチド断片は、用量依存性を伴い、又は伴わない、特定の生物学的アッセイにおいて計測される元のポリペプチド、例えば、成熟形態の活性と類似するが必ずしも同一でなくてもよい活性を示すポリペプチドを指す。用量依存性が存在する場合、それは、ポリペプチドのそれと同一である必要はなく、むしろ、元のポリペプチドと比較して所与の活性において用量依存性と実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、元のポリペプチドに対して高い活性又は約２５倍以下少ない、一部の実施形態においては、約１０倍以下少ない活性、若しくは約３倍以下少ない活性を示す）。

【0057】

種ホモログは、本明細書に提供される配列から好適なプローブ又はプライマーを作製し、好適な核酸資源を所望のホモログについてスクリーニングすることにより単離及び同定することができる。

【0058】

「バリアント」は、元のポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるが、その必須の特性を保持するポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。一般に、バリアントは、元のポリヌクレオチド又はポリペプチドと全体的に密接に類似し、多くの領域において、同一である。

【0059】

実際問題として、任意の特定の核酸分子又はポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるか否かは、慣用的には、公知のコンピュータプログラムを使用して決定することができる。グローバル配列アラインメントとも称される、クエリ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的なマッチを決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｌｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７－２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリ配列及び対象配列は両方ともＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することにより比較することができる。前記グローバル配列アラインメントの結果は、パーセント同一性におけるものである。パーセント同一性を計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントに使用される好ましいパラメータは以下である：行列＝ユニタリー、ｋ－タプル＝４、ミスマッチペナルティ－－１、結合ペナルティ－－３０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝ｌ、ギャップペナルティ－－５、ギャップサイズペナルティ０．０５、ウィンドウサイズ＝５００又は対象ヌクレオチド配列の長さのどちらか短い方。対象配列が、内部欠失のためではなく５’又は３’欠失に起因してクエリ配列よりも短い場合、その結果を手作業により補正しなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、パーセント同一性を計算する場合、対象配列の５’及び３’トランケーションを考慮しないためである。クエリ配列に対して５’又は３’末端においてトランケートされた対象配列について、パーセント同一性は、クエリ配列の全塩基のパーセントとして、マッチング／アラインメントされていない対象配列の５’及び３’であるクエリ配列の塩基の数を計算することにより補正される。ヌクレオチドがマッチング／アラインメントされているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。次いで、この割合は、規定のパラメータを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性から減算され、最終のパーセント同一性スコアに達する。この補正スコアが、本発明のために使用されるものである。クエリ配列とマッチング／アラインメントされていない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントによりディスプレイされる対象配列の５’及び３’塩基の外側の塩基のみが、パーセント同一性スコアを手作業により調整する目的に計算される。例えば、９０塩基の対象配列は、１００塩基のクエリ配列とアラインメントされてパーセント同一性が決定される。欠失は対象配列の５’末端において生じ、したがって、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端における最初の１０塩基のマッチング／アラインメントを示さない。この１０個の損なわれた塩基はその配列の１０％（マッチングされていない５’及び３’末端における塩基の数／クエリ配列中の塩基の総数）に相当し、したがって、１０％がＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性スコアから減算される。残りの９０塩基が完全にマッチした場合、最終のパーセント同一性は９０％である。別の例において、９０塩基の対象配列が、１００塩基のクエリ配列と比較される。この場合、欠失は内部欠失であるため、クエリとマッチング／アラインメントされていない対象配列の５’にも３’にも塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算されたパーセント同一性は、手作業により補正されない。これにもかかわらず、特定の場合において、全体同一性は、例えば、配列番号１の配列と少なくともいくらかの程度の類似性を有する配列の部分のみを指す。換言すると、２０００ｂｐのクエリ配列の配列同一性は、配列番号１を含む配列の一部又はその極めて類似する一部についてのみ計算される。

【0060】

本発明のクエリアミノ酸配列と少なくとも、例えば９５％「同一の」アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、対象ポリペプチドのアミノ酸配列は、対象ポリペプチド配列がクエリアミノ酸配列のそれぞれの１００アミノ酸につき５つまでのアミノ酸変更を含み得ることを除きクエリ配列と同一であることが意図される。換言すると、クエリアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るため、対象配列中のアミノ酸残基の５％までを挿入し、欠失し、又は別のアミノ酸と置換することができる。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ若しくはカルボキシ末端位置において、又はそれらの末端位置の間のいずれの箇所でも、参照配列中の残基の間に個々に、又は参照配列内の１つ以上の連続する群として散在して生じ得る。

【0061】

実際問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、配列に示されるアミノ酸配列又は寄託ＤＮＡクローンによりコードされるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるか否かは、慣用的には、公知のコンピュータプログラムを使用して決定することができる。グローバル配列アラインメントとも称される、クエリ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的なマッチを決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７－２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリ配列及び対象配列は両方ともヌクレオチド配列又は両方ともアミノ酸配列のいずれかである。前記グローバル配列アラインメントの結果は、パーセント同一性におけるものである。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントに使用される好ましいパラメータは以下である：行列＝ＰＡＭ０、ｋ－タプル＝２、ミスマッチペナルティ－－Ｉ、結合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ長＝０、カットオフスコア＝ｌ、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ－－５、ギャップサイズペナルティ－－０．０５、ウィンドウサイズ＝５００又は対象アミノ酸配列の長さのどちらか短い方。対象配列が、内部欠失のためではなくＮ又はＣ末端欠失に起因してクエリ配列よりも短い場合、その結果を手作業により補正しなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、グローバルパーセント同一性を計算する場合、対象配列のＮ及びＣ末端トランケーションを考慮しないためである。クエリ配列に対してＮ及びＣ末端においてトランケートされた対象配列について、パーセント同一性は、クエリ配列の全塩基のパーセントとして、対応する対象残基とマッチング／アラインメントされていない、対象配列のＮ及びＣ末端であるクエリ配列の残基の数を計算することにより補正される。残基がマッチング／アラインメントされているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。次いで、この割合は、規定のパラメータを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算されたパーセント同一性から減算され、最終のパーセント同一性スコアに達する。この最終パーセント同一性スコアが、本発明のために使用されるものである。クエリ配列とマッチング／アラインメントされていない、対象配列のＮ及びＣ末端にある残基のみが、パーセント同一性スコアを手作業により調整する目的に考慮される。それは、対象配列の最も遠いＮ及びＣ末端残基の外側のクエリ残基位置のみである。クエリ配列とマッチング／アラインメントされていない、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいてディスプレイされる対象配列のＮ及びＣ末端の外側の残基位置のみが手作業により補正される。他の手作業による補正は、本発明のために行われるべきでない。

【0062】

天然に存在するタンパク質バリアントは、「アレルバリアント」と呼ばれ、生物体の染色体上の所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つを指す（Ｇｅｎｅｓ １１，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらのアレルバリアントは、ポリヌクレオチドレベル及び／又はポリペプチドレベルのいずれかにおいて変動し得る。あるいは、天然に存在しないバリアントは、突然変異誘発技術により、又は直接的合成により産生することができる。

【0063】

「標識」は、直接的に、又はシグナル産生系の１つ以上の追加のメンバーとの相互作用を通して、検出可能なシグナルを提供し得る薬剤を指す。直接的に検出可能であり、本発明において使用することができる標識としては、蛍光標識が挙げられる。具体的なフルオロフォアとしては、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン色素などが挙げられる。

【0064】

「蛍光標識」は、ある波長の光を、別の波長の光により活性化された場合に放射する能力を有する任意の標識を指す。

【0065】

「蛍光」は、蛍光シグナルの任意の検出可能な特徴を指し、それとしては、強度、スペクトル、波長、細胞内分布などが挙げられる。

【0066】

蛍光を「検出すること」は、定性的又は定量的方法を使用して細胞の蛍光を評価することを指す。本発明の実施形態の一部において、蛍光は、定性的様式で検出される。換言すれば、組換え融合タンパク質が発現されるか否かを示す蛍光マーカーが存在するか否かである。他の例として、蛍光は、例えば、蛍光強度、スペクトル、又は細胞内分布を計測する定量的手段を使用して測定することができ、異なる条件下で得られる値の統計的比較を可能とする。レベルは、定性的方法、例えば、複数の試料、例えば、蛍光顕微鏡又は他の光学的検出器（例えば、画像分析システムなど）を使用して検出される試料のヒトによる目視分析及び比較を使用して測定することもができる。蛍光における「変更」又は「モジュレーション」は、別の条件と比較した特定の条件下での蛍光の強度、細胞内分布、スペクトル、波長、又は他の側面における任意の検出可能な差を指す。例えば、「変更」又は「モジュレーション」は定量的に検出され、その差は統計的に有意な差である。蛍光における任意の「変更」又は「モジュレーション」は、標準的な機器、例えば、蛍光顕微鏡、ＣＣＤ、若しくは任意の他の蛍光検出器を使用して検出することができ、自動システム、例えば、統合システムを使用して検出することができ、又はヒト観測者による変更の主観的検出を反映し得る。

【0067】

「緑色蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）は、青色光に曝露された場合に緑色の蛍光を発する、クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）／エクオレア・エクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ａｅｑｕｏｒｅａ）／エクオレア・フォルスカレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｆｏｒｓｋａｌｅａ）から最初に単離された、２３８アミノ酸（２６．９ｋＤａ）から構成されるタンパク質である。Ａ．ビクトリア（Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ）からのＧＦＰは、３９５ｎｍの波長におけるメジャー励起ピーク及び４７５ｎｍにおけるマイナーピークを有する。この発光ピークは５０９ｎｍであり、それは、可視スペクトルの低い方の緑色部分に存在する。ウミシイタケ（レニラ・レニフォルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））からのＧＦＰは、４９８ｎｍにおける単一のメジャー励起ピークを有する。広範な使用法の潜在性及び研究者らの発展的要望に起因して、ＧＦＰの多くの異なる突然変異体が遺伝子操作されている。最初の主要な改善は、Ｒｏｇｅｒ ＴｓｉｅｎによりＮａｔｕｒｅにおいて１９９５年に報告された単一点突然変異（Ｓ６５Ｔ）であった。この突然変異は、ＧＦＰのスペクトル特徴を大幅に改善し、増加した蛍光、光安定性及びピーク放射を５０９ｎｍに保持したままでのメジャー励起ピークの４８８ｎｍへのシフトをもたらした。この足場への３７℃フォールディング効率（Ｆ６４Ｌ）点突然変異体の追加は、増強型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）を生じさせた。ＥＧＦＰは、９．１３×１０－２１ｍ^２／分子の光学的断面積としても公知であり、５５，０００Ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）としても引用される、消衰係数（εと表示される）を有する。十分にフォールディングしていないペプチドと融合した場合でさえもＧＦＰが迅速にフォールディングし、成熟するのを可能とする一連の突然変異であるスーパーフォールダー（Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ）ＧＦＰが２００６年に報告された。

【0068】

「黄色蛍光タンパク質」（ＹＦＰ）は、エクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光タンパク質の遺伝子突然変異体である。この励起ピークは５１４ｎｍであり、その発光ピークは５２７ｎｍである。

【0069】

本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他に記述しない限り、複数の参照対象を含む。

【0070】

「ウイルス」は、宿主細胞の外側では成長も繁殖もし得ない超顕微鏡的感染性物質である。それぞれのウイルス粒子、又はビリオンは、キャプシドと呼ばれる保護タンパク質コート内の遺伝子材料、ＤＮＡ、又はＲＮＡからなる。キャプシド形状は、単純ならせん及び正二十面体（多面体又はほぼ球形）形態から、尾部又はエンベロープを有するより複雑な構造まで変動する。ウイルスは、細胞生物形態に感染し、感染される宿主のタイプに応じて動物、植物及び細菌タイプに分類される。

【0071】

本明細書において使用される場合、用語「経シナプス性ウイルス」は、あるニューロンから別の介在ニューロンにシナプスを通って移動し得るウイルスを指す。このような経シナプス性ウイルスの例は、ラブドウイルス、例えば、狂犬病ウイルス、及びアルファヘルペスウイルス、例えば、仮性狂犬病ウイルス又は単純ヘルペスウイルスである。本明細書において使用される場合、用語「経シナプス性ウイルス」はまた、あるニューロンから別の介在ニューロンにシナプスを通って移動する能力をそれ自体で有するウイルスのサブユニット及び生物学的ベクター、例えば、そのようなサブユニットを組み込み、あるニューロンから別の介在ニューロンにシナプスを通って移動する能力を実証する改変ウイルスを包含する。

【0072】

経シナプス性移動は、順行性又は逆行性のいずれかであり得る。逆行性移動の間、ウイルスは、シナプス後ニューロンからシナプス前ニューロンに動く。したがって、順行性移動の間、ウイルスは、シナプス前ニューロンからシナプス後ニューロンに動く。

【0073】

ホモログは、共通の祖先を共有するタンパク質を指す。アナログは、共通の祖先を共有しないが、それらを１つのクラスに含めることにさせるいくつかの（構造的よりむしろ）機能的な類似性を有する（例えば、トリプシン様セリンプロテイナーゼ及びサブチリシンは明らかに関連せず、活性部位の外側のそれらの構造は完全に異なるが、それらは、事実上幾何的に同一の活性部位を有し、したがって、アナログへの収束進化の一例とみなされる）。

【0074】

ホモログの２つのサブクラスのオルソログ及びパラログが存在する。オルソログは、異なる種における同一遺伝子である（例えば、シトコム（ｃｙｔｏｃｈｏｍｅ）「ｃ」）。同一生物体における２つの遺伝子は、オルソログであり得ない。パラログは遺伝子重複の結果である（例えば、ヘモグロビンベータ及びデルタ）。２つの遺伝子／タンパク質が相同であり、同一生物体内に存在する場合、それらはパラログである。

【0075】

本明細書において使用される場合、用語「障害」は、不快感、疾患、疾病、臨床病態、又は病的状態を指す。

【0076】

本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、化学的に不活性であり、それが投与される患者に対して毒性ではない担体媒体を指す。

【0077】

本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容可能な誘導体」は、対象に対して比較的無毒である、例えば、本発明のスクリーニングの方法を使用して同定される薬剤の任意のホモログ、アナログ、又は断片を指す。

【0078】

用語「治療剤」は、障害又は障害の合併症の予防又は治療を補助する任意の分子、化合物、又は治療物を指す。

【0079】

適合性医薬担体中に配合されたそのような薬剤を含む組成物は、治療のために調製し、包装し、ラベル貼付することができる。

【0080】

複合体が水溶性である場合、それは、適切な緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水又は他の生理学的に適合性の溶液中で配合することができる。

【0081】

あるいは、得られた複合体が水性溶媒中で不十分な溶解度を有する場合、それは、非イオン性界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、又はポリエチレングリコールと共に配合することができる。したがって、化合物及び生理学的に許容可能なその溶媒和物は、（口腔又は鼻腔のいずれかを介する）吸入若しくは吹送による投与又は経口、バッカル、非経口、直腸投与のために配合することができ、又は腫瘍の場合、固形腫瘍中に直接注射することができる。

【0082】

経口投与について、医薬製剤は、液体形態、例えば、液剤、シロップ剤若しくは懸濁液剤であり得、又は使用前の水若しくは他の好適なビヒクルによる再構成のための薬物製品として提供することができる。このような液体製剤は、薬学的に許容可能な添加剤、例えば、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水添食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシアガム）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、又は分留植物油）；及び保存剤（例えば、メチル若しくはプロピルｐ－ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）を用いて慣用の手段により調製することができる。医薬組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース又はリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）を用いて慣用の手段により調製される、例えば、錠剤又はカプセル剤の形態をとり得る。錠剤は、当分野において周知の方法によりコーティングすることができる。

【0083】

経口投与のための製剤は、活性化合物の徐放性を与えるように好適に配合することができる。

【0084】

吸入による投与のため、本発明による使用のための化合物は、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の好適なガスを使用して加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレー提供物の形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を送達するための弁を提供することにより決定することができる。化合物及び好適な粉末基剤、例えば、ラクトース又はデンプンの粉末混合物を含有する、吸入具又は吸入器における使用のための例えば、ゼラチンのカプセル剤及びカートリッジを配合することができる。

【0085】

化合物は、注射、例えば、ボーラス注射又は持続注入による非経口投与のために配合することができる。注射用配合物は、添加される保存剤と共に、単位剤形中で、例えば、アンプル中又は複数用量容器中で提供することができる。

【0086】

組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルションのような形態をとり得、配合用薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）、例えば、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤を含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前の好適なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水による構成のための粉末の形態であり得る。

【0087】

化合物は、例えば、局所的適用、例えば、クリーム剤又はローション剤として配合することもできる。

【0088】

上記の配合物に加えて、化合物はまた、デポー製剤として配合することができる。このような長時間作用性配合物は、埋込（例えば、眼内、皮下又は筋肉内）により、又は眼内注射により投与することができる。

【0089】

したがって、例えば、化合物は、好適なポリマー若しくは疎水性材料と共に（例えば、許容可能な油中のエマルションとして）、又はイオン交換樹脂と共に、又は難溶性誘導体、例えば、難溶性塩として配合することができる。リポソーム及びエマルションは、親水性薬物のための送達ビヒクル又は担体の周知の例である。

【0090】

組成物は、所望により、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含有し得るパック又は分注装置中で提供することができる。パックは、例えば、金属又はプラスチックホイル、例えば、ブリスターパックを含み得る。パック又は分注装置には、投与についての説明書を添付することができる。

【0091】

本発明はまた、本発明の治療レジメンを実施するためのキットを提供する。このようなキットは、１つ以上の容器中で、治療又は予防有効量の組成物を薬学的に許容可能な形態で含む。

【0092】

キットのバイアル中の組成物は、例えば、滅菌生理食塩水、デキストロース溶液、又は緩衝溶液、又は他の薬学的に許容可能な滅菌流体との組合せで、薬学的に許容可能な溶液の形態であり得る。あるいは、複合体は、凍結乾燥又は乾燥させることができ；この場合、キットは、場合により、容器中で複合体を再構成して注射目的の溶液を形成するための好ましくは滅菌した薬学的に許容可能な溶液（例えば、生理食塩水、デキストロース溶液など）をさらに含む。

【0093】

別の実施形態において、キットは、複合体を注射するための、好ましくは無菌形態で包装された針若しくはシリンジ、及び／又は包装されたアルコールパッドをさらに含む。臨床医又は患者による組成物の投与についての説明書が場合により含まれる。

【0094】

特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているものと同一の意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は均等の方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料が以下に記載される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、及び実施例は説明のためのものにすぎず、限定的なものではない。

【実施例】

【0095】

遺伝子構築物
本実施例において使用されるプロモーター（９６４ｂｐ；配列番号３）は、配列番号２の最小プロモーターＳＶ４０プロモーターに結合している配列番号１のものからなる。ＣｈＲ２－ｅＧＦＰコード配列をこのプロモーター及び最適化コザック配列（ＧＣＣＡＣＣ）の直後に挿入し、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及びＳＶ４０ポリアデニル化部位が続いた。２．９Ｅ＋１０ＧＣ／ｍＬの力価を有するＡＡＶ血清型２／８を使用して、網膜ニューロンを標的化した。

【0096】

ウイルス形質移入及び組織調製
ＡＡＶ投与のため、麻酔した動物の眼球をレンズに近い強膜中で鋭利な３０ゲージ針により穿刺した。２マイクロＬのＡＡＶ粒子懸濁液をＨａｍｉｌｔｏｎシリンジにより網膜下注射した。３週間後、単離網膜をＰＢＳ中４％のＰＦＡ中で３０分間固定し、次いで洗浄ステップをＰＢＳ中で４℃において行った。全網膜をＰＢＳ中１０％の正常ロバ血清（ＮＤＳ）、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００により室温において１時間処理した。ＰＢＳ中３％のＮＤＳ、１％のＢＳＡ、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中のモノクローナルラット抗ＧＦＰ Ａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；１：５００）及びポリクローナルヤギ抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：１：２００）による処理を、室温において５日間実施した。二次ロバ抗ラットＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－４８８ Ａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．；１：２００）、抗ヤギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－６３３及びヘキストによる処理を２時間行った。切片を洗浄し、ＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）によりスライドガラス上にマウントし、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ｚ２レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．）を使用して撮影した。

以下の態様を包含し得る。
［１］ 霊長類の網膜色素上皮の細胞中で特異的に外因性遺伝子を発現させる方法であって、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子を、前記霊長類の前記網膜色素上皮の細胞に送達するステップを含み、前記単離核酸分子は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす方法。
［２］ 前記単離核酸分子が、最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターをさらに含む、上記［１］に記載の方法。
［３］ 前記単離核酸分子が、発現カセットの一部である、上記［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ 前記発現カセットが、ベクターの一部である、上記［３］に記載の方法。
［５］ 前記ベクターが、ウイルスベクターである、上記［４］に記載の方法。
［６］ 霊長類の網膜色素上皮の細胞中で特異的に外因性遺伝子を発現させるための、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子の使用であって、前記単離核酸分子は、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす使用。
［７］ 前記単離核酸分子が、最小プロモーター、例えば、配列番号２の最小プロモーターをさらに含む、上記［６］に記載の使用。
［８］ 前記単離核酸分子が、発現カセットの一部である、上記［６］又は［７］に記載の使用。
［９］ 前記発現カセットが、ベクターの一部である、上記［８］に記載の使用。
［１０］ 前記ベクターが、ウイルスベクターである、上記［９］に記載の使用。
［１１］ 網膜色素上皮と関連する疾患の治療における使用のための、配列番号１の核酸配列を含み、若しくはそれからなり、又は配列番号１の前記配列と少なくとも８０％の全体同一性を有する少なくとも４００ｂｐの核酸配列からなる単離核酸分子であって、霊長類の網膜色素上皮の細胞中の外因性遺伝子の発現を、前記外因性遺伝子をコードする核酸配列が前記単離核酸分子に作動可能に結合している場合に特異的にもたらす単離核酸分子。
［１２］ 網膜色素上皮と関連する前記疾患は、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症及び網膜色素上皮肥大症からなる群から選択される、上記［１１］に記載の使用のための単離核酸分子。

【図1】

【配列表】

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