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特許7352307自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、その製造方法及び使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-20
(45)【発行日】2023-09-28
(54)【発明の名称】自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、その製造方法及び使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20230921BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20230921BHJP
A61K 38/48 20060101ALI20230921BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230921BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20230921BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230921BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230921BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230921BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20230921BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20230921BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20230921BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230921BHJP
C12N 9/48 20060101ALI20230921BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230921BHJP
C12N 15/57 20060101ALI20230921BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20230921BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
A61K35/17
A61K38/48
A61K39/395 T
A61K48/00
A61P35/00
A61P43/00 105
C07K14/705
C07K16/30
C07K19/00
C12N5/0783
C12N5/10
C12N9/48
C12N15/13
C12N15/57
C12N15/867 Z
【請求項の数】
30
(21)【出願番号】P 2021555364
(86)(22)【出願日】2020-03-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-17
(86)【国際出願番号】 CN2020077582
(87)【国際公開番号】W WO2020187016
(87)【国際公開日】2020-09-24
【審査請求日】2021-10-14
(31)【優先権主張番号】201910196531.5
(32)【優先日】2019-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520200230
【氏名又は名称】阿思科力（蘇州）生物科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＣＬＥＰＩＵＳ （ＳＵＺＨＯＵ） ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＭＰＡＮＹ ＧＲＯＵＰ ＣＯ．，ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】２１８ Ｘｉｎｇｈｕ Ｓｔｒ．Ｓｕｚｈｏｕ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２１５１２３ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002262
【氏名又は名称】ＴＲＹ国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】韓 昆昆
(72)【発明者】
【氏名】傅 剣敏
(72)【発明者】
【氏名】周 敏
(72)【発明者】
【氏名】曽 凡軍
(72)【発明者】
【氏名】王 強
(72)【発明者】
【氏名】李 華順
【審査官】藤山 純
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／１８１５５２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２１８７１０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１０９１３６２４４（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５０９８７９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／６２
Ａ６１Ｋ ３５／１７
Ａ６１Ｋ ３８／４８
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ｃ０７Ｋ １４／７０５
Ｃ０７Ｋ １６／３０
Ｃ０７Ｋ １９／００
Ｃ１２Ｎ ５／０７８３
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｎ ９／４８
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ｃ１２Ｎ １５／５７
Ｃ１２Ｎ １５／８６７
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸であって、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子及び誘導性自殺遺伝子を含み、
前記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達領域を含み、
前記キメラ抗原受容体は、構造がＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζであり、前記ＳｃＦｖは、腫瘍特異的抗原ＲＯＢＯ１のＦＮ３ドメインに特異的に結合可能であり、ＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のコーディングヌクレオチド配列は、配列番号１１に示され、
前記誘導性自殺遺伝子は、ｉＣａｓｐａｓｅ９、ＥＧＦＲｔ、ＣＤ２０、ラパマイシン及びＲＱＲ８中の一つであることを特徴とする核酸。
【請求項2】
前記誘導性自殺遺伝子は、ｉＣａｓｐａｓｅ９であり、前記ｉＣａｓｐａｓｅ９は、ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖ及びΔＣａｓｐａｓｅ９を含み、
前記ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖのヌクレオチド配列は、配列番号１に示され、
前記ΔＣａｓｐａｓｅ９のヌクレオチド配列は、配列番号２に示されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項3】
前記ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６ＶとΔＣａｓｐａｓｅ９はＬｉｎｋｅｒにより接続され、前記Ｌｉｎｋｅｒのヌクレオチド配列は、配列番号３に示されることを特徴とする、請求項２に記載の核酸。
【請求項4】
前記ｉＣａｓｐａｓｅ９には、マーカー遺伝子がさらに含まれ、前記マーカー遺伝子は、ＣＤ１９、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ、ＨＡ及びＨｉｓ中の一つであることを特徴とする、請求項３に記載の核酸。
【請求項5】
前記マーカー遺伝子は、ＣＤ１９であり、前記ｉＣａｓｐａｓｅ９には、切断遺伝子が含まれ、
前記切断遺伝子は、Ｔ２Ａであり、
前記ＣＤ１９のヌクレオチド配列は、配列番号４に示され、
前記Ｔ２Ａのヌクレオチド配列は、配列番号５に示されることを特徴とする、請求項４に記載の核酸。
【請求項6】
前記ｉＣａｓｐａｓｅ９のヌクレオチド配列は、配列番号６に示されることを特徴とする、請求項５に記載の核酸。
【請求項7】
前記誘導性自殺遺伝子は、ＥＧＦＲｔであり、前記ＥＧＦＲｔは、ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩ、細胞外ドメインＩＶ及び膜貫通領域を含み、
前記ＥＧＦＲｔのヌクレオチド配列は、配列番号１２に示されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項8】
前記抗原結合ドメインは、ＲＯＢＯ１のＦＮ３ドメインに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であり、前記抗原結合断片は、ＳｃＦｖであることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項9】
前記ＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９に示されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸。
【請求項10】
請求項１から９のいずれか１項に記載の核酸を含むことを特徴とする、自殺遺伝子を持つ構築物。
【請求項11】
前記自殺遺伝子がｉＣａｓｐａｓｅ９である場合、前記構築物のヌクレオチド配列は、配列番号７に示され、或いは前記自殺遺伝子がＥＧＦＲｔである場合、前記構築物のヌクレオチド配列は、配列番号１３に示されることを特徴とする、請求項１０に記載の構築物。
【請求項12】
請求項１から９のいずれか１項に記載の核酸によってコードされることを特徴とする、自殺遺伝子を持つキメラ抗原受容体。
【請求項13】
請求項１２に記載のキメラ抗原受容体を発現することを特徴とする、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞。
【請求項14】
肺がん細胞、膵臓がん細胞、肝がん細胞、乳がん細胞、結腸がん細胞、前立腺がん細胞又は胃がん細胞を効果的に殺傷させるか又は殺すことができることを特徴とする、請求項１３に記載の自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞。
【請求項15】
請求項１３又は１４に記載の自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の製造方法であって、請求項１から９のいずれか１項に記載の核酸を合成して増幅し、前記核酸をレンチウイルス発現ベクターへクローニングし、自殺遺伝子を持つレンチウイルスベクターを得るステップ（１）と、
さらに、レンチウイルスパッケージング細胞株、及びステップ（１）で得られた自殺遺伝子を持つレンチウイルスベクターを含む３プラスミドシステムによりレンチウイルスをパッケージングして自殺遺伝子を持つレンチウイルスを得た後、前記自殺遺伝子を持つレンチウイルスをＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に感染させることで自殺遺伝子をそのゲノムに導入し、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を得るステップ（２）と、
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項16】
前記ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、請求項１から９のいずれか１項に記載の核酸を合成し、ＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のコーディングヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを得るステップａと、
レンチウイルスパッケージングプラスミド及びステップａで得られたレンチウイルス発現ベクターによりパッケージング細胞株においてパッケージングを行い、レンチウイルスを製造するステップｂと、
ステップｂで得られたレンチウイルスをＮＫ細胞に感染させ、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を得るステップｃと、
を含む方法により製造されることを特徴とする、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項17】
請求項１３若しくは１４に記載の自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞又は請求項１５若しくは１６に記載の製造方法により製造される自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む、ことを特徴とする医薬組成物。
【請求項18】
前記医薬組成物はインデューサーをさらに含み、前記自殺遺伝子がｉＣａｓｐａｓｅ９である場合、前記インデューサーはＡＰ１９０３又はＡＰ２０１８７であり、前記インデューサーの濃度は０～５０ｎＭであり、
前記自殺遺伝子がＥＧＦＲｔである場合、前記インデューサーはセツキシマブであり、その作用濃度が１μｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞と腫瘍細胞とのエフェクター／標的比は（０．５～５）：１であることを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項20】
前記エフェクター／標的比は（０．５～１）：１であることを特徴とする、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項21】
薬学的に許容される塩、担体、賦形剤及び補助材料をさらに含むことを特徴とする、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項22】
がんを治療及び／又は予防するための医薬品の製造における請求項１３若しくは１４に記載の自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞又は請求項１５若しくは１６に記載の製造方法により製造される自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の使用であることを特徴とする、使用。
【請求項23】
前記がんは、肝臓がん、乳がん、結腸がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん又は肺がんであることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項24】
前記医薬品は、腫瘍内投与剤形の医薬品、腫瘍内注射剤形の医薬品又は静脈内注入剤型の医薬品を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項25】
がんを治療及び／又は予防する注射剤であって、前記注射剤は請求項１３若しくは１４に記載の自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、請求項１５若しくは１６に記載の製造方法により製造される自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、又は請求項１７から２１のいずれか1項に記載の医薬組成物を含む、ことを特徴とするがんを治療及び／又は予防する注射剤。
【請求項26】
前記がんは、肝臓がん、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん又は肺がんであることを特徴とする請求項２５に記載の注射剤。
【請求項27】
前記がんは、乳がん、結腸直腸がん又は肝臓がんであることを特徴とする、請求項２５に記載の注射剤。
【請求項28】
前記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の注射量は（０．５～５）×１０９細胞／回であることを特徴とする、請求項２５に記載の注射剤。
【請求項29】
前記注射剤の投与方法は、腫瘍内注射、静脈注射、胸腔内注射又は局所的介入であることを特徴とする、請求項２５に記載の注射剤。
【請求項30】
前記注射剤の投与方法は静脈注射であることを特徴とする、請求項２９に記載の注射剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬品の技術分野に属し、ＮＫ細胞、その製造方法及び使用に関し、具体的には、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、その製造方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、ＣＡＲ－Ｔ細胞に基づく免疫療法は、業界で大きな注目を集めており、「生きている」薬剤として、ＣＡＲ－Ｔ療法は従来の薬剤とは大きく異なっている。まず、この療法では、患者体内からＴ細胞を分離し、インビトロでキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によりＴ細胞を修飾してがん細胞を特異的に識別可能にし、そして改変されたＴ細胞を増殖させ、患者体内に戻す必要がある。例えば、ＣＤ１９陽性悪性腫瘍患者へのＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の応用の成功は、この方法をがん免疫療法として使用可能であることを証明している（Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。また、様々な腫瘍抗原を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞については、積極的に臨床開発されている（Ｋａｌｏｓｅｔａｌ．，２０１３）。
【0003】
ＣＡＲ－Ｔ療法は大きな可能性を示しているが、それは大きく制限されている。まず、細胞を体外へ分離する必要がある（この過程は時間と費用がかかる）。また、特定の患者に対してＴ細胞を修飾する必要がある。しかし、一部の患者は、Ｔ細胞を採取することができないか、Ｔ細胞の準備過程を待つのに十分な時間がない問題がある。ＣＡＲ－Ｔは現在、汎用のＣＡＲ－Ｔに向けて開発されているが、実際には臨床的リスクと運用上の困難が高くなっている。さらに、ＣＡＲ－Ｔの高いコスト（現在上場している２つの会社、ノバルティスとケイトを参照）に直面すると、これらの制限により、一部の有望な患者がＣＡＲ－Ｔ免疫療法を受けることができなくなる可能性がある。また、ＣＡＲ－Ｔ療法には、サイトカイン放出症候群ＣＲＳ、神経毒性などの深刻な毒性又は副作用もある。
【0004】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、養子がん免疫療法に用いる重要なエフェクター細胞である。Ｔ細胞と同様に、ＮＫ細胞は修飾されてキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）を発現することにより抗腫瘍活性を増強させることができる。ＮＫ細胞は、がん免疫監視において重要な役割を果たし、養子がん免疫療法に用いる重要なエフェクター細胞を表している。Ｔ細胞に比べ、ＮＫ細胞は複雑なＭＨＣ分子によって提示されるペプチド抗原を事前に活性化して認識する必要はない。逆に、コード化された細胞表面受容体を介してＣＤ３ζ分子を結合することにより、ＮＫ細胞は適切な刺激の下で殺傷活性を示すことができる。従って、ＣＡＲ－ＮＫ療法は腫瘍細胞治療の重要な発展の方向性になることが期待されている。
【0005】
本発明者らがＮＫ９２細胞を改変してＣＡＲを導入したことにより、その標的性が大幅に向上するとともに、自殺遺伝子スイッチ素子を導入したことにより、ＣＡＲ－ＮＫ細胞の安全性及び制御可能性がさらに向上した。臨床前の実験によっても、本発明のＣＡＲ－ＮＫは明らかな毒性や副作用を有しないことが証明されている。しかし、ＣＡＲ－ＮＫ療法の安全性及び有効性を向上させるために、さらなる開発及び改良が必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
上記の技術的問題に対して、本発明の目的の一つは自殺遺伝子を持つヌクレオチド配列を提供し、本発明のもう一つの目的は自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を提供することであり、本発明の別の目的は自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の使用を提供することである。本発明では、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に自殺遺伝子のスイッチ素子を追加することにより、ＣＡＲ－ＮＫ細胞をより良好に制御でき、臨床上の安全性をさらに向上できる。
【0007】
本発明に係る自殺遺伝子を持つヌクレオチド配列は、自殺遺伝子を持つヌクレオチド配列であって、キメラ抗原受容体をコードする遺伝子及び誘導性自殺遺伝子を含み、上記キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達領域を含み、上記抗原結合ドメインは、腫瘍特異的抗原に特異的に結合し、膜貫通ドメイン及び共刺激シグナル伝達領域を介してＮＫ細胞を活性化可能であり、上記腫瘍特異的抗原はＲＯＢＯ１である。
【0008】
本発明の好ましい実施例において、上記誘導性自殺遺伝子はｉＣａｓｐａｓｅ９、ＥＧＦＲｔ、ＣＤ２０、ラパマイシン及び／又はＲＱＲ８である。
【0009】
本発明の好ましい実施例において、上記誘導性自殺遺伝子は、ｉＣａｓｐａｓｅ９であり、上記ｉＣａｓｐａｓｅ９は、ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖ及びΔＣａｓｐａｓｅ９を含み、上記ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖのヌクレオチド配列は、配列番号１に示され、上記ΔＣａｓｐａｓｅ９のヌクレオチド配列は、配列番号２に示される。
【0010】
本発明の好ましい実施例において、上記ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６ＶとΔＣａｓｐａｓｅ９はＬｉｎｋｅｒにより連結され、上記Ｌｉｎｋｅｒのヌクレオチド配列は配列番号３に示される。リンカー（Ｌｉｎｋｅｒ）配列の設計は、遺伝子融合技術を成功させるための重要な技術の一つであり、適切なリンカー配列により異なる目的遺伝子を連結し、それを適切な生体内で単一のペプチド鎖となるように発現させる。連結作用を奏するアミノ酸はＬｉｎｋｅｒと呼ばれる。Ｌｉｎｋｅｒは目的タンパク質のそれぞれの機能に影響を与えず、融合タンパク質に正しい空間構造を形成させ、生物学的活性をよりよく発揮させることができる。
【0011】
本発明の好ましい実施例において、上記ｉＣａｓｐａｓｅ９自殺遺伝子にはマーカー遺伝子がさらに含まれ、上記マーカー遺伝子は、好ましくはＣＤ１９、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ、ＨＡ又はＨｉｓである。マーカー遺伝子を検出することにより目的タンパク質が正しく発現されたか否かを確認することができる。
【0012】
本発明の好ましい実施例において、上記マーカー遺伝子はＣＤ１９、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ、ＨＡ又はＨｉｓであってもよく、好ましくはＣＤ１９である。上記ｉＣａｓｐａｓｅ９自殺遺伝子には切断遺伝子がさらに含まれる。上記切断遺伝子はＴ２Ａ又はＰ２Ａであり、好ましくはＴ２Ａである。上記ＣＤ１９マーカーのヌクレオチド配列は４に示され、上記Ｔ２Ａのヌクレオチド配列は配列番号５に示される。マーカー遺伝子ＣＤ１９により細胞内で発現したＣａｓｐａｓｅ９タンパク質を識別することができる。また、切断遺伝子の作用下でｍＲＮＡにより翻訳された融合タンパク質のマーカーとｉＣａｓｐａｓｅ９とを正常に切断することができる。ＣＤ１９は短くされたＣＤ１９であり、ＣＤ１９の細胞外セグメント、膜貫通領域及び細胞内における短くされた配列（細胞内シグナル伝達領域を含まない）を含み、自殺遺伝子を検出するためのマーカーのみとして作用し、他の機能を有しない。また、ＣＤ１９は自殺遺伝子の検出マーカーとしてすでに臨床患者に比較的良い検査結果を示しており、他のマーカーに比べてより高い安全性を有する。２つの遺伝子はＴ２Ａポリペプチドにより１つのＯＲＦとなるように連結され、ｍＲＮＡによって１つの融合タンパク質に翻訳されるが、この融合タンパク質は２Ａを識別するプロテアーゼにより２つのタンパク質に消化される。この２つのタンパク質はそれぞれ発現し、それらの機能は互いに影響しない。Ｔ２Ａの利点は、配列が非常に短く、基本的にタンパク質の機能に影響を与えないことにある。
【0013】
本発明の好ましい実施例において、上記ｉＣａｓｐａｓｅ９のヌクレオチド配列は、配列番号６に示される。
【0014】
本発明の好ましい実施例において、上記誘導性自殺遺伝子はＥＧＦＲｔであり、上記ＥＧＦＲｔはＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩ、細胞外ドメインＩＶ及び膜貫通領域を含む。
【0015】
本発明の好ましい実施例において、上記ＥＧＦＲｔのヌクレオチド配列は配列番号１２に示される。
【0016】
本発明の好ましい実施例において、上記抗原結合ドメインは、腫瘍特異的抗原ＲＯＢＯ１のＩｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、Ｉｇ４、Ｉｇ５、ＦＮ１、ＦＮ２及びＦＮ３ドメインのうちの１種又は複数種に特異的に結合可能である。
【0017】
本発明の好ましい実施例において、上記抗原結合ドメインは、腫瘍特異的抗原ＲＯＢＯ１のＦＮ３ドメインに特異的に結合可能である。
【0018】
本発明の好ましい実施例において、上記抗原結合ドメインは、ＲＯＢＯ１のＦＮ３ドメインに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であり、上記抗原結合断片は、Ｆａｂ又はＳｃＦｖである。
【0019】
本発明の好ましい実施例において、上記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ及びＣＤ１５４からなる群より選択される１種又は複数種であり、好ましくは、上記膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインであり、及び／又は上記共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインを含み、上記共刺激分子は、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、４－１ＢＢ及びＯＸ４０からなる群より選択される１種又は複数種であり、好ましくは、上記共刺激シグナル伝達領域は、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む。
【0020】
本発明の好ましい実施例において、上記キメラ抗原受容体は、構造がＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζの融合タンパク質であり、上記ＳｃＦｖは腫瘍特異的抗原ＲＯＢＯ１のＦＮ３ドメインに特異的に結合可能である。
【0021】
本発明の好ましい実施例において、上記ＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８又は配列番号９に示される。
本発明の好ましい実施例において、上記ＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のコーディングヌクレオチド配列は、配列番号１０又は配列番号１１に示される。
本発明の好ましい実施例において、上記ＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のコーディングヌクレオチド配列は、配列番号１０又は配列番号１１に示される。
【0022】
本発明によれば、上記ヌクレオチド配列を含む自殺遺伝子を持つ構築物がさらに提供される。
【0023】
本発明の好ましい実施例において、上記構築物はレンチウイルス構築物であり、好ましくは、上記自殺遺伝子がｉＣａｓｐａｓｅ９である場合、上記構築物のヌクレオチド配列は、配列番号７に示され、或いは上記自殺遺伝子がＥＧＦＲｔである場合、上記構築物のヌクレオチド配列は、配列番号１３に示される。
【0024】
本発明によれば、上記ヌクレオチド配列によってコードされる自殺遺伝子を持つキメラ抗原受容体がさらに提供される。
【0025】
本発明によれば、キメラ抗原受容体を発現する自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞がさらに提供される。
【0026】
本発明の好ましい実施例において、上記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、肺がん細胞、膵臓がん細胞、肝がん細胞、乳がん細胞、結腸がん細胞、前立腺がん細胞又は胃がん細胞を効果的に殺傷させるか又は殺すことができる。
【0027】
本発明によれば、
上記ヌクレオチド配列における自殺遺伝子を合成して増幅し、上記ヌクレオチド配列をレンチウイルス発現ベクターへクローニングし、自殺遺伝子を持つレンチウイルスベクターを得るステップ（１）と、
さらに、レンチウイルスパッケージング細胞株、及びステップ（１）で得られた自殺遺伝子を持つレンチウイルスベクターを含む３プラスミドシステムによりレンチウイルスをパッケージングして自殺遺伝子を持つレンチウイルスを得た後、上記自殺遺伝子を持つレンチウイルスをＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に感染させることで自殺遺伝子をそのゲノムに導入し、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を得るステップ（２）と、
を含む上記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の製造方法がさらに提供される。
上記ヌクレオチド配列における自殺遺伝子を合成して増幅し、上記ヌクレオチド配列をレンチウイルス発現ベクターへクローニングし、自殺遺伝子を持つレンチウイルスベクターを得るステップ（１）と、
さらに、レンチウイルスパッケージング細胞株、及びステップ（１）で得られた自殺遺伝子を持つレンチウイルスベクターを含む３プラスミドシステムによりレンチウイルスをパッケージングして自殺遺伝子を持つレンチウイルスを得た後、上記自殺遺伝子を持つレンチウイルスをＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に感染させることで自殺遺伝子をそのゲノムに導入し、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を得るステップ（２）と、
を含む上記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の製造方法がさらに提供される。
【0028】
本発明の好ましい実施例において、上記ＲＯＢＯ１－ＮＫ細胞は、
上記キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を合成して増幅し、上記ヌクレオチド配列をレンチウイルス発現ベクターへクローニングし、好ましくは、上記ＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のコーディングヌクレオチド配列を合成し、ＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のコーディングヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを得るステップａと、
レンチウイルスパッケージングに必要なプラスミド及びステップａで得られたレンチウイルス発現ベクターによりレンチウイルスパッケージング細胞株においてパッケージングを行い、レンチウイルスを製造するステップｂと、
ステップｂで得られたレンチウイルスをＮＫ細胞に感染させ、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を得るステップｃと、
を含む方法により製造される。
上記キメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を合成して増幅し、上記ヌクレオチド配列をレンチウイルス発現ベクターへクローニングし、好ましくは、上記ＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のコーディングヌクレオチド配列を合成し、ＳｃＦｖ－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合タンパク質のコーディングヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを得るステップａと、
レンチウイルスパッケージングに必要なプラスミド及びステップａで得られたレンチウイルス発現ベクターによりレンチウイルスパッケージング細胞株においてパッケージングを行い、レンチウイルスを製造するステップｂと、
ステップｂで得られたレンチウイルスをＮＫ細胞に感染させ、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を得るステップｃと、
を含む方法により製造される。
【0029】
本発明によれば、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞又は上記製造方法により製造される自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を含み、好ましくは、インデューサーをさらに含み、上記自殺遺伝子がｉＣａｓｐａｓｅ９である場合、上記インデューサーはＡＰ１９０３又はＡＰ２０１８７であり、上記低分子化学インデューサーの濃度は０～５０ｎＭであり、上記自殺遺伝子がＥＧＦＲｔである場合、上記インデューサーはセツキシマブであり、その作用濃度が１μｇ／ｍｌである医薬組成物がさらに提供される。
【0030】
本発明の好ましい実施例において、上記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞が腫瘍の殺傷に使用される場合、上記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞と腫瘍細胞のエフェクター／標的比は（０．５～５）：１であり、好ましくは上記エフェクター／標的比は（０．５～１）：１である。
【0031】
本発明の好ましい実施例において、上記医薬組成物は、薬学的に許容される塩、担体、賦形剤及び補助材料をさらに含む。
【0032】
本発明が属する技術分野における通常の方法により、本発明の医薬品を薬学的に許容される様々な剤形、例えば、錠剤、カプセル剤、経口液剤、トローチ剤、注射剤、軟膏剤、顆粒剤又は様々な徐放性製剤などに製剤化することができる。好ましくは、注射剤であり、皮下注射で投与可能である。
【0033】
本発明の医薬品の担体は、薬学分野で入手できる一般的なるタイプであってもよく、接着剤、潤滑剤、崩壊剤、溶解補助剤、希釈剤、安定剤、懸濁剤又は基質などを含む。
【0034】
本発明によれば、がんを治療及び／又は予防するための医薬品の製造における上記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞又は上記製造方法により製造される自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の使用がさらに提供される。好ましくは、上記がんは、ＲＯＢＯ１高発現腫瘍及びその関連疾患である。
【0035】
本発明の好ましい実施例において、上記がんは、肝臓がん、乳がん、結腸がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん又は肺がんである。
【0036】
本発明の好ましい実施例において、上記医薬品は、腫瘍内投与剤形の医薬品、例えば、腫瘍内注射剤形の医薬品又は静脈内注入剤型の医薬品である。
【0037】
本発明によれば、上記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、上記製造方法により製造される自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、又は上記医薬組成物を用いてがんを治療及び／又は予防する方法であって、有効量の自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を含む医薬組成物を患者に投与することを含む方法がさらに提供される。
【0038】
本発明の好ましい実施例において、上記がんは、ＲＯＢＯ１高発現腫瘍及びその関連疾患である。
【0039】
本発明の好ましい実施例において、上記がんは、肝臓がん、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がん、前立腺がん、胃がん又は肺がんであり、好ましくは、上記がんは、乳がん、結腸直腸がん又は肝臓がんである。
【0040】
本発明の好ましい実施例において、上記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の投与量は（０．５～５）×１０９細胞／回である。
【0041】
本発明の好ましい実施例において、上記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の投与方法は、腫瘍内注射、静脈注射、胸腔内注射又は局所的介入である。
【0042】
本発明の好ましい実施例において、上記自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の投与方法は、静脈注射である。
【0043】
本発明は、以下の有益な効果を有する。
まず、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、腫瘍系疾患の治療薬としてＲＯＢＯ１分子高発現腫瘍の治療に適用でき、且つサイトカインストームなどの有害現象がなく、従来の手術、化学療法、放射線療法に効果のない腫瘍に対して新しい治療法を提供する。また、ＮＫ９２細胞をそこにＣＡＲを導入することで改変することにより標的性は大幅に向上し、ＣＡＲにおける標的は抗腫瘍標的ＲＯＢＯ１であり、標的性を向上させるとともに、その抗腫瘍性能を大幅に向上させる。さらに、臨床前の実験により、現在使用されているＲＯＢＯ１ＣＡＲ－ＮＫの毒性や副作用はＣＡＲ－Ｔよりも小さく、殺傷効果はより高いことを発見した。つまり、本発明で構築されるＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、まず、ＮＫ９２細胞をそこにＣＡＲを導入することで改変することによりその標的性が向上し、そして、ＮＫ９２細胞はリンパ腫患者の末梢血から分離して構築されたものであるため、ＭＨＣ制限なしで標的細胞を識別でき、前感作なしで腫瘍細胞を殺傷できるとともに、一連のサイトカインを産生して生体の獲得免疫を調節できるので、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫは、二次免疫を調節できる作用も有する。しかし、人体に使用した後、腫瘍が形成される可能性がある。
まず、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、腫瘍系疾患の治療薬としてＲＯＢＯ１分子高発現腫瘍の治療に適用でき、且つサイトカインストームなどの有害現象がなく、従来の手術、化学療法、放射線療法に効果のない腫瘍に対して新しい治療法を提供する。また、ＮＫ９２細胞をそこにＣＡＲを導入することで改変することにより標的性は大幅に向上し、ＣＡＲにおける標的は抗腫瘍標的ＲＯＢＯ１であり、標的性を向上させるとともに、その抗腫瘍性能を大幅に向上させる。さらに、臨床前の実験により、現在使用されているＲＯＢＯ１ＣＡＲ－ＮＫの毒性や副作用はＣＡＲ－Ｔよりも小さく、殺傷効果はより高いことを発見した。つまり、本発明で構築されるＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、まず、ＮＫ９２細胞をそこにＣＡＲを導入することで改変することによりその標的性が向上し、そして、ＮＫ９２細胞はリンパ腫患者の末梢血から分離して構築されたものであるため、ＭＨＣ制限なしで標的細胞を識別でき、前感作なしで腫瘍細胞を殺傷できるとともに、一連のサイトカインを産生して生体の獲得免疫を調節できるので、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫは、二次免疫を調節できる作用も有する。しかし、人体に使用した後、腫瘍が形成される可能性がある。
【0044】
そこで、ＣＡＲ－ＮＫ療法の安全性及び制御可能性をさらに向上させるために、本発明者らは、現在のＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞をもとに、レンチウイルストランスフェクション技術により、自殺遺伝子をゲノムに組み込んで作用メカニズムが異なる自殺遺伝子を持つＣＡＲ－ＮＫを形成した。インビトロで低分子化学インデューサー、例えば、ＡＰ１９０３医薬品を加えると、自殺遺伝子におけるＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖ上のドメインと結合して二量体のｉＣａｓｐａｓｅ９を形成し、Ｃａｓｐａｓｅ３，６，７を活性化し、細胞アポトーシスを誘発することができる。インビトロでインデューサーであるセツキシマブを加えると、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫは、殺傷／エフェクター細胞（ＮＫ９２－ＣＤ１６、即ち、ＣＤ１６分子を高発現するＮＫ９２細胞株）又はＰＢＭＣの作用下で、セツキシマブとＥＧＦＲｔが結合し、そのＦｃセグメントがＮＫ９２－ＣＤ１６又はＰＢＭＣ表面のＦｃＲに結合し、抗体依存性細胞が媒介する細胞毒性作用（ＡＤＣＣ）を活性化し、殺傷／エフェクター細胞が標的細胞を直接殺傷するように媒介することにより、ＣＡＲ－ＮＫ細胞をより良好に制御でき、臨床上の安全性及び制御可能性がさらに向上し、ＣＡＲ－ＮＫ療法の発展を促進できる。
【図面の簡単な説明】
【0045】
図面を参照しながら以下の詳細な説明を読むことにより、本発明をより明確に理解することができる。
【図1】本発明の実施例１に係るレンチウイルスプラスミドベクターｐＲＲＬＳＩＮ－ＳｃＦｖ（ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）の構造模式図である。
【図2】本発明の実施例４に係るｉＣａｓｐａｓｅ９自殺遺伝子を持つレンチウイルスプラスミドベクター（１９４２－３－ＩＣ９）の構造模式図である。
【図5】本発明の実施例４に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に対してフローサイトメトリーによりｉＣａｓｐａｓｅ９とＲＯＢＯ１の陽性率を検出した結果の図である。ここで、ＰＥはＦｌａｇタブを検出するチャンネルである。Ｆｌａｇ－ＰＥチャンネル内の陽性率はＲＯＢＯ１ ＣＡＲ陽性率の結果を示す。ＡＰＣはＣＤ１９を検出するチャンネルである。ＡＰＣ－ＣＤ１９チャンネル内の陽性率はｉＣａｓｐａｓｅ９陽性率の結果を示す。Ｆｌａｇ／ＣＤ１９は検出された二重陽性の結果を示す。この二重陽性の陽性率は、ｉＣａｓｐａｓｅ９とＲＯＢＯ１が同時に発現する陽性率の結果を示す。
【図6】本発明の実施例４に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のＲＴ－ＰＣＲ ｍＲＮＡレベルの検出結果である。同図において、１はＮＫ－９２細胞、２はＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、３はＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９細胞、ｉＣａｓ９はｉＣａｓｐａｓｅ９を示す。
【図7】本発明の実施例５に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の全ゲノムのシークエンシング結果である。結果は分析されたゲノム挿入位置の情報である。
【図8】本発明の実施例６に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の安定性検出結果である。
【図9】ＡＰ１９０３によって誘導される本発明の実施例６に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のアポトーシスの結果である。
【図10a】本発明の実施例６に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７に対してフローサイトメトリーにより陽性率を検出した結果である。
【図10b】本発明の実施例６に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｄ５に対してフローサイトメトリーにより陽性率を検出した結果である。
【図11】本発明の実施例７に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に対して異なる濃度のＡＰ１９０３によりアポトーシスを誘導した結果である。
【図12】本発明の実施例７において異なる濃度のＡＰ１９０３によりそれぞれ２ｈ、４ｈ及び２４ｈ処理した細胞に対して新鮮な培地を交換した後、引き続き３日培養した後の細胞存生存率のカウント結果である。
【図13】本発明の実施例７において４ｈ処理した後の実験群に対して新鮮な培地を交換して２４ｈ培養した結果である。
【図14a】本発明の実施例８における異なる乳がん細胞中のＲＯＢＯ１のタンパク質の発現状況の検出結果である。同図において、ＨＣＣ１１８７、ＨＣＣ１９３７、ＨＣＣ３８、ＭＤＡＭＢ－２３１、ＭＤＡＭＢ－４５３、ＭＤＡＭＢ－４６８はトリプルネガティブ乳がん細胞株である。
【図15】本発明の実施例９に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を乳がん細胞に用いた殺傷結果である。
【図17a】本発明の実施例９における正常乳腺細胞及びＰＢＭＣ中のＲＯＢＯ１の発現状況の検出結果である。
【図17b】本発明の実施例９に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の正常乳腺細胞及びＰＢＭＣに対する殺傷の実験結果である。
【図18】本発明の実施例９に係るＰＢＭＣの自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に対する殺傷結果である。
【図19】本発明の実施例１０に係るレンチウイルスプラスミドベクター１９４２－３－ｈＥＧＦＲｔの構造模式図である。
【図20】本発明の実施例１０に係るＥＦＧＲｔの構造模式図である。
【図21a】本発明の実施例１０に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－３Ｃ１０－２Ｄ１０に対してフローサイトメトリーにより陽性率を検出した結果である。
【図21b】本発明の実施例１０に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－３Ｃ１０－１Ｆ１１に対してフローサイトメトリーにより陽性率を検出した結果である。
【図22】本発明の実施例１１に係る異なる種類のがん細胞中のＲＯＢＯ１タンパク質の発現レベルの検出結果である。
【図23a】本発明の実施例１１に係る自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を殺傷実験に用いた殺傷結果の実験図である。
【図23b】本発明の実施例１１においてＲＯＢＯ１を過剰発現するモノクローナル細胞株（ＨＣＴ１１６－ＲＯＢＯ１）モデルにより測定された自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を殺傷実験に用いた特異性殺傷結果の実験図である。
【図23c】本発明の実施例１１においてＲＯＢＯ１を過剰発現するモノクローナル細胞株（ＭＤＡＭＢ－２３１－ＲＯＢＯ１）モデルにより測定された自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を殺傷実験に用いた特異性殺傷結果の実験図である。
【図24】本発明の実施例１２においてインビトロで構築されたＮＫ９２－ＣＤ１６（高親和力）エフェクター細胞により自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－ＣＡＲ－ＮＫ細胞中の自殺スイッチの有効性を評価する実験結果の図である。
【図25】本発明の実施例１２においてＰＢＭＣエフェクター細胞により自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－ＣＡＲ－ＮＫ細胞中の自殺スイッチの有効性を評価する実験結果の図である。 図面において、ＡＴＣＧ４２７Ａ－２ｈ、ＡＴＣＧ４２７Ａ－４ｈ、ＡＴＣＧ４２７Ａ－２４ｈはそれぞれＡＰ１９０３でＡＴＣＧ４２７Ａを２ｈ、４ｈ及び２４ｈ誘導処理した結果を示す。ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７－２ｈ、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７－４ｈ、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７－２４ｈはそれぞれＡＰ１９０３でＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７を２ｈ、４ｈ及び２４ｈ誘導処理した結果を示す。ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｄ５－２ｈ、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｄ５－４ｈ、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｄ５－２４ｈは、ＡＰ１９０３でＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｄ５を２ｈ、４ｈ及び２４ｈ誘導処理した結果を示す。 Ｔ４７Ｄ－２ｈ、ＨＣＣ１１８７－２ｈ、ＭＣＦ－２ｈ、ＨｅｐＧ２－２ｈ、Ｈｕｈ７－２ｈ、ＨＣＴ１１６－２ｈ、ＨＣＴ１１６－Ｆｌａｇ．ＲＯＢＯ１．Ｆｕｌｌ－１Ｃ１１－２ｈ、ＨＣＴ１１６－Ｆｌａｇ．ＲＯＢＯ１．Ｆｕｌｌ－１Ｄ１１－２ｈ、ＭＤＡＭＢ－２３１－２ｈ、ＭＤＡＭＢ－２３１－Ｆｌａｇ．ＲＯＢＯ１．Ｆｕｌｌ－１Ｃ１１－２ｈ、ＭＤＡＭＢ－２３１－Ｆｌａｇ．ＲＯＢＯ１．Ｆｕｌｌ－１Ｄ１１－２ｈは、いずれも対応するがん細胞を２ｈ誘導殺傷したがん細胞を示す。ＨＣＴ１１６－Ｆｌａｇ．ＲＯＢＯ１．Ｆｕｌｌ－１Ｃ１１－２ｈ、ＨＣＴ１１６－Ｆｌａｇ．ＲＯＢＯ１．Ｆｕｌｌ－１Ｄ１１－２ｈは、それぞれＲＯＢＯ１を過剰発現するＨＣＴ１１６－ＲＯＢＯ１モデルの異なるクローンにより２ｈ誘導殺傷したことを示す。ＭＤＡＭＢ－２３１－Ｆｌａｇ．ＲＯＢＯ１．Ｆｕｌｌ－１Ｃ１１－２ｈ、ＭＤＡＭＢ－２３１－Ｆｌａｇ．ＲＯＢＯ１．Ｆｕｌｌ－１Ｄ１１－２ｈは、それぞれＲＯＢＯ１を過剰発現するＭＤＡＭＢ－２３１－ＲＯＢＯ１モデルの異なるクローンにより２ｈ誘導殺傷したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0046】
以下、図面を参照しながら本発明の各例示的実施例を説明する。なお、特に明記しない限り、これらの実施例に記載の方法及びステップのパラメータは本発明の範囲に限定されない。
【0047】
以下、少なくとも１つの例示的実施例に対する説明は、実質的に例示的なものにすぎず、本発明及びその応用又は使用を制限するものではない。
【0048】
関連分野の通常の技術者に知られている技術、方法は詳細に論じられないことがあるが、適切な場合には明細書の一部とみなされる。
【0049】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ＮＫ細胞」は、末梢血ＮＫ細胞、ＮＫ９２細胞及び他のＮＫ細胞を含む。
【0050】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ＮＫ－９２細胞」は、ＮＫ細胞と同義である。
【0051】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ」とは、ＲＯＢＯ１を標的とするキメラ抗原受容体細胞、特に、ＲＯＢＯ１を標的とする強化されたＣＡＲ－Ｔ細胞及びＣＡＲ－ＮＫ細胞を指す。本明細書に記載の英語の名称は大文字と小文字を区別しない。例えば、ＲＯＢＯ１、Ｒｏｂｏ１、ｒｏｂｏ１などで表される意味は同じである。Ｒｏｂｏ１ ＣＡＲ－ＮＫ、Ｒｏｂｏ１－ＣＡＲ ＮＫで表される意味は同じである。それらの具体的な製造過程は以下の実施例で後述する。
【0052】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ＡＴＣＧ４２７Ａ」とは、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞又はＲＯＢＯ１ＭＣＡＲ－ＮＫを指す。
【0053】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ｉＣａｓｐａｓｅ９」、「ｉＣａｓ９」とは、いずれも誘導性自殺遺伝子Ｃａｓｐａｓｅ９を指す。
【0054】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞」とは、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を指す。
【0055】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ＡＴＣＧ４２７Ｂ」とは、自殺遺伝子ｉＣａｓｐａｓｅ９を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、即ちＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を指す。
【0056】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ＦＫＢＰ１２」とは、ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖを指す。
【0057】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ＣＭＶ」とは、ＣＭＶプロモーターを指す。
【0058】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ＡＴＣＧ４２７Ｅ」とは、自殺遺伝子ＥＧＦＲｔを持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、即ちＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を指す。
【0059】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ＡＴＣＧ４２７Ａ－ＫＯ」とは、「Ｃｒｉｓｐ Ｃａｓ９遺伝子編集によりＣＡＲにおけるＲＯＢＯ１－ｓｃＦＶ標的の遺伝子配列をノックアウトし、シグナル伝達配列を残したものをＮＫ９２細胞にノックインし、即ち４２７ＡにおけるＣＡＲと同様のゲノム挿入部位にＲＯＢＯ１標的がないＣＡＲ配列をノックインしたＮＫ細胞を指す。
【0060】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「ＮＫ」とは、正常ヒトＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞株を指し、ＮＫ９２細胞、ＹＴ細胞、ＮＫＬ細胞、ＨＡＮＫ－１細胞、ＮＫ－ＹＳ細胞、ＫＨＹＧ－１細胞、ＳＮＫ－６細胞及びＩＭＣ－１細胞などを含む。本発明の具体的な実施例ではＮＫ９２細胞を例として説明する。
【0061】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「担体」は物質組成物であり、分離された核酸を含み、分離された核酸を細胞内部に送達することに使用できる。当該技術分野で知られている担体は数多くあり、線状ポリヌクレオチド、イオン又は両性分子化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含むが、これらに限定されない。したがって、「担体」という用語は、自己複製可能なプラスミド又はウイルスを含む。この用語は、核酸の細胞への転移を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどを含むものとしても解釈されるべきである。ウイルスベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0062】
特に明記しない限り、本明細書に記載の「抗体」は、抗体全体及び任意の抗原結合断片（即ち、抗原結合部分）又は一本鎖を含む。
【0063】
特に明記しない限り、本明細書に記載の試薬は、いずれも分析グレードの純度であり、正規ルートから購入可能である。
【0064】
実施例で使用される材料の由来
ＮＫ－９２細胞（ＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０７）；乳がんＢＴ４７４、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１１８７、ＨＣＣ１９３７、ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ－２３１、ＭＤＡＭＢ－４５３、ＭＤＡＭＢ－４６８、ＺＲ－７５－１；肺がん細胞Ａ５４９、Ｈ１２９９；肝がん細胞Ｈｕｈ７、ＳＭＭＣ７７２１及びＨＥＰＧ２；膵臓がん細胞ＢｘＰＣ３、ＰＡＮＣ１、Ｃａｐａｎ－２、及びＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔ細胞；結腸直腸がん細胞ＨＴ－２９、ＬｏＶｏ及びＨＣＴ１１６は、いずれも中国科学院上海生科院細胞資源センターから購入した。
ＮＫ－９２細胞（ＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０７）；乳がんＢＴ４７４、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１１８７、ＨＣＣ１９３７、ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ－２３１、ＭＤＡＭＢ－４５３、ＭＤＡＭＢ－４６８、ＺＲ－７５－１；肺がん細胞Ａ５４９、Ｈ１２９９；肝がん細胞Ｈｕｈ７、ＳＭＭＣ７７２１及びＨＥＰＧ２；膵臓がん細胞ＢｘＰＣ３、ＰＡＮＣ１、Ｃａｐａｎ－２、及びＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔ細胞；結腸直腸がん細胞ＨＴ－２９、ＬｏＶｏ及びＨＣＴ１１６は、いずれも中国科学院上海生科院細胞資源センターから購入した。
【0065】
実施例１：レンチウイルスベクターの製造
ＳｃＦｖ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８（ＣＤ８ＴＭ）－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子配列（そのアミノ酸配列は配列番号８に示され、遺伝子配列は配列番号１０に示される）及び変異型ＳｃＦｖ （Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８（ＣＤ８ＴＭ）－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子配列（そのアミノ酸配列は配列番号９に示され、遺伝子配列は配列番号１１に示され、その変異部位ＧＣＣはＧＣＧであってもよい）をそれぞれ合成した。ＳｃＦＶ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子を例としてＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の製造過程を説明する。変異型ＳｃＦＶ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子を用いてＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を製造する過程はそれと同じである。
ＳｃＦｖ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８（ＣＤ８ＴＭ）－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子配列（そのアミノ酸配列は配列番号８に示され、遺伝子配列は配列番号１０に示される）及び変異型ＳｃＦｖ （Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８（ＣＤ８ＴＭ）－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子配列（そのアミノ酸配列は配列番号９に示され、遺伝子配列は配列番号１１に示され、その変異部位ＧＣＣはＧＣＧであってもよい）をそれぞれ合成した。ＳｃＦＶ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子を例としてＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の製造過程を説明する。変異型ＳｃＦＶ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子を用いてＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を製造する過程はそれと同じである。
【0066】
酵素消化によりＳｃＦｖ（Ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）－ＣＤ８－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ融合遺伝子配列をｐＲＲＬＳＩＮベクターに変換結合し、遺伝子の上流はＥＦ－１αプロモーターである。ベクターでＳｔｂｌ３大腸菌株を形質転換し、アンピシリンでスクリーニングし、陽性クローンを得た。プラスミドを抽出し、酵素消化してクローンを同定し、ｐＲＲＬＳＩＮ－ＳｃＦｖ（ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）レンチウイルストランスフェクションベクターを得た（図１）。
【0067】
実施例２：レンチウイルスの製造
（１）トランスフェクションの２４時間前、約８×１０６個の細胞／皿でＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔ細胞を１５ｃｍペトリ皿に接種した。トランスフェクション中に細胞が約８０％のコンフルエントでペトリ皿に均一に分布することを確保するようにした。
（１）トランスフェクションの２４時間前、約８×１０６個の細胞／皿でＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔ細胞を１５ｃｍペトリ皿に接種した。トランスフェクション中に細胞が約８０％のコンフルエントでペトリ皿に均一に分布することを確保するようにした。
【0068】
（２）溶液Ａ及び溶液Ｂの準備
溶液Ａ：６．２５ｍｌ ２×ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ緩衝液（５つの大きな皿を一緒にパッケージングした量；最も効果的である）。
溶液Ａ：６．２５ｍｌ ２×ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ緩衝液（５つの大きな皿を一緒にパッケージングした量；最も効果的である）。
【0069】
溶液Ｂは、以下のプラスミドをそれぞれ添加した混合物である。
１１２．５μｇ ｐＲＲＬＳＩＮ－ＳｃＦｖ （ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）（ｔａｒｇｅｔ ｐｌａｓｍｉｄ）；３９．５μｇ ｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－Ｇ ｅｎｖｅｌｏｐ）；７３μｇ ｐＣＭＶＲ８．７４（ｇａｇ，ｐｏｌ，ｔａｔ，ｒｅｖ）；６２５μｌ ２Ｍカルシウムイオン溶液。溶液Ｂの総体積は６．２５ｍｌであった。
１１２．５μｇ ｐＲＲＬＳＩＮ－ＳｃＦｖ （ａｎｔｉ ＲＯＢＯ１－ＦＮ３）（ｔａｒｇｅｔ ｐｌａｓｍｉｄ）；３９．５μｇ ｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ－Ｇ ｅｎｖｅｌｏｐ）；７３μｇ ｐＣＭＶＲ８．７４（ｇａｇ，ｐｏｌ，ｔａｔ，ｒｅｖ）；６２５μｌ ２Ｍカルシウムイオン溶液。溶液Ｂの総体積は６．２５ｍｌであった。
【0070】
溶液Ｂを十分に混合し、溶液Ａを軽くボルテックスしながら、溶液Ｂを一滴ずつ加え、ＡとＢの混合溶液を得た後、５－１５分間静置した。上記ＡとＢの混合溶液を軽くボルテックスし、２．５ｍｌ／皿でＬｅｎｔｉ－Ｘ－２９３Ｔ細胞を含むペトリ皿に一滴ずつ加え、ペトリ皿を軽く前後揺動してＤＮＡとカルシウムイオンの混合物を均一に分布させ、さらにこのペトリ皿を回転せずにインキュベーターに置いて１６－１８時間培養した。新鮮な培地を交換して引き続き培養し、それぞれ４８時間及び７２時間後にウイルスを含む上清を収集した。５００ｇ、２５℃で１０分間遠心分離した。ＰＥＳ膜（０．４５μｍ）で濾過した。濾過したレンチウイルスを含む上清を限外ろ過遠沈管に転移した。各管における上清の体積が管容積の２／３以下であり、２５０００ｒｐｍ、４℃で２時間遠心分離した。遠沈管を注意深く取り出し、上清を捨て、遠沈管を逆さにして残留液を除去した。１００μｌ新鮮な培地を加え、遠沈管を密封して４℃で２時間静置し、２０分間ごとに軽くボルテックスし、５００ｇで１分間（２５℃）遠心分離し、ウイルス上清を収集した。さらに収集したウイルス上清を氷上で冷却した後、－８０℃で保存した。
【0071】
実施例３：ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の製造
ＮＫ９２細胞密度を（２～３）×１０５個／ｍｌに調整し、ウイルス：細胞培地＝１：５の体積比（Ｖ／Ｖ）で実施例２で製造されたウイルスを添加し、同時にポリブレン８μｇ／ｍｌを添加した。４ｈ後に、等量の新鮮な完全培地を補充して細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、引き続き培養した。翌日、すべての細胞を遠心分離し、新鮮な培地を加え、引き続き培養した。細胞密度が（２～３）×１０５個／ｍｌに維持されるように１～２ごとに培養液を補充した。７２ｈ後にＣＡＲ抗体染色を行い、フローサイトメトリーによりＲＯＢＯ１ ＣＡＲ ＮＫ－９２陽性細胞を選別して拡大培養した。培地の色の変化、細胞密度、細胞形態を毎日観察し、記録した。
ＮＫ９２細胞密度を（２～３）×１０５個／ｍｌに調整し、ウイルス：細胞培地＝１：５の体積比（Ｖ／Ｖ）で実施例２で製造されたウイルスを添加し、同時にポリブレン８μｇ／ｍｌを添加した。４ｈ後に、等量の新鮮な完全培地を補充して細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整し、引き続き培養した。翌日、すべての細胞を遠心分離し、新鮮な培地を加え、引き続き培養した。細胞密度が（２～３）×１０５個／ｍｌに維持されるように１～２ごとに培養液を補充した。７２ｈ後にＣＡＲ抗体染色を行い、フローサイトメトリーによりＲＯＢＯ１ ＣＡＲ ＮＫ－９２陽性細胞を選別して拡大培養した。培地の色の変化、細胞密度、細胞形態を毎日観察し、記録した。
【0072】
フローサイトメトリーにより選別した後、陽性ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ ＮＫ－９２細胞をＧＭＰ工場で継続培養し、臨床使用に必要な量に増殖させた後、遠心分離及び３回の洗浄（ＰＢＳ溶液）を行い、臨床治療のために、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ ９２を生理食塩水に再懸濁させた。
【0073】
臨床治療前に、細胞品質の安全性を確保するために、薬局方に規定の検出方法に従ってＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ ９２の品質を検査した。検査結果を表１に示す。
【0074】
【表1】
【0075】
フローサイトメトリーによりＣＡＲ ＮＫ－９２細胞の陽性率を検出した。フローサイトメトリー検出の結果を図３ａ及び図３ｂに示す。図３ａ及び図３ｂにおいて、用いる抗体はＡＰＣ蛍光標識であり、横軸に示される。ＮＫ－９２細胞がＣＡＲ分子を正常に発現した場合、信号値は顕著に高くなる。図３ａ及び図３ｂから分かるように、ＡＰＣ蛍光標識の信号値は顕著に高くなり、ＮＫ－９２細胞がＣＡＲ分子を正常に発現したことを示しており、ＣＡＲ－ＮＫ９２陽性率は９８．８９％であった。
【0076】
図４ａ及び図４ｂは、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫフローサイトメトリーによりＣＤ５６分子の陽性率を検出した結果の図である。図４ａは対照群、図４ｂは実験群である。図４ａ及び図４ｂから分かるように、ＣＤ５６分子は陽性であるため、製造されたＣＡＲ－ＮＫ９２細胞はＣＤ５６分子を失わず、他の形の分化が発生せず、ＮＫ細胞の基本的な特性を保存していることを示している。
【0077】
同様の方法によりＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を製造した。
実施例４：ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の製造
ｉＣａｓｐａｓｅ９自殺遺伝子［配列番号６：ＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＣＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＴＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡ（ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖ：配列番号１）ＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣ（Ｌｉｎｋｅｒ：配列番号３）ＧＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡ（ΔＣａｓｅｐａｓｅ９：配列番号２）ＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡ（Ｔ２Ａ：配列番号５）ＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＡＧＧＧＧＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＧＧＡＧＴＣＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＣＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣＴＣＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣＣＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＧＣＣＡＡＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＣＡＣＣＧＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＣＣＴＡＡＧＴＣＡＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＡＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＡＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＡＧＴＡＣＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧＣＴＴＡＴＣＴＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＧＡＣＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＧＴＧＡ（ＣＤ１９：配列番号４）］を合成し、さらに、それをレンチウイルスベクターにクローニングし、ｉＣａｓｐａｓｅ９自殺遺伝子を持つレンチウイルスプラスミドベクター（１９４２－３－ＩＣ９）（図２に示すように、そのヌクレオチド配列は配列番号７に示される）を得た後、３プラスミドシステム（補助プラスミドｐＭＤ２．Ｇ及びｐＣＭＶＲ８．７４）によりウイルスをパッケージングし（ウイルスをパッケージングするヌクレオチド配列は配列番号７に示される）、そしてウイルス感染により実施例３で製造されたＲＯＢＯ１ＣＡＲ－ＮＫ細胞（又はＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞；以下の実施例に用いるのはＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞である）に感染させ、さらにフローサイトメトリーによりＲＯＢＯ１及びｉＣａｓｐａｓｅ９の両方とも陽性である細胞、即ち自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞）を選別し、スクリーニングされた細胞を培養し、培養した細胞に対してフローサイトメトリーにより自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の陽性率を検出した。結果を図５に示す。図から分かるように、ＡＰＣ及びＰＥ蛍光標識の信号値はいずれも顕著に高くなり、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（即ち、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞）が正常に得られた。
実施例４：ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の製造
ｉＣａｓｐａｓｅ９自殺遺伝子［配列番号６：ＡＴＧＧＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＧＡＣＧＧＧＣＧＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＡＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＣＡＣＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＡＴＴＣＣＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＴＧＣＴＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＴＧＣＣＣＡＧＡＴＧＡＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＴＣＴＣＣＡＧＡＴＴＡＴＧＣＣＴＡＴＧＧＴＧＣＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＡＣＴＧＧＡＡ（ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖ：配列番号１）ＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＴＣＧＡＣ（Ｌｉｎｋｅｒ：配列番号３）ＧＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＣＧＴＧＡＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＴＧＣＧＧＣＧＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＣＴＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＣＴＡＣＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＴＣＧＧＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＡＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣＧＣＣＡＴＡＴＣＴＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＴＡＣＴＣＴＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＴＧＧＴＡＣＧＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＡＧＧＧＴＣＧＣＴＡＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＴＣＡ（ΔＣａｓｅｐａｓｅ９：配列番号２）ＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＧＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＣＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡ（Ｔ２Ａ：配列番号５）ＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＴＧＧＡＡＧＴＣＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧＡＡＣＣＴＣＴＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＴＡＡＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＴＣＡＡＧＧＧＧＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＣＴＣＧＧＧＡＧＴＣＣＣＣＧＣＴＴＡＡＡＣＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＡＣＴＣＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＣＡＴＧＡＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＴＣＴＣＴＣＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＧＧＣＣＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＣＡＧＴＣＡＡＴＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＣＴＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＴＴＣＧＧＡＣＣＴＡＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＣＴＴＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＡＴＧＡＧＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＧＣＣＡＡＡＧＡＣＣＧＣＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＣＡＣＣＧＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＴＣＴＧＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＣＣＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧＧＧＧＣＣＴＡＡＧＴＣＡＴＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＡＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＡＴＡＴＧＴＧＧＧＴＡＡＴＧＧＡＧＡＣＧＧＧＴＣＴＧＴＴＧＴＴＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＡＧＴＡＣＴＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧＣＴＴＡＴＣＴＧＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＣＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＣＧＡＡＴＧＡＣＴＧＡＣＣＣＣＡＣＣＡＧＧＡＧＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＧＡＣＧＣＣＴＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＧＧＧＴＧＡ（ＣＤ１９：配列番号４）］を合成し、さらに、それをレンチウイルスベクターにクローニングし、ｉＣａｓｐａｓｅ９自殺遺伝子を持つレンチウイルスプラスミドベクター（１９４２－３－ＩＣ９）（図２に示すように、そのヌクレオチド配列は配列番号７に示される）を得た後、３プラスミドシステム（補助プラスミドｐＭＤ２．Ｇ及びｐＣＭＶＲ８．７４）によりウイルスをパッケージングし（ウイルスをパッケージングするヌクレオチド配列は配列番号７に示される）、そしてウイルス感染により実施例３で製造されたＲＯＢＯ１ＣＡＲ－ＮＫ細胞（又はＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞；以下の実施例に用いるのはＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞である）に感染させ、さらにフローサイトメトリーによりＲＯＢＯ１及びｉＣａｓｐａｓｅ９の両方とも陽性である細胞、即ち自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞）を選別し、スクリーニングされた細胞を培養し、培養した細胞に対してフローサイトメトリーにより自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の陽性率を検出した。結果を図５に示す。図から分かるように、ＡＰＣ及びＰＥ蛍光標識の信号値はいずれも顕著に高くなり、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（即ち、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞）が正常に得られた。
【0078】
さらに、培養後のＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞のＲＮＡを抽出し、自殺遺伝子断片をＲＴ－ＰＣＲ ｍＲＮＡレベルで検出し、ＮＫ－９２細胞及びＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞を対照とした。結果を図６に示す。図から分かるように、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞）はｍＲＮＡレベルで検証され得る。
【0079】
実施例５：ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のシークエンシング
実施例４で製造されたＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞の全ゲノムをシークエンシングしてＮＫ－９２細胞ゲノムでの挿入部位を検出した。シークエンシング結果を図７に示す。ＰＣＲ方法によりシークエンシング結果を検証したところ、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子が２番染色体に挿入され、ＲＯＢＯ１遺伝子が１０番染色体に挿入された。
実施例４で製造されたＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞の全ゲノムをシークエンシングしてＮＫ－９２細胞ゲノムでの挿入部位を検出した。シークエンシング結果を図７に示す。ＰＣＲ方法によりシークエンシング結果を検証したところ、ｉＣａｓｐａｓｅ９遺伝子が２番染色体に挿入され、ＲＯＢＯ１遺伝子が１０番染色体に挿入された。
【0080】
実施例６：ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の安定性スクリーニング
実施例４で構築されたＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞を培養し、異なるクローンのＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞をそれぞれＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｄ１１、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｅ１、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ５、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ９、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｃ３、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｄ５と表記し、そしてフローサイトメトリーによりこれらの細胞におけるタグ抗体Ｆｌａｇ及びＣＤ１９の陽性率を検出し（具体的には、それぞれフローサイトメトリー用抗体Ｆｌａｇ及びＣＤ１９により細胞を暗所で１５ｍｉｎ染色した後、ＰＢＳで２回洗浄し、検出する）、細胞安定性の指標とした。結果を図８に示す。
実施例４で構築されたＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞を培養し、異なるクローンのＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞をそれぞれＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｄ１１、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｅ１、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ５、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ９、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｃ３、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｄ５と表記し、そしてフローサイトメトリーによりこれらの細胞におけるタグ抗体Ｆｌａｇ及びＣＤ１９の陽性率を検出し（具体的には、それぞれフローサイトメトリー用抗体Ｆｌａｇ及びＣＤ１９により細胞を暗所で１５ｍｉｎ染色した後、ＰＢＳで２回洗浄し、検出する）、細胞安定性の指標とした。結果を図８に示す。
【0081】
異なる量のＡＰ１９０３医薬品をそれぞれ実施例４で得られたＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＡＰ１９０３医薬品の最終濃度は０ｎＭ及び１０ｎＭ）に加えて４ｈ処理し、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞のアポトーシスへの影響を検出した。結果を図９に示す。
【0082】
図８－９から分かるように、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７及び２Ｄ５は、インビトロで比較的安定で安全性が比較的高い２本のサブクローンである。
【0083】
フローサイトメトリーにより陽性率を検出した後の自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞から２本の最適なサブクローンを選んで実験及び連続培養を行い、また、この２本のサブクローン細胞につきシークエンシング検証を行ったところ、シークエンシング結果は正しかった。最後に、検証後のサブクローンに対してフローサイトメトリーによりそれぞれＲＯＢＯ１及びｉＣａｓｐａｓｅ ９の陽性率を検出した。結果を図１０ａ－１０ｂに示す。図から分かるように、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７及び２Ｄ５は、スクリーニングされた安定な２本のサブクローンである。
【0084】
実施例７：ＡＰ１９０３医薬品によって誘導されるＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞アポトーシスの検出
異なる量のＡＰ１９０３医薬品を実施例６でスクリーニングされた自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７及び２Ｄ５）に加え、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＡＴＣＧ４２７Ｂと表記する）アポトーシスに対する影響を検出し、ＡＰ１９０３医薬品をＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に加えて対照とし、３つの実験群に分け、異なる濃度のＡＰ１９０３医薬品（０ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ）で細胞を２ｈ、４ｈ及び２４ｈ処理し、次いで細胞アポトーシスの状況を確認した。結果を図１１に示す。それぞれ４ｈ及び２４ｈ処理した後の実験群に対して新鮮な培地を交換して引き続き培養し、３日後に細胞の生存率をカウントした。結果を図１２に示す。さらに、４ｈ処理した後の０ｎＭ、１０ｎＭ実験群に対して新鮮な培地を交換して２４ｈ培養した後、写真を撮った。結果を図１３に示す。
異なる量のＡＰ１９０３医薬品を実施例６でスクリーニングされた自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７及び２Ｄ５）に加え、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＡＴＣＧ４２７Ｂと表記する）アポトーシスに対する影響を検出し、ＡＰ１９０３医薬品をＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に加えて対照とし、３つの実験群に分け、異なる濃度のＡＰ１９０３医薬品（０ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ）で細胞を２ｈ、４ｈ及び２４ｈ処理し、次いで細胞アポトーシスの状況を確認した。結果を図１１に示す。それぞれ４ｈ及び２４ｈ処理した後の実験群に対して新鮮な培地を交換して引き続き培養し、３日後に細胞の生存率をカウントした。結果を図１２に示す。さらに、４ｈ処理した後の０ｎＭ、１０ｎＭ実験群に対して新鮮な培地を交換して２４ｈ培養した後、写真を撮った。結果を図１３に示す。
【0085】
図１１から分かるように、ＡＰ１９０３医薬品を用いてインビトロ、１０ｎＭの濃度で細胞を２ｈ処理することで、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９細胞は６０％のアポトーシス効率に達し、４ｈでは８０％、２４ｈでは９５％以上に達する一方、ＲＯＢＯ１ＣＡＲ－ＮＫ細胞はほとんどアポトーシスしなかった。
【0086】
図１２から分かるように、ＡＰ１９０３医薬品で処理した後、ＲＯＢＯ１ＣＡＲ－ＮＫ細胞の生存率は８０％以上である一方、本発明のＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞はほとんど全部アポトーシスした。
【0087】
図１３から分かるように、１０ｎＭのＡＰ１９０３医薬品で処理した後、２４ｈ観察したところ、細胞はほとんどアポトーシスした。
【0088】
上記結果より、ＡＰ１９０３医薬品は、２４時間内でＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞を効果的に殺傷できるが、ＲＯＢＯ１ＣＡＲ－ＮＫ細胞に対して作用しない。これは、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞をがんの治療に使用すると、ＡＰ１９０３医薬品の誘導によって細胞はアポトーシスし、これによって、ＣＡＲ－ＮＫ細胞をより良好に制御でき、臨床上の安全性を高めることができることを示している。
【0089】
実施例８：異なる乳がん細胞株におけるＲＯＢＯ１発現の検出
異なる乳がん細胞ＢＴ４７４、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１１８７、ＨＨ１９３７、ＨＣＣ３８、ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ－２３１、ＭＤＡＭＢ－４５３、ＭＤＡＭＢ－４６８及びＺＲ－７５－１を培養した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにより異なる乳がん細胞におけるＲＯＢＯ１の発現状況を検出した。結果を図１４ａに示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによりＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔで測定したＲＯＢＯ１の光学密度と対照ＧＡＰＤＨの光学密度との比を分析した。結果を図１４ｂに示す。
異なる乳がん細胞ＢＴ４７４、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１１８７、ＨＨ１９３７、ＨＣＣ３８、ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ－２３１、ＭＤＡＭＢ－４５３、ＭＤＡＭＢ－４６８及びＺＲ－７５－１を培養した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔにより異なる乳がん細胞におけるＲＯＢＯ１の発現状況を検出した。結果を図１４ａに示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによりＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔで測定したＲＯＢＯ１の光学密度と対照ＧＡＰＤＨの光学密度との比を分析した。結果を図１４ｂに示す。
【0090】
結果から分かるように、異なる乳がん細胞株でのＲＯＢＯ１の発現が異なり、Ｔ４７Ｄでの発現量が最も高い。
【0091】
実施例９：ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞殺傷試験
１．乳がん細胞に対する自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の殺傷
ＣＦＳＥ染色方法（Ａ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ａｎｎａ Ｓｃｈｅｒｂａｋｏｖａ，１，２ Ｈｅｌｅｎ Ｌｕｓｔ，１，２ Ｈｅｌｅ Ｅｖｅｒａｕｓ，１，２，３ Ａｌａｒ Ａｉｎｔｓ１，２，４＊を参照）により、実施例５でスクリーニングされた自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｄ５）の殺傷効果を検出し、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ及びＮＫ－９２細胞を対照とした。異なる乳がん細胞には、ＢＴ４７４、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１１８７、ＨＣＣ１９３７、ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ－２３１、ＭＤＡＭＢ－４５３、ＭＤＡＭＢ－４６８及びＺＲ－７５－１が含まれる。
１．乳がん細胞に対する自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の殺傷
ＣＦＳＥ染色方法（Ａ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ａｎｎａ Ｓｃｈｅｒｂａｋｏｖａ，１，２ Ｈｅｌｅｎ Ｌｕｓｔ，１，２ Ｈｅｌｅ Ｅｖｅｒａｕｓ，１，２，３ Ａｌａｒ Ａｉｎｔｓ１，２，４＊を参照）により、実施例５でスクリーニングされた自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｄ５）の殺傷効果を検出し、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ及びＮＫ－９２細胞を対照とした。異なる乳がん細胞には、ＢＴ４７４、Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１１８７、ＨＣＣ１９３７、ＭＣＦ７、ＭＤＡＭＢ－２３１、ＭＤＡＭＢ－４５３、ＭＤＡＭＢ－４６８及びＺＲ－７５－１が含まれる。
【0092】
実験の操作方法
（１）標的細胞を事前に処理し、１×１０６個の細胞／１μｌでＣＦＳＥを加え、暗所でインキュベーターで１５ｍｉｎインキュベートし、１０％のＢＳＡで停止させ、ＰＢＳで２回洗浄し、２４ウェルプレートに調製された５００μｌ腫瘍細胞懸濁液（８×１０４個の細胞／ウェル）を加えた。培養プレートをインキュベーターで１２ｈ前培養した。
（２）エフェクター細胞と標的細胞との比が０．５：１及び１：１であるように５００μｌのエフェクター細胞を加え、各実験につき３重測定し、エフェクター細胞と標的細胞を２時間インキュベートした。
（３）２時間後、上清を１．５のＥＰ管に移し、各ウェルに２００μｌのパンクレアチンを加え、１ｍｉｎ消化した後、移された上清を用いて細胞をピペッティングし、遠心分離し、ＰＢＳで再懸濁させ、１ｕｌの７－ＡＡＤを加え、暗所で１５ｍｉｎインキュベートした後、検出した。
（４）殺傷率＝（標的細胞の殺傷率－自発的死亡率）／（１－自発的死亡率）１００％；
（１）標的細胞を事前に処理し、１×１０６個の細胞／１μｌでＣＦＳＥを加え、暗所でインキュベーターで１５ｍｉｎインキュベートし、１０％のＢＳＡで停止させ、ＰＢＳで２回洗浄し、２４ウェルプレートに調製された５００μｌ腫瘍細胞懸濁液（８×１０４個の細胞／ウェル）を加えた。培養プレートをインキュベーターで１２ｈ前培養した。
（２）エフェクター細胞と標的細胞との比が０．５：１及び１：１であるように５００μｌのエフェクター細胞を加え、各実験につき３重測定し、エフェクター細胞と標的細胞を２時間インキュベートした。
（３）２時間後、上清を１．５のＥＰ管に移し、各ウェルに２００μｌのパンクレアチンを加え、１ｍｉｎ消化した後、移された上清を用いて細胞をピペッティングし、遠心分離し、ＰＢＳで再懸濁させ、１ｕｌの７－ＡＡＤを加え、暗所で１５ｍｉｎインキュベートした後、検出した。
（４）殺傷率＝（標的細胞の殺傷率－自発的死亡率）／（１－自発的死亡率）１００％；
【0093】
結果を図１５に示す。図から分かるように、異なるがん細胞のインビトロ殺傷効果は異なり、ＲＯＢＯ１発現量が高い細胞、例えば、Ｔ４７Ｄ細胞の殺傷効果は比較的高く、ＲＯＢＯ１不発現細胞、例えば、ＨＣＣ１９３７の殺傷効果は比較的低かった。ＭＤＡＭＢ－２３１にＲＯＢＯ１が発現されたが、殺傷効果は比較的低かった。その理由は、（１）ＭＤＡＭＢ－２３１自体が発現するＲＯＢＯ１タンパク質が比較的低く；（２）ＭＤＡＭＢ－２３１細胞においてＰＤＬ１分子が高発現され、殺傷過程においてＰＤ１－ＰＤ－Ｌ１信号経路がエフェクター細胞の殺傷を抑制し、（３）ＭＤＡＭＢ－２３１自体においてＭＩＣＡ／Ｂがほとんど発現されず、ＮＫ細胞の殺傷作用の一部が活性化受容体、例えば、ＮＫＧ２ＤとリガンドＭＩＣＡ／Ｂとの結合に依存するため、ＭＩＣＡ／Ｂの不発現もＭＤＡＭＢ－２３１細胞に対する殺傷を低減させることであると考えられる。また、エフェクター細胞のＭＤＡＭＢ－２３１に対する殺傷は他の免疫メカニズムにより制御される可能性もある。つまり、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞のＭＤＡＭＢ－２３１細胞に対する殺傷の制御メカニズムについては、さらに検証される余地がある。
【0094】
上記実験の結果から分かるように、本発明の自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞は殺傷に適用され、その特異的殺傷効果は、ＲＯＢＯ１発現レベルと正の相関関係を示す。
【0095】
２．異なるがん細胞に対する自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞殺傷
上記１と同じ方法により他の種類の腫瘍細胞を２ｈ殺傷し、実施例５でスクリーニングされた自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｄ５）の異なる腫瘍細胞に対する殺傷効果を検出した。異なる腫瘍細胞には、肺がん細胞Ａ５４９、Ｈ１２９９；肝がん細胞Ｈｕｈ７、ＳＭＭＣ７７２１；膵臓がん細胞ＢｘＰＣ３、ＰＡＮＣ１、Ｃａｐａｎ－２が含まれる。培養した後、殺傷を行った。結果を図１６ａ－ｃに示す。図から分かるように、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９細胞の肺がん及び肝臓がんに対する殺傷効果は比較的良好である。
上記１と同じ方法により他の種類の腫瘍細胞を２ｈ殺傷し、実施例５でスクリーニングされた自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＡＴＣＧ４２７Ｂ－１Ｆ７、ＡＴＣＧ４２７Ｂ－２Ｄ５）の異なる腫瘍細胞に対する殺傷効果を検出した。異なる腫瘍細胞には、肺がん細胞Ａ５４９、Ｈ１２９９；肝がん細胞Ｈｕｈ７、ＳＭＭＣ７７２１；膵臓がん細胞ＢｘＰＣ３、ＰＡＮＣ１、Ｃａｐａｎ－２が含まれる。培養した後、殺傷を行った。結果を図１６ａ－ｃに示す。図から分かるように、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９細胞の肺がん及び肝臓がんに対する殺傷効果は比較的良好である。
【0096】
３．正常乳腺細胞及びＰＢＭＣに対する自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の殺傷
健常者を３名ランダムに選択し、それぞれ５０ｍｌ新鮮な血液を採取し、ＰＢＳを用いて１：１で希釈し、新しい遠沈管を取り、Ｆｉｃｏｌｌ（リンパ球分離液）を入れ、管を４５度傾斜し、希釈した血液をＦｉｃｏｌｌ：血液＝２：１でＦｉｃｏｌｌ液面の上方にゆっくりと加え、２０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離した後、ピペットを雲層に直接挿入し、雲層（即ち、単一の核細胞層）を吸い出し、新しい遠沈管に入れ、洗浄して上清を捨て、１ｍｌのＲＰＭＩ－１６４０培地を加え、ピペッティングして均一に混合することにより、ＰＢＭＣ細胞懸濁液を製造し、それをそれぞれＰＢＭＣ－１、ＰＢＭＣ－２、ＰＢＭＣ－３とし、正常乳腺細胞及びＰＢＭＣにおけるＲＯＢＯ１の発現状況を検出した。結果を図１７ａに示す。上記１と同じ方法により、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９細胞の正常乳腺細胞ＰＢＭＣ－１、ＰＢＭＣ－２、ＰＢＭＣ－３及びＭＤＡ－ｋｂ２に対する殺傷効率を検出し、殺傷過程においてＰＢＭＣ－１、ＰＢＭＣ－２、ＰＢＭＣ－３及びＭＤＡ－ｋｂ２細胞に対するＮＫ９２とＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫの殺傷率を比較した。結果を図１７ｂに示す。図から分かるように、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、インビトロで正常乳腺及びＰＢＭＣに対する殺傷が顕著ではないことで、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞医薬品の安全性がさらに証明されている。
健常者を３名ランダムに選択し、それぞれ５０ｍｌ新鮮な血液を採取し、ＰＢＳを用いて１：１で希釈し、新しい遠沈管を取り、Ｆｉｃｏｌｌ（リンパ球分離液）を入れ、管を４５度傾斜し、希釈した血液をＦｉｃｏｌｌ：血液＝２：１でＦｉｃｏｌｌ液面の上方にゆっくりと加え、２０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心分離した後、ピペットを雲層に直接挿入し、雲層（即ち、単一の核細胞層）を吸い出し、新しい遠沈管に入れ、洗浄して上清を捨て、１ｍｌのＲＰＭＩ－１６４０培地を加え、ピペッティングして均一に混合することにより、ＰＢＭＣ細胞懸濁液を製造し、それをそれぞれＰＢＭＣ－１、ＰＢＭＣ－２、ＰＢＭＣ－３とし、正常乳腺細胞及びＰＢＭＣにおけるＲＯＢＯ１の発現状況を検出した。結果を図１７ａに示す。上記１と同じ方法により、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９細胞の正常乳腺細胞ＰＢＭＣ－１、ＰＢＭＣ－２、ＰＢＭＣ－３及びＭＤＡ－ｋｂ２に対する殺傷効率を検出し、殺傷過程においてＰＢＭＣ－１、ＰＢＭＣ－２、ＰＢＭＣ－３及びＭＤＡ－ｋｂ２細胞に対するＮＫ９２とＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫの殺傷率を比較した。結果を図１７ｂに示す。図から分かるように、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、インビトロで正常乳腺及びＰＢＭＣに対する殺傷が顕著ではないことで、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞医薬品の安全性がさらに証明されている。
【0097】
４．自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に対するＰＢＭＣの殺傷
ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞が異体細胞として人体に注入された後、体内のＰＢＭＣ免疫細胞は、異体由来細胞に対して殺傷効果を発揮する可能性がある。ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞がＰＢＭＣによって除去されるか否かを検証するために、インビトロで、健常者を３名ランダムに選択し、採血し、分離してＰＢＭＣ細胞を製造し（製造方法は上記方法と同じ）、それぞれＰＢＭＣ－４、ＰＢＭＣ－５、ＰＢＭＣ－６と表記し、上記１と同じ方法によりＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞に対するＰＢＭＣ－４、ＰＢＭＣ－５、ＰＢＭＣ－６の殺傷を検出し、各群の実験においてＮＫ９２及びＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に対するＰＢＭＣの殺傷を比較した。結果を図１８に示す。図１８から分かるように、ＰＢＭＣはインビトロでＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９細胞に対する殺傷が顕著ではなく、これによって、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞医薬品は、インビボで特異的殺傷作用をより良好に発揮できることがさらに証明されている。
ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞が異体細胞として人体に注入された後、体内のＰＢＭＣ免疫細胞は、異体由来細胞に対して殺傷効果を発揮する可能性がある。ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞がＰＢＭＣによって除去されるか否かを検証するために、インビトロで、健常者を３名ランダムに選択し、採血し、分離してＰＢＭＣ細胞を製造し（製造方法は上記方法と同じ）、それぞれＰＢＭＣ－４、ＰＢＭＣ－５、ＰＢＭＣ－６と表記し、上記１と同じ方法によりＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ＣＡＲ－ＮＫ細胞に対するＰＢＭＣ－４、ＰＢＭＣ－５、ＰＢＭＣ－６の殺傷を検出し、各群の実験においてＮＫ９２及びＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞に対するＰＢＭＣの殺傷を比較した。結果を図１８に示す。図１８から分かるように、ＰＢＭＣはインビトロでＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９細胞に対する殺傷が顕著ではなく、これによって、自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞医薬品は、インビボで特異的殺傷作用をより良好に発揮できることがさらに証明されている。
【0098】
上記の実験結果より、本発明のＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の殺傷効果は、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の殺傷効果と相当し、腫瘍細胞を効果的に殺傷でき、ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも毒性が小さく、殺傷効果が高いとともに、自殺遺伝子（ｉＣａｓｐａｓｅ９スイッチ素子）が増加したため、安全性がさらに向上する。さらに、実験によりこの細胞は正常細胞を殺傷することがなく、正常細胞はこの細胞を殺傷することもないことが証明され、ＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の安全性がさらに証明されている。
【0099】
実施例１０：ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の製造及びモノクローナル細胞株のスクリーニング
を合成した（配列番号１２；最初と最後の斜体で下線付きの部分は酵素切断部位である）（その簡略化構造を図20に示す）。さらにそれをレンチウイルスベクターへクローニングし、図１９に示されるレンチウイルスベクター（１９４２－３－ｈＥＧＦＲｔと呼ばれる）（そのヌクレオチド配列は配列番号１３に示される）を得た。さらに３プラスミドシステム（補助プラスミドｐＭＤ２．Ｇ及びｐＣＭＶＲ８．７４）によりウイルスをパッケージングし、そしてウイルス感染により実施例３で製造されたＲＯＢＯ１ＣＡＲ－ＮＫ細胞（又はＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞；以下の実施例に用いるのはＲＯＢＯ１Ｍ ＣＡＲ－ＮＫ細胞）に感染させ、次いでフローサイトメトリーによりＲＯＢＯ１とＥＧＦＲｔが共に陽性である細胞、即ち自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞；４２７Ｅとも呼ばれる）を選別し、スクリーニングされた細胞をモノクローナルスクリーニングして培養し、その後、培養した細胞をフローサイトメトリーにより自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の陽性率を検出した。結果を図２１ａ－ｂに示す。図から分かるように、ＡＰＣ及びＰＥ蛍光標識の信号値はいずれも顕著に高くなり、２つの自殺遺伝子を持つＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫモノクローナル細胞（ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞、即ち４２７Ｅ）が正常にスクリーニングにされ、それぞれＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－３Ｃ１０－２Ｄ１０及びＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－３Ｃ１０－１Ｆ１１（それぞれ４２７Ｅ－３Ｃ１０－２Ｄ１０及び４２７Ｅ－３Ｃ１０－１Ｆ１１とも呼ばれる）と表記した。この２つのモノクローナル細胞のマザークローンはＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－３Ｃ１０（４２７Ｅ－３Ｃ１０）である。
【0100】
実施例１１：ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の殺傷実験
実施例１０で製造されたモノクローナル細胞株及び上記２つのモノクローナル細胞株のマザークローンに対して腫瘍特異的殺傷の実験を行った。実験過程は以下の通りである。まず、Ｗｅｓｔｅｒｎにより乳がん細胞以外の他の異なる種類のがん細胞におけるＲＯＢＯ１タンパク質の発現レベルを検出し、具体的には、異なるがん細胞株を収集し、総タンパク質を抽出して分解し、ＢＣＡキットを用いて総タンパク質を定量し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによりＲＯＢＯ１タンパク質に対して電気泳動、転写膜を行い、最後に現象してＲＯＢＯ１タンパク質を検出した。一部の乳がん細胞におけるＲＯＢＯ１の発現状況を図１４ａに示す。結腸直腸がん（例えば、ＨＴ－２９、ＬｏＶｏ及びＨＣＴ１１６）、肝臓がん（例えば、ＳＭＭＣ７７２１、Ｈｕｈ７及びＨＥＰＧ２）の検出結果を図２２に示す。結果により、異なる種類のがん細胞におけるＲＯＢＯ１タンパク質の発現には確かに明らかな違いがあることが示されている。
実施例１０で製造されたモノクローナル細胞株及び上記２つのモノクローナル細胞株のマザークローンに対して腫瘍特異的殺傷の実験を行った。実験過程は以下の通りである。まず、Ｗｅｓｔｅｒｎにより乳がん細胞以外の他の異なる種類のがん細胞におけるＲＯＢＯ１タンパク質の発現レベルを検出し、具体的には、異なるがん細胞株を収集し、総タンパク質を抽出して分解し、ＢＣＡキットを用いて総タンパク質を定量し、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによりＲＯＢＯ１タンパク質に対して電気泳動、転写膜を行い、最後に現象してＲＯＢＯ１タンパク質を検出した。一部の乳がん細胞におけるＲＯＢＯ１の発現状況を図１４ａに示す。結腸直腸がん（例えば、ＨＴ－２９、ＬｏＶｏ及びＨＣＴ１１６）、肝臓がん（例えば、ＳＭＭＣ７７２１、Ｈｕｈ７及びＨＥＰＧ２）の検出結果を図２２に示す。結果により、異なる種類のがん細胞におけるＲＯＢＯ１タンパク質の発現には確かに明らかな違いがあることが示されている。
【0101】
Ｔ４７Ｄ、ＨＣＣ１１８７、ＭＣＦ７、ＨｅｐＧ２及びＨｕｈ７を含む異なるがん細胞を取って培養すると同時に、ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－３Ｃ１０、ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－３Ｃ１０－２Ｄ１０及びＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－３Ｃ１０－１Ｆ１１を培養し、それぞれエフェクター／標的＝０．５：１及び１：１でインビトロで２時間殺傷し、ＮＫ９２及び４２７Ａを対照群として添加した。ＨＣＣ１１８７、ＭＣＦ７、ＨｅｐＧ２の殺傷実験には４２７Ａ－ＫＯ実験群がさらに追加された（４２７Ａ－ＫＯについては、Ｃｒｉｓｐ Ｃａｓ９遺伝子編集によりＣＡＲにおけるＲＯＢＯ１－ｓｃＦＶ標的の遺伝子配列をノックアウトし、他のシグナル伝達配列を残したものをＮＫ９２細胞にノックインし、即ち、４２７ＡにおけるＣＡＲと同様のゲノム挿入部位にＲＯＢＯ１標的のＣＡＲ配列がないＮＫ細胞をノックインした）。中国検験検疫科学研究院「免疫細胞治療剤のインビトロ殺傷効果評価方法についての分析及び研究」により、ＲＴＣＡ Ｓｙｓｔｅｍｓリアルタイム細胞分析システムは新しいタイプの細胞検出システム（ＡＣＥＡ）である。結果を図２３ａに示す。殺傷分析から分かるように、ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、高い殺傷効果を示し、固形腫瘍に対する殺傷効果が顕著であり、この細胞の特異的殺傷効果はＲＯＢＯ１の発現レンベルと正の相関を示す。これによって、ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞医薬品の有効性が証明されている。
【0102】
ＲＯＢＯ１ ＣＡＲの特異性を証明するために、インビトロでＲＯＢＯ１を過剰発現するモノクローナル細胞株（ＨＣＴ１１６－ＲＯＢＯ１）モデルも構築し、ＨＣＴ１１６を対照として使用し、上記方法により殺傷実験を行った。結果を図２３ｂに示す。図から分かるように、野生型ＨＣＴ１１６では、４２７Ｅ殺傷はＮＫ９２殺傷よりも強くなり、４２７Ａ－ＫＯはＲＯＢＯ１標的がノックアウトされた後、ＮＫ９２、４２７Ａと違いがないが、ＲＯＢＯ１を過剰発現するＨＣＴ１１６モノクローナル細胞株において、４２７Ａ－ＫＯは４２７Ａ及びＥよりも殺傷が顕著に低くなるとともに、４２７Ｅは過剰発現ＨＣＴ１１６細胞株における殺傷も野生型ＨＣＴ１１６の殺傷活性よりも顕著に高くなった。これによって、本発明のＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－ＣＡＲ－ＮＫ細胞におけるＲＯＢＯ１の標的性及び特異性が効果的に証明されている。
【0103】
さらに、同様の方法によりＲＯＢＯ１を過剰発現するモノクローナル細胞株（ＭＤＡＭＢ－２３１－ＲＯＢＯ１）モデルを構築し、ＭＤＡＭＢ－２３１を対照群とし、上記方法により殺傷実験を行った。結果を図２３ｃに示す。ＭＤＡＭＢ－２３１の対照群に比べ、ＲＯＢＯ１を過剰発現するモノクローナル細胞株（ＭＤＡＭＢ－２３１－ＲＯＢＯ１）モデルの殺傷活性及び特異性は顕著に高くなった。
【0104】
実施例１２：ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ－ＣＡＲ－ＮＫ細胞の安全性実験
安全性研究は、自殺スイッチインデューサー（セツキシマブ）に対する殺傷／エフェクター細胞の存在でのＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の感度を研究するものである。インデューサーであるセツキシマブによりＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（実施例１０で製造されたモノクローナル細胞株及びこの２つのモノクローナル細胞株のマザークローン）のアポトーシスを誘導し、インビトロで構築されたＮＫ９２－ＣＤ１６（高親和力）エフェクター細胞を添加して自殺スイッチの有効性を評価した。それぞれエフェクター細胞の作用濃度、エフェクター／標的比、作用時間、作用システムなどについて考察した結果、インデューサーであるセツキシマブの最適化作用条件は、インビトロ、作用時間４時間、作用濃度１μｇ／ｍｌ、ＮＫ９２－ＣＤ１６（高親和力）、ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のエフェクター／標的比２５：１（Ｅ：Ｔ）であった。検出方法は、ＣＦＳＥ（Ａ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ａｎｎａ Ｓｃｈｅｒｂａｋｏｖａ，１，２ Ｈｅｌｅｎ Ｌｕｓｔ，１，２ Ｈｅｌｅ Ｅｖｅｒａｕｓ，１，２，３ Ａｌａｒ Ａｉｎｔｓ１，２，４＊を参照）を採用し、７－ＡＡＤ／ＣＦＳＥ二重染色により細胞アポトーシス効率を検出した。具体的には、構築されたＮＫ９２－ＣＤ１６エフェクター細胞を事前にＣＦＳＥで標識し、そしてエフェクター／標的比でＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲ ＣＡＲ－ＮＫ及びＮＫ９２－ＣＤ１６細胞をプレートに敷いた後、それぞれ作用濃度が０、１及び１０μｇ／ｍｌのセツキシマブを加え、４時間作用した後、７－ＡＡＤにより１０ｍｉｎ染色し、そしてフローサイトメーターにより検出した（実験を並行して３回繰り返した）。検出結果を図２４に示す。結果から分かるように、スクリーニングされたサブクローン細胞株において、セツキシマブによって誘導されたアポトーシス効率は４０％～５０％であった。
安全性研究は、自殺スイッチインデューサー（セツキシマブ）に対する殺傷／エフェクター細胞の存在でのＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の感度を研究するものである。インデューサーであるセツキシマブによりＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞（実施例１０で製造されたモノクローナル細胞株及びこの２つのモノクローナル細胞株のマザークローン）のアポトーシスを誘導し、インビトロで構築されたＮＫ９２－ＣＤ１６（高親和力）エフェクター細胞を添加して自殺スイッチの有効性を評価した。それぞれエフェクター細胞の作用濃度、エフェクター／標的比、作用時間、作用システムなどについて考察した結果、インデューサーであるセツキシマブの最適化作用条件は、インビトロ、作用時間４時間、作用濃度１μｇ／ｍｌ、ＮＫ９２－ＣＤ１６（高親和力）、ＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞のエフェクター／標的比２５：１（Ｅ：Ｔ）であった。検出方法は、ＣＦＳＥ（Ａ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ａｎｎａ Ｓｃｈｅｒｂａｋｏｖａ，１，２ Ｈｅｌｅｎ Ｌｕｓｔ，１，２ Ｈｅｌｅ Ｅｖｅｒａｕｓ，１，２，３ Ａｌａｒ Ａｉｎｔｓ１，２，４＊を参照）を採用し、７－ＡＡＤ／ＣＦＳＥ二重染色により細胞アポトーシス効率を検出した。具体的には、構築されたＮＫ９２－ＣＤ１６エフェクター細胞を事前にＣＦＳＥで標識し、そしてエフェクター／標的比でＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲ ＣＡＲ－ＮＫ及びＮＫ９２－ＣＤ１６細胞をプレートに敷いた後、それぞれ作用濃度が０、１及び１０μｇ／ｍｌのセツキシマブを加え、４時間作用した後、７－ＡＡＤにより１０ｍｉｎ染色し、そしてフローサイトメーターにより検出した（実験を並行して３回繰り返した）。検出結果を図２４に示す。結果から分かるように、スクリーニングされたサブクローン細胞株において、セツキシマブによって誘導されたアポトーシス効率は４０％～５０％であった。
【0105】
インビボでのＡＤＣＣのメカニズムをよりよくシミュレートし、自殺スイッチの有効性をより正確に評価するために、インビトロで２名の健常者から末梢血を採取してＰＢＭＣを単離し、それぞれＰＢＭＣ－ＺＦ及びＰＢＭＣ－ＣＱと表記した。上記実験の方法及び条件に従って、ＰＢＭＣ－ＺＦ及びＰＢＭＣ－ＣＱをＮＫ９２／４２７Ａ／４２７Ｅ細胞株と共にインキュベートし、セツキシマブ（作用濃度は、それぞれ０、１及び１０μｇ／ｍｌである）を加え、エフェクター／標的比２５：１で４時間作用した後、フローサイトメトリーを用いてセツキシマブの作用下で４２７Ｅ細胞株がＰＢＭＣにより殺傷される効率を検出した（図２５）。結果から分かるように、同じエフェクター／標的比及び作用濃度下で、異なるヒトのＰＢＭＣは細胞殺傷を誘導する効率が異なるが、これは、人によって免疫細胞の成分と機能が異なるためである。しかし、４２７Ｅは、４２７Ａ、ＮＫ９２細胞に比べ、細胞殺傷の誘導効率は顕著に高くなった。全体として、ＰＢＭＣをエフェクター細胞（エフェクター／標的比２５：１）とする場合、ＡＴＣＧ４２７Ｅ－３Ｃ１０－１Ｆ１１及びＡＴＣＧ４２７Ｅ－３Ｃ１０－２Ｄ１０がセツキシマブ（作用濃度１μｇ／ｍｌ）によって誘導されたアポトーシス効率は３０％～４０％であり、ＮＫ９２－ＣＤ１６をエフェクター細胞とする場合での誘導されたアポトーシス効率よりもやや低く、これも先行文献及び特許文献に記載のデートと一致し、本発明の作用効果はより顕著である。
【0106】
以上のことから、インビトロでのＡＤＣＣ作用効果に対する評価から分かるように、ＮＫ９２－ＣＤ１６又はＰＢＭＣを殺傷／エフェクター細胞とするにもかかわらず、４２７Ｅはセツキシマブによって効果的に誘導されて自殺スイッチ素子をオンにし、細胞アポトーシスを引き起こし、細胞の制御可能性を向上させることができる。
【0107】
上記実験結果から分かるように、まず、本発明のＲＯＢＯ１－ｉＣａｓｐａｓｅ９ ＣＡＲ－ＮＫ及びＲＯＢＯ１－ＥＧＦＲｔ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の殺傷効果は、ＲＯＢＯ１ ＣＡＲ－ＮＫ細胞の殺傷効果に相当し、ＮＫ９２細胞に比べ、特異的殺傷効果は顕著に強くなり、効果的に腫瘍細胞を標的として殺傷することができ、また、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞に比べて毒性が小さく、作用時間が短く、殺傷効果が速く、最後に、本発明のＣＡＲ－ＮＫ細胞には自殺遺伝子（例えば、ｉＣａｓｐａｓｅ９又はＥＧＦＲｔ誘導性自殺スイッチ素子）が追加されているため、ＣＡＲ－ＮＫ細胞の安全性及び制御可能性をさらに向上でき、これによって、臨床使用はより安全で制御されやすくなる。
【0108】
本発明の説明は、例示及び説明のために与えられるものであり、漏れなく、又は開示された形態に本発明を限定するものではない。多くの修正及び変化は、当業者にとって自明なものである。実施例を選択及び説明することは、本発明の原理及び実際の適用をよりよく説明し、本発明を当業者に理解させるために特定の目的に適した様々な変形を伴う様々な実施例を設計するためである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10a】
【図10b】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14a】
【図14b】
【図15】
【図16】
【図17a】
【図17b】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21a】
【図21b】
【図22】
【図23a】
【図23b】
【図23c】
【図24】
【図25】
【配列表】