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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-13
(45)【発行日】2023-09-22
(54)【発明の名称】癌ワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20230914BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230914BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230914BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20230914BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230914BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230914BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20230914BHJP
C12N 15/85 20060101ALN20230914BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 Z
A61P35/00
A61P37/04
A61K35/76
A61K48/00
A61K31/7088
C12N15/12 ZNA
C12N15/85 Z
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2020563998
(86)(22)【出願日】2019-05-14
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-09
(86)【国際出願番号】 GB2019051309
(87)【国際公開番号】W WO2019220090
(87)【国際公開日】2019-11-21
【審査請求日】2022-03-17
(31)【優先権主張番号】1807831.1
(32)【優先日】2018-05-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(73)【特許権者】
【識別番号】501125275
【氏名又は名称】ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114188
【弁理士】
【氏名又は名称】小野 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100119253
【弁理士】
【氏名又は名称】金山 賢教
(74)【代理人】
【識別番号】100124855
【弁理士】
【氏名又は名称】坪倉 道明
(74)【代理人】
【識別番号】100129713
【弁理士】
【氏名又は名称】重森 一輝
(74)【代理人】
【識別番号】100137213
【弁理士】
【氏名又は名称】安藤 健司
(74)【代理人】
【識別番号】100143823
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 英彦
(74)【代理人】
【識別番号】100183519
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻田 芳恵
(74)【代理人】
【識別番号】100196483
【弁理士】
【氏名又は名称】川嵜 洋祐
(74)【代理人】
【識別番号】100203035
【弁理士】
【氏名又は名称】五味渕 琢也
(74)【代理人】
【識別番号】100160749
【弁理士】
【氏名又は名称】飯野 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100160255
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 祐輔
(74)【代理人】
【識別番号】100202267
【弁理士】
【氏名又は名称】森山 正浩
(74)【代理人】
【識別番号】100182132
【弁理士】
【氏名又は名称】河野 隆
(74)【代理人】
【識別番号】100146318
【弁理士】
【氏名又は名称】岩瀬 吉和
(74)【代理人】
【識別番号】100127812
【弁理士】
【氏名又は名称】城山 康文
(72)【発明者】
【氏名】ゴドキン，アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】ガリモア，アウェン
(72)【発明者】
【氏名】スカー，マーティン
【審査官】長部 喜幸
(56)【参考文献】
【文献】Thermal Med，2011年，Vol. 27, No. 1，pp. 9-23
【文献】Jpn. J. Cancer Res.，2001年，Vol. 92，pp. 316-320
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／００
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３７／０４
Ａ６１Ｋ ３５／７６
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｋ ３１／７０８８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ４０）メンバーＢ７（ＤＮＡＪＢ７）もしくはその少なくとも１つの免疫原性断片を含む又はそれからなる、癌の治療のための癌ワクチンとしての使用のための医薬組成物。
【請求項2】
ＤＮＡＪＢ７がヒトＤＮＡＪＢ７である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項3】
ＤＮＡＪＢ７が、配列番号３１に記載されているアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列により表される、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記少なくとも１つの断片が５～３０アミノ酸長である、請求項１～３のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記少なくとも１つのＤＮＡＪＢ７免疫原性断片が、以下の群：ａ）ＭＶＤＹＹＥＶＬＧＬＱＲＹＡＳＰＥＤＩＫ（配列番号１）；
ＱＲＹＡＳＰＥＤＩＫＫＡＹＨＫＶＡＬＫＷ（配列番号２）；
ＫＡＹＨＫＶＡＬＫＷＨＰＤＫＮＰＥＮＫＥ（配列番号３）；
ＨＰＤＫＮＰＥＮＫＥＥＡＥＲＫＦＫＥＶＡ（配列番号４）；
ＥＡＥＲＫＦＫＥＶＡＥＡＹＥＶＬＳＮＤＥ（配列番号５）；
ＥＡＹＥＶＬＳＮＤＥＫＲＤＩＹＤＫＹＧＴ（配列番号６）；
ＫＲＤＩＹＤＫＹＧＴＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦ（配列番号７）；
ＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦ（配列番号８）；
ＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦＨＫＰＤＤＶＦＫＥＩ（配列番号９）；
ＨＫＰＤＤＶＦＫＥＩＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨ（配列番号１０）；
ＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬ（配列番号１１）；
ＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲ（配列番号１２）；
ＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴ（配列番号１３）；
ＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦ（配列番号１４）；
ＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦＳＳＹＤＴＧＹＴＳＱ（配列番号１５）；
ＳＳＹＤＴＧＹＴＳＱＧＳＬＧＨＥＧＬＴＳ（配列番号１６）；
ＧＳＬＧＨＥＧＬＴＳＦＳＳＬＡＦＤＮＳＧ（配列番号１７）；
ＦＳＳＬＡＦＤＮＳＧＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳ（配列番号１８）；
ＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮ（配列番号１９）；
ＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮＴＫＫＩＩＥＳＤＱＥ（配列番号２０）；
ＴＫＫＩＩＥＳＤＱＥＲＥＡＥＤＮＧＥＬＴ（配列番号２１）；
ＲＥＡＥＤＮＧＥＬＴＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥ（配列番号２２）；
ＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲ（配列番号２３）；
ＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲＴＱＳＦＮＮＹＳＰＮ（配列番号２４）；
ＴＱＳＦＮＮＹＳＰＮＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹ（配列番号２５）；
ＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩ（配列番号２６）；
ＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰ（配列番号２７）；
ＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰＩＦＳＡＧＶＫＥＧＧ（配列番号２８）；
ＩＦＳＡＧＶＫＥＧＧＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶ（配列番号２９）；および
ＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶＱＫＫＳＴＫＲＮＣ（配列番号３０）；または
ｂ）群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８５％の配列同一性を、そして群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしく
は９９％（好ましさの昇順）の配列同一性を有する断片；または
ｃ）群ａ）および／または群ｂ）における配列の任意の１以上の変異体である断片であって、該変異体が前記配列の任意の１以上における１以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されており、そして常にというわけではないが理想的には該変異体断片が、群ａ）および／または群ｂ）における変異体の任意の１以上の免疫原性と比較して増強した又は同等の免疫原性を保持または有する、断片
の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項１～４のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記少なくとも１つのＤＮＡＪＢ７断片が、ａ）ＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲ（配列番号２３）；
ＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬ（配列番号１１）；
ＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶＱＫＫＳＴＫＲＮＣ（配列番号３０）；
ＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩ（配列番号２６）；
ＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦ（（配列番号８）；
ＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴ（配列番号１３）；
ＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦ（配列番号１４）；
ＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮ（配列番号１９）；および
ＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰ（配列番号２７）；または
ｂ）群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８５％の配列同一性を、そして群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％（好ましさの昇順）の配列同一性を有する断片；または
ｃ）群ａ）および／または群ｂ）における配列の任意の１以上の変異体である断片であって、該変異体が前記配列の任意の１以上における１以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されており、そして常にというわけではないが理想的には該変異体断片が、群ａ）および／または群ｂ）における変異体の任意の１以上の免疫原性と比較して増強した又は同等の免疫原性を保持または有する、断片
を含む又はそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列により表される、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項7】
ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ４０）メンバーＢ７（ＤＮＡＪＢ７）またはその少なくとも１つの免疫原性断片をコードする核酸分子を含む、癌の治療のためのＤＮＡワクチンとしての使用のための医薬組成物。
【請求項8】
ＤＮＡＪＢ７がヒトＤＮＡＪＢ７である、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項9】
ＤＮＡＪＢ７が、配列番号３１に記載されているアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列により表される、請求項８記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記少なくとも１つの断片が５～３０アミノ酸長である、請求項７～９のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記少なくとも１つのＤＮＡＪＢ７免疫原性断片が、以下の群：
ａ）ＭＶＤＹＹＥＶＬＧＬＱＲＹＡＳＰＥＤＩＫ（配列番号１）；
ＱＲＹＡＳＰＥＤＩＫＫＡＹＨＫＶＡＬＫＷ（配列番号２）；
ＫＡＹＨＫＶＡＬＫＷＨＰＤＫＮＰＥＮＫＥ（配列番号３）；
ＨＰＤＫＮＰＥＮＫＥＥＡＥＲＫＦＫＥＶＡ（配列番号４）；
ＥＡＥＲＫＦＫＥＶＡＥＡＹＥＶＬＳＮＤＥ（配列番号５）；
ＥＡＹＥＶＬＳＮＤＥＫＲＤＩＹＤＫＹＧＴ（配列番号６）；
ＫＲＤＩＹＤＫＹＧＴＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦ（配列番号７）；
ＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦ（配列番号８）；
ＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦＨＫＰＤＤＶＦＫＥＩ（配列番号９）；
ＨＫＰＤＤＶＦＫＥＩＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨ（配列番号１０）；
ＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬ（配列番号１１）；
ＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲ（配列番号１２）；
ＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴ（配列番号１３）；
ＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦ（配列番号１４）；
ＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦＳＳＹＤＴＧＹＴＳＱ（配列番号１５）；
ＳＳＹＤＴＧＹＴＳＱＧＳＬＧＨＥＧＬＴＳ（配列番号１６）；
ＧＳＬＧＨＥＧＬＴＳＦＳＳＬＡＦＤＮＳＧ（配列番号１７）；
ＦＳＳＬＡＦＤＮＳＧＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳ（配列番号１８）；
ＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮ（配列番号１９）；
ＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮＴＫＫＩＩＥＳＤＱＥ（配列番号２０）；
ＴＫＫＩＩＥＳＤＱＥＲＥＡＥＤＮＧＥＬＴ（配列番号２１）；
ＲＥＡＥＤＮＧＥＬＴＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥ（配列番号２２）；
ＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲ（配列番号２３）；
ＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲＴＱＳＦＮＮＹＳＰＮ（配列番号２４）；
ＴＱＳＦＮＮＹＳＰＮＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹ（配列番号２５）；
ＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩ（配列番号２６）；
ＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰ（配列番号２７）；
ＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰＩＦＳＡＧＶＫＥＧＧ（配列番号２８）；
ＩＦＳＡＧＶＫＥＧＧＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶ（配列番号２９）；および
ＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶＱＫＫＳＴＫＲＮＣ（配列番号３０）；または
ｂ）群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８５％の配列同一性を、そして群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしく
は９９％（好ましさの昇順）の配列同一性を有する断片；または
ｃ）群ａ）および／または群ｂ）における配列の任意の１以上の変異体である断片であって、該変異体が前記配列の任意の１以上における１以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されており、そして常にというわけではないが理想的には該変異体断片が、群ａ）および／または群ｂ）における変異体の任意の１以上の免疫原性と比較して増強した又は同等の免疫原性を保持または有する、断片
の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項７～１０のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記少なくとも１つのＤＮＡＪＢ７断片が、
ａ）ＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲ（配列番号２３）；
ＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬ（配列番号１１）；
ＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶＱＫＫＳＴＫＲＮＣ（配列番号３０）；
ＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩ（配列番号２６）；
ＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦ（（配列番号８）；
ＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴ（配列番号１３）；
ＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦ（配列番号１４）；
ＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮ（配列番号１９）；および
ＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰ（配列番号２７）；または
ｂ）群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８５％の配列同一性を、そして群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％（好ましさの昇順）の配列同一性を有する断片；または
ｃ）群ａ）および／または群ｂ）における配列の任意の１以上の変異体である断片であって、該変異体が前記配列の任意の１以上における１以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されており、そして常にというわけではないが理想的には該変異体断片が、群ａ）および／または群ｂ）における変異体の任意の１以上の免疫原性と比較して増強した又は同等の免疫原性を保持または有する、断片
を含む又はそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列により表される、請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項13】
該核酸分子が、該ＤＮＡＪＢ７またはその該断片の少なくとも１つを発現するように適合化された発現ベクターの一部である、または該発現ベクターにおいて提供される、請求項７～１２のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項14】
該適合化が、該発現をもたらす少なくとも１つの転写制御配列の提供を含む、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記少なくとも１つの転写制御配列が細胞／組織特異的であり、該ＤＮＡＪＢ７またはその少なくとも１つの断片の誘導性または構成的発現に適合化されている、請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項16】
該核酸分子が該ＤＮＡＪＢ７の全体および／またはその幾つかの断片をコードする、請求項７～１５のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項17】
該癌が、鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、喉頭癌、口腔癌、肝癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリン産生腫瘍、褐色細胞腫、プロラクチン産生腫瘍、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、扁桃腺癌、脾臓癌、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンガー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルシノイド、胃腸管カルシノイド、線維肉腫、乳癌、筋肉癌、パジェット病、子宮頸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胆管癌、頭部癌、眼癌、鼻咽頭癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポシ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴン産生腫瘍、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、真菌性真菌症、インスリノーマ、カルシノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、唇癌、髄膜癌、口癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃腺癌の任意の１以上から選択される、請求項１～１６のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項18】
該癌が、結腸直腸癌、甲状腺癌、リンパ腫、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、カルチノイド、頭頸部癌、胃癌、尿路上皮癌、前立腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、神経膠腫、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、黒色腫、肝臓癌および腎癌を含む群から選択される、請求項１７記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ４０）メンバーＢ７またはその免疫原性断片を含む免疫原性物質；該タンパク質またはその少なくとも１つの免疫原性断片をコードする核酸を含むＤＮＡワクチン；がん（以下、癌と表記される）の治療における使用のための医薬組成物またはベクターもしくはＤＮＡワクチン；および該免疫原性物質または医薬組成物またはベクターもしくはＤＮＡワクチンの使用を含む癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【0002】
癌の免疫療法の臨床研究からの結果を取り巻く興奮ぶりは理解できるものの、実際の結果は期待外れである。免疫療法に対する多数のアップレギュレートされた腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）標的は、しばしば、健常組織の内部または表面上で或る程度発現され［例えば、自己抗原癌胎児性抗原（ＣＥＡ）］、したがって、そのような抗原に対する免疫応答の誘導は、望ましくない副作用につながりうる。実際、本発明者らは、ＣＥＡに対するＴ細胞応答が、結腸直腸癌（ＣＲＣ）の治療を受けた患者における早期疾患再発に関連していることを見出している。したがって、免疫療法により標的化されうる有用なＴＡＡの特定は、ｉ）腫瘍発現、ｉｉ）健常組織における同一抗原の発現レベル、およびｉｉｉ）同一抗原により誘導される抗原特異的免疫抑制応答の抑制の間の比較考量である。その難題は、潜在的に致命的な結果を伴う遠隔組織内のオフターゲット効果をもたらしうるＴ細胞交差反応性によって更に困難となる。
【0003】
ネオエピトープを標的化する免疫療法は、交差反応性が生じないことが保証されるのに十分な程度にネオエピトープが自己抗原とは異なっている可能性が高いため、有望であるが、それは個体レベルに非常に集中したものであり、開発に法外な費用を要する。癌ワクチン、癌に対する免疫動員モノクローナルＴ細胞受容体（ＩｍｍＴＡＣ）およびキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞のような、より広範な集団に対する療法においては、抗原は複数個体の同一腫瘍型において広範に発現される必要があり、健常組織においては最小限のレベルで存在する必要がある。理想的には、発見パイプラインはＴＡＡ候補の大規模分析、ならびにそれに続く、免疫原性および組織特異的発現に基づく選択を含むであろう。これらの基準を満たした候補は、適切な癌ワクチン接種物として更に研究されうるであろう。
【0004】
ＣＲＣとの関連においては、公知ＴＡＡには、新規抗原の特定をもたらした癌－精巣抗原発現パネルに関する幾つかの大規模な調査によるＣＥＡ、ＧＵＣＹ２Ｃ、５Ｔ４、ＭＡＧＥ抗原およびＨｅｒ－２が含まれるが、これらの抗原の問題は、それらが、しばしば、限られた割合の腫瘍でしか発現されないことである。これらの抗原のうち、ＣＥＡ、ＧＵＣＹ２Ｃおよび５Ｔ４は前臨床研究および臨床研究に進められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、広範な集団、理想的にはＨＬＡが異なる集団に投与されうる新規癌ワクチンが必要とされている。理想的なワクチンは、正常細胞においてではなく形質転換癌細胞においてのみ発現される標的抗原に対するＴ細胞応答を誘導または増強するであろう。これは、オフターゲット毒性を回避するために重要である。腫瘍と健常組織とのペアのゲノム解析は理論的にはＴＡＡの特定を促進させるが、実際には各配列決定サンプルにおける細胞投入物の多様性によって制限されるようである。
【0006】
差次的発現解析におけるＲＮＡ配列決定（ＲＮＡ－ｓｅｑ）の益々増加しつつある利用は、ＴＡＡ発見パイプラインを開始するための有用な方法論を提供する。しかし、結腸の場合には、免疫細胞、上皮および間質の混合物が、調べる発現プロファイルを複雑にして、特に腫瘍免疫浸潤が個体および腫瘍位置によって異なることも考慮すると、有意に及び異なって発現される遺伝子の特定を妨げる傾向にある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
ＲＮＡ配列決定分析の前の上皮細胞および腫瘍細胞の精製は、組織不均一性を克服するための新規方法である。本研究において、本発明者らは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、すなわち、上皮におけるＣａ２＋非依存性同型細胞間接着を媒介する膜貫通糖タンパク質を、精製を助けるために使用した。腫瘍および健常結腸上皮（２つの部位におけるもの）のＥｐＣＡＭ精製は腫瘍および健常細胞発現プロファイル間の分離を改善して、差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）の特定を助けた。全組織間の発現プロファイルに基づいて遺伝子リストを作成し、ＤＥＳＥＱ２比較分析において、有意な発現レベルを確定した。これらのリストを分析し、幾つかの遺伝子を、ワクチン候補としての更なる研究のために選択した。将来のＣＲＣ免疫療法のための最良の候補を選択するために、健常組織におけるこれらの遺伝子のタンパク質産物の免疫原性分析および組織発現を行った。幾つかの標的が、対照抗原と比較して有意な免疫原性を示したが、これらのうち、１つのマーカー、すなわち、ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ４０）メンバーＢ７（ＤＮＡＪＢ７）が、健常組織および癌組織の免疫組織化学データに基づいて最も好ましい発現プロファイルを示した。更に、本発明者らは、全てのドナーがＤＮＡＪＢ７に対するＴ細胞応答を誘発する能力を有することを確認した。したがって、このタンパク質抗原は将来の癌治療および予防治療戦略におけるワクチン標的として使用される可能性を有する。
【0008】
発明の開示
本発明の第１の態様においては、ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ４０）メンバーＢ７（ＤＮＡＪＢ７と称される）またはその少なくとも１つの免疫原性断片を含む又はそれからなる、癌ワクチンとしての使用のための免疫原性物質を提供する。
本発明の第１の態様においては、ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ４０）メンバーＢ７（ＤＮＡＪＢ７と称される）またはその少なくとも１つの免疫原性断片を含む又はそれからなる、癌ワクチンとしての使用のための免疫原性物質を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1A】腫瘍部位からの２つの距離で行われた腫瘍および健常組織切除の概要図である
【図1B】サンプル処理および精製フローチャートである。
【図1C】細胞選別の前および後のＥｐＣＡＭ＋およびＣＤ３－精製に関するフローサイトメトリーゲーティングである。
【図1D】未精製腫瘍組織および精製腫瘍組織と比較した場合の健常組織「近」および「遠」の４つのＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにわたるリードの例を示すものである
【図2A】２つの比較に基づいて差次的発現遺伝子の遺伝子リストを得るためのワークフロー（それぞれ左側および右側の、精製腫瘍対精製健常結腸「遠」、および精製腫瘍対精製健常結腸「近」）である。
【図2B】更なる分析のために選択された７つの遺伝子のそれぞれに関する正規化カウントを示すものである。
【図3A】健常組織における候補腫瘍抗原の発現プロファイルを示すものである。
【図3B】癌における候補腫瘍抗原の発現プロファイルを示すものである。
【図3C】胃腸腫瘍における染色の例を示すものである。
【図4A】予め定められた癌精巣抗原と比較した場合のＤＮＡＪＢ７の発現プロファイル（健常組織）を示すものである。
【図4B】予め定められた癌精巣抗原と比較した場合のＤＮＡＪＢ７の発現プロファイル（腫瘍型）を示すものである。
【図5A】各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）により評価した結果を示すものである。各陽性ペプチドプールに対する１０５個の培養ＰＢＭＣ当たりのＩＦＮ－γ＋スポット形成細胞の総数（Ａ）。
【図5B】各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）により評価した結果を示すものである。タンパク質におけるペプチド数に対する全体的な大きさ（Ｂ）。
【図5C】各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）により評価した結果を示すものである。ＤＮＡＪＢ７タンパク質を、１０個ずつ重複する３０個の２０マーに分割し（詳細は表２を参照されたい）、ついでそれらを、示されている１１個のペプチドプールのうちの２個に配置した。
【図5D】各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）により評価した結果を示すものである。ＩＦＮ－γ／グランザイムＢフルオロスポットによるＣＲＣ患者における免疫原性ＤＮＡＪＢ７ペプチドの特定の代表例。
【図5E】各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）により評価した結果を示すものである。この患者は、ペプチド３および２３に対する応答を示すペプチドプール３、６および１０に対するＩＦＮ－γおよびグランザイムＢ（「Ｇｒｚ－Ｂ」）の両方の応答を誘発した（例示ウェルイメージが示されている）。
【図5F】各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）により評価した結果を示すものである。１０％を超えるペプチド配列の応答率は、ペプチド２３が、試験された全てのドナーの中で最も免疫原性であることを示している。
【図5G】各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）により評価した結果を示すものである。試験された全ての癌を有する患者が、これまでのところ、抗ＤＮＡＪＢ７ Ｔ細胞応答を誘発しているようである（ＣＲＣ－結腸直腸癌；ＣＣ－胆管癌；ＨＣＣ－肝細胞癌；ＨＮＣ－頭頸部扁平上皮癌）。
【図6A】各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した結果を示すものである。該タンパク質におけるペプチド数に対する１０５個の培養ＰＢＭＣ当たりのＩＦＮ－γ＋スポット形成細胞（ＳＦＣ）の総数を評価し、試験された全てのドナーにおいて応答中央値によりランク付けした。
【図6B】各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した結果を示すものである。ＣＲＣ患者（青丸ＴＮＭステージ１／２；ｎ＝６、黒丸ＴＮＭステージ３；ｎ＝８）および健常ドナー（‘ＨＤ’，白丸；ｎ＝１０）により細分した。
【図6C】各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した結果を示すものである。他の胃腸癌を有する患者を、抗ＤＮＡＪＢ７ Ｔ細胞応答を誘発する彼らの能力に関して試験した。（ＣＣ－胆管癌；ＨＣＣ－肝細胞癌；ＨＮＣ－頭頸部扁平上皮癌）。
【図7A】結腸切除後のＣＲＣ患者に治療第１日～８日および第１５日～２２日に低用量メトロノミックシクロホスファミドを投与し、治療中を通じて血液サンプルを毎週採取し、各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を各時点で培養ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した結果を示すものである。
【図7B】ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔウェルの例示イメージである。
【図7C】１０５個の培養ＰＢＭＣ当たりのＩＦＮ－γ＋スポット形成細胞（ＳＦＣ）の総数（重複実験ウェルの平均）を各ＴＡＡに関して計算した結果を示すものである。
【図7D】ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞数およびＫｉ６７＋ Ｔｒｅｇ（％）をシクロホスファミド処理中にフローサイトメトリーにより測定した結果を示すものである。
【図8A】ＨＣＣ患者に治療第１日～８日および第１５日～２２日に低用量メトロノミックシクロホスファミドを投与し、治療中を通じて血液サンプルを毎週採取し、各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を各時点で培養ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した結果における、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔウェルの例示イメージである。
【図8B】１０５個の培養ＰＢＭＣ当たりのＩＦＮ－γ＋スポット形成細胞（ＳＦＣ）の総数（重複実験ウェルの平均）を各ＴＡＡに関して計算した結果を示すものである。
【図8C】ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞数およびＫｉ６７＋ Ｔｒｅｇ（％）をシクロホスファミド処理中にフローサイトメトリーにより測定した結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書におけるＤＮＡＪＢ７に対する言及は、ＡＴＰアーゼ活性を刺激することにより分子シャペロン活性を調節する、進化的に保存されたＤＮＡＪ／ＨＳＰ４０ファミリーのタンパク質に属するタンパク質に対するものである。当業者に公知のとおり、ＤＮＡＪタンパク質は３つまでの異なるドメイン、すなわち、通常はＮ末端に存在する保存された７０アミノ酸のＪドメイン、グリシン／フェニルアラニン（Ｇ／Ｆ）に富む領域、およびジンクフィンガードメインに類似した４つのモチーフを含有する、システインに富むドメインを有しうる。
【0011】
本発明の好ましい実施形態においては、前記ＤＮＡＪＢ７はヒトＤＮＡＪＢ７である。
【0012】
好ましくは、前記ＤＮＡＪＢ７は、配列番号３１に記載されているアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列により表される。
【0013】
本明細書における免疫原性断片に対する言及は、インビボで使用された場合に免疫応答を誘発しうるＤＮＡＪＢ７の一部分に対するものであり、この応答は、本明細書に記載されているような公知試験を用いて測定または決定されうる。用いられうる１つの試験は、限定的なものではないが、免疫系の成分により腫瘍が認識され作用されることを該断片が引き起こしうるかどうかの試験である。好都合なことに、Ｃ末端付近からＮ末端へと伸長する全長ＤＮＡＪＢ７ペプチドの部分（すなわち、ペプチドの全長）からのこれらの免疫原性断片は応答を誘発しうることが判明している。
【0014】
本発明の好ましい実施形態においては、前記の少なくとも１つの断片は５～３０アミノ酸長であり、好ましくは、前記の少なくとも１つの断片は８～２５アミノ酸長である。最も好ましくは、前記の少なくとも１つの断片は１９アミノ酸長である。
【0015】
本発明の好ましい実施形態においては、前記の少なくとも１つのＤＮＡＪＢ７断片は、以下の群の少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる：
ａ）ＭＶＤＹＹＥＶＬＧＬＱＲＹＡＳＰＥＤＩＫ（配列番号１）；
ＱＲＹＡＳＰＥＤＩＫＫＡＹＨＫＶＡＬＫＷ（配列番号２）；
ＫＡＹＨＫＶＡＬＫＷＨＰＤＫＮＰＥＮＫＥ（配列番号３）；
ＨＰＤＫＮＰＥＮＫＥＥＡＥＲＫＦＫＥＶＡ（配列番号４）；
ＥＡＥＲＫＦＫＥＶＡＥＡＹＥＶＬＳＮＤＥ（配列番号５）；
ＥＡＹＥＶＬＳＮＤＥＫＲＤＩＹＤＫＹＧＴ（配列番号６）；
ＫＲＤＩＹＤＫＹＧＴＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦ（配列番号７）；
ＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦ（配列番号８）；
ＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦＨＫＰＤＤＶＦＫＥＩ（配列番号９）；
ＨＫＰＤＤＶＦＫＥＩＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨ（配列番号１０）；
ＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬ（配列番号１１）；
ＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲ（配列番号１２）；
ＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴ（配列番号１３）；
ＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦ（配列番号１４）；
ＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦＳＳＹＤＴＧＹＴＳＱ（配列番号１５）；
ＳＳＹＤＴＧＹＴＳＱＧＳＬＧＨＥＧＬＴＳ（配列番号１６）；
ＧＳＬＧＨＥＧＬＴＳＦＳＳＬＡＦＤＮＳＧ（配列番号１７）；
ＦＳＳＬＡＦＤＮＳＧＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳ（配列番号１８）；
ＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮ（配列番号１９）；
ＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮＴＫＫＩＩＥＳＤＱＥ（配列番号２０）；
ＴＫＫＩＩＥＳＤＱＥＲＥＡＥＤＮＧＥＬＴ（配列番号２１）；
ＲＥＡＥＤＮＧＥＬＴＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥ（配列番号２２）；
ＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲ（配列番号２３）；
ＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲＴＱＳＦＮＮＹＳＰＮ（配列番号２４）；
ＴＱＳＦＮＮＹＳＰＮＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹ（配列番号２５）；
ＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩ（配列番号２６）；
ＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰ（配列番号２７）；
ＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰＩＦＳＡＧＶＫＥＧＧ（配列番号２８）；
ＩＦＳＡＧＶＫＥＧＧＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶ（配列番号２９）；および
ＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶＱＫＫＳＴＫＲＮＣ（配列番号３０）；あるいは
ｂ）群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８５％の配列同一性を、そして群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％（好ましさの昇順）の配列同一性を有する断片；あるいは
ｃ）群ａ）および／または群ｂ）における配列の任意の１以上の変異体である断片であって、該変異体が前記配列の任意の１以上における１以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されており、そして常にというわけではないが理想的には該変異体断片が、群ａ）および／または群ｂ）における変異体の任意の１以上の免疫原性と比較して増強した又は同等の免疫原性を保持または有する、断片。
ａ）ＭＶＤＹＹＥＶＬＧＬＱＲＹＡＳＰＥＤＩＫ（配列番号１）；
ＱＲＹＡＳＰＥＤＩＫＫＡＹＨＫＶＡＬＫＷ（配列番号２）；
ＫＡＹＨＫＶＡＬＫＷＨＰＤＫＮＰＥＮＫＥ（配列番号３）；
ＨＰＤＫＮＰＥＮＫＥＥＡＥＲＫＦＫＥＶＡ（配列番号４）；
ＥＡＥＲＫＦＫＥＶＡＥＡＹＥＶＬＳＮＤＥ（配列番号５）；
ＥＡＹＥＶＬＳＮＤＥＫＲＤＩＹＤＫＹＧＴ（配列番号６）；
ＫＲＤＩＹＤＫＹＧＴＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦ（配列番号７）；
ＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦ（配列番号８）；
ＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦＨＫＰＤＤＶＦＫＥＩ（配列番号９）；
ＨＫＰＤＤＶＦＫＥＩＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨ（配列番号１０）；
ＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬ（配列番号１１）；
ＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲ（配列番号１２）；
ＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴ（配列番号１３）；
ＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦ（配列番号１４）；
ＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦＳＳＹＤＴＧＹＴＳＱ（配列番号１５）；
ＳＳＹＤＴＧＹＴＳＱＧＳＬＧＨＥＧＬＴＳ（配列番号１６）；
ＧＳＬＧＨＥＧＬＴＳＦＳＳＬＡＦＤＮＳＧ（配列番号１７）；
ＦＳＳＬＡＦＤＮＳＧＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳ（配列番号１８）；
ＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮ（配列番号１９）；
ＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮＴＫＫＩＩＥＳＤＱＥ（配列番号２０）；
ＴＫＫＩＩＥＳＤＱＥＲＥＡＥＤＮＧＥＬＴ（配列番号２１）；
ＲＥＡＥＤＮＧＥＬＴＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥ（配列番号２２）；
ＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲ（配列番号２３）；
ＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲＴＱＳＦＮＮＹＳＰＮ（配列番号２４）；
ＴＱＳＦＮＮＹＳＰＮＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹ（配列番号２５）；
ＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩ（配列番号２６）；
ＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰ（配列番号２７）；
ＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰＩＦＳＡＧＶＫＥＧＧ（配列番号２８）；
ＩＦＳＡＧＶＫＥＧＧＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶ（配列番号２９）；および
ＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶＱＫＫＳＴＫＲＮＣ（配列番号３０）；あるいは
ｂ）群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８５％の配列同一性を、そして群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％（好ましさの昇順）の配列同一性を有する断片；あるいは
ｃ）群ａ）および／または群ｂ）における配列の任意の１以上の変異体である断片であって、該変異体が前記配列の任意の１以上における１以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されており、そして常にというわけではないが理想的には該変異体断片が、群ａ）および／または群ｂ）における変異体の任意の１以上の免疫原性と比較して増強した又は同等の免疫原性を保持または有する、断片。
【0016】
当業者に理解されるとおり、免疫原性の測定および／または比較は、当業者に公知の任意の手段、例えばインビトロ・フルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）アッセイ（これに限定されるものではない）により実施可能であり、インビトロ・フルオロスポット・アッセイにおいては、ＤＮＡＪＢ７タンパク質またはそれに由来するペプチドの存在下で末梢血単核細胞を培養し、これらのペプチドに応答したＴ細胞サイトカイン産生を測定する。
【0017】
当技術分野で公知のとおり、変異体ポリペプチドは、任意の組合せで存在しうる１以上の置換、付加、欠失またはトランケーションによりアミノ酸配列において異なりうる。好ましい変異体としては、保存的アミノ酸置換により参照ポリペプチドと異なる変異体が挙げられる。そのような置換は、所与アミノ酸を類似特性の別のアミノ酸により置換するものである。例えば、荷電アミノ酸残基には、リジン（＋）、アルギニン（＋）、ヒスチジン（＋）、アスパルタート（－）およびグルタマート（－）が含まれ、極性アミノ酸には、セリン、スレオニン、アスパラギン、グルタミンおよびチロシンが含まれ、一方、疎水性アミノ酸には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、システインおよびメチオニンが含まれる。一般に、グリシンは、しばしば、タンパク質の表面、ループまたはコイル領域内で見出され、これらの位置でポリペプチド鎖に高い柔軟性を付与する。これは、それが幾分か親水性であることを示唆している。一方、プロリンは一般に無極性であり、ほとんどがタンパク質内部に埋もれて存在するが、グリシンと同様に、それはループ領域内で見出されることが多い。グリシンとは対照的に、プロリンは、構造のセグメントに或るねじれ角を強いることにより、ポリペプチド鎖に剛性を付与する。グリシンおよびプロリンは、特定のタンパク質フォールドの保存に不可欠であるため、しばしば、タンパク質ファミリー内で高度に保存されている。
【0018】
また、以下の非限定的なアミノ酸群においては、各群内の各アミノ酸は互いに保存的な置換と見なされる：ａ）アラニン、セリンおよびスレオニン；ｂ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；ｃ）アスパラギンおよびグルタミン；ｄ）アルギニン、ヒスチジンおよびリジン；ｅ）イソロイシン、ロイシン、メチオニンおよびバリン；ならびにｆ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。最も好ましいのは、変異の元となった参照ポリペプチドと比較して増強した生物学的機能または免疫原性を保持または有する変異体である。
【0019】
本発明の好ましい実施形態においては、前記の少なくとも１つのＤＮＡＪＢ７断片は、
ａ）ＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲ（配列番号２３）；
ＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬ（配列番号１１）；
ＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶＱＫＫＳＴＫＲＮＣ（配列番号３０）；
ＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩ（配列番号２６）；
ＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦ（配列番号８）；
ＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴ（配列番号１３）；
ＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦ（配列番号１４）；
ＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮ（配列番号１９）；および
ＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰ（配列番号２７）；あるいは
ｂ）群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８５％の配列同一性を、そして群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％（好ましさの昇順）の配列同一性を有する断片；あるいは
ｃ）群ａ）および／または群ｂ）における配列の任意の１以上の変異体である断片であって、該変異体が前記配列の任意の１以上における１以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されており、そして常にというわけではないが理想的には該変異体断片が、群ａ）および／または群ｂ）における変異体の任意の１以上の免疫原性と比較して増強した又は同等の免疫原性を保持または有する、断片
を含む又はそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列により表される。
ａ）ＦＦＬＶＮＳＶＡＮＥＥＧＦＡＫＥＣＳＷＲ（配列番号２３）；
ＦＨＥＲＤＰＦＳＦＨＦＦＥＤＳＬＥＤＬＬ（配列番号１１）；
ＫＲＫＫＫＫＲＫＥＶＱＫＫＳＴＫＲＮＣ（配列番号３０）；
ＳＨＳＳＫＨＶＳＱＹＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩ（配列番号２６）；
ＥＧＬＮＧＧＧＳＨＦＤＤＥＣＥＹＧＦＴＦ（配列番号８）；
ＮＲＰＧＳＳＹＧＮＲＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴ（配列番号１３）；
ＮＲＤＡＧＹＦＦＳＴＡＳＥＹＰＩＦＥＫＦ（配列番号１４）；
ＭＤＮＹＩＳＶＴＴＳＤＫＩＶＮＧＲＮＩＮ（配列番号１９）；および
ＴＦＶＤＮＤＥＧＧＩＳＷＶＴＳＮＲＤＰＰ（配列番号２７）；あるいは
ｂ）群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８５％の配列同一性を、そして群ａ）における配列の任意の１以上に対して少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％（好ましさの昇順）の配列同一性を有する断片；あるいは
ｃ）群ａ）および／または群ｂ）における配列の任意の１以上の変異体である断片であって、該変異体が前記配列の任意の１以上における１以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換により修飾されており、そして常にというわけではないが理想的には該変異体断片が、群ａ）および／または群ｂ）における変異体の任意の１以上の免疫原性と比較して増強した又は同等の免疫原性を保持または有する、断片
を含む又はそれらからなる群から選択されるアミノ酸配列により表される。
【0020】
本発明のもう１つの態様においては、本明細書に開示されている該ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリー（Ｈｓｐ４０）メンバーＢ７（ＤＮＡＪＢ７と称される）またはその少なくとも１つの断片をコードする核酸分子を含むベクターまたはＤＮＡワクチンを提供する。
【0021】
本発明の好ましい実施形態においては、該核酸分子は、該ＤＮＡＪＢ７またはその該断片の少なくとも１つを発現するように適合化された発現ベクターの一部である、または該発現ベクターにおいて提供される。
【0022】
典型的には、該適合化は、該発現をもたらす少なくとも１つの転写制御配列（例えば、少なくとも１つのプロモーター配列）の提供を含む。好ましくは、該プロモーターは細胞／組織特異的であり、より理想的には、該ＤＮＡＪＢ７またはその少なくとも１つの断片の誘導性または構成的発現に尚も適合している。
【0023】
ある実施形態においては、該核酸分子は該ＤＮＡＪＢ７の全体および／またはその幾つかの断片をコードする。
【0024】
プロモーターなる語は以下の特徴（それらは限定的なものではなく、単なる例示として示されているに過ぎない）を含むと当業者は理解するであろう：エンハンサーが連結されている遺伝子の転写の速度を増加させるように機能する、遺伝子の転写開始部位の５’側でしばしば見出されるシス作用性核酸配列である少なくとも１つのエンハンサーエレメント（エンハンサーは遺伝子配列の３’側でも見出され、または更にはイントロン配列内にも位置することがあり、したがって、位置非依存的である）。更に、エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているトランス作用性転写因子（例えば、ポリペプチド）に対して応答性である。転写因子の結合／活性（Ｄａｖｉｄ Ｓ ＬａｔｃｈｍａｎによるＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照されたい）は、例えば中間代謝物（例えば、グルコース、脂質）、環境エフェクター（例えば、光、熱）（これらに限定されるものではない）を含む多数の環境因子に対して応答性である。
【0025】
プロモーターエレメントには、転写開始部位を提供するように機能するＴＡＴＡボックスおよびＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列も含まれる。これらの配列はまた、とりわけ、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進させるように機能するポリペプチドに結合する。
【0026】
ベクターに対する適合化は、真核細胞または原核生物宿主のいずれかにおける該ベクターの維持を容易にする自律複製配列および選択可能マーカーの提供をも含む。自律的に維持されるベクターはエピソームベクターと称され、本発明の範囲内に含まれる。
【0027】
ベクターコード化遺伝子の発現を促進させる、本発明の範囲内に含まれるベクターに対する更なる適合化は、転写終結／ポリアデニル化配列を含む。この又はこれらの特徴は、バイシストロン性またはマルチシストロン性発現カセット内に配置されたベクターコード化遺伝子の発現を最大化するように機能する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の提供をも含む。
【0028】
本発明の範囲内に含まれるベクターに対する更なる適合化は発現制御配列、例えば遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）である。これらは、マウスにおいてトランスジェニック構築物としてアッセイされた場合に位置非依存的コピー数依存的発現を連結遺伝子にもたらす調節エレメントである。ＬＣＲは、隣接ヘテロクロマチンのサイレンシング効果から導入遺伝子を保護する調節エレメントを含む（Ｇｒｏｓｖｅｌｄら，Ｃｅｌｌ（１９８７），５１：９７５－９８５）。
【0029】
前記の適合化は当技術分野でよく知られている。実際、発現ベクター構築および組換えＤＮＡ発現技術の全般に関する相当な量の公開文献が存在する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹおよびそれにおける参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ，Ｆ（１９８７）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｖｏｌ ＩＩＩ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ ＵＫ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｆ Ｍ Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照されたい。最終的なベクターまたは構築物が、培養または宿主環境において該ベクターにより発現されうるＤＮＡＪＢ７またはその少なくとも１つの断片をコードする核酸分子を含有する限り、本発明を実施する場合に、これらの公知技術のいずれか１以上が用いられうる。
【0030】
本発明のもう１つの態様においては、本発明の前記免疫原性物質またはベクターまたはＤＮＡワクチンを含む医薬組成物を提供する。
【0031】
本発明のもう１つの態様においては、癌の治療における使用のための、ＤＮＡＪＢ７またはその少なくとも１つの断片を含有またはコードする少なくとも１つの免疫原性物質またはベクターまたはＤＮＡワクチンまたは医薬組成物を提供する。
【0032】
本発明のもう１つの態様においては、癌を治療するための医薬の製造における使用のための、ＤＮＡＪＢ７またはその少なくとも１つの断片を含有またはコードする少なくとも１つの免疫原性物質またはベクターまたはＤＮＡワクチンまたは医薬組成物を提供する。
【0033】
本明細書中で用いる「癌」なる語は、自律的増殖能、すなわち、無制御細胞増殖により特徴づけられる異常な状態または状況を有する細胞を意味する。この語は、組織病理学的タイプまたは浸潤段階には無関係に、全てのタイプの癌性増殖または発癌過程、転移性組織または悪性形質転換した細胞、組織もしくは器官を含むと意図される。
【0034】
最も好ましくは、本明細書中で言及されている癌は以下の癌の任意の１以上を含む：鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、喉頭癌、口腔癌、肝癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリン産生腫瘍、褐色細胞腫、プロラクチン産生腫瘍、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、扁桃腺癌、脾臓癌、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンガー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルシノイド、胃腸管カルシノイド、線維肉腫、乳癌、筋肉癌、パジェット病、子宮頸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胆管癌、頭部癌、眼癌、鼻咽頭癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポシ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴン産生腫瘍、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、真菌性真菌症、インスリノーマ、カルシノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、唇癌、髄膜癌、口癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃腺癌。
【0035】
より好ましくは更に、該癌は、以下の癌を含む群から選択される：結腸直腸癌、甲状腺癌、リンパ腫、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、カルチノイド、頭頸部癌、胃癌、尿路上皮癌、前立腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、神経膠腫、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、肝臓癌および腎癌。
【0036】
更により好ましくは、該癌は結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌または肝臓癌である。
【0037】
本発明のもう１つの態様においては、本発明の免疫原性物質、ベクター、ＤＮＡワクチンまたは医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、癌に罹患している又は癌の素因を有する対象にワクチン接種する方法を提供する。
【0038】
最も好ましくは、本明細書中で言及されている癌は以下の癌の任意の１以上を含む：鼻咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎癌、結合組織癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、喉頭癌、口腔癌、肝癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリン産生腫瘍、褐色細胞腫、プロラクチン産生腫瘍、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、扁桃腺癌、脾臓癌、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンガー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明癌、カルシノイド、胃腸管カルシノイド、線維肉腫、乳癌、筋肉癌、パジェット病、子宮頸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、胆管癌、頭部癌、眼癌、鼻咽頭癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポシ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、骨髄腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴン産生腫瘍、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、真菌性真菌症、インスリノーマ、カルシノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、唇癌、髄膜癌、口癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃腺癌。
【0039】
より好ましくは更に、該癌は、以下の癌を含む群から選択される：結腸直腸癌、甲状腺癌、リンパ腫、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、カルチノイド、頭頸部癌、胃癌、尿路上皮癌、前立腺癌、精巣癌、子宮内膜癌、神経膠腫、乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、肝臓癌および腎癌。
【0040】
更により好ましくは、該癌は結腸直腸癌、頭頸部扁平上皮癌または肝臓癌である。
【0041】
後記の特許請求の範囲および本発明の前記説明においては、明示的な文言または必要な含意ゆえに文脈が別の解釈を要求する場合を除き、「含む」なる語または「含み」もしくは「含んで」のような派生語は包括的な意味で用いられ、すなわち、示されている特徴の存在を示すために用いられるが、本発明の種々の実施形態における他の特徴の存在または追加を除外するものではない。
【0042】
本明細書中で引用されている任意の特許または特許出願を含む全ての参考文献を参照により本明細書に組み入れることとする。いずれの参考文献も先行技術を構成するとは認められない。更に、先行技術はいずれも、当技術分野における一般的な知識の一部を構成するとは認められない。
【0043】
本発明の各態様の好ましい特徴は、その他の態様のいずれかに関して記載されているとおりでありうる。
【0044】
本発明の他の特徴は以下の具体例（実施例）から明らかになるであろう。一般的に言えば、本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含む）に開示されている特徴の任意の新規のもの、または任意の新規の組合せに及ぶ。したがって、本発明の個々の態様、実施形態または具体例に関して記載されている特徴、整数、特性、化合物または化学部分は、本明細書に記載されている任意の他の態様、実施形態または具体例に、それらに不適合でない限り、適用可能であると理解されるべきである。
【0045】
更に、特に示されていない限り、本明細書に開示されている任意の特徴は、同じまたは類似の目的を果たす代替的特徴により置換されうる。
【0046】
本明細書の説明および特許請求の範囲の全体を通して、文脈に矛盾しない限り、単数形は複数形を包含する。特に、単数形が用いられている場合、文脈に矛盾しない限り、その特定は単数形だけでなく複数形をも想定していると理解されるべきである。
【0047】
次に、本発明の１つの実施形態を、以下を参照して、単なる例示として説明する。
【実施例】
【0048】
図１：ＲＮＡ－ｓｅｑの前のＥｐＣＡＭ選別による上皮細胞および腫瘍細胞の単離。（Ａ）腫瘍部位からの２つの距離で行われた腫瘍および健常組織切除の概要図。サンプルを３名の患者の直腸腫瘍から採取した。（Ｂ）サンプル処理および精製フローチャート。（Ｃ）細胞選別の前および後のＥｐＣＡＭ＋およびＣＤ３－精製に関するフローサイトメトリーゲーティング。（Ｄ）未精製腫瘍組織および精製腫瘍組織と比較した場合の健常組織「近」および「遠」の４つのＲＮＡ－ｓｅｑデータセットにわたるリード（読取り；ｒｅａｄ）の例。イメージは統合ゲノミクスビューア（Ｂｒｏａｄ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から取得された。４つの矢印はカバレッジバーを示し、下のボックスは患者サンプルの１セットにおける整列リードを示す。
【0049】
図２：差次的発現分析に基づく更なる研究のための候補の特定。（Ａ）２つの比較に基づいて差次的発現遺伝子の遺伝子リストを得るためのワークフロー（それぞれ左側および右側の、精製腫瘍対精製健常結腸「遠」、および精製腫瘍対精製健常結腸「近」）。遺伝子リストは、全３名の患者にわたって、そして３名の患者のうちの２名において別々に、有意に差次的に発現された遺伝子から得た。これらを整列させ、「遠」および「近」比較の間で相互参照して、より小さな遺伝子リストを得、これを更に、健常組織における発現に基づいて、そして最終的には更なる研究に対する適合性に基づいて縮小させた。（Ｂ）更なる分析のために選択された７つの遺伝子のそれぞれに関する正規化カウント。４つの条件のそれぞれに関して、全３名の患者を表す箱ひげ図として、カウントが示されている。
【0050】
図３：健常組織および癌における候補腫瘍抗原の発現プロファイル。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓを使用して、７つの特定されたＴＡＡのタンパク質発現を、ある範囲の健常組織（Ａ）および腫瘍型（Ｂ）において、位置ごとに評価した。免疫組織化学は、ＤＮＡＪＢ７発現が腫瘍サンプルに限局していることを示した。胃腸腫瘍における染色の例が示されている（Ｃ）。
【0051】
図４：予め定められた癌精巣抗原と比較した場合のＤＮＡＪＢ７の発現プロファイル。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓを使用して、ＤＮＡＪＢ７のタンパク質発現を、ある範囲の健常組織（Ａ）および腫瘍型（Ｂ）において、他の十分に特徴づけられた癌精巣抗原と共に、位置ごとに評価した。
【0052】
図５：候補ＴＡＡの免疫原性。各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）により評価した（ペプチド配列に関しては表４を参照されたい）。各陽性ペプチドプールに対する１０５個の培養ＰＢＭＣ当たりのＩＦＮ－γ＋スポット形成細胞の総数（Ａ）およびタンパク質におけるペプチド数に対する全体的な大きさ（Ｂ）をＣＲＣ患者において評価した。（Ｃ）ＤＮＡＪＢ７タンパク質を、１０個ずつ重複する３０個の２０マーに分割し（詳細は表２を参照されたい）、ついでそれらを、示されている１１個のペプチドプールのうちの２個に配置した。（Ｄ）ＩＦＮ－γ／グランザイムＢフルオロスポットによるＣＲＣ患者における免疫原性ＤＮＡＪＢ７ペプチドの特定の代表例。（Ｅ）この患者は、ペプチド３および２３に対する応答を示すペプチドプール３、６および１０に対するＩＦＮ－γおよびグランザイムＢ（「Ｇｒｚ－Ｂ」）の両方の応答を誘発した（例示ウェルイメージが示されている）。（Ｆ）１０％を超えるペプチド配列の応答率は、ペプチド２３が、試験された全てのドナーの中で最も免疫原性であることを示している。（Ｇ）試験された全ての癌を有する患者が、これまでのところ、抗ＤＮＡＪＢ７ Ｔ細胞応答を誘発しているようである（ＣＲＣ－結腸直腸癌；ＣＣ－胆管癌；ＨＣＣ－肝細胞癌；ＨＮＣ－頭頸部扁平上皮癌）。
【0053】
図６：候補ＴＡＡの免疫原性。各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を培養ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した。該タンパク質におけるペプチド数に対する１０５個の培養ＰＢＭＣ当たりのＩＦＮ－γ＋スポット形成細胞（ＳＦＣ）の総数を評価し、試験された全てのドナーにおいて応答中央値によりランク付けし（Ａ）、ついでＣＲＣ患者（青丸ＴＮＭステージ１／２；ｎ＝６、黒丸ＴＮＭステージ３；ｎ＝８）および健常ドナー（‘ＨＤ’，白丸；ｎ＝１０）により細分した（Ｂ）。（Ｃ）他の胃腸癌を有する患者を、抗ＤＮＡＪＢ７ Ｔ細胞応答を誘発する彼らの能力に関して試験した。（ＣＣ－胆管癌；ＨＣＣ－肝細胞癌；ＨＮＣ－頭頸部扁平上皮癌）。
【0054】
図７：ある新規ＴＡＡに対するＴＨ１応答は結腸直腸癌（ＣＲＣ）における調節性Ｔ細胞枯渇により明らかとなった。（Ａ）結腸切除後のＣＲＣ患者に治療第１日～８日および第１５日～２２日に低用量メトロノミックシクロホスファミドを投与し、治療中を通じて血液サンプルを毎週採取した。各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を各時点で培養ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔウェルの例示イメージが示されている（Ｂ）。（Ｃ）１０５個の培養ＰＢＭＣ当たりのＩＦＮ－γ＋スポット形成細胞（ＳＦＣ）の総数（重複実験ウェルの平均）を各ＴＡＡに関して計算した。（Ｄ）ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞数およびＫｉ６７＋ Ｔｒｅｇ（％）をシクロホスファミド処理中にフローサイトメトリーにより測定した。
【0055】
図８：ある新規ＴＡＡに対するＴＨ１応答は肝細胞癌（ＨＣＣ）における調節性Ｔ細胞枯渇により明らかとなった。（Ａ）ＨＣＣ患者に治療第１日～８日および第１５日～２２日に低用量メトロノミックシクロホスファミドを投与し、治療中を通じて血液サンプルを毎週採取した。各候補ＴＡＡのタンパク質配列全体にわたるペプチドプールに対するＴ細胞応答を各時点で培養ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔにより評価した。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔウェルの例示イメージが示されている（Ａ）。（Ｂ）１０５個の培養ＰＢＭＣ当たりのＩＦＮ－γ＋スポット形成細胞（ＳＦＣ）の総数（重複実験ウェルの平均）を各ＴＡＡに関して計算した。（Ｃ）ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＦｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞数およびＫｉ６７＋ Ｔｒｅｇ（％）をシクロホスファミド処理中にフローサイトメトリーにより測定した。
【0056】
表１．最終分析により特定された全２３個の遺伝子の詳細。「＊」は、前に進められたものを強調表示しており、「＊＊」は、タンパク質をコードしていなかったものを示す。
【0057】
表２．ＤＮＡＪＢ７のアミノ酸配列（配列番号３１；アクセッション番号ＮＰ＿６６０１５７．１）
表３．ＤＮＡＪＢ７の核酸配列（配列番号３２；アクセッション番号ＮＭ＿１４５１７４．１）
表４．ＤＮＡＪＢ７のペプチド配列。
表３．ＤＮＡＪＢ７の核酸配列（配列番号３２；アクセッション番号ＮＭ＿１４５１７４．１）
表４．ＤＮＡＪＢ７のペプチド配列。
【0058】
詳細な説明
方法および材料
患者の治療スケジュール
経口投与される５０ｍｇのシクロホスファミドを治療第１日～７日および第１５日～２１日に１日２回投与した。治療第８日～１４日および第２２日～１０６日ならびに患者に再発が生じるまでは、シクロホスファミドを投与しなかった。末梢血サンプル（４０ｍＬ）を治療中に定期的に採取した。
方法および材料
患者の治療スケジュール
経口投与される５０ｍｇのシクロホスファミドを治療第１日～７日および第１５日～２１日に１日２回投与した。治療第８日～１４日および第２２日～１０６日ならびに患者に再発が生じるまでは、シクロホスファミドを投与しなかった。末梢血サンプル（４０ｍＬ）を治療中に定期的に採取した。
【0059】
結腸組織および腫瘍組織の切除
カーディフのウェールズ大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｗａｌｅｓ，Ｃａｒｄｉｆｆ）において結腸直腸腺癌の原発腫瘍切除を受けた３名の患者から結腸直腸腫瘍およびペアになったバックグラウンド（未罹患）結腸検体を得た。腫瘍部位からの「近」（２ｃｍ以内）および「遠」（少なくとも１０ｃｍ）の両方の、切除組織の巨視的正常切片から、自己結腸サンプルを切り出した（図１Ａ）。全ての新鮮腫瘍サンプルを、組織病理学的病期分類に必要な腫瘍の深部を損なわないように、検体の管腔側面から得た。全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。ウェールズ研究倫理委員会（Ｗａｌｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）はこの研究に倫理的承認を与えた。
カーディフのウェールズ大学病院（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｗａｌｅｓ，Ｃａｒｄｉｆｆ）において結腸直腸腺癌の原発腫瘍切除を受けた３名の患者から結腸直腸腫瘍およびペアになったバックグラウンド（未罹患）結腸検体を得た。腫瘍部位からの「近」（２ｃｍ以内）および「遠」（少なくとも１０ｃｍ）の両方の、切除組織の巨視的正常切片から、自己結腸サンプルを切り出した（図１Ａ）。全ての新鮮腫瘍サンプルを、組織病理学的病期分類に必要な腫瘍の深部を損なわないように、検体の管腔側面から得た。全ての参加者からインフォームドコンセントを得た。ウェールズ研究倫理委員会（Ｗａｌｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）はこの研究に倫理的承認を与えた。
【0060】
組織サンプルの精製
バックグラウンド結腸および腫瘍検体を輸送し、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、２％ ヒトＡＢ血清（Ｗｅｌｓｈ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ）、２０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および２μｇ／ｍｌ ファンギゾン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で補足されたＲＰＭＩを含む抽出培地中で洗浄した。患者からの切除から３０分以内に、サンプルをペトリ皿において刃で細かく切り刻み、７０μｍの細胞濾過機に通して単細胞懸濁液を集めた。いずれの場合においても、コラゲナーゼまたはＤＮアーゼ処理を行わなかった。腫瘍、近および遠健常結腸組織の解離細胞調製物を、まず、アミン反応性生存性色素生／死（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ）固定可能Ａｑｕａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色し、ついでＣＤ３－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＥｐＣＡＭ－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）抗体で表面マーカー染色を行った。ＥｐＣＡＭを選択したのは、それが間質組織上の上皮集団および免疫集団の単離を可能にするからであり（Ｍａｒｔｏｗｉｃｚら，２０１６；Ｓｃｈｎｅｌｌら，２０１３）、Ｔ細胞集団が下流分析に含まれないことを保証するためにＣＤ３を使用した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ）で生／死－ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ３－集団へと選別する前に、サンプルをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ ＢＳＡ）に再懸濁させた。ゲーティング法が示されている（図１Ｃ）。同様にＣＤ３およびＥｐＣＡＭ抗体で染色された腫瘍組織を更に、ゲーティング無しで細胞選別機に通過させ、ＲＮＡ－ｓｅｑのための未選別対照として使用した。全てのサンプルを、ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中に直接選別し、－８０℃で凍結させた。凍結サンプルを解凍し、ＲＮＡ簡便微量単離（ｅａｓｙ ｍｉｃｒｏ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを単離した。
バックグラウンド結腸および腫瘍検体を輸送し、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ－グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、２％ ヒトＡＢ血清（Ｗｅｌｓｈ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｒｖｉｃｅ）、２０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および２μｇ／ｍｌ ファンギゾン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で補足されたＲＰＭＩを含む抽出培地中で洗浄した。患者からの切除から３０分以内に、サンプルをペトリ皿において刃で細かく切り刻み、７０μｍの細胞濾過機に通して単細胞懸濁液を集めた。いずれの場合においても、コラゲナーゼまたはＤＮアーゼ処理を行わなかった。腫瘍、近および遠健常結腸組織の解離細胞調製物を、まず、アミン反応性生存性色素生／死（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ）固定可能Ａｑｕａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色し、ついでＣＤ３－ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＥｐＣＡＭ－ＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）抗体で表面マーカー染色を行った。ＥｐＣＡＭを選択したのは、それが間質組織上の上皮集団および免疫集団の単離を可能にするからであり（Ｍａｒｔｏｗｉｃｚら，２０１６；Ｓｃｈｎｅｌｌら，２０１３）、Ｔ細胞集団が下流分析に含まれないことを保証するためにＣＤ３を使用した。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤ）で生／死－ＥｐＣＡＭ＋ＣＤ３－集団へと選別する前に、サンプルをＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、２％ ＢＳＡ）に再懸濁させた。ゲーティング法が示されている（図１Ｃ）。同様にＣＤ３およびＥｐＣＡＭ抗体で染色された腫瘍組織を更に、ゲーティング無しで細胞選別機に通過させ、ＲＮＡ－ｓｅｑのための未選別対照として使用した。全てのサンプルを、ベータメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中に直接選別し、－８０℃で凍結させた。凍結サンプルを解凍し、ＲＮＡ簡便微量単離（ｅａｓｙ ｍｉｃｒｏ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを単離した。
【0061】
ＲＮＡ配列決定
ライブラリー調製およびＲＮＡ配列決定はＶＧＴＩ－ＦＬ（Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ）により実施された。精製されたＲＮＡを使用し、ＴｒｕＳｅｑキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してライブラリーを作製した。ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉ Ｓｅｑプラットフォームで３７～６３Ｍリード（ｒｅａｄ）ペアの深度まで配列決定した。ペア・エンド・リード（ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ ｒｅａｄ）をカーディフ大学パイプライン（Ｃａｒｄｉｆｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｉｐｅｌｉｎｅ）で処理し、トリミングし、マッピングし、品質管理分析を行った。リードをＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｂｏｌｇｅｒら，２０１４）でトリミングし、デフォルトパラメーターを用いるＦａｓｔＱＣ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）を使用して品質に関して評価した。ＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎら，２０１３）を使用してＥｎｓｅｍｂｌ ＦＴＰサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｆｏ／ｄａｔａ／ｆｔｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ／）からダウンロードされたＥｎｓｅｍｂｌヒトゲノムビルドＧＲＣｈ３８．８９に対してマッピングした。
ライブラリー調製およびＲＮＡ配列決定はＶＧＴＩ－ＦＬ（Ｆｌｏｒｉｄａ，ＵＳＡ）により実施された。精製されたＲＮＡを使用し、ＴｒｕＳｅｑキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してライブラリーを作製した。ライブラリーをＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉ Ｓｅｑプラットフォームで３７～６３Ｍリード（ｒｅａｄ）ペアの深度まで配列決定した。ペア・エンド・リード（ｐａｉｒｅｄ ｅｎｄ ｒｅａｄ）をカーディフ大学パイプライン（Ｃａｒｄｉｆｆ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｐｉｐｅｌｉｎｅ）で処理し、トリミングし、マッピングし、品質管理分析を行った。リードをＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｂｏｌｇｅｒら，２０１４）でトリミングし、デフォルトパラメーターを用いるＦａｓｔＱＣ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）を使用して品質に関して評価した。ＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎら，２０１３）を使用してＥｎｓｅｍｂｌ ＦＴＰサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ／ｉｎｆｏ／ｄａｔａ／ｆｔｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ／）からダウンロードされたＥｎｓｅｍｂｌヒトゲノムビルドＧＲＣｈ３８．８９に対してマッピングした。
【0062】
差次的発現分析
整列リードを、ＲにおけるＤＥＳＥＱ２（ＤＥＳＥＱ２ ｉｎ Ｒ）（Ｌｏｖｅら，２０１４）を使用して正規化した。精製腫瘍サンプル、精製近上皮および精製遠上皮において差次的発現遺伝子を特定した。ペア分析において全ドナーに関してサンプル型間でＤＥＳＥＱ２を使用して差次的発現分析を行った。腫瘍および近または遠組織の比較を行い、マッピングされた１００万個のリード当たりのキロベースの転写産物当たりの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）（ＦＰＫＭ値）を使用して、比較のためにリードを標準化した。３ドナー発現分析の場合、３個のドナーのうちのいずれか２個において、３．５を超えるｌｏｇ２倍変化、３．５未満の健常組織におけるＦＰＫＭ値、および４．０を超える腫瘍におけるＦＰＫＭ値を有する、ならびに３個のドナーにおいて０．０５未満の補正Ｐ値を有する遺伝子を、更なる分析のために前に進めた。
整列リードを、ＲにおけるＤＥＳＥＱ２（ＤＥＳＥＱ２ ｉｎ Ｒ）（Ｌｏｖｅら，２０１４）を使用して正規化した。精製腫瘍サンプル、精製近上皮および精製遠上皮において差次的発現遺伝子を特定した。ペア分析において全ドナーに関してサンプル型間でＤＥＳＥＱ２を使用して差次的発現分析を行った。腫瘍および近または遠組織の比較を行い、マッピングされた１００万個のリード当たりのキロベースの転写産物当たりの断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｒｅａｄｓ）（ＦＰＫＭ値）を使用して、比較のためにリードを標準化した。３ドナー発現分析の場合、３個のドナーのうちのいずれか２個において、３．５を超えるｌｏｇ２倍変化、３．５未満の健常組織におけるＦＰＫＭ値、および４．０を超える腫瘍におけるＦＰＫＭ値を有する、ならびに３個のドナーにおいて０．０５未満の補正Ｐ値を有する遺伝子を、更なる分析のために前に進めた。
【0063】
それらの３個のドナーのうちの２個のデータに関して別々の比較において有意に差次的に発現された遺伝子に、該分析を拡張させた（これは、１個のドナーにおいては発現されなかったが残りの２個のドナーにおいては高発現された遺伝子を特定するのに役立った）。両方のドナーの腫瘍組織における５．０より大きな及び健常組織における１．０未満のＦＰＫＭ、６より大きなｌｏｇ２倍変化、ならびに０．０５未満の補正ｐ値では、より高い発現カットオフ値を用いた。これらの比較から得られた遺伝子リストを更なる分析のために前に進めた。マッピングプされたリード（ｒｅａｄ）の精査を、統合ゲノムビューアーソフトウェア（Ｂｒｏａｄ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して行った。
【0064】
ＰＢＭＣ培養
血液サンプルを手術の最大７日前に１０ｍｌのリチウムヘパリンチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内に集めた。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）でのヘパリン処理血液の遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ついで細胞を洗浄し、ＣＴＬ Ｔｅｓｔ Ｐｌｕｓ培地（ＣＴＬ Ｅｕｒｏｐｅ）、Ｌ－グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンに再懸濁させた。ＰＢＭＣを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）内でプレーティングし、第３日、第７日および第１０日に２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含有する新鮮培地で補足された特異的抗原を含有する３重重複（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）ウェル内で１４日間培養した。
血液サンプルを手術の最大７日前に１０ｍｌのリチウムヘパリンチューブ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内に集めた。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）でのヘパリン処理血液の遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ついで細胞を洗浄し、ＣＴＬ Ｔｅｓｔ Ｐｌｕｓ培地（ＣＴＬ Ｅｕｒｏｐｅ）、Ｌ－グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンに再懸濁させた。ＰＢＭＣを９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）内でプレーティングし、第３日、第７日および第１０日に２０ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２を含有する新鮮培地で補足された特異的抗原を含有する３重重複（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）ウェル内で１４日間培養した。
【0065】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
既に記載されているとおりに（Ｓｃｕｒｒら，２０１７）、新規腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。簡潔に説明すると、ＰＶＤＦ ９６ウェル濾過プレートを５０μｌのＩＦＮ－γ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）でコーティングした。細胞を洗浄し、プレーティングし、５μｇ／ｍｌ 抗原で刺激した［これを２重重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ウェルにおいて行った］。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、細胞を除去し、スポットを現像した。スポット形成細胞（ＳＦＣ）、すなわち、ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞を、自動ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ Ｕｌｔｒａ；ＣＴＬ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）のＳｍａｒｔＣｏｕｎｔ設定を用いて計数した。陽性応答は、陰性（抗原無し）対照の少なくとも２倍および少なくとも２０個のＳＦＣ（１０５個の培養ＰＢＭＣ当たり）を有するものとして特定された。スポット数が１０００を超えるウェルは、数が多すぎて数えられないとみなされ、このレベルが上限とされた。
既に記載されているとおりに（Ｓｃｕｒｒら，２０１７）、新規腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。簡潔に説明すると、ＰＶＤＦ ９６ウェル濾過プレートを５０μｌのＩＦＮ－γ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）でコーティングした。細胞を洗浄し、プレーティングし、５μｇ／ｍｌ 抗原で刺激した［これを２重重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ウェルにおいて行った］。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、細胞を除去し、スポットを現像した。スポット形成細胞（ＳＦＣ）、すなわち、ＩＦＮ－γ産生Ｔ細胞を、自動ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ Ｕｌｔｒａ；ＣＴＬ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）のＳｍａｒｔＣｏｕｎｔ設定を用いて計数した。陽性応答は、陰性（抗原無し）対照の少なくとも２倍および少なくとも２０個のＳＦＣ（１０５個の培養ＰＢＭＣ当たり）を有するものとして特定された。スポット数が１０００を超えるウェルは、数が多すぎて数えられないとみなされ、このレベルが上限とされた。
【0066】
フルオロスポットアッセイ
既に記載されているとおりに（Ｓｃｕｒｒら，２０１７）、新規腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、ＩＦＮ－γ／グランザイムＢフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）アッセイを行った。簡潔に説明すると、低い自己蛍光用に設計されたＰＶＤＦ ９６ウェル濾過プレート（ＩＰＦＬ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を全てのフルオロスポットアッセイに使用した。ＩＦＮ－γおよびグランザイムＢに対する抗体ならびに蛍光増強キットをＭａｂｔｅｃｈから入手した。全ての抗体のインキュベーションは５０μｌ／ウェルで行った。ついで細胞を洗浄し、プレーティングし、５μｇ／ｍｌ 抗原で刺激した［これを２重重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ウェルにおいて行った］。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。サイトカイン産生Ｔ細胞を、自動フルオロスポットプレートリーダー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ Ｕｌｔｒａ；ＣＴＬ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）のスマートカウント（Ｓｍａｒｔ Ｃｏｕｎｔ）設定を用いて計数して、一重および二重サイトカイン産生細胞の評価を可能にした。陽性応答は、陰性（抗原無し）対照の少なくとも２倍および少なくとも５個のＳＦＣ（１０５個の培養ＰＢＭＣ当たり）を有するものとして特定された。
既に記載されているとおりに（Ｓｃｕｒｒら，２０１７）、新規腫瘍抗原特異的Ｔ細胞応答を評価するために、ＩＦＮ－γ／グランザイムＢフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）アッセイを行った。簡潔に説明すると、低い自己蛍光用に設計されたＰＶＤＦ ９６ウェル濾過プレート（ＩＰＦＬ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を全てのフルオロスポットアッセイに使用した。ＩＦＮ－γおよびグランザイムＢに対する抗体ならびに蛍光増強キットをＭａｂｔｅｃｈから入手した。全ての抗体のインキュベーションは５０μｌ／ウェルで行った。ついで細胞を洗浄し、プレーティングし、５μｇ／ｍｌ 抗原で刺激した［これを２重重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ウェルにおいて行った］。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で２４時間インキュベートした。サイトカイン産生Ｔ細胞を、自動フルオロスポットプレートリーダー（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｓ６ Ｕｌｔｒａ；ＣＴＬ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）のスマートカウント（Ｓｍａｒｔ Ｃｏｕｎｔ）設定を用いて計数して、一重および二重サイトカイン産生細胞の評価を可能にした。陽性応答は、陰性（抗原無し）対照の少なくとも２倍および少なくとも５個のＳＦＣ（１０５個の培養ＰＢＭＣ当たり）を有するものとして特定された。
【0067】
抗原
特定された各ＴＡＡのタンパク質配列全体をカバーする、１０アミノ酸が重複した２０マーペプチドを、Ｆｍｏｃ化学法により、９５％を超える純度で合成し（ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）、示されているとおりのプールに分割した（表４）。リコール抗原であるツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ；Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）および血球凝集素［ＨＡ；英国ロンドンの国立医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）のＪｏｈｎ Ｓｋｅｈｅｌ博士からの寄贈］ならびにＴ細胞マイトジェンＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ）を陽性対照として使用した。全ての抗原を５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。
特定された各ＴＡＡのタンパク質配列全体をカバーする、１０アミノ酸が重複した２０マーペプチドを、Ｆｍｏｃ化学法により、９５％を超える純度で合成し（ＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）、示されているとおりのプールに分割した（表４）。リコール抗原であるツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ；Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）および血球凝集素［ＨＡ；英国ロンドンの国立医学研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）のＪｏｈｎ Ｓｋｅｈｅｌ博士からの寄贈］ならびにＴ細胞マイトジェンＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ）を陽性対照として使用した。全ての抗原を５μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。
【0068】
免疫組織化学
この研究で特定したＴＡＡを、ヒトタンパク質アトラスリソース（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ）（Ｕｈｌｅｎ Ｍら，２０１５）を使用することにより健常組織および或る範囲の腫瘍サンプルにおけるタンパク質発現特性に関して評価した。
この研究で特定したＴＡＡを、ヒトタンパク質アトラスリソース（Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓ ｒｅｓｏｕｒｃｅ）（Ｕｈｌｅｎ Ｍら，２０１５）を使用することにより健常組織および或る範囲の腫瘍サンプルにおけるタンパク質発現特性に関して評価した。
【0069】
結果
ＲＮＡ－ｓｅｑ分析前のサンプルの精製は差次的発現遺伝子の分離能の増強をもたらした
ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットは、幾つかの正規化手順に従うことによって比較可能であった。全３名の患者における精製腫瘍組織に対する健常組織（「近」および「遠」）のＤＥＳＥＱ２を用いて差次的発現比較を行い、ついで２名の患者の各組合せごとに別々の分析を行った。健常組織に対する未精製腫瘍組織の追加的な比較を行って、ＥｐＣＡＭ選別の影響を調べた。免疫療法により標的化されうる関連遺伝子を見つけるために、腫瘍組織における高発現と組合された健常組織における低レベル発現を定めた基準（ＦＰＫＭおよびｌｏｇ２倍変化に基づく）を適用した。０．０５未満の補正Ｐ値が割り当てられた遺伝子のみを更なる分析のために前に進めた。
ＲＮＡ－ｓｅｑ分析前のサンプルの精製は差次的発現遺伝子の分離能の増強をもたらした
ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットは、幾つかの正規化手順に従うことによって比較可能であった。全３名の患者における精製腫瘍組織に対する健常組織（「近」および「遠」）のＤＥＳＥＱ２を用いて差次的発現比較を行い、ついで２名の患者の各組合せごとに別々の分析を行った。健常組織に対する未精製腫瘍組織の追加的な比較を行って、ＥｐＣＡＭ選別の影響を調べた。免疫療法により標的化されうる関連遺伝子を見つけるために、腫瘍組織における高発現と組合された健常組織における低レベル発現を定めた基準（ＦＰＫＭおよびｌｏｇ２倍変化に基づく）を適用した。０．０５未満の補正Ｐ値が割り当てられた遺伝子のみを更なる分析のために前に進めた。
【0070】
初期遺伝子リストは、腫瘍と遠結腸組織との間で差次的発現を示す８３個の有意な遺伝子を示し、一方、腫瘍と近結腸組織との間では９２個の遺伝子を示した。これらの遺伝子リストの相互参照は、両方の比較において有意な基準を満たす５個の遺伝子を与えた（前に進めたもののうちの以下の４つを含む：ＡＲＳＪ、ＣＥＮＰＱ、ＺＣ３Ｈ１２ＢおよびＣＥＡＣＡＭ３）。本発明者らの分析を拡張するために、本発明者らは、３名中２名の患者の腫瘍組織において有意に発現されたＤＥＧを、より高いレベル（発現カットオフを増加させ、健常組織発現の閾値を低下させた）まで調べた。これらの遺伝子リストを３つのドナーリストと組合せ、ついで近および遠組織と相互参照した（図２Ａ）。これは５４個の遺伝子の初期セットを与え、それを、全３個のドナーの健常組織での発現レベルに基づいて２３個に絞った。これらの２３個の遺伝子のうち、１８個がタンパク質でコードされていた。これらの１８個の遺伝子を精査し、更なる分析に最も適したものを選択して、中枢神経系に関与するものを排除し、あるいは、ＩＧＶにおけるマッピングされたリード（ｒｅａｄ）の視覚的キュレーションにより測定された３個のドナーにおける一貫性のない発現またはリード（ｒｅａｄ）マッピングプロファイルを示す遺伝子を排除した。
【0071】
選択された最終的な遺伝子は、治療的利用のためのそれらの理想的発現プロファイルに基づいて、ＤＮＡＪＢ７、ＣＥＮＰＱ、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ、ＺＳＷＩＭ１、ＣＥＡＣＡＭ３、ＡＲＳＪおよびＣＹＰ２Ｂ６であった（図２Ｂ）。未精製腫瘍組織からのＲＮＡ－ｓｅｑデータにおける関連発現プロファイルの精査は、これらの遺伝子のいずれもが、精製組織より遥かに低い発現レベルを示して、全ドナーの未精製組織においては検出されなかったことを例証している。２個のドナーの未精製組織において検出されたものはＤＥＳＥＱ２による差次的発現分析においては有意とはならず、この場合もまた、ＲＮＡ－ｓｅｑ分析前の精製の効力を強く示している。
【0072】
複数の健常組織にわたるタンパク質発現の分析は、癌精巣抗原としての、および免疫療法の適切な標的としてのＤＮＡＪＢ７を強く示している
各候補ＴＡＡのタンパク質発現レベルを、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓにおいて公的に利用可能な免疫組織化学データを使用して評価した。各候補は、ＡＲＳＪではより限定的であったものの、健常組織よりも腫瘍組織において有意なアップレギュレーションを示したが、免疫特権部位である精巣を除く任意の健常組織においてＤＮＡＪＢ７が発現を完全に欠いていることを考慮すると、ＤＮＡＪＢ７が新規癌精巣抗原として特定されたのは予想外であった（図３Ａ～Ｃ）。更に、進化的に保存されたＤＮＡＪ熱ショックファミリーに属するタンパク質であるＤＮＡＪＢ７は、非常に広範な固形腫瘍、特に消化管および消化副器官の腫瘍（結腸直腸癌および膵管腺癌を含む）において発現された（図３Ｂ；例示的免疫組織化学データは図３Ｃをも含んでいた）。
各候補ＴＡＡのタンパク質発現レベルを、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓにおいて公的に利用可能な免疫組織化学データを使用して評価した。各候補は、ＡＲＳＪではより限定的であったものの、健常組織よりも腫瘍組織において有意なアップレギュレーションを示したが、免疫特権部位である精巣を除く任意の健常組織においてＤＮＡＪＢ７が発現を完全に欠いていることを考慮すると、ＤＮＡＪＢ７が新規癌精巣抗原として特定されたのは予想外であった（図３Ａ～Ｃ）。更に、進化的に保存されたＤＮＡＪ熱ショックファミリーに属するタンパク質であるＤＮＡＪＢ７は、非常に広範な固形腫瘍、特に消化管および消化副器官の腫瘍（結腸直腸癌および膵管腺癌を含む）において発現された（図３Ｂ；例示的免疫組織化学データは図３Ｃをも含んでいた）。
【0073】
ＤＮＡＪＢ７の発現プロファイルを、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ１およびＳＳＸ２を含む明確に定められた他の６つの癌精巣抗原と比較した。ＳＰＡＧ９を除く全てのこれらの抗原の高タンパク質発現は精巣に限局していることが確認された（図４Ａ）。その他の癌精巣抗原と比較して、ＤＮＡＪＢ７は最も広い腫瘍型範囲で発現され、試験された全患者の６７％以上が、リンパ腫を除く彼らの腫瘍において陽性（低、中、高）タンパク質発現を示した（図４Ｂ）。この注目すべきタンパク質発現プロファイルは、広範に適用可能な癌免疫療法の優れた標的として、ＤＮＡＪＢ７を確保させるものである。
【0074】
候補ＴＡＡ ＴＨ１応答の分析は、ＤＮＡＪＢ７が免疫原性であることを示している
関連遺伝子の特定およびタンパク質発現の確認の後、重複ペプチドプールとＣＲＣ患者および健常ドナーのＰＢＭＣの存在下の培養とを用いて、それらの免疫原性を評価した。ＩＦＮ－γ／グランザイムＢフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）による培養ＰＢＭＣの分析は、７個中５個のタンパク質が大多数のドナーにおいて免疫原性を示すことを確認した（図５Ａ～Ｂおよび６Ａ～Ｂ）。ペプチドライブラリーのサイズは各タンパク質によって大きな違いがあるため、各プールにおけるペプチドの数に関して免疫原性を標準化した（図５Ｂおよび６Ｂ）。この分析は、ＣＹＰ２Ｂ６、ＤＮＡＪＢ７およびＣＥＡＣＡＭ３が、ＨＬＡ型による層別化の非存在下、複数の個人の間で同等に免疫原性であることを示した。逆に、ＣＥＮＰＱおよびＡＲＳＪは、試験したほとんどのドナーにおいて免疫原性が低かった。ＤＮＡＪＢ７は、肝細胞癌、胆管癌および非消化管頭頸部扁平上皮癌を含む他の腫瘍型を有する患者においても免疫原性があることが判明した（図５Ｇおよび６Ｃ）。
関連遺伝子の特定およびタンパク質発現の確認の後、重複ペプチドプールとＣＲＣ患者および健常ドナーのＰＢＭＣの存在下の培養とを用いて、それらの免疫原性を評価した。ＩＦＮ－γ／グランザイムＢフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）による培養ＰＢＭＣの分析は、７個中５個のタンパク質が大多数のドナーにおいて免疫原性を示すことを確認した（図５Ａ～Ｂおよび６Ａ～Ｂ）。ペプチドライブラリーのサイズは各タンパク質によって大きな違いがあるため、各プールにおけるペプチドの数に関して免疫原性を標準化した（図５Ｂおよび６Ｂ）。この分析は、ＣＹＰ２Ｂ６、ＤＮＡＪＢ７およびＣＥＡＣＡＭ３が、ＨＬＡ型による層別化の非存在下、複数の個人の間で同等に免疫原性であることを示した。逆に、ＣＥＮＰＱおよびＡＲＳＪは、試験したほとんどのドナーにおいて免疫原性が低かった。ＤＮＡＪＢ７は、肝細胞癌、胆管癌および非消化管頭頸部扁平上皮癌を含む他の腫瘍型を有する患者においても免疫原性があることが判明した（図５Ｇおよび６Ｃ）。
【0075】
更に、前記のとおり、本発明者らのペプチドプール設計は、マトリックス形式に基づいて免疫原性を調べて、陽性Ｔ細胞応答をもたらすペプチドを決定することを可能にした（ＤＮＡＪＢ７の例；図５Ｃ～Ｆおよび６）。このタイプの分析はＴＡＡのＴＨ１刺激領域の単離に重要である。それは、ＣＲＣにおいて重要な複数の抗原の免疫原性成分に基づいてワクチンに配合されることが可能であり、また、免疫応答の増強のための、エピトープに基づく修飾および戦略の対象となりうる領域でもある。１名のＣＲＣ患者の代表例は、ＤＮＡＪＢ７ペプチドプール３、６および１０に対する陽性ＩＦＮ－γおよびグランザイムＢ応答を示し、これは、ペプチド３および２３（特にペプチド１１、３０、２６、８、１３、１４、１９および２７；図５ＤおよびＥ）内に含有されるエピトープに対するＴ細胞応答を示している。注目すべきことに、これらの免疫原性断片は、Ｃ末端付近からＮ末端にわたる全長ＤＮＡＪＢ７ペプチドの相当な部分を含み、このことは、該タンパク質の全長にわたる断片が応答を誘発しうることを有利にも示している。ペプチド２３はＤＮＡＪＢ７タンパク質の最も高い免疫原性領域であり、試験された健常対照ドナーおよびＣＲＣ患者の３９％において応答が見いだされた（図５Ｆ）。ＤＮＡＪＢ７は肝細胞癌、胆管癌および頭頸部癌において試験され、これらの患者においても免疫原性があることが判明した（図５Ｇおよび６Ｃ）。
【0076】
抗ＤＮＡＪＢ７ ＴＨ１応答はシクロホスファミド治療中に誘導される
本発明者らは、抗腫瘍ＴＨ１エフェクター応答が調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）により調節されること、およびインビトロでの枯渇または低用量シクロホスファミドによるインビボでの抑制／枯渇によるこれらのＴｒｅｇの標的化が抗腫瘍（５Ｔ４）免疫応答を増強することを既に示している（Ｓｃｕｒｒら，２０１７）。本発明者らは、短期間のメトロノミックシクロホスファミドの投与を受けた結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者（図７）および肝細胞（ＨＣＣ）患者（図８）において、新規腫瘍抗原に対してＴ細胞応答が誘導されるかどうかを評価することに努めた。抗５Ｔ４ ＴＨ１応答は、両方の患者において、４倍以上増強した。これは、生存転帰の改善に関連することが既に確認されている効果である（Ｓｃｕｒｒら，２０１７）。興味深いことに、抗ＤＮＡＪＢ７ ＴＨ１応答も、両方の場合において、この治療応答プロファイルを反映していたが、ＡＲＳＪ、ＣＥＮＰＱ、ＺＳＷＩＭ１およびＣＹＰ２Ｂ６に対しては応答が誘導されなかった（図７ＢおよびＣ、ならびに図８ＡおよびＢ）。これは、効率的な調節性Ｔ細胞の枯渇によっては応答が明らかに示されなかったことを考慮すると、ＣＲＣおよびＨＣＣにおいてはＤＮＡＪＢ７およびＣＥＡＣＡＭ３に対する応答が抑制されることを示唆している可能性がある（図７Ｄおよび図８Ｃ）。
本発明者らは、抗腫瘍ＴＨ１エフェクター応答が調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）により調節されること、およびインビトロでの枯渇または低用量シクロホスファミドによるインビボでの抑制／枯渇によるこれらのＴｒｅｇの標的化が抗腫瘍（５Ｔ４）免疫応答を増強することを既に示している（Ｓｃｕｒｒら，２０１７）。本発明者らは、短期間のメトロノミックシクロホスファミドの投与を受けた結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者（図７）および肝細胞（ＨＣＣ）患者（図８）において、新規腫瘍抗原に対してＴ細胞応答が誘導されるかどうかを評価することに努めた。抗５Ｔ４ ＴＨ１応答は、両方の患者において、４倍以上増強した。これは、生存転帰の改善に関連することが既に確認されている効果である（Ｓｃｕｒｒら，２０１７）。興味深いことに、抗ＤＮＡＪＢ７ ＴＨ１応答も、両方の場合において、この治療応答プロファイルを反映していたが、ＡＲＳＪ、ＣＥＮＰＱ、ＺＳＷＩＭ１およびＣＹＰ２Ｂ６に対しては応答が誘導されなかった（図７ＢおよびＣ、ならびに図８ＡおよびＢ）。これは、効率的な調節性Ｔ細胞の枯渇によっては応答が明らかに示されなかったことを考慮すると、ＣＲＣおよびＨＣＣにおいてはＤＮＡＪＢ７およびＣＥＡＣＡＭ３に対する応答が抑制されることを示唆している可能性がある（図７Ｄおよび図８Ｃ）。
【0077】
小括
本発明において、患者に適合したＥｐＣＡＭ＋ 結腸上皮細胞と比較して、高度に精製されたＥｐＣＡＭ＋ 結腸直腸腫瘍細胞のＲＮＡ配列決定を行って、最も差次的に発現される遺伝子を分析することにより、広範に発現される新規ＴＡＡのパネル（ＣＥＮＰＱ、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＤＮＡＪＢ７、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ、ＺＳＷＩＭ１、ＡＲＳＪ）を特定した。それらの遺伝子を明らかにするためには、腫瘍細胞の精製が必要であった。このことは、抗原特定のために腫瘍画分全体（すなわち、死細胞、間質細胞、免疫細胞および他の腫瘍浸潤細胞を含む）を配列決定する従来の方法が欠陥方法であることを示している。候補ＴＡＡのタンパク質発現を免疫組織化学法により確認し、これらの抗原に対する既存Ｔ細胞免疫原性をＩＦＮ－γ／グランザイムＢフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）により試験した。これらのうち、ＤＮＡＪＢ７（ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリーメンバーＢ７）は、その発現が精巣の細胞に著しく限局していたことから、新規癌精巣抗原として本発明において特定され、また、神経膠腫、乳癌、黒色腫、膵臓癌、肝臓癌、結腸直腸癌および腎癌を含む多種多様な腫瘍においてエフェクターおよびメモリーＴ細胞によって高度に免疫原性に認識されたため、種々の癌の治療におけるワクチン候補として有用である。
本発明において、患者に適合したＥｐＣＡＭ＋ 結腸上皮細胞と比較して、高度に精製されたＥｐＣＡＭ＋ 結腸直腸腫瘍細胞のＲＮＡ配列決定を行って、最も差次的に発現される遺伝子を分析することにより、広範に発現される新規ＴＡＡのパネル（ＣＥＮＰＱ、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＹＰ２Ｂ６、ＤＮＡＪＢ７、ＺＣ３Ｈ１２Ｂ、ＺＳＷＩＭ１、ＡＲＳＪ）を特定した。それらの遺伝子を明らかにするためには、腫瘍細胞の精製が必要であった。このことは、抗原特定のために腫瘍画分全体（すなわち、死細胞、間質細胞、免疫細胞および他の腫瘍浸潤細胞を含む）を配列決定する従来の方法が欠陥方法であることを示している。候補ＴＡＡのタンパク質発現を免疫組織化学法により確認し、これらの抗原に対する既存Ｔ細胞免疫原性をＩＦＮ－γ／グランザイムＢフルオロスポット（ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ）により試験した。これらのうち、ＤＮＡＪＢ７（ＤｎａＪ熱ショックタンパク質ファミリーメンバーＢ７）は、その発現が精巣の細胞に著しく限局していたことから、新規癌精巣抗原として本発明において特定され、また、神経膠腫、乳癌、黒色腫、膵臓癌、肝臓癌、結腸直腸癌および腎癌を含む多種多様な腫瘍においてエフェクターおよびメモリーＴ細胞によって高度に免疫原性に認識されたため、種々の癌の治療におけるワクチン候補として有用である。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【0078】
参考文献
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【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【配列表】