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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-15
(45)【発行日】2023-09-26
(54)【発明の名称】ウイルスベクター効率を改善するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20230919BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20230919BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230919BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20230919BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20230919BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230919BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230919BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20230919BHJP
C07K 14/16 20060101ALI20230919BHJP
C12N 15/49 20060101ALI20230919BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20230919BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230919BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20230919BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20230919BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
A61K47/42
A61K48/00
A61P7/00
A61P7/06
A61P37/04
A61P43/00 111
C07K14/00 ZNA
C07K14/16
C12N15/49
C12N15/864 100Z
C12N15/867 Z
C12Q1/70
G01N33/569 G
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2018528340
(86)(22)【出願日】2016-11-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-01-24
(86)【国際出願番号】 EP2016079304
(87)【国際公開番号】W WO2017093330
(87)【国際公開日】2017-06-08
【審査請求日】2019-09-12
【審判番号】
【審判請求日】2021-10-01
(31)【優先権主張番号】15306924.0
(32)【優先日】2015-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】16194180.2
(32)【優先日】2016-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】503197304
【氏名又は名称】ジェネトン
(73)【特許権者】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(73)【特許権者】
【識別番号】503119487
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・デヴリ・ヴァル・デソンヌ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】マジュール，サリハ
(72)【発明者】
【氏名】フェナール，ダヴィド
【合議体】
【審判長】上條 肇
【審判官】福井 悟
【審判官】牧野 晃久
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５２７０５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２７１５８４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】ＰＮＡＳ，２０１１，Ｖｏｌ．１０８，Ｎｏ．４１，ｐ．１６８８３－１６８８８
【文献】Ｎａｔｕｒｅ，２０１３年，Ｖｏｌ．４９４，ｐ．２０１－２０９
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
C07K
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号：８２及び配列番号：９０～９１のいずれか１つに示される配列を含むか、又はからなる、ペプチド。
【請求項2】
ウイルス又はウイルスベクターによる細胞のトランスダクションを促進するためのin vitro方法であって、該細胞と、該ウイルス又はウイルスベクター及び配列番号：７４～８３及び配列番号：９１のいずれか１つに示される配列を含むペプチドとを接触させることを含む、in vitro方法。
【請求項3】
ペプチドが、配列番号７５: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFEIWHDGEFGT;
配列番号７７: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFHIWHSGQFGT;
配列番号７８: YGRKKRRQRRR GG YAQTQLDKLKKTNVFNATFEIWHDGEFGT;
配列番号７９: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFEIWHDGEFGTINNFRLGRLPSV;
配列番号８０: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFHIWHSGQFGTINNFRLGRLPSV;
配列番号８１: YGRKKRRQRRR GG VENQMRYAQTQLDKLKKTNVFNATFEIWHDGEF;
配列番号８２: YGRKKRRQRRR GG FEIWHDGEFGTINNFRLGRLPSVPV;
配列番号８３: YGRKKRRQRRR GG FNATFEIWHDGEFGTINNFRLGRLPSVPV; 又は
配列番号９１: YGRKKRRQRRR GG INCFTATFEIWVEGPLGV
に示される配列の一つからなる、請求項２記載のin vitro方法。
【請求項4】
細胞が、造血幹／前駆細胞、又はｈＣＤ３４＋細胞である、請求項２記載の方法。
【請求項5】
別のウイルストランスダクションエンハンサー、ベクトフシン（ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ）、ヒトフィブロネクチンフラグメント、ウイルス感染の様々な精液由来エンハンサー又はＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質由来のペプチドを接触させることをさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項6】
０．０１～２０μMに含まれる濃度で、ペプチドを使用する、請求項２記載の方法。
【請求項7】
ウイルス又はウイルスベクターが、レトロウイルス、レンチウイルス、シュードタイプウイルス、パルボウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項２記載の方法。
【請求項8】
請求項１記載のペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項9】
配列番号：７４～８３及び配列番号：９１のいずれか１つに示される配列からなるペプチドを含む、ウイルス又はウイルスベクターによる細胞のトランスダクションを促進するための、組成物。
【請求項10】
ペプチドが、配列番号７５: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFEIWHDGEFGT;
配列番号７７: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFHIWHSGQFGT;
配列番号７８: YGRKKRRQRRR GG YAQTQLDKLKKTNVFNATFEIWHDGEFGT;
配列番号７９: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFEIWHDGEFGTINNFRLGRLPSV;
配列番号８０: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFHIWHSGQFGTINNFRLGRLPSV;
配列番号８１: YGRKKRRQRRR GG VENQMRYAQTQLDKLKKTNVFNATFEIWHDGEF;
配列番号８２: YGRKKRRQRRR GG FEIWHDGEFGTINNFRLGRLPSVPV;
配列番号８３: YGRKKRRQRRR GG FNATFEIWHDGEFGTINNFRLGRLPSVPV; 又は
配列番号９１: YGRKKRRQRRR GG INCFTATFEIWVEGPLGV
に示される配列の一つからなる、請求項９記載の組成物。
【請求項11】
請求項１記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド含む、核酸構築物。
【請求項12】
サンプル中のウイルスの存在又は非存在を検出するための、細胞ベースのアッセイの感度を増加させるためのin vitro方法であって、サンプル又はサンプル由来抽出物と細胞及びペプチドとを接触させることを含み、該ペプチドは、配列番号：７４～８３及び配列番号：９１のいずれか１つに示される配列を含む、in vitro方法。
【請求項13】
ペプチドが、配列番号７５: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFEIWHDGEFGT;
配列番号７７: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFHIWHSGQFGT;
配列番号７８: YGRKKRRQRRR GG YAQTQLDKLKKTNVFNATFEIWHDGEFGT;
配列番号７９: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFEIWHDGEFGTINNFRLGRLPSV;
配列番号８０: YGRKKRRQRRR GG TNVFNATFHIWHSGQFGTINNFRLGRLPSV;
配列番号８１: YGRKKRRQRRR GG VENQMRYAQTQLDKLKKTNVFNATFEIWHDGEF;
配列番号８２: YGRKKRRQRRR GG FEIWHDGEFGTINNFRLGRLPSVPV;
配列番号８３: YGRKKRRQRRR GG FNATFEIWHDGEFGTINNFRLGRLPSVPV; 又は
配列番号９１: YGRKKRRQRRR GG INCFTATFEIWVEGPLGV
に示される配列の一つからなる、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、ターゲット細胞へのウイルスのトランスダクション効率の改善において使用するためのペプチド及び組成物に関する。
本発明は、ターゲット細胞へのウイルスのトランスダクション効率の改善において使用するためのペプチド及び組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
遺伝子治療アプローチは、多くの場合、リコンビナントウイルスベクターによるターゲット細胞の低いトランスダクション効率によって妨げられる。レトロウイルスベクター、特にヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）ベースのレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、遺伝子治療のための有望なビヒクルである(D'Costa et al., 2009)。これらベクターは、現在、様々な疾患、例えば免疫不全、神経変性性又は神経学的疾患、貧血症、ＨＩＶ感染症を処置するための臨床用途において使用されている。レトロウイルスベクターの用途のいくつかは、ex vivoにおける特定のターゲット細胞、例えばＣＤ３４マーカーを発現する造血幹／前駆細胞のトランスダクションに依拠する。リコンビナントレンチウイルス粒子の使用に伴う制限要因は、リコンビナントレンチウイルスベクター粒子の生産中に高感染力価を得る能力である。この制限を回避する１つの方法は、精製工程中にウイルス上清を濃縮することである(Rodrigues et al., 2007)。しかしながら、ＧＡＬＶＴＲ－ＬＶ（両種性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ－Ａ）エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部に融合されたテナガザル白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質でシュードタイピングされたＬＶ(Sandrin et al., 2002))の場合のように、ウイルス粒子をシュードタイピングするために使用されるエンベロープ糖タンパク質に応じて、いくつかのＬＶについては、精製プロトコールは確立困難である。したがって、多くのレンチウイルスベクター調製物は低い力価を有し、トランスダクション効率は限られている。別の制限要因は、ターゲット細胞に感染するレンチウイルスベクターそれ自体の能力である。いくつかのエンベロープ糖タンパク質、例えばＶＳＶ－Ｇ、ＲＤ１１４ＴＲ、ＧＡＬＶＴＲは、レンチウイルスベクターをシュードタイピングするために使用され得、ターゲット細胞、例えばＣＤ３４＋細胞に対する不定の感染性を有する(Sandrin et al., 2002)。これらの制限を回避する１つの戦略は、トランスダクションプロトコールを最適化する補因子、例えばカチオン性ポリマー（例えば、ポリブレン）又はフィブロネクチンフラグメント（例えば、レトロネクチン）を追加することである(Davis et al., 2004; Pollok et al., 1999)。米国特許第７，７５９，４６７号には、レトロウイルスによる造血細胞のトランスダクション効率を増加させるための方法であって、フィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントの存在下における該細胞の感染を含む方法が記載されている。しかしながら、少なくとも２つの理由により、提案されている方法は全体的に満足なものではない。第１に、レトロウイルスの効率を改善するために使用されるフィブロネクチンフラグメントは、通常、約２７０個以上のアミノ酸を含むので、大きな経済的欠点を示す。さらに、フィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントの使用は、培養プレートをコーティングし、ウイルス上清を固定化フィブロネクチンフラグメント上にプレロードすることを必要とする。これら２つの工程は標準化困難であり、使用されるフィブロネクチンフラグメント及びウイルス上清の濃度に応じて、ターゲット細胞のトランスダクションのある程度の飽和をもたらし得る(Novelli et al., 1999)。
遺伝子治療アプローチは、多くの場合、リコンビナントウイルスベクターによるターゲット細胞の低いトランスダクション効率によって妨げられる。レトロウイルスベクター、特にヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）ベースのレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、遺伝子治療のための有望なビヒクルである(D'Costa et al., 2009)。これらベクターは、現在、様々な疾患、例えば免疫不全、神経変性性又は神経学的疾患、貧血症、ＨＩＶ感染症を処置するための臨床用途において使用されている。レトロウイルスベクターの用途のいくつかは、ex vivoにおける特定のターゲット細胞、例えばＣＤ３４マーカーを発現する造血幹／前駆細胞のトランスダクションに依拠する。リコンビナントレンチウイルス粒子の使用に伴う制限要因は、リコンビナントレンチウイルスベクター粒子の生産中に高感染力価を得る能力である。この制限を回避する１つの方法は、精製工程中にウイルス上清を濃縮することである(Rodrigues et al., 2007)。しかしながら、ＧＡＬＶＴＲ－ＬＶ（両種性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ－Ａ）エンベロープ糖タンパク質の細胞質尾部に融合されたテナガザル白血病ウイルスエンベロープ糖タンパク質でシュードタイピングされたＬＶ(Sandrin et al., 2002))の場合のように、ウイルス粒子をシュードタイピングするために使用されるエンベロープ糖タンパク質に応じて、いくつかのＬＶについては、精製プロトコールは確立困難である。したがって、多くのレンチウイルスベクター調製物は低い力価を有し、トランスダクション効率は限られている。別の制限要因は、ターゲット細胞に感染するレンチウイルスベクターそれ自体の能力である。いくつかのエンベロープ糖タンパク質、例えばＶＳＶ－Ｇ、ＲＤ１１４ＴＲ、ＧＡＬＶＴＲは、レンチウイルスベクターをシュードタイピングするために使用され得、ターゲット細胞、例えばＣＤ３４＋細胞に対する不定の感染性を有する(Sandrin et al., 2002)。これらの制限を回避する１つの戦略は、トランスダクションプロトコールを最適化する補因子、例えばカチオン性ポリマー（例えば、ポリブレン）又はフィブロネクチンフラグメント（例えば、レトロネクチン）を追加することである(Davis et al., 2004; Pollok et al., 1999)。米国特許第７，７５９，４６７号には、レトロウイルスによる造血細胞のトランスダクション効率を増加させるための方法であって、フィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントの存在下における該細胞の感染を含む方法が記載されている。しかしながら、少なくとも２つの理由により、提案されている方法は全体的に満足なものではない。第１に、レトロウイルスの効率を改善するために使用されるフィブロネクチンフラグメントは、通常、約２７０個以上のアミノ酸を含むので、大きな経済的欠点を示す。さらに、フィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントの使用は、培養プレートをコーティングし、ウイルス上清を固定化フィブロネクチンフラグメント上にプレロードすることを必要とする。これら２つの工程は標準化困難であり、使用されるフィブロネクチンフラグメント及びウイルス上清の濃度に応じて、ターゲット細胞のトランスダクションのある程度の飽和をもたらし得る(Novelli et al., 1999)。
【0003】
興味深いことに、最近、ヒト精液において、ＳＥＶＩと称される天然カチオン性ペプチドがＨＩＶ－１感染性の強力なエンハンサーとして同定されている(Munch et al., 2007; Roan et al., 2009)。細胞のウイルス感染を促進するヒト前立腺酸性フォスファターゼのアミノ酸残基２４０～２９０のフラグメントが記載されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５０７２７号においても、このファミリーのペプチドが開示されている。
【0004】
本出願人はまた、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０６２６４号において、ウイルス又はウイルスベクターによる真核細胞の感染を促進するためのＬＡＨ４ペプチド又はその機能的誘導体の使用を以前に提案し、特にＬＶベクターによるｈＣＤ３４＋細胞の感染に関して、非常に優れた結果を提供した。
【0005】
本発明者らの目的は、ターゲット細胞へのウイルス又はウイルスベクターのトランスダクション効率を増加させるための改善された手段を提供することである。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、ターゲット細胞へのウイルストランスダクションを改善するための組成物及び方法を提供する。
【0007】
本発明者らは、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分及びＢｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分（両部分は以下で定義される）を含むペプチド、特にＭＡＰ－Ｂｅｃｌｉｎ－１、Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ－１又はＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ－２ペプチドが、真核細胞におけるウイルスのトランスダクション効率を促進する特性を有する。ことを見出した。Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（ＴＢ１）ペプチドはオートファジー（ウイルス阻害に関与する細胞機構）を誘導すると以前に記載されているので（国際公開公報第２０１３／１１９３７７号；Shoji-Kawata et al., 2013）、この観察結果は非常に驚くべきものである。同様に、２０１３年に、He Cらは、Ｂｅｃｌｉｎ２が、Ｂｅｃｌｉｎ１のようにオートファジーに関与する哺乳動物特異的タンパク質であることを同定した（He C. et al, 2013）。しかしながら、Ｂｅｃｌｉｎ１ではなくＢｅｃｌｉｎ２は、さらなるリソソーム分解経路において機能する。しかし、本明細書では、ＣＰＰ部分及びＢｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分を含むペプチド（Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ２ペプチド、Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ－１ペプチド及びＭＡＰ－Ｂｅｃｌｉｎ－１ペプチド）は、異なる真核生物ターゲット細胞における多くの異なるウイルス型のトランスダクション効率を有意に改善することが開示される。
【0008】
したがって、一態様では、本発明は、ウイルスによる細胞の感染を促進するための方法であって、前記細胞と、前記ウイルスと、
（ｉ）ＣＰＰ部分；及び
（ｉｉ）Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分、特にＢｅｃｌｉｎ－１－又はＢｅｃｌｉｎ－２由来ペプチド部分
を含むペプチドとを接触させることを含む方法を提供する。
（ｉ）ＣＰＰ部分；及び
（ｉｉ）Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分、特にＢｅｃｌｉｎ－１－又はＢｅｃｌｉｎ－２由来ペプチド部分
を含むペプチドとを接触させることを含む方法を提供する。
【0009】
特定の実施態様では、本発明の方法は、in vitro方法である。より具体的には、前記方法は、サンプル中のウイルスの存在又は非存在を検出するための細胞ベースのアッセイの感度を増加させるため実行される。実際、本発明において実行されるペプチドのトランスダクション増強特性により、感染性が改善されるので、サンプル中の少量のウイルスさえ検出され得る。
【0010】
加えて、本発明の方法はまた、被験体におけるウイルスによる感染を診断するために実行され得、細胞、並びにＣＰＰ部分及びＢｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分を含む本発明のペプチドと共に被験体のサンプルをインキュベーションして、前記サンプルに含まれる任意のウイルスの前記細胞への侵入を増大させ、続いて、前記細胞に侵入したウイルスを同定することを含む。
【0011】
より好ましくは、本発明は、治療遺伝子をコードするウイルスベクターと組み合わせた遺伝子治療法における、ＣＰＰ部分及びＢｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分（例えば、Ｂｅｃｌｉｎ－１－又はＢｅｃｌｉｎ－２由来ペプチド部分）を含む上記で定義されるペプチドの使用に関する。
【0012】
特定の実施態様では、本発明のペプチドと共に使用されるウイルス又はウイルスベクターは、レトロウイルス、特にレンチウイルス、例えば偽型レンチウイルスである。別の実施態様では、ウイルス又はウイルスベクターは、パルボウイルス、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。特定の実施態様では、本発明のペプチドは、ウイルスによる細胞の感染を促進し、細胞は、造血幹／前駆細胞、好ましくはｈＣＤ３４＋細胞である。本発明のペプチドはまた、別のウイルストランスダクションエンハンサー、例えばｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ、ヒトフィブロネクチンフラグメント、ウイルス感染の様々な精液由来エンハンサー又はＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質由来のペプチドと共に使用され得る。
【0013】
さらに、本発明は、ＣＰＰ部分及びＢｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分（例えば、Ｂｅｃｌｉｎ－１－又はＢｅｃｌｉｎ－２由来ペプチド部分）を含むペプチドに関する。特に、本発明は、ＭＡＰ部分及びＢｅｃｌｉｎ－１由来ペプチド部分を含むペプチドに関する。
【0014】
本発明の別の態様は、ウイルス又はウイルスベクターと、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分及びＢｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分を含むペプチドとの複合体に関する。別の態様では、本発明は、ウイルス又はウイルスベクターと、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分及びＢｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分を含むペプチドとの混合物に関する。特定の実施態様では、本発明の複合体又は混合物中のウイルス又はウイルスベクターは、レトロウイルス、特にレンチウイルスである。特定のレンチウイルスは、偽型レンチウイルスを含む。別の実施態様では、ウイルス又はウイルスベクターは、パルボウイルス、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。さらなる実施態様では、ペプチドは、上記で、より具体的には特許請求の範囲で定義されるとおりであるか、又はペプチドは、配列番号：７５、配列番号：７７及び配列番号：９８～１０１に示されている配列を含むか若しくはそれからなる、
【0015】
本発明はさらに、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。
【0016】
本発明の別の態様は、本発明のペプチド及びウイルスベクターを含むキットに関する。
【0017】
他の態様及び実施態様は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１は、様々なレンチウイルスベクターによる細胞株トランスダクションを促進する。Ａ）示されている濃度のＴａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ又はＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１ペプチドの非存在下又は存在下、ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ（２×１０５TU/ml）でＨＣＴ１１６細胞を６時間トランスダクションした。Ｂ）Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ又はＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１ペプチド（５μM）の非存在下又は存在下、様々な力価のＶＳＶ－Ｇ－ＬＶでＨＣＴ１１６細胞をトランスダクションした。Ｃ）Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ（５μM）、Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（５μM）、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１（６μg/ml）、硫酸プロタミン（４μg/ml）又はポリブレン（３μg/ml）の非存在下又は存在下、ＧＡＬＶＴＲ－ＬＶ又はＲＤ１１４ＴＲ－ＬＶ（１０６TU/ml）でＨＣＴ１１６細胞をトランスダクションした。３つのパネルにおいて、３～４日後にＧＦＰ発現をモニタリングすることによって、トランスダクション効率を評価した。全てのデータは、２回反復で実施した３回の独立した実験の平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。
【図2】Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１は、明らかな細胞毒性を伴わずに、ｈＣＤ３４＋ＨＳＰＣのレンチウイルストランスダクションを増強する。Ａ）レトロネクチン（７μg/cm2）又は示されている濃度のＴａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ若しくはＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１ペプチドの非存在下（なし）又は存在下で、高精製ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ（２×１０７ig/ml、ＭＯＩ ２４０）をｈＣＤ３４＋細胞に感染させた。３～５日後、ＧＦＰ発現をモニタリングすることによって、トランスダクション効率を評価した。データは、２回反復で実施した３回の独立した実験（３つのＵＣＢドナー）の平均±ＳＥＭとして表されている。Ｂ）Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（１０μM）の非存在下又は存在下、ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ（２×１０５TU/ml）でｈＣＤ３４＋細胞（６つのＵＣＢドナー）を２回反復でトランスダクションした。データは、各ＵＣＢドナーの平均トランスダクションレベルとして表されている。バーは、分布の平均値を示す。マン・ホイットニー検定を使用して、Ｐ値を決定した（＊＊Ｐ＜０．０１）。Ｃ）コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイにおけるトランスダクションｈＣＤ３４＋細胞の分化。結果は、レトロネクチン（７μg/cm2）、Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ（１０μM）又はＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（１０μM）ペプチドの非存在下（なし）又は存在下、ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ（５×１０７ig/ml）によるトランスダクション後にプレーティングした細胞 １０００個について得られた異なる種類のコロニーの平均数を表している。データは、２回反復で実施した３回の独立した実験（３つのＵＣＢドナー）の平均±ＳＥＭである。
【図3】Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１は、レンチウイルス粒子とターゲット細胞との接着及び融合を促進する。Ａ）ウイルス融合アッセイ。１０μMのＴａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ又はＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１の非存在下（なし）又は存在下で、細胞をＶＳＶ－Ｇ－ＢＬＡＭ－ＬＶと共に３７℃で２．５時間インキュベーションした。次に、フローサイトメトリーを使用して、ターゲット細胞における切断ＣＣＦ２基質の割合をモニタリングすることによって、ウイルス融合効率を評価した。データは、２回反復で実施した３回の独立した実験（ｈＣＤ３４＋細胞のための３つのＵＣＢドナー）の平均±ＳＥＭとして表されている。Ｂ）接着アッセイ。Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ又はＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（５μM）の非存在下又は存在下で、ＨＣＴ１１６細胞を３７℃で３０分間プレインキュベーションした。次に、Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ又はＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（５μM）の非存在下又は存在下で、細胞をＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ（ｐ２４ ７５ng）と共に４℃で２．５時間インキュベーションした。ポジティブコントロールとして、１つの状態のＨＣＴ１１６細胞を、凝集ペプチドＶｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１（１２μg/ml）と混合したＶＳＶ－Ｇ－ＬＶの冷溶液と共にインキュベーションした。データは、２回反復で実施した３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表されている。Ｃ）ウイルスプルダウンアッセイ。ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ粒子をＴａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ（１０μM）、Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（１０μM）又はポジティブコントロールＶｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１（１０μM）のいずれかと混合した。短い遠心分離（１５，０００ｇ）後、ＨＩＶ－１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキットを使用して、ペレット化ウイルス粒子の割合を定量した。データは、ｐ２４インプットのレベルに対して正規化され、２回反復で実施した３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表されている。
【図4】Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１及び様々な誘導体のウイルストランスダクションエンハンサー活性。２．５μM（薄灰色のヒストグラム）又は５μM（黒色のヒストグラム）のいずれかの示されているペプチドの非存在下（なし）又は存在下で、図１Ａに記載されているように、ＨＣＴ１１６細胞をトランスダクションした。データは、２回反復で実施した３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表されている。
【図5】Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１変異体のウイルストランスダクション効率。Ａ）ヒトＢｅｃｌｉｎ１タンパク質の残基２４６～３２２（homo sapiens、ＮＰ＿００３７５７）の一次配列。突然変異Ｈ２７５Ｅ、Ｓ２７９Ｄ及びＱ２８１Ｅは、太字斜体で強調されている。二次構造要素は、配列の上に示されている（αヘリックス（α）、ループ（Ｌ）及びβシート（β））。構造要素の上にある暗色の線は、各Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１変異体のタンパク質配列の範囲を表す。Ｂ）２．５μM（薄灰色のヒストグラム）若しくは５μM（黒色のヒストグラム）のいずれかの示されているペプチドの非存在下（なし）若しくは存在下で、又はＣ）漸増濃度のＴａｔ－Ｂｅｃ（２６７－２９６）で、又はＤ）２．５μMの示されているペプチドで、図１Ａに記載されているように、ＨＣＴ１１６細胞をトランスダクションした。全てのパネルについて、データは、２回反復で実施した３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表されている。
【図6】Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１は、リコンビナントアデノ随伴ウイルスによる細胞株トランスダクションを増強する。Ａ）示されている濃度のＴａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ又はＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１ペプチドの非存在下又は存在下、ＧＦＰ発現リコンビナントＡＡＶ８（ＭＯＩ １０００）で２９３Ｔ細胞を６時間トランスダクションした。３～４日後、ＧＦＰ発現をモニタリングすることによって、トランスダクション効率を評価した。データは、２回反復で実施した３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして表されており、線形回帰モデルを使用して分析されている。
【図7】レンチウイルストランスダクションを促進する最適用量のＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１は、オートファジーを誘導しない。Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（５μM）の非存在下若しくは存在下で、又はアール平衡塩類溶液中で、ｍＣｈｅｒｒｙ－ｅＧＦＰ－ＬＣ３融合タンパク質を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６時間インキュベーションした。次に、イメージングフローサイトメーターを使用して、細胞を分析した。明視野、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光及びＳＳＣチャネルで、細胞の画像を取得した。データは、個々の各細胞において観察されたｍＣｈｅｒｒｙスポットの数として表されている。バーは、３回の独立した実験から得られた分布の平均値を示す。マン・ホイットニー検定を使用して、Ｐ値を決定した。ｎ．ｓ．非統計。
【図8】Ｂｅｃｌｉｎ２由来ペプチドは、非常に低用量で、ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶによる細胞株トランスダクションを促進する。Ａ）Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１野生型（Ｔａｔ－ＢｅｃＷＴ）及びＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ２野生型（Ｔａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴ）ペプチドの一次配列。Ｂ）示されている濃度のＴａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ（Ｔａｔ－Ｓｃｒ）、Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１、Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１野生型（Ｔａｔ－ＢｅｃＷＴ）、Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ２（Ｔａｔ－Ｓｃｒ２ＷＴ）及びＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ２野生型（Ｔａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴ）ペプチドの非存在下又は存在下、ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ（２×１０５TU/ml）でＨＣＴ１１６細胞を６時間トランスダクションした。全てのデータは、２回反復で実施した３回の独立した実験の平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表されている。
【発明を実施するための形態】
【0019】
詳細な説明
本発明は、
（ｉ）ＣＰＰ部分；及び
（ｉｉ）Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分
を含むか又はそれらからなる天然に存在しない合成ペプチドに関する。
本発明は、
（ｉ）ＣＰＰ部分；及び
（ｉｉ）Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分
を含むか又はそれらからなる天然に存在しない合成ペプチドに関する。
【0020】
両部分は、場合によりアミノ酸又は非アミノ酸リンカーを介して共有結合される。加えて、本発明によれば、ペプチドは、任意の方向で両部分を含み得る（例えば、Ｎ末端からＣ末端に：ＣＰＰ部分－Ｂｅｃｌｉｎ由来部分；又はＢｅｃｌｉｎ由来部分－ＣＰＰ部分）。
【0021】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分
本発明との関連では、「細胞透過性ペプチド」又は「ＣＰＰ」という用語は、限定されないが、ペプチドがその機能を実行する機構にかかわらず、カーゴが少なくとも１つの測定可能な生物学的応答又は機能に影響を及ぼし得る細胞にカーゴが運搬されるような、細胞膜を介した細胞外区画からのカーゴ（例えば、ペプチド、核酸、ウイルス又は他のカーゴ）の輸送を増強又は促進することが公知の又はそれが実証され得る可変長のペプチド鎖を指す。ＣＰＰは、典型的には、高相対存在量の正荷電アミノ酸、例えばリシン若しくはアルギニンを含有するアミノ酸組成を有し得るか、又は極性／荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸との交互パターンを含有する配列を有し得る。
本発明との関連では、「細胞透過性ペプチド」又は「ＣＰＰ」という用語は、限定されないが、ペプチドがその機能を実行する機構にかかわらず、カーゴが少なくとも１つの測定可能な生物学的応答又は機能に影響を及ぼし得る細胞にカーゴが運搬されるような、細胞膜を介した細胞外区画からのカーゴ（例えば、ペプチド、核酸、ウイルス又は他のカーゴ）の輸送を増強又は促進することが公知の又はそれが実証され得る可変長のペプチド鎖を指す。ＣＰＰは、典型的には、高相対存在量の正荷電アミノ酸、例えばリシン若しくはアルギニンを含有するアミノ酸組成を有し得るか、又は極性／荷電アミノ酸と非極性疎水性アミノ酸との交互パターンを含有する配列を有し得る。
【0022】
したがって、本発明の特定の実施態様では、ＣＰＰ部分は、５～５０個のアミノ酸残基、特に１０～２０個のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなる。さらなる特定の実施態様では、ＣＰＰ部分は、正荷電残基、例えばリシン残基及びアルギニン残基を含むアミノ酸配列を有する。別の実施態様では、ＣＰＰ部分は、正荷電残基、例えばリシン又はアルギニン残基と、非極性疎水性残基、例えばアラニン及びロイシン残基とを交互に有するアミノ酸配列を有する。
【0023】
ＣＰＰ部分は、細胞膜を介して移動することができる天然に存在するタンパク質、例えばDrosophilaホメオボックスタンパク質アンテナペディア（転写因子）、ウイルスタンパク質、例えばＨＩＶ－１転写因子ＴＡＴ及びＨＩＶ－１由来カプシドタンパク質ＶＰ２２に由来し得、並びに／又はそれらは、例えばキメラタンパク質から合成によって生成されるもの、若しくは合成ポリペプチド、例えばポリアルギニンであり得る。ＣＰＰの総説は、Milletti, 2012に見られ得る。
【0024】
特定の実施態様では、ＣＰＰ部分は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型の転写トランス活性化因子（ｔａｔ）ペプチド由来のペプチドである。本発明との関連では、ｔａｔペプチド由来のペプチドは、細胞透過特性を有するアミノ酸配列を含むｔａｔフラグメントである。特に、ｔａｔ由来ペプチドは、ｔａｔのアミノ酸４７～５７（配列番号：１）、４８～６０（配列番号：２）又は４９～５７（配列番号：３）を含むか又はそれからなるペプチドである。
【0025】
限定されないが、本発明の実施において使用され得る他のＣＰＰとしては、ＭＡＰ－又はアンテナペディア由来ペプチドが挙げられる。
【0026】
表１は、使用され得る様々な代表的なペプチドを掲載している。
【表1】
【0027】
特定の実施態様では、ＣＰＰ部分は、配列番号：１～６２のいずれかから選択されるペプチド配列、又は配列番号：１～６２のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％配列同一性を有するその変異体であって、細胞へのカーゴ分子の送達を増強するその能力の少なくとも一部を保持するその変異体を含むか、又はそれからなる。
【0028】
特定の実施態様では、ＣＰＰ部分は、配列番号：１～配列番号：４、特に配列番号：１及び配列番号：４からなる群より選択される。
【0029】
Ｂｅｃｌｉｎペプチド部分
本発明との関連では、Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分は、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質由来のアミノ酸配列に対応する。
本発明との関連では、Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分は、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質由来のアミノ酸配列に対応する。
【0030】
本発明との関連では、Ｂｅｃｌｉｎペプチドの「機能的変異体」又は「誘導体」は、前記機能的変異体又は前記誘導体がＣＰＰ部分に融合された場合、ウイルスのトランスダクション効率を改善することができるペプチドである。特に、機能的変異体は、ＣＰＰ部分に融合された場合、ウイルスのトランスダクション効率を少なくとも１０％、少なくとも２０％又は少なくとも３０％又はそれ以上、好ましくは少なくとも３０％改善することができる。より具体的には、機能的変異体は、ＣＰＰ部分に融合された場合、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）由来のエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）でシュードタイピングされたＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクター（ＬＶ）のトランスダクション効率を少なくとも１０％、少なくとも２０％又は少なくとも３０％又はそれ以上、好ましくは少なくとも３０％改善することができる。さらにより具体的には、機能的変異体は、ＣＰＰ部分に融合された場合、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）由来のエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）でシュードタイピングされたＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクター（ＬＶ）によるｈＣＤ３４＋細胞のトランスダクション効率を少なくとも１０％、少なくとも２０％又は少なくとも３０％又はそれ以上改善することができる。さらなる特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎペプチドの機能的変異体は、親Ｂｅｃｌｉｎペプチドの（すなわち、それが由来するペプチド由来の）配列、例えば配列番号：６５又は８９に示されているＢｅｃｌｉｎペプチド由来の配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、最も具体的には少なくとも８３％の配列同一性をさらに有する。特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分の配列は、１～６個のアミノ酸残基の付加、欠失又は置換が親Ｂｅｃｌｉｎペプチド（例えば、配列番号：６５又は８９に示されている配列）に行われたアミノ酸配列を含む。特定の態様では、Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分は、配列番号：６５又は８９において１、２、３、４、５又は６個のアミノ酸置換、例えば４、５又は６個のアミノ酸置換を含むＢｅｃｌｉｎ－１又はＢｅｃｌｉｎ－２ペプチド部分である。
【0031】
特定の実施態様によれば、Ｂｅｃｌｉｎ由来部分の長さは、１４～２２個のアミノ酸残基長、例えば１６～２０個のアミノ酸残基長に含まれ、特に１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個のアミノ酸残基長からなるペプチドである。特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ由来部分の長さは、１８個のアミノ酸残基である。
【0032】
特定の態様では、Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分は、一般式（Ｉ）：
Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｔ Ｆ Ｎ９Ｉ Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３Ｇ Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８（Ｉ）
（式中：
Ｎ１は極性アミノ酸であるか、又はＩ、特にＴ若しくはＩ、より具体的にはＩであり；
Ｎ２は、極性アミノ酸、特にＮ、Ｄ又はＳ、より具体的にはＮであり；
Ｎ３は、疎水性アミノ酸又はＣ、特にＶ、Ｃ又はＩ、より具体的にはＣであり；
Ｎ４は、疎水性アミノ酸、特にＦ又はＬ、より具体的にはＦであり；
Ｎ５は、極性アミノ酸、特にＮ、Ｔ、Ｓ、Ｒ又はＱ、より具体的にはＴであり；
Ｎ６は、疎水性アミノ酸、特にＡ又はＶ、より具体的にはＡであり；
Ｎ９は、極性アミノ酸、特にＨ、Ｅ又はＴ、より具体的にはＥであり；
Ｎ１１は、Ｗ、Ｓ、Ｇ又はＲ、特にＷであり；
Ｎ１２は極性アミノ酸であるか、又はＶ、特にＨ、Ｖ、Ｄ、Ｑ若しくはＥ、より具体的にはＶであり；
Ｎ１３は極性アミノ酸であるか、又はＡ、特にＳ、Ｅ、Ｄ、Ａ、より具体的にはＥであり；
Ｎ１５は、Ｑ、Ｐ、Ｓ又はＥ、特にＰであり；
Ｎ１６は、疎水性アミノ酸、特にＦ、Ｌ、Ｖ又はＩ、より具体的にはＬであり；
Ｎ１７は、疎水性アミノ酸、特にＧ、Ａ又はＰ、より具体的にはＧであり；
Ｎ１８は、Ｔ、Ｖ又はＩ、特にＶである）
の配列を含むか、又はそれからなる。
Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６Ｔ Ｆ Ｎ９Ｉ Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３Ｇ Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８（Ｉ）
（式中：
Ｎ１は極性アミノ酸であるか、又はＩ、特にＴ若しくはＩ、より具体的にはＩであり；
Ｎ２は、極性アミノ酸、特にＮ、Ｄ又はＳ、より具体的にはＮであり；
Ｎ３は、疎水性アミノ酸又はＣ、特にＶ、Ｃ又はＩ、より具体的にはＣであり；
Ｎ４は、疎水性アミノ酸、特にＦ又はＬ、より具体的にはＦであり；
Ｎ５は、極性アミノ酸、特にＮ、Ｔ、Ｓ、Ｒ又はＱ、より具体的にはＴであり；
Ｎ６は、疎水性アミノ酸、特にＡ又はＶ、より具体的にはＡであり；
Ｎ９は、極性アミノ酸、特にＨ、Ｅ又はＴ、より具体的にはＥであり；
Ｎ１１は、Ｗ、Ｓ、Ｇ又はＲ、特にＷであり；
Ｎ１２は極性アミノ酸であるか、又はＶ、特にＨ、Ｖ、Ｄ、Ｑ若しくはＥ、より具体的にはＶであり；
Ｎ１３は極性アミノ酸であるか、又はＡ、特にＳ、Ｅ、Ｄ、Ａ、より具体的にはＥであり；
Ｎ１５は、Ｑ、Ｐ、Ｓ又はＥ、特にＰであり；
Ｎ１６は、疎水性アミノ酸、特にＦ、Ｌ、Ｖ又はＩ、より具体的にはＬであり；
Ｎ１７は、疎水性アミノ酸、特にＧ、Ａ又はＰ、より具体的にはＧであり；
Ｎ１８は、Ｔ、Ｖ又はＩ、特にＶである）
の配列を含むか、又はそれからなる。
【0033】
別の特定の態様では、Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分は、一般式（ＩＩ）
Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｆ Ｎ５Ｎ６Ｔ Ｆ Ｎ９Ｉ Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３Ｇ Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８（ＩＩ）
（式中：
Ｎ１は、極性アミノ酸であるか、又はＩ、特にＴ若しくはＩ、より具体的にはＩであり；
Ｎ２は、極性アミノ酸、特にＮ、Ｄ又はＳ、より具体的にはＮであり；
Ｎ３は、疎水性アミノ酸、特にＶ、Ｃ又はＩ、より具体的にはＣであり；
Ｎ５は、極性アミノ酸、特にＮ、Ｔ、Ｓ、Ｒ又はＱ、より具体的にはＴであり；
Ｎ６は、疎水性アミノ酸、特にＡ又はＶ、より具体的にはＡであり；
Ｎ９は、極性アミノ酸、特にＥ又はＴ、より具体的にはＥであり；
Ｎ１１は、Ｗ、Ｓ、Ｇ又はＲ、特にＷであり；
Ｎ１２は、極性アミノ酸であるか、又はＶ、特にＨ、Ｖ、Ｄ、Ｑ若しくはＥ、より具体的にはＶであり；
Ｎ１３は、極性アミノ酸であるか、又はＡ、特にＳ、Ｅ、Ｄ、Ａ、より具体的にはＥであり；
Ｎ１５は、Ｐ又はＳ、特にＰであり；
Ｎ１６は、疎水性アミノ酸、好ましくはＬ、Ｖ又はＩ、より具体的にはＬであり；
Ｎ１７は、疎水性アミノ酸、好ましくはＧ、Ａ又はＰ、より具体的にはＧであり；
Ｎ１８は、疎水性アミノ酸、特にＶ又はＩ、より具体的にはＶである）
の配列を含むか、又はそれからなる。
Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｆ Ｎ５Ｎ６Ｔ Ｆ Ｎ９Ｉ Ｎ１１Ｎ１２Ｎ１３Ｇ Ｎ１５Ｎ１６Ｎ１７Ｎ１８（ＩＩ）
（式中：
Ｎ１は、極性アミノ酸であるか、又はＩ、特にＴ若しくはＩ、より具体的にはＩであり；
Ｎ２は、極性アミノ酸、特にＮ、Ｄ又はＳ、より具体的にはＮであり；
Ｎ３は、疎水性アミノ酸、特にＶ、Ｃ又はＩ、より具体的にはＣであり；
Ｎ５は、極性アミノ酸、特にＮ、Ｔ、Ｓ、Ｒ又はＱ、より具体的にはＴであり；
Ｎ６は、疎水性アミノ酸、特にＡ又はＶ、より具体的にはＡであり；
Ｎ９は、極性アミノ酸、特にＥ又はＴ、より具体的にはＥであり；
Ｎ１１は、Ｗ、Ｓ、Ｇ又はＲ、特にＷであり；
Ｎ１２は、極性アミノ酸であるか、又はＶ、特にＨ、Ｖ、Ｄ、Ｑ若しくはＥ、より具体的にはＶであり；
Ｎ１３は、極性アミノ酸であるか、又はＡ、特にＳ、Ｅ、Ｄ、Ａ、より具体的にはＥであり；
Ｎ１５は、Ｐ又はＳ、特にＰであり；
Ｎ１６は、疎水性アミノ酸、好ましくはＬ、Ｖ又はＩ、より具体的にはＬであり；
Ｎ１７は、疎水性アミノ酸、好ましくはＧ、Ａ又はＰ、より具体的にはＧであり；
Ｎ１８は、疎水性アミノ酸、特にＶ又はＩ、より具体的にはＶである）
の配列を含むか、又はそれからなる。
【0034】
「極性アミノ酸」という用語は、水性（すなわち、水）環境に存在することを好む親水性側鎖を含むアミノ酸を指す。したがって、これらの側鎖は、水素結合相互作用に関与し得る。「極性アミノ酸」という用語は、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ｈなどの「極性荷電アミノ酸」並びにＳ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｎ及びＱ「極性非荷電アミノ酸」を含む。
【0035】
「疎水性アミノ酸」という用語は、生理学的ｐＨで非荷電性の非極性側鎖を含むアミノ酸を指す。疎水性側鎖は化学的に非反応性であり、水性環境に露出するのではなく凝集する傾向がある。「疎水性アミノ酸」という用語は、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｆ、Ｗ及びＭを含む。
【0036】
本明細書で使用される「アミノ酸」は、標準的な１文字表記：アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、システイン（Ｃ）を使用して指定されることもある。合成の及び天然に存在しないアミノ酸類似体（及び／又はペプチド結合）が含まれる。
【0037】
特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ由来部分は、ヒトＢｅｃｌｉｎタンパク質、例えば配列番号：６３に示されているヒトＢｅｃｌｉｎ－１タンパク質又は配列番号：６４に示されているヒトＢｅｃｌｉｎ－２タンパク質に由来する：
【化1】
【化2】
【0038】
特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ－２由来ペプチド部分は、配列番号：６４のアミノ酸２４９～２６６（下線配列：ＩＮＣＦＴＡＴＦＥＩＷＶＥＧＰＬＧＶは配列番号：８９と称される）を含む。特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ－２由来ペプチド部分は、配列番号：８９に示されている配列を含むか若しくはそれからなり、又は上記で定義されるその機能的変異体に対応する配列を含むか若しくはそれからなる。特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ－２由来ペプチドの機能的変異体は、配列番号：６４のアミノ酸２５２及び２５６に対応するその位置においてフェニルアラニン残基を有する。
【0039】
特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ－２由来ペプチド部分又はその機能的変異体は、限定されないが、ヒト、マウス、ウサギ、ブタ、ウマ、パンダ又はウシＢｅｃｌｉｎ－２を含む任意の種のＢｅｃｌｉｎ－２に由来する。以下の表２は、ヒトＢｅｃｌｉｎ－２配列の２４９～２６６のアミノ酸と、マウス、ウサギ、ブタ、ウマ、パンダ及びウシにおける対応する配列とのアライメントに対応する。
【表2】
【0040】
特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチドは、表２の配列からなる群において選択されるＢｅｃｌｉｎ－２ペプチドに由来する。
【0041】
特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ－１由来ペプチド部分は、Ｂｅｃｌｉｎ－１のβ１シート又はＢｅｃｌｉｎ－１のβ１シート（これは、配列番号：６３のアミノ酸２７４～２７９に位置する）の機能的変異体を含む。さらなる特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ－１由来ペプチド部分は、Ｂｅｃｌｉｎ－１のＬ１ループ及びβ１シートを含む。別の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ－１由来ペプチド部分は、（Ｂｅｃｌｉｎ－１のα１ヘリックスに対応する）配列番号：６３のアミノ酸２５０～２６２の少なくともＣ末端部又は全部、Ｂｅｃｌｉｎ－１のＬ１ループ及びβ１シートを含む。配列番号：６３における下線配列は、以下の説明では配列番号：６５と称される（配列番号：６５：ＴＮＶＦＮＡＴＦＨＩＷＨＳＧＱＦＧＴ）。それは、Ｂｅｃｌｉｎ－１の進化保存ドメイン（ＥＣＤ２６７－２８４）のフラグメントに対応する。特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ－１由来ペプチド部分は、配列番号：６５に示されている配列を含むか若しくはそれからなり、又は上記で定義されるその機能的変異体に対応する配列を含むか若しくはそれからなる。特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ－１由来ペプチドの機能的変異体は、配列番号：６３のアミノ酸２７０及び２７４に対応するその位置においてフェニルアラニン残基を有する。
【0042】
配列番号：６６に示されているＢｅｃｌｉｎ－１由来ペプチド（これは、（配列番号：６３の２７５位、２７９位及び２８１位に対応する）配列番号：６５の９位、１３位及び１５位において置換を有し、配列番号：６５の２７０位及び２７４位に対応するアミノ酸位置において維持されたフェニルアラニン残基を有する配列番号：６５に対応する）は、本発明の例示的な機能的変異体である：
【化3】
【0043】
特定の態様では、Ｂｅｃｌｉｎ－１由来ペプチド部分は、１０～６０個のアミノ酸、特に１５～５５個、特に１８～５０個、特に１８～４９個のアミノ酸（例えば、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個及び４９個のアミノ酸）、特に１８～３５個のアミノ酸、より具体的には１８～３３個のアミノ酸（例えば、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個及び３３個のアミノ酸）を含み得る。
【0044】
特定の実施態様では、Ｂｅｃｌｉｎ－１由来ペプチド部分は、配列番号：６３のアミノ酸２７０～２８２、特にアミノ酸２６７～２８４（すなわち、配列番号：６５）又は上記その変異体を含み、いずれか又は両方の末端において、アミノ酸２６７～２８４に隣接するＢｅｃｌｉｎ－１タンパク質の少なくとも１個以上のアミノ酸を含む。例えば、Ｂｅｃｌｉｎ－１由来のペプチド部分は、特に、配列番号：６５に示されている配列に加えて、配列番号：６３のアミノ酸２６７～２８４に隣接する１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個又は１７個のアミノ酸をさらに含み得る。例えば、Ｂｅｃｌｉｎ－１由来部分は、アミノ酸２５０～２６６又は２５６～２６６をさらに含み得る。上記配列で言及されているアミノ酸に代えて又はそれに加えて、それはまた、配列番号：６５の配列又はその機能的変異体、例えば配列番号：６６に加えて、配列番号：６３のアミノ酸２８５～２９６又は２８５～２９８を含み得る。さらに、本発明はまた、配列番号：６５に示されている前記配列の一部を含む配列番号：６５の機能的変異体、例えば配列番号：６３のアミノ酸２６８～２８４、２６９～２８４、２７０～２８４、２６７～２８３又は２６７～２８２を含む機能的変異体を想定する。加えて、機能的変異体は、配列番号：６６に示されている配列の変異体であって、それらのＮ末端又はＣ末端又は両方の末端から１個、２個又は３個のアミノ酸が欠失された変異体であり得る。
【0045】
本発明のＢｅｃｌｉｎ－１ペプチドの例示的な機能的変異体としては、以下のものが挙げられる：
【化4】
【0046】
融合ペプチド
上記のように、本発明のペプチドは、互いに共有結合的に連結されたＣＰＰ部分及びＢｅｃｌｉｎ由来部分を含むので、融合ペプチドである。
上記のように、本発明のペプチドは、互いに共有結合的に連結されたＣＰＰ部分及びＢｅｃｌｉｎ由来部分を含むので、融合ペプチドである。
【0047】
ペプチドの２つの部分の連結は、共有結合によって直接的に、又はリンカー部分を介して行われ得る。
【0048】
配列番号：７４のペプチドは、２つのペプチド部分の直接的な連結の例であり、ＣＰＰ部分は配列番号：１に示されているＴａｔ配列であり、Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分は、配列番号：６３のアミノ酸２８５～２９６に融合された配列番号：６６に示されているアミノ酸配列からなる：
【化5】
【0049】
配列番号：９０のペプチドは、２つのペプチド部分の直接的な連結の例であり、ＣＰＰ部分は配列番号：１に示されているＴａｔ配列であり、Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分は、配列番号：８９に示されているアミノ酸配列からなる：
【化6】
【0050】
特定の実施態様では、ペプチドは、リンカーを含む。リンカーは、１～２５個のアミノ酸、特に１～５個のアミノ酸を含むペプチドであり得る。特定の実施態様では、リンカーは、単一中性（すなわち、生理学的ｐＨで中性の）アミノ酸、例えばＧ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｙ又はＴ、特にＧである。あるいは、リンカーは、中性アミノ酸のジペプチド、例えばＧＧ、ＡＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＡＳ、ＡＹ、ＧＳ、ＧＴ、ＧＶ、ＡＶ、ＳＶ、ＴＶ、ＶＧ、ＶＡ及びＶＴから選択されるジペプチドであり得る。
【0051】
別の特定の実施態様では、リンカーは、非ペプチドリンカー、例えば－（ＣＨ２）ｎ－リンカー（ｎは、１～６に含まれる整数である）である。
【0052】
Ｎ末端からＣ末端に、本発明のペプチドは、
－場合により上記リンカーを介して連結されたＣＰＰ部分及びＢｅｃｌｉｎ由来部分；又は
－場合により上記リンカーを介して連結されたＢｅｃｌｉｎ由来部分及びＣＰＰ部分
をこの順序で含み得る。
－場合により上記リンカーを介して連結されたＣＰＰ部分及びＢｅｃｌｉｎ由来部分；又は
－場合により上記リンカーを介して連結されたＢｅｃｌｉｎ由来部分及びＣＰＰ部分
をこの順序で含み得る。
【0053】
特定の実施態様では、本発明のペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に、場合により上記リンカーを介して連結されたＣＰＰ部分及びＢｅｃｌｉｎ由来部分を含む。さらなる特定の実施態様では、本発明のペプチドは、ＣＰＰ部分、リンカー（特に、ジペプチドリンカー、例えばＧＧジペプチド）及びＢｅｃｌｉｎ由来部分をこの順序で含む。
【0054】
別の特定の実施態様では、本発明のペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に、場合により上記リンカーを介して連結されたＢｅｃｌｉｎ由来部分及びＣＰＰ部分を含む。さらなる特定の実施態様では、本発明のペプチドは、Ｂｅｃｌｉｎ由来部分、リンカー（特に、ジペプチドリンカー、例えばＧＧジペプチド）及びＣＰＰ部分をこの順序で含む。
【0055】
特定の実施態様では、本発明のペプチドは、（ｉ）Ｔａｔ配列（例えば、配列番号：１、２及び３に示されている配列の１つ、特に配列番号：１に示されている配列）又はＭＡＰ配列（例えば、配列番号：４又は５）であるＣＰＰ部分、（ｉｉ）ジペプチドリンカー、例えばＧＧジペプチド、及び（ｉｉｉ）式（Ｉ）又は（ＩＩ）のＢｅｃｌｉｎ由来部分、例えばＢｅｃｌｉｎ－１由来部分、例えば配列番号：６５～７３の１つ又はＢｅｃｌｉｎ－２由来部分、例えば配列番号：８９をこの順序で含む融合ペプチドである。特に、本発明において実行されるペプチドは、
に示されているペプチドである。
【化7】
に示されているペプチドである。
【0056】
特定の実施態様によれば、本発明はまた、本明細書に開示されるトランスダクション促進特性を保持する上記で定義されるペプチドのレトロ、インベルソ又はレトロインベルソ誘導体を包含する。特定の実施態様では、本発明は、上記で定義されるペプチドのレトロインベルソ誘導体に関する。特に、本発明のペプチドのレトロインベルソ誘導体は、タンパク質分解に対してより耐性であるので、in vivo用途に適切である。ペプチドは、少なくとも１つのＤアミノ酸並びにイミノアミノ酸及び希アミノ酸を含み得る。本発明はまた、本発明のペプチドのペプチド模倣体に関する。これらは、例えば、１つ以上のペプチド結合の改変、例えば逆ペプチド結合又はエステル結合を特徴とし得る。本発明はまた、α－アミノ酸とは異なるアミノ酸、例えばβ又はγ－アミノ酸を含む上記ペプチドの誘導体を含む。
【0057】
融合ペプチドの使用
本発明のペプチドは、細胞のウイルス感染を促進する。本明細書で使用される「ウイルス」は、天然に存在するウイルス及び人工ウイルスに関する。例えば、パラミクソウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、麻疹ウイルス）、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病、ＶＳＶ）、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、トガウイルス（例えば、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス）、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス）、アレナウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ブンヤウイルス、ボルナウイルス、アルテリウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、例えばアデノ随伴ウイルス。特定の実施態様によれば、ウイルスは、例えば、カーゴ、例えば治療、診断又は任意の他の目的に有用な（例えば、ターゲット細胞内において機能的研究を行うために有用な）カーゴを含み得る人工ウイルスである。例示的なカーゴとしては、核酸カーゴ、例えば産物、特に遺伝子治療産物（例えば、タンパク質又はＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）又は診断産物をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列が挙げられる。さらに、本発明によれば、ウイルスは、カーゴ、例えばタンパク質カーゴ、核酸カーゴ（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡカーゴ）、診断カーゴ又は薬物カーゴをさらに含有し得るウイルス様粒子（又はＶＬＰ）であり得る。本発明との関連では、ウイルスは、エンベロープウイルス又は非エンベロープウイルスのいずれかである。アデノ随伴ウイルス（又はＡＡＶ）などのパルボウイルスは、例示的な非エンベロープウイルスである。好ましい実施態様では、ウイルスは、エンベロープウイルスである。好ましい実施態様では、ウイルスは、レトロウイルス、特にレンチウイルスである。本発明者らは、本発明のペプチドが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）、改変ネコ内因性レトロウイルス（ＲＤ１１４ＴＲ）及び改変テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶＴＲ）由来のエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）でシュードタイピングされたＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクター（ＬＶ）による真核細胞の感染を促進し得ることを示した。本発明者らは、本発明のペプチドが、アデノ随伴ウイルスを含むパルボウイルスなどの他のウイルスの侵入を効率的に促進することをさらに示し、それにより、それらの広範な効率を実証した。本発明のペプチドを用いて得られたトランスダクションの効率と、開示されている実験において使用したウイルスベクター及びＧＰの多様性とを考慮すると、本ペプチドは、真核細胞におけるエンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスのトランスダクション効率を増加させるための一般的手段として使用され得ることが明らかである。したがって、本発明のペプチドは、多くの他のウイルス若しくは他の偽型ウイルス、例えばウイルスエンベロープ糖タンパク質（Levy, 2015）、例えば両種性マウス白血病ウイルスＧＰ（Ａ－ＭＬＶ）若しくは改変ヒヒ内因性ウイルスＧＰ（ＢａＥＶＴＲ）でシュードタイピングされたレンチウイルスによる、又は非エンベロープウイルス、例えばパルボウイルス、特にＡＡＶ、例えばリコンビナントＡＡＶベクターによる真核細胞の感染を促進し得ることも予想される。
本発明のペプチドは、細胞のウイルス感染を促進する。本明細書で使用される「ウイルス」は、天然に存在するウイルス及び人工ウイルスに関する。例えば、パラミクソウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス、麻疹ウイルス）、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、フラビウイルス（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病、ＶＳＶ）、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、トガウイルス（例えば、シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス）、フィロウイルス（例えば、エボラウイルス）、アレナウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、ブンヤウイルス、ボルナウイルス、アルテリウイルス、バキュロウイルス、パルボウイルス、例えばアデノ随伴ウイルス。特定の実施態様によれば、ウイルスは、例えば、カーゴ、例えば治療、診断又は任意の他の目的に有用な（例えば、ターゲット細胞内において機能的研究を行うために有用な）カーゴを含み得る人工ウイルスである。例示的なカーゴとしては、核酸カーゴ、例えば産物、特に遺伝子治療産物（例えば、タンパク質又はＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ）又は診断産物をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列が挙げられる。さらに、本発明によれば、ウイルスは、カーゴ、例えばタンパク質カーゴ、核酸カーゴ（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡカーゴ）、診断カーゴ又は薬物カーゴをさらに含有し得るウイルス様粒子（又はＶＬＰ）であり得る。本発明との関連では、ウイルスは、エンベロープウイルス又は非エンベロープウイルスのいずれかである。アデノ随伴ウイルス（又はＡＡＶ）などのパルボウイルスは、例示的な非エンベロープウイルスである。好ましい実施態様では、ウイルスは、エンベロープウイルスである。好ましい実施態様では、ウイルスは、レトロウイルス、特にレンチウイルスである。本発明者らは、本発明のペプチドが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）、改変ネコ内因性レトロウイルス（ＲＤ１１４ＴＲ）及び改変テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶＴＲ）由来のエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）でシュードタイピングされたＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクター（ＬＶ）による真核細胞の感染を促進し得ることを示した。本発明者らは、本発明のペプチドが、アデノ随伴ウイルスを含むパルボウイルスなどの他のウイルスの侵入を効率的に促進することをさらに示し、それにより、それらの広範な効率を実証した。本発明のペプチドを用いて得られたトランスダクションの効率と、開示されている実験において使用したウイルスベクター及びＧＰの多様性とを考慮すると、本ペプチドは、真核細胞におけるエンベロープウイルス及び非エンベロープウイルスのトランスダクション効率を増加させるための一般的手段として使用され得ることが明らかである。したがって、本発明のペプチドは、多くの他のウイルス若しくは他の偽型ウイルス、例えばウイルスエンベロープ糖タンパク質（Levy, 2015）、例えば両種性マウス白血病ウイルスＧＰ（Ａ－ＭＬＶ）若しくは改変ヒヒ内因性ウイルスＧＰ（ＢａＥＶＴＲ）でシュードタイピングされたレンチウイルスによる、又は非エンベロープウイルス、例えばパルボウイルス、特にＡＡＶ、例えばリコンビナントＡＡＶベクターによる真核細胞の感染を促進し得ることも予想される。
【0058】
ターゲット細胞は、任意の種類の真核細胞、例えば哺乳動物細胞、特にヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、イヌ細胞又はハムスター細胞であり得る。特定の実施態様では、ターゲット細胞は、ＣＤ３４＋細胞、特に、造血系の遺伝子治療を必要とする患者から採取されたＣＤ３４＋細胞である。他の代表的な非限定的なターゲット組織／細胞は、皮膚、筋肉、肝臓、眼、ニューロン、リンパ球、線維芽細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、筋芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞、より一般的には、ウイルスのターゲットとして公知の又はウイルスのターゲットとして同定されるであろう任意の真核細胞である。以下の実験パートでは、本発明者らは、本発明のペプチドによって多種多様な細胞のトランスダクションが得られることを示し、それにより、それらの広範な効率及び適用性を実証する。
【0059】
本明細書に開示される方法では、本発明のペプチドは、有効な量で使用される。ペプチドの「有効量」という用語は、本明細書では、ベクターのトランスダクション効率を有意に増加させるために必要な量を表す。この有効量は、一般に、試験される特定のペプチド、ターゲット細胞、及び実行されるウイルスベクターに依存するであろう。特に、有効量は、オートファジープロセスを誘導又は増加させずに、ウイルスベクターのトランスダクション効率の増加を誘導するペプチドの量である。この量は、当技術分野で周知の方法にしたがって、特にレポーターアッセイを実行する上記方法にしたがって決定され得、実施例で例証され得る。例えば、本発明者らは、驚くべきことに、以前に開示されているＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１ペプチド（Shoji-Kawata et al., 2013）が、トランスダクションされる細胞型に応じて、低濃度で、典型的には１～２０μM、例えば２．５～２０μMに含まれる濃度で、ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ又はＧＡＬＶＴＲ－ＬＶによるＨＣＴ１１６細胞又はＣＤ３４＋細胞のウイルストランスダクションを最適に促進することを示した。また、本発明者らは、Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ－２ペプチドが、０．０１μM～約１０μM、特に０．１～５μMに含まれるさらに低用量で、レンチウイルストランスダクションの強力なエンハンサーであることを示した。本発明のペプチドを使用するための典型的な濃度範囲としては、０．０１μM～２０μM、例えば１～２０μM、例えば２．５～２０μM、特に３～１５μM、より具体的には４～１２μMの濃度、例えば４、５、６、７、８、９又は１０μMの濃度が挙げられる。特定の実施態様では、本発明のペプチドは、約５μM又は約１０μMの濃度で使用される。
【0060】
特定の実施態様では、本発明のペプチド、特にＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ－１ペプチドは、０．０１μM～５μM、特に１μM～５μMに含まれる有効量で使用される。
【0061】
さらなる態様によれば、本発明は、本発明のペプチドとウイルス粒子、特に非エンベロープ（例えば、パルボウイルス、例えばＡＡＶベクター）又はエンベロープウイルス粒子、より具体的には遺伝子治療のためのエンベロープウイルスベクターとの複合体に関する。また、本発明の別の態様は、このような複合体を調製するための方法であって、ペプチドとウイルス粒子とを混合することを含む方法に関する。
【0062】
別の態様によれば、本発明は、本発明のペプチドとウイルス粒子（特に、エンベロープウイルス粒子又は非エンベロープウイルス粒子、より具体的には遺伝子治療のためのエンベロープウイルスベクター）と細胞との混合物に関する。また、本発明の別の態様は、このような混合物を調製するための方法であって、ペプチドとウイルス粒子と細胞とを混合することを含む方法に関する。
【0063】
本発明のペプチドは、医薬組成物において使用され得る。したがって、本発明は、上記で定義されるペプチドと、適切な薬学的に許容し得るビヒクルとを含む組成物に関する。本発明の医薬組成物は、本発明のペプチド又は該ペプチドの生理学的に許容し得る塩の１つ以上を含有する。本発明の医薬組成物はまた、例えば該組成物の溶解性、安定性若しくは滅菌性に寄与するか、又は体内への取り込み効率を増加させる薬学的に有用な助剤を含有し得る。
【0064】
本発明の態様はまた、医薬として使用するための、上記で定義されるペプチドに関する。特定の態様では、医薬は、遺伝子治療ウイルスベクターの効率を増加させるために使用される(D'Costa et al., 2009)。
【0065】
ペプチドを含有する医薬組成物の形と含有量は、投与経路に依存する。好ましくは、ペプチドが非分解状態でターゲット部位に到達するガレヌス製剤及び適用形態が選択される。医薬は、注射、点滴、スプレー、錠剤、坐剤、クリーム、軟膏、ゲルなどとして局所投与され得る。一定期間にわたってボーラス投与又は反復投与を実施することが可能である。
【0066】
本発明のペプチド、複合体又は医薬組成物又は医薬は、局所経路又は全身経路を介して、例えば筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は頭蓋内経路を介してそれを注射することによってin vivo投与され得る。したがって、本発明はまた、遺伝子治療のための方法であって、上記ペプチド、複合体又は医薬組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。前記方法はまた、本発明のペプチドの投与前、投与後、又は投与と一緒に、遺伝子治療のためのウイルスベクターを投与することを含む。当技術分野で十分に理解されているように、本発明の遺伝子治療において使用するためのウイルス又はウイルスベクターは、治療遺伝子を含む。
【0067】
一態様によれば、ペプチド、複合体又は医薬組成物又は医薬は、細胞治療のためのex vivo方法において使用される。この態様では、ペプチド、複合体、医薬組成物又は医薬は、患者から採取された細胞であって、遺伝子治療ウイルスベクターによって遺伝子改変されることを目的とする細胞への遺伝子治療ウイルスベクターの侵入を増強するために使用される。特定の実施態様では、細胞は、造血幹／前駆細胞、例えばｈＣＤ３４＋細胞である。細胞において検出された任意の欠陥を修正するために、前記細胞は、本発明のペプチド及び遺伝子治療ウイルスベクターと混合され得る。特に、このex vivo方法は、ペプチドと、疾患の処置に有用な産物（例えば、タンパク質又は治療用ＲＮＡ）をコードする目的の遺伝子を発現するウイルスベクター、例えばＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクターとの混合物によるトランスダクション後に、患者への遺伝子改変ｈＣＤ３４＋細胞の静脈内注射に有用である。例えば、治療産物は、ウィスコット・アルドリッチ症候群を修正するためのウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質、重症複合免疫不全症１を修正するためのＩＬ２受容体γ鎖、慢性肉芽腫性疾患を修正するためのｇｐ９１ｐｈｏｘタンパク質、アデノシンデアミナーゼ欠損症（又はＡＤＡ－ＳＣＩＤ）を修正するためのアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、サラセミアを修正するためのβ－グロビン、鎌状赤血球病を修正するためのβ－グロビン若しくはγ－グロビン、ファンコニ貧血を修正するためのファンコニ貧血タンパク質（例えば、ＦＡ－Ａ）、小児大脳性副腎白質ジストロフィーを修正するためのＡＴＰ結合カセットタンパク質、又は異染性白質ジストロフィーを修正するためのアリールスルファターゼＡであり得る。本発明はまた、他のex vivo遺伝子治療、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞ベースの治療に使用され得る。特定の態様では、本発明はまた、培養培地中において上記ペプチドを含む組成物であって、ウイルス又はウイルスベクター、特に非エンベロープ又はエンベロープウイルス又はウイルスベクターによる細胞のトランスダクションを促進するための感染促進試薬としての使用を目的とする組成物に関する。したがって、本発明はまた、適切な培地、特に適切な培養培地において本発明のペプチドを含むウイルス感染促進試薬に関する。
【0068】
別の態様によれば、本発明はまた、本発明のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチドは、異なるヌクレオチド化学物質、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又は化学的に改変されたヌクレオチドを含み得る。
【0069】
別の態様では、本発明は、発現宿主におけるペプチドの産生を指令する少なくとも１つのコントロール配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む核酸構築物に関する。「作動可能に連結された」という用語は、本明細書では、コントロール配列が本発明のペプチドのコード配列の発現を指令するように、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対してコントロール配列が適切な位置に配置された構成を表す。本発明との関連における核酸構築物は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの核酸分子であり、天然に存在する遺伝子から単離されたものであるか、又は他の方法では天然に存在しないであろう様式で核酸のセグメントを含有するように改変されたものであるか、又は合成のものである。核酸構築物が、本発明のペプチドコード配列の発現に必要なコントロール配列を含有する場合、核酸構築物という用語は、「発現カセット」という用語と同義である。本発明によれば、コントロール配列は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な全ての成分を含む。各コントロール配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にとってネイティブ若しくは外来性のものであり得るか、又は互いにとってネイティブ若しくは外来性のものであり得る。このようなコントロール配列としては、限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列及び転写ターミネーターが挙げられる。最低でも、コントロール配列は、プロモーター並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。コントロール配列と、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的のために、コントロール配列は、リンカーと共に提供され得る。
【0070】
さらに別の態様では、本発明は、核酸構築物を含むリコンビナント発現ベクターに関する。例示的なリコンビナント発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド及びウイルスベクターが挙げられる。
【0071】
別の態様では、本発明は、核酸又はリコンビナント発現ベクターを含むリコンビナント宿主細胞に関する。宿主細胞は、原核細胞（例えば、Escherichia Coli細胞）又は真核細胞であり得る。
【0072】
別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを生産するための方法であって、（ｉ）ペプチドの生産を行うための条件下で、本発明の核酸構築物を含む宿主細胞を培養する工程；及び（ｉｉ）該ペプチドを回収する工程を含む方法に関する。あるいは、本発明のペプチドは、当技術分野で公知の従来の方法を使用して、in vitro合成によって生産され得る。例えば、Applied Biosystems Inc., Beckmanによる自動合成機などの様々な市販の合成装置が利用可能である。例示的なin vitro合成は、以下の実験パートに示されており、ペプチドは、標準的なフルオレニルメチルオキシ－カルボニルクロリド固相ペプチド合成によって生産され、分取逆相ＨＰＬＣによって精製され、ＨＰＬＣ及び質量分析によって分析される。合成機を使用することによって、天然に存在するアミノ酸は、非天然アミノ酸、特にＤ－異性体（又はＤ型）、例えばＤ－アラニン及びＤ－イソロイシン、ジアステレオ異性体、異なる長さ又は官能性を有する側鎖などで置換され得る。特定の配列及び調製様式は、利便性、経済性、必要な純度などによって決定される。
【0073】
本明細書に記載されるペプチドは、広範囲の用途、例えば治療用途及び診断用途に使用され、細胞へのウイルスの侵入の性能及び研究のための有益な実験室ツールである。
【0074】
したがって、一態様では、本発明は、ウイルス又はウイルスベクターによる細胞のトランスダクションを促進するための方法（特に、in vitro方法）であって、該細胞と、該ウイルスと、
－細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分；及び
－Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分
を含む上記で定義されるペプチドとを接触させることを含む方法に関する。
－細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分；及び
－Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分
を含む上記で定義されるペプチドとを接触させることを含む方法に関する。
【0075】
特定の実施態様では、ペプチドは、配列番号：７５及び配列番号：７７に示されているペプチドではない。
【0076】
この態様の特定の実施態様では、前記方法は、ウイルスによる細胞の有効なトランスダクション又はトランスダクションのレベルを検証することをさらに含む。さらに、この態様によれば、本明細書に開示されるペプチドは、多くの下記用途を有する目的のウイルス又はウイルスベクターの感染又はトランスダクションを改善するために使用される。
【0077】
本発明の好ましい実施態様は、ウイルスベクター系ベースのルーチンな実験室又は遺伝子治療アプローチのための、ウイルス感染又はトランスダクション効率の一般的なエンハンサーとしての本発明のペプチドの使用である。ペプチドは、ex vivo、in vitro又はin vivoで細胞へのベクター（例えば、遺伝子治療、診断又は任意の他の目的のために設計されたもの（例えば、機能研究に使用されるベクター）の侵入を増強する。ペプチドは、ウイルスベクター、例えば遺伝子治療又は診断のためのベクターと組み合わせて投与され得、ターゲット細胞へのウイルスベクターの侵入を媒介し得る。ペプチドはまた、細胞へのウイルスの取り込みを促進するので、in vitroで有用である。したがって、それらは、ウイルス及びそれらの作用機構を研究するためのツールとして有用である。本発明の別の実施態様は、診断アプローチのための本発明のペプチド（特に、ＨＩＶ－１及び他のエンベロープウイルスのようなウイルスのもの）の使用である。したがって、本発明はまた、サンプル中のウイルスの存在又は非存在を検出するための細胞ベースのアッセイの感度を増加させるためのin vitro方法であって、該サンプル又は該サンプル由来抽出物と、細胞と、上記で定義されるペプチドとを接触させることを含み、前記ペプチドが、
－細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分；及び
－Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分
を含むin vitro方法に関する。
－細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）部分；及び
－Ｂｅｃｌｉｎ由来ペプチド部分
を含むin vitro方法に関する。
【0078】
この接触工程の後、適切な培養条件で、細胞を培養する。次いで、当技術分野で公知の任意の方法によって、例えば、細胞及び／又は細胞培養培地におけるウイルスのレベルを決定することによって、ウイルスの存在又は非存在の検出を行い得る。
【0079】
本発明のペプチドは、ウイルス粒子の感染力価を増強するので、それらの細胞取り込みを増強し、残存ウイルス混入物質の検出を可能にする。したがって、それは、被験体、特にウイルス（より具体的には、エンベロープウイルス）に感染していると疑われるヒト被験体由来の血清、血液、血漿、精子又は組織のようなサンプルからウイルス粒子を単離するために使用され得る。本発明のペプチドはまた、水、食物（鳥インフルエンザ、ＳＡＲＳ）、又はバイオテロにおいて使用される任意の（エンベロープ又は非エンベロープ）ウイルス由来のウイルス粒子を研究するために使用され得る。ウイルス単離の成功は、ルーチンな診断方法と比較して数倍有利であり得る。安全な溶液を得るために、好ましい方法は、ウイルスを含むと疑われるか又はウイルスを含むことが公知の溶液から定量的にウイルスを除去する結合親和性アッセイ及び方法である。このような方法では、本発明のペプチドは、好ましくは、支持体又はカラムに共有結合される。
【0080】
本発明のペプチドは、一般に、ターゲット細胞へのウイルス粒子の侵入を増強するために使用され得る。ペプチドはまた、ウイルス粒子、例えば非エンベロープウイルス粒子、例えばパルボウイルス、例えばＡＡＶベクター又はウイルスエンベロープウイルス粒子、例えば外来エンベロープ糖タンパク質を運搬する粒子（擬似粒子）、例えばＶＳＶ－Ｇ、ＧＡＬＶＴＲ、ＲＤ１１４ＴＲなどの感染／トランスダクション率の一般的なエンハンサーとして使用され得る。本発明の上記ペプチドは、全ての分析したエンベロープウイルス粒子の感染率を促進する。これは、以前は実現不可能であった特に一次細胞における感染実験を実施することを可能にする。したがって、本発明のペプチドは、in vitroにおける実験ツールとして有用である。
【0081】
本発明のペプチドはまた、ベクター系ベースの、特に非エンベロープ又はエンベロープベクター系ベースのex vivo又はin vivo遺伝子治療アプローチにおける遺伝子送達率を増強するために使用され得る。したがって、本発明はまた、それを必要とする被験体におけるウイルス又はウイルスベクターによる真核細胞の感染を促進するための遺伝子治療において使用するための上記ペプチドに関する。本発明のペプチドは、遺伝子治療においてウイルス又はウイルスベクターと組み合わせて使用され得る。特に、本発明は、遺伝子治療によって疾患を処置するための方法において使用するための本発明のペプチドであって、前記疾患の処置のための適切な治療導入遺伝子をそのゲノムに含むウイルス又はウイルスベクターと組み合わせて使用される本発明のペプチドに関する。特定の実施態様では、処置は、上記に列挙されている対応する疾患の処置において使用するための上記導入遺伝子の１つを含むウイルス又はウイルスベクターを投与することによって行われる。ペプチドは、遺伝子治療ベクターと同時投与、別個投与又は逐次投与するためのものであり得る。遺伝子治療のための、特に幹細胞のex vivo遺伝子治療のための高感染性ウイルスベクターの作製は、困難な手順である。特に、幹細胞のためのウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）のトランスダクション効率は低い。しかしながら、本発明のペプチドの存在下では、幹細胞及び細胞株は、ウイルスベクターで効率的にトランスダクションされ、ペプチドを含有しないサンプルと比較して、ターゲット細胞への高い遺伝子送達効率が得られ得る。本発明のペプチドの別の利点は、低い（又は最適未満の）感染力価を有するウイルスバッチの使用を可能にすること、又は本発明のペプチドが実行されない場合よりも少ないウイルスベクターの使用を可能にすることである。
【0082】
本発明のin vitro及びex vivo方法では、ペプチドは、固体支持体への前固定化にかかわらず使用され得る。有利なことに、増加したトランスダクション効率を得るために、固定化は不要である。
【0083】
本発明のin vitro方法の特定の実施態様では、別のトランスダクション改善手段が、本発明のペプチドと一緒に使用される。例えば、特定の実施態様では、トランスダクション効率は、本発明のペプチドと、別のウイルストランスダクションエンハンサー、例えばＶｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１（ＫＫＡＬＬＨＡＡＬＡＨＬＬＡＬＡＨＨＬＬＡＬＬＫＫＡ－ＮＨ２：配列番号：８４）、ヒトフィブロネクチンフラグメント（例えば、Clontechなどから市販されているレトロネクチン）、ウイルス感染の様々な精液由来エンハンサー（例えば、ＳＥＶＩ（ＧＩＨＫＱＫＥＫＳＲＬＱＧＧＶＬＶＮＥＩＬＮＨＭＫＲＡＴＱＩＰＳＹＫＫＬＩＭＹ；配列番号：８５）、セメノゲリン１ペプチドＳＥＭ１（８６－１０７）（ＤＬＮＡＬＨＫＴＴＫＳＱＲＨＬＧＧＳＱＱＬＬ；配列番号：８６））又はＨＩＶ－１エンベロープ糖タンパク質由来ペプチド（例えば、ＥＦ－Ｃペプチド（ＱＣＫＩＫＱＩＩＮＭＷＱ；配列番号：８７）、Ｐ１６ペプチド（Ａｃ－ＮＷＦＤＩＴＮＷＬＷＹＩＫＫＫＫ－ＮＨ２；配列番号：８８））のような以前に記載されているウイルストランスダクションエンハンサーとの両方を用いて増加される。
【0084】
別の実施態様では、本発明は、上記で定義されるペプチドを含むキットを提供する。キットは、ウイルス又はウイルスベクターをさらに含み得る。
【0085】
以下の実施例によって、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【0086】
材料及び方法
ペプチド及び試薬
標準的なフルオレニルメチルオキシ－カルボニルクロリド固相ペプチド合成によって、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１、Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ、Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１及びその誘導体を生産し、分取逆相ＨＰＬＣによって精製し、ＨＰＬＣ及び質量分析法によって分析した（Genecust, Dudelange, Luxembourg）。７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）、ポリブレン、硫酸プロタミン及びＴｒｉｔｏｎＸ－１００は、Sigma-Aldrich (St-Quentin-Fallavier, France)から入手した。
ペプチド及び試薬
標準的なフルオレニルメチルオキシ－カルボニルクロリド固相ペプチド合成によって、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１、Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ、Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１及びその誘導体を生産し、分取逆相ＨＰＬＣによって精製し、ＨＰＬＣ及び質量分析法によって分析した（Genecust, Dudelange, Luxembourg）。７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）、ポリブレン、硫酸プロタミン及びＴｒｉｔｏｎＸ－１００は、Sigma-Aldrich (St-Quentin-Fallavier, France)から入手した。
【0087】
細胞株培養
１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）(Life Technologies, St-Aubin, France)を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で、ヒト結腸直腸ガン由来ＨＣＴ１１６細胞(CCL-247; ATCC, Manassas, VA)及びヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ細胞(Merten, 2011)を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）(Life Technologies, St-Aubin, France)を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で、ヒト結腸直腸ガン由来ＨＣＴ１１６細胞(CCL-247; ATCC, Manassas, VA)及びヒト胚腎臓ＨＥＫ２９３Ｔ細胞(Merten, 2011)を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【0088】
ウイルスベクターの生産及びベクターの力価測定
以前に記載されているように(Fenard, 2013)、ＬＶを作製した。簡潔に言えば、４つのプラスミド：ｇａｇｐｏｌ（ｐＫＬｇａｇｐｏｌ）及びｒｅｖ（ｐＫｒｅｖ）発現プラスミド、トランスファープラスミド（ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈＰＧＫ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ）並びにＶＳＶ－Ｇ（ｐＭＤＧ）エンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）、ＧＡＬＶＴＲ ＧＰ（ｐＢＡ．ＧＡＬＶ／Ａｍｐｈｏ－Ｋａｎａ）又はＲＤ１１４ＴＲ ＧＰ（ｐＨＣＭＶ－ＲＤ１１４ＴＲ）のいずれかをコードするプラスミド．によるリン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクションする。２４時間の産生後、生ウイルス上清を採取し、ろ過し（０．４５μm）、－８０℃で凍結した。いくつかの膜ベースの工程及びクロマトグラフィー工程によるＧＦＰ発現ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶの精製が以前に記載されている(Merten, 2011)。市販のＥＬＩＳＡキット(Perkin Elmer, Courtaboeuf, France)を使用してＨＩＶ－１ ｐ２４カプシド含有量を測定することによって、物理的粒子力価を決定した。フローサイトメトリー(FACSCalibur, BD Biosciences, Le Pont de Claix, France)によるＧＦＰの検出（力価は、１ミリリットル当たりのトランスダクション単位（TU/ml）として表される）を使用して、又はＱ－ＰＣＲ（力価は、１ミリリットル当たりの感染ゲノム（ig/ml）として表される）を使用して、ＨＣＴ１１６細胞において、感染力価を決定した(Merten, 2011)。
以前に記載されているように(Fenard, 2013)、ＬＶを作製した。簡潔に言えば、４つのプラスミド：ｇａｇｐｏｌ（ｐＫＬｇａｇｐｏｌ）及びｒｅｖ（ｐＫｒｅｖ）発現プラスミド、トランスファープラスミド（ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈＰＧＫ．ｅＧＦＰ．ＷＰＲＥ）並びにＶＳＶ－Ｇ（ｐＭＤＧ）エンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）、ＧＡＬＶＴＲ ＧＰ（ｐＢＡ．ＧＡＬＶ／Ａｍｐｈｏ－Ｋａｎａ）又はＲＤ１１４ＴＲ ＧＰ（ｐＨＣＭＶ－ＲＤ１１４ＴＲ）のいずれかをコードするプラスミド．によるリン酸カルシウムトランスフェクションを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性トランスフェクションする。２４時間の産生後、生ウイルス上清を採取し、ろ過し（０．４５μm）、－８０℃で凍結した。いくつかの膜ベースの工程及びクロマトグラフィー工程によるＧＦＰ発現ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶの精製が以前に記載されている(Merten, 2011)。市販のＥＬＩＳＡキット(Perkin Elmer, Courtaboeuf, France)を使用してＨＩＶ－１ ｐ２４カプシド含有量を測定することによって、物理的粒子力価を決定した。フローサイトメトリー(FACSCalibur, BD Biosciences, Le Pont de Claix, France)によるＧＦＰの検出（力価は、１ミリリットル当たりのトランスダクション単位（TU/ml）として表される）を使用して、又はＱ－ＰＣＲ（力価は、１ミリリットル当たりの感染ゲノム（ig/ml）として表される）を使用して、ＨＣＴ１１６細胞において、感染力価を決定した(Merten, 2011)。
【0089】
細胞株のトランスダクション
レンチウイルストランスダクションでは、４８プレート中、培養添加物の非存在下又は存在下、所望の量のレンチウイルスベクター上清でＨＣＴ１１６細胞を６時間トランスダクションした。次に、新鮮培地中で細胞をインキュベーションし、さらに３～４日間培養した。
レンチウイルストランスダクションでは、４８プレート中、培養添加物の非存在下又は存在下、所望の量のレンチウイルスベクター上清でＨＣＴ１１６細胞を６時間トランスダクションした。次に、新鮮培地中で細胞をインキュベーションし、さらに３～４日間培養した。
【0090】
リコンビナントアデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＡＶ８－ＧＦＰ）を用いて実施したトランスダクション実験では、１２ウェルプレート中、培養添加物の非存在下又は存在下、感染多重度（ＭＯＩ）１０００で２９３Ｔ細胞をトランスダクションした。１６時間後、細胞を洗浄し、新鮮培地中でさらに２４時間培養した。これらの実験では、フローサイトメトリー(FACSCalibur, BD Biosciences)を使用してＧＦＰ発現を追跡することによって、トランスダクション効率を評価した。
【0091】
ヒトＣＤ３４＋細胞の培養及びトランスダクション
French Ministry of Research and Higher Studiesへの申告N° DC-201-1655の下、国際倫理原則及びフランスの国内法（生命倫理法n°2011-814）にしたがって、Centre Hospitalier Sud Francilien, Evry, Franceにおいて、合併症を伴わない出産後にインフォームドコンセントを得て、臍帯血（ＵＣＢ）サンプルを収集した。免疫磁気選択(Miltenyi Biotec, Paris, France)によって、ヒトＣＤ３４＋細胞を単離した。以前に記載されているように(Ingrao et al., 2014)、ｈＣＤ３４＋細胞の予備活性化を一晩実施した。予備活性化細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、目的のペプチドと混合した又は混合していない所望の量のＬＶ粒子を追加することによって、トランスダクションを開始した。トランスダクションの６時間後、分化培地を各ウェルに追加することによって、反応物を希釈した。４～６日後、７－ＡＡＤ標識及びＧＦＰ発現の測定によって、細胞死亡率及びトランスダクション効率をそれぞれ評価した。
French Ministry of Research and Higher Studiesへの申告N° DC-201-1655の下、国際倫理原則及びフランスの国内法（生命倫理法n°2011-814）にしたがって、Centre Hospitalier Sud Francilien, Evry, Franceにおいて、合併症を伴わない出産後にインフォームドコンセントを得て、臍帯血（ＵＣＢ）サンプルを収集した。免疫磁気選択(Miltenyi Biotec, Paris, France)によって、ヒトＣＤ３４＋細胞を単離した。以前に記載されているように(Ingrao et al., 2014)、ｈＣＤ３４＋細胞の予備活性化を一晩実施した。予備活性化細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、目的のペプチドと混合した又は混合していない所望の量のＬＶ粒子を追加することによって、トランスダクションを開始した。トランスダクションの６時間後、分化培地を各ウェルに追加することによって、反応物を希釈した。４～６日後、７－ＡＡＤ標識及びＧＦＰ発現の測定によって、細胞死亡率及びトランスダクション効率をそれぞれ評価した。
【0092】
ウイルスプルダウンアッセイ
以前に記載されているプロトコール(Yolamanova, 2013)から、培養添加物の存在下におけるＬＶ粒子のプルダウンを適合させた。簡潔に言えば、室温で平衡化したX-Vivo20培地で、ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ上清を１００ng/ml ｐ２４に希釈した。次に、１０μMの示されている培養添加物の非存在下又は存在下で、ＬＶ懸濁液 ５００μlを１．５mlチューブにロードした。ホモジナイズした後、サンプルを低速（１５，０００ｇ）、室温で５分間遠心分離した。次いで、上清を廃棄し、ペレットを新鮮培地 １００μlに懸濁し、－２０℃で凍結した。各条件について、上記のように市販のＨＩＶ－１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキットを使用して、ペレット化ｐ２４の量を評価した。
以前に記載されているプロトコール(Yolamanova, 2013)から、培養添加物の存在下におけるＬＶ粒子のプルダウンを適合させた。簡潔に言えば、室温で平衡化したX-Vivo20培地で、ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ上清を１００ng/ml ｐ２４に希釈した。次に、１０μMの示されている培養添加物の非存在下又は存在下で、ＬＶ懸濁液 ５００μlを１．５mlチューブにロードした。ホモジナイズした後、サンプルを低速（１５，０００ｇ）、室温で５分間遠心分離した。次いで、上清を廃棄し、ペレットを新鮮培地 １００μlに懸濁し、－２０℃で凍結した。各条件について、上記のように市販のＨＩＶ－１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキットを使用して、ペレット化ｐ２４の量を評価した。
【0093】
接着及びＢＬＡＭ－ＬＶ融合アッセイ
以前の研究(Fenard, 2013)から、ターゲット細胞に対するＬＶ接着のプロトコールを適合させた。簡潔に言えば、Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ又はＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（５μM）の非存在下又は存在下で、ＨＣＴ１１６細胞を３７℃で３０分間プレインキュベーションした。次いで、培養添加物の非存在下又は存在下で、細胞をウイルス上清と共に４℃でさらに２．５時間インキュベーションした。次に、冷ＰＢＳ１×で細胞を３回洗浄し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及びプロテアーゼカクテル阻害剤Complete (Roche diagnostics, Meylan, France)を含有するＰＢＳ１×で溶解した。市販のＨＩＶ－１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキットを使用して溶解物中のｐ２４含有量を評価し、ＤＣタンパク質アッセイ(Biorad, Ivry-sur-Seine, France)を使用して全タンパク質含有量に対してデータを正規化した。ウイルス融合アッセイ（ＢＬＡＭ－ＬＶ）アッセイについて、プロトコールは以前に詳細に記載されていた(Ingrao et al., 2014)。
以前の研究(Fenard, 2013)から、ターゲット細胞に対するＬＶ接着のプロトコールを適合させた。簡潔に言えば、Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ又はＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（５μM）の非存在下又は存在下で、ＨＣＴ１１６細胞を３７℃で３０分間プレインキュベーションした。次いで、培養添加物の非存在下又は存在下で、細胞をウイルス上清と共に４℃でさらに２．５時間インキュベーションした。次に、冷ＰＢＳ１×で細胞を３回洗浄し、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及びプロテアーゼカクテル阻害剤Complete (Roche diagnostics, Meylan, France)を含有するＰＢＳ１×で溶解した。市販のＨＩＶ－１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡキットを使用して溶解物中のｐ２４含有量を評価し、ＤＣタンパク質アッセイ(Biorad, Ivry-sur-Seine, France)を使用して全タンパク質含有量に対してデータを正規化した。ウイルス融合アッセイ（ＢＬＡＭ－ＬＶ）アッセイについて、プロトコールは以前に詳細に記載されていた(Ingrao et al., 2014)。
【0094】
ＣＦＣアッセイ
製造業者の説明書にしたがって、Methocult (H4434, Stemcell Technologies)１ミリリットル当たりトランスダクション細胞又は非トランスダクション細胞 ５００個をプレーティングすることによって、ＣＦＣアッセイを２回反復で実施した。２週間の培養後、標準的な視覚的基準を用いて倒立顕微鏡を使用して、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ－Ｅ）；顆粒球－単球コロニー形成単位（ＣＦＵ－ＧＭ）及び顆粒球－赤血球－マクロファージ－巨核球コロニー形成単位（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）をカウントした。
製造業者の説明書にしたがって、Methocult (H4434, Stemcell Technologies)１ミリリットル当たりトランスダクション細胞又は非トランスダクション細胞 ５００個をプレーティングすることによって、ＣＦＣアッセイを２回反復で実施した。２週間の培養後、標準的な視覚的基準を用いて倒立顕微鏡を使用して、赤芽球バースト形成単位（ＢＦＵ－Ｅ）；顆粒球－単球コロニー形成単位（ＣＦＵ－ＧＭ）及び顆粒球－赤血球－マクロファージ－巨核球コロニー形成単位（ＣＦＵ－ＧＥＭＭ）をカウントした。
【0095】
イメージングフローサイトメトリーベースのオートファジーアッセイ（ImageStream）
一過性リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して、ｐＢＡＢＥ－ｐｕｒｏ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｅＧＦＰ－ＬＣ３発現プラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（５μM）の非存在下若しくは存在下で、又はアール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）中で、細胞（細胞 ５×１０Ｅ５個／ウェル）を３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベーションした。次に、ＰＢＳ１×で細胞をで洗浄し、固定し（１．２％ＰＦＡ）、ImageStream (Amnis corporation, Seattle, WA, USA)を使用して分析した。感度を最適化するために４０倍対物レンズ及び最低流速を使用して、明視野チャネル、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光チャネル及び最後にＳＳＣチャネル（７４２nm）で、細胞の画像を取得した。取得したら、Ideas（登録商標）ソフトウェアを用いて、画像を処理した。ヒストグラムで焦点画像をゲートし、４０～９０の明視野チャンネルでGradient_RMS特徴値を示した。次いで、（明視野チャンネルの）面積対アスペクト比の散布図を使用して、単一細胞をゲートし、細胞のダブレットを除去した。単一細胞をゲートしたら、Ideas（登録商標）ソフトウェアに含まれる自動スポットカウントウィザードを使用して、各細胞上のスポットの数をｍＣｈｅｒｒｙチャネルでカウントした。テキストファイルとしてデータをエクスポートし、GraphPad Prismを用いて処理した。
一過性リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して、ｐＢＡＢＥ－ｐｕｒｏ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｅＧＦＰ－ＬＣ３発現プラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１（５μM）の非存在下若しくは存在下で、又はアール平衡塩類溶液（ＥＢＳＳ）中で、細胞（細胞 ５×１０Ｅ５個／ウェル）を３７℃、５％ＣＯ２で６時間インキュベーションした。次に、ＰＢＳ１×で細胞をで洗浄し、固定し（１．２％ＰＦＡ）、ImageStream (Amnis corporation, Seattle, WA, USA)を使用して分析した。感度を最適化するために４０倍対物レンズ及び最低流速を使用して、明視野チャネル、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光チャネル及び最後にＳＳＣチャネル（７４２nm）で、細胞の画像を取得した。取得したら、Ideas（登録商標）ソフトウェアを用いて、画像を処理した。ヒストグラムで焦点画像をゲートし、４０～９０の明視野チャンネルでGradient_RMS特徴値を示した。次いで、（明視野チャンネルの）面積対アスペクト比の散布図を使用して、単一細胞をゲートし、細胞のダブレットを除去した。単一細胞をゲートしたら、Ideas（登録商標）ソフトウェアに含まれる自動スポットカウントウィザードを使用して、各細胞上のスポットの数をｍＣｈｅｒｒｙチャネルでカウントした。テキストファイルとしてデータをエクスポートし、GraphPad Prismを用いて処理した。
【0096】
結果及び考察
低用量のＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１は、様々な偽型による細胞株のレンチウイルストランスダクションを強く改善した。
レンチウイルストランスダクションに対するＴＢ１（配列番号：７５）ペプチドの効果を評価するために、低用量又は高用量のＴＢ１又はコントロールペプチドＴａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ（ＴＳ）存在下、広く使用されているＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質エンベロープ（ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ）でシュードタイピングしたレンチウイルスベクター（ＬＶ）でＨＣＴ１１６細胞をトランスダクションした（図１Ａ）。興味深いことに、低用量のＴＢ１の使用は、レンチウイルストランスダクションを強く改善した（１０倍）。さらに、１対数濃度のＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ、１０Ｅ５～１０Ｅ６ TU/ml（ＭＯＩ ０．５～５に相当）では、ＴＢ１効果は飽和せず、最大８４％のトランスダクション効率に達した（図１Ｂ）。
低用量のＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１は、様々な偽型による細胞株のレンチウイルストランスダクションを強く改善した。
レンチウイルストランスダクションに対するＴＢ１（配列番号：７５）ペプチドの効果を評価するために、低用量又は高用量のＴＢ１又はコントロールペプチドＴａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ（ＴＳ）存在下、広く使用されているＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質エンベロープ（ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ）でシュードタイピングしたレンチウイルスベクター（ＬＶ）でＨＣＴ１１６細胞をトランスダクションした（図１Ａ）。興味深いことに、低用量のＴＢ１の使用は、レンチウイルストランスダクションを強く改善した（１０倍）。さらに、１対数濃度のＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ、１０Ｅ５～１０Ｅ６ TU/ml（ＭＯＩ ０．５～５に相当）では、ＴＢ１効果は飽和せず、最大８４％のトランスダクション効率に達した（図１Ｂ）。
【0097】
ＬＶを遺伝子移入に使用することの大きな利点は、特異的細胞ターゲティングのための多数の異種エンベロープ糖タンパク質によるシュードタイピングを支援するそれらの能力である(Levy, 2015)。したがって、様々なＬＶ偽型（すなわち、改変テナガザル白血病ウイルス糖タンパク質でシュードタイピングしたＬＶ（ＧＡＬＶＴＲ－ＬＶ）及び改変ＲＤ１１４ネコ内因性レトロウイルス糖タンパク質でシュードタイピングしたＬＶ（ＲＤ１１４ＴＲ－ＬＶ））において、ＴＢ１の効果を評価した。非常に重要なことに、これらの造血指向性偽型は、効率的なトランスダクションを促進するための培養添加物の要件が周知である。接着細胞株では、ＬＶを促進するために使用される古典的な可溶性添加剤は、ポリブレン、硫酸プロタミン又は最近特定されたＶｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１(Fenard, 2013)である。図１Ｃに示されているように、ＴＢ１は、他の培養添加物と同程度に、ＧＡＬＶＴＲ及びＲＤ１１４ＴＲ－ＬＶトランスダクションを促進している。したがって、ＴＢ１は、細胞株及びレンチウイルス偽型の他の大きな一団効率的なレンチウイルストランスダクションエンハンサーである。
【0098】
Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１は、造血幹／前駆細胞の安全なレンチウイルストランスダクションを促進する。
基礎研究のために細胞株のレンチウイルストランスダクションを促進することは興味深いが、別の関心対象は、ex vivo遺伝子治療アプローチのために、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）をターゲティングするレンチウイルストランスダクションの現在の臨床プロトコールを最適化することである。図２Ａに示されているように、高精製ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ粒子を使用して、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣをトランスダクションした。ＴＢ１の存在下では、レンチウイルストランスダクションの２倍の増加が観察された。ＨＳＰＣのレンチウイルストランスダクションを促進するためのＴＢ１の最適用量は、約１０μMと定義された（図２Ａ～Ｂ）。
基礎研究のために細胞株のレンチウイルストランスダクションを促進することは興味深いが、別の関心対象は、ex vivo遺伝子治療アプローチのために、造血幹／前駆細胞（ＨＳＰＣ）をターゲティングするレンチウイルストランスダクションの現在の臨床プロトコールを最適化することである。図２Ａに示されているように、高精製ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶ粒子を使用して、ヒトＣＤ３４＋ＨＳＰＣをトランスダクションした。ＴＢ１の存在下では、レンチウイルストランスダクションの２倍の増加が観察された。ＨＳＰＣのレンチウイルストランスダクションを促進するためのＴＢ１の最適用量は、約１０μMと定義された（図２Ａ～Ｂ）。
【0099】
ＴＢ１ペプチドは、オートシス（ａｕｔｏｓｉｓ）と称される特異的細胞死をトリガーすることが以前に示されているので(Liu, 2013)、ＨＳＰＣにおいて安全性研究を実施した。そのために、レンチウイルストランスダクション中に最適濃度のレトロネクチン、ＴＳ又はＴＢ１ペプチドに曝露したヒトＣＤ３４＋細胞から、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイを実行した。これらの実験では、本発明者らは、高精製ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶを使用してＣＤ３４＋細胞をトランスダクションしたが、これは、これらのベクターが、このアッセイにおいて測定可能な造血毒性を示さないためである(Merten, 2011)。図２Ｃに示されているように、アッセイにおいて使用したいかなる培養添加物からも毒性の証拠はなかった。ＴＢ１へのＣＤ３４＋細胞の曝露は、ＣＦＣとしてのそれらのその後の成長及び骨髄赤血球分化に影響を与えなかった。
【0100】
Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１は、ＬＶとターゲット細胞膜との接着及び融合段階に作用している。
ターゲット細胞へのＬＶの侵入は律速段階である。したがって、本発明者らは、低用量のＴＢ１が、ＬＶとターゲット細胞膜との接着及び融合を増強することができるかを試験することを決定した。そのために、ＢＬＡＭ－ＬＶアッセイを使用した(Ingrao, 2014)。図３Ａに示されているように、細胞株（ＨＣＴ１１６）又はｈＣＤ３４＋ＨＳＰＣのような関連一次細胞のいずれかを用いた場合、ＴＢ１は、ウイルス融合段階を強く増加させた。次に、４℃でターゲット細胞と相互作用するウイルス粒子の数を定量することによって、本発明者らは、ＴＢ１の存在下では、ウイルス接着のレベルが、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１を使用したコントロール条件と同程度のレベルまで強く増加することを示した（図３Ｂ）。しかしながら、ウイルスプルダウンアッセイを使用して、本発明者らは、ウイルス接着のこの増加が、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１（ナノフィブリルペプチド）の場合のようにウイルス粒子のＴＢ１誘導性凝集の結果ではないことを示した（図３Ｃ）。したがって、ＴＢ１ペプチドは、ウイルス粒子の凝集を伴わない分子機構を介して、ウイルス接着及び融合段階を増加させることができる。
ターゲット細胞へのＬＶの侵入は律速段階である。したがって、本発明者らは、低用量のＴＢ１が、ＬＶとターゲット細胞膜との接着及び融合を増強することができるかを試験することを決定した。そのために、ＢＬＡＭ－ＬＶアッセイを使用した(Ingrao, 2014)。図３Ａに示されているように、細胞株（ＨＣＴ１１６）又はｈＣＤ３４＋ＨＳＰＣのような関連一次細胞のいずれかを用いた場合、ＴＢ１は、ウイルス融合段階を強く増加させた。次に、４℃でターゲット細胞と相互作用するウイルス粒子の数を定量することによって、本発明者らは、ＴＢ１の存在下では、ウイルス接着のレベルが、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１を使用したコントロール条件と同程度のレベルまで強く増加することを示した（図３Ｂ）。しかしながら、ウイルスプルダウンアッセイを使用して、本発明者らは、ウイルス接着のこの増加が、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１（ナノフィブリルペプチド）の場合のようにウイルス粒子のＴＢ１誘導性凝集の結果ではないことを示した（図３Ｃ）。したがって、ＴＢ１ペプチドは、ウイルス粒子の凝集を伴わない分子機構を介して、ウイルス接着及び融合段階を増加させることができる。
【0101】
多数のＴａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ１変異体の設計及びレンチウイルストランスダクションに対するその評価。
レンチウイルストランスダクションに対するＴＢ１の作用の特異性を評価するために、Ｔａｔトランスダクションドメイン（Ｔａｔ）及び２６７－２８４改変ｂｅｃｌｉｎ１ドメイン（Ｂｅｃ）を合成し、ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶによるＨＣＴ１１６細胞のトランスダクション中に試験した。図４に示されているように、Ｔａｔ及びＢｅｃペプチドはいずれも、レンチウイルストランスダクションを促進することができない。したがって、レンチウイルストランスダクションに対するＴＢ１のポジティブな効果は、Ｔａｔの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）活性によるものではない。また、Ｂｅｃｌｉｎ１ドメインは、トランスダクションドメインに連結されてその効果を発揮するが、これは、Shoji-Kawataの研究に記載されるＧＡＰＲ－１タンパク質との特異的相互作用を確かに介して、又はまだ同定されていない別の細胞パートナーとの相互作用を介して、それが細胞内で作用していることを示唆している。
レンチウイルストランスダクションに対するＴＢ１の作用の特異性を評価するために、Ｔａｔトランスダクションドメイン（Ｔａｔ）及び２６７－２８４改変ｂｅｃｌｉｎ１ドメイン（Ｂｅｃ）を合成し、ＶＳＶ－Ｇ－ＬＶによるＨＣＴ１１６細胞のトランスダクション中に試験した。図４に示されているように、Ｔａｔ及びＢｅｃペプチドはいずれも、レンチウイルストランスダクションを促進することができない。したがって、レンチウイルストランスダクションに対するＴＢ１のポジティブな効果は、Ｔａｔの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）活性によるものではない。また、Ｂｅｃｌｉｎ１ドメインは、トランスダクションドメインに連結されてその効果を発揮するが、これは、Shoji-Kawataの研究に記載されるＧＡＰＲ－１タンパク質との特異的相互作用を確かに介して、又はまだ同定されていない別の細胞パートナーとの相互作用を介して、それが細胞内で作用していることを示唆している。
【0102】
そのペプチド溶解性を増加させるために、Shoji-Kawataらは、ＴＢ１の２６７－２８４Ｂｅｃｌｉｎ１ドメインにおいて３つの突然変異（すなわち、Ｈ２７５Ｅ、Ｓ２７９Ｄ及びＱ２８１Ｅ）を組み込んだ（国際公開公報第２０１３／１１９３７７号、Shoji-Kawata et al. 2013）。ウイルストランスダクションエンハンサー活性に対するこれらの突然変異の影響を評価するために、ヒトＢｅｃｌｉｎ１タンパク質の野生型２６７－２８４ドメインをＴａｔに融合した（Ｔａｔ－ＢｅｃＷＴ）。図４に示されているように、Ｔａｔ－ＢｅｃＷＴは、２．５μMの濃度で、ＴＢ１と同じくらい効率的にレンチウイルストランスダクションを促進することができる。しかしながら、このペプチドは、５μMの濃度では、ＴＢ１と比較してもはや活性ではない。これら３つの突然変異が、ＧＡＰＲ－１タンパク質又は別の重要なパートナーとの相互作用を改善して、より優れたウイルストランスダクションエンハンサー活性をもたらし得ることは除外されない。実際、これらの突然変異は、このＢｅｃｌｉｎ１ドメインとウイルス因子（ＨＩＶ－１ Ｎｅｆタンパク質）との相互作用を２５～３０％増加させる（Shoji-Kawata et al. 2013の補足図１ｄを参照のこと）。
【0103】
ウイルストランスダクションに対するＴＢ１の作用機構をさらに理解するために、ＴＢ１ペプチドにおける２つのフェニルアラニン残基の役割が評価されている。以前、Shoji-Kawataらは、Ｔａｔ－Ｂｅｃ（Ｆ２７０Ｓ）及びＴａｔ－Ｂｅｃ（Ｆ２７４Ｓ）ペプチドが、オートファジー経路をもはや誘導することができないことを示した(Shoji-Kawata et al. 2013)。本発明者らのウイルストランスダクション実験においても、これらのペプチドはレンチウイルストランスダクションを促進することができず（図４）、これは、フェニルアラニン残基がこれらの機能のいずれかに重要であることを示唆している。
【0104】
過去数年間に、多数の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が発見されている(Milletti et al. 2012)。したがって、広く使用されているＴａｔペプチドとは異なるＣＰＰを試験することが興味深いものであり得る。１つの興味深い候補は、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）である。本発明者らは、ＭＡＰ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄネガティブコントロール及びＭＡＰ－Ｂｅｃｌｉｎ１ペプチドを設計した（ＭＡＰ部分は、配列番号：４に示されている配列を有する）。図４に示されているように、ＭＡＰ－Ｂｅｃｌｉｎ１（配列番号：７６）は、レンチウイルストランスダクションの促進に関してＴＢ１と同じくらい効率的であるが、これは、様々なＣＰＰを使用して、ターゲット細胞の細胞質への改変Ｂｅｃｌｉｎ１ドメインの侵入を可能にし得ることを示唆している。
【0105】
ＴＢ１ペプチドの改変Ｂｅｃｌｉｎ１ドメインは、ヒトＢｅｃｌｉｎ１タンパク質（homo sapiens、ＮＰ＿００３７５７）のアミノ酸残基２６７～２８４に対応する。このドメインは、ヒトＧＡＰＲ－１及びＨＩＶ－１ Ｎｅｆタンパク質結合ドメインを有すると記載されている。しかしながら、高効率でレンチウイルストランスダクションを促進することができる最適なＢｅｃｌｉｎ１ペプチド配列は評価されていない。そのために、多数のペプチドを設計した（図５Ａ）。これらのペプチドは、Ｂｅｃｌｉｎ１タンパク質をより広くカバーすることを可能にする。例えば、Ｔａｔ－Ｂｅｃ（２５０－２８２）（配列番号：８１）は、α１ヘリックス、Ｌ１ループ及びβ１シートを完全にカバーする（結晶構造に基づく、Huang et al. 2012）。一方、Ｔａｔ－Ｂｅｃ（２７４－２９８）（配列番号：８２）は、β１及びβ２シート並びにＬ２ループを完全にカバーする（図５Ａ）。レンチウイルストランスダクションアッセイにおいて、これらのＴＢ１誘導体全てを試験した。図５Ｂに示されているように、前記ペプチドは全て、レンチウイルストランスダクションを促進することができるが、その程度は異なる。２．５μMでは、Ｔａｔ－Ｂｅｃ（２７４－２９８）を除いて、誘導体のほとんどがＴＢ１よりもかなり効率的である。しかしながら、５μMでは、ペプチド配列がタンパク質のＣ末端側にシフトするほど、レンチウイルストランスダクションに対する有効性が低いように見える。Ｔａｔ－Ｂｅｃ（２６７－２９６）（配列番号：８３）を使用した用量反応実験は、非常に低用量（１μMまで）のこのペプチドが最適なレンチウイルストランスダクションを促進することができることを示している（図５Ｃ）。興味深いことに、２６７－２９６Ｂｅｃｌｉｎ１フラグメントの野生型配列を含有するペプチド（Ｔａｔ－Ｂｅｃ（２６７－２９６）ＷＴ）（配列番号：８０）は、レンチウイルストランスダクションを促進しているが、３つの改変Ｈ２７５Ｅ、Ｓ２７９Ｄ及びＱ２８１Ｅを含有するＴａｔ－Ｂｅｃ（２６７－２９６）ペプチドよりも非効率的である（図５Ｄ）。この結果は、Ｔａｔ－ＢｅｃＷＴ（配列番号：７７）を用いて得られたものを思い起こさせる（図４）。最後に、Ｔａｔ－Ｂｅｃ（２６７－２９６）ｄＧＧ（配列番号：７４）（ＧＧリンカーを削除したＴａｔ－Ｂｅｃ（２６７－２９６）のペプチド変異体）は、ウイルストランスダクションのレベルを約５倍増加させているが、これは、レンチウイルストランスダクションに対するペプチドのポジティブな効果の観察に関して、このリンカーが全く無関係であることを示唆している。要するに、これらのｂｅｃｌｉｎ１ドメイン変異体は、レンチウイルストランスダクションの促進に関して、ヒトＢｅｃｌｉｎ１配列におけるアミノ酸残基２７０～２８２をカバーする領域の非常に重要な役割を強調している。低用量（２．５μM）で最も高性能のペプチドはＴａｔ－Ｂｅｃ（２５０－２８２）であるが、これは、α１ヘリックス、Ｌ１ループ及びβ１シートドメインの重要な役割を示唆している。
【0106】
アデノ随伴ウイルスベクターに対するＴＢ１作用の評価
アデノ関連ベクター（ＡＡＶ）は、遺伝子治療アプローチのための最も頻繁に使用されるウイルスベクターである。異なる血清型の中でも、ＡＡＶ－８は臨床使用が成功しており、肝臓特異的遺伝子治療にかなり有望である(Nathwani et al, 2014)。したがって、ＡＡＶ８トランスダクション効率に対するＴＢ１の効果をin vitroで評価した。図６に示されているように、ＴＢ１は、リコンビナントＡＡＶ８の感染性を用量依存的に増強することができるが、Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄコントロールペプチドは効果を有しない。この結果は、ＴＢ１の作用が広範囲であり、エンベロープウイルスベクター及び非エンベロープウイルスベクターの両方に作用することを強調している。
アデノ関連ベクター（ＡＡＶ）は、遺伝子治療アプローチのための最も頻繁に使用されるウイルスベクターである。異なる血清型の中でも、ＡＡＶ－８は臨床使用が成功しており、肝臓特異的遺伝子治療にかなり有望である(Nathwani et al, 2014)。したがって、ＡＡＶ８トランスダクション効率に対するＴＢ１の効果をin vitroで評価した。図６に示されているように、ＴＢ１は、リコンビナントＡＡＶ８の感染性を用量依存的に増強することができるが、Ｔａｔ－Ｓｃｒａｍｂｌｅｄコントロールペプチドは効果を有しない。この結果は、ＴＢ１の作用が広範囲であり、エンベロープウイルスベクター及び非エンベロープウイルスベクターの両方に作用することを強調している。
【0107】
オートファジープロセスに対するＴＢ１最適用量の評価
ＴＢ１の作用機構をより良く理解するために、本発明者らは、レンチウイルストランスダクションの増加がオートファジープロセスの活性化の結果であるかを調査しようとした。単一細胞レベルでオートファジーをモニタリングするために、ｍＣｈｅｒｒｙ－ｅＧＦＰ－ＬＣ３融合タンパク質を発現するプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。次に、細胞をＴＢ１（５μM）又はＥＢＳＳ飢餓溶液と共にインキュベーションし、イメージングフローサイトメーターを用いて分析した。予想通り、ＥＢＳＳは、１細胞当たりのオートファゴリソソーム（ｍＣｈｅｒｒｙスポット）の数を増加させている（図７）。反対に、ＴＢ１処置ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるオートファゴリソソームの数は、ペプチドの非存在下（なし）におけるコントロール条件と同程度である。これらのデータは、ＴＢ１の存在下で観察されるレンチウイルストランスダクションの改善が確かに、オートファジーフラックスの誘導の結果ではないことを示唆している。
ＴＢ１の作用機構をより良く理解するために、本発明者らは、レンチウイルストランスダクションの増加がオートファジープロセスの活性化の結果であるかを調査しようとした。単一細胞レベルでオートファジーをモニタリングするために、ｍＣｈｅｒｒｙ－ｅＧＦＰ－ＬＣ３融合タンパク質を発現するプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクションした。次に、細胞をＴＢ１（５μM）又はＥＢＳＳ飢餓溶液と共にインキュベーションし、イメージングフローサイトメーターを用いて分析した。予想通り、ＥＢＳＳは、１細胞当たりのオートファゴリソソーム（ｍＣｈｅｒｒｙスポット）の数を増加させている（図７）。反対に、ＴＢ１処置ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるオートファゴリソソームの数は、ペプチドの非存在下（なし）におけるコントロール条件と同程度である。これらのデータは、ＴＢ１の存在下で観察されるレンチウイルストランスダクションの改善が確かに、オートファジーフラックスの誘導の結果ではないことを示唆している。
【0108】
Ｔａｔ－Ｂｅｃｌｉｎ２の設計及びレンチウイルストランスダクションに対するその評価
ヒトＢｅｃｌｉｎ１及びＢｅｃｌｉｎ２タンパク質の配列アラインメントは、ＥＣＤドメインにおける相同性を示している。したがって、本発明者らは、Ｔａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴペプチド（Ｔａｔ（４７－５７）トランスダクションペプチドとヒトＢｅｃｌｉｎ２ ＥＣＤ２４９－２６６ドメインとの融合物）を設計することを決定した（図８Ａ）。ＴＢ１は３つの突然変異（Ｈ２７５Ｅ、Ｓ２７９Ｄ及びＱ２８１Ｅ）を含有するので、Ｔａｔ（４７－５７）ペプチドと野生型ヒトＢｅｃｌｉｎ１ ＥＣＤ２６７－２８４ドメインとの融合物に相当するＴａｔ－ＢｅｃＷＴペプチドも設計し、配列アラインメントに示されている（図８Ａ）。広範囲の濃度にわたって、レンチウイルス産生を促進する能力について、これら３つのペプチドを試験した。図８Ｂに示されているように、前記ペプチドは全て、レンチウイルストランスダクションを効率的に促進することができるが、それらの最適用量（ＴＢ１の場合には３μM、Ｔａｔ－ＢｅｃＷＴの場合には１μM及びＴａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴの場合には５００nM）にはかなりの変動がある。１００nMのＴａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴのみがレンチウイルストランスダクションを３倍（１０から３０％に）増加させることができ（８Ｂ）、この濃度では、ＴＢ１及びＴａｔ－ＢｅｃＷＴは効果を有しない。Ｔａｔ－Ｓｃｒ２ＷＴ（Ｔａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴのスクランブルバージョン）は、レンチウイルストランスダクションを促進しているが、Ｔａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴに対する効果の程度の減少に相当する用量では、確かにＴａｔ依存的活性である。結論として、Ｔａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴは、非常に低用量で、レンチウイルストランスダクションの強力なエンハンサーである。
ヒトＢｅｃｌｉｎ１及びＢｅｃｌｉｎ２タンパク質の配列アラインメントは、ＥＣＤドメインにおける相同性を示している。したがって、本発明者らは、Ｔａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴペプチド（Ｔａｔ（４７－５７）トランスダクションペプチドとヒトＢｅｃｌｉｎ２ ＥＣＤ２４９－２６６ドメインとの融合物）を設計することを決定した（図８Ａ）。ＴＢ１は３つの突然変異（Ｈ２７５Ｅ、Ｓ２７９Ｄ及びＱ２８１Ｅ）を含有するので、Ｔａｔ（４７－５７）ペプチドと野生型ヒトＢｅｃｌｉｎ１ ＥＣＤ２６７－２８４ドメインとの融合物に相当するＴａｔ－ＢｅｃＷＴペプチドも設計し、配列アラインメントに示されている（図８Ａ）。広範囲の濃度にわたって、レンチウイルス産生を促進する能力について、これら３つのペプチドを試験した。図８Ｂに示されているように、前記ペプチドは全て、レンチウイルストランスダクションを効率的に促進することができるが、それらの最適用量（ＴＢ１の場合には３μM、Ｔａｔ－ＢｅｃＷＴの場合には１μM及びＴａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴの場合には５００nM）にはかなりの変動がある。１００nMのＴａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴのみがレンチウイルストランスダクションを３倍（１０から３０％に）増加させることができ（８Ｂ）、この濃度では、ＴＢ１及びＴａｔ－ＢｅｃＷＴは効果を有しない。Ｔａｔ－Ｓｃｒ２ＷＴ（Ｔａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴのスクランブルバージョン）は、レンチウイルストランスダクションを促進しているが、Ｔａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴに対する効果の程度の減少に相当する用量では、確かにＴａｔ依存的活性である。結論として、Ｔａｔ－Ｂｅｃ２ＷＴは、非常に低用量で、レンチウイルストランスダクションの強力なエンハンサーである。
【0109】
参考文献
【表3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】