特許 7348675 α－及びβ－１，４－グリコシド結合を全て切断する酵素の用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-12

(45)【発行日】2023-09-21

(54)【発明の名称】α－及びβ－１，４－グリコシド結合を全て切断する酵素の用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/24 20060101AFI20230913BHJP

   C12N 9/26 20060101ALI20230913BHJP

   C12N 9/38 20060101ALI20230913BHJP

   C12N 15/56 20060101ALI20230913BHJP

   C12P 19/02 20060101ALI20230913BHJP

   C12P 19/04 20060101ALI20230913BHJP

   C12P 19/18 20060101ALI20230913BHJP

【ＦＩ】

C12N9/24 ZNA

C12N9/26 Z

C12N9/38

C12N15/56

C12P19/02

C12P19/04 Z

C12P19/18

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2021569130

(86)(22)【出願日】2020-05-21

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-10

(86)【国際出願番号】 KR2020006649

(87)【国際公開番号】W WO2020235946

(87)【国際公開日】2020-11-26

【審査請求日】2022-03-25

(31)【優先権主張番号】10-2019-0059565

(32)【優先日】2019-05-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】314000442

【氏名又は名称】高麗大学校産学協力団

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

【住所又は居所原語表記】１４５， Ａｎａｍ－ｒｏ Ｓｅｏｎｇｂｕｋ－ｇｕ Ｓｅｏｕｌ ０２８４１， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(74)【代理人】

【識別番号】100176474

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 信彦

(72)【発明者】

【氏名】キム，ギョンホン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ドヒョン

【審査官】伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】特開平０７－２３６４８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】"Vibrio sp. EJY3 chromosome 1,complete sequence", CP003241，2014年1月30日掲載, 2023年2月3日検索，National Center for BiotechnologyInformation, [online]，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP003241.1?report=genbank&from=2520455&to=2522278

【文献】Journal of Bacteriology, 2012, Vol.194,No.10, pp.2773-2774

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むα－Ｌ－フコシダーゼ（α－Ｌ－ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ）；及び
ラクトース及び重合度（ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ）２～４のマルトオリゴ糖からなる群より選択された一つ以上の基質を含むことを特徴とする、単糖類又はマルトオリゴ糖生産用組成物であって、
ラクトースはα－Ｌ－フコシダーゼによって単糖類であるグルコース及びガラクトースに分解され、
重合度２～４のマルトオリゴ糖はα－Ｌ－フコシダーゼによって分解され、基質で用いられるマルトオリゴ糖より高い重合度のマルトオリゴ糖が生成する、
組成物。

【請求項2】

α－Ｌ－フコシダーゼは、α－１，４グルコシダーゼ及びβ－１，４ガラクトシダーゼ活性とトランスグリコシル化活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の単糖類又はマルトオリゴ糖生産用組成物。

【請求項3】

α－Ｌ－フコシダーゼは、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）菌株ＥＪＹ３から分離したものであることを特徴とする、請求項１に記載の単糖類又はマルトオリゴ糖生産用組成物。

【請求項4】

α－Ｌ－フコシダーゼは、前記α－Ｌ－フコシダーゼをコーディングする遺伝子を含む組換えベクターに形質転換された宿主細胞又はその培養物から得たものであることを特徴とする、請求項１に記載の単糖類又はマルトオリゴ糖生産用組成物。

【請求項5】

遺伝子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項４に記載の単糖類又はマルトオリゴ糖生産用組成物。

【請求項6】

ラクトース及び重合度（ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ）２～４のマルトオリゴ糖からなる群より選択された一つ以上の基質とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むα－Ｌ－フコシダーゼ（α－Ｌ－ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を反応させる段階；及び
前記反応の生成物から単糖類及び基質で用いられるマルトオリゴ糖より高い重合度のマルトオリゴ糖を回収する段階を含むことを特徴とする、単糖類又はマルトオリゴ糖の生産方法であって、
ラクトースはα－Ｌ－フコシダーゼによって単糖類であるグルコース及びガラクトースに分解され、
重合度２～４のマルトオリゴ糖はα－Ｌ－フコシダーゼによって分解され、基質で用いられるマルトオリゴ糖より高い重合度のマルトオリゴ糖が生成する、
生産方法。

【請求項7】

反応は、３０～４０℃、ｐＨ６～８、３０分～４８時間の条件で行うことを特徴とする、請求項６に記載の単糖類又はマルトオリゴ糖の生産方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、α－及びβ－１，４－グリコシド結合を全て切断する酵素の用途に関する。

【背景技術】

【0002】

α－Ｌ－フコシダーゼ（３．２．１．５１）は、相異なる類型のフコシル化されたオリゴ糖及びフコグリココンジュゲートの非還元末端からα－連結されたＬ－フコシル残基の加水分解を触媒し得るエキソグリコシル加水分解酵素である。酵素が触媒作用をする反応の種類と基質に対する特異性によってフコシダーゼは、フコース及びガラクトースの間のα－１，２結合を切断するα－１，２－Ｌ－フコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．６３）、フコース及びＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の間のα－１，３結合を切断するα－１，３－フコシダーゼ（３．２．１．１１１）、及びフコースとガラクトースの間のα－１，２結合及びフコースとＧｌｃＮＡｃの間のα－１，３／４／６結合のような多様な範疇の結合を切断し得る特異性が低いα－Ｌ－フコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．５１）に分類する。炭水化物－活性酵素（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺｙｍｅｓ（ＣＡＺｙ））データベースの分類によると（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ－Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．ｈｔｍｌ）、α－Ｌ－フコシダーゼは、互いに加水分解反応の触媒に用いられたメカニズムが相異なるＧＨファミリ２９（ＧＨ２９）及び９５（ＧＨ９５）に属する。ＧＨ９５のα－Ｌ－フコシダーゼは、特に、直接置換（反転）メカニズムを通じて多様なオリゴ糖と糖タンパク質の糖鎖から発見されるα－１，２フコシル結合を加水分解する。反対に、ＧＨ２９のα－Ｌ－フコシダーゼにより媒介される加水分解反応は、生成された産物で基質アノマー中心の配列が維持される位置で古典的なコシュランド二重－置換メカニズムを通じて行われる。特に、ＧＨ２９の保有酵素は、加水分解反応だけでなく、トランスグリコシル化、すなわち、切断されたグリコシド残基の最終受容体が水と他のヒドロキシ基－保有分子の反応を触媒することができる。最近、ＧＨ２９は、基質特異性及び配列相同性に基礎して二つのサブファミリ、ＧＨサブファミリ２９Ａ及び２９Ｂに分類した。ＧＨサブファミリ２９Ａは、α－Ｌ－フコシダーゼを含み、ｐ－ニトロフェニル－α－Ｌ－フコピラノシド（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－α－Ｌ－ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃ）のような合成基質に作用することができ、フコシルオリゴ糖に対する加水分解能力が制限的である。ＧＨファミリ２９Ｂは、α－Ｌ－フコシダーゼを含み、非還元性末端に分枝型ガラクトース残基を有するα－１，３／４フコシル結合に対してより位置特異的であり、ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃを実質的に加水分解できない。

【0003】

α－Ｌ－フコシダーゼは、細菌、真菌、植物、海洋無脊椎動物及び哺乳動物を含む広範囲な生物体から分離された。最近、α－Ｌ－フコシダーゼは、クローニングされてビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）及びラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）を含んでいくつかの腸内細菌から特性が糾明された。また、一部の腸内微生物によるα－Ｌ－フコシダーゼ及びフコシルグリカンの分解の間の関係が報告された。現在まで、すべての報告されたα－Ｌ－フコシダーゼは、オリゴ糖又はそれらのコンジュゲートの末端フコシル結合の除去を触媒するが、非－フコシル化された基質を加水分解する能力は報告されたことがなかった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的は、二重グリコシド加水分解活性を有するビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）由来の新規なフコシダーゼの用途を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

前記目的を達成するために、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むα－Ｌ－フコシダーゼ（α－Ｌ－ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ）；及びラクトース及び重合度（ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ）２以上のマルトオリゴ糖からなる群より選択された一つ以上の基質を含む単糖類又はマルトオリゴ糖生産用組成物を提供する。

【0006】

また、本発明は、単糖類又はマルトオリゴ糖を生産するためのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むα－Ｌ－フコシダーゼ（α－Ｌ－ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ）の用途を提供する。

【0007】

また、本発明は、ラクトース及び重合度（ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ）２以上のマルトオリゴ糖からなる群より選択された一つ以上の基質とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むα－Ｌ－フコシダーゼ（α－Ｌ－ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を反応させる段階；及び

【0008】

前記反応の生成物から単糖類及び基質で用いられるマルトオリゴ糖より高い重合度のマルトオリゴ糖を回収する段階を含む単糖類又はマルトオリゴ糖の生産方法を提供する。

【発明の効果】

【0009】

本発明のα－Ｌ－フコシダーゼは、α－１，４－グルコシダーゼ及びβ－１，４－ガラクトシダーゼ活性を有するため、非－フコシル化された糖質から単糖類であるグルコース及び／又はガラクトースを生産し、前記酵素は、トランスグリコシル化活性を有するため、基質で用いられるマルトオリゴ糖より高い重合度を有するマルトオリゴ糖を生産して、食品産業において高付加価値の新素材開発に適用し得る。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いたＶｅＦＵＣの発現を示す。レーン１は、タンパク質マーカー、レーン２は、Ｈｉｓ－ｔａｇ親和性クロマトグラフィーにより精製されたＶｅＦＵＣである。

【0011】

【図2】ＶｅＦＵＣの酵素活性を示す。反応は、基質としてｐＮＰ－α－Ｌ－ｆｕｃ、ｐＮＰ－α－Ｄ－Ｇｌｃ、ｐＮＰ－β－Ｄ－Ｇｌｃ、ｐＮＰ－α－Ｄ－Ｇａｌ、ｐＮＰ－β－Ｄ－Ｇａｌを用いて３０３Ｋで６０分間行った。データは、３繰り返しの平均±標準偏差を示す。

【0012】

【図3】ＶｅＦＵＣの基質特異性を示す。ＶｅＦＵＣをラクトース、ラミナリビオース、スクロース、マルトース及びセロビオースを含んでバイオマス－由来基質とともに３０３Ｋで３０分間インキュベーションして得た反応産物のＴＬＣ分析結果である。グルコース（Ｇｌｃ）及びガラクトース（Ｇａｌ）は、反応産物のためのマーカーで用いられた（Ｓｔｄ、標準物質；－、基質単独；＋、基質とＶｅＦＵＣの反応結果）。

【0013】

【図4】酵素反応のためのｐＨ及び温度の効果を示す。相違するｐＨで（Ａ）ｐＮＰ－α－Ｌ－ｆｕｃ、（Ｂ）ラクトース及び（Ｃ）マルトースと反応したＶｅＦＵＣの相対活性；相違する温度で（Ｄ）ｐＮＰ－α－Ｌ－ｆｕｃ、（Ｅ）ラクトース及び（Ｆ）マルトースと反応したＶｅＦＵＣの相対活性；（Ｇ）ｐＮＰ－α－Ｌ－ｆｕｃ、（Ｈ）ラクトース及び（Ｉ）マルトースを用いたＶｅＦＵＣの熱的安定性を決定するために、異なる温度で６０分間予備－インキュベーションされたＶｅＦＵＣの相対活性の測定結果である。データは、３繰り返しの平均±標準偏差を示す。

【0014】

【図5】基質としてラクトース（Ａ）及びマルトース（Ｂ）を用いたＶｅＦＵＣ酵素反応産物のＴＬＣ（左側）及びＨＰＬＣ（右側）の分析結果を示す。反応は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で３１３Ｋで１２０分間行った。グルコース（Ｇｌｃ）及びガラクトース（Ｇａｌ）は、反応産物のためのマーカーで用いた（Ｓｔｄ、標準物質；－、基質単独；＋、基質とＶｅＦＵＣの反応結果）。

【0015】

【図6】ＶｅＦＵＣのトランスグリコシル化活性を示す。マルトース（ＤＰ２）、マルトトリオース（ＤＰ３）及びマルトテトラオース（ＤＰ４）とＶｅＦＵＣの酵素反応産物は、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳにより分析された。反応は、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で３１３Ｋで６０分間行った。

【発明を実施するための形態】

【0016】

以下、本発明の構成を具体的に説明する。

【0017】

本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むα－Ｌ－フコシダーゼ（α－Ｌ－ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ）；及びラクトース及び重合度（ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ）２以上のマルトオリゴ糖からなる群より選択された一つ以上の基質を含む単糖類又はマルトオリゴ糖生産用組成物に関する。

【0018】

また、本発明は、単糖類又はマルトオリゴ糖を生産するためのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むα－Ｌ－フコシダーゼ（α－Ｌ－ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ）の用途を提供する。

【0019】

また、本発明は、ラクトース及び重合度（ｄｅｇｒｅｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ）２以上のマルトオリゴ糖からなる群より選択された一つ以上の基質とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を含むα－Ｌ－フコシダーゼ（α－Ｌ－ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を反応させる段階；及び

【0020】

前記反応の生成物から単糖類及び基質で用いられるマルトオリゴ糖より高い重合度のマルトオリゴ糖を回収する段階を含む単糖類又はマルトオリゴ糖の生産方法を提供する。

【0021】

本発明者らが海洋細菌ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）菌株ＥＪＹ３由来のα－Ｌ－フコシダーゼ、ＶｅＦＵＣをクローニングし、発現させて特性を糾明した結果、α－Ｌ－フコシダーゼは、α－１，４グルコシダーゼ及びβ－１，４ガラクトシダーゼ活性により非－フコシル化された基質を単糖類のグルコース及び／又はガラクトースに加水分解し得ることを最初に報告した。それだけでなく、前記酵素は、トランスグリコシル化活性を有しているため、基質より高い重合度のオリゴ糖を生成し得る。

【0022】

本発明の一具体例によると、前記α－Ｌ－フコシダーゼは、合成基質又は天然二糖類に対する加水分解活性を測定した結果、合成基質、例えば、ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃ、ｐＮＰ－α－Ｄ－Ｇｌｃ、ｐＮＰ－β－Ｄ－Ｇｌｃ、ｐＮＰ－α－Ｄ－Ｇａｌ及びｐＮＰ－β－Ｄ－ＧａｌのうちｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃ、ｐＮＰ－α－Ｄ－Ｇｌｃ、ｐＮＰ－β－Ｄ－Ｇａｌに対して高い相対活性を示すが、ｐＮＰ－α－Ｄ－Ｇａｌ及びｐＮＰ－β－Ｄ－Ｇｌｃに対しては活性を示さなかった。また、多様な類型のグリコシド結合を有する二糖類を基質として用いた場合、ラクトース（β－１，４－グリコシド結合）及びマルトース（α－１，４－グリコシド結合）は、ＶｅＦＵＣにより加水分解されるが、Ｄ－グルコースの２個の単位で構成されたα－１，２－グリコシド結合を有するスクロース、β－１，３－グリコシド結合を有するラミナリビオース及びβ－１，４－グリコシド結合のセロビオースを加水分解しなかった。したがって、前記α－Ｌ－フコシダーゼは、α－フコシダーゼ、α－１，４－グルコシダーゼ及びβ－１，４－ガラクトシダーゼ活性を有するが、α－ガラクトシダーゼ及びβ－グルコシダーゼ活性を有しないことが分かる。

【0023】

前記結果から、本発明のα－Ｌ－フコシダーゼは、基質として非還元末端の結合様式でβ－１，４－グリコシド結合を有するラクトースとα－１，４－グリコシド結合を有するマルトースを使用できることが分かる。

【0024】

また、酢酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、グリシン－ＮａＯＨなどのような緩衝溶液内の前記α－Ｌ－フコシダーゼの最適ｐＨは、緩衝溶液の種類によって変わり得るが、約ｐＨ４～８で６０％以上の酵素活性を示し、具体的に、約ｐＨ６～８で最も高い活性を示す。本発明の一具体例によると、ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃ、マルトース及びラクトースに対するＶｅＦＵＣの最も高い活性は、それぞれ１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ６．０、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液でｐＨ７．０及び１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液でｐＨ６．０で得た。

【0025】

前記α－Ｌ－フコシダーゼの酵素活性に対する最適温度は、３０～４０℃であり、より具体的に、約３０℃である。熱的安定性試験結果、α－Ｌ－フコシダーゼは、約３０℃以下の温度で安定したが、約３０℃より高い温度で相対活性は減少する。したがって、室温でも十分に酵素反応が可能なので、温度を高めるためのエネルギー消費がなくとも経済的に工程を行うことができるという長所がある。また、既存酵素に比べて相対的に低い温度での熱処理でも酵素を不活性化させ得る。

【0026】

前記α－Ｌ－フコシダーゼは、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）菌株ＥＪＹ３に由来したものであってもよいが、これに特に制限するものではない。

【0027】

また、α－Ｌ－フコシダーゼは、酵素のコーディング領域の前及び後の領域だけではなく、個別コーディング分節間の介在配列が含まれたポリペプチドを生産するのに連関されたＤＮＡ分節、すなわち、コーディング遺伝子を通じて転写及び翻訳され得る。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載した配列から転写及び翻訳され得るが、これに特に制限されるものではない。また、前記酵素の一つ以上の置換、欠損、転位、添加などの変異タンパク質として前記単糖類又はマルトオリゴ糖の加水分解活性を有するタンパク質も本発明の酵素の権利範囲に含まれ、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に開示されたアミノ酸配列と配列相同性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上及び９９％以上であるアミノ酸配列を含む。

【0028】

前記α－Ｌ－フコシダーゼは、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）菌株ＥＪＹ３培養物の上澄液から分離及び精製することができ、遺伝工学的組換え技術を用いてビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）菌株ＥＪＹ３以外の菌株又は人工的な化学的合成法などによって生産及び分離し得る。

【0029】

組換え技術を用いる場合、通常的な組換えタンパク質発現の容易さのために用いられる因子、例えば、抗生剤抵抗性遺伝子、親和性カラムクロマトグラフィーに用いられ得るレポータータンパク質又はペプチドを用いることができ、このような技術は、本願発明が属する技術分野の当業者であれば容易に実施可能な範疇に該当する。例えば、前記α－Ｌ－フコシダーゼをコーディングする遺伝子、すなわち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載した塩基配列を含む組換えベクターに形質転換された宿主細胞又はその培養物から収得され得る。前記宿主細胞で大腸菌を用いるが、これに制限するものではない。

【0030】

上述したように、本発明のα－Ｌ－フコシダーゼは、ラクトース及びマルトースを基質で用いて加水分解反応を通じて単糖類を分解産物として得ることができる。前記単糖類は、グルコース及び／又はガラクトースであってもよい。本発明の一具体例によると、ラクトースを基質で用いる場合、グルコース及びガラクトースが分解産物として生成される。マルトースを基質で用いる場合、α－グルコシダーゼ及びトランスグリコシル化活性によりグルコースと基質より高い重合度のマルトオリゴ糖が生成される。

【0031】

本発明の一具体例によると、前記α－Ｌ－フコシダーゼのトランスグリコシル化活性を調査するために、マルトース（ＤＰ２）、マルトトリオース（ＤＰ３）、マルトテトラオース（ＤＰ）を基質として反応させた結果、各基質に対して高い重合度を有するマルトオリゴ糖が生成され、マルトースの場合、グルコースに加水分解し、ＤＰ３、ＤＰ４、ＤＰ５のマルトオリゴ糖が生成される。アルトトリオース及びマルトテトラオースを基質で用いる場合、それぞれＤＰ８及びＤＰ９までのマルトオリゴ糖が生成される。

【0032】

したがって、前記α－Ｌ－フコシダーゼは、ラクトース及び重合度（ｄｅｇｒｅｅｓｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ）２以上のマルトオリゴ糖を基質で用いることができる。好ましくは、前記マルトオリゴ糖は、重合度２～４のマルトオリゴ糖であってもよい。また、基質で重合度２～４のマルトオリゴ糖を用いる場合、分解産物は、基質より高い重合度のマルトオリゴ糖が生成され得る。

【0033】

前記α－Ｌ－フコシダーゼと基質の反応は、３０～４０℃、ｐＨ６～８、３０分～４８時間の条件で反応させて生産され得る。より具体的に、３０～３５℃、ｐＨ６～８、３０分～２時間の条件で反応させて生産され得る。

【0034】

前記α－Ｌ－フコシダーゼの分解産物は、吸着クロマトグラフィーであるシリカゲルクロマトグラフィー及びゲル透過クロマトグラフィーであるバイオゲルＰ２クロマトグラフィーを順次に実施して約９５％の高純度の単糖類又はマルトオリゴ糖を分離精製することができる。

【0035】

本明細書で「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本願で相互交換可能に用いられる。

【0036】

本発明でポリペプチドがまた他の配列に対して特定割合（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％）の配列相同性を有するということは、前記二つの配列を整列させるとき、前記配列の比較時に前記割合のアミノ酸残基が同一であることを意味する。前記整列及び百分率相同性又は同一性は、当業界で公知となった任意の適当なソフトウェアプログラム、例えば、文献［ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴ°ＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌなど（ｅｄｓ）１９８７ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０ ｓｅｃｔｉｏｎ ７．７．１８）］に記載されたものなどを用いて決定し得る。好ましいプログラムとしては、ＧＣＧ Ｐｉｌｅｕｐプログラム、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎなど１９８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：２４４４－２４４８）、及びＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌなど、Ｎａｔｌ．Ｃｅｎｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｉｎｆ．、Ｎａｔｌ Ｌｉｂ．Ｍｅｄ．（ＮＣＩＢ ＮＬＭ ＮＩＨ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ及びＡｌｔｓｃｈｕｌなど１９９７ ＮＡＲ ２５：３３８９－３４０２）がある。また他の好ましい整列プログラムは、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＰＡ）であって、好ましくは、基本媒介変数を用いるものである。使用可能なまた他の配列ソフトウェアプログラムは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で利用可能なＴＦＡＳＴＡ Ｄａｔａ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍである。

【0037】

本発明で細胞、核酸、タンパク質又はベクターと関連して用いられるとき、用語「組換え」は、前記細胞、核酸、タンパク質又はベクターが異種核酸又はタンパク質の導入又は本来的核酸又はタンパク質の変更によって変形されたか、又は前記細胞がこのように変形された細胞に由来したことを示す。すなわち、例えば、組換え細胞は、前記細胞の本来的（非組換え）形態内では発見されない遺伝子を発現するか、又は、或いは発現時に非正常的に発現するか又は全く発現されない本来的遺伝子を発現する。

【0038】

本明細書で「核酸」は、一本鎖は二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの化学的変形体を包括する。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本願で相互交換可能に用いられ得る。遺伝暗号が縮退されているため、特定アミノ酸をエンコードするために一つ以上のコドンを用いることができ、本発明は、特定アミノ酸配列をエンコードするポリヌクレオチドを包括する。

【0039】

核酸配列を細胞内に挿入する用語「導入」は、「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」又は「形質転換」又は「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」を意味し、核酸配列の真核又は原核細胞内への統合に対する言及が含まれ、このとき、前記核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体又はミトコンドリアＤＮＡ）内に統合され、自律レプリコンに転換されるか、又は一時的に発現される。

【0040】

以下、本発明による実施例を通じて本発明をより詳しく説明するが、本発明の範囲が下記提示された実施例によって制限されるものではない。
＜発明を実施するための形態＞

【0041】

＜実施例１＞ＶｅＦＵＣクローニング、発現及び特性の糾明

【0042】

（ＶｅＦＵＣのクローニング及び発現）

【0043】

ＶｅＦＵＣを暗号化する遺伝子のクローニングのためにビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）菌株ＥＪＹ３のゲノムＤＮＡを次のように製造した：ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）菌株ＥＪＹ３を２３ｇ／Ｌ Ｉｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ Ｓｅａ Ｓａｌｔ（Ａｑｕａｒｉｕｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｅｎｔｏｒ、ＯＨ、ＵＳＡ）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２ｇ／Ｌグルコース、１ｇ／Ｌ酵母抽出物及び０．５ｇ／Ｌアンモニウムクロリドで構成された最小培地で３０３Ｋ及び２００ｒｐｍで１８時間の間培養した。ゲノムＤＮＡは、製造社のプロトコルによってＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて培養物から抽出した。標的遺伝子、ＶＥＪＹ３＿１１３１０（ＵｎｉＰｒｏｔ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．Ｈ２ＩＨＷ９．１）は、次のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。下線部分は、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位である；

【0044】

５'－ＧＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＣＡＧＣＡＧＧＴＧ－３'（正方向：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）；

【0045】

５'－ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＧＣＣＡＡＧＣＧＧＧＧＧＣＣＣＡＡＣＴＧ－３'（逆方向：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）

【0046】

６個のヒスチジンを暗号化する配列を逆方向プライマーに添加してＨｉｓＴｒａｐｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて組換えタンパク質を精製した。ＰＣＲ産物にＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を処理し、その後、ｐＥＴ－２１ａ ｐｌａｓｍｉｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にライゲーションしてｐＥＴ２１ａ－ＶｅＦＵＣプラスミドを構築した。

【0047】

（ＶｅＦＵＣの発現及び精製）

【0048】

ｐＥＴ２１ａ－ＶｅＦＵＣプラスミドが搭載された組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）を３１０Ｋ及び２００ｒｐｍで１００ｍｇＬ^－１のアンピシリンを含むＬｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロスで、６００ｎｍで測定された培養ブロスの吸光度が０．６に到逹するまで成長させた。酵素の過発現は、２８９Ｋで１６時間の間１ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）により誘導された。４，０００ Ｘ ｇで１５分間遠心分離して細胞を回収し、超音波で破壊した後、１６，０００ Ｘ ｇで１時間の間遠心分離した。無細胞粗酵素（ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ）は、Ｎｉ－ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＮＴＡ） ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて精製した。溶出は、３００ｍＭイミダゾールとともに１ｍＬの溶出バッファーで行った。精製された組換えタンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｕｎｉｔ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｃｕｔｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｏｆ ５０，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて濃縮した。濃縮された酵素溶液は、ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＢＣＡ）タンパク質分析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）及び１２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動で分析して標的タンパク質の濃度、サイズ及び純度を測定した。

【0049】

（ＶｅＦＵＣの酵素活性の測定）

【0050】

ＶｅＦＵＣの酵素活性を測定するために、４ｎｍｏｌのＶｅＦＵＣを１００μｌの１０ｍＭ合成基質、例えば、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－α－Ｌ－ｆｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃ、α－フコシダーゼ分析用基質）、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－α－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ｐＮＰ－α－ＤＧｌｃ、α－グルコシダーゼ分析用基質）、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ｐＮＰ－β－Ｄ－Ｇｌｃ、β－グルコシダーゼ分析用基質）、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－α－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ｐＮＰ－α－Ｄ－Ｇａｌ、α－ガラクトシダーゼ分析用基質）、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－β－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ｐＮＰ－β－Ｄ－Ｇａｌ、β－ガラクトシダーゼ分析用基質）（全てＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入）とともに３０３Ｋで６０分間インキュベーションした。５００μｌの１Ｍ炭酸ナトリウムを添加して反応を終結し、反応混合物の吸光度は、４０５ｎｍで分光光度法によって定量した。１ユニット（Ｕ）のＶｅＦＵＣは、上述した酵素反応条件下で１分当たり１μｍｏｌのｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ（ｐＮＰ）を生産するために必要な酵素の量で定義した。

【0051】

また、ＶｅＦＵＣの酵素活性を試すために、スクロース（α－１，２グリコシド結合を有するＤ－グルコース及びＤ－フルクトース単位で形成される）、マルトース（α－１，４グリコシド結合を有する二つのＤ－グルコースで形成される）（全てＳｉｇｍａから購入）、ラミナリビオース（β－１，３グリコシド結合で二つのＤ－グルコースで形成される）（Ｍｅｇａｚｙｍｅ、Ｗｉｃｋｌｏｗ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、ラクトース（β－１，４グリコシド結合を有するＤ－ガラクトース及びＤ－グルコース単位で形成される）及びセロビオース（β－１，４グリコシド結合を有するＤ－グルコースの二つの単位で形成される）を含んでバイオマス－由来の二糖類を試した。酵素反応のために、４ｎｍｏｌのＶｅＦＵＣを３０ｍＭの各基質を含む１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）と３００Ｋで６０分間インキュベーションした。

【0052】

ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃに対するＶｅＦＵＣのキネティックパラメーターを測定するために、上述した同一の条件下で０．１０９～０．８７５ｍＭ範囲のｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃの濃度別酵素反応を行った。ＶｅＦＵＣの酵素キネティックパラメーター、Ｖ_ｍａｘ、Ｋ_ｍ及びｋ_ｃａｔは、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋプロットから測定された。

【0053】

（ＴＬＣ及びＨＰＬＣによる酵素反応産物の分析）

【0054】

ＶｅＦＵＣの酵素反応産物を分析するために、ＴＬＣ及びＨＰＬＣを用いた。ＴＬＣ分析のために、１μｌの反応混合物をシリカゲル６０プレート（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にローディングし、このとき、ｎ－ブタノール／酢酸／水（３：２：２の体積比）で構成された移動相を用い、エタノールのうち１０％（ｖ／ｖ）硫酸溶液を用いて４０３Ｋで５分間ＴＬＣプレートを加熱して可視化した。

【0055】

また、反応産物は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ－８７Ｈカラム及びｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ、ＵＳＡ）が装着されたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分析した。ＨＰＬＣ分析は、移動相で５ｍＭ硫酸を用いて３３８Ｋで０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速で行った。

【0056】

（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ－ｔａｎｄｅｍ ｔｉｍｅ ｏｆ ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）による酵素反応産物の分析）

【0057】

ＶｅＦＵＣのトラスグリコシル化活性を測定するために、４ｎｍｏｌのＶｅＦＵＣを基質として３０ｍＭのマルトース、マルトトリオース（α－１，４グリコシド結合を有する３個のＤ－グルコース単位で形成される）、又はマルトテトラオース（α－１，４グリコシド結合を有する４個のＤ－グルコース単位で形成される）とインキュベーションした。反応混合物は、ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳにより分析された。サンプルの製造のために、反応産物を水に溶かし、１μｌの可溶化された反応産物をステンレススチールターゲットプレートに点滴してから、０．３μｌの１０ｍＭ ＮａＣｌ及び５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中の５０ｇ／Ｌの２，５－ジヒドロキシ安息香酸０．５μｌを添加した。スポットは、真空下で速く乾燥させて均一に結晶化されるようにした。サンプルは、上述したようにＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳにより分析された。原始ＭＳデータは、ＦｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて加工した。全てのＭＳピークは、デコンボリューションし、サンプルから全ての中性質量のリストが生成された。存在比は、質量スペクトラムのピーク強度で示した。

【0058】

（ＶｅＦＵＣ酵素の特性糾明）

【0059】

ＶｅＦＵＣ活性のための最適ｐＨを測定するために、４ｎｍｏｌのＶｅＦＵＣを多様なｐＨの緩衝溶液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０～６．０）、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０～９．０）及び１０ｍＭ ｇｌｙｃｉｎｅ－ＮａＯＨ（ｐＨ９．０～１０．０））で１０ｍＭ ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃ、１０ｍＭラクトース及び１０ｍＭマルトースのそれぞれと３０３Ｋで１０分間インキュベーションした。

【0060】

ＶｅＦＵＣの酵素活性のための最適温度を測定するために、４ｎｍｏｌのＶｅＦＵＣを１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で１０ｍＭ ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃ、１０ｍＭラクトース及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）でそれぞれ１０ｍＭマルトースと２９３Ｋ～３４３Ｋの温度範囲で３０分間インキュベーションした。

【0061】

ＶｅＦＵＣの熱的安定性を測定するために、４ｎｍｏｌのＶｅＦＵＣを１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で１０ｍＭ ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃ、１０ｍＭラクトース及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ７．０）でそれぞれ１０ｍＭマルトースとの酵素反応前に２９３Ｋ～３４３Ｋの多様な温度範囲で１時間の間予めインキュベーションした。反応混合物を沸いている水で１分間インキュベーションすることで酵素反応を終結した。反応混合物は、ＨＰＬＣで分析した。

【0062】

＜実験例１＞ＶｅＦＵＣの酵素活性及び基質特異性

【0063】

ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）菌株ＥＪＹ３由来のＶｅＦＵＣ、α－Ｌ－フコシダーゼの酵素活性を特性糾明した。そのために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ）菌株でＶｅＦＵＣを発現させ、ＶｅＦＵＣの分子量は、それらの理論的な質量値、６９．９ｋＤａに相応した（図１）。合成基質、天然二糖類を含んで基質別に酵素分析を行った結果、ＶｅＦＵＣは、独特で、且つ従来報告されたことのない活性を示す新規なα－Ｌ－フコシダーゼであると確認された。

【0064】

ＶｅＦＵＣの酵素活性を測定するために、合成基質、例えば、ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃ、ｐＮＰ－α－Ｄ－Ｇｌｃ、ｐＮＰ－β－Ｄ－Ｇｌｃ、ｐＮＰ－α－Ｄ－Ｇａｌ及びｐＮＰ－β－Ｄ－Ｇａｌを酵素反応に用いた。この部類の化合物は、通常、グリコシダーゼ活性及び特異性の分析に用いられ、ｐ－ニトロフェニル（ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ、ｐＮＰ）基は、優れた離脱基として作用し、分光法により容易に定量化され得る。ＶｅＦＵＣは、ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃに対して最も高い活性を示し、また、ｐＮＰ－α－Ｄ－Ｇｌｃを加水分解して４１．５％の相対活性を示し、ｐＮＰ－β－Ｄ－Ｇａｌに対しては、６５．３％の相対活性を示した（図２）。しかし、ＶｅＦＵＣは、ｐＮＰ－α－Ｄ－Ｇａｌ及びｐＮＰ－β－Ｄ－Ｇｌｃに対して活性を示さなかった。

【0065】

ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃに対するＶｅＦＵＣのキネティックパラメーターを測定するために、基質濃度を異にして１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ６．０）で３１３Ｋで酵素反応を行った。ＶｅＦＵＣのキネティックパラメーターは、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋ ｐｌｏｔを用いて測定した。ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃに対するＶｅＦＵＣのＶ_ｍａｘ、Ｋ_ｍ及びｋ_ｃａｔ値は、それぞれ２４．８±０．９Ｕｍｇ^―１ｐｒｏｔｅｉｎ、６．３４±０．４８ｍＭ及び４．８１±１．８ｓ^－１であった。ＶｅＦＵＣに対する触媒定数は、他の特性が糾明された細菌性フコシダーゼの正常範囲内にあった（表１）。

【0066】

【表1】

【表2】

【0067】

また、多様な類型のグリコシド結合を有する１０ｍＭのいくつかの二糖類と酵素反応を行った。二糖類グループのうちラクトース（β－１，４－グリコシド結合）及びマルトース（α－１，４－グリコシド結合）は、ＶｅＦＵＣにより加水分解された（図３）。しかし、ＶｅＦＵＣは、Ｄ－グルコースの２個の単位で構成されたα－１，２－グリコシド結合を有するスクロース、β－１，３－グリコシド結合を有するラミナリビオース及びβ－１，４－グリコシド結合のセロビオースを加水分解しなかった。これら結果は、ＶｅＦＵＣがα－フコシダーゼ、α－１，４－グルコシダーゼ及びβ－１，４－ガラクトシダーゼ活性を有するが、α－ガラクトシダーゼ及びβ－グルコシダーゼ活性を有しないことを示唆する。

【0068】

＜実験例２＞ＶｅＦＵＣの特性糾明

【0069】

ＶｅＦＵＣの酵素活性に対するｐＨ及び温度の効果を試すために、１０ｍＭ ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃ、１０ｍＭラクトース及び１０ｍＭマルトースを４ｎｍｏｌのＶｅＦＵＣと多様なｐＨ（ｐＨ４．０－１０．０）及び温度（２９３－３４３Ｋ）でインキュベーションした。

【0070】

ｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃ、マルトース及びラクトースに対するＶｅＦＵＣの最も高い活性は、それぞれ１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝溶液でｐＨ６．０、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液でｐＨ７．０及び１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝溶液でｐＨ６．０として得た（図４の（ａ）－（ｃ））。ＶｅＦＵＣ酵素活性に対する最適温度は、全ての基質に対して約３１３Ｋとなることが測定された（図４の（ｄ）－（ｆ））。熱的安定性試験での結果によると、ＶｅＦＵＣは、６０分間予備－インキュベーションした後、３０３Ｋ以下の温度で安定したが、３０３Ｋより高い温度で予備－インキュベーションした後に相対活性は減少した（図４の（ｇ）－（ｉ））。

【0071】

＜実験例３＞ＶｅＦＵＣの作用モード

【0072】

最適化された反応条件でラクトース及びマルトースとインキュベーションされたＶｅＦＵＣの反応産物をＴＬＣ及びＨＰＬＣにより分析した。ラクトースを基質で用いる場合、グルコース及びガラクトースが生成された（図５の（ａ））。これら結果は、ＶｅＦＵＣがβ－ガラクトシダーゼ活性によりラクトースのβ－１，４－グリコシド結合を加水分解することを示唆する。マルトースを基質で用いる場合、α－グルコシダーゼ及びトランスグリコシル化活性によってそれぞれグルコースと基質より高い重合度が形成された（図５の（ｂ））。今まで、ＶｅＦＵＣは、α－１，４グルコシダーゼ及びβ－１，４ガラクトシダーゼ活性によりフコシル化されないα－及びβ－グリコシド結合を加水分解し得る二重触媒活性を示す最初の酵素である。

【0073】

ＶｅＦＵＣのトランスグリコシル化活性を調査するために、マルトース（ＤＰ２）、マルトトリオース（ＤＰ３）又はマルトテトラオース（ＤＰ４）とインキュベーションされたＶｅＦＵＣの反応混合物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳにより分析した。基質としてＤＰ２、ＤＰ３及びＤＰ４をそれぞれ用いた全ての反応混合物で基質より高い重合度を有するオリゴ糖が検出された（図６）。基質でマルトースを用いて得た反応産物は、ＶｅＦＵＣが一次的にマルトースをグルコース（ＤＰ１、１７６．９ｍ／ｚ）に加水分解し、ＤＰ５（ＤＰ３、５２７．１ｍ／ｚ；ＤＰ４、６８９．２ｍ／ｚ；ＤＰ５、８５１．３ｍ／ｚ）までの範囲に至るオリゴ糖を形成することを示した。マルトトリオース及びマルトテトラオースを基質で用いる場合、ＶｅＦＵＣは、それぞれＤＰ８及びＤＰ９までのオリゴ糖を形成した（図６）。

【0074】

細菌及び真核生物から発見された多くの代表的なＧＨ２９α－Ｌ－フコシダーゼは、相異なる効率でトランスフコシル化反応を触媒する能力を有することを示した。今まで、大部分のトランスフコシル化は、フコシルドナーとしてｐＮＰ－α－Ｌ－Ｆｕｃを用いた。特に、ＶｅＦＵＣは、α－１，４－オリゴ糖に対して高いトランスグリコシル化活性を示した（図６）。この結果によると、基質の非還元末端から放出されたグルコースは、α－１，４位置選択性を有する基質に伝達される。したがって、基質であるマルトースは、ドナー及び受容体（自己－縮合）の双方として提供し得るので、基質より高い重合度を有するオリゴ糖を形成することができる。ＶｅＦＵＣのトランスグリコシル化活性から生成されたマルトオリゴ糖は、弱い甘味、相対的に低い浸透圧、高い水分－保有能力及び適当な粘度、そして結晶化を抑制してパンの老化（ｓｔａｌｉｎｇ）を遅延させる能力によって食品産業において潜在的適用が可能な高付加価値の機能性オリゴ糖である。

【産業上の利用可能性】

【0075】

本発明は、高い重合度を有するマルトオリゴ糖を効率的に生産して食品産業において高付加価値の新素材開発に適用し得る。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図4H】

【図4I】

【図5】

【図6】

【配列表】

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