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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-13
(45)【発行日】2023-09-22
(54)【発明の名称】ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法
(51)【国際特許分類】
C07H 19/207 20060101AFI20230914BHJP
C07H 21/02 20060101ALI20230914BHJP
C12Q 1/52 20060101ALI20230914BHJP
C12Q 1/58 20060101ALI20230914BHJP
C12Q 1/32 20060101ALI20230914BHJP
【ＦＩ】
C07H19/207
C07H21/02
C12Q1/52
C12Q1/58
C12Q1/32
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2018160136
(22)【出願日】2018-08-29
(65)【公開番号】P2020033288
(43)【公開日】2020-03-05
【審査請求日】2021-07-28
(73)【特許権者】
【識別番号】000131474
【氏名又は名称】株式会社シノテスト
(72)【発明者】
【氏名】和田 祥太朗
【審査官】早乙女 智美
(56)【参考文献】
【文献】特開２００４－１０５０２４（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０２８６３４９５（ＣＮ，Ａ）
【文献】独国特許出願公開第１０２００８０６１８６６（ＤＥ，Ａ１）
【文献】米国特許第０５８０４４０３（ＵＳ，Ａ）
【文献】特開昭５５－０４２５９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０４－２２９１９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表平１０－５１３０６３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｈ
Ｃ１２Ｑ１／００－１／５８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｐＨ６．２～ｐＨ７．８の水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共に、カリウムイオンの水酸化物又は塩、カルシウムイオンの水酸化物又は塩、ナトリウムイオンの水酸化物又は塩、アルミニウムイオンの水酸化物又は塩、リチウムイオンの水酸化物又は塩、ベリリウムイオンの水酸化物又は塩、マグネシウムイオンの水酸化物又は塩、アンモニウムイオンの水酸化物又は塩、グアジニウムイオンの水酸化物又は塩、アルギニウムイオンの水酸化物又は塩、ベンザルコニウムの水酸化物又は塩、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインの水酸化物又は塩、及びカルニチンの水酸化物又は塩からなる群から選ばれるものを共存させることを特徴とする、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法に関するものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
本発明は、臨床検査、臨床病理学及び医学などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【0002】
ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド［還元型］）及びＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸［還元型］）は生体内の電子伝達体である。
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ（以下総称して「ＮＡＤＨ類」ということがある。）は、種々の脱水素酵素の補酵素として働く。
ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ（以下総称して「ＮＡＤＨ類」ということがある。）は、種々の脱水素酵素の補酵素として働く。
【0003】
例えば、血清又は血漿中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）［ＧＯＴ］の活性を測定する方法として、次の方法が知られている。
検体中のＡＳＴは、Ｌ－アスパラギン酸及びα－ケトグルタル酸を基質として接触させることにより、オキサロ酢酸とＬ－グルタミン酸を生成する。
このオキサロ酢酸は、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤ）の作用によりＬ－リンゴ酸に変化し、同時に補酵素としてのＮＡＤＨはＮＡＤ＋［酸化型］に変化する。
ＮＡＤＨは、３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定することによりＡＳＴ活性値を求めることができる。
検体中のＡＳＴは、Ｌ－アスパラギン酸及びα－ケトグルタル酸を基質として接触させることにより、オキサロ酢酸とＬ－グルタミン酸を生成する。
このオキサロ酢酸は、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤ）の作用によりＬ－リンゴ酸に変化し、同時に補酵素としてのＮＡＤＨはＮＡＤ＋［酸化型］に変化する。
ＮＡＤＨは、３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定することによりＡＳＴ活性値を求めることができる。
【0004】
しかしながら、ＮＡＤＨ類は水溶液中において、その安定性が悪いことが知られており、特に、高ｐＨ域に比べて、中性域から酸性域において特に安定性が悪いことが知られていた。
【0005】
よって、ＮＡＤＨ類は、高ｐＨ域において存在させることが一般的であった。
【0006】
例えば、基準試薬溶液のｐＨが少なくとも約７．９の塩基性範囲にまで上昇するように強塩基を含有させる条件下で、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの基準試薬溶液の安定寿命を延長する方法において、アミン塩基、強塩基、カチオンが正の１価をもつと考えられる塩基、カチオンが正の２価をもつと考えられる塩基、及び強塩基と弱酸との反応で生じる塩の塩基性溶液からなる群から選ばれる１種以上のものを含有させることを特徴とする方法が提案された（特許文献１参照。）。
【0007】
また、ＮＡＤＨが補酵素となる酵素反応に直接的又は間接的に影響を受ける、生物学的試料の成分を決定するためのキットであって、ａ）決定しようとする成分により影響を受ける反応系のための共反応物を含有する一試薬、並びにｂ）追加の試薬として、ＮＡＤＨを約１～４ミリモルの濃度及びアルカリ金属若しくはアンモニウムカーボネート／ビカーボネート緩衝剤を約２～１５ミリモルの濃度で含み、約９．５～１１．０のｐＨの水溶液、からなるキットが提案された（特許文献２参照。）。
【0008】
更に、水素転移酵素の補酵素の安定化された水溶液であって、使用溶液が少なくとも８．５のｐＨ値を有し、酸化型もしくは還元型のＮＡＤ、ＮＡＤＰまたは適当な誘導体、並びに１．０～６０ｍＭの水溶性重金属塩を含む水溶液が提案された（特許文献３参照。）。
【0009】
ところで、測定反応に使用する酵素は、その至適ｐＨが中性域にあるものが多く、その酵素の安定性も中性域において安定なものが多い。
【0010】
すなわち、多くの酵素にとって至的な中性域において、ＮＡＤＨ類を安定化する方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【文献】特開昭５５－４２５９９号公報
【文献】特開平４－２２９１９２号公報
【文献】特表平１０－５１３０６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
試料中の測定対象物質の測定において脱水素酵素等の補酵素等に用いられるＮＡＤＨ類は、高ｐＨ域では比較的安定であるものの、中性域ではその安定性は必ずしも良くないものであった。
しかしながら、測定反応に使用する酵素は、その至適ｐＨが中性域にあるものが多く、その酵素の安定性も中性域において安定なものが多いものであった。
しかしながら、測定反応に使用する酵素は、その至適ｐＨが中性域にあるものが多く、その酵素の安定性も中性域において安定なものが多いものであった。
【0013】
これに対して、本発明の課題は、中性域において、ＮＡＤＨ類を安定化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0014】
本発明者らは、中性域においてＮＡＤＨ類を安定化する方法について検討を重ねたところ、ＮＡＤＨ類と共にカチオン部位を有する物質を共存させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0015】
すなわち、本発明は、以下の発明よりなる。
ｐＨ６．２～ｐＨ７．８の水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共に、カリウムイオンの水酸化物又は塩、カルシウムイオンの水酸化物又は塩、ナトリウムイオンの水酸化物又は塩、アルミニウムイオンの水酸化物又は塩、リチウムイオンの水酸化物又は塩、ベリリウムイオンの水酸化物又は塩、マグネシウムイオンの水酸化物又は塩、アンモニウムイオンの水酸化物又は塩、グアジニウムイオンの水酸化物又は塩、アルギニウムイオンの水酸化物又は塩、ベンザルコニウムの水酸化物又は塩、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインの水酸化物又は塩、及びカルニチンの水酸化物又は塩からなる群から選ばれるものを共存させることを特徴とする、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法。
ｐＨ６．２～ｐＨ７．８の水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共に、カリウムイオンの水酸化物又は塩、カルシウムイオンの水酸化物又は塩、ナトリウムイオンの水酸化物又は塩、アルミニウムイオンの水酸化物又は塩、リチウムイオンの水酸化物又は塩、ベリリウムイオンの水酸化物又は塩、マグネシウムイオンの水酸化物又は塩、アンモニウムイオンの水酸化物又は塩、グアジニウムイオンの水酸化物又は塩、アルギニウムイオンの水酸化物又は塩、ベンザルコニウムの水酸化物又は塩、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインの水酸化物又は塩、及びカルニチンの水酸化物又は塩からなる群から選ばれるものを共存させることを特徴とする、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法。
【発明の効果】
【0016】
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法は、ｐＨ６．２～ｐＨ７．８の水溶液中において、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを長期間安定に保つことができるものである。
【0017】
すなわち、本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法は、測定反応に使用する酵素の至適ｐＨ及び安定性がある中性域でＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを長期間安定に保つことができるものである。
【発明を実施するための形態】
【0018】
１．総論
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法は、ｐＨ６．２～ｐＨ７．８の水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共にカチオン部位を有する物質を共存させることを特徴とするものである。
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法は、ｐＨ６．２～ｐＨ７．８の水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共にカチオン部位を有する物質を共存させることを特徴とするものである。
【0019】
そして、本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法は、ｐＨ６．２～ｐＨ７．８の水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共にカチオン部位を有する物質を共存させることにより、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを長期間安定に保つことができるものである。
【0020】
２．本発明におけるＮＡＤＨ類
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法におけるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨとしては、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨだけに限られず、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの類縁体や誘導体を含むものとする。
例えば、チオＮＡＤＨやチオＮＡＤＰＨも、本発明におけるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに含まれる。
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法におけるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨとしては、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨだけに限られず、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの類縁体や誘導体を含むものとする。
例えば、チオＮＡＤＨやチオＮＡＤＰＨも、本発明におけるＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに含まれる。
【0021】
また、ＮＡＤＨ類は、遊離の形態のものであってもよいが、塩の形態のものであってもよい。
塩の形態としては、例えば、第１族元素、又は第２族元素等との塩を挙げることができる。
塩の形態としては、例えば、第１族元素、又は第２族元素等との塩を挙げることができる。
【0022】
この場合、第１族元素としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、又はルビジウム等を挙げることができる。
【0023】
また、第２族元素としては、例えば、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、又はバリウム等を挙げることができる。
【0024】
塩の形態としては、第１族元素との塩が好ましく、ナトリウム塩又はカリウム塩がより好ましく、ナトリウム塩が特に好ましい。
【0025】
水溶液中において、ＮＡＤＨ類を存在させる場合の濃度については、特に限定はない。
極微量域から高濃度域まで、適応することができる。
極微量域から高濃度域まで、適応することができる。
【0026】
３．本発明におけるカチオン部位を有する物質
（１）総論
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法においては、カチオン部位を有する物質は、カチオン部位を有する物質であればよく、特に限定はない。
（１）総論
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法においては、カチオン部位を有する物質は、カチオン部位を有する物質であればよく、特に限定はない。
【0027】
（２）カチオン部位
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法において、カチオン部位は、カチオンからなる部位よりなるものであって、特に限定はない。
本発明のＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの安定化方法において、カチオン部位は、カチオンからなる部位よりなるものであって、特に限定はない。
【0028】
このカチオン部位としては、例えば、金属イオン、アンモニウムイオン、又はグアニジウムイオン等を挙げることができる。
【0029】
この金属イオンとしては、例えば、第１族元素、第２族元素、又はその他の金属等のイオンを挙げることができる。
【0030】
第１族元素としては、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、又はルビジウム等を挙げることができる。
【0031】
第２族元素としては、例えば、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、又はバリウム等を挙げることができる。
【0032】
その他の金属としては、例えば、アルミニウム、ガリウム、インジウム、又はゲルマニウム等を挙げることができる。
【0033】
カチオン部位としては、例えば、アンモニウムイオン、グアニジウムイオン、第１族元素のイオン、又は第２族元素のイオンが好ましい。
【0034】
（３）カチオン部位を有する物質
本発明において、カチオン部位を有する物質としては、特に限定はなく、カチオン部位を有する物質であればよい。
このカチオン部位を有する物質としては、例えば、カチオン部位の水酸化物、又はカチオン部位の塩等を挙げることができる。
本発明において、カチオン部位を有する物質としては、特に限定はなく、カチオン部位を有する物質であればよい。
このカチオン部位を有する物質としては、例えば、カチオン部位の水酸化物、又はカチオン部位の塩等を挙げることができる。
【0035】
このカチオン部位の塩としては、例えば、ハロゲンイオンとの塩、又は酸基との塩等を挙げることができる。
【0036】
ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、又はヨウ素イオン等を挙げることができる。
【0037】
酸基としては、例えば、硫酸基、塩酸基、又は硝酸基等を挙げることができる。
【0038】
カチオン部位を有する物質の具体例としては、例えば、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、塩化アルミニウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、臭化ナトリウム、塩化リチウム、硫酸ベリリウム、塩化マグネシウム、デシル硫酸ナトリウム、デキストラン硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ二ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、塩化アンモニウム、グアニジン塩酸塩、アルギニン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン、又はカルニチン等を挙げることができる。
【0039】
カチオン部位を有する物質としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化アルミニウム、塩化マグネシウム、グアニジン塩酸塩、アルギニン、又は塩化カリウム等が好ましい。
【0040】
水溶液中において、カチオン部位を有する物質の濃度の下限は、特に限定はないが、０．０１ｍＭ以上が好ましく、０．１ｍＭ以上がより好ましく、１ｍＭ以上が特に好ましい。
【0041】
また、水溶液中において、カチオン部位を有する物質の濃度の上限は、特に限定はないが、コスト等のことを考えると、１００００ｍＭ以下が好ましく、５０００ｍＭ以下がより好ましく、１０００ｍＭ以下が特に好ましい。
【0042】
（４）水溶液
本発明において、ｐＨ６．２～ｐＨ７．８の水溶液中には、このｐＨ域に緩衝能を有する公知の緩衝剤を含有させることが好ましい。
この緩衝剤としては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシル）アミノメタン、又は、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、若しくはＴＡＰＳ等のグッド緩衝剤等を挙げることができる。
その他に、この水溶液には、酵素、酵素の基質、酵素の安定化剤、又は酵素の活性化剤等を含有させてもよい。
本発明において、ｐＨ６．２～ｐＨ７．８の水溶液中には、このｐＨ域に緩衝能を有する公知の緩衝剤を含有させることが好ましい。
この緩衝剤としては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシル）アミノメタン、又は、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、若しくはＴＡＰＳ等のグッド緩衝剤等を挙げることができる。
その他に、この水溶液には、酵素、酵素の基質、酵素の安定化剤、又は酵素の活性化剤等を含有させてもよい。
【0043】
（５）測定試薬
本発明を、測定試薬に応用する場合の例を以下に示す。
本発明を、測定試薬に応用する場合の例を以下に示す。
【0044】
（ａ）アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）［ＧＯＴ］活性測定試薬
【0045】
（ｉ）第１試薬（酵素補酵素試液）［ｐＨ６．２～ｐＨ７．８］
Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム（例えば、１ｍＭ～３０００ｍＭ）
ＮＡＤＨ・２Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ～１ｍＭ）
カチオン部位を有する物質（例えば、０．０１ｍＭ～１００００ｍＭ）
リンゴ酸脱水素酵素（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム（例えば、１ｍＭ～３０００ｍＭ）
ＮＡＤＨ・２Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ～１ｍＭ）
カチオン部位を有する物質（例えば、０．０１ｍＭ～１００００ｍＭ）
リンゴ酸脱水素酵素（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
【0046】
（ｉｉ）第２試薬（α－ＫＧ液）［例えば、ｐＨ３．０～ｐＨ１１．０］
Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム（例えば、０ｍＭ～３０００ｍＭ）
α－ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ～５００ｍＭ）
Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム（例えば、０ｍＭ～３０００ｍＭ）
α－ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ～５００ｍＭ）
【0047】
（ｉｉｉ）測定原理
検体中のＡＳＴは、Ｌ－アスパラギン酸及びα－ケトグルタル酸を基質として接触させることにより、オキサロ酢酸とＬ－グルタミン酸を生成する。
このオキサロ酢酸は、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤ）の作用によりＬ－リンゴ酸に変化し、同時に補酵素としてのＮＡＤＨと水素イオンはＮＡＤ＋に変化する。
ＮＡＤＨは、３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定することによりＡＳＴ活性値を求めることができる。
検体中のＡＳＴは、Ｌ－アスパラギン酸及びα－ケトグルタル酸を基質として接触させることにより、オキサロ酢酸とＬ－グルタミン酸を生成する。
このオキサロ酢酸は、リンゴ酸脱水素酵素（ＭＤ）の作用によりＬ－リンゴ酸に変化し、同時に補酵素としてのＮＡＤＨと水素イオンはＮＡＤ＋に変化する。
ＮＡＤＨは、３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定することによりＡＳＴ活性値を求めることができる。
【0048】
（ｉｖ）自動分析装置を用いて測定する場合の測定例
検体５．７μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬３３μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中のＡＳＴ活性値を求める。
検体５．７μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬３３μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中のＡＳＴ活性値を求める。
【0049】
（ｂ）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）［ＧＰＴ］活性測定試薬
【0050】
（ｉ）第１試薬（酵素補酵素試液）［ｐＨ６．２～ｐＨ７．８］
Ｌ－アラニン（例えば、１ｍＭ～３０００ｍＭ）
ＮＡＤＨ・２Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ～１ｍＭ）
カチオン部位を有する物質（例えば、０．０１ｍＭ～１００００ｍＭ）
乳酸脱水素酵素（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
Ｌ－アラニン（例えば、１ｍＭ～３０００ｍＭ）
ＮＡＤＨ・２Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ～１ｍＭ）
カチオン部位を有する物質（例えば、０．０１ｍＭ～１００００ｍＭ）
乳酸脱水素酵素（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
【0051】
（ｉｉ）第２試薬（α－ＫＧ液）［例えば、ｐＨ３．０～ｐＨ１１．０］
Ｌ－アラニン（例えば、０ｍＭ～３０００ｍＭ）
α－ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ～５００ｍＭ）
Ｌ－アラニン（例えば、０ｍＭ～３０００ｍＭ）
α－ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ～５００ｍＭ）
【0052】
（ｉｉｉ）測定原理
検体中のＡＬＴは、Ｌ－アラニン及びα－ケトグルタル酸を基質としてピルビン酸とＬ－グルタミン酸を生成する。
このピルビン酸は乳酸脱水素酵素の作用によりＬ－乳酸に変化し、同時にＮＡＤＨと水素イオンはＮＡＤ＋に変わる。
ＮＡＤＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定してＡＬＴ活性値を求めることができる。
検体中のＡＬＴは、Ｌ－アラニン及びα－ケトグルタル酸を基質としてピルビン酸とＬ－グルタミン酸を生成する。
このピルビン酸は乳酸脱水素酵素の作用によりＬ－乳酸に変化し、同時にＮＡＤＨと水素イオンはＮＡＤ＋に変わる。
ＮＡＤＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定してＡＬＴ活性値を求めることができる。
【0053】
（ｉｖ）自動分析装置を用いて測定する場合の測定例
検体５．７μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬３３μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中のＡＬＴ活性値を求める。
検体５．７μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬３３μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中のＡＬＴ活性値を求める。
【0054】
（ｃ）尿素窒素（ＢＵＮ）測定試薬
（ｉ）第１試薬（酵素試液Ａ）［ｐＨ６．２～ｐＨ７．８］
ＮＡＤＰＨ・４Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ～１ｍＭ）
カチオン部位を有する物質（例えば、０．０１ｍＭ～１００００ｍＭ）
グルタミン酸脱水素酵素（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
α－ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ～５００ｍＭ）
（ｉ）第１試薬（酵素試液Ａ）［ｐＨ６．２～ｐＨ７．８］
ＮＡＤＰＨ・４Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ～１ｍＭ）
カチオン部位を有する物質（例えば、０．０１ｍＭ～１００００ｍＭ）
グルタミン酸脱水素酵素（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
α－ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ～５００ｍＭ）
【0055】
（ｉｉ）第２試薬（酵素試液Ｂ）［例えば、ｐＨ３．０～ｐＨ１１．０］
ウレアーゼ（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
α－ケトグルタル酸（例えば、０ｍＭ～５００ｍＭ）
ウレアーゼ（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
α－ケトグルタル酸（例えば、０ｍＭ～５００ｍＭ）
【0056】
（ｉｉｉ）測定原理
まず、アンモニアとα－ケトグルタル酸とＮＡＤＰＨと水素イオンをグルタミン酸脱水素酵素によりグルタミン酸とＮＡＤＰ＋と水に変換し、検体中の内因性のアンモニアを消去する。
この検体中の内因性のアンモニアを消去した後、検体中の尿素はウレアーゼの作用によりアンモニアと二酸化炭素に分解される。
このアンモニアとα－ケトグルタル酸はグルタミン酸脱水素酵素の作用によりグルタミン酸に変化し、同時にＮＡＤＰＨはＮＡＤＰ＋に変わる。
ＮＡＤＰＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定して尿素窒素値を求めることができる。
まず、アンモニアとα－ケトグルタル酸とＮＡＤＰＨと水素イオンをグルタミン酸脱水素酵素によりグルタミン酸とＮＡＤＰ＋と水に変換し、検体中の内因性のアンモニアを消去する。
この検体中の内因性のアンモニアを消去した後、検体中の尿素はウレアーゼの作用によりアンモニアと二酸化炭素に分解される。
このアンモニアとα－ケトグルタル酸はグルタミン酸脱水素酵素の作用によりグルタミン酸に変化し、同時にＮＡＤＰＨはＮＡＤＰ＋に変わる。
ＮＡＤＰＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定して尿素窒素値を求めることができる。
【0057】
（ｉｖ）自動分析装置を用いて測定する場合の測定例
検体１．７μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬２５μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＰＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中の尿素窒素値を求める。
検体１．７μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬２５μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＰＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中の尿素窒素値を求める。
【0058】
（ｄ）尿素窒素（ＵＮ）測定試薬［ＩＣＤＨ共存法］
（ｉ）第１試薬（酵素試液Ａ）［ｐＨ６．２～ｐＨ７．８］
グルタミン酸脱水素酵素（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
イソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）（例えば、１U／L～１０００００U／L）
Ｌ－イソクエン酸カリウム（例えば、０．１ｍＭ～１０００ｍＭ）
ＮＡＤＰＨ・４Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ～１ｍＭ）
カチオン部位を有する物質（例えば、０．０１ｍＭ～１００００ｍＭ）
α－ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ～５００ｍＭ）
（ｉ）第１試薬（酵素試液Ａ）［ｐＨ６．２～ｐＨ７．８］
グルタミン酸脱水素酵素（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
イソクエン酸脱水素酵素（ＩＣＤＨ）（例えば、１U／L～１０００００U／L）
Ｌ－イソクエン酸カリウム（例えば、０．１ｍＭ～１０００ｍＭ）
ＮＡＤＰＨ・４Ｎａ（例えば、０．０１ｍＭ～１ｍＭ）
カチオン部位を有する物質（例えば、０．０１ｍＭ～１００００ｍＭ）
α－ケトグルタル酸（例えば、１ｍＭ～５００ｍＭ）
【0059】
（ｉｉ）第２試薬（酵素試液Ｂ）［例えば、ｐＨ３．０～ｐＨ１１．０］
ウレアーゼ（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
α－ケトグルタル酸（例えば、０ｍＭ～５００ｍＭ）
ウレアーゼ（例えば、１００U／L～１０００００U／L）
α－ケトグルタル酸（例えば、０ｍＭ～５００ｍＭ）
【0060】
（ｉｉｉ）測定原理
まず、アンモニアとα－ケトグルタル酸とＮＡＤＰＨと水素イオンをグルタミン酸脱水素酵素によりグルタミン酸とＮＡＤＰ＋と水に変換し、検体中の内因性のアンモニアを消去する。
このとき生じたＮＡＤＰ＋はＬ－イソクエン酸と共にイソクエン酸脱水素酵素の作用により、ＮＡＤＰＨとα－ケトグルタル酸と二酸化炭素に変換される。
検体中の内因性のアンモニアを消去した後、検体中の尿素はウレアーゼの作用によりアンモニアと二酸化炭素に分解される。
このアンモニアとα－ケトグルタル酸はグルタミン酸脱水素酵素の作用によりグルタミン酸に変化し、同時にＮＡＤＰＨはＮＡＤＰ＋に変わる。
ＮＡＤＰＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定して尿素窒素値を求めることができる。
まず、アンモニアとα－ケトグルタル酸とＮＡＤＰＨと水素イオンをグルタミン酸脱水素酵素によりグルタミン酸とＮＡＤＰ＋と水に変換し、検体中の内因性のアンモニアを消去する。
このとき生じたＮＡＤＰ＋はＬ－イソクエン酸と共にイソクエン酸脱水素酵素の作用により、ＮＡＤＰＨとα－ケトグルタル酸と二酸化炭素に変換される。
検体中の内因性のアンモニアを消去した後、検体中の尿素はウレアーゼの作用によりアンモニアと二酸化炭素に分解される。
このアンモニアとα－ケトグルタル酸はグルタミン酸脱水素酵素の作用によりグルタミン酸に変化し、同時にＮＡＤＰＨはＮＡＤＰ＋に変わる。
ＮＡＤＰＨは３４０ｎｍに吸収極大を持つので、この吸光度の減少速度を測定して尿素窒素値を求めることができる。
【0061】
（ｉｖ）自動分析装置を用いて測定する場合の測定例
検体３．８μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬２５μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＰＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中の尿素窒素値を求める。
検体３．８μＬに前記の第１試薬１００μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした後、前記の第２試薬２５μＬを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。この第２試薬を添加した後、主波長３４０ｎｍ及び副波長４０５ｎｍでＮＡＤＰＨの吸光度の減少速度を測定して、検体中の尿素窒素値を求める。
【実施例】
【0062】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【0063】
〔実施例１〕（カチオン部位を有する物質によるＮＡＤＨ類の安定化の効果の確認）
本発明におけるカチオン部位を有する物質によるＮＡＤＨ類の安定化の効果を確かめた。
本発明におけるカチオン部位を有する物質によるＮＡＤＨ類の安定化の効果を確かめた。
【0064】
１．水溶液
０．３ｍＭのＮＡＤＨ二ナトリウム又はＮＡＤＰＨ四ナトリウム（４水塩）にカチオン部位を有する物質及び緩衝剤を共存させて各々の水溶液を調製した。
０．３ｍＭのＮＡＤＨ二ナトリウム又はＮＡＤＰＨ四ナトリウム（４水塩）にカチオン部位を有する物質及び緩衝剤を共存させて各々の水溶液を調製した。
【0065】
なお、それぞれのカチオン部位を有する物質及びその濃度並びに緩衝剤及びその濃度及びｐＨを表１に示した。
【0066】
【表1】
【0067】
そして、カチオン部位を有する物質として、塩化カリウム［関東化学］、塩化カルシウム（２水塩）［国産化学］、塩化アルミニウム六水和物［富士フィルム和光純薬］、硝酸カリウム［富士フィルム和光純薬］、硫酸ナトリウム［関東化学］、臭化ナトリウム［富士フィルム和光純薬］、塩化リチウム［国産化学］、硫酸ベリリウム（四水和物）［林純薬工業］、塩化マグネシウム六水和物［国産化学］、デシル硫酸ナトリウム［日光ケミカルズ］、デキストラン硫酸ナトリウム５０００［富士フィルム和光純薬］、ＥＤＴＡ二ナトリウム（２水塩）［積水メディカル］、ＣＡ－１０１〔塩化ベンザルコニウム〕［日光ケミカルズ］、塩化アンモニウム［富士フィルム和光純薬］、グアニジン塩酸塩［富士フィルム和光純薬］、Ｌ－アルギニン［ナカライテスク］、ＡＭ－３０１〔ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタイン〕［日光ケミカルズ］、及びＤＬ－カルニチン塩酸塩［富士フィルム和光純薬］をそれぞれ使用した。
【0068】
２．保存前測定
前記１で調製した各水溶液の３４０ｎｍにおける吸光度（吸光度１）を、分光光度計［日本分光社；Ｖ－６３０］で測定した。
前記１で調製した各水溶液の３４０ｎｍにおける吸光度（吸光度１）を、分光光度計［日本分光社；Ｖ－６３０］で測定した。
【0069】
３．保存
前記２で測定した各水溶液を、それぞれ表１に示した温度及び期間保存した。
前記２で測定した各水溶液を、それぞれ表１に示した温度及び期間保存した。
【0070】
４．測定
前記３で保存した各水溶液の３４０ｎｍにおける吸光度（吸光度２）を、分光光度計［日本分光社；Ｖ－６３０］で測定した。
前記３で保存した各水溶液の３４０ｎｍにおける吸光度（吸光度２）を、分光光度計［日本分光社；Ｖ－６３０］で測定した。
【0071】
５．残存濃度比率
前記４の「吸光度２」の値を前記２の「吸光度１」の値で除した値に１００を乗じて、「残存濃度比率」（単位：パーセント）の値を求めた。
前記４の「吸光度２」の値を前記２の「吸光度１」の値で除した値に１００を乗じて、「残存濃度比率」（単位：パーセント）の値を求めた。
【0072】
なお、この「残存濃度比率」の値が高い程、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが安定化されていると判断する。
【0073】
６．測定結果を表２に示した。
【0074】
【表2】
【0075】
この表より、カチオン部位を有する物質を共存させない場合に比べて、カチオン部位を有する物質を共存させた場合は、いずれも残存濃度比率が増加していることが分かる。
このことより、ｐＨ６．２～ｐＨ７．８の水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共にカチオン部位を有する物質を共存させることにより、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを安定化することができることが確かめられた。
このことより、ｐＨ６．２～ｐＨ７．８の水溶液中において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共にカチオン部位を有する物質を共存させることにより、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを安定化することができることが確かめられた。