7350851 グルカゴン由来ペプチド及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-15

(45)【発行日】2023-09-26

(54)【発明の名称】グルカゴン由来ペプチド及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/605 20060101AFI20230919BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20230919BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20230919BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20230919BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20230919BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20230919BHJP

   A61K 38/26 20060101ALI20230919BHJP

【ＦＩ】

C07K14/605 ZNA

A61P3/00

A61P3/04

A61P3/10

A61P3/06

A61P1/16

A61K38/26

【請求項の数】 19

(21)【出願番号】P 2021525711

(86)(22)【出願日】2019-11-12

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-18

(86)【国際出願番号】 CN2019117715

(87)【国際公開番号】W WO2020103729

(87)【国際公開日】2020-05-28

【審査請求日】2021-08-03

(31)【優先権主張番号】201811338218.2

(32)【優先日】2018-11-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】521201551

【氏名又は名称】天津薬物研究院有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＴＩＡＮＪＩＮ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ３０６ Ｈｕｉｒｅｎ Ｒｏａｄ， Ｂｉｎｈａｉ Ｎｅｗ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｔｉａｎｊｉｎ ３００４５１， ＣＨＩＮＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100197642

【弁理士】

【氏名又は名称】南瀬 透

(74)【代理人】

【識別番号】100099508

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 久

(74)【代理人】

【識別番号】100182567

【弁理士】

【氏名又は名称】遠坂 啓太

(74)【代理人】

【識別番号】100219483

【弁理士】

【氏名又は名称】宇野 智也

(72)【発明者】

【氏名】韓英梅

(72)【発明者】

【氏名】劉巍

(72)【発明者】

【氏名】劉冰▲ニー▼

(72)【発明者】

【氏名】孔維苓

(72)【発明者】

【氏名】趙娜夏

(72)【発明者】

【氏名】夏廣萍

(72)【発明者】

【氏名】商倩

(72)【発明者】

【氏名】孔曉華

(72)【発明者】

【氏名】▲ジン▼京

(72)【発明者】

【氏名】李玉▲チュエン▼

(72)【発明者】

【氏名】劉旭圓

【審査官】野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１８－５２１０４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／１８１４５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１９－５２０３１４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

一般式Ｉ
ＨＸ²ＱＧＴＦＴＳＤＸ¹⁰ＳＸ¹²ＹＬＸ¹⁵Ｘ¹⁶Ｘ¹⁷Ｘ¹⁸ＡＸ²⁰ＥＦＸ²³Ｘ²⁴ＷＬＸ²⁷Ｘ²⁸Ｘ²⁹Ｘ³⁰Ｘ³¹において、
Ｘ²はＡｉｂであり、
Ｘ¹⁰はＬｙｓ又はＴｙｒであり、
Ｘ¹²はＬｙｓ又はＡｒｇであり、
Ｘ¹⁵はＡｓｐ又はＧｌｕであり、
Ｘ¹⁶はＧｌｕであり、
Ｘ¹⁷はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｘ¹⁸はＬｙｓ、Ａｌａ又はＡｒｇであり、
Ｘ²⁰はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｘ²³はＶａｌ又はＩｌｅであり、
Ｘ²⁴はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり、
Ｘ²⁷は存在せず、
Ｘ²⁸はＧｌｕ又は存在せず、
Ｘ²⁹はＡｌａ又はＧｌｕであり、
Ｘ³⁰はＺであり、
Ｘ³¹は存在せず、
Ｘ²⁸がＧｌｕであるときＸ²⁹がＡｌａであり、Ｘ²⁸が存在せずのときＸ²⁹がＧｌｕであり、
ＺはフラグメントペプチドＧＧＰＳＳＧであり、
Ｃ末端カルボキシ基は遊離し又はアミド化され、
且つ、Ｘ¹⁰、Ｘ¹⁷、Ｘ²⁰及びＸ²⁴のうち１つのみが、側鎖が修飾されたＬｙｓである、
上記の一般式Ｉの配列で示されるポリペプチドを含むことを特徴とするポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項2】

一般式Ｉａ）
ＨＸ²ＱＧＴＦＴＳＤＸ¹⁰ＳＫＹＬＥＸ¹⁶Ｘ¹⁷Ｘ¹⁸ＡＸ²⁰ＥＦＸ²³Ｘ²⁴ＷＬＸ²⁷Ｘ²⁸Ｘ²⁹Ｘ³⁰において、
Ｘ²はＡｉｂであり、
Ｘ¹⁰はＴｙｒ又はＬｙｓであり、
Ｘ¹⁶はＧｌｕであり、
Ｘ¹⁷はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｘ¹⁸はＬｙｓ、Ａｌａ又はＡｒｇであり、
Ｘ²⁰はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｘ²³はＶａｌ又はＩｌｅであり、
Ｘ²⁴はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり、
Ｘ²⁷は存在せず、
Ｘ²⁸はＧｌｕであり、
Ｘ²⁹はＡｌａであり、
Ｘ³⁰はＺであり、ＺはフラグメントペプチドＧＧＰＳＳＧであり、
Ｘ¹⁰、Ｘ¹⁷、Ｘ²⁰及びＸ²⁴のうち１つのみが、側鎖が修飾されたＬｙｓであり、
Ｃ末端カルボキシ基は遊離し又はアミド化される、
上記の一般式Ｉａ）の配列で示されるポリペプチドを含む請求項１に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項3】

前記一般式Ｉａ）で、
Ｘ²はＡｉｂであり、
Ｘ¹⁶はＧｌｕであり、
Ｘ¹⁷はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｘ²⁰はＬｙｓであり、
Ｘ²⁷は存在せず、
Ｘ²⁸はＧｌｕであり、
Ｘ³⁰はＺであり、
Ｘ¹⁰及びＸ²⁰のうち１つのみが、側鎖が修飾されたＬｙｓであることを特徴とする請求項２に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項4】

前記一般式Ｉａ）は、
Ｘ¹⁷はＡｒｇで且つＸ¹⁸はＡｌａである、
Ｘ¹⁷はＡｒｇで且つＸ¹⁸はＬｙｓである、又は
Ｘ¹⁷はＬｙｓで且つＸ¹⁸はＡｒｇである、
上記のアミノ酸配列の組み合わせを含むことを特徴とする請求項２又は３に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項5】

前記一般式Ｉａ）は、
Ｘ²³はＶａｌで且つＸ²⁴はＡｌａもしくはＧｌｕである、又は
Ｘ²³はＩｌｅで且つＸ²⁴はＡｌａもしくはＧｌｕである、
上記のアミノ酸配列の組み合わせを含むことを特徴とする請求項２～４のいずれか１項に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項6】

前記一般式Ｉで、
Ｘ²はＡｉｂであり、
Ｘ¹⁶はＧｌｕであり、
Ｘ¹⁷はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｘ²⁷は存在せず、
Ｘ²⁸は存在せず、
Ｘ²⁹はＧｌｕであり、
Ｘ³⁰はＺであり、
Ｘ³¹は存在せず、
Ｘ¹⁰及びＸ²⁰のうち１つのみが、側鎖が修飾されたＬｙｓであることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項7】

前記一般式Ｉは、
Ｘ¹⁷はＡｒｇで且つＸ¹⁸はＡｌａである、
Ｘ¹⁷はＡｒｇで且つＸ¹⁸はＬｙｓである、又は
Ｘ¹⁷はＬｙｓで且つＸ¹⁸はＡｒｇである、
上記のアミノ酸配列の組み合わせを含むことを特徴とする請求項６に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項8】

前記一般式Ｉは、
Ｘ²³はＶａｌで且つＸ²⁴はＡｌａもしくはＧｌｕである、又は
Ｘ²³はＩｌｅで且つＸ²⁴はＡｌａもしくはＧｌｕである、
上記のアミノ酸配列の組み合わせを含むことを特徴とする請求項６又は７に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項9】

Ｘ²⁰が、側鎖が修飾されたＬｙｓである場合に、Ｘ¹⁰はＴｙｒであることを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項10】

前記側鎖が修飾されたＬｙｓとは、前記Ｌｙｓの側鎖ε－アミノ基に親水性リンカーを介して脂肪酸がカップリングされて修飾されることであることを特徴とする請求項１～９のいずれか１項に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項11】

前記親水性リンカーは、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌｙ及びＡｄｏ（８－アミノ－３，６ジオキシオクタン酸）のうちの１つ以上によって構成されたフラグメントから選ばれることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項12】

前記親水性リンカーは、γＧｌｕ－γＧｌｕ－、Ｇｌｕ－γＧｌｕ－、Ｇｌｕ－γＧｌｕ－、γＧｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、γＧｌｕ－Ｇｌｙ－γＧｌｕ－、γＧｌｕ－Ａｄｏ－Ａｄｏ－、Ａｄｏ－Ａｄｏ－γＧｌｕ－、又はγＧｌｕ－Ａｄｏ－Ａｄｏ－γＧｌｕ－であることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項13】

前記脂肪酸はＣ_14~20脂肪酸であることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項14】

前記脂肪酸はＣ_16~20脂肪族ジカルボン酸であることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項15】

前記ポリペプチドの配列は配列番号４～２７のいずれか１つである請求項１に記載のポリペプチド誘導体又はその塩。

【請求項16】

請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチド誘導体又はその塩と、任意選択で薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項17】

代謝性疾患の治療薬を製造するための請求項１～１５のいずれか１項に記載のポリペプチド誘導体又はその塩の使用。

【請求項18】

前記代謝性疾患は糖尿病、肥満、脂肪肝、高脂血症及び／又はメタボリックシンドロームである請求項１７に記載のポリペプチド誘導体又はその塩の使用。

【請求項19】

前記脂肪肝は非アルコール性脂肪性肝疾患である請求項１８に記載のポリペプチド誘導体又はその塩の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、製薬及びバイオテクノロジーの分野に属し、具体的には、グルカゴン由来ペプチド及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

肥満は様々な疾患を引き起こす危険因子で、世界的な公衆衛生上の問題となっている。特に、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）をはじめとするメタボリックシンドローム、心血管疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患などの一般的な疾患で、発生率と疾患の進行は肥満と密接に関係している。正常体重の集団と比べて、心血管疾患と複数の代謝性疾患の発生率がＢＭＩ２５．０～２９．９ｋｇ／ｍ²、３０．０～３４．９ｋｇ／ｍ²及びＢＭＩ＞３５．０ｋｇ／ｍ²の体重過多、肥満又は重度肥満の集団でそれぞれ２倍、５倍、１５倍高いことが複数の大規模な臨床研究から判明した（Ｌａｎｃｅｔ ２，ｅ２７７－ｅ２８５，２０１７）。また、Ｔ２ＤＭ患者の８０～９０％が体重過多又は肥満であることが研究から判明し、適度の減量（４～５ｋｇ）は疾患の予防及び緩和につながり、例えば、罹患率低減、血糖値や障害発生率（致死率）の管理である（Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｏｐｉｎ．２０１１，２７（７），１４３１－１４３８）。

【0003】

食事制限、運動は体重を減らすために最も理想的な手段とされるものの、満足のいく効果が得られないことも多い。薬物を用いる肥満治療は効果が限定的でしかも様々なリスクがあり、例えば、心血管系に対する重度な影響や中枢神経系の作用で生じる精神障害などの副作用である。これまでに、５～１０％を超える体重減少を単一の薬物で達成する例はまれである。Ｔ２ＤＭ治療薬のうち体重管理に効果的なのはＳＧＬＴ２阻害薬、ＧＬＰ－１受容体アゴニストだけである。減量手術の効果が明らかであるが、手術のリスクが大きく、長期的な効果に疑問がある。これに鑑みて、臨床上、体重管理薬物の需要がまだ大きく、原発性疾患の治療効果を持ち合わせ安全でかつ効果的な体重管理を実現できる薬物は理想的な選択肢である。

【0004】

血糖・エネルギー調節信号システムはペプチドホルモンなどの様々な因子によって保たれる精密なバランスである。プログルカゴン（ｐｒｏ－ｇｌｕｃａｇｏｎ）は１５８のアミノ酸を有する前駆体ポリペプチドで、様々な組織で加工されてグルカゴン（ＧＣ）、グルカゴン様ペプチド－１、２（ＧＬＰ－１、２）やオキシントモジュリンなどの様々なプログルカゴン由来ペプチドが生成され、これらのホルモンが体内のグルコースバランス、インスリン分泌、胃内容排出、腸の成長や食物摂取などの様々な生理学的機能の調節に関与する。したがって、プログルカゴンに基づく腸ホルモンでの治療は、代謝性疾患分野で関心を集めており研究の方向性となっている。

【0005】

ＧＣはプログルカゴンの３３～６１位のアミノ酸によって構成された２９のアミノ酸を含む誘導ペプチドで、膵α細胞での加工で生成され、飢餓や冷え込みなどのストレス状態下で肝臓に作用し、糖分解と糖新生により血糖レベルを正常な範囲に保つ。血糖レベル
を上げる効果の他にも、動物又はヒト試験結果によりＧＣが熱生成、満腹感、脂肪分解、脂肪酸化、ケトン体生成などの役割を有し、長期投与すると、体重が減少するなどエネルギー代謝を改善させることが判明されたが、これらのエネルギー代謝に有益な効果はその固有の血糖増加作用のため利用されていない。

【0006】

ＧＬＰ－１はプログルカゴンの７２～１０８位のアミノ酸によって構成された３７のアミノ酸残基を含む誘導ペプチドで、摂食後に腸のＬ細胞によって分泌され、膵β細胞に作用してインスリン分泌を促すとともに、ＧＣ受容体に拮抗して血糖増加を抑える。ＧＬＰ－１受容体アゴニストは糖尿病患者用の高血糖治療薬として開発され、血糖降下と同時に膵島細胞を保護及び増殖させ、胃内容排出を遅らせ食物摂取を抑えることにより、体重を効果的に減らすことができる。現在、市場で販売されているＧＬＰ－１受容体アゴニストは７種で、短時間作用型のエキセナチド、リラグルチド、リキシセナチド（１～２回／日）、長時間作用型のアルビグルチド、デュラグルチド、Ｂｙｕｄｅｒｏｎ、セマグルチド（１回／週）である。ＧＬＰ－１受容体作動薬は安全で独特な血糖降下効果があるものの、体重を減らすために用いる場合には一般に大用量が必要で、しかも大用量下でこれらの薬物は胃腸に副作用があり、忍容性が悪く、治療ウィンドウが狭い。したがって、忍容性が高められ、効果的に血糖を制御し体重を減らせる治療薬が必要である。

【0007】

オキシントモジュリン（Ｏｘｙｎｔｏｍｏｄｕｌｉｎ、略称ＯＸＭ）はプログルカゴンの翻訳後の修飾加工段階で腸で生成されたホルモンで、摂食に応じて回腸のＬ細胞によってＧＬＰ－１などのホルモンと一緒に分泌される。ＯＸＭの急性効果は胃内容排出、胃及び膵臓の外分泌、食物摂取阻害、安静時のエネルギー消費などを含み、体重を減らす効果がある。ＯＸＭの特異的な受容体はまだ判明されないが、ＯＸＭは内因性ＧＣＧＲ／ＧＬＰ－１Ｒデュアルアゴニストで、両方の受容体に対する活性は各受容体の天然リガンドより弱いということが研究から明かになった。動物又はヒト試験により、ＯＸＭの末梢投与は食物摂取量を低減させ体重を減らし、肥満対象での代謝率、特に運動関連のエネルギー消費を増やすことが判明されている。特に、ＯＸＭの大用量末梢投与臨床試験では、体重減少の一方、吐き気、嘔吐などの一般的な胃腸副作用の発生率が比較的低かった。したがって、ＯＸＭ又はＧＬＰ－１／ＧＣＧＲデュアルアゴニストに基づく治療は肥満や肥満型糖尿病に潜在的な価値があるにもかかわらずまだ市販の関連薬物が見当たらない現状である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【文献】中国特許出願第ＣＮ２００９８０１３２５６２．９号

【文献】中国特許出願第ＣＮ２０１０８００２７０２６．５号

【文献】中国特許出願第ＣＮ２０１６８００６２１９６．４号

【文献】中国特許出願第ＣＮ２０１６８００３６７７１．３号

【非特許文献】

【0009】

【文献】Ｌａｎｃｅｔ ２，ｅ２７７－ｅ２８５，２０１７

【文献】Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｏｐｉｎ．２０１１，２７（７），１４３１－１４３８

【文献】Ａｎｄｒｅａｓ Ｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１７，６０，４２９３－４３０３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の１つの目的は、グルカゴンのポリペプチド誘導体を提供することである。前記ポリペプチドはＧＣの天然配列に基づいて設計された変異体で、ＧＣ／ＧＬＰ－１受容体に対する二重の作動効果でエネルギー代謝に相乗効果を与え、効果的に血糖を降下させ体重を減らし、体内の脂肪レベルを改善させることができ、単独のＧＬＰ－１受容体アゴニストに比べて、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、非アルコール性脂肪性肝疾患などの症状改善にもっと有益である。

【0011】

本発明のもう一つの目的は、本発明のグルカゴンのポリペプチド誘導体を含む医薬組成物を提供することである。

【0012】

本発明のもう一つの目的は、本発明のグルカゴンのポリペプチド誘導体の用途を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明の目的は次の技術的解決手段によって達成される。

【0014】

本発明の第１態様では、
一般式Ｉ
ＨＸ²ＱＧＴＦＴＳＤＸ¹⁰ＳＸ¹²ＹＬＸ¹⁵Ｘ¹⁶Ｘ¹⁷Ｘ¹⁸ＡＸ²⁰ＥＦＸ²³Ｘ²⁴ＷＬＸ²⁷Ｘ²⁸Ｘ²⁹Ｘ³⁰Ｘ³¹において、
Ｘ²はＳｅｒ、Ｄ－Ｓｅｒ又はＡｉｂであり、
Ｘ¹⁰はＬｙｓ又はＴｙｒであり、
Ｘ¹²はＬｙｓ又はＡｒｇであり、
Ｘ¹⁵はＡｓｐ又はＧｌｕであり、
Ｘ¹⁶はＳｅｒ又はＧｌｕであり、
Ｘ¹⁷はＡｒｇ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり、
Ｘ¹⁸はＬｙｓ、Ａｌａ又はＡｒｇであり、
Ｘ²⁰はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｘ²³はＶａｌ又はＩｌｅであり、
Ｘ²⁴はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり、
Ｘ²⁷はＬｅｕ、Ｖａｌであり又は存在せず、
Ｘ²⁸はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｚであり又は存在せず、
Ｘ²⁹はＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ｚであり、
Ｘ³⁰はＧｌｕ、Ｚであり、
Ｘ³¹はＺであり又は存在せず、
ＺはフラグメントペプチドＧＧＰＳＳＧであり、Ｘ²⁸、Ｘ²⁹、Ｘ³⁰及びＸ³¹のうち１つのみがＺであり、Ｃ末端カルボキシ基は遊離又はアミド化され、
且つ、Ｘ¹⁰、Ｘ¹⁷、Ｘ²⁰及びＸ²⁴のうち１つのみが、側鎖が修飾されたＬｙｓである、
上記の一般式Ｉの配列で示されるポリペプチドを含むポリペプチド誘導体、その修飾誘導体又はその塩を提供する。

【0015】

さらに、本発明は、
一般式Ｉａ）
ＨＸ²ＱＧＴＦＴＳＤＸ¹⁰ＳＫＹＬＥＸ¹⁶Ｘ¹⁷Ｘ¹⁸ＡＸ²⁰ＥＦＸ²³Ｘ²⁴ＷＬＸ²⁷Ｘ²⁸Ｘ²⁹Ｘ³⁰において、
Ｘ²はＳｅｒ又はＡｉｂであり、
Ｘ¹⁰はＴｙｒ又はＬｙｓであり、
Ｘ¹⁶はＳｅｒ又はＧｌｕであり、
Ｘ¹⁷はＡｒｇ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり、
Ｘ¹⁸はＬｙｓ、Ａｌａ又はＡｒｇであり、
Ｘ²⁰はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｘ²³はＶａｌ又はＩｌｅであり、
Ｘ²⁴はＡｌａ、Ｇｌｕ又はＬｙｓであり、
Ｘ²⁷はＬｅｕであり又は存在せず、
Ｘ²⁸はＧｌｕであり又は存在せず、
Ｘ²⁹はＡｌａであり、
Ｘ³⁰はＺであり、ＺはフラグメントペプチドＧＧＰＳＳＧであり、
Ｘ¹⁰、Ｘ¹⁷、Ｘ²⁰及びＸ²⁴のうち１つのみが、側鎖が修飾されたＬｙｓであり、
Ｃ末端カルボキシ基は遊離し又はアミド化される、
上記の一般式Ｉａ）の配列で示されるポリペプチドを含むポリペプチド誘導体、その修飾誘導体又はその塩を提供する。

【0016】

本発明の好ましい実施形態では、前記一般式Ｉａ）で、
Ｘ²はＡｉｂであり、
Ｘ¹⁰はＬｙｓ又はＴｙｒであり、
Ｘ¹⁶はＧｌｕであり、
Ｘ¹⁷はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｘ¹⁸はＡｌａ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、
Ｘ²⁰はＬｙｓであり、
Ｘ²⁷は存在せず、
Ｘ²⁸はＧｌｕであり、
Ｘ²⁹はＡｌａであり、
Ｘ³⁰はＺであり、
Ｘ¹⁰及びＸ²⁰のうち１つのみが、側鎖が修飾されたＬｙｓであり、
Ｃ末端カルボキシ基は遊離し又はアミド化される。

【0017】

いくつかの好ましい実施形態では、前記一般式Ｉａ）は、
Ｘ¹⁷はＡｒｇで且つＸ¹⁸はＡｌａである、
Ｘ¹⁷はＡｒｇで且つＸ¹⁸はＬｙｓである、又は
Ｘ¹⁷はＬｙｓで且つＸ¹⁸はＡｒｇである、
上記のアミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0018】

好ましい実施形態では、前記一般式Ｉａ）は、
Ｘ²³はＶａｌで且つＸ²⁴はＡｌａもしくはＧｌｕである、又は
Ｘ²³はＩｌｅで且つＸ²⁴はＡｌａもしくはＧｌｕである、
上記のアミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0019】

本発明の好ましい実施形態で、前記ポリペプチド誘導体は、配列番号４～１５から選ばれたいずれかの配列を有するポリペプチドを含む。

【0020】

本発明のまたいくつかの好ましい実施形態では、
前記一般式Ｉで、
Ｘ²はＡｉｂであり、
Ｘ¹⁰はＬｙｓ又はＴｙｒであり、
Ｘ¹⁶はＧｌｕであり、
Ｘ¹⁷はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｘ¹⁸はＡｌａ、Ｌｙｓ又はＡｒｇであり、
Ｘ²⁰はＡｒｇ又はＬｙｓであり、
Ｘ²⁷は存在せず、
Ｘ²⁸は存在せず、
Ｘ²⁹はＧｌｕであり、
Ｘ³⁰はＺであり、
Ｘ³¹は存在せず、
Ｘ¹⁰及びＸ²⁰のうち１つのみが、側鎖が修飾されたＬｙｓであり、
Ｃ末端カルボキシ基は遊離し又はアミド化される、
上記の一般式Ｉの構造を有するポリペプチドを提供する。

【0021】

本発明の好ましい実施形態で、前記一般式Ｉは、
Ｘ¹⁷はＡｒｇで且つＸ¹⁸はＡｌａである、
Ｘ¹⁷はＡｒｇで且つＸ¹⁸はＬｙｓである、又は
Ｘ¹⁷はＬｙｓで且つＸ¹⁸はＡｒｇである、
上記のアミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0022】

本発明のより好ましい実施形態で、前記一般式Ｉは、
Ｘ²³はＶａｌで且つＸ²⁴はＡｌａもしくはＧｌｕである、又は
Ｘ²³はＩｌｅで且つＸ²⁴はＡｌａもしくはＧｌｕである、
上記のアミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0023】

本発明の好ましい実施形態で、前記ポリペプチド誘導体は、配列番号１６～２７から選ばれたいずれかの配列を有するポリペプチドを含む。

【0024】

本発明の好ましい実施形態で、前記ポリペプチド誘導体は、Ｘ²⁰が、側鎖が修飾されたＬｙｓである場合、Ｘ¹⁰はＴｙｒであることを特徴とする。

【0025】

本発明のいくつかの実施形態で、前記側鎖が修飾されたＬｙｓとは、前記Ｌｙｓの側鎖ε－アミノ基に親水性リンカーを介して脂肪酸がカップリングされて修飾されることである。

【0026】

好ましくは、前記Ｌｙｓの側鎖ε－アミノ基を修飾する親水性リンカーは、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌｙ及びＡｄｏ（８－アミノ－３，６ジオキシオクタン酸）のうちの１つ以上によって構成されたフラグメントから選ばれ、好ましくはγＧｌｕ－γＧｌｕ－、Ｇｌｕ－γＧｌｕ－、Ｇｌｕ－γＧｌｕ－、γＧｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、γＧｌｕ－Ｇｌｙ－γＧｌｕ－、γＧｌｕ－Ａｄｏ－Ａｄｏ－、Ａｄｏ－Ａｄｏ－γＧｌｕ－、又はγＧｌｕ－Ａｄｏ－Ａｄｏ－γＧｌｕ－である。

【0027】

本発明の好ましい実施形態において、前記の脂肪酸はＣ１４～２０脂肪酸であり、より好ましくはＣ１６～２０脂肪族ジカルボン酸である。

【0028】

本発明の第２態様は、本発明に記載のポリペプチド誘導体、その修飾誘導体又はその塩を含む医薬組成物を提供することである。

【0029】

好ましくは、前記医薬組成物は薬学的に許容される１種以上の賦形剤をさらに含む。前記薬学的に許容される賦形剤は担体、希釈剤、水溶性充填剤、ｐＨ調整剤、安定剤、注射用水、浸透圧調整剤などを含む。

【0030】

好ましくは、前記水溶性充填剤はマンニトール、低分子デキストラン、ソルビトール、ポリエチレングリコール、グルコース、ラクトース、ガラクトースなどを含むが、但しこれらに限定されず、前記ｐＨ調整剤はクエン酸、リン酸、乳酸、酒石酸、塩酸などの有機酸又は無機酸及び水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム塩などの生理的に許容される無機塩基又は塩を含むが、但しこれらに限定されず、前記安定剤はＥＤＴＡ－２Ｎａ、チオ硫酸ナトリウム、二亜硫酸二ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、アルギニン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシ／ヒドロキシセルロース又はその誘導体（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ－ＳＬ、ＨＰＣ－Ｌ、ＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、ドデシル硫酸ナトリウム又はトリスヒドロキシメチルアミノメタンなどを含むが、これらに限定されず、前記浸透圧調整剤は塩化ナトリウム、塩化カリウムを含むが、これらに限定されるのではない。

【0031】

好ましくは、本発明に記載の医薬組成物は静脈内、筋肉内又は皮下注射されてもよいし、経口、経直腸又は経鼻投与されてもよい。用量範囲は５μｇ～１０ｍｇ／回で、治療対象、投与方法、適応症、他の要因によって決まる。

【0032】

本発明の第３態様は、代謝性疾患の治療薬を製造するための、本発明に記載のポリペプチド誘導体、その修飾誘導体又はその塩の用途を提供することであって、好ましくは、前記の代謝性疾患は糖尿病、肥満、脂肪肝、高脂血症及び／又はメタボリックシンドロームであり、より好ましくは、前記脂肪肝は非アルコール性脂肪性肝疾患である。

【0033】

本発明の第４態様は、治療を必要とする患者に本発明に記載のポリペプチド誘導体、その修飾誘導体又はその塩を投与するステップを含む代謝性疾患の治療方法を提供することであって、好ましくは、前記の代謝性疾患は糖尿病、肥満、脂肪肝、高脂血症及び／又はメタボリックシンドロームであり、より好ましくは、前記脂肪肝は非アルコール性脂肪性肝疾患である。

【発明の効果】

【0034】

単独のＧＬＰ－１受容体アゴニストと比べて、本発明のポリペプチド誘導体はより効果的に血糖を降下させ、体重減量を促進し、また体重増加を防ぎ、インスリン抵抗性を逆転させる効果があって、従来の薬物には予期されない有益な効果がある。

【0035】

グルカゴン由来ペプチドの構造：内因性ＧＬＰ－１はプログルカゴンの７２～１０８位のアミノ酸によって構成された３０～３１のアミノ酸残基（７～３６／３７）を含む誘導ペプチドで、そのアミノ酸配列はＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲ（７～３６）（配列番号１）、ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（７～３７）で、そのＣ末端は遊離し又はアミド化される。内因性ＧＣはプログルカゴンの３３～６１位のアミノ酸によって構成された２９のアミノ酸を含む誘導ペプチドで、そのアミノ酸配列はＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号２）で、Ｃ末端カルボキシ基は遊離する。天然ＧＬＰ－１とＧＣとのアミノ酸配列に４７％の相同性があり（Ａｎｄｒｅａｓ Ｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１７，６０，４２９３－４３０３）、両者のＮ末端配列は高度に保存的であり、ＧＬＰ－１はその受容体に対して選択性が高く、ＧＣはＧＬＰ－１受容体の弱いアゴニストでもある。したがって、ＧＣ配列に基づくＧＬＰ－１／ＧＣＧＲデュアルアゴニストの設計は可能である。

【0036】

ＯＸＭのアミノ酸配列はＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号３）で、ＧＣの原配列（１～２９）及びプログルカゴンのアミノ酸配列８２～８９に対応するインサートペプチド－１（ＩＰ－１、３０～３７）を含む。ＯＸＭがＧＣ／ＧＬＰ－１Ｒに二重の作動活性があることから、ＧＣ配列のＣ末端配列の調整がＧＣ／ＧＬＰ－１Ｒの力価のバランスを実現するために役立つと示唆される。中国特許出願第ＣＮ２００９８０１３２５６２．９号、第ＣＮ２０１０８００２７０２６．５号、第ＣＮ２０１６８００６２１９６．４号などの公開特許技術文献は、ＧＣの原配列（１～２９）の変異体に対して、エキセンディン－４のＣ末端の１０アミノ酸ペプチド（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ、Ｃｅｘと略す）の配列でＣ末端を伸長させたものである。中国特許出願第ＣＮ２０１６８００３６７７１．３号はＯＸＭ配列のＣ末端のインサートペプチドセグメント（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）をペプチドセグメントＧＧＰＳＳＧに置き換えるという設計である。これらの従来技術ではいずれもＧＣ完全長配列（１～２９）を保持させつつ複数の部位突然変異を加え、そして異なるペプチドセグメントで伸長させるという設計である。

【0037】

ＧＣ配列に基づくポリペプチドのＣ末端変化はＧＣ／ＧＬＰ－１受容体の認識に、特にＧＣ受容体の活性に高度に敏感である。したがって、ＧＣ配列のＣ末端の保持がＧＣ受容体の作動活性の保持に特に重要であるということは一般的に受け入れられている。従来技術は一般にＧＣ完全長配列（１～２９）を保持させつつ個別の部位突然変異を加えたもので、当該分野で周知された合理的な置換規則が適用される。例えば、２１位のＡｓｐをＧｌｕに置き換え、２４位のＧｌｎを保持させ又はＧｌｕに置き換え、Ｃ末端の２７～２９位のフラグメントにおける敏感なアミノ酸、例えば２７位のＭｅｔをＬｅｕに、２８位のＡｓｎをＧｌｕ又はＡｌａに置き換える。本発明者が研究したところ、これらの保存的な方法を用いた上で、Ｃ末端を伸長させ脂肪アシル化修飾を行っても、力価にバランスがとれたＧＣ／ＧＬＰ－１受容体に対する二重の受容体アゴニストを得ることが予想しにくい、ということが判明した。また、これらの手段がポリペプチドの疎水性の改善につながらず、特に長鎖脂肪アシル化修飾を入れる場合、合成の難度が減らせないだけでなく、コストが増え、最終の生成物の溶解性が悪いため、製剤の実施可能性に影響がある。

【0038】

本発明に係る技術的解決手段は従来と違い、ポリペプチド主鎖の設計においてはＧＣ配列の１～２６位のペプチドセグメントだけが保持され、個別の部位に合理的な変異を加えた上でＣ末端を適切に伸長させ、後に脂肪アシル化修飾を行って、活性対力価比のバランスがとれた、溶解性及び安定性がともに優れたＧＣ／ＧＬＰ－１受容体に対する二重の受容体アゴニストを得た。

【0039】

本発明のいくつかの特定の実施形態では、ＧＣ（１～２６）配列の１６～２０位に合理的な置換を行い、例えば、１６位のＳｅｒをＧｌｕに、１８位のＡｒｇをＡｌａ又はＬｙｓに、２０位のＧｌｎをＬｙｓに置き換えており、本分野ではこれらがＧＬＰ－１受容体の選択性向上に役立つ設計処置として周知されている。また、いくつかの特定の実施形態では、該当するペプチドセグメントの電荷分布を調整するために２４位のＧｌｎがＧｌｕに置き換えられる。これまでに公開された技術的解決手段では、一般的にＧＣ配列の２７位のＭｅｔを中性電荷又は正電荷のアミノ酸、例えばＬｅｕやＬｙｓで置換するが、本発明の好ましい技術的解決手段に係るポリペプチド配列の対応する部位はＧｌｕ残基で、その上Ａｌａを挿入、あるいは直接親水性アミノ酸残基を含むペプチドセグメント（ＧＧＰＳＳＧ）でＣ末端を伸長して主鎖配列を得る。例えば、実施例１の化合物１、２、化合物４～７、化合物１０～１５、化合物２１、２２、化合物２７～３９及び化合物４１～８１の主鎖配列である。

【0040】

脂肪アシル化修飾は本技術分野で周知されたポリペプチドの長時間作用化技術である。本発明の実施形態では、活性ペプチド配列の特定の部位のＬｙｓ側鎖に親水性スペーサーを介して脂肪アシル基が修飾されている。いくつかの実施形態では、前記リシン残基は１０位に位置し、いくつかの実施形態では、修飾部位は２０位である。修飾後のポリペプチドの溶解性の改善及びポリペプチド構造の柔軟性保持のため、親水性スペーサーでポリペプチドと脂肪アシル化修飾基を接続させる必要がある。本発明のいくつかの実施形態では前記親水性スペーサーは－γ－Ｇｌｕ－γ－Ｇｌｕ－で、いくつかの実施形態では－γ－Ｇｌｕ－Ａｄｏ－Ａｄｏ－γ－Ｇｌｕで、またいくつかの実施形態では－Ａｄｏ－Ａｄｏ－γ－Ｇｌｕである。前記脂肪アシル基はＣ１６～２０のモノ脂肪酸又は脂肪族ジカルボン酸であることが好ましい。いくつかの実施形態において、前記脂肪アシル基はＣ１６又はＣ１８のアシル基で、いくつかの特定の実施形態ではＣ１８、Ｃ２０のジカルボン酸モノエステルアシル基である。

【0041】

一般に、相同性を保持させるためには天然配列をなるべく変えない方が有利であるが、内因性プログルカゴン配列は製薬上、次のいくつかの難点がある。Ｎ末端のジペプチドが体内のジペプチドキニンにより識別され、加水分解で不活性となるため、血中濃度半減期が１２分間以下に短縮される。物理的特性が不安定で、等電点（ｐＩ）７．６の中性であり、しかも疎水性と溶解性が悪いため、溶液で凝集して沈殿しやすい。配列にＭｅｔ、Ａｓｐ、Ａｓｎなどの酸化又はラセミ化されやすいアミノ酸があるため、化学的性質が不安定となる。

【0042】

本発明の好ましい実施形態において、前記ポリペプチドの代謝安定性を高めるために、２位のＳｅｒを一般にＡｉｂ又はＤ－Ｓｅｒに置換して、ポリペプチドの活性の持続的な発揮を保証した。また本発明の好ましい実施形態では、さらにＧＣ配列中の敏感なアミノ酸が置換された。例えば１５位、２１位のＡｓｐがＧｌｕに置き換えられ、調整後のＣ末端のペプチドセグメントにＭｅｔ、Ｇｌｎ、Ａｓｎなどの敏感なアミノ酸残基が含まれないため、化学的安定性が大幅に向上される。前記の調整及び改良手段は活性のバランス、物理的及び化学的特性の改善に複数の有益な効果をもたらしており、従来技術より優れた効果が得られる。

【0043】

本発明で提供されるＧＬＰ－１／グルカゴンに二重の作動効果を有するペプチドは、本発明に記載の構造設計により、活性的に以下の特徴が得られる。本発明に係るポリペプチドはＧＬＰ－１／ＧＣＧＲの各受容体の天然リガンドと比べて少なくとも１％の受容体作動活性を有する。複数の構造の最適化設計により、ＧＬＰ－１受容体に対する作動作用強度が内因性天然リガンドＧＬＰ－１（７～３６／３７）と同等、又は天然リガンドの１５０％、２００％、３００％、５００％もしくは１０００％以上になる。グルカゴン受容体に対する作動活性は内因性リガンド（ＧＣ）と同等、又は内因性アゴニストの作用強度の１０～１０００％に相当する。いくつかの実施形態では、本発明に係るポリペプチドは内因性リガンドと同等で又はより高い受容体作動活性を有する。またいくつかの実施形態では、グルカゴン受容体よりもＧＬＰ－１受容体に対する作動作用が強く、又は両方の受容体に対する作動作用の強度が等しい。ＧＬＰ－１とグルカゴン受容体に対する活性強度は力価比で示されてもよく、即ち本発明に係る一般式Ｉの配列を含むポリペプチドのＧＬＰ－１／グルカゴン受容体に対する力価比は１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、３：１又は１：１～１：１０であるが、これらに限定されるのではない。

【0044】

本発明に係る一般式Ｉの構造を有するポリペプチド誘導体の基本的なペプチド鎖は本分野で周知された方法で得られる。
１）従来の固相法又は液相法によって段階的又は断片組み立により合成できる。
２）宿主細胞においてポリペプチドをコードする核酸構築物を発現させ、宿主細胞の培養物から発現産物を回収する。
３）ポリペプチドをコードする核酸構築物の無細胞インビトロ発現に影響を与え、発現産物を回収する。
あるいは、方法１）、２）又は３）の任意の組み合わせでペプチドフラグメントを得、その後、これらのフラグメントを接続させて目的ペプチドを得る。

【0045】

本発明に係る実施形態で、Ｆｍｏｃ固相合成方法を用いて目的ペプチドを合成することが好ましく、当該技術は当業者に周知されている。

【0046】

置換基は前記ペプチド合成ステップで段階的に導入されてもよい。適切な保護置換基、例えば、Ｆｍｏｃ－８－アミノ－３，６ジオキサオクタン酸、又はＦｍｏｃ－γ－Ｇｌｕ－ＯｔＢｕを用いる。脂肪鎖部分の導入で、特に脂肪族ジカルボン酸モノエステルアシル基の導入は、非限定的に、例えばＣ１８、Ｃ２０アルカン酸モノ－ｔ－ブチルエステルで実現してもよい。各カップリングステップ後に、過剰の無水酢酸とピリジンで未反応の中間体をブロックさせてもよい。修飾可能なＬｙｓのε－アミノ基はＭｔｔ又はＤｄｅで保護してもよい。

【0047】

精製：抱合反応後に、本分野で周知された適切な方法で目的生成物を分離してもよい。適切な方法は限外濾過、透析、クロマトグラフィーなどを含むが、これらに限定されるのではない。本発明の実施形態では、分取高速液体クロマトグラフィーで精製することが好ましい。

【0048】

受容体活性測定：本発明の実施形態ではＧＬＰ－１／ＧＣ受容体に媒介されるインビトロｃＡＭＰ発生に対する影響によって、ＧＬＰ－１／ＧＣ受容体に対する前記ポリペプチドの作用を評価する。

【0049】

体重及び血糖に対する調節効果：本発明の実施形態では高脂肪食肥満型糖尿病マウス（ＤＩＯ）モデルを用いて本発明のポリペプチドの体重及び血糖に対する影響を評価した。その結果、本発明に係るポリペプチド誘導体は有意な体重減少と血糖降下の効果を示し、体重減少効果が陽性対照薬より有意に優れていることから、肥満などの代謝性疾患の緩和と糖尿病の治療薬開発で潜在的な利点があることが示唆された。

【図面の簡単な説明】

【0050】

次に、図面を参照して本発明の実施形態を詳細に説明する。

【図1】図１は実施例３の化合物１、４、６、２２のＤＩＯマウスの体重に対する影響で、図中のサンプル番号１～４番はそれぞれ化合物１、化合物４、化合物６及び化合物２２である。

【発明を実施するための形態】

【0051】

次に、具体的な実施例を用いて本発明を一層説明する。これらの実施例は本発明を解釈するためのものに過ぎず、何らかの形で本発明の内容を限定するものではない。

【0052】

アミノ酸略号：
Ｇｌｙ：グリシン（Ｇ）
Ａｌａ：アラニン（Ａ）
Ｖａｌ：バリン（Ｖ）
Ｌｅｕ：ロイシン（Ｌ）
Ｐｈｅ：フェニルアラニン（Ｆ）
Ｔｒｐ：トリプトファン（Ｗ）
Ｓｅｒ：セリン（Ｓ）
Ｔｈｒ：トレオニン（Ｔ）
Ｇｌｕ：グルタミン酸（Ｅ）
Ｇｌｎ：グルタミン（Ｑ）
Ａｓｐ：アスパラギン酸（Ｄ）
Ａｓｎ：アスパラギン（Ｎ）
Ｔｙｒ：チロシン（Ｙ）
Ａｒｇ：アルギニン（Ｒ）
Ｌｙｓ：リシン（Ｋ）
Ｈｉｓ：ヒスチジン（Ｈ）
Ａｉｂ：α－アミノイソブタン酸
Ａｄｏ：８－アミノ－３，６－ジオキサオクタン酸

【0053】

試薬略号：
Ｂｏｃ：ｔ－ブトキシカルボニル基
Ｔｅｒｔ－Ｂｕ：ｔ－ブチル基
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
Ｆｍｏｃ：９－フルオレニルメトキシカルボニル基
ＨｏＢｔ：１－ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＢＴＵ：２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチル－ウロニウムヘキサフルオロホスファート
ＨＡＴＵ：Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－ウロニウムヘキサフルオロホスファート
Ｍｔｔ：４－メチルトリチル基
ＮＭＰ：Ｎ－メチルピロリドン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７－ペンタメチルジヒドロベンゾフラン
Ｄｄｅ：１－（４，４－ジメチル－２，６－ジオキソシクロヘキシリデン）－３－メチル－ブチル
Ｔｒｔ：トリフェニルメチル基
ＥＤＴ：エタンジチオール
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
ＦＢＳ：ウシ胎児血清

【0054】

実施例１：
本発明に係るポリペプチドの基本的な線形配列及び側鎖修飾誘導ペプチドは次の一般的な方法で合成する。
１）合成：Ｆｍｏｃストラテジーを用い、ＰＳＩ２００型ポリペプチドシンセサイザーで次のステップで段階的に合成した。
ａ）活性化試薬系の存在下で樹脂固相担体とＦｍｏｃによって保護されたＣ末端アミノ酸をカップリングさせてＦｍｏｃ－アミノ酸－樹脂を得た。Ｃ末端アミド化ポリペプチドの合成にはアミノ樹脂、例えば、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＡＭ、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ、Ｒｉｎｋ ＭＢＨＡなどを用いた。Ｆｍｏｃ－アミノ酸と樹脂の比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）は３～５：１で、ＨＯＢＴ／ＤＩＣ又はＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡをカップリング活性化試薬とした。

【0055】

ｂ）ペプチド鎖の伸長：固相合成によりペプチド配列のアミノ酸の順番でアミノ酸を接続させて、Ｎ末端で側鎖保護を備えるペプチド－樹脂コンジュゲートを得た。側鎖を有するアミノ酸は次の方法で保護した。トリプトファンはＢｏｃで、グルタミン酸はＯｔＢｕで、リシンはＢｏｃで、グルタミンはＴｒｔで、チロシンはｔＢｕで、セリンはＴｒｔ又はｔＢｕで、アスパラギン酸はＯｔＢｕで、トレオニンはｔＢｕで、システインはＴｒｔで、アルギニンはＰｂｆで保護し、ヒスチジン（Ｔｒｔ）のα－アミノ基はＢｏｃで保護し、修飾可能なリシンのε－アミノ基はＤｄｅで保護した。カップリング活性化試薬としてＨＯＢＴ／ＤＩＣ、ＨＯＢＴ／ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡ及びＨＯＢＴ／ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡを使用し、ニンヒドリン反応で反応終了を検出し、脱保護剤はピペリジンを２０％含むＮＭＰ（ＤＭＦ）溶液である。

【0056】

ｃ）リシンのε－アミノ基の脱保護：
前記ステップで合成した完全保護したポリペプチド－樹脂をＮＭＰ－ＤＣＭ（１：１ｖ／ｖ）で３回洗浄し、新たに調製した２．０％ヒドラジン一水和物のＮＭＰ溶液を加え、室温下で１２分間攪拌し、濾過し、２回繰り返し、樹脂をＤＣＭ、ＮＭＰでそれぞれ３回洗浄した。

【0057】

ｄ）リシン側鎖の修飾：
リシンのε－アミノ基の脱保護を完了した後、樹脂：接続基１：４～５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の比率でＦｍｏｃ－Ａｄｏ又はＦｍｏｃ－γ－Ｇｌｕ（ｔＢｕ）及びＨＯＢｔ／ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡを加え、攪拌しながら２～４時間反応させ、Ｆｍｏｃ保護を除去し、同じ方法で引き続き連結アームと脂肪アシル基を接続させて所定の鎖長にした。２回繰り返しても完全に反応できない場合、過剰の無水酢酸／ピリジンを加えてブロックさせ、次のステップの反応を行った。

【0058】

ｅ）ポリペプチドの開裂：完全に保護されたペプチド－樹脂をＮＭＰで洗浄し、次にＤＣＭで３～６回洗浄してＮＭＰを除去し、ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ／Ｈ₂Ｏ（９２．５：２．５：２．５：２．５ｖ／ｖ）溶液を添加して、室温で、窒素の保護下で９０分間攪拌して脱保護と脱樹脂を行った。吸引濾過して濾液を得、過剰の氷ジエチルエーテルで沈殿させてポリペプチド粗品を得、遠心分離で沈殿物を収集し、少量のジエチルエーテルで沈殿物を洗浄し、そして真空下で乾燥してポリペプチド粗品を得た。

【0059】

２）精製：ポリペプチド粗品を水又は１０～１５％アセトニトリル（１０～５０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、分取ＨＰＬＣ（Ｃ８又はＣ１８カラム、アセトニトリル－水－トリフルオロ酢酸系）により分離及び精製し、濃縮し、凍結乾燥して、ポリペプチド精製品を得た（純度９７％以上）。

【0060】

前記方法で次の構造のポリペプチド誘導体を合成した。

【0061】

【表1】

＊：γＥ－γＥ－ＯＣ₁₆Ｈ₃₁
＊＊：－Ａｄｏ－Ａｄｏ－γＥ－ＯＣ₁₇Ｈ₃₂ＣＯＯＨ
＊＊＊：－Ａｄｏ－Ａｄｏ－γＥ－ＯＣ₁₉Ｈ₃₆ＣＯＯＨ

【0062】

実施例２：ＧＬＰ－１／ＧＣ受容体に対する作用
ＧＬＰ－１／ＧＣ受容体に媒介されるインビトロｃＡＭＰ生成に対する影響により前記ポリペプチドのＧＬＰ－１／ＧＣ受容体に対する作用を評価した。

【0063】

ヒトＧＬＰ－１受容体をトランスフェクトした中国モルモット肺細胞、ＧＣ受容体をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を９６ウェルマイクロプレートに接種し、（２０万個／ウェル）、Ｈａｎｋｓ’平衡塩バッファーで洗浄した後、２００ｍｍｏｌ／Ｌの３－イソブチル－１－メチルアリザリンの存在下で異なる濃度の被験ポリペプチドサンプル（１０^-5～１０^-12ｍｏｌ／Ｌ）と一緒に３７℃で２０分間インキュベートした。培地を除去し、細胞を溶解し、分析キットの取扱説明書の測定手順に従ってｃＡＭＰ値を測定した。ソフトウェアＯｒｉｇｉｎで５０％効果濃度（ＥＣ₅₀）を算出した。結果は表２に示すとおりである。

【0064】

【表2】

【0065】

表２のインビトロ受容体作動活性結果から分かるように、本発明のアミノ酸配列を持ったポリペプチド誘導体はＧＬＰ－１／ＧＣ受容体に対する二重の作動活性を有し、同じ条件で、Ｃ末端２７位から末端の配列がＥＡＧＧＰＳＳＧ又はＥＧＧＰＳＳＧであるポリペプチド誘導体、とりわけ前者の方が、他の末端配列を有するポリペプチド誘導体に比べて活性強度及び力価比が優れていた。好ましく選択されたポリペプチド誘導体の力価比が１０：１～１：１０の範囲にあって、ＧＬＰ－１／ＧＣ受容体に対する良好な二重の作動活性が実現された。

【0066】

実施例３：
実施例１の代表的な化合物１、４、６、２２のＤＩＯマウスの体重及び血糖に対する影響
１）体重に対する影響
３５匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用い、モデル群（ｎ＝３０）はＨ１００６０高脂肪食による飲食誘導肥満（ＤＩＯ）で、ブランク対照群（ｎ＝５）は標準食で飼育し、いずれも３４週飼育した。初回投与の前日、モデル群は体重に基づいて、１群当たり５匹ずつ、モデル対照群、陽性対照群（セマグルチド）、被験サンプル群（１～４番は化合物１、化合物４、化合物６及び化合物２２）にそれぞれランダムに群分けした（平均体重範囲は４５．０～５２．０ｇ）。ブランク対照群、モデル対照群は毎日生理食塩水を皮下投与し、陽性対照群、被験サンプル群は毎日皮下注射投与で、１４日間投与した。毎日動物の体重を秤量及び記録し、最終投与日に開始時体重との比較で体重変化率（％）を算出した。結果は表３及び図１に示すとおりである。

【0067】

計算式：（開始時体重－最終重量）／開始時体重＝体重変化率（％）
計算結果が正の値である場合は減少、負の値である場合は増加を表す。

【0068】

【表3】

【0069】

２）グルコース負荷モデル動物に対する血糖降下効果：
ＤＩＯマウスを１６時間絶食させ、皮下注射で投与し、投与から１時間後にグルコース溶液（１ｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して糖負荷試験を行い、糖投与後０．５、１、１．５時間にそれぞれ血糖値を測定し、血中糖濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、モデル対照群との比較で血糖阻害率（％）を算出した。結果は表４に示すとおりである。

【0070】

【表4】

^**はモデル対照群との比較でＰ＜０．０１であることを、^*はモデル対照群との比較でＰ＜０．０５であることを表す。

【0071】

結論：表３及び表４に示すように、モデル群と比べて、陽性薬及び本発明の被験化合物は有意な体重減少効果を示し耐糖能を有意に改善できた。本発明の被験化合物は陽性対照薬と同等な血糖降下効果を有するほか、ＧＬＰ－１受容体アゴニスト（陽性対照薬）単独と比べて、より優れた体重減少作用があることが示唆された。

【0072】

実施例４：
実施例１の化合物２７、３５、５４、５７及び６６のＤＩＯマウスの体重及び血糖に対する影響
方法は実施例３と同じで、体重に対する影響の試験結果を表５、血糖に対する影響を表６に示す。表中、５～９番はそれぞれ化合物２７、化合物３５、化合物５４、化合物５７及び化合物６６であった。

【0073】

【表5】

【0074】

【表6】

^**はモデル対照群との比較でＰ＜０．０１であることを、^*はモデル対照群との比較でＰ＜０．０５であることを表す。

【0075】

結論：表５、表６に示すように、化合物２７、化合物３５、化合物５４、化合物５７及び化合物６６投与は治療を受けないモデル対照群と比べて、耐糖能が有意に改善され（Ｐ＜０．０１）、体重が顕著に減少していた。被験化合物投与群はいずれも陽性薬と同等な血糖降下活性を表し、陽性薬より顕著な体重減少効果があることが判明される。

【0076】

実施例５：
実施例１の化合物の短期投与のモデル動物の食物摂取量及び体重に対する影響
方法：飲食誘導肥満マウス（ＤＩＯ）を用い、平均体重は５２．５ｇで、１群当たり５匹ずつモデル対照群、被験群に分けた。ｐＨ７．４の１０ｍＭのＰＢＳで被験サンプルを溶解し、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で２４時間おきに１回注射し、２回の投与とし、モデル群は溶媒を注射し、４８時間の食物摂取量及び体重変化を測定し、投与前日に対する変化率を算出した。結果を表７に示す。

【0077】

【表7】

【0078】

表７の結果が示すように、モデル群と比べ、被験化合物の投与期間で食物摂取量が顕著に低減し、体重が有意に減少していることから、被験化合物の体重減少効果が食物摂取量の低減とある程度関係していることが示される。

【0079】

実施例６：
実施例１の化合物の溶解性に関する研究
２ｍｇの化合物を秤量し、それぞれ、異なる濃度（１０、２０ｍＭ）とｐＨ（７．５、８．０）のリン酸塩バッファー１ｍＬで溶解して、遠心分離し、上清液を採取し、ＨＰＬＣ（カラム：Ａｅｒｉｓ ｗｉｄｅｐｏｒｅ ＸＢ－Ｃ１８ ３．６ｍｍ、４．６×１５０ｍｍ、移動相：Ａ：０．０５％ＴＦＡ、Ｂ：９５％アセトニトリル、検出波長：２１４ｎｍ）でピーク面積を測定し、対応するサンプル標準溶液と比較して被験サンプル溶液の相対濃度を算出した。結果を表８に示す。

【0080】

【表8】

【0081】

結論：表８に示すように、グルカゴンと比べて、本発明の化合物は生理学的に許容されるｐＨ条件下で溶解度が高められており、本発明の好ましい技術的解決手段である短縮ＧＣ（１～２６）配列の伸長ペプチド誘導体は保存的な原配列の突然変異伸長ペプチド（化合物３、化合物１６、化合物２５、化合物２６）と比べて、溶解性が大幅に改善された。長鎖脂肪アシル化修飾を含んだ化合物でも、生理学的に許容されるｐＨ条件での水溶性が高められたことから、薬物の製剤化に好適になったことが期待される。

【0082】

実施例７：
実施例１の化合物の化学的安定性
加速安定性試験で本発明の化合物の注射溶液系における化学的安定性を評価した。

【0083】

方法：適量の実施例１の化合物を秤量し、１０ｍＭのｐＨ８．５のリン酸水素二ナトリウムバッファーで溶解して、０．１Ｎの塩酸で溶液の最終ｐＨを７．３に調整し、適量のＴｗｅｅｎ８０及びフェノールを加え、１０、３７℃で１４日間静置し、ＨＰＬＣ－ＵＶで検出し、ピーク面積の正規化によりメインピーク面積を得、０日に対する変化を得た。結果を表９に示す。

【0084】

ＨＰＬＣ検出は実施例６と同じで、クロマトグラフィーのピーク分離状況に基づいて移動相の勾配を適切に調整した。

【0085】

【表9】

【0086】

結論：表９で示すように、注射製剤の初歩的な配合系で、被験化合物の化学的安定性が製剤学的に許容される範囲にあって、実施の最適化が期待できる。

【図1】

【配列表】

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