▶ イノビオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイティドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-20
(45)【発行日】2023-09-28
(54)【発明の名称】メソセリンを標的とするがんワクチンおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20230921BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20230921BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20230921BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20230921BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20230921BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20230921BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20230921BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230921BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/86 Z
C07K14/705
A61K31/7088
A61K38/17
A61K39/00 H
A61P35/00
【請求項の数】
33
(21)【出願番号】P 2020532723
(86)(22)【出願日】2018-12-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-02-22
(86)【国際出願番号】 US2018065519
(87)【国際公開番号】W WO2019118760
(87)【国際公開日】2019-06-20
【審査請求日】2021-12-10
(31)【優先権主張番号】62/598,289
(32)【優先日】2017-12-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】509320254
【氏名又は名称】イノビオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100170852
【弁理士】
【氏名又は名称】白樫 依子
(72)【発明者】
【氏名】チエン イェン
(72)【発明者】
【氏名】アナ スレイガー
(72)【発明者】
【氏名】ブラッドリー ガーマン
(72)【発明者】
【氏名】ニール クーチ
【審査官】藤山 純
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５０２６９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００９－５２８０６５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３０１５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５１６７２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Kaneko O, et al.，A binding domain onmesothelin for CA125/MUC16，J Biol Chem，284(6)，2009年02月06日，pp.3739-3749
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１２
Ｃ１２Ｎ １５／６３
Ｃ１２Ｎ １５／８６
Ｃ０７Ｋ １４／７０５
Ａ６１Ｋ ３１／７０８８
Ａ６１Ｋ ３８／１７
Ａ６１Ｋ ３９／００
Ａ６１Ｐ ３５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７をコードする核酸配列、および
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％同一であるタンパク質であって、配列番号２に対して、アミノ酸位置３０３にアラニン、アミノ酸位置５８３にトレオニン、およびアミノ酸位置５８５にバリンを含むタンパク質をコードする核酸配列
からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項2】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１、および
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１と少なくとも９６％同一である断片であって、配列番号２に対して、アミノ酸位置３０３でアラニン、アミノ酸位置５８３でトレオニン、およびアミノ酸位置５８５でバリンをコードする断片
からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項3】
（ａ）配列番号２をコードする核酸配列、および
（ｂ）配列番号２と少なくとも９６％同一であるタンパク質であって、配列番号２に対して、アミノ酸位置３０３にアラニン、アミノ酸位置５８３にトレオニン、およびアミノ酸位置５８５にバリンを含むタンパク質をコードする核酸配列
からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項4】
（ａ）配列番号１、および
（ｂ）配列番号１と少なくとも９６％同一である断片であって、配列番号２に対して、アミノ酸位置３０３でアラニン、アミノ酸位置５８３でトレオニン、およびアミノ酸位置５８５でバリンをコードする断片
からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項5】
配列番号１に記載の核酸配列を含む、核酸分子。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項7】
前記核酸分子が、プロモーターおよびポリ－アデニル化シグナルから選択される制御性要素に動作可能に連結される、請求項６に記載のベクター。
【請求項8】
前記プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）である、請求項７に記載のベクター。
【請求項9】
前記ポリ－アデニル化シグナルが、ウシ成長ホルモンポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）である、請求項７に記載のベクター。
【請求項10】
前記ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターである、請求項６～９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項11】
請求項１～５のいずれか一項に記載の１つ以上の核酸分子を含む、組成物。
【請求項12】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項13】
請求項６～１０のいずれか一項に記載の１つ以上のベクターを含む、組成物。
【請求項14】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７、および
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列であって、配列番号２に対して、アミノ酸位置３０３にアラニン、アミノ酸位置５８３にトレオニン、およびアミノ酸位置５８５にバリンを含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項16】
（ａ）配列番号２、および
（ｂ）配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列であって、配列番号２に対して、アミノ酸位置３０３にアラニン、アミノ酸位置５８３にトレオニン、およびアミノ酸位置５８５にバリンを含むアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項17】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、タンパク質。
【請求項18】
抗原を含み、前記抗原が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、ワクチン。
【請求項19】
前記抗原が、配列番号１によりコードされる、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項20】
ペプチドを含み、前記ペプチドが、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有し、かつ配列番号２に対して、アミノ酸位置３０３にアラニン、アミノ酸位置５８３にトレオニン、およびアミノ酸位置５８５にバリンを有するアミノ酸配列を含む、ワクチン。
【請求項21】
核酸分子を含み、前記核酸分子が、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有し、かつ配列番号２に対して、アミノ酸位置３０３でアラニン、アミノ酸位置５８３でトレオニン、およびアミノ酸位置５８５でバリンをコードする核酸配列を含む、ワクチン。
【請求項22】
核酸分子を含み、前記核酸分子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも９６％の同一性を有し、かつ配列番号２に対して、アミノ酸位置３０３にアラニン、アミノ酸位置５８３にトレオニン、およびアミノ酸位置５８５にバリンを有するアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、ワクチン。
【請求項23】
前記核酸分子が、発現ベクターを含む、請求項２１または２２に記載のワクチン。
【請求項24】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項２１または２２に記載のワクチン。
【請求項25】
アジュバントをさらに含む、請求項２１または２２に記載のワクチン。
【請求項26】
前記アジュバントが、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、またはＲＡＮＴＥＳである、請求項２５に記載のワクチン。
【請求項27】
メソセリンを発現するがんの治療における使用のための、請求項１８～２０のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項28】
メソセリンを発現するがんの治療における使用のための、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項29】
メソセリンを発現するがんに対するワクチン接種における使用のための、請求項１８～２６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項30】
薬剤として使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項31】
がんの治療における薬剤として使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項32】
薬剤の調製において使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項33】
がんの治療のための薬剤の調製において使用するための、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１３日に申請された米国仮特許出願第６２／５９８，２８９号の優先権および利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１７年１２月１３日に申請された米国仮特許出願第６２／５９８，２８９号の優先権および利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１２月１１日に作成され、１０４４０９＿０００４４４＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、８，２２３バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年１２月１１日に作成され、１０４４０９＿０００４４４＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称であり、８，２２３バイトのサイズである。
【0003】
本発明は、メソセリン抗原およびそれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、メソセリン抗原および／または核酸分子を含むワクチンに関する。本発明はさらに、免疫応答を誘導し、メソセリンを発現するがん性細胞を有する対象を予防および／または治療するためにワクチンを使用する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
がんは、米国において、および世界的に依然として主な死亡原因である。がんワクチン市場は急速に成長している。有効な腫瘍ワクチンは、腫瘍の成長を予防するために有用であり得、かつ／または進行がんの患者の標準治療のより有効で毒性が低い代替品として有用であり得る。がんと関連する抗原、したがって抗腫瘍ワクチンの標的はメソセリンである。
【0005】
メソセリンは、３０ｋＤの巨核球増強因子および４１ｋＤのＧＰＩアンカー型膜結合成熟メソセリンの２つの生成物に切断される７１ｋＤのタンパク質である。メソセリンの機能は不明であるが、最近の研究では、メソセリンが、ＭＵＣ１６と結合することにより卵巣がん転移に役割を果たし得ることが示唆され、卵巣がん細胞の表面にも高発現される。メソセリンの発現は、ＩＨＣにより漿液性卵巣がんの８２～１００％で観察される。Ｈａｓｓａｎ，Ｒ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ４４，４６－５３（２００８）、Ｏｒｄｏｎｅｚ，Ｎ．Ｇ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２７，１４１８－１４２８（２００３）。メソセリンは、卵巣がんにおけるその高い発現および腫瘍浸潤との関連のため、魅力的ながん治療ワクチンの標的である。
【0006】
がんの治療および予防のためのワクチンは、非常に関心を集めるものである。腫瘍細胞抗原を標的とする既存のワクチンは、多くの場合、インビボでの不十分な抗原発現により制限される。したがって、メソセリンを発現する腫瘍に適用可能であり、それにより、かかるがんに罹患する対象の治療を提供し、生存を促進する安全かつ効果的なワクチンを開発する必要性が当技術分野に残存する。
【発明の概要】
【0007】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子が本明細書で提供される。
【0008】
配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１と少なくとも９６％同一である断片、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１と少なくとも９６％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子が本明細書でさらに提供される。
【0009】
（ａ）配列番号２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２と少なくとも９６％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２と少なくとも９６％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子が本明細書で提供される。
【0010】
（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１と少なくとも９６％同一である断片、および（ｄ）配列番号１と少なくとも９６％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１に記載の核酸配列を含む。
【0011】
本明細書に記載される核酸分子は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに組み込まれ得る。本明細書に記載される核酸分子は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。さらなる実施形態において、ベクターは、配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１と少なくとも９６％同一である断片、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１と少なくとも９６％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。なおさらなる実施形態において、ベクターは、（ａ）配列番号２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２と少なくとも９６％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２と少なくとも９６％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。さらなる実施形態において、ベクターは、（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１と少なくとも９６％同一である断片、および（ｄ）配列番号１と少なくとも９６％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。なおさらなる実施形態において、ベクターは、配列番号１に記載の核酸配列を含む。
【0012】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸は、制御性要素に動作可能に連結される。いくつかの実施形態において、制御性要素は、プロモーターおよび／またはポリ－アデニル化シグナルである。さらなる実施形態において、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）である。なおさらなる実施形態において、ポリ－アデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）である。
【0013】
本明細書に記載される１つ以上の核酸分子を含む組成物も本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
【0014】
（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むメソセリン抗原タンパク質がさらに提供される。
【0015】
（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むメソセリン抗原タンパク質がさらに提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
【0016】
メソセリン抗原を含み、抗原が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、ワクチンがさらに提供される。いくつかの実施形態において、抗原は、配列番号１によりコードされる。
【0017】
核酸分子を含み、核酸分子が、配列番号１に記載の核酸配列の全長にわたって少なくとも約９６％の同一性を有する核酸配列を含む、ワクチンがさらに提供される。核酸分子を含み、核酸分子が、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９６％の同一性を有するアミノ酸配列を含むメソセリン抗原をコードする、ワクチンがさらに本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、核酸分子は、発現ベクターを含み得る。ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、ワクチンは、アジュバントをさらに含み得る。特定の実施形態において、アジュバントは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、またはＲＡＮＴＥＳである。
【0018】
メソセリン抗原を含み、抗原が、配列番号２に記載のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ワクチンが本明細書でさらに提供される。
【0019】
本明細書に記載されるワクチンの治療有効量を投与することを含む、メソセリンを発現するがん性細胞を有する対象を治療する方法がさらに提供される。いくつかの実施形態において、投与は、エレクトロポレーションステップを含む。他の実施形態において、投与は、対象の１つ以上の部位で生じる。
【0020】
体液性免疫応答を誘導するのに有効な、本明細書に記載されるワクチンの量を投与することを含む、メソセリンを発現するがん性細胞に対して対象にワクチン接種する方法も提供される。いくつかの実施形態において、投与は、エレクトロポレーションステップを含む。他の実施形態において、投与は、対象の１つ以上の部位で生じる。
【0021】
（ａ）配列番号２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２と少なくとも９６％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）薬剤として使用するための、配列番号２と少なくとも９６％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸分子は、がんの治療における薬剤としての使用のためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸分子は、薬剤の調製において使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸分子は、がんの治療のための薬剤の調製において使用するためのものである。
【0022】
（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、（ｃ）配列番号１と少なくとも９６％同一である断片、および（ｄ）配列番号１と少なくとも９６％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む、核酸分子が本明細書でさらに提供される。いくつかの実施形態において、核酸分子は、薬剤として使用するための、配列番号１に記載の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸分子は、がんの治療における薬剤としての使用のためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸分子は、薬剤の調製において使用するためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される核酸分子は、がんの治療のための薬剤の調製において使用するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】メソセリン変異体の生成を示す。
【図2】ＧＰＩアンカー型メソセリンタンパク質前駆体の構造の模式図である。
【図3】合成コンセンサスメソセリンの模式図を示す。
【図4】改変されたｐＶＡＸ１骨格（ｐＧＸ０００１）の図表示である。
【図5】プラスミドｐＧＸ１４３８の図表示である。
【図6】ヒト横紋筋肉腫細胞における合成コンセンサスメソセリン抗原発現のウエスタンブロットを示す。
【図7A】本開示の実施形態を使用する合成コンセンサスメソセリンの免疫原性を示す。
【図7B】本開示の実施形態を使用する合成コンセンサスメソセリンの免疫原性を示す。
【図8】本開示の実施形態を使用するフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本発明は、メソセリン抗原を含むワクチンに関する。メソセリンは、多くの腫瘍で発現される。したがって、ワクチンは、メソセリンを発現するがんまたは腫瘍の治療を提供する。本発明のワクチンは、治療を必要とする対象のがんの特定の予防または治療のための特定のがん抗原の任意の組み合わせを提供することができる。
【0025】
組換えがん抗原の核酸およびそのコードされるアミノ酸配列を設計するための１つの方法は、天然がん抗原の全体的なアミノ酸配列において特定のアミノ酸を変化させる変異を導入することによるものである。変異の導入は、がん抗原をあまり改変しないため、哺乳動物対象、好ましくはヒトまたはイヌ対象にわたり普遍的に適用することはできないが、結果として生じるアミノ酸配列は、免疫応答を生成するために、寛容性を破壊するか、または外来抗原と見なされるように十分に変化する。別の方法は、その対応する天然がん抗原に対して少なくとも８５％および最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％および最大９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９３％および最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％および最大９８％の配列同一性を有するコンセンサス組換えがん抗原を作成することであり得る。場合によっては、組換えがん抗原は、その対応する天然がん抗原に対して９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性である。天然がん抗原は、特定のがんまたはがん腫瘍に通常関連する抗原である。がん抗原に応じて、がん抗原のコンセンサス配列は、哺乳動物種全体、または種のサブタイプ内、またはウイルス株全体、または血清型にわたることができる。いくつかのがん抗原は、がん抗原の野生型アミノ酸配列と大きく異ならない。いくつかのがん抗原は、種にわたって非常に異なるため、コンセンサス配列を生成することができない核酸／アミノ酸配列を有する。これらの場合では、その対応する天然がん抗原に対して少なくとも８５％および最大９９％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも９０％および最大９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９３％および最大９８％の配列同一性、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％および最大９８％の配列同一性を有する、寛容を破壊し、免疫応答を生成する組換えがん抗原が生成される。場合によっては、組換えがん抗原は、その対応する天然がん抗原に対して９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性である。前述のアプローチを組み合わせて、最終的な組換えがん抗原が、上述される天然がん抗原アミノ酸配列との類似性パーセントを有するようにすることができる。
【0026】
メソセリン抗原は、一部分において、異なる種または種内の異なるアイソフォームからのメソセリンの配列に由来するコンセンサスメソセリン抗原であり得、したがって、コンセンサスメソセリン抗原は非天然である。改変は、ＭＵＣ１６結合ドメインおよび／またはＧＰＩアンカリングシグナルの変異、ならびにメソセリン抗原のＮ末端への上流のコザックおよびＩｇＥリーダー配列の付加を含み得る。
【0027】
合成メソセリンは、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価抗体応答を誘導することができ、それにより抗原を発現するがんまたは腫瘍に指向されるか、またはそれに対して反応性である免疫応答を誘導または誘発する。いくつかの実施形態において、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、細胞性、体液性、または細胞性および体液性の両方の免疫応答であり得る。いくつかの実施形態において、誘導されたまたは誘発された細胞性免疫応答には、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）の誘導または分泌が含まれ得る。他の実施形態において、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、これらに限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を上方制御する因子、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ－１０およびＴＦＧ－βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生された可溶性因子、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ－１、ならびに免疫チェックポイント分子を低減または阻害することができる。
【0028】
ワクチンは、ＰＤ－１およびＰＤＬ－１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わせて、細胞性および体液性免疫応答の両方の刺激を増強することができる。抗ＰＤ－１または抗ＰＤＬ－１抗体を使用することによって、ＰＤ－１またはＰＤＬ－１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを妨げる。全般的に、免疫系によって認識されるがん抗原を設計することにより、腫瘍細胞による他の形態の免疫抑制を克服するのに役立ち、これらのワクチンは、Ｔ細胞および／またはＢ細胞応答をさらに増加させるために、抑制または阻害療法（抗ＰＤ－１および抗－ＰＤＬ－１抗体療法など）と組み合わせて使用することができる。
【0029】
定義
特に別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本文書が支配する。好ましい方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができる。本明細書に言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、制限することを意図するものではない。
特に別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本文書が支配する。好ましい方法および材料が以下に記載されるが、本明細書に記載されているものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができる。本明細書に言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定を意図するものではない。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、制限することを意図するものではない。
【0030】
本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、およびそれらの変形の用語は、追加の行為または構造の可能性を排除しない、制限のない過渡的な句、用語、または単語であることを意図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」には、文脈から明確に指示されない限り、複数の参照が含まれる。本開示は、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、および「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
【0031】
本明細書の数値範囲の列挙については、列挙された範囲の最小値および最大値と同じ程度の精度を有する各々の介在する値が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲では、６および９に加えて７および８の数値が企図され、６．０～７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０の数値が、明示的に企図される。
【0032】
本明細書で使用される「アジュバント」は、メソセリン抗原の免疫原性を増強するために本明細書に記載されるワクチンに追加される任意の分子および／または本明細書に記載される抗原をコードする核酸分子を意味する。
【0033】
本明細書で使用される「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、またはその断片もしくは誘導体を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、および一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二機能性抗体、ならびにそれらの誘導体を含む。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離した抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製した抗体、またはその任意の混合物であってよく、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対して十分な結合特異性を呈する。
【0034】
「メソセリン抗原」は、配列番号２のアミノ酸１９～６０７を含む変異したメソセリンアミノ酸配列、配列番号２、本明細書に記載の長さのその断片、バリアントを有するタンパク質、すなわち、本明細書に記載の配列番号２に対して同一性を有する配列および本明細書に記載の長さを有するバリアントの断片、配列番号２、本明細書に記載の長さのその断片、バリアントを有するタンパク質、すなわち、本明細書に記載の配列番号２に対して同一性を有する配列および本明細書に記載の長さを有するバリアントの断片を有するタンパク質、ならびにそれらの組み合わせを指す。抗原は、任意に、他のタンパク質からのものなどのシグナルペプチドを含み得る。
【0035】
本明細書で使用される「コード配列」または「コードする核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、核酸が投与される対象または哺乳動物の細胞における発現を指示することが可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、制御性要素に動作可能に連結される開始および終結シグナルをさらに含み得る。
【0036】
本明細書で使用される「補体」または「相補的」は、核酸がヌクレオチド間または核酸分子のヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対を意味し得ることを意味する。
【0037】
本明細書で使用される、「コンセンサス」または「コンセンサス配列」は、異なる生物からの同じ遺伝子の複数の配列のアライメントの分析に基づいたポリペプチド配列を意味する。コンセンサスポリペプチド配列をコードする核酸配列を調製することができる。コンセンサス配列を含むタンパク質および／またはそのようなタンパク質をコードする核酸分子を含むワクチンは、抗原に対して広範な免疫を誘導するために使用することができる。
【0038】
本明細書で使用される「定電流」は、同じ組織に送達される電気パルスの持続期間にわたって、組織または該組織を規定する細胞によって受け取られるまたは経験される電流を表す。電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達される。本明細書に提供される電気穿孔装置はフィードバック要素を有する、好ましくは即時フィードバックを有するため、この電流は、電気パルスの寿命にわたって該組織に一定のアンペア数のままである。フィードバック要素は、パルスの持続期間全体を通して組織（または細胞）の抵抗を測定し、電気穿孔装置にその電気エネルギー出力を変更させる（例えば、電圧増加させる）ため、同じ組織内の電流が電気パルス全体を通して（マイクロ秒ほどで）およびパルス間で一定のままである。いくつかの実施形態において、フィードバック要素はコントローラを含む。
【0039】
本明細書で使用される「電流フィードバック」または「フィードバック」は、交換可能に使用されてもよく、電極間の組織の電流を測定し、一定のレベルに電流を維持するためにＥＰ装置によって送達されるエネルギー出力を適宜変更することを含む、提供される電気穿孔装置の能動応答を意味し得る。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気治療の開始前にユーザによって予め調整される。フィードバックは、電気回路が電極間の組織の電流を継続的に監視し、監視した電流（または組織内の電流）を予め調整した電流と比較し、継続的にエネルギー出力調整を行って、監視した電流を予め調整したレベルに維持することができるため、電気穿孔装置の電気穿孔構成要素、例えばコントローラによって達成され得る。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるため、瞬時であり得る。
【0040】
本明細書で使用される「分散電流」は、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し、このパターンは、電気穿孔される組織の任意の領域の電気穿孔関連の熱ストレスの発生を最小限に抑えるか、好ましくは排除する。
【0041】
本明細書で交換可能に使用される「電気穿孔」、「電気透過」、または「電気運動増強」（「ＥＰ」）は、生体膜において微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電場パルスの使用を意味し、それらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水などの生体分子が細胞膜の一方の側からもう一方の側に通過するのを可能にする。
【0042】
核酸配列に関して本明細書で使用される「断片」は、本明細書に開示の抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドをコードする核酸配列またはその一部を意味する。断片は、以下に記載のタンパク質断片をコードする様々なヌクレオチド配列の少なくとも１つから選択されるＤＮＡ断片であり得る。断片は、付加されるいかなる異種シグナルペプチドも除いて、本明細書に記載の核酸配列のうちの１つ以上の全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、付加されるいかなる異種シグナルペプチドも除いて、以下に記載の核酸配列のうちの１つ以上の全長の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。
【0043】
いくつかの実施形態において、断片は、いかなる異種シグナルペプチドも除いて、本明細書に記載の核酸配列のうちの１つ以上と少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であり得る。いくつかの実施形態において、断片は、いかなる異種シグナルペプチドも除いて、以下に記載の核酸配列のうちの１つ以上と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり得る。
【0044】
さらなる実施形態において、断片は、加えて任意に、同一性パーセントを計算するときに含まれない異種シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列も含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に連結され得る。
【0045】
いくつかの実施形態において、断片は、以下に記載の核酸配列のうちの少なくとも１つの少なくとも１５００ヌクレオチド以上、１５１０ヌクレオチド以上、１５２０ヌクレオチド以上、１５３０ヌクレオチド以上、１５４０ヌクレオチド以上、１５５０ヌクレオチド以上、１５６０ヌクレオチド以上、１５７０ヌクレオチド以上、１５８０ヌクレオチド以上、１５９０ヌクレオチド以上、１６００ヌクレオチド以上、１６１０ヌクレオチド以上、１６２０ヌクレオチド以上、または１６３０ヌクレオチド以上、１６４０ヌクレオチド以上、１６５０ヌクレオチド以上、１６６０ヌクレオチド以上、１６７０ヌクレオチド以上、１６８０ヌクレオチド以上、１６９０ヌクレオチド以上、１７００ヌクレオチド以上、１７１０ヌクレオチド以上、１７２０ヌクレオチド以上、１７３０ヌクレオチド以上、１７４０ヌクレオチド以上、１７５０ヌクレオチド以上、１７６０ヌクレオチド以上、１７７０ヌクレオチド以上、１７８０ヌクレオチド以上、１７９０ヌクレオチド以上、１８００ヌクレオチド以上、１８１０ヌクレオチド以上、または１８２０ヌクレオチド以上を含むことができる。
【0046】
ポリペプチド配列に関して「断片」または「免疫原性断片」は、本明細書に開示の抗原と交差反応する哺乳動物において免疫応答を誘発することができるポリペプチドを意味する。断片は、本明細書に記載の様々なアミノ酸配列のうちの少なくとも１つから選択されるポリペプチド断片であり得る。コンセンサスタンパク質の断片は、付加されるいかなる異種シグナルペプチドも除いて、コンセンサスタンパク質の全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を含み得る。いくつかの実施形態において、断片は、付加されるいかなる異種シグナルペプチドも除いて、以下に記載のアミノ配列のうちの１つ以上の全長の少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含み得る。
【0047】
いくつかの実施形態において、断片は、いかなる異種シグナルペプチドも除いて、本明細書に記載のアミノ酸配列のうちの１つ以上と少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一であり得る。いくつかの実施形態において、断片は、付加されるいかなる異種シグナルペプチドも除いて、以下に記載のアミノ酸配列のうちの１つ以上と少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であり得る。
【0048】
さらなる実施形態において、断片は、加えて任意に、同一性パーセントを計算するときに含まれない異種シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。断片は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。
【0049】
いくつかの実施形態において、コンセンサスタンパク質の断片は、本明細書に開示されるタンパク質配列の少なくとも５４６アミノ酸以上、５４７アミノ酸以上、５４８アミノ酸以上、５４９アミノ酸以上、５５０アミノ酸以上、５５１アミノ酸以上、５５２アミノ酸以上、５５３アミノ酸以上、５５４アミノ酸以上、５５５アミノ酸以上、５５６アミノ酸以上、５５７アミノ酸以上、５５８アミノ酸以上、５５９アミノ酸以上、５６０アミノ酸以上、５６１アミノ酸以上、５６２アミノ酸以上、５６３アミノ酸以上、５６４アミノ酸以上、５６５アミノ酸以上、５６６アミノ酸以上、５６７アミノ酸以上、５６８アミノ酸以上、５６９アミノ酸以上、５７０アミノ酸以上、５７１アミノ酸以上、５７２アミノ酸以上、５７３アミノ酸以上、５７４アミノ酸以上、５７５アミノ酸以上、５７６アミノ酸以上、５７７アミノ酸以上、５７８アミノ酸以上、５７９アミノ酸以上、５８０アミノ酸以上、５８１アミノ酸以上、５８２アミノ酸以上、５８３アミノ酸以上、５８４アミノ酸以上、５８５アミノ酸以上、５８６アミノ酸以上、５８７アミノ酸以上、５８８アミノ酸以上、５８９アミノ酸以上、５９０アミノ酸以上、５９１アミノ酸以上、５９２アミノ酸以上、５９３アミノ酸以上、５９４アミノ酸以上、５９５アミノ酸以上、５９６アミノ酸以上、５９７アミノ酸以上、５９８アミノ酸以上、５９９アミノ酸以上、６００アミノ酸以上、６０１アミノ酸以上、６０２アミノ酸以上、６０３アミノ酸以上、６０４アミノ酸以上、６０５アミノ酸以上、６０６アミノ酸以上、６０７アミノ酸以上を含むことができる。
【0050】
本明細書で使用される「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与される対象の細胞において発現を指向することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む、制御性要素に動作可能に連結される開始および終結シグナルを含む。本明細書で使用される「発現可能な形態」という用語は、対象の細胞に存在する場合に、コード配列が発現されるようにタンパク質をコードするコード配列に動作可能に連結される必要な制御性要素を含有する遺伝子構築物を指す。
【0051】
本明細書で使用される「相同性」という用語は、相補性の程度を指す。部分的な相同性または完全な相同性（すなわち、同一性）が存在し得る。標的核酸へのハイブリダイズから完全な相補性配列を少なくとも部分的に阻害する部分的な相同性配列は、「実質的に相同」という機能的用語を使用して言及される。ｃＤＮＡまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して使用される場合、本明細書で使用される「実質的に相同」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列の鎖にハイブリダイズすることができるプローブを指す。一本鎖核酸配列に関して使用される場合、本明細書で使用される「実質的に相同」という用語は、低ストリンジェンシーの条件下で一本鎖核酸テンプレート配列にハイブリダイズすることができるプローブを指す（すなわち、その補体である）。
【0052】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される、「同一」または「同一性」は、配列が特定の領域にわたって同じである残基の特定のパーセンテージを有することを意味する。パーセンテージは、２つの配列を最適にアライメントし、特定の領域にわたって２つの配列を比較し、同一の残基が両配列で生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を特定の領域の位置の総数で除し、結果を１００で乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることにより計算することができる。２つの配列が異なる長さのものであるか、またはアライメントにより１つ以上の付着端が生じ、比較の特定の領域が単一配列のみを含む場合、単一配列の残基は計算の分母に含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、同等とみなされ得る。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータシーケンスアルゴリズムを使用することによって行うことができる。
【0053】
本明細書で使用される「インピーダンス」は、フィードバック機構を論じる場合に使用され得、オームの法則に従う電流値に変換され、したがって予め調整された電流と比較することができる。
【0054】
本明細書で使用される「免疫応答」は、抗原の導入に応答する、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味する。免疫応答は、細胞性もしくは液性応答、またはその両方の形態であり得る。
【0055】
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記述も相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸は記述される一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントが所与の核酸と同じ目的のために使用され得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸およびその補体も包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができるプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。
【0056】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖および一本鎖の両方の配列の一部を含み得る。核酸がデオキシリボ－およびリボ－ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン,
ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る場合、核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得る。核酸は、化学合成法または組換え法により得ることができる。
ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る場合、核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得る。核酸は、化学合成法または組換え法により得ることができる。
【0057】
本明細書で使用される「動作可能に連結される」は、遺伝子の発現が空間的に接続されるプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下の遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターとプロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当該技術分野において既知であるように、この距離の差異は、プロモーターの機能を喪失することなく調整され得る。
【0058】
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結された配列を意味し得、天然、合成、または天然および合成の改変もしくは組み合わせであり得る。
【0059】
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を付与する、活性化する、または増強することができる合成または天然由来の分子を意味する。プロモーターは、細胞における核酸の発現をさらに増強し、かつ／または空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つ以上の特異的転写制御配列を含み得る。プロモーターは、転写の開始部位から数千塩基対ほどに位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントも含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発達段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などの外部刺激に応答して、構成的または差次的に遺伝子構成成分の発現を制御することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、およびヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶ）が挙げられる。特定の実施形態において、プロモーターは、ｈＣＭＶプロモーターである。
【0060】
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書において交換可能に使用され、本明細書に記載のタンパク質のアミノ末端で連結され得るアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を指向する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、タンパク質が産生される細胞からその分泌を容易にする。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質の残りの部分から切断されることが多く、しばしば、細胞から分泌されると成熟タンパク質と称される。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のアミノ末端（すなわち、Ｎ末端）で連結される。
【0061】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が核酸の複雑な混合物などにおいて第２の核酸配列（例えば、標的）にハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる状況において異なる。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨで特異的配列の熱的融点（ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５～１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核濃度下で）であり得る（標的配列は過剰で存在するため、Ｔｍで、プローブの５０％は平衡で占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度がｐＨ７．０～８．３の約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、例えば、約０．０１～１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブについては（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）少なくとも約３０℃、そして長いプローブについては（例えば、約５０ヌクレオチド超）少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の添加によっても達成することができる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションに関して、正のシグナルは背景ハイブリダイゼーションの少なくとも２～１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２ｘＳＳＣにおいて洗浄、および６５℃で０．１％ＳＤＳが含まれる。
【0062】
本明細書で使用される「対象」は、本明細書に記載のワクチンで免疫化されることを望む、またはそれを必要とする哺乳動物を意味し得る。哺乳動物は、ヒト、チンパンジーなどの非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ネズミ、またはラットであり得る。
【0063】
本明細書で使用される「実質的に相補的」は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の補体に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるか、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。
【0064】
本明細書で使用される「実質的に同一」は、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、または第１の配列が第２の配列の補体と実質的に相補的である場合、核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であることを意味する。
【0065】
本明細書で使用される「治療する」、「治療」、または「治療すること」は、疾患を予防する、抑制する、阻止する、または完全に排除する手段により疾患から動物を保護することを意味し得る。疾患の予防は、疾患の発症前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の抑制は、疾患の誘導後であるが、その臨床的出現の前に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。疾患の阻止は、疾患の出現後に本発明のワクチンを動物に投与することを伴う。
【0066】
核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）言及されるヌクレオチド配列の一部もしくは断片、（ｉｉ）言及されるヌクレオチド配列もしくはその一部の補体、（ｉｉｉ）言及される核酸もしくはその補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）ストリンジェント条件下で、言及される核酸、その補体、もしくはそれに実質的に同一の配列にハイブリダイズする核酸を意味する。
【0067】
ペプチドまたはポリペプチドに関して本明細書で使用される「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味する。バリアントは、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を伴う言及されるタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を伴うタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似する特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸に置き換えることは、当該技術分野において典型的にわずかな変化を伴うと認識されている。これらのわずかな変化は、当該技術分野において理解されるように、一部、アミノ酸の疎水親水指数を考慮することによって同定され得る。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸の疎水親水指数は、その疎水性および電荷を考慮することに基づく。類似する疎水親水指数のアミノ酸が置換され、なおもタンパク質機能を保持することができることは当該技術分野において既知である。一態様では、±２の疎水親水指数を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性は、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらし得る置換を明らかにするために、使用することもできる。ペプチドの文脈において、アミノ酸の親水性を考慮することにより、抗原性および免疫原性と良好に相関することが報告されている有用な手段である、そのペプチドの最大局所平均親水性（ｇｒｅａｔｅｓｔ ｌｏｃａｌ ａｖｅｒａｇｅ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）の計算が可能となる。米国特許第４，５５４，１０１号、参照により本明細書に完全に組み込まれる。類似する親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該技術分野において理解されるように、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらし得る。置換は、互いに±２内の親水性値を有するアミノ酸で行うことができる。アミノ酸の疎水性指数および親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一致して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性により明らかにされるように、アミノ酸の相対類似性および特にそれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【0068】
バリアントは、完全な遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列の完全長またはその断片にわたって、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
【0069】
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。ベクターは、１つ以上の異種核酸配列を含有するか、それを含み得る。
【0070】
ワクチン
本明細書に記載されるメソセリン抗原またはメソセリン抗原をコードする核酸を含むワクチンが本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ワクチンは、本明細書に記載されるメソセリン抗原をコードする１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号２のアミノ酸１９～６０７をコードする核酸配列、配列番号２のアミノ酸１９～６０７を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および／または配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。
本明細書に記載されるメソセリン抗原またはメソセリン抗原をコードする核酸を含むワクチンが本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、ワクチンは、本明細書に記載されるメソセリン抗原をコードする１つ以上の核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号２のアミノ酸１９～６０７をコードする核酸配列、配列番号２のアミノ酸１９～６０７を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および／または配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。
【0071】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号２をコードする核酸配列、配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列、配列番号２と少なくとも９６％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および／または配列番号２と少なくとも９６％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列を含む１つ以上の核酸分子を含む。
【0072】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１、配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１と少なくとも９６％同一である断片、および／または配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１と少なくとも９６％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む１つ以上の核酸分子を含む。
【0073】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、配列番号１、配列番号１の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号１と少なくとも９６％同一である断片、および／または配列番号１と少なくとも９６％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む１つ以上の核酸分子を含む。
【0074】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、ＭＵＣ１６抗原を含み、抗原は、配列番号２のアミノ酸１９～６０７、配列番号２のアミノ酸１９～６０７を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片、配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および／または配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
【0075】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、ＭＵＣ１６抗原を含み、抗原は、配列番号２、配列番号２の長さの少なくとも９０％を含む断片、配列番号２と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列、および／または配列番号２と少なくとも９６％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片を含む。
【0076】
ワクチンは、対象において、抗原に対して免疫応答を生成することが可能であり得る。免疫応答は、治療的または予防的免疫応答であり得る。ワクチンは、がん、例えば、メソセリンを発現するがんまたは腫瘍を防ぐために、使用することができる。ワクチンは、メソセリンを発現する腫瘍を予防および／または治療するために、それを必要とする対象において使用することができる。ワクチンは、メソセリンに対しておよびメソセリンを発現する腫瘍に対して細胞性および／または抗体応答を誘導することができる。一実施形態において、ワクチンは、メソセリンを発現する卵巣がん細胞、具体的には、メソセリンを発現する上皮性卵巣がん細胞、より具体的には、メソセリンを発現する漿液性卵巣がん細胞に対する細胞性および／または抗体応答を防御、予防および／または治療するために、または誘導するために使用することができる。
【0077】
本明細書に記載されるがんワクチンの開発には、免疫系によって認識されず、異常に発現した自己抗原であるがん抗原、例えばメソセリンを同定することを含む。同定されたがん抗原は、免疫系によって認識されるために、自己抗原から外来抗原に変更される。自己から外来抗原に組換えがん抗原の核酸およびアミノ酸配列を再設計することにより、免疫系による抗原の寛容が破壊される。寛容を破壊するために、以下に記載されるように、いくつかの再設計手段ががん抗原に適用され得る。
【0078】
ワクチンの組換えがん抗原は、自己として認識されず、それにより寛容を破壊する。寛容の破壊は、抗原特異的Ｔ細胞および／または高力価抗体応答を誘導することができ、それにより抗原を発現するがんまたは腫瘍に指向されるか、またはそれに対して反応性である免疫応答を誘導または誘発する。いくつかの実施形態において、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、細胞性、液性、または細胞性および液性の両方の免疫応答であり得る。いくつかの実施形態において、誘導されたまたは誘発された細胞性免疫応答には、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）および／または腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）の誘導または分泌が含まれ得る。他の実施形態において、誘導されたまたは誘発された免疫応答は、抗原を発現する腫瘍またはがんの成長を促進する１つ以上の免疫抑制因子、例えば、限定されないが、ＭＨＣ提示を下方制御する因子、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）を上方制御する因子、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、ＩＬ－１０およびＴＦＧ－βなどのサイトカイン、腫瘍関連マクロファージ、腫瘍関連線維芽細胞、免疫抑制細胞により産生された可溶性因子、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＭＤＳＣ、ＭＣＰ－１、ならびに免疫チェックポイント分子を低減または阻害することができる。
【0079】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、および同第５，６７６，５９４号（参照により完全に本明細書に組み込まれる）に開示されている。いくつかの実施形態において、核酸分子は、発現ベクターを含み得る。ＤＮＡワクチンは、それが染色体に組み込まれるのを阻害する要素または試薬をさらに含み得る。
【0080】
ワクチンは、がん抗原をコードするＲＮＡを含み得る。ＲＮＡワクチンは、細胞内に導入され得る。
【0081】
ワクチンは、弱毒生ワクチン、組換えベクターを使用して抗原を送達するワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチンであり得、例えば、これらに限定されないが、ワクチンは、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号、および同第６，５８９，５２９号に記載され、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる。
【0082】
いくつかの実施形態において、核酸ワクチンは、分子アジュバントをさらに含み得、場合によっては、分子アジュバントは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、および／またはＲＡＮＴＥＳであり得、場合によっては、分子アジュバントは、抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、抗プログラム死受容体－１（ＰＤ－１）、および抗リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ－３）を含むチェックポイント阻害剤である。ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、および／またはＲＡＮＴＥＳについてのコード配列は、１つ以上の抗原についてのコード配列を含む１つ以上の核酸分子に含まれ得る。ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、および／またはＲＡＮＴＥＳについてのコード配列は、核酸ワクチンによって、例えば同じプラスミドにコードされ得るか、またはそれらは、別個のプラスミドなどの別個の核酸分子に含まれ得る。
【0083】
本発明のワクチンは、ワクチン自体が病気もしくは死を引き起こさないように安全である、病気を防ぐ、中和抗体を誘導する、防御性Ｔ細胞応答を誘導する、ならびに投与の容易性、少ない副作用、生物学的安定性、および投与あたりの低費用を提供するなど、有効なワクチンに求められる特徴を有し得る。ワクチンは、以下に論じるがん抗原を含有することによりこれらの特徴のいくつかまたはすべてを達成することができる。
【0084】
ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下により詳細に説明される。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラスの提示、Ｔ細胞の提示および／もしくは分化、Ｂ細胞の提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達などの免疫系における任意の構成成分の抑制を妨げる任意の核酸またはタンパク質である。以下でさらに詳細に記載するように、ワクチンは、ＰＤ－１およびＰＤＬ－１などのチェックポイント阻害剤に対する抗体とさらに組み合わせて、細胞性および体液性免疫応答の両方の刺激を増強することができる。抗ＰＤ－１または抗ＰＤＬ－１抗体を使用することによって、ＰＤ－１またはＰＤＬ－１がＴ細胞および／またはＢ細胞応答を抑制するのを予防する。
抗原
抗原
【0085】
上述されるように、ワクチンは、抗原または抗原をコードする核酸を含むことができる。抗原は、メソセリン、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0086】
メソセリンは、３０ｋＤの巨核球増強因子および４１ｋＤのＧＰＩアンカー型膜結合成熟メソセリンの２つの生成物に切断される７１ｋＤのタンパク質である。メソセリンの機能は不明であるが、最近の研究では、メソセリンが、ＭＵＣ１６と結合することにより卵巣がん転移に役割を果たし得ることが示唆され、卵巣がん細胞の表面にも高発現される。メソセリンの発現は、ＩＨＣにより漿液性卵巣がんの８２～１００％で観察される。Ｈａｓｓａｎ，Ｒ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ４４，４６－５３（２００８）、Ｏｒｄｏｎｅｚ，Ｎ．Ｇ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２７，１４１８－１４２８（２００３）。
【0087】
したがって、ワクチンは、メソセリンを発現するがんまたは腫瘍に罹患する対象を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態において、がんは、卵巣がんである。メソセリン抗原は、天然の「正常な」メソセリンとは異なり、したがってメソセリン抗原発現腫瘍に対する療法または予防法を提供することができる。したがって、天然のメソセリン遺伝子とは異なるメソセリン抗原配列（すなわち、組み合わせたまたは変異したメソセリン遺伝子または配列）が本明細書に提供される。
【0088】
上述の異種配列を含む核酸分子が提供される。上述の異種配列からなる核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、核酸分子は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１を含む核酸分子の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む断片、（ｃ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１と少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である断片、および（ｄ）配列番号１のヌクレオチド５５～１８２１と少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、（ａ）配列番号１、（ｂ）配列番号１の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む断片、（ｃ）配列番号１と少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である断片、および（ｄ）配列番号１と少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である核酸配列の全長の少なくとも９０％を含む断片からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号１に記載の核酸配列を含む。
【0089】
メソセリン抗原をコードする核酸分子が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む断片をコードする核酸配列から選択される１つ以上の核酸を含む核酸分子。いくつかの実施形態において、（ａ）配列番号２をコードする核酸配列、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む断片をコードする核酸配列、（ｃ）配列番号２と少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるタンパク質をコードする核酸配列、および（ｄ）配列番号２と少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるタンパク質の全長の少なくとも９０％を含む断片をコードする核酸配列からなる群から選択される１つ以上の核酸配列を含む核酸分子が提供される。
【0090】
上述の異種配列を含む単離された核酸分子は、プラスミド、ウイルスベクター、および以下に記載される核酸分子の他の形態などのベクターに組み込まれ得る。
【0091】
上述の異種アミノ酸配列を含むタンパク質分子が提供される。上述の異種アミノ酸配列からなるタンパク質分子が提供される。上述の配列を有するタンパク質およびポリペプチドが本明細書に提供される。タンパク質およびポリペプチドは、メソセリン抗原およびメソセリン免疫源と称され得る。メソセリン抗原は、メソセリン抗原を発現する腫瘍に対して免疫応答を誘発することができる。いくつかの実施形態において、（ａ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７、（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７を含むタンパク質の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む断片、（ｃ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、および（ｄ）配列番号２のアミノ酸１９～６０７と少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質。いくつかの実施形態において、（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号２の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む断片、（ｃ）配列番号２と少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、および（ｃ）配列番号２と少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列の全長の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％を含む断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
【0092】
一態様では、転写を増加するための低ＧＣ含有リーダー配列、ｍＲＮＡ安定性およびコドンの最適化、ならびに可能な限り、シス作用性配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）の排除のうちの１つ以上を含む、コンセンサス抗原が転写および翻訳の改善を提供することが望ましい。
【0093】
メソセリン抗原は、２つ以上の種に由来するコンセンサス抗原（または免疫源）配列であり得る。メソセリンコンセンサス抗原は、ＭＵＣ－１６結合ドメインにおけるアミノ酸の１つ以上の置換を含み得る１つ以上の変異を含み得る。１つ以上の変異は、チロシンからアラニンへの置換をもたらす、核酸変異を含み得る。１つ以上の変異は、ＧＰＩアンカリングシグナルにおけるアミノ酸の１つ以上の置換を含み得る。１つ以上の変異は、セリンからトレオニンおよび／またはトレオニンからバリンへの置換を含み得る。したがって、いくつかの実施形態において、１つ以上の変異は、メソセリンＭＵＣ１６結合および／またはＧＰＩアンカリングシグナルにおける１つ、２つ、または３つのアミノ酸を置き換えることができる。
【0094】
メソセリン抗原は、発現を改善するための改変を含み得る。改変は、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、翻訳開始を増加させるためのコザック配列（例えば、ＧＣＣ ＡＣＣ）の追加、および／またはメソセリン抗原の免疫原性を増加させるための免疫グロブリンリーダー配列の追加を含み得る。メソセリン抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、限定されないが、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）シグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含み得る。
【0095】
免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたワクチン
ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下でより詳細に記載する。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラスの提示、Ｔ細胞の提示、および／もしくは分化、Ｂ細胞の提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達などの免疫系における任意の構成成分の抑制を妨げる任意の核酸またはタンパク質である。
ワクチンは、１つ以上の免疫チェックポイント分子の１つ以上の阻害剤（すなわち、免疫チェックポイント阻害剤）をさらに含み得る。免疫チェックポイント分子は、以下でより詳細に記載する。免疫チェックポイント阻害剤は、ＭＨＣクラスの提示、Ｔ細胞の提示、および／もしくは分化、Ｂ細胞の提示および／もしくは分化、任意のサイトカイン、ケモカイン、または免疫細胞の増殖および／もしくは分化のためのシグナル伝達などの免疫系における任意の構成成分の抑制を妨げる任意の核酸またはタンパク質である。
【0096】
そのような阻害剤は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸は、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤と連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列も含むことができる。小分子は、低分子量、例えば８００ダルトン未満の、酵素基質として機能し得る有機もしくは無機化合物、タンパク質もしくは核酸により結合されるリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの制御因子であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0097】
いくつかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせをコードする１つ以上の核酸配列であり得る。他の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0098】
ａ．免疫チェックポイント分子
免疫チェックポイント分子は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸は、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤と連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列も含むことができる。小分子は、低分子量、例えば８００ダルトン未満の、酵素基質として機能し得る有機もしくは無機化合物、タンパク質もしくは核酸により結合されるリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの制御因子であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
免疫チェックポイント分子は、核酸配列、アミノ酸配列、小分子、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。核酸は、ペプチド結合により免疫チェックポイント阻害剤と連結されるリンカーまたはタグ配列をコードする追加の配列も含むことができる。小分子は、低分子量、例えば８００ダルトン未満の、酵素基質として機能し得る有機もしくは無機化合物、タンパク質もしくは核酸により結合されるリガンド（またはその類似体）、または生物学的プロセスの制御因子であり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0099】
（１）ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１
免疫チェックポイント分子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、それらの断片、それらのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ－１は、ＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされる細胞表面タンパク質である。ＰＤ－１は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞およびプロＢ細胞上に発現され、したがって、これらの細胞の運命および／または分化に寄与する。特に、ＰＤ－１は、Ｔ細胞制御因子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーの１型膜タンパク質であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルを負に制御し、それにより免疫応答を負に制御する。ＰＤ－１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を負に制御することができ、したがって、ＣＤ８媒介細胞傷害性を阻害し、腫瘍成長を増強する。
免疫チェックポイント分子は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、それらの断片、それらのバリアント、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ－１は、ＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされる細胞表面タンパク質である。ＰＤ－１は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞およびプロＢ細胞上に発現され、したがって、これらの細胞の運命および／または分化に寄与する。特に、ＰＤ－１は、Ｔ細胞制御因子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーの１型膜タンパク質であり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルを負に制御し、それにより免疫応答を負に制御する。ＰＤ－１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を負に制御することができ、したがって、ＣＤ８媒介細胞傷害性を阻害し、腫瘍成長を増強する。
【0100】
ＰＤ－１は、Ｂ７ファミリーのメンバーであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の２つのリガンドを有する。ＰＤ－Ｌ１は、ＬＰＳおよびＧＭ－ＣＳＦ治療に応答してマクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ）上で、ならびにＴＣＲおよびＢ細胞受容体シグナル伝達時にＴ細胞およびＢ細胞上で上方制御される。ＰＤ－Ｌ１は、骨髄腫、マスト細胞腫、および黒色腫を含む多くの腫瘍細胞株によって発現される。
【0101】
ｂ．抗免疫チェックポイント分子抗体
上述されるように、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体であり得る。抗体は、抗原（すなわち、上述される免疫チェックポイント分子）と結合または反応することができる。したがって、抗体は、抗免疫チェックポイント分子抗体または免疫チェックポイント分子抗体と考慮され得る。抗体は、に含まれる核酸配列によってコードされ得る。
上述されるように、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体であり得る。抗体は、抗原（すなわち、上述される免疫チェックポイント分子）と結合または反応することができる。したがって、抗体は、抗免疫チェックポイント分子抗体または免疫チェックポイント分子抗体と考慮され得る。抗体は、に含まれる核酸配列によってコードされ得る。
【0102】
抗体は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域および／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含み得る。少なくとも１つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、および定常重鎖領域３（ＣＨ３）、ならびに／またはヒンジ領域を含み得る。
【0103】
いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。他の実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。
【0104】
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得る。ＣＤＲセットは、ＶＨ領域の３つの超可変領域を含み得る。重鎖ポリペプチドのＮ末端から順に、これらのＣＤＲは、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
【0105】
軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域および／または定常軽鎖（ＣＬ）領域を含み得る。軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得る。ＣＤＲセットは、ＶＬ領域の３つの超可変領域を含み得る。軽鎖ポリペプチドのＮ末端から順に、これらのＣＤＲは、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
【0106】
抗体は、重鎖および軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得、ＣＤＲに対して支持を提供し、ＣＤＲの空間的な関係を相互に定義する重鎖および軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間にそれぞれ挿入される。ＣＤＲセットは、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含み得る。重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、これらの領域は、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、「ＣＤＲ３」と表される。したがって、抗原結合部位は、重および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含み得る。
【0107】
抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
【0108】
加えて、タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断して、いくつかの断片をもたらし、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）はそれぞれ、無傷抗原結合部位を含む共有結合ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を含むいくつかの断片を提供することができ、両方の抗原結合部位を含む。したがって、抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
【0109】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種からの抗体であり得る。
【0110】
（１）ＰＤ－１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ－１抗体（本明細書では「ＰＤ－１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ－１抗体は、ニボルマブであり得る。抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍増殖を減少させることができる。
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ－１抗体（本明細書では「ＰＤ－１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。ＰＤ－１抗体は、ニボルマブであり得る。抗ＰＤ－１抗体は、ＰＤ－１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍増殖を減少させることができる。
【0111】
（２）ＰＤ－Ｌ１抗体
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（本明細書では「ＰＤ－Ｌ１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍増殖を減少させることができる。
抗免疫チェックポイント分子抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（本明細書では「ＰＤ－Ｌ１抗体」とも称される）、そのバリアント、その断片、またはそれらの組み合わせであり得る。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１活性を阻害し、それにより腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導、誘発、または増加させ、腫瘍増殖を減少させることができる。
【0112】
ベクター
ワクチンは、メソセリン抗原をコードする異種核酸を含む１つ以上のベクターを含み得る。１つ以上のベクターが、哺乳動物において免疫応答を誘発するのに有効な量で抗原を発現することが可能であり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、複製起点を含む核酸配列を有し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
ワクチンは、メソセリン抗原をコードする異種核酸を含む１つ以上のベクターを含み得る。１つ以上のベクターが、哺乳動物において免疫応答を誘発するのに有効な量で抗原を発現することが可能であり得る。ベクターは、抗原をコードする異種核酸を含み得る。ベクターは、複製起点を含む核酸配列を有し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【0113】
１つ以上のベクターは、特異的遺伝子を標的細胞に導入するために使用される、一般的にプラスミドである発現構築物であり得る。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞転写および翻訳機構リボソーム複合体によって生成される。プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として機能し、発現ベクターで運ばれる遺伝子の効率的な転写をもたらす制御配列を含むように頻繁に操作される。本発明のベクターは、大量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、したがってタンパク質を発現する。
【0114】
ベクターは、強力なプロモーター、強力な終止コドン、プロモーターとクローニングされた遺伝子との間の距離の調整、ならびに転写終結配列およびＰＴＩＳ（携帯型翻訳開始配列）の挿入などの発現シグナルを有し得る。
【0115】
ベクターは、プロモーターおよびポリ－アデニル化シグナルから選択される制御性要素に動作可能に連結される核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）である。いくつかの実施形態において、ポリ－アデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリ－アデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）である。
【0116】
ベクターは、環状プラスミドまたは直鎖状核酸であり得る。環状プラスミドおよび直鎖状核酸は、適切な対象細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指向することができる。ベクターは、終結シグナルに動作可能に連結され得る抗原コードヌクレオチド配列に動作可能に連結されるプロモーターを有し得る。ベクターは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列、ならびにベクターおよびその断片をクローニングおよびサブクローニングするための配列も含み得る。関心のヌクレオチド配列を含むベクターはキメラであり得る、つまり、その構成成分のうちの少なくとも１つがその他の構成成分のうちの少なくとも１つに対して異種である。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞がある特定の外部刺激に曝されるときにのみ転写を開始する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織もしくは臓器または発達段階に特異的であり得る。
【0117】
ベクターは、プラスミドであり得る。プラスミドは、抗原をコードする核酸を細胞にトランスフェクトするのに有用であり得、形質転換された宿主細胞は、抗原の発現が起こる条件下で培養および維持される。
【0118】
プラスミドは、抗原に対して免疫応答を誘発することができる合成のコンセンサス抗原、かかるタンパク質の断片、かかるタンパク質のバリアント、バリアントまたは融合タンパク質の断片をコードするコード配列を含む、上記に開示された様々な抗原の１つ以上をコードする核酸配列を含み得、これらは、コンセンサスタンパク質および／またはコンセンサスタンパク質の断片および／またはコンセンサスタンパク質のバリアントおよび／またはコンセンサスタンパク質のバリアントの断片の組み合わせで構成される。
【0119】
いくつかの実施形態において、プラスミドは、単独でまたはこれらのプラスミドの一部としてＣＣＲ２０をコードするコード配列をさらに含み得る。同様に、プラスミドは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、および／またはＩＬ－２８のコード配列をさらに含み得る。
【0120】
プラスミドは、コード配列の上流であり得る開始コドン、およびコード配列の下流であり得る終止コドンをさらに含み得る。開始および終止コドンは、コード配列を有するインフレームであり得る。
【0121】
プラスミドは、コード配列に動作可能に連結されるプロモーターも含み得る。コード配列に動作可能に連結されるプロモーターは、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからのプロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）などのヒト遺伝子からのプロモーターであり得る。プロモーターはまた、天然または合成の、筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであり得る。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第ＵＳ２００４／０１７５７２７号に記載されており、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【0122】
プラスミドは、コード配列の下流であり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナル、またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）であり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
【0123】
プラスミドは、コード配列の上流のエンハンサーも含み得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、もしくはＥＢＶからのものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、およびＷ０９４／０１６７３７に記載されており、それぞれの内容は参照により完全に組み込まれる。
【0124】
プラスミドは、プラスミドを染色体外で維持し、細胞においてプラスミドの複数コピーを産生するために、哺乳動物の複製起点も含み得る。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐＶＡＸＩ、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であり得、これらは、エプスタイン・バーウイルスの複製起点および核抗原ＥＢＮＡ－１コード領域を含み得、組み込みをすることなく高コピー数のエピソーム複製物を産生し得る。プラスミドの骨格は、ｐＡ Ｖ０２４２であり得る。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであり得る。
【0125】
プラスミドは、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現によく適している場合がある制御配列も含み得る。コード配列は、宿主細胞におけるコード配列のより効率的な転写を可能にし得るコドンを含み得る。
【0126】
コード配列は、免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列も含み得る。リーダー配列は、コード配列の５’’であり得る。この配列によってコードされるコンセンサス抗原は、Ｎ末端Ｉｇリーダー、続いてコンセンサス抗原タンパク質を含み得る。Ｎ末端Ｉｇリーダーは、ＩｇＥまたはＩｇＧであり得る。
【0127】
プラスミドは、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）におけるタンパク質産生のために使用され得る。プラスミドはまた、ｐ－ＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これは酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生のために使用され得る。プラスミドはまた、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものであってもよく、これは昆虫細胞におけるタンパク質産生のために使用され得る。プラスミドはまた、ｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であってもよく、これはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるタンパク質産生のために使用され得る。プラスミドはまた、ｐＧＸ００１（Ｉｎｏｖｉｏ）であり得、これはｐＶＡＸ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から改変される。
【0128】
ベクターは、細胞ゲノムに組み込むことによって標的細胞を形質転換するか、または染色体外で存在し得る環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自己複製プラスミド）であり得る。
【0129】
ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【0130】
電気穿孔により対象に効率的に送達され、１つ以上の所望の抗原を発現することができる直鎖状核酸ワクチンまたは直鎖状発現カセット（「ＬＥＣ」）も本明細書に提供される。ＬＥＣは、任意のリン酸骨格を欠く任意の直鎖状ＤＮＡであり得る。ＤＮＡは、１つ以上の抗原をコードし得る。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、終止コドン、および／またはポリアデニル化シグナルを含有し得る。抗原の発現は、プロモーターにより制御され得る。ＬＥＣは、任意の抗生物質耐性遺伝子および／またはリン酸骨格を含有しなくてもよい。ＬＥＣは、所望の抗原遺伝子発現に無関係の他の核酸配列を含有しなくてもよい。
【0131】
ＬＥＣは、局在化することができる任意のプラスミドに由来し得る。プラスミドは、抗原を発現することが可能であり得る。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘ、または抗原をコードするＤＮＡを発現し、細胞が配列を免疫系によって認識される抗原に翻訳することを可能にすることができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【0132】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）およびｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
【0133】
ベクターは、プロモーターを有し得る。プロモーターは、遺伝子発現を駆動し、単離された核酸の発現を制御することができる任意のプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ経由の転写に要するシス作用配列要素であり、本明細書に記載の抗原配列を転写する。異種核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、ベクターの転写開始から、これがその天然の設定における転写開始部位からの距離であるのとほぼ同じ距離に配置され得る。しかしながら、この距離の差異は、プロモーターの機能を喪失することなく対応し得る。
【0134】
プロモーターは、転写物、リボソーム結合部位、および翻訳終結の効率的なポリアデニル化に必要な抗原およびシグナルをコードする核酸配列に動作可能に連結され得る。
【0135】
プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞において発現に有効であると示される別のプロモーターであり得る。
【0136】
ベクターは、機能的なスプライスドナーおよびアクセプター部位を有するエンハンサーおよびイントロンを含み得る。ベクターは、効率的な終結を提供するために、構造遺伝子の下流に転写終結領域を含有し得る。終結領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子から得ることができるか、または異なる遺伝子から得てもよい。
ベクターを調製する方法
ベクターを調製する方法
【0137】
本明細書で論じられるメソセリン抗原をコードする核酸分子を含むベクターを調製するための方法が本明細書に提供される。哺乳動物発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップ後、当該技術分野において既知の方法を使用して、ベクターを大規模な発酵タンクにおいて細胞培養物に接種するために使用することができる。
【0138】
以下により詳細に説明される電気穿孔装置で使用するためのベクターは、既知の装置および技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは２００８年５月２３日に出願された米国特許公開第２００９／００４７１６号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの例では、これらの研究に使用されたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術はまた、２００７年７月３日に発行された米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般に即知である様々なデバイスおよびプロトコルを含む、または組み込む。上に言及される出願および特許である、米国特許公開第２００９／００４７１６号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0139】
賦形剤およびワクチンの他の構成成分
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤などの機能分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などの界面活性剤、または他の既知のトランスフェクション促進剤が含まれ得る。
ワクチンは、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤などの機能分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得、これには、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などの界面活性剤、または他の既知のトランスフェクション促進剤が含まれ得る。
【0140】
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタメートであり、ポリ－Ｌ－グルタメートは、６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度でワクチンに存在し得る。トランスフェクション促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体含有モノホスホリル脂質Ａ、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞などの界面活性剤も含み得、遺伝子構築物とともに投与されるヒアルロン酸も使用され得る。ＤＮＡプラスミドワクチンは、脂質、リポソーム（ＤＮＡ－リポソーム混合物として、レシチンリポソームまたは当該技術分野において既知の他のリポソームを含む）（例えばＷ０９３２４６４０を参照されたい）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などのトランスフェクション促進剤、または他の既知のトランスフェクション促進剤も含み得る。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ－Ｌ－グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。ワクチンにおけるトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【0141】
薬学的に許容される賦形剤は、１つ以上のアジュバントであり得る。アジュバントは、代替えのプラスミドにおいて発現されるか、またはワクチンにおいて上記のプラスミドと組み合わせてタンパク質として送達される他の遺伝子であり得る。１つ以上のアジュバントは、ＣＣＬ２０、α－インターフェロン（ＩＦＮ－α）、β－インターフェロン（ＩＦＮ－β）、γ－インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ－ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１～、ＩＬ－８、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ－７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、ＴＡＰ２、欠失したシグナル配列をコードするシグナル配列またはコード配列を有し、任意選択でＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチド、もしくはＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチドをコードするコード配列を含むＩＬ－１５、およびそれらの機能断片、またはそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。アジュバントは、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＲβ、ＧＭ－ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、またはそれらの組み合わせであり得る。
【0142】
いくつかの実施形態において、アジュバントは、１つ以上のタンパク質および／またはＣＣＬ－２０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、もしくはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列であり得る。ＩＬ－１２構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号および対応する米国出願第０８／９５６，８６５号、ならびに２０１１年１２月１２日に出願された米国仮出願第６１／５６９６００号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－１５構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号および対応する米国出願第１０／５６０，６５０号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号および対応する米国出願第１２／１６０，７６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳＩ０／０４８８２７号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２８構築物および配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号および対応する米国出願第１２／９３６，１９２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、およびＭＥＣ構築物ならびに配列の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号および対応する米国出願第１１／７１９，６４６号に開示されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。ＯＸ４０および他の免疫調節剤の例は、米国出願第１０／５６０，６５３号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。ＤＲ５および他の免疫調節剤の例は、米国出願第０９／６２２４５２号に開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【0143】
アジュバントとして有用であり得る他の遺伝子は、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｐ、ＩＬ－８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｅ－セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ－１、ＭａｄＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、ＶＬＡ－１、Ｍａｃ－１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ－１、ＩＣＡＭ－２、ＩＣＡＭ－３、ＣＤ２、ＬＦＡ－３、Ｍ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１８の変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ－７、ＩＬ－２２、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ－１、ｐ５５、ＷＳＬ－１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ－３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ、Ｓｐ－１、Ａｐ－１、Ａｐ－２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ－１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ－Ｒ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０ ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能断片をコードするものを含む。
【0144】
ワクチンは、１９９４年４月１日に出願された米国第０２１，５７９号（参照により完全に組み込まれる）に説明される遺伝子ワクチン促進剤をさらに含み得る。
【0145】
ワクチンは、抗原コードベクターを約１ナノグラム～１００ミリグラム、約１マイクログラム～約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム～約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム～約２ミリグラムの量で含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、約５ナノグラム～約１０００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、約１０ナノグラム～約８００マイクログラムの核酸を含有し得る。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、約０．１～約５００マイクログラムの核酸を含有し得る。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、約１～約３５０マイクログラムの核酸を含有し得る。いくつかの好ましい実施形態において、ワクチンは、約２５～約２５０マイクログラム、約１００～約２００マイクログラム、約１ナノグラム～１００ミリグラム、約１マイクログラム～約１０ミリグラム、約０．１マイクログラム～約１０ミリグラム、約１ミリグラム～約２ミリグラム、約５ナノグラム～約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム～約８００マイクログラム、約０．１～約５００マイクログラム、約１～約３５０マイクログラム、約２５～約２５０マイクログラム、約１００～約２００マイクログラムの抗原またはそのプラスミドを含有し得る。
【0146】
ワクチンは、使用される投与モードにより製剤化され得る。注射可能なワクチン薬学的組成物は、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｆｒｅｅ）であり得る。等張製剤または溶液を使用することができる。等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。ワクチンは、血管収縮剤（ｖａｓｏｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）を含み得る。等張溶液は、リン酸緩衝食塩水を含み得る。ワクチンは、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定剤をさらに含み得る。ＬＧＳまたはポリカチオンもしくはポリアニオンを含む安定剤は、製剤を長期間室温または周囲温度で安定させることができる。
【0147】
ワクチンの薬学的組成物
ワクチンは、薬学的組成物の形態であり得る。薬学的組成物は、ワクチンを含むことができる。薬学的組成物は、約５ナノグラム（ｎｇ）～約１０ミリグラム（ｍｇ）のワクチンの核酸分子を含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約２５ｎｇ～約５ｍｇのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約５０ｎｇ～約１ｍｇのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約０．１～約５００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１～約３５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約５～約２５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０～約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１５～約１５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０～約１００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５～約７５マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０～約５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５～約４０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１００～約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０マイクログラム～約１００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０マイクログラム～約８０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５マイクログラム～約６０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０ｎｇ～約５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５ｎｇ～約４５マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約０．１～約５００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１～約３５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約２５～約２５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１００～約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。
ワクチンは、薬学的組成物の形態であり得る。薬学的組成物は、ワクチンを含むことができる。薬学的組成物は、約５ナノグラム（ｎｇ）～約１０ミリグラム（ｍｇ）のワクチンの核酸分子を含むことができる。いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、約２５ｎｇ～約５ｍｇのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約５０ｎｇ～約１ｍｇのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約０．１～約５００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１～約３５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約５～約２５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０～約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１５～約１５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０～約１００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５～約７５マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０～約５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５～約４０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１００～約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１０マイクログラム～約１００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２０マイクログラム～約８０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約２５マイクログラム～約６０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３０ｎｇ～約５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約３５ｎｇ～約４５マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約０．１～約５００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１～約３５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約２５～約２５０マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの好ましい実施形態において、薬学的組成物は、約１００～約２００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含む。
【0148】
いくつかの実施形態において、本発明による薬学的組成物は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇのワクチンの核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラムのワクチンの核酸分子を含み得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ以上のワクチンの核酸分子を含み得る。
【0149】
他の実施形態において、薬学的組成物は、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ｎｇ（これらの値を含む）のワクチンの核酸分子を含み得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、最大１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラム（これらの値を含む）のワクチンの核酸分子を含み得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、最大１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ（これらの値も含む）のワクチンの核酸分子を含み得る。
【0150】
薬学的組成物は、使用される投与モードにより製剤目的のための他の薬剤をさらに含み得る。薬学的組成物が注射可能な薬学的組成物である場合、それらは、減菌、発熱性物質不含、および微粒子不含である。等張製剤を使用することが好ましい。一般的に、等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤が製剤に添加される。
【0151】
薬学的組成物は、上記で提供されるような薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。例えば、薬学的に許容される賦形剤は、上記で提供されるように、機能性分子、ビヒクル、アジュバント、担体、希釈剤、またはトランスフェクション促進剤を含むことができる。
【0152】
ワクチン接種方法
上記の薬学的製剤を使用して、卵巣がんなどであるが、これに限定されない、メソセリン発現がんを治療および／または予防するための方法が本明細書に提供される。対象における卵巣がんなどであるが、これに限定されない、メソセリン発現がんの治療および／または予防に上記の薬学的製剤を使用する方法も本明細書に記載される。対象にワクチン接種する方法も本明細書に記載される。本明細書に記載の薬学的製剤を、それを必要する対象に投与する方法も本明細書に記載される。集合的に本明細書に記載の薬学的製剤を使用する治療方法と称される本明細書に記載の方法は、治療的および／または予防的免疫応答を誘導するために、本明細書に記載される１つ以上のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含み得る。ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節し、免疫応答を増強するために対象に投与され得る。ワクチンの投与は、免疫系が認識し、細胞性、体液性、または細胞性および体液性応答を誘導すると、細胞において発現され、細胞の表面に送達される核酸分子として本明細書に開示されるがん抗原のトランスフェクションであり得る。ワクチンの投与は、本明細書で論じられるワクチンを対象に投与することによって、メソセリンに対して、対象において免疫応答を誘導または誘発するために使用することができる。
上記の薬学的製剤を使用して、卵巣がんなどであるが、これに限定されない、メソセリン発現がんを治療および／または予防するための方法が本明細書に提供される。対象における卵巣がんなどであるが、これに限定されない、メソセリン発現がんの治療および／または予防に上記の薬学的製剤を使用する方法も本明細書に記載される。対象にワクチン接種する方法も本明細書に記載される。本明細書に記載の薬学的製剤を、それを必要する対象に投与する方法も本明細書に記載される。集合的に本明細書に記載の薬学的製剤を使用する治療方法と称される本明細書に記載の方法は、治療的および／または予防的免疫応答を誘導するために、本明細書に記載される１つ以上のワクチンを、それを必要とする対象に投与することを含み得る。ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節し、免疫応答を増強するために対象に投与され得る。ワクチンの投与は、免疫系が認識し、細胞性、体液性、または細胞性および体液性応答を誘導すると、細胞において発現され、細胞の表面に送達される核酸分子として本明細書に開示されるがん抗原のトランスフェクションであり得る。ワクチンの投与は、本明細書で論じられるワクチンを対象に投与することによって、メソセリンに対して、対象において免疫応答を誘導または誘発するために使用することができる。
【0153】
ワクチンは、対象の免疫系の活性を調節するために対象に投与され、それにより免疫応答を増強し得る。いくつかの実施形態において、対象は哺乳動物である。哺乳動物にワクチンを投与し、それによりベクターを哺乳動物の細胞に導入すると、トランスフェクトした細胞が本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上を発現し、分泌する。これらの分泌されたタンパク質または合成抗原は、１つ以上のがん抗原に対して作られた抗体を含み得る免疫応答、および１つ以上のがん抗原に対して特異的にＴ細胞応答を開始する免疫系により異物として認識される。いくつかの例では、本明細書で論じられるワクチンをワクチン接種された哺乳動物は、抗原刺激を受けた（ｐｒｉｍｅｄ）免疫系を有し、本明細書に開示される１つ以上のがん抗原を接種された場合、抗原刺激を受けた免疫系は、体液性、細胞性、または細胞性および体液性の両方の免疫応答によるかにかかわらず、本明細書に開示される後のがん抗原の迅速な除去を可能にする。
【0154】
ＤＮＡのワクチンの投与方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、その両方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0155】
ワクチンを哺乳動物に投与して、哺乳動物において免疫応答を誘発することができる。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、好ましくはヒト、ウシ、またはブタであり得る。ワクチンは同様に、免疫応答を誘発するために、非哺乳動物対象、例えば、ニワトリに投与され得る。
【0156】
ワクチンの用量は、経時的にキログラム（ｋｇ）体重あたり１マイクログラム～１０ｍｇ（構成成分／ｋｇ体重／時間）の活性構成成分であり得、２０マイクログラム～１０ｍｇ構成成分／ｋｇ体重／時間であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のためのワクチン投与数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与であり得る。
【0157】
ワクチンにより免疫応答を生成する方法
ワクチンを使用して、治療的または予防的免疫応答を含む、哺乳動物または非哺乳動物対象において免疫応答を生成することができる。免疫応答は、本明細書に開示される１つ以上のがん抗原に指向される抗体および／またはキラーＴ細胞を生成することができる。そのような抗体およびＴ細胞が単離され得る。
ワクチンを使用して、治療的または予防的免疫応答を含む、哺乳動物または非哺乳動物対象において免疫応答を生成することができる。免疫応答は、本明細書に開示される１つ以上のがん抗原に指向される抗体および／またはキラーＴ細胞を生成することができる。そのような抗体およびＴ細胞が単離され得る。
【0158】
いくつかの実施形態は、本明細書に開示されるがん抗原のうちの１つ以上に対して免疫応答を生成する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態は、上記のメソセリン抗原のうちの１つ以上を発現するがんまたは腫瘍に対して対象に予防的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。いくつかの実施形態は、メソセリンを発現する卵巣がんまたは腫瘍に罹患している対象に治療的にワクチン接種する方法を提供し、その実施形態は、ワクチンを投与することを含む。ワクチンの投与前に本明細書に開示される１つ以上のメソセリン抗原を発現する卵巣がんまたは腫瘍の診断は、日常的に行うことができる。
【0159】
ワクチンによりがんを治療する方法
ワクチンは、卵巣がん、より具体的には上皮卵巣がん、最も具体的には、漿液性卵巣がんなどであるが、これらに限定されない、メソセリンを発現するがんに対して反応性または指向性である哺乳動物において免疫応答を生成または誘発するために使用することができる。誘発された免疫応答は、卵巣がんまたは腫瘍の成長を防止することができる。
ワクチンは、卵巣がん、より具体的には上皮卵巣がん、最も具体的には、漿液性卵巣がんなどであるが、これらに限定されない、メソセリンを発現するがんに対して反応性または指向性である哺乳動物において免疫応答を生成または誘発するために使用することができる。誘発された免疫応答は、卵巣がんまたは腫瘍の成長を防止することができる。
【0160】
誘発された免疫応答は、卵巣がんに罹患している対象におけるがん性または腫瘍細胞の転移を防止および／または低減することができる。したがって、ワクチンは、ワクチンを投与されたがんに罹患している哺乳動物または対象におけるがんまたは腫瘍を治療および／または予防する方法で使用することができる。
【0161】
いくつかの実施形態において、投与されたワクチンは、（１）単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ－１）の産生を遮断し、それにより骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を遅延し、腫瘍成長を抑制する抗体を生成するために、Ｂ細胞応答による液性免疫、（２）腫瘍細胞を攻撃し、死滅させるために、ＣＤ８+などの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の増加、（３）Ｔヘルパー細胞応答の増加、（４）ならびにＩＦＮ－γおよびＴＦＮ－αによる炎症応答の増加、または好ましくは前述のすべてを誘導することにより、クリアランスを媒介するか、または腫瘍細胞の成長を予防することができる。ワクチンは、無腫瘍生存率（ｔｕｍｏｒ ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、および４５％増加させることができる。ワクチンは、免疫化後、腫瘍量を、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％低減することができる。ワクチンは、骨髄由来サプレッサー細胞により分泌されるサイトカインである単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ－１）の増加を予防または遮断することができる。ワクチンは、腫瘍生存を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％で増強することができる。
【0162】
いくつかの実施形態において、免疫応答は、ワクチンを投与された対象において、様々な組織または系（例えば、脳または神経系など）に損傷を与えないか、またはその炎症をもたらさない体液性免疫応答および／または抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を生成することができる。
【0163】
いくつかの実施形態において、ワクチンは、がん性もしくは腫瘍細胞または組織を標的とする抗原特異的免疫応答を確立して、ワクチンを投与された対象において、損傷を与える、または病気もしくは死を引き起こすことなく、１つ以上のがん抗原を発現するがんまたは腫瘍を除去または排除するために、末梢に投与され得る（以下により詳細に説明される）。
【0164】
ワクチンの投与は、対象における細胞性免疫応答を、約５０倍～約６０００倍、約５０倍～約５５００倍、約５０倍～約５０００倍、約５０倍～約４５００倍、約１００倍～約６０００倍、約１５０倍～約６０００倍、約２００倍～約６０００倍、約２５０倍～約６０００倍、または約３００倍～約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態において、ワクチンの投与は、ワクチンを投与されていない対象における細胞性免疫応答と比較して、この対象における細胞性免疫応答を、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍増加させることができる。
【0165】
ワクチンの投与は、対象におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）レベルを、約５０倍～約６０００倍、約５０倍～約５５００倍、約５０倍～約５０００倍、約５０倍～約４５００倍、約１００倍～約６０００倍、約１５０倍～約６０００倍、約２００倍～約６０００倍、約２５０倍～約６０００倍、または約３００倍～約６０００倍増加させることができる。いくつかの実施形態において、ワクチンの投与は、ワクチンを投与されていない対象におけるＩＦＮ－γレベルと比較して、この対象におけるＩＦＮ－γレベルを、約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍増加させることができる。
【0166】
ワクチンの用量は、経時的にキログラム（ｋｇ）体重あたり１マイクログラム～１０ｍｇ（構成成分／ｋｇ体重／時間）の活性構成成分であり得、２０マイクログラム～１０ｍｇ構成成分／ｋｇ体重／時間であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日ごとに投与され得る。有効な治療のためのワクチン投与数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上の投与であり得る。
【0167】
投与経路
ワクチンまたは薬学的組成物は、経口、非経口、舌下、経皮的、直腸に、経粘膜的、局所的、吸入により、頬側投与により、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および／もしくは関節内、またはそれらの組み合わせにより投与され得る。獣医学的使用では、通常の獣医学的実践に従い、組成物を適切に許容される配合剤として投与することができる。獣医は、特定の動物に最も適した投与レジメンおよび投与経路を、容易に決定することができる。ワクチンは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子銃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｇｕｎｓ）」、または電気穿孔法（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波などの他の物理的方法により投与され得る。
ワクチンまたは薬学的組成物は、経口、非経口、舌下、経皮的、直腸に、経粘膜的、局所的、吸入により、頬側投与により、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および／もしくは関節内、またはそれらの組み合わせにより投与され得る。獣医学的使用では、通常の獣医学的実践に従い、組成物を適切に許容される配合剤として投与することができる。獣医は、特定の動物に最も適した投与レジメンおよび投与経路を、容易に決定することができる。ワクチンは、従来の注射器、無針注射装置、「微粒子銃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｇｕｎｓ）」、または電気穿孔法（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波などの他の物理的方法により投与され得る。
【0168】
ワクチンのベクターは、インビボ電気穿孔を伴うまたは伴わないＤＮＡ注射（ＤＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、リポソーム媒介トランスフェクション、ナノ粒子促進トランスフェクション（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、ならびに組換えベクター、例えば、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス随伴ウイルス、および組換えワクシニアを含む、いくつかの周知の技術により哺乳動物に投与され得る。ワクチンの１つ以上のがん抗原は、インビボ電気穿孔法とともにＤＮＡ注射を介して投与され得る。
【0169】
電気穿孔法
ワクチンまたは薬学的組成物は、電気穿孔法により投与され得る。電気穿孔法によるワクチンの投与は、可逆性細孔を細胞膜において形成させるのに有効なエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得る電気穿孔装置を使用して、達成することができ、好ましくは、エネルギーのパルスは、ユーザによって入力される予め調整された電流と類似する定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを備え得る。電気穿孔構成要素は、コントローラ、電流波形発生装置、インピーダンステスター、波形ロガー、入力素子、状態報知素子、通信ポート、メモリー構成要素、電源、および電源スイッチを含む、電気穿孔装置の様々な要素のうちの１つ以上を含み、組み込むことができる。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にするために、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して達成され得る。
ワクチンまたは薬学的組成物は、電気穿孔法により投与され得る。電気穿孔法によるワクチンの投与は、可逆性細孔を細胞膜において形成させるのに有効なエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得る電気穿孔装置を使用して、達成することができ、好ましくは、エネルギーのパルスは、ユーザによって入力される予め調整された電流と類似する定電流である。電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを備え得る。電気穿孔構成要素は、コントローラ、電流波形発生装置、インピーダンステスター、波形ロガー、入力素子、状態報知素子、通信ポート、メモリー構成要素、電源、および電源スイッチを含む、電気穿孔装置の様々な要素のうちの１つ以上を含み、組み込むことができる。電気穿孔は、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にするために、インビボ電気穿孔装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ）（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）を使用して達成され得る。
【0170】
本発明のＤＮＡワクチンの投与を容易にし得る電気穿孔装置および電気穿孔方法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが含まれ、これらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンの投与を容易にするために使用することができる他の電気穿孔装置および電気穿孔方法には、２００６年１０月１７日に出願された米国仮出願第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日に出願された同第６０／９７８，９８２号に対して３５ＵＳＣ１１９（ｅ）による利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願された同時係属中および共有の米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されたものが含まれ、これらのすべては、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0171】
Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを容易にするためのモジュール電極システムおよびそれらの使用を説明している。モジュール電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への伝導性リンクを提供する電気コネクタ、および電源を備え得る。オペレーターは、支持構造に載置される複数の針電極を把持し、それらを身体もしくは植物の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次いで、生体分子を、皮下注射針により選択された組織内に投与する。プログラム可能な定電流パルスコントローラを作動させ、定電流電気パルスを複数の針電極に適用する。適用された定電流電気パルスは、生体分子を、複数の電極間の細胞に導入するのを容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0172】
Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、身体または植物の選択された組織の細胞に生体分子を導入するのを効果的に容易にするために使用することができる電気穿孔装置を説明している。電気穿孔装置は、操作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される動電装置（「ＥＫＤ装置」）を備える。ＥＫＤ装置は、ユーザ制御に基づいた一列の電極とパルスパラメータのとの間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを作り出し、電流波形データの保存および取得を可能にする。電気穿孔装置は、一連の針電極を有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注射チャネル、および着脱可能なガイドディスクも備える。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全内容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【0173】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に説明される電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく他の組織または臓器にも深く浸透させるのに適している。電極アレイの形態によって、注射針が、標的臓器にも完全に挿入され、電極によって予め描かれた領域の標的組織に垂直に注射投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３号に説明される電極は、好ましくは２０ｍｍ長および２１ゲージである。
【0174】
加えて、電気穿孔装置およびその使用を組み込むいくつかの実施形態において企図される、以下の特許：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された同第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日に発行された同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号に記載される電気穿孔装置が存在する。さらに、様々な装置のいずれかを使用したＤＮＡの投与に関係する２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡを注射する方法が注目された２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号に提供される主題を網羅する特許が、本明細書で企図される。上記の特許は、その全体が参照により組み込まれる。
【0175】
ワクチンを調製する方法
本明細書に論じられるＤＮＡプラスミドを調製するための方法が本明細書において提供される。哺乳動物発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップ後、当該技術分野において既知の方法を使用して、ＤＮＡプラスミドを大規模な発酵タンクにおいて細胞培養物に接種するために使用することができる。
本明細書に論じられるＤＮＡプラスミドを調製するための方法が本明細書において提供される。哺乳動物発現プラスミドへの最終的なサブクローニングステップ後、当該技術分野において既知の方法を使用して、ＤＮＡプラスミドを大規模な発酵タンクにおいて細胞培養物に接種するために使用することができる。
【0176】
本発明の電気穿孔装置で使用するためのＤＮＡプラスミドは、既知の装置および技術の組み合わせを使用して製剤化または製造することができるが、好ましくは２００７年５月２３日に出願された米国公開出願第２００９／０００４７１６号に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。いくつかの例では、これらの研究に使用されたＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化され得る。製造技術は、２００７年７月３日に発行された許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般的に既知である様々な装置およびプロトコルも含むか、またはそれらも組み込む。上に言及される出願および特許である、米国第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それぞれ、それらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0177】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって図示される多くの態様を有する。
【実施例】
【0178】
本発明は、以下の実施例においてさらに図示される。これらの実施形態は、本発明の好ましい実施形態を示すが、単に図示のために示されることを理解するべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を様々な使用および条件に適応させることができる。したがって、本明細書に示され記載されるものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正も、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【0179】
実施例１：コンセンサスメソセリン配列の生成
３つのメソセリンバリアントが、ＧｅｎＢａｎｋに報告されている。バリアント１および２は、ヌクレオチドレベルで９８％同一であり、バリアント３は、ＧＰＩアンカー領域を分裂させる選択的スプライスによるＣ末端を有する部分配列である。３つの転写バリアントはすべて、ヒトがん細胞によって発現されることが報告されている。配列分析に基づいて、バリアント１を標的とするワクチンはまた、バリアント２および３における配列の大部分を標的にし得る。加えて、バリアント１は、卵巣腫瘍に発現した主要転写物である。したがって、バリアント１は、ワクチン標的物として選択された。
３つのメソセリンバリアントが、ＧｅｎＢａｎｋに報告されている。バリアント１および２は、ヌクレオチドレベルで９８％同一であり、バリアント３は、ＧＰＩアンカー領域を分裂させる選択的スプライスによるＣ末端を有する部分配列である。３つの転写バリアントはすべて、ヒトがん細胞によって発現されることが報告されている。配列分析に基づいて、バリアント１を標的とするワクチンはまた、バリアント２および３における配列の大部分を標的にし得る。加えて、バリアント１は、卵巣腫瘍に発現した主要転写物である。したがって、バリアント１は、ワクチン標的物として選択された。
【0180】
ヒトコンセンサスメソセリンを生成するために、ヒト１４個のメソセリン配列が、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）から集められた。選択されたメソセリン配列のＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ＮＲ＿００５８１４．２、ＢＡＡ０８４１９．１、ＡＡＨ０９２７２．１、ＡＡＶ８７５３０．１、ＡＡＨ０３５１２．１、ＸＰ＿００８９５９１８２．１、ＡＡＣ５０３４８．１、ＸＰ＿００９４２８３０９．１、ＸＰ＿００７９７８９６９．１、ＸＰ＿０１１８２２２９９．１、ＸＰ＿０１１８１７８４１．１、ＸＰ＿０１１８２２２９８．１、ＣＲ＿００９１９３８８０．１、およびＸＰ＿０１１８１７８４３．１である。
【0181】
コンセンサス配列は、ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（バージョン１３．０．０．３５７）を使用して生成された。ＧｅｎＢａｎｋからのメソセリン配列をＭｅｇＡｌｉｇｎに取り込み、ＣｌｕｓｔａｌＷ多重配列アライメントプログラムを使用してアライメントした。得られたメソセリンコンセンサス配列（配列番号１）は、天然ヒトメソセリンと９５．８％の相同性を共有する。
【0182】
実施例２：メソセリンの機能を無効にするための変異の導入
得られたコンセンサスメソセリンタンパク質の潜在的な生物学的機能を無効にするために、１つの変異を導入して、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５結合を無効にした。加えて、２つの変異を導入して、ＧＰＩ付着を破壊した。これらの変異の導入の根拠を以下に記載した。
得られたコンセンサスメソセリンタンパク質の潜在的な生物学的機能を無効にするために、１つの変異を導入して、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５結合を無効にした。加えて、２つの変異を導入して、ＧＰＩ付着を破壊した。これらの変異の導入の根拠を以下に記載した。
【0183】
ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５結合変異
欠失突然変異生成を使用して、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５のメソセリンにおける結合部位を同定した（図１）。図１に示すように、メソセリン前駆体（７１ｋＤａ）は、３０ｋＤａの巨核球増強因子（ＭＰＦ；残基Ｓｅｒ３４－Ａｒｇ２８６）およびＧｌｕ２９６から始まる４１ｋＤａのＧＰＩアンカー型膜結合成熟メソセリン（薄灰色）の２つの生成物に切断される。タンパク質分解的切断領域（斜線した灰色）は、Ａｒｇ２９５でフリン切断部位を含み、他のプロテアーゼ切断部位は、Ａｒｇ２８６でトリプシン切断部位を含む。メソセリンにおける４つの予測されたＮ結合型グリカン（黒色ロリポップ；Ａｓｎ５７、Ａｓｎ３８８、Ａｓｎ４８８、およびＡｓｎ５１５）を示す。欠失変異（領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＡＢ、ＩＢＣ、ＩＡ、ＩＢ、およびＩＣ）を、ウサギＦｃ融合タンパク質として生成して、ＣＡ１２５結合ドメインのメソセリンを連続的に絞り込んだ。
欠失突然変異生成を使用して、ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５のメソセリンにおける結合部位を同定した（図１）。図１に示すように、メソセリン前駆体（７１ｋＤａ）は、３０ｋＤａの巨核球増強因子（ＭＰＦ；残基Ｓｅｒ３４－Ａｒｇ２８６）およびＧｌｕ２９６から始まる４１ｋＤａのＧＰＩアンカー型膜結合成熟メソセリン（薄灰色）の２つの生成物に切断される。タンパク質分解的切断領域（斜線した灰色）は、Ａｒｇ２９５でフリン切断部位を含み、他のプロテアーゼ切断部位は、Ａｒｇ２８６でトリプシン切断部位を含む。メソセリンにおける４つの予測されたＮ結合型グリカン（黒色ロリポップ；Ａｓｎ５７、Ａｓｎ３８８、Ａｓｎ４８８、およびＡｓｎ５１５）を示す。欠失変異（領域Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＡＢ、ＩＢＣ、ＩＡ、ＩＢ、およびＩＣ）を、ウサギＦｃ融合タンパク質として生成して、ＣＡ１２５結合ドメインのメソセリンを連続的に絞り込んだ。
【0184】
Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００９ Ｆｅｂ ６；２８４（６）：３７３９－４９の図５に示すように、アラニンを有する位置３１８（Ｙ３１８Ａ）でのチロシンの置換は、ＣＡ１２５との相互作用を完全に破壊した。Ｇｌｕ３２４（Ｅ３２４Ａ；ＫＤ４２．４ｎＭ）およびＴｒｐ３２１（Ｗ３２１Ａ；ＫＤ１９．５ｎＭ）でのアラニン変異は、ＣＡ１２５へのメソセリンの結合を減少させた。Ｈｉｓ３５４（Ｈ３５４Ａ）でのアラニン変異は、メソセリン－ＣＡ１２５の相互作用（ＫＤ２．７１ｎＭ）を変化させなかった。
【0185】
Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００９ Ｆｅｂ ６；２８４（６）：３７３９－４９の図４に示すように、領域ＩＡＢ（２９６～３５９）内のアラニン変異のウエスタンブロットは、異なる結合を示す。Ｔｙｒ３１８（Ｙ３１８Ａ）およびＧｌｕ３２４（Ｅ３２４Ａ）でのアラニン変異は、ＣＡ１２５へのメソセリンの結合を無効にした。Ｔｒｐ３２１（Ｗ３２１Ａ）でのアラニン変異は、ＣＡ１２５へのメソセリンの結合を部分的に減少した。Ｈｉｓ３５４でのアラニン変異は、メソセリン－ＣＡ１２５の相互作用を変化させなかった。
【0186】
最終的に、Ｋａｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００９ Ｆｅｂ ６；２８４（６）：３７３９－４９の図６に示すように、蛍光強度（相乗平均）は、ＣＡ１２５の結合を定量的に測定するために使用した。ＣＡ１２５への完全長の成熟形態のメソセリン（完全）の結合は、１００％の結合として判定された。領域Ｉ（２９６～３９０）、領域ＩＡＢ（２９６～３５９）、および列挙された任意の他の断片または変異よりも著しく強力なＣＡ１２５に結合したＩＡＢのＨ３５４Ａ変異（*、ｐ＿０．０５）。Ｙ３１８Ａ変異は、完全長の成熟形態のメソセリンと比較して、結合を大幅に減少した。これらの所見に基づいて、Ｙ３１８Ａ変異を、最終的な合成コンセンサスメソセリン配列に導入した。
【0187】
ＧＰＩ付着部位
ＧＰＩアンカリングシグナルは、親水性スペーサー領域によってＧＰＩ付着部位（ωサイト）から分離される疎水性領域からなる（図２）。付着部位は、短い側鎖を有する３つの隣接するアミノ酸の１番目である。通常構造化されていない短いスペーサー配列が続き、次いで、カルボキシ末端、疎水性シグナリング配列でなければならない。Ｍａｙｏｒ，Ｓ．＆ Ｒｉｅｚｍａｎ，Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ５（２００４）。メソセリンの共同部位は、セリンからトレオニンに変異した。メソセリンのω＋２は、トレオニンからバリンに変異した。
表１に示すように、合成コンセンサスメソセリンタンパク質配列は、ヒト天然メソセリンと９５．２％の同一性を共有する。
ＧＰＩアンカリングシグナルは、親水性スペーサー領域によってＧＰＩ付着部位（ωサイト）から分離される疎水性領域からなる（図２）。付着部位は、短い側鎖を有する３つの隣接するアミノ酸の１番目である。通常構造化されていない短いスペーサー配列が続き、次いで、カルボキシ末端、疎水性シグナリング配列でなければならない。Ｍａｙｏｒ，Ｓ．＆ Ｒｉｅｚｍａｎ，Ｈ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ５（２００４）。メソセリンの共同部位は、セリンからトレオニンに変異した。メソセリンのω＋２は、トレオニンからバリンに変異した。
表１に示すように、合成コンセンサスメソセリンタンパク質配列は、ヒト天然メソセリンと９５．２％の同一性を共有する。
【表1】
【0188】
実施例３：合成コンセンサスメソセリン構築物の特徴
合成コンセンサスメソセリンＤＮＡ配列が得られたら、より高いレベルの発現を有するために、上流のコザック配列およびＩｇＥリーダー配列をＮ末端に付加した。Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ １８４，８０９－８１６（２００１）。さらに、この遺伝子のコドン使用を、ホモサピエンス遺伝子のコドンバイアスに適合させた。Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，１４９７－１５０３（１９９８）、Ｄｅｍｌ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，１０９９１－１１００１（２００１）。ＧＣ含有量が非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）領域、ならびに内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、およびリボソームエントリー部位などのシス作用性配列モチーフを避けるために、ＲＮＡ最適化も行った。Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１４，１３４－１４６（２００３）、Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１４，１３４－１４６（２００３）。
合成コンセンサスメソセリンＤＮＡ配列が得られたら、より高いレベルの発現を有するために、上流のコザック配列およびＩｇＥリーダー配列をＮ末端に付加した。Ｙａｎｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ １８４，８０９－８１６（２００１）。さらに、この遺伝子のコドン使用を、ホモサピエンス遺伝子のコドンバイアスに適合させた。Ａｎｄｒｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２，１４９７－１５０３（１９９８）、Ｄｅｍｌ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５，１０９９１－１１００１（２００１）。ＧＣ含有量が非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）領域、ならびに内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、およびリボソームエントリー部位などのシス作用性配列モチーフを避けるために、ＲＮＡ最適化も行った。Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１４，１３４－１４６（２００３）、Ｍｕｔｈｕｍａｎｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３１４，１３４－１４６（２００３）。
【0189】
合成コンセンサスメソセリン構築物の略図を図３に示す。アスタリスク（*）は、ＭＵＣ１６結合およびＧＰＩ結合を無効にするための変異を示す。合成コンセンサスメソセリンにおけるヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸（配列番号２）は、それぞれ、表１６および表１７に示す。配列番号２の要素および対応するアミノ酸位置の注釈を、表２に提供する。
【表2】
【0190】
合成コンセンサス設計プロセスの可能性のあるタンパク質構造効果をよりよく理解するために、ＭＰＦおよびメソセリンの分子前駆体の比較モデルを生成した。複数の二次構造要素を使用して、モデルをアライメントし、生成した。予測されたグリコシル化部位を、モデルの表面上に正確に配向する。モデルのメソセリン部分は、Ｓａｔｈｙａｎａｒａｙａｎａらによって行われた研究から補外され、一連のＡＲＭ反復としてモデル化された。Ｓａｔｈｙａｎａｒａｙａｎａ，Ｂ．Ｋ．，Ｈａｈｎ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ９，１（２００９）。Ｓａｔｈｙａｎａｒａｙａｎａの言及は、ジスルフィド結合の位置に対処するように思われなかった。この特徴は、改善されたモデルにおいて対処され、局所的に正確に配向する。加えて、潜在的なＮ結合型糖化部位は、表面にアクセス可能である。
【0191】
合成コンセンサスメソセリンの特徴を表３に要約する。
【表3】
【0192】
実施例４：プラスミド構築物および構造
ベクター骨格は、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）の制御下にあるｐＧＸ０００１、２９９８ｂｐの改変されたｐＶＡＸ１発現ベクターである。元のｐＶＡＸ１は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た。ｐＧＸ０００１骨格は、産生目的のカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含む。これらの要素は、真核細胞において機能的ではない。改変された発現ベクターｐＶＡＸ１（ｐＧＸ０００１）のマップおよび説明を、図４に示す。
ベクター骨格は、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター（ｈＣＭＶプロモーター）の制御下にあるｐＧＸ０００１、２９９８ｂｐの改変されたｐＶＡＸ１発現ベクターである。元のｐＶＡＸ１は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た。ｐＧＸ０００１骨格は、産生目的のカナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）およびプラスミド複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉ）を含む。これらの要素は、真核細胞において機能的ではない。改変された発現ベクターｐＶＡＸ１（ｐＧＸ０００１）のマップおよび説明を、図４に示す。
【0193】
改変をｐＶＡＸ１に導入して、ｐＧＸ０００１を作製した。これらの改変は図４に列挙されており、プラスミド増幅、ならびに抗原の転写および翻訳に関して問題は検出されていない。これまでのところ、ｐＧＸ０００１を骨格として使用したｐＧＸ０００１の配列内にさらなる変更は観察されていない。塩基対２、３、および４は、ＣＭＶプロモーターの上流の骨格においてＡＣＴからＣＴＧに変更される。
【表4】
【0194】
合成された合成コンセンサスメソセリンは、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで消化され、サイトメガロウイルス最初期プロモーターの転写制御下に配置された発現カセットとともにｐＧＸ０００１にクローニングされた。得られたプラスミドはｐＧＸ１４３０と名付けられた。完全長配列決定を行い、次いで、２人の分析専門家によって分析され、正しいことを確認した。ｐＧＸ１４３０の概略図を、図５に表す。
【0195】
実施例５：インビトロ抗原発現
ｐＧＸ１４３０による抗原タンパク質の発現を、ウエスタンブロッティングにより確認した。１０％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭ培地で維持されたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１３６）に、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔｉｎ ８（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用してｐＧＸ１４３０またはｐＧＸ０００１（６μｇ／１０ｃｍ２ディッシュ）をトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して細胞を溶解し、細胞溶解物を収集した。総タンパク質濃度を決定するためのＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）後、１５μｇの細胞溶解物を、４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で電気穿孔し、市販の抗メソセリン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙクローンＤ４Ｘ７Ｍ）を使用して検出を行い、次いで、ＥＣＬウエスタンブロット分析システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃ｓｃ－２００４）で可視化した。負荷対照として、抗β－アクチンモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、クローン、Ｃ４）を使用して、ブロットのアクチン発現を再プローブした。
ｐＧＸ１４３０による抗原タンパク質の発現を、ウエスタンブロッティングにより確認した。１０％ＦＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含むＤＭＥＭ培地で維持されたヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１３６）に、Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔｉｎ ８（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を使用してｐＧＸ１４３０またはｐＧＸ０００１（６μｇ／１０ｃｍ２ディッシュ）をトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して細胞を溶解し、細胞溶解物を収集した。総タンパク質濃度を決定するためのＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）後、１５μｇの細胞溶解物を、４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で電気穿孔し、市販の抗メソセリン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙクローンＤ４Ｘ７Ｍ）を使用して検出を行い、次いで、ＥＣＬウエスタンブロット分析システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＃ｓｃ－２００４）で可視化した。負荷対照として、抗β－アクチンモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ、クローン、Ｃ４）を使用して、ブロットのアクチン発現を再プローブした。
【0196】
ヒトメソセリン前駆体は、４６～４８ｋＤａで切断したグリコシル化形態を有する７０ｋＤａであるが、一方、合成コンセンサスメソセリン前駆体は、３５～３７ｋＤａで切断したグリコシル化形態を有する６４．２８ｋＤａである。図６に示すように、ｐＧＸ１４３０に対して予想分子量のタンパク質バンドを、検出した（６４．２８ｋＤ）。ｐＧＸ０００１レーンにおいて、タンパク質バンドは検出されなかった。同様の強度の抗β－アクチンバンドが検出され、等量のタンパク質が各レーンにローディングされたことを示す。
【0197】
実施例６：合成コンセンサスメソセリンワクチン構築物の免疫原性
動物および免疫化
８週齢の雌のＣＢ６Ｆ１マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
すべての動物を、ＢＴＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の温度制御された光サイクル施設に収容した。動物の世話は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｐｒｏｐｏｓａｌ（ＡＣＵＰ）（ＢＴＳ ＡＣＵＰ ＃１５－０９１）のガイドラインに従って実施した。マウスを表５に示すように５つの群に分けた。
動物および免疫化
８週齢の雌のＣＢ６Ｆ１マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。
すべての動物を、ＢＴＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の温度制御された光サイクル施設に収容した。動物の世話は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｐｒｏｐｏｓａｌ（ＡＣＵＰ）（ＢＴＳ ＡＣＵＰ ＃１５－０９１）のガイドラインに従って実施した。マウスを表５に示すように５つの群に分けた。
【表5】
【0198】
免疫した群のマウスを、ＳＯＰ Ｒ２０－００３１４７ ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）３Ｐ Ｍｏｕｓｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔに従ってｐＧＸ０００１またはｐＧＸ１４３０の示された用量でワクチン接種した。簡単に言えば、示される用量が筋肉内注射により３０μＬの注射量で前脛骨筋に送達されるように、プラスミドを減菌注射用水（ＶｅｔＯｎｅ）に製剤化した。各筋肉内注射の直後に、３Ｐアレイを有するＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）２０００ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用する電気穿孔（ＥＰ）が続いた。装置は、５２ｍｓパルス幅の２つの０．１Ａｍｐパルスを１秒遅れの間隔で送達するように構成された。マウスは、３週間間隔で３回免疫化を受けた。最後の免疫から３週間後にマウスを殺処分し、細胞免疫の読み取りのために脾臓を採取した。他の組織は収集されなかった。
【0199】
脾臓リンパ球の単離
脾細胞を無菌で単離し、５ｍＬのＲ１０培地（１０％のウシ胎児血清および１％の抗生物質－抗真菌剤を添加したＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０）に入れた。Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ機器（Ｓｅｗａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して脾臓を機械的に破砕することにより脾細胞を単離し、得られた生成物を、４０μｍセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を使用して濾過した。得られた生成物を遠心分離し、ＲＢＣの溶解のためにペレットをＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）で５分間処理した。次いで、脾細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、次いでＲ１０培地に再懸濁し、さらなる分析のために直ちに使用した。
ＩＦＮγエリスポット
脾細胞を無菌で単離し、５ｍＬのＲ１０培地（１０％のウシ胎児血清および１％の抗生物質－抗真菌剤を添加したＲｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０）に入れた。Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ機器（Ｓｅｗａｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して脾臓を機械的に破砕することにより脾細胞を単離し、得られた生成物を、４０μｍセルストレーナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）を使用して濾過した。得られた生成物を遠心分離し、ＲＢＣの溶解のためにペレットをＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｏｎｚａ）で５分間処理した。次いで、脾細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、次いでＲ１０培地に再懸濁し、さらなる分析のために直ちに使用した。
ＩＦＮγエリスポット
【0200】
マウスＩＦＮγエリスポットアッセイ（ＭａｂＴｅｃｈ）を行って、抗原特異的な細胞応答を評価した。抗マウスＩＦＮγ抗体で予めコーティングされた９６ウェルプレートをＰＢＳで洗浄し、完全培地（１０％ＦＢＳおよび抗生物質を添加したＲＰＭＩ１６４０）で、室温で２時間遮断した。脾臓リンパ球を、Ｒ１０培地に再懸濁した（次いで、２×１０5細胞／ウェルの投入細胞数で３つ組で添加した。ペプチドのセットが合成され（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、各々が合成コンセンサスメソセリンタンパク質配列全体を表す１１個のアミノ酸が重複する１５のアミノ酸残基を含む。ペプチドのこれらのセットをＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、約２μｇ／ｍｌのペプチドの濃度で２つのペプチドプールにプールした。ペプチドプールは、合成コンセンサスメソセリン抗原タンパク質に対応するペプチドを含んだ。５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ）を陽性対照として使用し、完全培養培地を陰性対照として使用した。プレートを、５％ＣＯ2大気のインキュベータ内で、３７℃で１８時間インキュベートした。次いで、ビオチン化抗マウスＩＦＮγ検出抗体（ＭａｂＴｅｃｈ）を添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン－ＡＬＰ抗体（ＭａｂＴｅｃｈ）を添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。
【0201】
スポット検出は、キットの製造元の指示（ＭａｂＴｅｃｈ）に従って完了した。プレートのスポットは、自動エリスポットリーダー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して計数した。スポット形成単位（ＳＦＵ）の平均数は、データ表示用に１×１０6脾臓細胞に調整した。ＩＦＮγエリスポットによる抗原特異的応答を、培地のみの対照におけるＳＦＵよりも大きい１×１０6脾臓細胞あたりのＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）の数として報告する。
【0202】
合成コンセンサスメソセリン構築物の免疫原性を、ＩＦＮγエリスポットおよびフローサイトメトリー（ｎ＝８／群）によって４つの用量（１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、および５０μｇ）で評価した。陰性対照（ｎ＝４／群）として空のプラスミド骨格（ｐＧＸ０００１）を、マウスに免疫した。合成コンセンサスメソセリン（ｐＧＸ１４３０）によるワクチン接種は、陰性対照のワクチン接種されたマウスと比較して、細胞性免疫応答を誘導した。エリスポットによって決定した合成コンセンサスメソセリン特異的ＩＦＮγ産生の大きさは、１０および２０μｇの用量で用量非依存性であり（図７Ａおよび図７Ｂ）、３０および５０μｇの用量で同様の最大応答を達成した。具体的には、合成コンセンサスメソセリンＩＦＮγ ＳＦＵは、１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、および５０μｇで、それぞれ、１３４５±１２９０、２２４１±１７２１、２２４２±１９３２、および２００４±６７４であった。合成コンセンサスメソセリンＩＦＮγ応答は、ｐＧＸ１４３０の１０μｇ（ｐ＝０．００４）、２０μｇ（ｐ＝０．００４）、３０μｇ（ｐ＝０．００４）、および５０μｇ（ｐ＝０．００４）の用量でナイーブよりも有意に高かった。ＩＦＮγ応答を表６に要約する。
【表6】
【0203】
フローサイトメトリー
合成コンセンサスメソセリンにより誘導された細胞性免疫応答は、フローサイトメトリーによりさらに特徴付けされた。ワクチン接種したおよび未処理マウスからの２×１０6脾臓細胞を、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、モネンシン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で６時間、合成コンセンサスメソセリンペプチドで単離した直後に刺激した。ペプチドで刺激した後、脾臓細胞を遠沈し、マウスＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液の１ウェルあたり２０μＬに再懸濁した。Ｆｃ Ｂｌｏｃｋを、ＰＢＳで１：４０の初期希釈で使用し、４℃で５分間インキュベートした。
合成コンセンサスメソセリンにより誘導された細胞性免疫応答は、フローサイトメトリーによりさらに特徴付けされた。ワクチン接種したおよび未処理マウスからの２×１０6脾臓細胞を、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、モネンシン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＦＩＴＣ抗マウスＣＤ１０７ａ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で６時間、合成コンセンサスメソセリンペプチドで単離した直後に刺激した。ペプチドで刺激した後、脾臓細胞を遠沈し、マウスＢＤ Ｆｃ Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）溶液の１ウェルあたり２０μＬに再懸濁した。Ｆｃ Ｂｌｏｃｋを、ＰＢＳで１：４０の初期希釈で使用し、４℃で５分間インキュベートした。
【0204】
インキュベーション後、残りの細胞外抗体（ＰＢＳ中）を１ウェルあたり３０μＬ添加し、４℃で３０分間インキュベートする。細胞外株の添加により、各ウェルの最終容積は５０μＬであり、１：１００の最終希釈でのＦｃ Ｂｌｏｃｋおよびそれらの適切な作業希釈での細胞外抗体からなる。次いで、細胞を生存能色素（Ｖｉｖｉｄ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）、ならびにＡＰＣ－Ｃｙ７抗マウスＣＤ３ｅ、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５抗マウスＣＤ４、およびＡＰＣ抗マウスＣＤ８ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の細胞外抗体で染色した。その後、細胞内サイトカインをＢＶ６０５抗マウスＩＦＮγ、ＡＰＣ－Ｒ７００抗マウスＩＬ－２、およびＰＥ抗マウスＴＮＦ－α（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の抗体で染色した。
【0205】
ＩＣＳデータを、１０色ＦＡＣＳ ＣＡＮＴＯ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析を完了した。フローサイトメトリーのゲーティング戦略を図８に示す。フローサイトメトリーにより抗原特異的と呼ばれる細胞に関して、報告されたパラメーターの頻度は、培地のみの対照の頻度を超えなければならない。抗原特異的ＣＤ１０７ａを産生すると同定される細胞に関して、細胞は、ブーリアンゲーティングによって同定される、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－２および／またはＴＮＦαの抗原特異的産生が陽性であると同定されなければならない。
【0206】
合成コンセンサスメソセリンは、ＣＤ４+Ｔ細胞区画での応答と比較して、ＣＤ８+Ｔ細胞区画でより強力な応答を誘発した（図９Ａ～９Ｄ）。合成コンセンサスメソセリンは、１０μｇ（０．２９％±０．２０％）（ｐ＜０．００４）、２０μｇ（０．５０％±０．３０％）（ｐ＜０．００４）、３０μｇ（０．４２％±０．２４％）（ｐ＜０．００４）、および５０μｇ（０．３８％±０．１７％）（ｐ＜０．００４）の用量群で未処理（０．０９％±０．０７％）よりもはるかに強力な抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答の頻度を誘導した（図９Ａ）。合成コンセンサスメソセリン特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答は、１０および２０μｇの用量で用量依存的であったが、３０および５０μｇの用量では用量依存的でなく、主に、ＩＦＮγ－ＩＬ－２－ＴＮＦα＋、ＩＦＮγ＋ＩＬ－２－ＴＮＦα－、ＩＦＮγ－ＩＬ－２＋ＴＮＦα＋、またはＩＦＮγ＋ＩＬ－２＋ＴＮＦα＋産生ＣＤ４+Ｔ細胞で構成された（図９Ｃ）。抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の頻度は、表７にさらに詳述される。
【表7】
【0207】
合成コンセンサスメソセリンによって誘導された抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、すべての用量群において対照よりも有意に増加した（図９Ｂ）。具体的には、１０μｇ（０．６４％±０．４２％）（ｐ＝０．０１６）、２０μｇ（０．７０％±０．４８％）（ｐ＝０．０２８）、３０μｇ（０．９７％±０．９６％）（ｐ＝０．００８）、および５０μｇ（１．００％±０．２２％）（ｐ＝０．００４）のｐＧＸ１４３０で免疫した群における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ応答の頻度は、未処理（０．１５％±０．０４％）と比較してはるかに高い用量ではるかに強力であった。合成コンセンサスメソセリン特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答は、用量とともに増加し、主に、ＩＦＮγ＋ＩＬ－２－ＴＮＦα産生ＣＤ８+Ｔ細胞で構成された（図９Ｄ）。抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度は、表８にさらに詳述される。
【表8】
【0208】
すべての用量の合成コンセンサスメソセリンは、未処理（０．０１％±０．０１％）よりも高い頻度でＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞を誘導した。具体的には、抗原特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．００４）、２０μｇ（ｐ＝０．００４）、３０μｇ（ｐ＝０．０１６）、および５０μｇ（ｐ＝０．００４）の用量群において、それぞれ、０．１０％±０．１１％、０．２０％±０．１３％、０．１６％±０．１３％、および０．１５％±０．１１％であった（図１０Ａ）。合成コンセンサスメソセリン特異的ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、用量群間にわたり類似しており、主に、ＩＦＮγ+ＩＬ－２+ＴＮＦα+、ＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα+、ＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-細胞で構成された（図１０Ｃ）。細胞溶解能を有する抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の頻度は、表９にさらに詳述される。
【表9】
【0209】
抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の大きさと同様に、合成コンセンサスメソセリンは、未処理（０．０５％±０．０２％）と比較して、すべての群間でＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度に有意な変化を誘導した（図１０Ｃ）。具体的には、抗原特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度は、１０μｇ（ｐ＝０．００８）、２０μｇ（ｐ＝０．０２８）、３０μｇ（ｐ＝０．００４）、および５０μｇ（ｐ＝０．００４）の用量群において、それぞれ、０．２７％±０．２２％、０．５７％±０．４３％、０．８３％±０．８５％、および０．９０％±０．２４％であった（図１０Ａ）。合成コンセンサスメソセリン特異的ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞のサイトカインプロファイルは、用量群にわたり類似しており、大部分がＩＦＮγ-ＩＬ－２-ＴＮＦα+およびＩＦＮγ+ＩＬ－２+ＴＮＦα+で構成された１０μｇの用量群を除いて、大部分は、ＩＦＮγ+ＩＬ－２-ＴＮＦα-で構成された（図１０Ｄ）。細胞溶解能を有する抗原特異的ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度を、表１０にさらに詳述される。
【表10】
【0210】
全体として、報告したデータのいずれも、免疫群間の応答に有意差はなかった（すなわち、１０μｇは５０μｇよりも有意に低くなかったなど）。
統計分析
統計分析
【0211】
ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２２（ＩＢＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して統計分析を完了した。多くの比較のためのデータは、正規分布されなかった。この理由のため、マンホイットニーＵ検定がすべての分析のために使用され、多くの比較のために事後ボンフェローニ補正を用いた。統計的有意性は、ｐ≦０．０１３（０．０５／４つの比較＝０．０１２５）であると仮定する。
【0212】
結論
合成コンセンサスメソセリンは、未処理と比較して、抗原特異的ＣＤ４+、ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+、およびＣＤ８+、ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度を増加させたが、応答の大きさは、ＣＤ８+Ｔ細胞区画ではるかに強固であった。
合成コンセンサスメソセリンは、未処理と比較して、抗原特異的ＣＤ４+、ＣＤ４+ＣＤ１０７ａ+、およびＣＤ８+、ＣＤ８+ＣＤ１０７ａ+Ｔ細胞の頻度を増加させたが、応答の大きさは、ＣＤ８+Ｔ細胞区画ではるかに強固であった。
【0213】
実施例７：合成コンセンサスメソセリン一価非ヒト霊長類研究
合成コンセンサスメソセリンを単独で低および高用量のＩＬ－１２と組み合わせた可能性を調査するために、固有のＮＨＰ ＩＤ番号によってそれぞれ同定された１８匹の成熟アカゲザルを、６匹ずつ３つの群に分け、以下のとおりにｐＧＸ１４３０を免疫した。６匹の動物に、３．０ｍｇのｐＧＸ１４３０（群１）を免疫し、アジュバントとして３．０ｍｇのｐＧＸ１４３０＋０．０４ｍｇのｐＧＸ６００６（ｏｐｔ ｒｈ ＩＬ－１２）を６匹に（群２）、アジュバントとして３．０ｍｇのｐＧＸ１４３０＋０．２０ｍｇのｐＧＸ６００６（ｏｐｔ ｒｈ ＩＬ－１２）を６匹に（群３）、１．０ｍＬの注射量でＳＳＣ中に製剤化した。免疫注射を、０、４、８、および１２週目に投与し、任意選択で５回目の免疫化を行った。したがって、すべての免疫化は、対側肢に交互に行う際に、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）２０００ ５Ｐ－ＩＭ ＥＰ装置を用いて滅菌ＷＦＩ中に製剤化された１ｍｌの注射量でＩＭ（筋肉注射）を行った。ＥＰ条件は、以下のとおりであった。ＯｐＢｌｏｃｋ ００７０－ＩＭ、０．５Ａｍｐ、３パルス、５２ｍｓｅｃ、パルス間隔０．２秒。メソセリン免疫原性を、２、６、１０、および１４週目に評価した。
合成コンセンサスメソセリンを単独で低および高用量のＩＬ－１２と組み合わせた可能性を調査するために、固有のＮＨＰ ＩＤ番号によってそれぞれ同定された１８匹の成熟アカゲザルを、６匹ずつ３つの群に分け、以下のとおりにｐＧＸ１４３０を免疫した。６匹の動物に、３．０ｍｇのｐＧＸ１４３０（群１）を免疫し、アジュバントとして３．０ｍｇのｐＧＸ１４３０＋０．０４ｍｇのｐＧＸ６００６（ｏｐｔ ｒｈ ＩＬ－１２）を６匹に（群２）、アジュバントとして３．０ｍｇのｐＧＸ１４３０＋０．２０ｍｇのｐＧＸ６００６（ｏｐｔ ｒｈ ＩＬ－１２）を６匹に（群３）、１．０ｍＬの注射量でＳＳＣ中に製剤化した。免疫注射を、０、４、８、および１２週目に投与し、任意選択で５回目の免疫化を行った。したがって、すべての免疫化は、対側肢に交互に行う際に、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）２０００ ５Ｐ－ＩＭ ＥＰ装置を用いて滅菌ＷＦＩ中に製剤化された１ｍｌの注射量でＩＭ（筋肉注射）を行った。ＥＰ条件は、以下のとおりであった。ＯｐＢｌｏｃｋ ００７０－ＩＭ、０．５Ａｍｐ、３パルス、５２ｍｓｅｃ、パルス間隔０．２秒。メソセリン免疫原性を、２、６、１０、および１４週目に評価した。
【0214】
群１～３における動物同定、起源、性別、および体重を、表１１に提供する。
【表11】
【0215】
ＰＢＭＣ単離
非ヒト霊長類全血を、抗凝固剤およびゲルバリアを含むクエン酸ナトリウム細胞調製チューブ（ＣＰＴ ＣＰＴ’ｓ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に収集した。翌日配達便による発送前に、ＰＭＢＣを分離し、濃縮するために、収集直後（２時間以内）に、全血を回転させる。赤血球および好中球は、チューブの底にペレット化し、ゲルバリアによって適所に置く。血漿およびリンパ球は、ゲルバリア上に残る。各ＣＰＴは、約８ｍＬの血液を保持することができ、室温で出荷される。Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏにある前臨床研究室に到着したらすぐに、回転させたＣＰＴチューブを、ＰＢＭＣ単離用に処理した。塩化アンモニウムカリウム（ＡＣＫ）緩衝液を用いた赤血球溶解後、生存細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭ自動細胞計数器を用いて計数し、完全培養培地（ｍｅｄｉｕｍ）培地（ｍｅｄｉａ）（１０％ＦＢＳ、抗生物質、およびβメルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０）中で再懸濁した。この報告書に記載されるアッセイの完了時に、残りのＰＢＭＣを、冷凍し、冷結保存バイアル中の凍結培地（Ｓｅｒａｄｉｇｍからの９０％ＦＢＳ中のＳｉｇｍａからの１０％ＤＭＳＯ）中に、液体窒素中で長期間保存した。
非ヒト霊長類全血を、抗凝固剤およびゲルバリアを含むクエン酸ナトリウム細胞調製チューブ（ＣＰＴ ＣＰＴ’ｓ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に収集した。翌日配達便による発送前に、ＰＭＢＣを分離し、濃縮するために、収集直後（２時間以内）に、全血を回転させる。赤血球および好中球は、チューブの底にペレット化し、ゲルバリアによって適所に置く。血漿およびリンパ球は、ゲルバリア上に残る。各ＣＰＴは、約８ｍＬの血液を保持することができ、室温で出荷される。Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏにある前臨床研究室に到着したらすぐに、回転させたＣＰＴチューブを、ＰＢＭＣ単離用に処理した。塩化アンモニウムカリウム（ＡＣＫ）緩衝液を用いた赤血球溶解後、生存細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣｏｕｎｔｅｓｓＴＭ自動細胞計数器を用いて計数し、完全培養培地（ｍｅｄｉｕｍ）培地（ｍｅｄｉａ）（１０％ＦＢＳ、抗生物質、およびβメルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０）中で再懸濁した。この報告書に記載されるアッセイの完了時に、残りのＰＢＭＣを、冷凍し、冷結保存バイアル中の凍結培地（Ｓｅｒａｄｉｇｍからの９０％ＦＢＳ中のＳｉｇｍａからの１０％ＤＭＳＯ）中に、液体窒素中で長期間保存した。
【0216】
ＩＦＮγエリスポット
ワクチンで誘導された抗原特異的な細胞性応答を評価するために、サルＩＦＮγエリスポットアッセイを、キット（ＭａｂＴｅｃｈ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔＰｒｏ、番号３４２１Ｍ－２ＡＰＷ－１０）を用いて単離されたＰＭＢＣにおいて各時点で行った。簡単に言えば、抗サルＩＦＮγ抗体（ｍＡｂ ＭＴ１２６Ｌ）で予めコーティングされた９６ウェルプレートをＰＢＳで洗浄し、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、抗生物質、およびβメルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０）で、室温で２時間遮断した。ＮＨＰ ＰＢＭＣを、Ｒ１０培地に再懸濁し、（次いで、２×１０５細胞／ウェルの投入細胞数で３つ組で添加した。ペプチドのセットが合成され（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、各々が合成コンセンサスタンパク質配列全体を表す１１個のアミノ酸が重複する１５のアミノ酸残基を含んだ。ペプチドのこれらのセットをＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、それぞれ、約２μｇ／ｍｌの各ペプチドの濃度でプールにプールした。すべての抗原特異なプールしたペプチドは、１：１００の希釈で使用され、ＰＢＭＣと組み合わせたときに、各ウェル中に１：２００の最終希釈をもたらす。４つのプールを、メソセリンのために生成した。
ワクチンで誘導された抗原特異的な細胞性応答を評価するために、サルＩＦＮγエリスポットアッセイを、キット（ＭａｂＴｅｃｈ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔＰｒｏ、番号３４２１Ｍ－２ＡＰＷ－１０）を用いて単離されたＰＭＢＣにおいて各時点で行った。簡単に言えば、抗サルＩＦＮγ抗体（ｍＡｂ ＭＴ１２６Ｌ）で予めコーティングされた９６ウェルプレートをＰＢＳで洗浄し、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、抗生物質、およびβメルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ１６４０）で、室温で２時間遮断した。ＮＨＰ ＰＢＭＣを、Ｒ１０培地に再懸濁し、（次いで、２×１０５細胞／ウェルの投入細胞数で３つ組で添加した。ペプチドのセットが合成され（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、各々が合成コンセンサスタンパク質配列全体を表す１１個のアミノ酸が重複する１５のアミノ酸残基を含んだ。ペプチドのこれらのセットをＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、それぞれ、約２μｇ／ｍｌの各ペプチドの濃度でプールにプールした。すべての抗原特異なプールしたペプチドは、１：１００の希釈で使用され、ＰＢＭＣと組み合わせたときに、各ウェル中に１：２００の最終希釈をもたらす。４つのプールを、メソセリンのために生成した。
【0217】
イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含む、抗ＣＤ３（ｍＡｈ ＣＤ－２ Ｍａｂｔｅｃｈ）および／またはＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）を、陽性対照として使用した。完全Ｒ１０培養培地を、陰性対照として使用した。プレートを５％ＣＯ２大気のインキュベータ内で、３７℃で約１８時間インキュベートした。細胞の除去およびＡＬＰコンジュゲート抗サルＩＦＮγ検出抗体（ＭａｂＴｅｃｈ Ａｂ ７－Ｂ６－１－ＡＬＰ）の添加後、プレートを、室温で２時間インキュベートする。次いで、サンドイッチ免疫酵素アッセイは、キット製造業者のの指示（ＭａｂＴｅｃｈ）に従ってＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液を使用して発展させる。濃い藍色の沈殿物がスポットとして形成し、各個々のＩＦＮγ産生細胞を示す。次いで、このスポットを走査し、ＣＴＬ ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商）分析器およびソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって計数し、品質は訓練を受けた操作者によって制御される。ＩＦＮγ応答を、培地のみの対照におけるＳＦＵよりも大きい１×１０6ＰＭＢＣに対するスポット形成単位（ＳＦＵ）として報告する。
【0218】
免疫学結果
メソセリン特異的なＩＦＮγ応答を、群１～３に対して図１１Ａ～１１Ｃに示し、メソセリン単独（図１２Ａ）、低用量のＩＬ－１２（０．０４ｍｇ）を含むメソセリン（図１１Ｂ）、または高用量のＩＬ－１２（０．２ｍｇ）を含むメソセリン（図１１Ｃ）で、免疫化を行った。これらの結果は、投与から２週間後の各時点での応答を示す。全体として、すべての群および個々の動物は、前採血ベースラインと比較して、４回の投与から２週間後の研究の終了による応答の増加を有した。図１１Ａ～１１Ｃは、ＰＤ３までの合成コンセンサスメソセリンへのＩＦＮγ応答におけるアジュバント効果を提供するＩＬ－１２に関する傾向を示す。
メソセリン特異的なＩＦＮγ応答を、群１～３に対して図１１Ａ～１１Ｃに示し、メソセリン単独（図１２Ａ）、低用量のＩＬ－１２（０．０４ｍｇ）を含むメソセリン（図１１Ｂ）、または高用量のＩＬ－１２（０．２ｍｇ）を含むメソセリン（図１１Ｃ）で、免疫化を行った。これらの結果は、投与から２週間後の各時点での応答を示す。全体として、すべての群および個々の動物は、前採血ベースラインと比較して、４回の投与から２週間後の研究の終了による応答の増加を有した。図１１Ａ～１１Ｃは、ＰＤ３までの合成コンセンサスメソセリンへのＩＦＮγ応答におけるアジュバント効果を提供するＩＬ－１２に関する傾向を示す。
【0219】
図１２Ａ～１２Ｃは、平均化したメソセリン特異的なＩＦＮγ応答を示し、免疫化は、メソセリン単独（図１２Ａ）、
低用量のＩＬ－１２（０．０４ｍｇ）を含むメソセリン（図１２Ｂ）、または高用量のＩＬ－１２（０．２ｍｇ）を含むメソセリン（図１２Ｃ）で行われた。図１２Ａ～１２Ｃは、ＩＬ－１２が、合成コンセンサスメソセリンに対するＩＦＮγ応答の大きさを増加したが、幅は増加しなかったことを示す。
低用量のＩＬ－１２（０．０４ｍｇ）を含むメソセリン（図１２Ｂ）、または高用量のＩＬ－１２（０．２ｍｇ）を含むメソセリン（図１２Ｃ）で行われた。図１２Ａ～１２Ｃは、ＩＬ－１２が、合成コンセンサスメソセリンに対するＩＦＮγ応答の大きさを増加したが、幅は増加しなかったことを示す。
【0220】
生理学的パラメーター
表１２、１３、および１４にそれぞれ示すように、群１、２、および３に対する免疫化により測定された生理学的パラメーターのいずれも差がなかった。ＲＢＣ、ＨＣＴ、好中球、リンパ球、単球、好酸球（データは示さず）に対する有意差は言及されなかった。これらの値は、同様の実験手順を行っているこの種、性別、および年齢の動物に対して予測される範囲内である。規定された正常範囲からの任意の変動は、散発的性質からのものであり、一方の性別のみを示し、用量レベルまたはタイミングに関連していない。
表１２、１３、および１４にそれぞれ示すように、群１、２、および３に対する免疫化により測定された生理学的パラメーターのいずれも差がなかった。ＲＢＣ、ＨＣＴ、好中球、リンパ球、単球、好酸球（データは示さず）に対する有意差は言及されなかった。これらの値は、同様の実験手順を行っているこの種、性別、および年齢の動物に対して予測される範囲内である。規定された正常範囲からの任意の変動は、散発的性質からのものであり、一方の性別のみを示し、用量レベルまたはタイミングに関連していない。
【表12】
【表13】
【表14】
【0221】
すべての群に対して、下の表１５に示すように、研究コースにわたる体重の著しい変化はなく、正常範囲は、４～１２である。
【表15】
【0222】
概して、これらの結果は、単独で投与された合成コンセンサスメソセリンが、１００％のＮＨＰ中で免疫応答を誘導することができることを示す。ＩＬ－１２のアジュバントの添加による著しい改善はなかった。
【0223】
前述の詳細な説明および付随する実施例は一例にすぎず、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物によってのみ定義される本発明の範囲に対する制限であると解釈されないことが理解される。
【0224】
本開示の実施形態に対する様々な変更および修正は、当業者には明らかであろう。限定されないが、本発明の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、製剤、または使用方法に関連するものを含む、本開示の実施形態に対するそのような変更および修正は、その精神および範囲から逸脱することなく行うことができる。
【表16】
【表17】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【配列表】