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特許7350994新規なプロモーター及びそれを用いた標的物質生産方法
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-15
(45)【発行日】2023-09-26
(54)【発明の名称】新規なプロモーター及びそれを用いた標的物質生産方法
(51)【国際特許分類】
   C12N 15/11 20060101AFI20230919BHJP
   C12N 1/21 20060101ALI20230919BHJP
   C12N 9/02 20060101ALI20230919BHJP
   C12N 15/53 20060101ALI20230919BHJP
   C12N 15/67 20060101ALI20230919BHJP
   C12N 15/77 20060101ALI20230919BHJP
   C12P 13/04 20060101ALI20230919BHJP
   C12P 13/06 20060101ALN20230919BHJP
   C12P 13/08 20060101ALN20230919BHJP
【FI】
C12N15/11 Z ZNA
C12N1/21
C12N9/02
C12N15/53
C12N15/67 Z
C12N15/77 Z
C12P13/04
C12P13/06 B
C12P13/06 C
C12P13/08 D
【請求項の数】 15
(21)【出願番号】P 2022514254
(86)(22)【出願日】2020-09-01
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-11-14
(86)【国際出願番号】 KR2020011679
(87)【国際公開番号】W WO2021045472
(87)【国際公開日】2021-03-11
【審査請求日】2022-03-04
(31)【優先権主張番号】10-2019-0108263
(32)【優先日】2019-09-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】514199250
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ユン、ビョン フン
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ジン スク
(72)【発明者】
【氏名】キム、ソン ヘ
(72)【発明者】
【氏名】イ、ジ ヘ
(72)【発明者】
【氏名】チェ、ソン ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】キム、キョンリム
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヒョン ジュン
【審査官】山▲崎▼ 真奈
(56)【参考文献】
【文献】特開平07-087977(JP,A)
【文献】特表2016-519949(JP,A)
【文献】国際公開第2006/028063(WO,A1)
【文献】韓国公開特許第10-2019-0037224(KR,A)
【文献】特表2015-513892(JP,A)
【文献】特表2009-521960(JP,A)
【文献】Miroslav Patek et al.,Microbiology,1996年,vol.142,pp.1297-1309
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
C12N
CAplus/REGISTRY/MEDLINE/EMBASE/BIOSIS(STN)
GenBank/EMBL/DDBJ/GeneSeq
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記一般式1で表されるヌクレオチド配列を含む、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドであって、
下記一般式1において、
XはCNGNであり、
YはCTAATTNであり、
ZはCATGTGTGTGGTATAATであり、
前記N、前記N及び前記Nは、それぞれA(アデニン)、T(チミン)、G(グアニン)又はC(シトシン)から選択されるいずれかであるポリヌクレオチド。
[一般式1]
X-Y-Z
【請求項2】
前記XのNは、C(シトシン)又はG(グアニン)である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項3】
前記XのNは、A(アデニン)又はT(チミン)である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記YのNは、A(アデニン)又はG(グアニン)である、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記Xは配列番号8~11のいずれかであり、Yは配列番号6又は7である、請求項3に記載のポリヌクレオチド。
【請求項6】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号13~20から選択されるいずれかのポリヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
【請求項7】
請求項1~6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むプロモーター。
【請求項8】
請求項7に記載のプロモーター、及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクター。
【請求項9】
前記標的タンパク質はアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ(acetohydroxy acid isomeroreductase)である、請求項8に記載のベクター。
【請求項10】
請求項1~6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属微生物。
【請求項11】
前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項10に記載の微生物。
【請求項12】
請求項10に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップと、
前記培地から標的物質を回収するステップとを含む、
標的物質を生産する方法。
【請求項13】
前記標的物質はアミノ酸である、請求項12に記載の方法。
【請求項14】
前記アミノ酸はL-分枝鎖アミノ酸である、請求項13に記載の方法。
【請求項15】
請求項1~6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むプロモーターを標的遺伝子と作動可能に連結させるステップを含む標的遺伝子発現強化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、新規なプロモーター及びそれを用いた標的物質生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
コリネ型微生物は、伝統的にアミノ酸や核酸関連物質の生産に最も広く用いられている産業用微生物である。主にアミノ酸及び各種核酸を含む飼料、医薬品、食品などの分野で様々な用途を有する化学物質の生産に用いられるグラム陽性菌であり、生育にビオチンが必要である。細胞分裂の際に直角に曲がる特徴(snapping)を有し、生成される代謝物質に対する分解活性が低いことがこの菌の利点の一つである。
【0003】
コリネ型微生物が生産する産物の一つであるL-アミノ酸は、タンパク質の基本構成単位であり、薬品の原料や、食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として用いられている。よって、アミノ酸を産業的に生産することは、経済的に重要な産業工程となっている。
【0004】
アミノ酸を効率的に生産するための様々な研究、例えばアミノ酸高効率生産微生物や発酵工程技術を開発するための努力がなされている。具体的には、コリネバクテリウム属菌株においてアミノ酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、アミノ酸生合成に不要な遺伝子を除去するような標的物質に特異的なアプローチが開発されており(特許文献1など)、これらの方法以外にも、アミノ酸生産に関与しない遺伝子を除去する方法、アミノ酸生産において具体的に機能が知られていない遺伝子を除去する方法も活用されている。しかし、依然として効率的かつ高収率でアミノ酸を生産する方法に関する研究が強く求められている。
【0005】
前述したようにコリネ型微生物から遺伝工学的又は代謝工学的技術により標的物質を高力価で生産する菌株を開発するためには、微生物中の様々な代謝過程に関与する遺伝子の発現を選択的に調節しなければならない。このような調節のためには、調節遺伝子の一つとしてDNA分子上にRNA合成酵素が結合して転写(transcription)を開始する部位であるプロモーターの活性を調節することが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】米国特許第8030036号明細書
【文献】米国特許出願公開第2020/0032305号明細書
【文献】米国特許第8465962号明細書
【文献】国際公開第2008/033001号
【文献】韓国登録特許第10-1335789号公報
【文献】韓国公開特許第10-2019-0003019号公報
【文献】韓国登録特許第10-0057684号公報
【文献】米国特許第10351859号明細書
【非特許文献】
【0007】
【文献】Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【文献】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【文献】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【文献】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)
【文献】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)
【文献】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994
【文献】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073
【文献】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482
【文献】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)
【文献】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745
【文献】Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【文献】Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467
【文献】Appl. Microbiol. Biotechnol. 45, 612-620 (1996)
【文献】World J Microbiol Biotechnol (2015) 31:1369-1377
【文献】Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008
【文献】van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明者らは、強力な発現誘導活性を示すプロモーターを開発すべく鋭意努力した結果、コリネバクテリウム染色体上のilvC遺伝子プロモーターを塩基置換により改良し、改良したプロモーターがそれと作動可能に連結された遺伝子の発現を増加させることを確認し、本出願を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本出願は、配列番号1のヌクレオチド配列の少なくとも1つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換され、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供する。
本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むプロモーターを提供する。
【0010】
本出願は、前記プロモーター及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
本出願は、前記ポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【0011】
本出願は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含む、標的物質を生産する方法を提供する。
本出願は、前記プロモーターを標的遺伝子に作動可能に連結させるステップを含む、標的遺伝子の発現強化方法を提供する。
【0012】
本出願は、配列番号1のヌクレオチド配列の少なくとも1つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチドのプロモーターとしての使用を提供する。
【発明の効果】
【0013】
本出願の新規なプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを用いると、前記ポリヌクレオチドに連結された標的遺伝子の発現を増加させることができるので、標的物質の生産に有用である。
【図面の簡単な説明】
【0014】
図1】バリン生産菌株のilvCプロモーター領域を示す図である。
図2】バリン生産菌株のilvCプロモーター領域を示す図である。
図3】バリン生産菌株のilvCプロモーター領域を示す図である。
図4】バリン生産菌株のilvCプロモーター領域を示す図である。
図5】イソロイシン生産菌株のilvCプロモーター領域を示す図である。
図6】イソロイシン生産菌株のilvCプロモーター領域を示す図である。
図7】ロイシン生産菌株のilvCプロモーター領域を示す図である。
図8】ロイシン生産菌株のilvCプロモーター領域を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下、本出願をより詳細に説明する。なお、本出願で開示される一態様の説明及び実施形態は、共通事項について他の態様の説明及び実施形態にも適用される。また、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。さらに、以下の具体的な説明に本出願が限定されるものではない。
【0016】
また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。
【0017】
本出願の一態様は、配列番号1のヌクレオチド配列の少なくとも1つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換され、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供する。
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体(monomer)が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体(polymer)であって、所定の長さより長いDNA鎖を意味する。
【0018】
本出願における「プロモーター活性を有するポリヌクレオチド」とは、後に連結する遺伝子、すなわち標的遺伝子の発現のために、RNAポリメラーゼやエンハンサーなどが結合する部位を含む標的遺伝子の転写部位付近に存在するDNA領域を意味する。本出願の目的上、前記ポリヌクレオチドは、汎用強化プロモーターとして用いられ、細胞内において、従来のプロモーターや細胞内在性プロモーターと比較して、それと作動可能に連結される標的遺伝子の発現、前記標的遺伝子によってコードされるタンパク質の生産及び/又は活性を調節することのできるものであるか、前記タンパク質が生産に関与する標的産物(生物学的活性物質であり、例えばアミノ酸、核酸、ビタミン、タンパク質、脂肪酸、有機酸などからなる群から選択される1種以上)の生産及び/又は活性を増加させるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0019】
一例として、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼの発現を強化させるプロモーターとして用いられてもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、アミノ酸、具体的には分枝鎖アミノ酸、より具体的にはロイシン、バリン、イソロイシンが含まれるアミノ酸の生産又は生産量の増加に関与するポリヌクレオチドであるが、これらに限定されるものではなく、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。
【0020】
本出願における配列番号1は、プロモーター活性を有する配列であり、配列番号1のヌクレオチド配列は、公知のデータベースであるNCBIGenbankでその配列を確認することができ、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)由来のものであってもよいが、これに限定されるものではなく、前記ヌクレオチドと同じ活性を有する配列であればいかなるものでもよい。なお、配列番号1は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ(acetohydroxy acid isomeroreductase)のプロモーターであってもよい。しかし、これに限定されるものではない。
【0021】
本出願における「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ(acetohydroxy acid isomeroreductase)」は、L-分枝鎖アミノ酸の生合成に関与する酵素である。L-分枝鎖アミノ酸の生合成経路においては、まずアセトヒドロキシ酸シンターゼ(acetohydroxy acid synthase)がピルビン酸の脱炭酸(decarboxylation)と他のピルビン酸分子との縮合反応を触媒し、バリンの前駆体であるアセト乳酸を生産するか、ピルビン酸の脱炭酸と2-ケトブチレート(2-ketobutyrate)との縮合反応を触媒し、イソロイシンの前駆体であるアセトヒドロキシブチレートを生産することができる。アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、このように生成されたアセト乳酸又はアセトヒドロキシブチレートを基質として反応を次のステップで行い、L-バリン、L-ロイシン及びL-イソロイシンを生成する。具体的には、アセトヒドロキシ酸シンターゼの反応により生成されたアセト乳酸又はアセトヒドロキシブチレートとアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼの反応により異性化が起こり、その後還元反応が進行し、各基質から(2R)-2,3-ジヒドロキシ-3-イソ吉草酸((2R)-2,3-dihydroxy-3-isovalerate)又は(2R,3R)-2,3-ジヒドロキシ-3-メチル吉草酸((2R,3R)-2,3-dihydroxy-3-methylvalerate)が生成される。(2R)-2,3-ジヒドロキシ-3-イソ吉草酸がジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(dihydroxy acid dehydratase)、トランスアミナーゼB(transaminase B)により触媒される反応を経るとL-バリンが生成され、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ(dihydroxy acid dehydratase)、2-イソプロピルリンゴ酸シンターゼ(2-isopropylmalate synthase)、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼ(isopropylmalateisomerase)、3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ(3-isopropylmalate dehydrogenase)、トランスアミナーゼB(transaminase B)により触媒される反応を順次経るとL-ロイシンが生成され、(2R,3R)-2,3-ジヒドロキシ-3-メチル吉草酸がジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、トランスアミナーゼBにより触媒される反応を経るとL-イソロイシンが生成される。よって、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼは、L-分枝鎖アミノ酸の生合成経路における重要な酵素である。
【0022】
本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドとは、配列番号1及び/又は配列番号1と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%もしくは99%以上の相同性(homology)もしくは同一性(identity)を有するヌクレオチド配列において、少なくとも1つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたものを意味する。相同性もしくは同一性を有するヌクレオチド配列は、前記範疇のうち100%の同一性を有する配列を除くものであってもよく、100%未満の同一性を有する配列であってもよい。
【0023】
具体的には、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、配列番号1のヌクレオチド配列の少なくとも1つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むものであってもよく、具体的には、配列番号1のヌクレオチド配列の少なくとも1つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドからなるものであってもよい。
【0024】
前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、一般式1で表され、前記一般式1において、i)XはCNGNであり、ii)YはCTAATTNであり、iii)ZはCATGTGTGTGGTANAANであり、iv)前記NはA(アデニン)、T(チミン)、G(グアニン)又はC(シトシン)から選択されるいずれかであってもよい。また、前記一般式1のポリヌクレオチド配列において、Zは配列番号2で表されるものであってもよく、Yは配列番号3で表されるものであってもよく、Xは配列番号4で表されるものであってもよい。
【0025】
[一般式1]
X-Y-Z
具体的には、前記一般式1において、XはCNGNであり、YはCTAATTNであり、ZはCATGTGTGTGGTATAATで表されるものであってもよく、N、N及びNはそれぞれA(アデニン)、T(チミン)、G(グアニン)又はC(シトシン)から選択されるいずれかであってもよい。
【0026】
より具体的には、前記一般式1において、i)NはC(シトシン)もしくはG(グアニン)であるか、ii)NはA(アデニン)もしくはT(チミン)であるか、iii)NはA(アデニン)もしくはG(グアニン)であるか、又はiv)前記i)~iii)の置換の組み合わせであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0027】
一例として、式1のポリヌクレオチド配列において、Zは配列番号2で表されるヌクレオチド配列の14番目のN及び17番目のNがT(チミン)であってもよく、ここで、Xは配列番号4で表されるヌクレオチド配列の2番目のNがC(シトシン)又はG(グアニン)であり、4番目のNがA(アデニン)又はT(チミン)であってもよく、配列番号8~11のいずれかであってもよく、Yは配列番号3で表されるヌクレオチド配列の7番目のNがA(アデニン)又はG(グアニン)であってもよい。具体的には、Zは配列番号2で表されるヌクレオチド配列の14番目のN及び17番目のNがT(チミン)であり、Xは配列番号8~11のいずれかであり、Yは配列番号6又は7であってもよい。
【0028】
他の例として、前記ポリヌクレオチドは、配列番号13~20から選択されるいずれかのポリヌクレオチド配列を有するものであってもよい。
本出願において「特定配列番号で表されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」、「特定配列番号で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド」と記載されていても、当該配列番号のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、前記ポリヌクレオチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、当該配列番号のヌクレオチド配列の前後の無意味な配列付加、自然に発生する突然変異、又はその非表現突然変異(silent mutation)を除外するものではなく、このような配列付加又は突然変異を有するものも本出願に含まれることは言うまでもない。
【0029】
相同性(homology)及び同一性(identity)とは、2つの与えられた塩基配列が関連する程度を意味し、百分率で表される。
相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられる。
【0030】
保存されている(conserved)ポリヌクレオチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか(homologous)又は同じ(identical)配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件(stringent conditions)下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約50%、60%、70%、80%又は90%以上ハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドは、コドンの代わりに縮退コドンを有するポリヌクレオチドであってもよい。
【0031】
任意の2つのポリヌクレオチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献1のようなデフォルトパラメーターと「FASTA」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、EMBOSSパッケージのニードルマンプログラム(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献2)(バージョン5.0.0又はそれ以降のバージョン)で行われるように、ニードルマン=ウンシュ(Needleman-Wunsch)アルゴリズム(非特許文献3)を用いて決定することができる(GCGプログラムパッケージ(非特許文献4)、BLASTP、BLASTN、FASTA(非特許文献5,6,7)を含む)。例えば、国立生物工学情報センターのBLAST又はClustalWを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
【0032】
ポリヌクレオチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献8に開示されているように、非特許文献3などのGAPコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、GAPプログラムは、2つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号(すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸)の数を割った値と定義している。GAPプログラムのためのデフォルトパラメーターは、(1)二進法比較マトリックス(同一性は1、非同一性は0の値をとる)及び非特許文献9に開示されているように、非特許文献10の加重比較マトリックス(又はEDNAFULL(NCBINUC4.4のEMBOSSバージョン)置換マトリックス)と、(2)各ギャップに3.0のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の0.10ペナルティ(又はギャップオープンペナルティ10、ギャップ延長ペナルティ0.5)と、(3)末端ギャップに無ペナルティとを含んでもよい。よって、本出願における「相同性」又は「同一性」は、配列間の関連性(relevance)を示す。
【0033】
また、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、同じ活性を有するポリヌクレオチド配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件(stringent condition)」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献(例えば、非特許文献11)に具体的に記載されている。例えば、相同性(homology)又は同一性(identity)の高い遺伝子同士、40%以上、具体的には70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、より具体的には95%以上、さらに具体的には97%以上、特に具体的には99%以上の相同性又は同一性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性又は同一性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション(southern hybridization)の洗浄条件である60℃、1×SSC、0.1%SDS、具体的には60℃、0.1×SSC、0.1%SDS、より具体的には68℃、0.1×SSC、0.1%SDSに相当する塩濃度及び温度において、1回、具体的には2回~3回洗浄する条件が挙げられる。
【0034】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ(mismatch)が可能であっても、2つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、DNAにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シアトンはグアニンに相補的である。よって、本出願には、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
【0035】
具体的には、相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、55℃のTm値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Tm値は、60℃、63℃又は65℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
【0036】
ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切な厳格さはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である(非特許文献11参照)。
本出願の他の態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むプロモーターを提供する。
【0037】
本出願における「プロモーター」とは、RNAポリメラーゼ(polymerase)に対する結合部位を含み、標的遺伝子のmRNAへの転写(transcription)開始活性を有する、コード領域の上流(upstream)の翻訳されないヌクレオチド配列、すなわちRNAポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始させるDNA領域を意味する。前記プロモーターは、mRNA転写開始部位の5’部位に位置する。
【0038】
本出願のプロモーターは、従来のプロモーターより増加したプロモーター活性を有してもよい。すなわち、宿主細胞において、標的遺伝子の発現だけでなく、標的遺伝子によりコードされるタンパク質の発現及び活性を増加させることができる。
【0039】
本出願の目的上、生産しようとする産物、すなわち「標的産物」に応じて発現強化のための標的遺伝子を適宜変更することができ、前記プロモーターは、標的遺伝子の強化のための汎用プロモーターとして用いられる。
【0040】
前記「標的遺伝子」とは、本出願の目的上、本出願のプロモーター配列により発現を調節しようとする遺伝子を意味する。前記標的遺伝子によりコードされるタンパク質を「標的タンパク質」といい、前記「標的タンパク質」をコードする遺伝子を「標的遺伝子」という。例えば、前記プロモーターの標的遺伝子は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子、すなわちilvCであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0041】
また、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コドンの縮退(degeneracy)により、又は前記ポリヌクレオチドを発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、ポリペプチド配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。ポリヌクレオチド配列については前述した通りである。
【0042】
本出願のさらに他の態様は、本出願のプロモーターを含むベクターを提供する。
本出願のさらに他の態様は、本出願のプロモーター及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
【0043】
具体的には、前記標的タンパク質は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼであるベクターであってもよいが、これに限定されるものではない。
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的ポリヌクレオチドを発現させることができるように、好適な発現調節領域又は発現調節配列に作動可能に連結された前記標的ポリヌクレオチドをコードする塩基配列を含有するDNA産物を意味する。前記発現調節配列には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれ、具体的には本出願のプロモーターが含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【0044】
例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより染色体内で標的ポリヌクレオチドに置換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え(homologous recombination)により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー(selection marker)をさらに含んでもよい。選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、すなわち標的ポリヌクレオチド分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤(selective agent)で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【0045】
本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、Charon21Aなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系、pET系などを用いることができる。具体的には、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いることができる。
【0046】
本出願のさらに他の態様は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物を提供する。
本出願のさらに他の態様は、本出願のポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むコリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)微生物を提供する。
【0047】
本出願における「微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は弱化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物が全て含まれる概念である。本出願における微生物は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドが導入されるか、それを含む微生物であればいかなるものでもよい。
【0048】
具体的には、前記微生物は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換することにより作製される微生物であってもよく、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子、又はそれらを含むベクターを含む微生物であってもよい。具体的には、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質が生産に関与する標的産物の生産能を有する微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記微生物は、自然に標的タンパク質もしくは標的産物生産能を有する微生物、又は標的タンパク質もしくは標的産物生産能のない親株に標的タンパク質又は標的産物生産能が付与された微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0049】
本出願における「標的タンパク質又は標的産物を生産する微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするタンパク質又は産物の生産のために遺伝的改変(modification)が行われた微生物であってもよい。当該微生物は、標的タンパク質、それをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも1つにより遺伝的に改変された微生物、前記標的タンパク質もしくはそれをコードするポリヌクレオチドを発現するように改変された微生物、前記標的タンパク質もしくはそれをコードするポリヌクレオチドを発現する組換え微生物、又は前記標的タンパク質活性を有する組換え微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0050】
本出願における「形質転換」とは、本出願のポリヌクレオチドと標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドとが含まれるポリヌクレオチド又はベクターを宿主細胞又は微生物内に導入することにより、宿主細胞内で標的タンパク質を発現させることを意味する。標的タンパク質が宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞又は微生物内に導入されたポリヌクレオチド又はベクターが宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター(promoter)、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含み、前記プロモーターは、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドであってもよい。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本出願のポリヌクレオチドと作動可能に連結され、それ自体の形態で宿主細胞に導入されてもよいが、これに限定されるものではない。
【0051】
さらに、本出願における「作動可能に連結」されたものとは、前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されたものを意味する。前記プロモーター配列は、本出願において提供するプロモーターであってもよい。
【0052】
本出願のベクターを形質転換する方法は、核酸を細胞内に導入するいかなる方法であってもよく、当該分野において公知であるように、宿主細胞に適した標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション(electroporation)、リン酸カルシウム(CaPO)沈殿、塩化カルシウム(CaCl)沈殿、微量注入法(microinjection)、ポリエチレングリコール(PEG)法、DEAE-デキストラン法、カチオン性リポソーム法、酢酸リチウム-DMSO法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0053】
本出願の目的上、前記微生物は、標的タンパク質又は標的産物を生産する微生物であって、本出願のポリヌクレオチドを含み、標的タンパク質又は標的産物生産能が向上したことを特徴とする微生物であってもよい。
【0054】
一例において、本出願のポリヌクレオチドを含む微生物は、配列番号1のヌクレオチド配列の少なくとも1つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換され、標的タンパク質の活性を強化した微生物であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0055】
具体的には、前記微生物は、配列番号1のポリヌクレオチド配列における少なくとも1つのヌクレオチドが置換され、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含む微生物であって、前記プロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、一般式1で表され、前記式1において、XはCNGNであり、YはCTAATTNであり、ZはCATGTGTGTGGTANAANであり、前記NはA(アデニン)、T(チミン)、G(グアニン)又はC(シトシン)から選択されるいずれかであってもよい。前記ポリヌクレオチドについては前述した通りである。
【0056】
[一般式1]
X-Y-Z
一例として、本出願の微生物は、本出願のポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換され、標的タンパク質の活性が強化されたものであってもよい。
【0057】
本出願における、標的タンパク質もしくは標的産物を生産する微生物、又は標的タンパク質もしくは標的産物生産能を有する微生物は、標的タンパク質又は標的産物生合成経路の遺伝子の一部が強化又は弱化されるか、標的タンパク質又は標的産物分解経路の遺伝子の一部が強化又は弱化された微生物であってもよい。
【0058】
例えば、標的タンパク質が分枝鎖アミノ酸の生産に関与するタンパク質である場合、自然に分枝鎖アミノ酸生産能を有する微生物、又は分枝鎖アミノ酸生産能のない親株に分枝鎖アミノ酸生産能が付与された微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0059】
一例として、標的タンパク質がアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼである場合、本出願のポリヌクレオチドとアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子が作動可能に連結され、前記アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼの活性を強化できる細胞又は微生物であってもよく、ここで、宿主細胞又は微生物は、前記標的タンパク質を含み、分枝鎖アミノ酸を生産する微生物であってもよい。
【0060】
本出願における前記「分枝鎖アミノ酸を生産する微生物」は、「分枝鎖アミノ酸を生産できる微生物」、「分枝鎖アミノ酸生産能を有する微生物」と混用される。
本出願における「分枝鎖アミノ酸」とは、側鎖に分岐アルキル基を有するアミノ酸を意味し、バリン、ロイシン及びイソロイシンが含まれるものである。具体的には、本出願における前記分枝鎖アミノ酸は、L-分枝鎖アミノ酸であり、前記L-分枝鎖アミノ酸は、L-バリン、L-イソロイシン又はL-ロイシンであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0061】
本出願における「分枝鎖アミノ酸を生産する微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とする分枝鎖アミノ酸の生産のために遺伝的変異を起こすか、活性を強化した微生物であってもよい。本出願の目的上、前記分枝鎖アミノ酸を生産する微生物は、前記本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含み、目的とする分枝鎖アミノ酸生産能が向上したことを特徴とし、具体的にはコリネバクテリウム属微生物であってもよい。具体的には、本出願における、分枝鎖アミノ酸を生産する微生物、又は分枝鎖アミノ酸生産能を有する微生物は、分枝鎖アミノ酸生合成経路の遺伝子の一部が強化又は弱化されるか、分枝鎖アミノ酸分解経路の遺伝子の一部が強化又は弱化された微生物であってもよい。例えば、前記分枝鎖アミノ酸を生産する微生物は、本出願において提供するプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含み、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするilvCの発現が増加したものであるが、これに限定されるものではない。
【0062】
本出願における「分枝鎖アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属(the genus Corynebacterium)微生物」とは、天然のもの又は変異により分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を意味する。具体的には、本出願の分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物は、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードするilvCを含み、ilvCのプロモーターの活性を強化することにより向上した分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。より具体的には、本出願における、分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含むか、又は前記ポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されることにより、向上した分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を意味する。
【0063】
前記「向上した分枝鎖アミノ酸生産能を有するコリネバクテリウム属微生物」とは、形質転換前の親株又は非改変微生物に比べて分枝鎖アミノ酸生産能が向上した微生物を意味する。前記「非改変微生物」とは、天然型の菌株自体、前記アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼをコードする遺伝子を含まない微生物、又は本出願のポリヌクレオチド配列を含まないか、本出願のポリヌクレオチド及び標的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。
【0064】
また、前記「親株」は、分枝鎖アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物であってもよい。具体的には、前記親株は、自然に又は人為的に遺伝的変異が起こった分枝鎖アミノ酸生産微生物であってもよい。例えば、前記親株は、コリネバクテリウム属微生物に変異[ilvN(A42V);非特許文献12]を導入してL-バリン生産能が向上した菌株であってもよく、コリネバクテリウム属微生物にlysC(L377K)変異体及びhom(G378E)変異体(非特許文献13)を導入し、トレオニンデヒドラターゼ(L-threonine dehydratase)をコードする遺伝子にilvA(V383A)変異(非特許文献14)を導入してL-イソロイシン生産能が向上した菌株であってもよい。また、コリネバクテリウム属微生物に変異[leuA(R558H,G561D);特許文献2]を導入してL-ロイシン生産能が向上した菌株であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0065】
本出願における「コリネバクテリウム属微生物」は、コリネバクテリウム属微生物であればいかなるものでもよい。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)、コリネバクテリウム・クルジラクチス(Corynebacterium crudilactis)、コリネバクテリウム・デセルティ(Corynebacterium deserti)、コリネバクテリウム・カルナエ(Corynebacterium callunae)、コリネバクテリウム・シングラレ(Corynebacterium singulare)、コリネバクテリウム・ハロトレランス(Corynebacterium halotolerans)、コリネバクテリウム・ストリアツム(Corynebacterium striatum)、コリネバクテリウム・ポルティソリ(Corynebacterium pollutisoli)、コリネバクテリウム・イミタンス(Corynebacterium imitans)、コリネバクテリウム・テスツディノリス(Corynebacterium testudinoris)、コリネバクテリウム・フラベッセンス(Corynebacterium flavescens)などであるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【0066】
本出願のさらに他の態様は、本出願のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含む、標的物質を生産する方法を提供する。
具体的には、前記標的物質はアミノ酸であり、より具体的には、分枝鎖アミノ酸であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0067】
前記方法における前記微生物を培養するステップは、特に限定されるものではないが、公知の回分培養法、連続培養法、流加培養法などにより行うことができる。ここで、培養条件は、特にこれらに限定されるものではないが、塩基性化合物(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア)又は酸性化合物(例えば、リン酸又は硫酸)を用いて適正pH(例えば、pH5~9、具体的にはpH6~8、最も具体的にはpH6.8)に調節してもよく、酸素又は酸素含有ガス混合物を培養物に導入して好気性条件を維持してもよい。培養温度は20~45℃、具体的には25~40℃に維持し、約10~160時間培養してもよいが、これらに限定されるものではない。前記培養により生産されたアミノ酸は、培地中に分泌されるか、又は細胞内に残留する。
【0068】
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源として糖及び炭水化物(例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス(molasses)、デンプン及びセルロース)、油脂(例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油)、脂肪酸(例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸)、アルコール(例えば、グリセリン及びエタノール)、有機酸(例えば、酢酸)などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物(例えば、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆粕及び尿素)、無機化合物(例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウム)などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、培地は、その他金属塩(例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄)、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。
【0069】
本出願の標的物質の生産方法は、前記培地から標的物質を回収するステップをさらに含んでもよい。
本出願の前記培養ステップで生産された標的物質を回収する方法は、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養液から目的とする物質を回収(collect)することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、HPLCなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とする物質を回収することができる。
【0070】
また、前記回収ステップは、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の好適な方法を用いて行うことができる。例えば、標的物質がアミノ酸である場合、前記回収されるアミノ酸は、精製された形態であってもよく、アミノ酸を含有する微生物発酵液であってもよい(非特許文献15)。
【0071】
本出願のさらに他の態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むプロモーターを標的遺伝子に作動可能に連結させるステップを含む、標的遺伝子の発現強化方法を提供する。
前記ポリヌクレオチド、標的遺伝子、プロモーターなどについては前述した通りである。
【0072】
本出願のさらに他の態様は、配列番号1のヌクレオチド配列の少なくとも1つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに置換されたポリヌクレオチドのプロモーターとしての使用を提供する。
【0073】
前記ポリヌクレオチドについては前述した通りである。
【実施例
【0074】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例1】
【0075】
ランダム変異法によるバリン生産能向上変異株の選択
実施例1-1:UV照射によるランダム突然変異誘発
バリン生産能が向上した変異株を選択するために、寒天を含む栄養培地にバリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11201P(特許文献3)を塗抹し、30℃で36時間培養した。このようにして得られた数百個のコロニーに室温でUVを照射し、菌株のゲノムにランダム突然変異を誘発した。
【0076】
<栄養培地(pH7.2)>
グルコース10g,肉汁5g,ポリペプトン10g,塩化ナトリウム2.5g,酵母エキス5g,寒天20g,尿素2g(蒸留水1リットル中)
実施例1-2:突然変異誘発菌株の発酵力価試験及び菌株の選択
親株として用いたコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11201Pに比べてL-バリンの生産能が向上した変異株を選択するために、ランダム突然変異を誘発した菌株を対象に発酵力価試験を行った。各コロニーを栄養培地で継代培養し、その後生産培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃、200rpmで72時間振盪培養した。その後、HPLCを用いてL-バリンの濃度を分析した。分析したL-バリンの濃度を表1に示す。
【0077】
<栄養培地(pH7.2)>
グルコース10g,肉汁5g,ポリペプトン10g,塩化ナトリウム2.5g,酵母エキス5g,寒天20g,尿素2g(蒸留水1リットル中)
<生産培地(pH7.0)>
グルコース100g,硫酸アンモニウム40g,大豆タンパク質2.5g,コーンスティープソリッド(Corn Steep Solids)5g,尿素3g,リン酸水素二カリウム1g,硫酸マグネシウム7水塩0.5g,ビオチン100μg,チアミンHCl1mg,パントテン酸カルシウム2mg,ニコチンアミド3mg,炭酸カルシウム30g(蒸留水1リットル中)
【0078】
【表1】
【0079】
表1に示すように、対照群であるKCCM11201P菌株に対するバリン生産量がそれぞれ178%、174%である、最も多く増加したM4及びM15菌株を選択した。
【実施例2】
【0080】
遺伝子シーケンシングによる変異の確認
バリン生産能が向上した前記M4及びM15菌株のバリン生合成経路における主要遺伝子をシーケンシングし、KCCM11201P菌株、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型菌株ATCC14067、ATCC13032及びATCC13869と比較した。その結果、前記M4及びM15菌株がアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ(Acetohydroxy acid isomeroreductase; AHAIR)をコードする遺伝子であるilvCのプロモーター領域(promoter region)の特定位置に同じ変異を含むことが確認された(図1)。具体的には、M4及びM15は、配列番号5で表される配列を含むプロモーター領域の配列における14番目のヌクレオチドであるG、及び17番目のヌクレオチドであるCがTに置換されていることが確認された。配列番号5で表される配列は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム(ATCC14067、ATCC13032及びATCC13869)のilvCのプロモーター領域に共通して含まれる配列である。以下の実施例においては、前記変異がコリネバクテリウム属微生物のアミノ酸の生産量に影響を及ぼすか否かを確認する。
【実施例3】
【0081】
変異を導入した菌株の作製及びバリン生産能の確認
実施例3-1:コリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11201Pに変異を導入した菌株の作製及びバリン生産能の評価
実施例3-1-1:菌株の作製
配列番号5で表されるポリヌクレオチド配列の14番目、17番目のヌクレオチドをTに置換し、その変異をバリン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11201Pに導入するために、ターゲット変異を含むベクターを作製した。
【0082】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるATCC14067菌株のゲノムDNAをG-spinTotalDNA抽出ミニキット(Intron社, Cat. No 17045)を用いて、キットのプロトコルに従って抽出した。前記各ゲノムDNAを鋳型とし、PCRを行った。ilvC遺伝子のプロモーター領域に変異を導入するベクターを作製するために、プライマー1(配列番号21)とプライマー2(配列番号22)のプライマー対、及びプライマー3(配列番号23)とプライマー4(配列番号24)のプライマー対を用いて、DNA断片A、Bをそれぞれ得た。
【0083】
前述した2つの断片を鋳型とし、プライマー1(配列番号21)とプライマー4(配列番号24)を用いてOverlappingPCRを行うことにより、約1.4kbのPCR産物(以下、「変異導入断片」という)が得られた。用いたプライマー配列を表2に示す。
【0084】
【表2】
【0085】
前述したように得られた変異導入断片を制限酵素XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)で処理し、その後同じ制限酵素で処理したpDZベクター(特許文献4)とT4リガーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いてライゲーションした。前述したように作製した遺伝子を大腸菌DH5αに形質転換し、その後それをカナマイシン含有LB培地から選択し、DNA-spinプラスミドDNA精製キット(iNtRON社)によりDNAを得て、組換えプラスミドpDZ-ilvC(Pm3)-14067を作製した。前記ATCC14067のゲノムDNAをコリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるATCC13869及びATCC13032のそれぞれに置換して同じ過程を行い、それぞれpDZ-ilvC(Pm3)-13869及びpDZ-ilvC(Pm3)-13032と命名した組換えプラスミドをさらに作製した。
【0086】
前述したように作製した3種の組換えプラスミドのうちpDZ-ilvC(Pm3)-14067を染色体上での相同組換えにより、L-バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11201Pに形質転換した(非特許文献16)。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/lを含有する培地から選択した。その後、2次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー1及び4を用いたPCRにより、染色体上でilvCプロモーターに変異を導入した菌株KCCM11201P-ilvC(Pm3)を作製した(図2)。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムCA08-1063と命名し、2019年8月21日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(KCCM)に受託番号KCCM12574Pとして寄託した。
【0087】
実施例3-1-2:バリン生産能の評価
バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11201PとKCCM11201P-ilvC(Pm3)のバリン生産能を比較するために、発酵力価評価を行った。各菌株を栄養培地で継代培養し、その後生産培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃、200rpmで72時間振盪培養した。その後、HPLCを用いてL-バリンの濃度を分析した。分析したL-バリンの濃度を表3に示す。
【0088】
<栄養培地(pH7.2)>
グルコース10g,肉汁5g,ポリペプトン10g,塩化ナトリウム2.5g,酵母エキス5g,寒天20g,尿素2g(蒸留水1リットル中)
<生産培地(pH7.0)>
グルコース100g,硫酸アンモニウム40g,大豆タンパク質2.5g,コーンスティープソリッド(Corn Steep Solids)5g,尿素3g,リン酸水素二カリウム1g,硫酸マグネシウム7水塩0.5g,ビオチン100μg,チアミンHCl1mg,パントテン酸カルシウム2mg,ニコチンアミド3mg,炭酸カルシウム30g(蒸留水1リットル中)
【0089】
【表3】
【0090】
これらの結果から、KCCM11201P-ilvC(Pm3)菌株のL-バリン生産能は、対照群に対して11%増加することが確認された。その結果、ilvC遺伝子のプロモーター変異によりL-バリンの生産能が向上することが確認された。
【0091】
実施例3-2:コリネバクテリウム・グルタミカムCJ7Vに変異を導入した菌株の作製及びL-バリン生産能の評価
実施例3-2-1:バリン生産菌株CJ7Vの作製
L-バリンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカム属菌株においても前記と同じ効果があるか否かを確認するために、野生株コリネバクテリウム・グルタミカムATCC14067に1種の変異[ilvN(A42V);非特許文献12]を導入してL-バリン生産能が向上した菌株を作製した。
【0092】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム野生型であるATCC14067菌株のゲノムDNAをG-spinTotalDNA抽出ミニキット(Intron社, Cat. No 17045)を用いて、キットのプロトコルに従って抽出した。前記ゲノムDNAを鋳型とし、PCRを行った。ilvN遺伝子にA42V変異を導入するベクターを作製するために、プライマー5(配列番号25)とプライマー6(配列番号26)のプライマー対、及びプライマー7(配列番号27)とプライマー8(配列番号28)のプライマー対を用いて、遺伝子断片A、Bをそれぞれ得た。PCRの条件は、94℃で5分間の変性後、94℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で60秒間の重合を25サイクル行い、次いで72℃で7分間の重合反応を行うものとした。用いたプライマー配列を表4に示す。
【0093】
【表4】
【0094】
その結果、断片A、Bのどちらも537bpのポリヌクレオチドが得られた。前述した2つの断片を鋳型とし、プライマー5(配列番号25)とプライマー8(配列番号28)を用いてOverlappingPCRを行うことにより、1044bpのPCR産物(以下、「変異導入断片」という)が得られた。
【0095】
前述したように得られた変異導入断片を制限酵素XbaI(New England Biolabs, Beverly, MA)で処理し、その後同じ制限酵素で処理したpDZベクターとT4リガーゼ(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いてライゲーションした。前述したように作製した遺伝子を大腸菌DH5αに形質転換し、その後それをカナマイシン含有LB培地から選択し、DNA-spinプラスミドDNA精製キット(iNtRON社)によりDNAを得た。前記ilvN遺伝子へのA42V変異導入を目的とするベクターをpDZ-ilvN(A42V)と命名した。
【0096】
その後、前述したように作製した組換えプラスミドpDZ-ilvN(A42V)を染色体上での相同組換えにより、野生型であるコリネバクテリウム・グルタミカムATCC14067に形質転換した(非特許文献16)。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/lを含有する培地から選択した。その後、2次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー5及び8を用いたPCRにより遺伝子断片を増幅し、次いで遺伝子配列分析により変異導入菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムCJ7Vと命名した。
【0097】
実施例3-2-2:バリン生産能の評価
実施例3-2-1で作製したL-バリン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカムCJ7Vを対象に、実施例3-1と同様にpDZ-ilvC(Pm3)-14067を形質転換させてilvC遺伝子のプロモーターに変異を導入した菌株を作製し、CJ7V-ilvC(Pm3)と命名した(図3)。作製した菌株のL-バリン生産能を比較するために、実施例3-1と同様に培養してL-バリンの濃度を分析した。分析したL-バリンの濃度を表5に示す。
【0098】
【表5】
【0099】
これらの結果から、CJ7V-ilvC(Pm3)菌株のL-バリン生産能は、対照群に対して14%増加することが確認された。すなわち、コリネバクテリウム属微生物においてilvC遺伝子のプロモーター変異によりL-バリンの生産能が向上することが再度確認された。
【0100】
実施例3-3:コリネバクテリウム・グルタミカムCJ8Vに変異を導入した菌株の作製及びL-バリン生産能の評価
実施例3-3-1:バリン生産菌株CJ8Vの作製
L-バリンを生産するさらに他のコリネバクテリウム・グルタミカム属菌株においても前記と同じ効果があるか否かを確認するために、実施例3-2と同様に野生株コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869に1種の変異[ilvN(A42V)]を導入してL-バリン生産能を有する変異株を作製し、前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムCJ8Vと命名した。
【0101】
実施例3-3-2:バリン生産能の評価
実施例3-3-1で作製したL-バリン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカムCJ8Vを対象に、ilvCプロモーター変異を導入した菌株の作製を試みた。よって、実施例3-1-1で作製した組換えベクターpDZ-ilvC(Pm3)-14067、pDZ-ilvC(Pm3)-13869をそれぞれCJ8Vに形質転換した(非特許文献16)。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/lを含有する培地から選択した。その後、2次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー1及び4を用いたPCRにより、染色体上でilvCプロモーターに変異を導入した菌株CJ8V-ilvC(Pm3)とCJ8V-ilvC(Pm3)-2を作製した(図4)。前記組換え菌株のうちCJ8V-ilvC(Pm3)-2をコリネバクテリウム・グルタミカムCA08-2034と命名し、2019年8月21日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(KCCM)に受託番号KCCM12575Pとして寄託した。
【0102】
作製した前記菌株のL-バリン生産能を比較するために、実施例3-1と同様に培養してL-バリンの濃度を分析した。分析したL-バリンの濃度を表6に示す。
【0103】
【表6】
【0104】
これらの結果から、CJ8V-ilvC(Pm3)及びCJ8V-ilvC(Pm3)-2菌株のL-バリン生産能は、どちらも対照群に対して8.6%増加することが確認された。すなわち、コリネバクテリウム属微生物においてilvC遺伝子のプロモーター変異によりL-バリンの生産能が向上することが再度確認された。
【実施例4】
【0105】
イソロイシン生産菌株の作製及び生産能の評価
実施例4-1:L-イソロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11248P菌株にilvCプロモーター変異を導入した菌株の作製及び評価
実施例3と同様に、L-イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11248P(特許文献5)に実施例3-1で作製した組換えプラスミドpDZ-ilvC(Pm3)-14067及びpDZ-ilvC(Pm3)-13869を染色体上での相同組換えにより導入した菌株を作製し、それぞれKCCM11248P::ilvC(Pm3)及びKCCM11248P::ilvC(Pm3)-2と命名した(図5)。作製した菌株を次の方法で培養し、イソロイシン生産能を比較した。
【0106】
種培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃、200rpmで20時間振盪培養した。次に、生産培地24mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃、200rpmで48時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
【0107】
<種培地(pH7.0)>
グルコース20g,ペプトン10g,酵母エキス5g,尿素1.5g,KHPO4g,KHPO8g,MgSO7HO0.5g,ビオチン100μg,チアミンHCl1000μg,パントテン酸カルシウム2000μg,ニコチンアミド2000μg(蒸留水1リットル中)
<生産培地(pH7.0)>
グルコース50g,(NHSO 12.5g,大豆タンパク質2.5g,コーンスティープソリッド(Corn Steep Solids)5g,尿素3g,KHPO1g,MgSO7HO0.5g,ビオチン100μg,チアミン塩酸塩1000μg,パントテン酸カルシウム2000μg,ニコチンアミド3000μg,CaCO30g(蒸留水1リットル中)
培養終了後に、HPLCによりL-イソロイシンの生産能を測定した。実験を行った各菌株における培養液中のL-イソロイシン濃度を表7に示す。
【0108】
【表7】
【0109】
表7に示すように、L-イソロイシン生産菌株KCCM11248Pに比べて、ilvCプロモーター強化変異を導入したKCCM11248P::ilvC(Pm3)及びKCCM11248::ilvC(Pm3)-2においては、L-イソロイシンの濃度がそれぞれ約32.3%、約27.8%増加することが確認された。よって、ilvC遺伝子のプロモーター変異によりL-イソロイシンの生産能が向上することが確認された。これらの結果は、コリネバクテリウム属L-イソロイシン生産菌株においてilvCプロモーター変異の導入がL-イソロイシン生産に効果的であることを示すものである。
【0110】
実施例4-2:コリネバクテリウム・グルタミカム野生株ATCC13032にilvCプロモーター変異を導入したL-イソロイシン菌株の作製及びL-イソロイシン生産能の評価
ilvCプロモーター導入によるL-イソロイシン生産能に及ぼす効果を確認するために、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032(以下、WT)菌株をベースにlysC(L377K)変異体(特許文献6)とhom(G378E)変異体(非特許文献13)を導入して菌株を作製し、公知のトレオニンデヒドラターゼ(L-threonine dehydratase)をコードする遺伝子にilvA(V383A)変異(非特許文献14)を導入してL-イソロイシン生産能を比較した。用いたプライマー配列を表8に示す。
【0111】
【表8】
【0112】
実施例4-2-1:L377K変異の導入
WTの染色体を鋳型とし、プライマー9とプライマー10のプライマー対、又はプライマー11とプライマー12のプライマー対を用いてPCRを行った。95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の重合を30サイクル行い、次いで72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、lysC遺伝子の変異を中心に、5’末端上流の509bpのDNA断片と、3’末端下流の520bpのDNA断片がそれぞれ得られた。
【0113】
増幅された2つのDNA断片を鋳型とし、プライマー9とプライマー12のプライマー対によりPCRを行った。95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で60秒間の重合を30サイクル行い、次いで72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、377番目のロイシンがリシンに置換されたアスパルトキナーゼ変異体をコードするlysC遺伝子の変異を含む1011bpのDNA断片が増幅された。
【0114】
コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なpDZベクターと1011bpのDNA断片を制限酵素XbaIで処理し、次いでDNA接合酵素を用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得て、それをpDZ-lysC(L377K)と命名した。
【0115】
このようにして得たpDZ-lysC(L377K)ベクターをWT菌株に電気パルス法(非特許文献16)で導入し、その後カナマイシン(kanamycin)25mg/Lを含有する選択培地から形質転換菌株を得た。2次組換え過程(cross-over)を経て、染色体上に挿入されたDNA断片によりlysC遺伝子にヌクレオチド変異を導入した菌株WT::lysC(L377K)を得た。
【0116】
実施例4-2-2:G378E変異の導入
hom(G378E)変異を導入するベクターを作製するために、WT genomicDNAを鋳型とし、プライマー13とプライマー14のプライマー対、プライマー15とプライマー16のプライマー対を用いて、それぞれPCRを行った。PCR条件は、95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の重合を30サイクル行い、次いで72℃で7分間の重合反応を行うものとした。その結果、hom遺伝子の変異を中心に、5’末端上流の220bpのDNA断片と、3’末端下流の220bpのDNA断片が得られた。この2つのPCRproductを鋳型とし、プライマー13とプライマー16のプライマー対を用いてPCRを行った。95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の重合を30サイクル行い、次いで72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、hom遺伝子の変異を含む440bpのDNA断片が増幅された。用いたプライマー配列を表9に示す。
【0117】
【表9】
【0118】
前述したpDZベクターと440bpのDNA断片を制限酵素XbaIで処理し、次いでDNA接合酵素を用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得て、それをpDZ-hom(G378E)と命名した。
【0119】
このようにして得たpDZ-hom(G378E)ベクターを実施例4-2-1で作製したWT::lysC(L377K)菌株に電気パルス法で導入し、その後カナマイシン25mg/Lを含有する選択培地から形質転換菌株を得た。2次組換え過程(cross-over)を経て、染色体上に挿入されたDNA断片によりhom遺伝子にヌクレオチド変異を導入した菌株WT::lysC(L377K)-hom(G378E)を得た。
【0120】
実施例4-2-3:ilvCプロモーター変異の導入
前記実施例と同様に、実施例4-2-2で作製したWT::lysC(L377K)-hom(G378E)菌株に実施例3-1で作製した組換えプラスミドpDZ-ilvC(Pm3)-14067及びpDZ-ilvC(Pm3)-13032を染色体上での相同組換えにより導入した菌株を作製し、それぞれWT::lysC(L377K)-hom(G378E)-ilvC(Pm3)及びWT::lysC(L377K)-hom(G378E)-ilvC(Pm3)-3と命名した。
【0121】
実施例4-2-4:ilvA変異の導入
ilvA遺伝子を対象に、公知のilvA(V383A)変異(非特許文献14)を導入したベクターを作製するために、変異位置を中心に、5’末端上流を増幅するためのプライマー1対(プライマー17及び18)と、3’末端下流を増幅するためのプライマー1対(プライマー19及び20)を考案した。プライマー17及び20の各末端にBamHI制限酵素部位(下線表示)を挿入し、プライマー18及び19は交差するように考案した部位にヌクレオチド置換変異(下線表示)が位置するようにした。用いたプライマー配列を表10に示す。
【0122】
【表10】
【0123】
増幅された2つのDNA断片を鋳型とし、プライマー17及びWTの染色体を鋳型とし、プライマー17とプライマー18のプライマー対、プライマー19とプライマー20のプライマー対を用いてPCRを行った。PCR条件は、95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の重合を30サイクル行い、次いで72℃で7分間の重合反応を行うものとした。その結果、ilvA遺伝子の変異を中心に、5’末端上流の627bpのDNA断片と、3’末端下流の608bpのDNA断片が得られた。プライマー20のプライマー対によりPCRを行った。95℃で5分間の変性後、95℃で30秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で60秒間の重合を30サイクル行い、次いで72℃で7分間の重合反応を行った。その結果、383番目のバリンがアラニンに置換されたIlvA変異体をコードするilvA遺伝子の変異を含む1217bpのDNA断片が増幅された。
【0124】
pECCG117(特許文献7)ベクターと1011bpのDNA断片を制限酵素BamHIで処理し、DNA接合酵素を用いて連結し、その後クローニングすることによりプラスミドを得て、それをpECCG117-ilvA(V383A)と命名した。
【0125】
pECCG117-ilvA(V383A)ベクターを前記実施例のATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)及びATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)-3に導入した菌株をそれぞれ作製し、ATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)/pECCG117-ilvA(V383A)及びATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)-3/pECCG117-ilvA(V383A)とそれぞれ命名した(図6)。また、その対照群として、ATCC13032::-hom(G378E)-lysC(L377K)にilvA(V383A)変異のみ導入した菌株も作製した。
【0126】
実施例4-2-5:イソロイシン生産能の評価
実施例4-1のフラスコ培養法と同様に培養し、培養液中のL-イソロイシン濃度を分析した。
【0127】
【表11】
【0128】
表11に示すように、野生型菌株ATCC13032::-hom(G378E)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V383A)に比べて、ilvC変異を含むATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)/pECCG117-ilvA(V383A)とATCC13032::hom(G378E)-lysC(L377K)-ilvC(Pm3)-3/pECCG117-ilvA(V383A)においては、L-イソロイシンの濃度が約25%、約24%増加することが確認された。これらの結果は、コリネバクテリウム属L-イソロイシン生産菌株においてilvCプロモーター変異の導入がL-イソロイシン生産に効果的であることを示すものである。
【実施例5】
【0129】
ロイシン生産菌株の作製及び生産能の確認
実施例5-1:L-ロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11661P、KCCM11662P菌株にilvCプロモーター変異を導入した菌株の作製及びロイシン生産能の評価
実施例3-1で作製した組換えプラスミドpDZ-ilvC(Pm3)-14067を染色体上での相同組換えにより、L-ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11661P(特許文献8)、KCCM11662P(特許文献8)に形質転換した(非特許文献16)。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン(kanamycin)25mg/lを含有する培地から選択した。その後、2次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー1及び4を用いたPCRにより、染色体上でilvCプロモーターに変異を導入した菌株を作製した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11661P-ilvC(Pm3)及びKCCM11662P-ilvC(Pm3)と命名した(図7)。ロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKCCM11661P-ilvC(Pm3)及びKCCM11662P-ilvC(Pm3)のロイシン生成能を比較するために、発酵力価評価を行った。各菌株を栄養培地で継代培養し、その後生産培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃、200rpmで72時間振盪培養した。その後、HPLCを用いてL-ロイシンの濃度を分析した。分析したL-ロイシンの濃度を表12に示す。
【0130】
<栄養培地(pH7.2)>
グルコース10g,肉汁5g,ポリペプトン10g,塩化ナトリウム2.5g,酵母エキス5g,寒天20g,尿素2g(蒸留水1リットル中)
<生産培地(pH7.0)>
グルコース50g,硫酸アンモニウム20g,コーンスティープソリッド(Corn Steep Solids)20g,リン酸水素二カリウム1g,硫酸マグネシウム7水塩0.5g,ビオチン100μg,チアミンHCl 1mg,炭酸カルシウム15g(蒸留水1リットル中)
【0131】
【表12】
【0132】
これらの結果から、KCCM11661P-ilvC(Pm3)及びKCCM11662P-ilvC(Pm3)菌株のL-ロイシン生産能は、対照群に対して約11%及び約10%増加することが確認された。よって、ilvC遺伝子のプロモーター変異によりL-ロイシンの生産能が向上することが確認された。
【0133】
実施例5-2:ロイシン生産菌株コリネバクテリウム・グルタミカムCJL8001に変異を導入した菌株の作製及びL-ロイシン生産能の評価
L-ロイシンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカム属菌株においても前記と同じ効果があるか否かを確認するために、野生株コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032に1種の変異[leuA(R558H,G561D);特許文献2]を導入してL-ロイシン生産能が向上した菌株を作製した。
【0134】
具体的には、前記特許で作製された組換えプラスミドpDZ-leuA(R558H,G561D)を染色体上での相同組換えにより、野生型であるコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032に形質転換した(非特許文献16)。その後、2次組換えが完了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、遺伝子配列分析により変異導入菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムCJL8001と命名した。
【0135】
最後に、L-ロイシン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカムCJL8001を対象に、実施例5-1と同様にpDZ-ilvC(Pm3)-14067及びpDZ-ilvC(Pm3)-13032ベクターを形質転換し、ilvC遺伝子のプロモーターに変異を導入した菌株CJL8001-ilvC(Pm3)及びCJL8001-ilvC(Pm3)-3を作製し(図8)、CJL8001-ilvC(Pm3)-3をコリネバクテリウム・グルタミカムCA13-8101と命名し、2019年8月21日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(KCCM)に受託番号KCCM12576Pとして寄託した。
【0136】
作製した菌株のL-ロイシン生産能を比較するために、実施例5-1と同様に培養してL-ロイシンの濃度を分析した。分析したL-ロイシンの濃度を表13に示す。
【0137】
【表13】
【0138】
これらの結果から、CJL8001-ilvC(Pm3)及びCJL8001-ilvC(Pm3)-3菌株のL-ロイシン生産能は、どちらも対照群に対して約15%増加することが確認された。すなわち、コリネバクテリウム属微生物においてilvC遺伝子のプロモーター変異によりL-ロイシン生産能が向上することが再度確認された。
【0139】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【0140】
【表14】
【0141】
【表15】
【0142】
【表16】
図1
図2
図3
図4
図5
図6
図7
図8
【配列表】
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