特許7351323共焦点スキャナ、共焦点スキャナシステム、及び共焦点顕微鏡システム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-19
(45)【発行日】2023-09-27
(54)【発明の名称】共焦点スキャナ、共焦点スキャナシステム、及び共焦点顕微鏡システム
(51)【国際特許分類】
G02B 21/06 20060101AFI20230920BHJP
G02B 21/00 20060101ALI20230920BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20230920BHJP
【ＦＩ】
G02B21/06
G02B21/00
G01N21/64 E
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021094660
(22)【出願日】2021-06-04
(65)【公開番号】P2022186438
(43)【公開日】2022-12-15
【審査請求日】2022-10-13
(73)【特許権者】
【識別番号】000006507
【氏名又は名称】横河電機株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100169823
【弁理士】
【氏名又は名称】吉澤 雄郎
(74)【代理人】
【識別番号】100202326
【弁理士】
【氏名又は名称】橋本 大佑
(72)【発明者】
【氏名】景 虹之
【審査官】岡田 弘
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５２４１９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１０－０６２６９１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平０９－１６６７５１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１０－１６１０３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００５／００９４２６１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許第０５７６０９５０（ＵＳ，Ａ）
【文献】米国特許第０４９１７４７８（ＵＳ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０２Ｂ １９／００－２１／００
Ｇ０２Ｂ ２１／０６－２１／３６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の第１ピンホールがアレイ状に配置されている第１ピンホールアレイディスクと、複数の第２ピンホールがアレイ状に配置されている第２ピンホールアレイディスクと、
複数の集光素子がアレイ状に配置されている集光素子アレイディスクであって、前記第１ピンホールアレイディスクと前記第２ピンホールアレイディスクとの間に位置する前記集光素子アレイディスクと、
前記第１ピンホールアレイディスク、前記第２ピンホールアレイディスク、及び前記集光素子アレイディスクを連結する連結軸と、
前記連結軸と共に前記第１ピンホールアレイディスク、前記第２ピンホールアレイディスク、及び前記集光素子アレイディスクを回転させるモータと、
を備え、
前記第１ピンホールアレイディスクは、前記集光素子アレイディスクにおける一の前記集光素子の第１焦点面に、一の前記第１ピンホールが、各々、位置するように前記連結軸に取り付けられ、
前記第２ピンホールアレイディスクは、前記集光素子アレイディスクにおける一の前記集光素子の第２焦点面に、一の前記第２ピンホールが、各々、位置するように前記連結軸に取り付けられている、
共焦点スキャナ。
【請求項2】
前記第１ピンホールアレイディスクと前記集光素子アレイディスクとの間、及び前記第２ピンホールアレイディスクと前記集光素子アレイディスクとの間の少なくとも一方に配置されている分岐素子をさらに備える、請求項１に記載の共焦点スキャナ。
【請求項3】
前記複数の第１ピンホールは、前記第１ピンホールアレイディスクにおいて等ピッチでかつ螺旋状に配置され、前記複数の第２ピンホールは、前記第２ピンホールアレイディスクにおいて等ピッチでかつ螺旋状に配置されている、
請求項１又は２に記載の共焦点スキャナ。
【請求項4】
前記第１ピンホールアレイディスクにおける前記複数の第１ピンホールの配置と前記第２ピンホールアレイディスクにおける前記複数の第２ピンホールの配置とは互いに同一である、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の共焦点スキャナ。
【請求項5】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の共焦点スキャナと、前記第１ピンホールアレイディスクと前記集光素子アレイディスクとの組み合わせである第１共焦点スキャナを含む第１光学系であって、前記第１共焦点スキャナを通過して試料を含む顕微鏡まで第１照射光を導き、かつ第１共焦点像に寄与する、前記第１照射光に基づく前記試料からの第１被測定光を第１検出器まで導く前記第１光学系と、
前記第２ピンホールアレイディスクと前記集光素子アレイディスクとの組み合わせである第２共焦点スキャナを含む第２光学系であって、前記第２共焦点スキャナを通過して前記顕微鏡まで第２照射光を導き、かつ第２共焦点像に寄与する、前記第２照射光に基づく前記試料からの第２被測定光を第２検出器まで導く前記第２光学系と、
を備える、
共焦点スキャナシステム。
【請求項6】
前記第１光学系は、前記第１ピンホールアレイディスクのピンホール面と、前記顕微鏡の像面と、を共役関係に結ぶ第１組のリレーレンズと、前記第１ピンホールアレイディスクのピンホール面と、前記第１検出器の受光面と、を共役関係に結ぶ第２組のリレーレンズと、を含む、請求項５に記載の共焦点スキャナシステム。
【請求項7】
請求項５又は６に記載の共焦点スキャナシステムと、前記共焦点スキャナシステムに入射する前記第１照射光を照射する第１光源と、
前記共焦点スキャナシステムに入射する前記第２照射光を照射する第２光源と、
前記第１照射光及び前記第２照射光が照射される前記試料を含む前記顕微鏡と、
前記試料からの前記第１被測定光を検出する前記第１検出器と、
前記試料からの前記第２被測定光を検出する前記第２検出器と、
を備える、
共焦点顕微鏡システム。
【請求項8】
前記第１ピンホールの径は前記第１照射光の波長に基づいて定められ、前記第２ピンホールの径は前記第２照射光の波長に基づいて定められている、
請求項７に記載の共焦点顕微鏡システム。
【請求項9】
前記第１光源は第１波長及び第３波長を有する第１照射光を照射し、前記第２光源は第２波長及び第４波長を有する第２照射光を照射し、
前記第１検出器は前記第１波長及び前記第３波長に基づく前記第１被測定光をそれぞれ検出する一対の検出器を含み、
前記第２検出器は前記第２波長及び前記第４波長に基づく前記第２被測定光をそれぞれ検出する一対の検出器を含み、
各波長は、前記第１波長、前記第２波長、前記第３波長、及び前記第４波長の順に長い、
請求項７又は８に記載の共焦点顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、共焦点スキャナ、共焦点スキャナシステム、及び共焦点顕微鏡システムに関する。
【背景技術】
【0002】
従来、共焦点顕微鏡システムにおいて用いられる、マイクロレンズ付きニポウディスク方式の共焦点スキャナに関する技術が知られている。
【0003】
例えば、特許文献１には、複数の照明及び発光波長で調査対象の試料を同時に照明及び検出するときの、被測定光としての発光放出の間のクロストーク、すなわち異なる波長のビームの相互干渉を抑制するための装置が記載されている。このような装置では、一組のピンホールアレイディスク及び集光素子アレイディスクからなる共焦点スキャナにおいて異なる箇所に第１の照明波長の照明光及び第２の照明波長の照明光がそれぞれ照射される。共焦点スキャナを通過したこれらの照明光の少なくとも一方は、共焦点スキャナと対物レンズとの間に位置するビームスプリッタデバイスによって偏向される。これにより、試料における各照明光の照射位置が互いに重ならず、クロストークの抑制につながる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特許第６４８４２３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、このような従来技術では偏向の量が数百マイクロメートル程度と非常に小さく、照明光の偏向に関して精密な調整が要求される。したがって、装置の製造及び管理が容易ではない。加えて、装置を長時間稼働し続けるような場合、照明光の偏向の経時変化も課題となる。
【0006】
本開示は、光学系に対する精密な調整を必要とせずに被測定光間のクロストークを抑制可能な共焦点スキャナ、共焦点スキャナシステム、及び共焦点顕微鏡システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
幾つかの実施形態に係る共焦点スキャナは、複数の第１ピンホールがアレイ状に配置されている第１ピンホールアレイディスクと、複数の第２ピンホールがアレイ状に配置されている第２ピンホールアレイディスクと、複数の集光素子がアレイ状に配置されている集光素子アレイディスクであって、前記第１ピンホールアレイディスクと前記第２ピンホールアレイディスクとの間に位置する前記集光素子アレイディスクと、前記第１ピンホールアレイディスク、前記第２ピンホールアレイディスク、及び前記集光素子アレイディスクを連結する連結軸と、前記連結軸と共に前記第１ピンホールアレイディスク、前記第２ピンホールアレイディスク、及び前記集光素子アレイディスクを回転させるモータと、を備え、前記第１ピンホールアレイディスクは、前記集光素子アレイディスクにおける一の前記集光素子の第１焦点面に一の前記第１ピンホールが位置するように前記連結軸に取り付けられ、前記第２ピンホールアレイディスクは、前記集光素子アレイディスクにおける一の前記集光素子の第２焦点面に一の前記第２ピンホールが位置するように前記連結軸に取り付けられている。
【0008】
これにより、光学系に対する精密な調整を必要とせずに被測定光間のクロストークを抑制可能である。例えば、共焦点スキャナは、第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナによる試料上の励起部位が重複しないように照射光の方向を偏向させる従来技術のような光学素子を必要としない。共焦点スキャナは、従来技術のような精度の高い機構調整を必要とすることなく、２枚のピンホールアレイディスクを用いることで、これらのディスク自体によって第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナによる試料上の励起部位の重複を抑制可能である。したがって、装置の組立調整が容易であり、装置のロバスト性が容易に得られる。
【0009】
一実施形態における共焦点スキャナは、前記第１ピンホールアレイディスクと前記集光素子アレイディスクとの間、及び前記第２ピンホールアレイディスクと前記集光素子アレイディスクとの間の少なくとも一方に配置されている分岐素子をさらに備えてもよい。これにより、共焦点スキャナは、光源からの照射光の光路と顕微鏡における試料からの蛍光の光路とを切り分けることが可能である。共焦点スキャナが２つの分岐素子の両方を有することで、第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナのいずれに対しても同様の効果が得られる。
【0010】
一実施形態における共焦点スキャナでは、前記複数の第１ピンホールは、前記第１ピンホールアレイディスクにおいて等ピッチでかつ螺旋状に配置され、前記複数の第２ピンホールは、前記第２ピンホールアレイディスクにおいて等ピッチでかつ螺旋状に配置されていてもよい。これにより、共焦点スキャナは、第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナのいずれにおいても、顕微鏡上の試料に対する光源からの照射光の高速スキャンを実現可能である。
【0011】
一実施形態における共焦点スキャナでは、前記第１ピンホールアレイディスクにおける前記複数の第１ピンホールの配置と前記第２ピンホールアレイディスクにおける前記複数の第２ピンホールの配置とは互いに同一であってもよい。これにより、共焦点スキャナの設計がさらに容易になる。
【0012】
幾つかの実施形態に係る共焦点スキャナシステムは、上記のいずれかの共焦点スキャナと、前記第１ピンホールアレイディスクと前記集光素子アレイディスクとの組み合わせである第１共焦点スキャナを含む第１光学系であって、前記第１共焦点スキャナを通過して試料を含む顕微鏡まで第１照射光を導き、かつ第１共焦点像に寄与する、前記第１照射光に基づく前記試料からの第１被測定光を第１検出器まで導く前記第１光学系と、前記第２ピンホールアレイディスクと前記集光素子アレイディスクとの組み合わせである第２共焦点スキャナを含む第２光学系であって、前記第２共焦点スキャナを通過して前記顕微鏡まで第２照射光を導き、かつ第２共焦点像に寄与する、前記第２照射光に基づく前記試料からの第２被測定光を第２検出器まで導く前記第２光学系と、を備えてもよい。
【0013】
これにより、光学系に対する精密な調整を必要とせずに被測定光間のクロストークを抑制可能である。例えば、共焦点スキャナシステムは、第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナによる試料上の励起部位が重複しないように照射光の方向を偏向させる従来技術のような光学素子を必要としない。共焦点スキャナシステムは、従来技術のような精度の高い機構調整を必要とすることなく、２枚のピンホールアレイディスクを用いることで、これらのディスク自体によって第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナによる試料上の励起部位の重複を抑制可能である。したがって、装置の組立調整が容易であり、装置のロバスト性が容易に得られる。
【0014】
一実施形態における共焦点スキャナシステムでは、前記第１光学系は、前記第１ピンホールアレイディスクのピンホール面と、前記顕微鏡の像面と、を共役関係に結ぶ第１組のリレーレンズと、前記第１ピンホールアレイディスクのピンホール面と、前記第１検出器の受光面と、を共役関係に結ぶ第２組のリレーレンズと、を含んでもよい。これにより、第１ピンホールアレイディスクのピンホール面、顕微鏡の像面、及び第１検出器の受光面の間で共役関係を維持した状態で光学系を適切に構築することが可能である。
【0015】
幾つかの実施形態に係る共焦点顕微鏡システムは、上記のいずれかの共焦点スキャナシステムと、前記共焦点スキャナシステムに入射する前記第１照射光を照射する第１光源と、前記共焦点スキャナシステムに入射する前記第２照射光を照射する第２光源と、前記第１照射光及び前記第２照射光が照射される前記試料を含む前記顕微鏡と、前記試料からの前記第１被測定光を検出する前記第１検出器と、前記試料からの前記第２被測定光を検出する前記第２検出器と、を備えてもよい。
【0016】
これにより、光学系に対する精密な調整を必要とせずに被測定光間のクロストークを抑制可能である。例えば、共焦点顕微鏡システムは、第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナによる試料上の励起部位が重複しないように照射光の方向を偏向させる従来技術のような光学素子を必要としない。共焦点顕微鏡システムは、従来技術のような精度の高い機構調整を必要とすることなく、２枚のピンホールアレイディスクを用いることで、これらのディスク自体によって第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナによる試料上の励起部位の重複を抑制可能である。したがって、装置の組立調整が容易であり、装置のロバスト性が容易に得られる。
【0017】
一実施形態における共焦点顕微鏡システムでは、前記第１ピンホールの径は前記第１照射光の波長に基づいて定められ、前記第２ピンホールの径は前記第２照射光の波長に基づいて定められていてもよい。照射光の波長に比例してピンホール径を設計することで、照射光の透過率及び共焦点性が異なるピンホールアレイディスクに対して互いに等しくなり、バランスの取れた共焦点画像を得ることが可能となる。
【0018】
一実施形態における共焦点顕微鏡システムでは、前記第１光源は第１波長及び第３波長を有する第１照射光を照射し、前記第２光源は第２波長及び第４波長を有する第２照射光を照射し、前記第１検出器は前記第１波長及び前記第３波長に基づく前記第１被測定光をそれぞれ検出する一対の検出器を含み、前記第２検出器は前記第２波長及び前記第４波長に基づく前記第２被測定光をそれぞれ検出する一対の検出器を含み、各波長は、前記第１波長、前記第２波長、前記第３波長、及び前記第４波長の順に長くてもよい。これにより、共焦点顕微鏡システムは、４色での撮影によって共焦点画像を得ることが可能である。
【発明の効果】
【0019】
本開示によれば、光学系に対する精密な調整を必要とせずに被測定光間のクロストークを抑制可能な共焦点スキャナ、共焦点スキャナシステム、及び共焦点顕微鏡システムを提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】一実施形態に係る共焦点顕微鏡システムの構成の一例を示す模式図である。
【図2】第１ピンホールアレイディスクの一例を上方から見たときの模式図である。
【図4】第１光学系及び第２光学系に共通に用いられるダイクロイックミラーの波長特性を示す模式図である。
【図5】集光素子アレイディスクの一例を上方から見たときの模式図である。
【図6A】第１ピンホールアレイディスクの一例を上方から見たときの模式図である。
【図6B】第２ピンホールアレイディスクの一例を下方から見たときの模式図である。
【図6C】本開示の効果を説明するための模式図である。
【図7】蛍光のクロストークを説明するための模式図である。
【図8A】従来技術の問題点を説明するための第１模式図である。
【図8B】従来技術の問題点を説明するための第２模式図である。
【図8C】従来技術の問題点を説明するための第３模式図である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
従来技術の背景及び問題点についてより詳細に説明する。
【0022】
従来技術における、マイクロレンズ付きニポウディスク方式の共焦点スキャナの代表的な構成について説明する。このような共焦点スキャナは、ピンホールアレイディスクを有する。ピンホールアレイディスクは、顕微鏡の対物レンズで観察する焦点面のみの信号光を通過させる。共焦点スキャナは、焦点面以外のノイズ光を遮断する。このようなピンホールによって共焦点画像が得られる。
【0023】
共焦点スキャナは、マイクロレンズアレイディスクをさらに有する。マイクロレンズアレイディスクは、顕微鏡上の試料に照射する照明光の利用効率を向上させる。ピンホールアレイディスク上に形成されている各ピンホールの位置とマイクロレンズアレイディスク上に形成されている集光手段としての各マイクロレンズの位置とは、互いに一対一の関係にある。
【0024】
共焦点スキャナは、ピンホールアレイディスク及びマイクロレンズアレイディスクを連結する連結軸をさらに有する。ピンホールアレイディスク及びマイクロレンズアレイディスクが取り付けられた連結軸の先端はモータに取り付けられている。モータは、連結軸と共にピンホールアレイディスク及びマイクロレンズアレイディスクを互いに同一方向に回転させる。共焦点スキャナは、照明光の光路と信号光の光路とを分けるためのビームスプリッタをさらに有する。
【0025】
ピンホールアレイディスク及びマイクロレンズアレイディスクをモータで互いに同一方向に回転させることにより、共焦点スキャナの機能が達成される。以上のような従来技術では、ピンホールアレイディスク上のピンホール径は１種類であり固定化されている。
【0026】
以上のようなマイクロレンズ付きニポウディスク方式の共焦点スキャナの問題点は、試料に含まれる異なる蛍光色素、例えば蛍光タンパクの間に蛍光のクロストークが存在することである。このような問題点は、蛍光イメージングに基づくハイコンテントアナリシスシステム、創薬支援装置、落射蛍光顕微鏡、及び共焦点蛍光顕微鏡などに共通する。
【0027】
蛍光色素の蛍光スペクトルは広い波長帯域に分布する。したがって、多重染色した試料にある複数の蛍光色素を同時に励起した場合、互いの蛍光が有する波長帯域で重複する部分が生じ得る。このような重複する部分が蛍光のクロストークと呼ばれる。蛍光のクロストークが生じると、本来蛍光信号が存在しないはずの細胞の画像に他の蛍光色素から蛍光が映り込み、蛍光信号として誤認識される。これがアーティファクトとなり、画像解析の精度の低下を招く。
【0028】
図７は、蛍光のクロストークを説明するための模式図である。例えば、図７に示すとおり、第１の蛍光と第２の蛍光が幅広い波長帯域にわたって存在する。このような第１の蛍光及び第２の蛍光の２つの蛍光を分離してイメージングする場合、ダイクロイックミラーを利用する。例えば、ダイクロイックミラーは、第１の蛍光を反射させ、第２の蛍光を透過させる。さらに、第１の蛍光フィルタ及び第２の蛍光フィルタを用いる。しかしながら、図７に示すとおり、２つの蛍光のうちの一方は他方の蛍光フィルタの波長帯域にまで存在する場合がある。図７においてハッチングにより示されている部分がクロストークとなる。
【0029】
特許文献１に記載の発明は、蛍光のクロストークを抑制することを目的とする。特許文献１に記載の装置は、一組のピンホールアレイディスク及びマイクロレンズアレイディスクを有する共焦点スキャナにおいて系統を２つ有する。装置は、各系統で試料の異なる部位にある異なる波長の蛍光色素を励起し、励起によって生じる蛍光をそれぞれの系統で集光する。共焦点スキャナの系統は波長別に分けられている。２つの系統は、最終的にはビームスプリッタデバイス及び偏光デバイスなどの光学素子を介して顕微鏡に接続されている。
【0030】
【0031】
特許文献１に記載の装置では、共焦点スキャナにおける２つの系統のそれぞれの走査及び励起範囲は、図８Ａの破線囲み部及び実線囲み部によってそれぞれ示す第１マスク領域及び第２マスク領域に対応する。当該２つの領域は１枚のニポウディスク上に設けられ、同一形状で螺旋状に配置されているピンホールによって走査される。
【0032】
図８Ａに示すとおり、第１マスク領域と第２マスク領域とは互いに回転対称の位置関係にある。第１マスク領域と第２マスク領域とは同一形状で螺旋状に配置されているピンホールによって走査されるため、このまま顕微鏡に接続した場合、第１マスク領域に対応する走査範囲と第２マスク領域に対応する走査範囲とは完全に一致する。例えば図８Ｂに示すとおり、第２マスク領域に対応する走査範囲が１８０°回転した状態で第１マスク領域に対応する走査範囲に重なる。また、その逆で、第１マスク領域に対応する走査範囲が１８０°回転した状態で第２マスク領域に対応する走査範囲に重なる。
【0033】
共焦点スキャナにおける２つの系統に対してその後の光学系が理想的に調整されている場合、第１マスク領域のピンホール像及び第２マスク領域のピンホール像も試料上で一致する。したがって、共焦点スキャナにおける２つの系統は、細胞試料の同一部位を励起することになり、同一部位からの蛍光を集光することになる。この場合、共焦点スキャナにおける２つの系統は異なる系統として機能せず、１系統の共焦点スキャナと等価である。結果として、蛍光のクロストークが生じる。
【0034】
以上のような問題点を解決するために、特許文献１に記載の発明では、第１マスク領域を通過する照明光及び第２マスク領域を通過する照明光の少なくとも一方を偏向させるビームスプリッタデバイスが設けられる。ビームスプリッタデバイスの設置角度を調整することで２つの照明光の方向を相対的に変化させ、第１マスク領域に対応する走査範囲をずらして、第２マスク領域に対応する走査範囲と重ならないようにしている。例えば、図８Ｃに示すとおり、２つの照明光を相対的に偏向させることで、各範囲が重複しないようにすることが可能である。
【0035】
しかしながら、偏向の量が数百マイクロメートル程度と非常に小さく、照明光の偏向に関して精密な調整が要求される。したがって、装置の製造及び管理が容易ではない。加えて、装置を長時間稼働し続けるような場合、照明光の偏向の経時変化も課題となる。
【0036】
以下では、これらの問題点を解決可能な共焦点スキャナ、共焦点スキャナシステム、及び共焦点顕微鏡システムについて説明する。本開示の一実施形態について、図面を参照して説明する。
【0037】
本開示は、マイクロレンズ付きニポウディスク方式の共焦点レーザ顕微鏡の中の共焦点スキャナに関する。本開示は、例えば共焦点画像解析に基づくハイコンテントアナリシスシステム及び創薬支援装置などの製品にも応用可能である。共焦点レーザ顕微鏡では、レーザ光を照射光として細胞などの試料に照射し、試料を励起する。細胞に予め蛍光物質を融合しておくと、励起光を受けたときに細胞から蛍光が放出される。蛍光信号を顕微鏡光学系で画像として撮影し、細胞の観察及び細胞の挙動の解析を行う。このような顕微手法は、生物の基礎研究から創薬の応用開発の分野まで幅広く利用可能である。細胞の画像を撮影する際、ボケの無い高画質な画像を得るために、光学系には共焦点方式が利用される。さらにマイクロレンズ付きニポウディスク方式の共焦点レーザ顕微鏡は、レーザ光の利用効率が高く、高速に画像を取得可能であり、生きた細胞のダイナミックな動きをリアルタイムで撮影可能である。したがって、当該共焦点レーザ顕微鏡は、生細胞ベースのスクリーニングで多用される。
【0038】
【0039】
共焦点顕微鏡システム１は、第１光源１０ａ及び第２光源１０ｂと、共焦点スキャナシステム２０と、顕微鏡３０と、第１検出器４０ａ及び第２検出器４０ｂと、を有する。
【0040】
第１光源１０ａは、共焦点スキャナシステム２０に入射して、顕微鏡３０上の試料Ｓに照射される第１照射光を出力する。第１光源１０ａは、例えばレーザ光源を含む。第１光源１０ａから照射される第１照射光の波長は、例えば試料Ｓの吸収帯に含まれ、試料Ｓから蛍光を発生させることが可能な波長領域に含まれる。例えば、第１光源１０ａから照射される第１照射光の波長は、可視領域に含まれていてもよい。例えば、第１照射光は、第１波長及び第３波長の異なる２種類の波長を有してもよい。
【0041】
第２光源１０ｂは、共焦点スキャナシステム２０に入射して、顕微鏡３０上の試料Ｓに照射される第２照射光を出力する。第２光源１０ｂは、例えばレーザ光源を含む。第２光源１０ｂから照射される第２照射光の波長は、例えば試料Ｓの吸収帯に含まれ、試料Ｓから蛍光を発生させることが可能な波長領域に含まれる。例えば、第２光源１０ｂから照射される第２照射光の波長は、可視領域に含まれていてもよい。例えば、第２照射光は、第２波長及び第４波長の異なる２種類の波長を有してもよい。
【0042】
共焦点スキャナシステム２０は、共焦点スキャナ２１と、複数の光学素子を含む第１光学系Ｓａと、複数の光学素子を含む第２光学系Ｓｂと、を有する。
【0043】
共焦点スキャナ２１は、複数の第１ピンホールがアレイ状に配置されている第１ピンホールアレイディスク２１１ａと、複数の第２ピンホールがアレイ状に配置されている第２ピンホールアレイディスク２１１ｂと、を有する。一実施形態に係る共焦点スキャナ２１では、第１ピンホールの径と第２ピンホールの径とは互いに同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【0044】
図２は、第１ピンホールアレイディスク２１１ａの一例を上方から見たときの模式図である。図２では、第１ピンホールアレイディスク２１１ａのみについて示しているが、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂについても図２と同様に構成されてもよい。例えば、第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおける複数の第１ピンホールの配置と第２ピンホールアレイディスク２１１ｂにおける複数の第２ピンホールの配置とは互いに同一であってもよい。
【0045】
第１ピンホールアレイディスク２１１ａに形成されている複数の第１ピンホールは、第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおいて等ピッチでかつ螺旋状に配置されている。同様に、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂに形成されている複数の第２ピンホールは、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂにおいて等ピッチでかつ螺旋状に配置されている。
【0046】
図１を再度参照すると、共焦点スキャナ２１は、複数の集光素子がアレイ状に配置されている集光素子アレイディスク２１２を有する。集光素子アレイディスク２１２は、第１ピンホールアレイディスク２１１ａと第２ピンホールアレイディスク２１１ｂとの間に挟まれるように位置する。集光素子は、例えばマイクロレンズを含む。
【0047】
共焦点スキャナ２１は、第１ピンホールアレイディスク２１１ａ、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂ、及び集光素子アレイディスク２１２を連結する連結軸２１３と、連結軸２１３と共に第１ピンホールアレイディスク２１１ａ、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂ、及び集光素子アレイディスク２１２を同一方向に回転させるモータ２１４と、を有する。
【0048】
第１ピンホールアレイディスク２１１ａは、集光素子アレイディスク２１２における一の集光素子の第１焦点面に一の第１ピンホールが位置するように連結軸２１３に取り付けられている。第２ピンホールアレイディスク２１１ｂは、集光素子アレイディスク２１２における一の集光素子の第２焦点面に一の第２ピンホールが位置するように連結軸２１３に取り付けられている。
【0049】
より具体的には、集光素子アレイディスク２１２におけるマイクロレンズアレイは、図１の上下方向に２つの焦点面を有する。第１ピンホールアレイディスク２１１ａは、上方の第１焦点面の位置に取り付けられている。第２ピンホールアレイディスク２１１ｂは、下方の第２焦点面の位置に取り付けられている。第１ピンホールアレイディスク２１１ａ及び第２ピンホールアレイディスク２１１ｂを含むピンホールアレイディスク２１１上に形成されている各ピンホールの位置と集光素子アレイディスク２１２上に形成されている集光素子としての各マイクロレンズの位置とは、互いに一対一の関係にある。
【0050】
以上のように、共焦点スキャナ２１は、例えば１枚のマイクロレンズアレイディスクとそれを挟むように配置した２枚のピンホールアレイディスク２１１から構成されるマイクロレンズ付きピンホールアレイディスクである。第１ピンホールアレイディスク２１１ａと集光素子アレイディスク２１２との組み合わせで第１共焦点スキャナが形成される。同様に、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂと集光素子アレイディスク２１２との組み合わせで第２共焦点スキャナが形成される。
【0051】
共焦点スキャナ２１は、第１ピンホールアレイディスク２１１ａと集光素子アレイディスク２１２との間に配置されている第１分岐素子２１５ａ、及び第２ピンホールアレイディスク２１１ｂと集光素子アレイディスク２１２との間に配置されている第２分岐素子２１５ｂをさらに有する。第１分岐素子２１５ａ及び第２分岐素子２１５ｂを含む分岐素子２１５は、例えばダイクロイックミラーを含む。
【0052】
第１光学系Ｓａは、第１ピンホールアレイディスク２１１ａと集光素子アレイディスク２１２との組み合わせである第１共焦点スキャナを含む。第１光学系Ｓａは、顕微鏡３０の直前に配置されているダイクロイックミラー２２ａを含む。
【0053】
第１光学系Ｓａは、複数のミラー２３ａを含む。例えば、第１光学系Ｓａは、第１光源１０ａから第１検出器４０ａに向かって順に配置されている第１ミラー２３ａ１、第２ミラー２３ａ２、第３ミラー２３ａ３、及び第４ミラー２３ａ４を含む。
【0054】
第１光学系Ｓａは、複数のレンズ２４ａを含む。例えば、第１光学系Ｓａは、第１光源１０ａから第１検出器４０ａに向かって順に配置されている第１レンズ２４ａ１、第２レンズ２４ａ２、第３レンズ２４ａ３、第４レンズ２４ａ４、第５レンズ２４ａ５、及び第６レンズ２４ａ６を含む。
【0055】
第１光学系Ｓａは、第５レンズ２４ａ５の直前に配置されている第１蛍光フィルタ２５ａ１を含む。第１光学系Ｓａは、第６レンズ２４ａ６の直前に配置されている第２蛍光フィルタ２５ａ２を含む。
【0056】
第１光学系Ｓａは、第４レンズ２４ａ４から、第１蛍光フィルタ２５ａ１及び第５レンズ２４ａ５を第１波長に基づく蛍光が通過する第１光路と第２蛍光フィルタ２５ａ２及び第６レンズ２４ａ６を第３波長に基づく蛍光が通過する第２光路とに分岐するダイクロイックミラー２６ａを含む。
【0057】
第２光学系Ｓｂは、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂと集光素子アレイディスク２１２との組み合わせである第２共焦点スキャナを含む。第２光学系Ｓｂは、顕微鏡３０の直前に配置されているダイクロイックミラー２２ｂを含む。
【0058】
第２光学系Ｓｂは、ミラー２３ｂを含む。第２光学系Ｓｂは、複数のレンズ２４ｂを含む。例えば、第２光学系Ｓｂは、第２光源１０ｂから第２検出器４０ｂに向かって順に配置されている第１レンズ２４ｂ１、第２レンズ２４ｂ２、第３レンズ２４ｂ３、及び第４レンズ２４ｂ４を含む。
【0059】
第２光学系Ｓｂは、第３レンズ２４ｂ３の直前に配置されている第１蛍光フィルタ２５ｂ１を含む。第２光学系Ｓｂは、第４レンズ２４ｂ４の直前に配置されている第２蛍光フィルタ２５ｂ２を含む。
【0060】
第２光学系Ｓｂは、第２レンズ２４ｂ２から、第１蛍光フィルタ２５ｂ１及び第３レンズ２４ｂ３を第２波長に基づく蛍光が通過する第１光路と第２蛍光フィルタ２５ｂ２及び第４レンズ２４ｂ４を第４波長に基づく蛍光が通過する第２光路とに分岐するダイクロイックミラー２６ｂを含む。
【0061】
第１光学系Ｓａのダイクロイックミラー２２ａと第２光学系Ｓｂのダイクロイックミラー２２ｂとは互いに同一のダイクロイックミラーである。すなわち、当該ダイクロイックミラーは、第１光学系Ｓａのダイクロイックミラー２２ａ及び第２光学系Ｓｂのダイクロイックミラー２２ｂとして共通に利用される。以下では、第１光学系Ｓａのダイクロイックミラー２２ａと第２光学系Ｓｂのダイクロイックミラー２２ｂとを互いに区別しないときは、単に「ダイクロイックミラー２２」と表記する。
【0062】
顕微鏡３０は、例えば試料Ｓの観察に利用可能な任意の顕微鏡を含む。顕微鏡３０には、第１光源１０ａからの第１照射光及び第２光源１０ｂからの第２照射光が照射される試料Ｓが含まれる。顕微鏡３０は、第１光源１０ａから照射された第１照射光及び第２光源１０ｂから照射された第２照射光を試料Ｓに対して最終的に集光する一組の結像レンズ３１及び対物レンズ３２を有する。
【0063】
第１検出器４０ａは、顕微鏡３０上の試料Ｓからの、第１照射光に基づく第１被測定光としての蛍光を検出する。第１検出器４０ａは、例えばカメラを含む。このようなカメラは、試料Ｓから放出される蛍光の波長帯域において適切な受光感度を有する。例えば、第１検出器４０ａは、可視領域において適切な受光感度を有してもよい。例えば、第１検出器４０ａは、第１照射光の第１波長及び第３波長に基づく第１被測定光をそれぞれ検出する一対の第１検出器４０ａ１及び第１検出器４０ａ２を含む。
【0064】
第２検出器４０ｂは、顕微鏡３０上の試料Ｓからの、第２照射光に基づく第２被測定光としての蛍光を検出する。第２検出器４０ｂは、例えばカメラを含む。このようなカメラは、試料Ｓから放出される蛍光の波長帯域において適切な受光感度を有する。例えば、第２検出器４０ｂは、可視領域において適切な受光感度を有してもよい。例えば、第２検出器４０ｂは、第２照射光の第２波長及び第４波長に基づく第２被測定光をそれぞれ検出する一対の第２検出器４０ｂ１及び第２検出器４０ｂ２を含む。
【0065】
【0066】
初めに、第１光学系Ｓａの機能について主に説明する。第１光学系Ｓａは、第１共焦点スキャナを通過して試料Ｓを含む顕微鏡３０まで第１照射光を導き、かつ第１共焦点像に寄与する、第１照射光に基づく試料Ｓからの第１被測定光、すなわち蛍光を第１検出器４０ａまで導く。
【0067】
例えば、共焦点顕微鏡システム１は、第１光学系Ｓａにおける第１共焦点スキャナによって第１波長及び第３波長の２波長の第１照射光に基づく２波長の蛍光を撮影するシステムを含む。２色の場合、第１光源１０ａにおいて、２波長のレーザが合波される。加えて、第１光学系Ｓａにおける蛍光の光路において、ダイクロイックミラー２６ａにより波長が互いに異なる蛍光が分離される。
【0068】
第１光源１０ａから拡散しながら出力された第１照射光は、共焦点スキャナシステム２０における第１光学系Ｓａの第１レンズ２４ａ１によって平行光となる。すなわち、第１レンズ２４ａ１はコリメートレンズとして機能する。平行光となった第１照射光は、第１ミラー２３ａ１で反射して共焦点スキャナ２１の集光素子アレイディスク２１２に入射する。
【0069】
集光素子アレイディスク２１２上に配置されているマイクロレンズを通過した第１照射光は、第１分岐素子２１５ａを透過して、各マイクロレンズの焦点で収束する。各マイクロレンズの焦点に収束した第１照射光は、マイクロレンズの第１焦点面の位置に配置されている第１ピンホールアレイディスク２１１ａの各第１ピンホールを通過する。図２の実線囲み部で示されているとおり、各マイクロレンズの焦点に収束した第１照射光は、第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおいて、例えば上方から見て３時の方向に位置する所定領域に照射されてもよい。
【0070】
図３に示すとおり、第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおいて多数の点光源となった第１照射光は、第２ミラー２３ａ２、第３ミラー２３ａ３、第４ミラー２３ａ４、及びダイクロイックミラー２２ａで反射して顕微鏡３０に入射する。このとき、第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおいて多数の点光源となった第１照射光は、光路内の第２レンズ２４ａ２及び第３レンズ２４ａ３によって、顕微鏡３０の像面Ｐ１にリレーされる。すなわち、第２レンズ２４ａ２及び第３レンズ２４ａ３は、第１ピンホールアレイディスク２１１ａのピンホール面と、顕微鏡３０の像面Ｐ１と、を共役関係に結ぶ一組のリレーレンズとして機能する。
【0071】
ダイクロイックミラー２２ａは第１共焦点スキャナを通過した第１照射光及び第１照射光によって励起された試料Ｓからの蛍光を反射させ、後述する第２共焦点スキャナを通過した第２照射光及び第２照射光によって励起された試料Ｓからの蛍光を透過させる。
【0072】
第１ピンホールアレイディスク２１１ａによる多数の点光源が、顕微鏡３０内の結像レンズ３１及び対物レンズ３２によって試料Ｓで点像となり、試料Ｓを励起する。このとき、試料Ｓは、第１波長及び第３波長を有する第１照射光に基づいて、第１波長及び第３波長の両方で励起される。共焦点スキャナ２１のモータ２１４の回転によって多数の点光源が試料Ｓの全面を走査し、２次元の画像情報を得ることが可能となる。
【0073】
多数の点光源によって励起された試料Ｓから第１波長及び第３波長に基づく蛍光が放出される。このような蛍光は逆光路を辿り、顕微鏡３０の像面Ｐ１において蛍光像が得られる。蛍光は、第４ミラー２３ａ４、第３ミラー２３ａ３、及び第２ミラー２３ａ２で反射し、光路内の第３レンズ２４ａ３及び第２レンズ２４ａ２によって第１ピンホールアレイディスク２１１ａのピンホール面にリレーされる。蛍光は、第１ピンホールの回転走査によって第１共焦点像となる。
【0074】
第１ピンホールアレイディスク２１１ａのピンホール像、すなわち第１共焦点像は、第１照射光が透過し対応する蛍光が反射する特性を有する第１分岐素子２１５ａのダイクロイックミラーで反射する。第１波長に基づく第１共焦点像は、ダイクロイックミラー２６ａを透過し、光路内の第４レンズ２４ａ４及び第５レンズ２４ａ５によって第１検出器４０ａ１の受光面にリレーされる。すなわち、第４レンズ２４ａ４及び第５レンズ２４ａ５は、第１ピンホールアレイディスク２１１ａのピンホール面と、第１検出器４０ａ１の受光面と、を共役関係に結ぶ一組のリレーレンズとして機能する。
【0075】
第１共焦点像は、第５レンズ２４ａ５の直前で第１蛍光フィルタ２５ａ１を介して、第１検出器４０ａ１のカメラにより画像として撮影される。第１蛍光フィルタ２５ａ１は、観察すべき試料Ｓの情報を含む、第１波長に基づく蛍光のみを透過させる。
【0076】
第３波長に基づく第１共焦点像は、ダイクロイックミラー２６ａで反射し、光路内の第４レンズ２４ａ４及び第６レンズ２４ａ６によって第１検出器４０ａ２の受光面にリレーされる。すなわち、第４レンズ２４ａ４及び第６レンズ２４ａ６は、第１ピンホールアレイディスク２１１ａのピンホール面と、第１検出器４０ａ２の受光面と、を共役関係に結ぶ一組のリレーレンズとして機能する。
【0077】
第１共焦点像は、第６レンズ２４ａ６の直前で第２蛍光フィルタ２５ａ２を介して、第１検出器４０ａ２のカメラにより画像として撮影される。第２蛍光フィルタ２５ａ２は、観察すべき試料Ｓの情報を含む、第３波長に基づく蛍光のみを透過させる。
【0078】
続いて、第２光学系Ｓｂの機能について主に説明する。第２光学系Ｓｂは、第２共焦点スキャナを通過して試料Ｓを含む顕微鏡３０まで第２照射光を導き、かつ第２共焦点像に寄与する、第２照射光に基づく試料Ｓからの第２被測定光、すなわち蛍光を第２検出器４０ｂまで導く。
【0079】
例えば、共焦点顕微鏡システム１は、第２光学系Ｓｂにおける第２共焦点スキャナによって第２波長及び第４波長の２波長の第２照射光に基づく２波長の蛍光を撮影するシステムを含む。２色の場合、第２光源１０ｂにおいて、２波長のレーザが合波される。加えて、第２光学系Ｓｂにおける蛍光の光路において、ダイクロイックミラー２６ｂにより波長が互いに異なる蛍光が分離される。
【0080】
第２光源１０ｂから拡散しながら出力された第２照射光は、共焦点スキャナシステム２０における第２光学系Ｓｂの第１レンズ２４ｂ１によって平行光となる。すなわち、第１レンズ２４ｂ１はコリメートレンズとして機能する。平行光となった第２照射光は、ミラー２３ｂで反射して共焦点スキャナ２１の集光素子アレイディスク２１２に入射する。
【0081】
集光素子アレイディスク２１２上に配置されているマイクロレンズを通過した第２照射光は、第２分岐素子２１５ｂを透過して、各マイクロレンズの焦点で収束する。各マイクロレンズの焦点に収束した第２照射光は、マイクロレンズの第２焦点面の位置に配置されている第２ピンホールアレイディスク２１１ｂの各第２ピンホールを通過する。図２の破線囲み部で示されているとおり、各マイクロレンズの焦点に収束した第２照射光は、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂにおいて、例えば上方から見て９時の方向に位置する所定領域に照射されてもよい。
【0082】
図３に示すとおり、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂにおいて多数の点光源となった第２照射光は、ダイクロイックミラー２２ｂを透過して顕微鏡３０に入射する。第２ピンホールアレイディスク２１１ｂによる多数の点光源が、顕微鏡３０内の結像レンズ３１及び対物レンズ３２によって試料Ｓで点像となり、試料Ｓを励起する。このとき、試料Ｓは、第２波長及び第４波長を有する第２照射光に基づいて、第２波長及び第４波長の両方で励起される。共焦点スキャナ２１のモータ２１４の回転によって多数の点光源が試料Ｓの全面を走査し、２次元の画像情報を得ることが可能となる。
【0083】
ダイクロイックミラー２２ｂは、第１共焦点スキャナを通過した第１照射光と第２共焦点スキャナを通過した第２照射光とを合波して、第１照射光によって励起された試料Ｓからの蛍光と第２照射光によって励起された試料Ｓからの蛍光とを分離するための光学素子である。ダイクロイックミラー２２ｂは、上述した第１共焦点スキャナを通過した第１照射光及び第１照射光によって励起された試料Ｓからの蛍光を反射させ、第２共焦点スキャナを通過した第２照射光及び第２照射光によって励起された試料Ｓからの蛍光を透過させる。
【0084】
多数の点光源によって励起された試料Ｓから第２波長及び第４波長に基づく蛍光が放出される。このような蛍光は逆光路を辿り、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂのピンホール面に入射する。蛍光は、第２ピンホールの回転走査によって第２共焦点像となる。
【0085】
第２ピンホールアレイディスク２１１ｂのピンホール像、すなわち第２共焦点像は、第２照射光が透過し対応する蛍光が反射する特性を有する第２分岐素子２１５ｂのダイクロイックミラーで反射する。第２波長に基づく第２共焦点像は、ダイクロイックミラー２６ｂを透過し、光路内の第２レンズ２４ｂ２及び第３レンズ２４ｂ３によって第２検出器４０ｂ１の受光面にリレーされる。すなわち、第２レンズ２４ｂ２及び第３レンズ２４ｂ３は、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂのピンホール面と、第２検出器４０ｂ１の受光面と、を共役関係に結ぶ一組のリレーレンズとして機能する。
【0086】
第２共焦点像は、第３レンズ２４ｂ３の直前で第１蛍光フィルタ２５ｂ１を介して、第２検出器４０ｂ１のカメラにより画像として撮影される。第１蛍光フィルタ２５ｂ１は、観察すべき試料Ｓの情報を含む、第２波長に基づく蛍光のみを透過させる。
【0087】
第４波長に基づく第２共焦点像は、ダイクロイックミラー２６ｂで反射し、光路内の第２レンズ２４ｂ２及び第４レンズ２４ｂ４によって第２検出器４０ｂ２の受光面にリレーされる。すなわち、第２レンズ２４ｂ２及び第４レンズ２４ｂ４は、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂのピンホール面と、第２検出器４０ｂ２の受光面と、を共役関係に結ぶ一組のリレーレンズとして機能する。
【0088】
第２共焦点像は、第４レンズ２４ｂ４の直前で第２蛍光フィルタ２５ｂ２を介して、第２検出器４０ｂ２のカメラにより画像として撮影される。第２蛍光フィルタ２５ｂ２は、観察すべき試料Ｓの情報を含む、第４波長に基づく蛍光のみを透過させる。
【0089】
以上のように、一組の回転するディスクユニットによって２系統の共焦点スキャナ２１が実現される。第１共焦点スキャナにおける第１ピンホールの径は第１照射光の波長に基づいて定められてもよい。第２共焦点スキャナにおける第２ピンホールの径は第２照射光の波長に基づいて定められてもよい。例えば、第１照射光の波長と第２照射光の波長とは互いに異なっている。したがって、第１ピンホールの径と第２ピンホールの径とは互いに異なっていてもよい。例えば、照射光の波長に比例して、２系統の共焦点スキャナにおけるピンホール径を異なる値に設計してもよい。より具体的には、照射光の波長が短くなるほどピンホール径を小さく設計し、照射光の波長が長くなるほどピンホール径を大きく設計してもよい。
【0090】
図４は、第１光学系Ｓａ及び第２光学系Ｓｂに共通に用いられるダイクロイックミラー２２の波長特性を示す模式図である。図４において、λ１、λ２、λ３、及びλ４は、第１照射光の第１波長、第２照射光の第２波長、第１照射光の第３波長、及び第２照射光の第４波長にそれぞれ対応する。例えば、各波長は、第１波長λ１、第２波長λ２、第３波長λ３、及び第４波長λ４の順に長い。
【0091】
例えば、ダイクロイックミラー２２は、第１共焦点スキャナを通過した、第１波長λ１及び第３波長λ３を有する第１照射光を反射させる。ダイクロイックミラー２２は、第１照射光によって励起された試料Ｓからの蛍光を反射させる。例えば、第１波長λ１に基づく蛍光は、第１波長λ１よりも長波長側で幅広い波長帯域にわたって放出される。例えば、第３波長λ３に基づく蛍光は、第３波長λ３よりも長波長側で幅広い波長帯域にわたって放出される。
【0092】
例えば、ダイクロイックミラー２２は、第２共焦点スキャナを通過した、第２波長λ２及び第４波長λ４を有する第２照射光を透過させる。ダイクロイックミラー２２は、第２照射光によって励起された試料Ｓからの蛍光を透過させる。例えば、第２波長λ２に基づく蛍光は、第２波長λ２よりも長波長側で幅広い波長帯域にわたって放出される。例えば、第４波長λ４に基づく蛍光は、第４波長λ４よりも長波長側で幅広い波長帯域にわたって放出される。
【0093】
互いに近接する２つの波長、例えば第１波長λ１及び第２波長λ２を、第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナのように共焦点スキャナ２１の異なる系統を用いて光学系を分離することで、蛍光のクロストークが抑制される。
【0094】
図５は、集光素子アレイディスク２１２の一例を上方から見たときの模式図である。図５は、図２の第１ピンホールアレイディスク２１１ａと同一方向から見たときの集光素子アレイディスク２１２の様子を示したものである。
【0095】
図５に示すとおり、集光素子アレイディスク２１２において、多数のマイクロレンズがアレイ状に配置されている。図３を用いて上述した第１光学系Ｓａにおいて第１照射光が集光素子アレイディスク２１２に照射されるとき、図５の実線囲み部Iで示されているとおり、第１照射光は、集光素子アレイディスク２１２において、例えば上方から見て３時の方向に位置する所定領域に照射されてもよい。一方で、図３を用いて上述した第２光学系Ｓｂにおいて第２照射光が集光素子アレイディスク２１２に照射されるとき、図５の実線囲み部IIで示されているとおり、第２照射光は、集光素子アレイディスク２１２において、例えば上方から見て９時の方向に位置する所定領域に照射されてもよい。
【0096】
以上のような一実施形態によれば、光学系に対する精密な調整を必要とせずに被測定光間のクロストークを抑制可能である。例えば、共焦点スキャナ２１は、第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナによる試料Ｓ上の励起部位が重複しないように照射光の方向を偏向させる従来技術のような光学素子を必要としない。共焦点スキャナ２１は、従来技術のような精度の高い機構調整を必要とすることなく、２枚のピンホールアレイディスク２１１を用いることで、これらのディスク自体によって第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナによる試料Ｓ上の励起部位の重複を抑制可能である。したがって、装置の組立調整が容易であり、装置のロバスト性が容易に得られる。
【0097】
例えば、共焦点スキャナ２１は、第１ピンホールアレイディスク２１１ａ及び第２ピンホールアレイディスク２１１ｂと、集光素子アレイディスク２１２と、を組み合わせた一組の回転するディスクユニットによって、２系統の共焦点スキャナを実現する。それぞれの共焦点スキャナによって波長別の共焦点イメージングが可能である。２系統の共焦点スキャナで試料Ｓの異なる部位を異なる波長の照射光で励起し、生じる波長別の蛍光を２系統の共焦点スキャナに分けて集光する。このように、励起部位が波長によって異なるため、同一部位から異なる波長の蛍光が生じにくい。このとき、第１共焦点スキャナにおける第１ピンホールの回転方向、及び第２共焦点スキャナにおける第２ピンホールの回転方向のそれぞれに特長がある。
【0098】
共焦点スキャナ２１では、第１ピンホールアレイディスク２１１ａ及び第２ピンホールアレイディスク２１１ｂの２枚のピンホールアレイディスクが集光素子アレイディスク２１２を挟んで上下に配置される。したがって、第１照射光及び第２照射光のそれぞれの伝搬方向から各ピンホールアレイディスクを見ると、一方は時計回りに、他方は反時計回りに回転する。これにより、第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナにおける共焦点スキャンは互いに同期することなく、独立に行われる。結果として、第１共焦点スキャナに基づく第１蛍光画像と第２共焦点スキャナに基づく第２蛍光画像とは重複することなく、蛍光のクロストークも十分に抑制される。したがって、高精度な画像解析を実現することが可能である。
【0099】
換言すると、同一時間において、第１共焦点スキャナが励起する試料Ｓの部位と第２共焦点スキャナが励起する試料Ｓの部位とが互いに異なるため、これら２つの部位からの蛍光がそれぞれの共焦点で集光されて混じり合うことが抑制される。したがって、同一時間において、第１被測定光の波長と第２被測定光の波長とが互いに重複することなく、蛍光のクロストークが十分に抑制される。
【0100】
図６Ａは、第１ピンホールアレイディスク２１１ａの一例を上方から見たときの模式図である。図６Ａは、図６Ｂ及び図６Ｃと対比させながら本開示の効果を説明する都合上、図２と同一の図を再掲したものである。図６Ａは、第１共焦点スキャナから第１照射光が出射する側で第１照射光の伝搬方向から第１ピンホールアレイディスク２１１ａを見たものである。図６Ｂは、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂの一例を下方から見たときの模式図である。図６Ｂは、第２共焦点スキャナから第２照射光が出射する側で第２照射光の伝搬方向から第２ピンホールアレイディスク２１１ｂを見たものである。
【0101】
本開示では、図６Ａ及び図６Ｂに示すとおり、従来技術における上述した第１マスク領域に対応する第１領域及び第２マスク領域に対応する第２領域はそれぞれ異なるピンホールアレイディスク２１１上に存在する。例えば、図６Ａにおいて実線囲み部で示すとおり、第１領域は、第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおいて３時の方向に位置する。例えば、図６Ｂにおいて実線囲み部で示すとおり、第２領域は、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂにおいて９時の方向に位置する。
【0102】
図６Ａ及び図６Ｂを比較すると、第１領域における第１ピンホールの配置と第２領域における第２ピンホールの配置とは、互いに反転する関係にある。したがって、第１領域における第１ピンホールの配置と第２領域における第２ピンホールの配置とは互いに回転対称ではなく、回転によって重複しない。
【0103】
【0104】
共焦点スキャナ２１は、第１分岐素子２１５ａを有することで、第１光源１０ａからの第１照射光の光路と顕微鏡３０における試料Ｓからの蛍光の光路とを切り分けることが可能である。同様に、共焦点スキャナ２１は、第２分岐素子２１５ｂを有することで、第２光源１０ｂからの第２照射光の光路と顕微鏡３０における試料Ｓからの蛍光の光路とを切り分けることが可能である。
【0105】
複数の第１ピンホールは、第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおいて等ピッチでかつ螺旋状に配置されている。複数の第２ピンホールは、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂにおいて等ピッチでかつ螺旋状に配置されている。以上により、共焦点スキャナ２１は、第１共焦点スキャナ及び第２共焦点スキャナのいずれにおいても、顕微鏡３０上の試料Ｓに対する光源からの照射光の高速スキャンを実現可能である。
【0106】
第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおける複数の第１ピンホールの配置と第２ピンホールアレイディスク２１１ｂにおける複数の第２ピンホールの配置とが互いに同一であることで、共焦点スキャナ２１の設計がさらに容易になる。
【0107】
共焦点スキャナシステム２０における第１光学系Ｓａは、第１組のリレーレンズとして、第２レンズ２４ａ２及び第３レンズ２４ａ３を含む。第１光学系Ｓａは、第２組のリレーレンズとして、第４レンズ２４ａ４及び第５レンズ２４ａ５、又は第４レンズ２４ａ４及び第６レンズ２４ａ６を含む。これにより、第１ピンホールアレイディスク２１１ａのピンホール面、顕微鏡３０の像面Ｐ１、及び第１検出器４０ａの受光面の間で共役関係を維持した状態で光学系を適切に構築することが可能である。
【0108】
第１ピンホールの径は第１照射光の波長に基づいて定められ、第２ピンホールの径は第２照射光の波長に基づいて定められている。照射光の波長に比例してピンホール径を設計することで、照射光の透過率及び共焦点性が異なるピンホールアレイディスク２１１に対して互いに等しくなり、バランスの取れた共焦点画像を得ることが可能となる。
【0109】
第１光源１０ａが第１波長及び第３波長を有する第１照射光を照射し、第２光源１０ｂが第２波長及び第４波長を有する第２照射光を照射することで、共焦点顕微鏡システム１は、４色での撮影によって共焦点画像を得ることが可能である。
【0110】
本開示は、その精神又はその本質的な特徴から離れることなく、上述した実施形態以外の他の所定の形態で実現できることは当業者にとって明白である。したがって、先の記述は例示的であり、これに限定されない。開示の範囲は、先の記述によってではなく、付加した請求項によって定義される。あらゆる変更のうちその均等の範囲内にあるいくつかの変更は、その中に包含されるとする。
【0111】
例えば、上述した各構成部の形状、配置、向き、及び個数は、上記の説明及び図面における図示の内容に限定されない。各構成部の形状、配置、向き、及び個数は、その機能を実現できるのであれば、任意に構成されてもよい。
【0112】
上記実施形態では、共焦点スキャナ２１は、第１分岐素子２１５ａ及び第２分岐素子２１５ｂを有すると説明したが、これに限定されない。共焦点スキャナ２１は、第１分岐素子２１５ａ及び第２分岐素子２１５ｂのいずれか一方のみを有してもよいし、両方有さなくてもよい。例えば、第１分岐素子２１５ａは、顕微鏡３０上の試料Ｓから放出された蛍光が第１ピンホールアレイディスク２１１ａ及び集光素子アレイディスク２１２を通過した後の第１光学系Ｓａにおける任意の箇所に配置されていてもよい。例えば、第２分岐素子２１５ｂは、顕微鏡３０上の試料Ｓから放出された蛍光が第２ピンホールアレイディスク２１１ｂ及び集光素子アレイディスク２１２を通過した後の第２光学系Ｓｂにおける任意の箇所に配置されていてもよい。
【0113】
上記実施形態では、分岐素子２１５は例えばダイクロイックミラーを含むと説明したが、これに限定されない。分岐素子２１５は、例えば各光源からの照射光を透過させて顕微鏡３０上の試料Ｓからの蛍光を反射させる任意の素子を含んでもよい。例えば、分岐素子２１５は、ビームスプリッタを含んでもよい。
【0114】
上記実施形態では、複数の第１ピンホールが第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおいて等ピッチでかつ螺旋状に配置され、複数の第２ピンホールが第２ピンホールアレイディスク２１１ｂにおいて等ピッチでかつ螺旋状に配置されていると説明したが、これに限定されない。複数の第１ピンホールは、第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおいて任意の状態で配置されていてもよい。複数の第２ピンホールは、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂにおいて任意の状態で配置されていてもよい。
【0115】
上記実施形態では、第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおける複数の第１ピンホールの配置と第２ピンホールアレイディスク２１１ｂにおける複数の第２ピンホールの配置とが互いに同一であると説明したが、これに限定されない。第１ピンホールアレイディスク２１１ａにおける複数の第１ピンホールの配置と第２ピンホールアレイディスク２１１ｂにおける複数の第２ピンホールの配置とは互いに異なっていてもよい。
【0116】
上記実施形態では、第１光学系Ｓａは、複数組のリレーレンズを含むと説明したが、これに限定されない。第１光学系Ｓａに代えて、第２光学系Ｓｂがこのような複数組のリレーレンズを含んでもよい。第１光学系Ｓａ及び第２光学系Ｓｂは、顕微鏡３０上の試料Ｓに対して第１共焦点像及び第２共焦点像の両方を鮮明に得ることが可能であれば任意に構成されてもよい。
【0117】
上記実施形態では、第１ピンホールの径が第１照射光の波長に基づいて定められ、第２ピンホールの径が第２照射光の波長に基づいて定められていると説明したが、これに限定されない。ピンホールの径は、照射光の波長に依存せずに一定に定められていてもよい。
【0118】
上記実施形態では、第１照射光が第１波長及び第３波長の異なる２種類の波長を有し、第２照射光が第２波長及び第４波長の異なる２種類の波長を有すると説明したが、これに限定されない。各照射光は１種類の波長のみを有してもよいし、３種類以上の波長を有してもよい。
【0119】
上記実施形態では、第１光源１０ａ及び第２光源１０ｂの各々は例えばレーザ光源を含むと説明したが、これに限定されない。各光源は、第１共焦点像及び第２共焦点像を得ることが可能な任意の光源を含んでもよい。例えば、各光源は、ＬＥＤ（Light Emitting Diode）を含んでもよい。また、上記実施形態では、各光源から照射される照射光の波長は可視領域に含まれていると説明したが、これに限定されない。各光源から照射される照射光の波長は、紫外領域及び赤外領域などに含まれていてもよい。
【0120】
上記実施形態では、集光素子アレイディスク２１２を構成する集光素子はマイクロレンズを含むと説明したが、これに限定されない。このような集光素子は、第１ピンホールアレイディスク２１１ａ及び第２ピンホールアレイディスク２１１ｂの位置で各光源からの照射光を集光可能な任意の素子を含んでもよい。
【0121】
上記実施形態では、図２及び図５に示すとおり、上方から見たときに第１ピンホールアレイディスク２１１ａ、第２ピンホールアレイディスク２１１ｂ、及び集光素子アレイディスク２１２において３時及び９時の位置にある所定領域に照射光又は蛍光が入射すると説明したが、これに限定されない。照射光又は蛍光が入射する領域は、第１光学系Ｓａと第２光学系Ｓｂとの間で任意の配置関係にあってもよい。
【符号の説明】
【0122】
１ 共焦点顕微鏡システム
１０ａ 第１光源
１０ｂ 第２光源
２０ 共焦点スキャナシステム
２１ 共焦点スキャナ
２１１ ピンホールアレイディスク
２１１ａ 第１ピンホールアレイディスク
２１１ｂ 第２ピンホールアレイディスク
２１２ 集光素子アレイディスク
２１３ 連結軸
２１４ モータ
２１５ 分岐素子
２１５ａ 第１分岐素子
２１５ｂ 第２分岐素子
２２、２２ａ、２２ｂ ダイクロイックミラー
２３ａ ミラー
２３ａ１ 第１ミラー
２３ａ２ 第２ミラー
２３ａ３ 第３ミラー
２３ａ４ 第４ミラー
２３ｂ ミラー
２４ａ レンズ
２４ａ１ 第１レンズ
２４ａ２ 第２レンズ
２４ａ３ 第３レンズ
２４ａ４ 第４レンズ
２４ａ５ 第５レンズ
２４ａ６ 第６レンズ
２４ｂ レンズ
２４ｂ１ 第１レンズ
２４ｂ２ 第２レンズ
２４ｂ３ 第３レンズ
２４ｂ４ 第４レンズ
２５ａ１ 第１蛍光フィルタ
２５ａ２ 第２蛍光フィルタ
２５ｂ１ 第１蛍光フィルタ
２５ｂ２ 第２蛍光フィルタ
２６ａ ダイクロイックミラー
２６ｂ ダイクロイックミラー
３０ 顕微鏡
３１ 結像レンズ
３２ 対物レンズ
４０ａ、４０ａ１、４０ａ２ 第１検出器
４０ｂ、４０ｂ１、４０ｂ２ 第２検出器
Ｐ１ 像面
Ｓ 試料
Ｓａ 第１光学系
Ｓｂ 第２光学系
λ１ 第１波長
λ２ 第２波長
λ３ 第３波長
λ４ 第４波長
１０ａ 第１光源
１０ｂ 第２光源
２０ 共焦点スキャナシステム
２１ 共焦点スキャナ
２１１ ピンホールアレイディスク
２１１ａ 第１ピンホールアレイディスク
２１１ｂ 第２ピンホールアレイディスク
２１２ 集光素子アレイディスク
２１３ 連結軸
２１４ モータ
２１５ 分岐素子
２１５ａ 第１分岐素子
２１５ｂ 第２分岐素子
２２、２２ａ、２２ｂ ダイクロイックミラー
２３ａ ミラー
２３ａ１ 第１ミラー
２３ａ２ 第２ミラー
２３ａ３ 第３ミラー
２３ａ４ 第４ミラー
２３ｂ ミラー
２４ａ レンズ
２４ａ１ 第１レンズ
２４ａ２ 第２レンズ
２４ａ３ 第３レンズ
２４ａ４ 第４レンズ
２４ａ５ 第５レンズ
２４ａ６ 第６レンズ
２４ｂ レンズ
２４ｂ１ 第１レンズ
２４ｂ２ 第２レンズ
２４ｂ３ 第３レンズ
２４ｂ４ 第４レンズ
２５ａ１ 第１蛍光フィルタ
２５ａ２ 第２蛍光フィルタ
２５ｂ１ 第１蛍光フィルタ
２５ｂ２ 第２蛍光フィルタ
２６ａ ダイクロイックミラー
２６ｂ ダイクロイックミラー
３０ 顕微鏡
３１ 結像レンズ
３２ 対物レンズ
４０ａ、４０ａ１、４０ａ２ 第１検出器
４０ｂ、４０ｂ１、４０ｂ２ 第２検出器
Ｐ１ 像面
Ｓ 試料
Ｓａ 第１光学系
Ｓｂ 第２光学系
λ１ 第１波長
λ２ 第２波長
λ３ 第３波長
λ４ 第４波長
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】