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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-21
(45)【発行日】2023-09-29
(54)【発明の名称】二重特異性抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20230922BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230922BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230922BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20230922BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20230922BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20230922BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20230922BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20230922BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20230922BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20230922BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230922BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20230922BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61P35/00
A61P37/04
A61P43/00 107
C07K16/46 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/62 Z
C12P21/08
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2020573186
(86)(22)【出願日】2019-06-28
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-11-11
(86)【国際出願番号】 CN2019093548
(87)【国際公開番号】W WO2020007240
(87)【国際公開日】2020-01-09
【審査請求日】2022-04-04
(31)【優先権主張番号】201810720048.8
(32)【優先日】2018-07-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520499041
【氏名又は名称】エルアンドエル バイオファーマ カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000578
【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】リウ ジャジィェン
【審査官】中山 基志
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０５５４０４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５１１６８７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
第一のタンパク質機能領域及び第二のタンパク質機能領域を含み、前記第一のタンパク質機能領域はＴＩＭ－３を標的とする蛋白機能領域である二重特異性抗体であって、前記第一のタンパク質機能領域に含まれるＴＩＭ－３を標的とするＴＩＭ－３全長抗体はマカク（Ｍａｃａｑｕｅ）ＴＩＭ－３と弱い結合活性を有し、前記第一のタンパク質機能領域は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列表における配列番号１３で示され、かつ軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列表における配列番号１４で示されるか、或いは重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列表における配列番号１５で示され、かつ軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列表における配列番号１６で示され、
前記第一のタンパク質機能領域又は第二のタンパク質機能領域は免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’） ２ であり、
前記第二のタンパク質機能領域はＰＤ－１を標的とするタンパク質機能領域であり、抗ＰＤ－１抗体のニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）又はＢａ０８であることを特徴とする抗体。
【請求項2】
前記第一のタンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第二のタンパク質機能領域はｓｃＦｖであるか、或いは前記第一のタンパク質機能領域はｓｃＦｖであり、前記第二のタンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域と軽鎖可変領域はリンカー１を介して連結し、前記リンカー１は（Ｇ４Ｓ）ｎであり、前記ｎは１、２、３又は４であり、前記免疫グロブリンの定常領域はヒト抗体の定常領域であり、前記ヒト抗体の定常領域はヒト抗体の軽鎖定常領域及びヒト抗体の重鎖定常領域を含み、前記ヒト抗体の軽鎖定常領域はκ鎖であり、前記ヒト抗体の重鎖定常領域はヒトＩｇＧ４であることを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項3】
前記ｓｃＦｖは軽鎖可変領域－リンカー２－重鎖可変領域であり、軽鎖可変領域のＮ末端又は重鎖可変領域のＣ末端がリンカー２を介して前記免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に連結しているか、或いは前記ｓｃＦｖは重鎖可変領域－リンカー２－軽鎖可変領域であり、重鎖可変領域のＮ末端又は軽鎖可変領域のＣ末端がリンカー２を介して前記免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に連結しており、前記リンカー２は（Ｇ４Ｓ）ｎであり、前記ｎは１、２、３又は４であることを特徴とする請求項２に記載の二重特異性抗体。
【請求項4】
前記リンカー２は（Ｇ４Ｓ）３であり、並びに／或いは、前記ｓｃＦｖの数は２つであり、それぞれ対称的に前記免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端及び／又はＮ末端に連結しており、前記ｓｃＦｖは軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域の構造であり、２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＮ末端に連結しているか、或いは前記ｓｃＦｖは重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域の構造であり、２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＣ末端に連結しており、かつｓｃＦｖが重鎖のＣ末端に連結している場合、前記重鎖のＣ末端のアミノ酸がＫからＡに突然変異していることを特徴とする請求項３に記載の二重特異性抗体。
【請求項5】
前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号１７で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号１８で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号１７で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号１９で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２０で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２１で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２０で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２２で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２３で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２４で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２３で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２５で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号３２で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号３３で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号３４で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号３３で示されることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体をコードするＤＮＡ。
【請求項7】
請求項６に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項8】
請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の製造方法であって、請求項８に記載の宿主細胞を培養し、培養物から二重特異性抗体を得る工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含み、さらに、ほかの抗腫瘍の医薬、及び／又は、緩衝液を含む医薬組成物。
【請求項11】
医薬キットＡ及び医薬キットＢを含む医薬キットの組み合わせであって、前記医薬キットＡは請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含み、前記医薬キットＢは抗腫瘍の医薬を含む医薬キットの組み合わせ。
【請求項12】
癌の治療及び／又は予防において使用される請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、前記癌は、肺癌、メラノーマ、腎臓癌、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓腺癌、膀胱癌又は白血病である二重特異性抗体。
【請求項13】
請求項１～５のいずれか１項に記載の二重特異性抗体であって、サンプルにおけるＴＩＭ－３レベルの検出、ＴＩＭ－３活性又はレベルの調節、生体に対するＴＩＭ－３の免疫抑制の解消、末梢血の単核球及び／又はＮＫリンパ球の活性化において使用される二重特異性抗体、
或いは、請求項１に記載の二重特異性抗体であって、
サンプルにおけるＰＤ－１及び／又はＴＩＭ－３レベルの検出、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２との結合の遮断、ＴＩＭ－３活性又はレベルの調節、ＰＤ－１活性又はレベルの調節、生体に対するＰＤ－１及び／又はＴＩＭ－３の免疫抑制の解消、Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞におけるＩＬ－２の発現の向上、Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γの発現の向上、並びに／或いは腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の殺傷作用の活性化において使用される二重特異性抗体。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本願は出願日が２０１８／７／３の中国特許出願２０１８１０７２００４８．８の優先権を要求する。本願は上記中国特許出願の全文を引用する。
［技術分野］
本発明は、腫瘍治療及び分子免疫学の分野に属し、具体的に、２つのタンパク質機能領域を含む二重特異性抗体であって、そのうちの１つのタンパク質機能領域はＴＩＭ－３を標的とするタンパク質機能領域である抗体に関する。
［技術分野］
本発明は、腫瘍治療及び分子免疫学の分野に属し、具体的に、２つのタンパク質機能領域を含む二重特異性抗体であって、そのうちの１つのタンパク質機能領域はＴＩＭ－３を標的とするタンパク質機能領域である抗体に関する。
【0002】
［背景技術］
腫瘍免疫治療は腫瘍治療分野で近年得られた重大な突破である。近年、免疫チェックポイントＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に対する研究は盛んで、最近の１年もない時間で、国内では既に５つのＰＤ－１抗体薬物が市販された。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１以外の免疫チェックポイントでは、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１とともにＴ細胞の活性を調節する免疫チェックポイントの一つである可能性がある。ＴＩＭ－３はＩＦＮ－γを分泌するＴｈ１（Ｔヘルパー１）ＣＤ４＋細胞及び細胞傷害性のＣＤ８＋Ｔ（Ｔｃ１）細胞において発現される膜貫通受容体タンパク質である。ＩＮＦ－γを分泌するＴｈ１、Ｔｃ１以外、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、先天性免疫細胞、樹状細胞ＤＣ、ナチュラルキラー細胞ＮＫ、単核球ｍｏｎｏｃｙｔｅｓなどにおいても発現される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ａ．Ｃ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４，２０１６，ｐ９８９－１００４）。ＴＩＭ－３は複数のリガンドを有し、ガレクチン９（ｇａｌｅｃｔｉｎ－９）、ホスファチジルセリンｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、ＨＭＧＢ１及びＣＥＡＣＭ－１などを含む。ＴＩＭ－３は、一般的に、ナイーブＴ細胞において発現されないが、活性化したエフェクターＴ細胞において上方調節され、体内における免疫性及び耐性の調節作用がある。ほかの免疫チェックポイントと異なるのは、ＴＩＭ－３は活性化したＴ細胞、例えばＴｈ１、Ｔｃ１において高発現され、共抑制機能に関与し、エフェクターＴ細胞の活性を抑制し、耐性につながるのみならず、疲弊（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ）Ｔ細胞においても高発現され、Ｔ細胞の機能を抑制する。ＴＩＭ－３はＰＤ－１抗体によって治療される動物モデルにおいて高発現され、かつＴＩＭ－３の抗体と併用すると、顕著に治療効果が向上する（Ｎｉｇｉｏｗ ＳＦら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７１（１０）：３５４０－５１，２０１１）。また、最近の研究では、ＰＤ－１抗体によって治療される患者に薬剤耐性が現れ、そのＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞においてＴＩＭ－３の発現が顕著に向上することが見出され、これは動物モデルで見られた様子と一致する（Ｋｏｙａｍａ Ｓら Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ． ２０１６ Ｆｅｂ １７）。そのため、ＴＩＭ－３抗体とＰＤ－１抗体の併用治療は、ＰＤ－１抗体による治療の効率を向上させる方法の一つのみならず、ＰＤ－１抗体による治療に薬剤耐性が現れた患者の有効な選択である可能性がある。現在、臨床試験中のＴＩＭ－３抗体として、単独で又はＰＤ－１抗体と併用して末期又は転移固形腫瘍を治療するＴｅｓａｒｏのＴＳＲ－０２２、及び単独で又はＰＤ－１抗体と併用して末期悪性腫瘍を治療するノバルティス社のＭＧＢ－４５３がある。
腫瘍免疫治療は腫瘍治療分野で近年得られた重大な突破である。近年、免疫チェックポイントＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１に対する研究は盛んで、最近の１年もない時間で、国内では既に５つのＰＤ－１抗体薬物が市販された。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１以外の免疫チェックポイントでは、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１とともにＴ細胞の活性を調節する免疫チェックポイントの一つである可能性がある。ＴＩＭ－３はＩＦＮ－γを分泌するＴｈ１（Ｔヘルパー１）ＣＤ４＋細胞及び細胞傷害性のＣＤ８＋Ｔ（Ｔｃ１）細胞において発現される膜貫通受容体タンパク質である。ＩＮＦ－γを分泌するＴｈ１、Ｔｃ１以外、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、先天性免疫細胞、樹状細胞ＤＣ、ナチュラルキラー細胞ＮＫ、単核球ｍｏｎｏｃｙｔｅｓなどにおいても発現される（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ａ．Ｃ．ら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４４，２０１６，ｐ９８９－１００４）。ＴＩＭ－３は複数のリガンドを有し、ガレクチン９（ｇａｌｅｃｔｉｎ－９）、ホスファチジルセリンｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、ＨＭＧＢ１及びＣＥＡＣＭ－１などを含む。ＴＩＭ－３は、一般的に、ナイーブＴ細胞において発現されないが、活性化したエフェクターＴ細胞において上方調節され、体内における免疫性及び耐性の調節作用がある。ほかの免疫チェックポイントと異なるのは、ＴＩＭ－３は活性化したＴ細胞、例えばＴｈ１、Ｔｃ１において高発現され、共抑制機能に関与し、エフェクターＴ細胞の活性を抑制し、耐性につながるのみならず、疲弊（ｅｘｈａｕｓｔｅｄ）Ｔ細胞においても高発現され、Ｔ細胞の機能を抑制する。ＴＩＭ－３はＰＤ－１抗体によって治療される動物モデルにおいて高発現され、かつＴＩＭ－３の抗体と併用すると、顕著に治療効果が向上する（Ｎｉｇｉｏｗ ＳＦら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７１（１０）：３５４０－５１，２０１１）。また、最近の研究では、ＰＤ－１抗体によって治療される患者に薬剤耐性が現れ、そのＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞においてＴＩＭ－３の発現が顕著に向上することが見出され、これは動物モデルで見られた様子と一致する（Ｋｏｙａｍａ Ｓら Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ． ２０１６ Ｆｅｂ １７）。そのため、ＴＩＭ－３抗体とＰＤ－１抗体の併用治療は、ＰＤ－１抗体による治療の効率を向上させる方法の一つのみならず、ＰＤ－１抗体による治療に薬剤耐性が現れた患者の有効な選択である可能性がある。現在、臨床試験中のＴＩＭ－３抗体として、単独で又はＰＤ－１抗体と併用して末期又は転移固形腫瘍を治療するＴｅｓａｒｏのＴＳＲ－０２２、及び単独で又はＰＤ－１抗体と併用して末期悪性腫瘍を治療するノバルティス社のＭＧＢ－４５３がある。
【0003】
既存技術では、ＴＩＭ－３に対するタンパク質機能領域を含む二重特異性抗体が欠けている。特許出願ＵＳ２０１７１１４１３５Ａにおける二重特異性抗体はＴＩＭ－３に対する抗体をそのタンパク質機能領域の一つとするが、当該二重特異性抗体におけるＴＩＭ－３抗体はヒトＴＩＭ－３との結合活性が弱い。そして、ＵＳ２０１７１１４１３５ＡにおけるＴＩＭ－３抗体はＴｉｍ３－００２８（動物薬効評価のための分子）、Ｔｉｍ３－００３８などを含み、アカゲザル、キヌザルなどの霊長類動物のＴＩＭ－３とほとんど結合しないため、臨床前の霊長類動物の選択（臨床前研究）において大きく制限される。また、二重特異性抗体、例えばＴｉｍ３－００２８及びＴｉｍ３－００３８はＮＫ細胞を活性化させて腫瘍細胞を殺傷する活性が低い。
【0004】
［発明の概要］
本発明の解決しようとする技術的課題は、既存技術では二重特異性抗体におけるＴＩＭ－３抗体の部分及びその相応する単独の完全な抗体のヒトＴＩＭ－３との結合活性が低く、かつＰＢＭＣ（ＮＫ）細胞を活性化させて腫瘍細胞を殺傷する活性が低いなどの欠陥を克服し、二重特異性抗体及びその使用を提供する。前記二重特異性抗体はＴＩＭ－３を標的とするタンパク質機能領域及びもう一つのタンパク質機能領域を含み、単独のＴＩＭ－３抗体が有するＰＢＭＣ（ＮＫ）を活性化させて腫瘍細胞を殺傷する活性を残しながら、もう一つのタンパク質機能領域に相応する全長抗体の元の活性を維持し、そして二つの分子の併用に相当するか、それ以上（相乗効果）のＴ細胞を活性化させる活性に達する。具体的に、発明者は、意外に、アカゲザルのＴＩＭ－３と弱い結合活性を有するが、キヌザル及びヒトのＴＩＭ－３と強い結合活性を有し、かつヒトＮＫ細胞の腫瘍に対する殺傷作用を活性化させる、ＴＩＭ－３抗体を見出したが、本発明のＴｉｍ－３抗体の配列に基づいて特異的に設計された二重特異性抗体（Ｓｂｏｄｙ）は構造が安定で、二つの標的に対する特異的な結合活性が良く、発現量が高く、精製プロセスが簡単である。そして、得られる二重特異分子（二重特異性抗体）は細胞機能活性が二つの単独のモノクローナル抗体の併用と同等かつ／又はそれ以上で、より意外なことに、本発明で設計される二重特異性抗体分子は動物薬効、生存優位性などがいずれも相乗効果を示し、二つの単独のモノクローナル抗体の併用よりも良い。また、二重特異性抗体は、さらに、単剤の低コスト、投与の便宜といった明らかな優勢がある。
本発明の解決しようとする技術的課題は、既存技術では二重特異性抗体におけるＴＩＭ－３抗体の部分及びその相応する単独の完全な抗体のヒトＴＩＭ－３との結合活性が低く、かつＰＢＭＣ（ＮＫ）細胞を活性化させて腫瘍細胞を殺傷する活性が低いなどの欠陥を克服し、二重特異性抗体及びその使用を提供する。前記二重特異性抗体はＴＩＭ－３を標的とするタンパク質機能領域及びもう一つのタンパク質機能領域を含み、単独のＴＩＭ－３抗体が有するＰＢＭＣ（ＮＫ）を活性化させて腫瘍細胞を殺傷する活性を残しながら、もう一つのタンパク質機能領域に相応する全長抗体の元の活性を維持し、そして二つの分子の併用に相当するか、それ以上（相乗効果）のＴ細胞を活性化させる活性に達する。具体的に、発明者は、意外に、アカゲザルのＴＩＭ－３と弱い結合活性を有するが、キヌザル及びヒトのＴＩＭ－３と強い結合活性を有し、かつヒトＮＫ細胞の腫瘍に対する殺傷作用を活性化させる、ＴＩＭ－３抗体を見出したが、本発明のＴｉｍ－３抗体の配列に基づいて特異的に設計された二重特異性抗体（Ｓｂｏｄｙ）は構造が安定で、二つの標的に対する特異的な結合活性が良く、発現量が高く、精製プロセスが簡単である。そして、得られる二重特異分子（二重特異性抗体）は細胞機能活性が二つの単独のモノクローナル抗体の併用と同等かつ／又はそれ以上で、より意外なことに、本発明で設計される二重特異性抗体分子は動物薬効、生存優位性などがいずれも相乗効果を示し、二つの単独のモノクローナル抗体の併用よりも良い。また、二重特異性抗体は、さらに、単剤の低コスト、投与の便宜といった明らかな優勢がある。
【0005】
本発明は主に以下の技術的解決手段によって上記技術的課題を解決する。
本発明の第一の側面では、二重特異性抗体を提供し、第一のタンパク質機能領域及び第二のタンパク質機能領域を含み、前記第一のタンパク質機能領域はＴＩＭ－３を標的とする蛋白機能領域であり、前記第一のタンパク質機能領域に相応するＴＩＭ－３を標的とするＴＩＭ－３全長抗体はアカゲザル（Ｍａｃａｃａ）ＴＩＭ－３と弱い結合活性を有し、前記弱い結合活性はＥＬＩＳＡによって測定されるＥＣ５０値が１ｎＭ超であり、好ましくは１０ｎＭ超であり、より好ましくはＥＣ５０値が検出されないものであり、かつキヌザル（Ｍａｒｍｏｓｅｔ）及びヒトＴＩＭ－３と強い結合活性を有して腫瘍細胞に対するヒトＮＫ細胞の殺傷作用の活性化ができ、前記強い結合活性はＥＬＩＳＡによって測定されるＥＣ５０値が１ｎＭ未満であり、好ましくは０．５ｎＭ未満であり、より好ましくは０．２ｎＭ未満であり、腫瘍細胞に対する前記ヒトＮＫ細胞の殺傷作用の活性化は、バックグラウンド、即ち、抗体濃度が０μｇ／ｍＬの場合と比べ、殺される腫瘍細胞が３％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上増加することである。本分野において、抗体と抗原の強い結合活性と弱い結合活性は相対的であり、本願では、上記のように、１ｎＭのＥＬＩＳＡによって測定されるＥＣ５０値を境に、１ｎＭ超の場合は弱い結合であり、１ｎＭ未満の場合は強い結合である。
本発明の第一の側面では、二重特異性抗体を提供し、第一のタンパク質機能領域及び第二のタンパク質機能領域を含み、前記第一のタンパク質機能領域はＴＩＭ－３を標的とする蛋白機能領域であり、前記第一のタンパク質機能領域に相応するＴＩＭ－３を標的とするＴＩＭ－３全長抗体はアカゲザル（Ｍａｃａｃａ）ＴＩＭ－３と弱い結合活性を有し、前記弱い結合活性はＥＬＩＳＡによって測定されるＥＣ５０値が１ｎＭ超であり、好ましくは１０ｎＭ超であり、より好ましくはＥＣ５０値が検出されないものであり、かつキヌザル（Ｍａｒｍｏｓｅｔ）及びヒトＴＩＭ－３と強い結合活性を有して腫瘍細胞に対するヒトＮＫ細胞の殺傷作用の活性化ができ、前記強い結合活性はＥＬＩＳＡによって測定されるＥＣ５０値が１ｎＭ未満であり、好ましくは０．５ｎＭ未満であり、より好ましくは０．２ｎＭ未満であり、腫瘍細胞に対する前記ヒトＮＫ細胞の殺傷作用の活性化は、バックグラウンド、即ち、抗体濃度が０μｇ／ｍＬの場合と比べ、殺される腫瘍細胞が３％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは１０％以上増加することである。本分野において、抗体と抗原の強い結合活性と弱い結合活性は相対的であり、本願では、上記のように、１ｎＭのＥＬＩＳＡによって測定されるＥＣ５０値を境に、１ｎＭ超の場合は弱い結合であり、１ｎＭ未満の場合は強い結合である。
【0006】
前記「腫瘍細胞に対するヒトＮＫ細胞の殺傷作用の活性化」の測定は、分離されたＮＫ細胞又はＮＫ細胞が分離されていないヒト血細胞（ＰＢＭＣ）でＮＫ細胞殺傷活性実験を行うことができ、本発明では、後者が好ましいため、最終的に検出されるのは腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の殺傷活性である。本発明に係るＮＫ細胞の全称はＮａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌであり、即ち、ナチュラルキラー細胞である。なお、本発明において、殺傷される腫瘍細胞の測定に使用されるのは乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）活性という指標であり、乳酸脱水素酵素放出量の増加百分率を、殺された腫瘍細胞の増加百分率とする。
【0007】
前記第一のタンパク質機能領域は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は好適にアミノ酸配列が配列表における配列番号１～３で示されるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義、又はＣＣＧ定義による配列表における配列番号２６、配列番号２及び配列番号３で示されるＣＤＲ）、又はアミノ酸配列が配列番号４～６で示されるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ定義、又はＣＣＧ定義による配列表における配列番号２７、配列番号５及び配列番号６で示されるＣＤＲ）を含み、前記軽鎖可変領域は好適にアミノ酸配列が配列表における配列番号７～９又は配列番号１０～１２で示されるＣＤＲを含む。
【0008】
好ましくは、前記第一のタンパク質機能領域において、重鎖可変領域がアミノ酸配列が配列表における配列番号１～３で示されるＣＤＲを含み、かつ軽鎖可変領域がアミノ酸配列が配列表における配列番号７～９で示されるＣＤＲを含むか、或いは重鎖可変領域がアミノ酸配列が配列表における配列番号２６、配列番号２及び配列番号３で示されるＣＤＲを含み、かつ軽鎖可変領域がアミノ酸配列が配列表における配列番号７～９で示されるＣＤＲを含むか、或いは重鎖可変領域がアミノ酸配列が配列表における配列番号４～６で示されるＣＤＲを含み、かつ軽鎖可変領域がアミノ酸配列が配列表における配列番号１０～１２で示されるＣＤＲを含むか、或いは重鎖可変領域がアミノ酸配列が配列表における配列番号２７、配列番号５及び配列番号６で示されるＣＤＲを含み、かつ軽鎖可変領域がアミノ酸配列が配列表における配列番号１０～１２で示されるＣＤＲを含む。
【0009】
ここで、配列表における配列番号１～３で示される配列は好適に順にそれぞれ重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であるか、或いは配列表における配列番号２６、配列番号２及び配列番号３で示される配列は好適に順にそれぞれ重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、かつ配列表における配列番号７～９で示される配列は好適に順にそれぞれ軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３である。配列表における配列番号４～６で示される配列は好適に順にそれぞれ重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であるか、或いは配列表における配列番号２７、配列番号５及び配列番号６で示される配列は好適に順にそれぞれ重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３であり、かつ配列表における配列番号１０～１２で示される配列は好適に順にそれぞれ軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３である。
【0010】
前記第一のタンパク質機能領域は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が好適に配列表における配列番号１３又は１５で示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が好適に配列表における配列番号１４又は１６で示され、好ましくは、前記第一のタンパク質機能領域は、重鎖可変領域のアミノ酸配列が好適に配列表における配列番号１３で示され、かつ軽鎖可変領域のアミノ酸配列が好適に配列表における配列番号１４で示されるか、或いは重鎖可変領域のアミノ酸配列が好適に配列表における配列番号１５で示され、かつ軽鎖可変領域のアミノ酸配列が好適に配列表における配列番号１６で示される。
【0011】
本発明に記載の第一のタンパク質機能領域又は第二のタンパク質機能領域は免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２が好ましい。生産プロセスが簡単でかつ有効な活性を維持する二重特異性抗体を設計するために、本発明の二重特異性抗体の形態は正常ＩｇＧの構造に類似し、具体的に、それぞれ単独の軽鎖及び重鎖を設計し、軽鎖及び／又は重鎖のＮ末端で２つの標的をターゲティングすることができ、軽鎖及び／又は重鎖、同様の重鎖Ｆｃ領域を共有するように設計する。より好ましくは、１つの標的の抗体分子をｓｃＦｖの形態でもう１つの標的の完全な抗体の軽鎖又は重鎖の一方の末端に連結している。これによって、異なる重鎖Ｆｃの発現による発現産物の不均一が避けられ、例えば、ノブ（Ｋｎｏｂ）形態のＦｃやホール（Ｈｏｌｅ）形態のＦｃが共発現すると、発現過程において不均一なＦｃ－Ｆｃマッチング形態が生じ、発現量に影響するだけでなく、精製プロセスにも不便をもたらす。同時に、軽・重鎖の一部の領域のクロス（ｃｒｏｓｓ）デザインの構造活性に対する影響が避けられる。
【0012】
好ましくは、前記第一のタンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記第二のタンパク質機能領域はｓｃＦｖであるか、或いは前記第一のタンパク質機能領域はｓｃＦｖであり、前記第二のタンパク質機能領域は免疫グロブリンであり、前記ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域と軽鎖可変領域はリンカー１を介して連結し、前記リンカー１は好ましくは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、前記ｎは好ましくは０～１０の間の整数であり、より好ましくは１、２、３又は４であり、前記免疫グロブリンの定常領域は好ましくはヒト抗体の定常領域であり、前記ヒト抗体の定常領域は好ましくはヒト抗体の軽鎖定常領域及びヒト抗体の重鎖定常領域を含み、前記ヒト抗体の軽鎖定常領域は好ましくはκ鎖又はλ鎖であり、より好ましくはκ鎖であり、前記ヒト抗体の重鎖定常領域は好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４、より好ましくはＩｇＧ４である。
【0013】
前記ｓｃＦｖは軽鎖可変領域－リンカー２－重鎖可変領域で（当該構造はＮ末端からＣ末端の配列形態であり、即ち、軽鎖可変領域のＮ末端及び重鎖可変領域のＣ末端が露出している）、軽鎖可変領域のＮ末端又は重鎖可変領域のＣ末端がリンカー２を介して相応的に前記免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に連結しているか、或いは前記ｓｃＦｖは重鎖可変領域－リンカー２－軽鎖可変領域で（重鎖可変領域のＮ末端及び軽鎖可変領域のＣ末端が露出している）、重鎖可変領域のＮ末端又は軽鎖可変領域のＣ末端がリンカー２を介して相応的に前記免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端又はＮ末端に連結しており、前記リンカー２は好ましくは（Ｇ４Ｓ）ｎであり、前記ｎは好ましくは０～１０の間の整数であり、より好ましくは１、２、３又は４である。
【0014】
好ましくは、前記リンカーは（Ｇ４Ｓ）３であり、並びに／或いは、前記ｓｃＦｖの数は２つ又は４つ又は６つ又は８つであり、それぞれ対称的に前記免疫グロブリンの軽鎖及び／又は重鎖のＣ末端及び／又はＮ末端に連結している。
【0015】
より好ましくは、前記ｓｃＦｖの数が２つの場合、（１）前記ｓｃＦｖは軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域の構造であり、２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＮ末端に連結しているか、或いは（２）前記ｓｃＦｖは重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域の構造であり、２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖又は重鎖のＣ末端に連結しており、かつｓｃＦｖが重鎖のＣ末端に連結している場合、前記重鎖のＣ末端のアミノ酸がＫからＡに突然変異している。
【0016】
前記ｓｃＦｖの数が４つの場合、（１）４つのｓｃＦｖはいずれも軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域の構造であり、そのうち、２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖可変領域のＮ末端に、もう２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖可変領域のＮ末端に連結しているか、（２）４つのｓｃＦｖはいずれも重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域の構造であり、そのうち、２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖のＣ末端に、もう２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖のＣ末端に連結しており、かつＣ末端のアミノ酸がＫからＡに突然変異しているか、（３）そのうち、２つのｓｃＦｖは軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域の構造であり、その重鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のＮ末端に連結しており、もう２つのｓｃＦｖは重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域の構造であり、その重鎖可変領域のＮ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖又は重鎖のＣ末端に連結しており、かつｓｃＦｖが重鎖のＣ末端に連結している場合、前記Ｃ末端のアミノ酸がＫからＡに突然変異している。
【0017】
前記ｓｃＦｖの数が６つの場合、（１）４つのｓｃＦｖは軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域の構造であり、そのうち、２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖可変領域のＮ末端に、もう２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖可変領域のＮ末端に連結しており、残りの２つのｓｃＦｖは重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域の構造であり、その重鎖可変領域のＮ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖可変領域のＣ末端又は２本の重鎖のＣ末端に連結しており、かつｓｃＦｖが重鎖のＣ末端に連結している場合、前記Ｃ末端のアミノ酸がＫからＡに突然変異しているか、（２）４つのｓｃＦｖは重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域の構造であり、そのうち、２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖可変領域のＣ末端に、もう２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖のＣ末端に連結しており、かつｓｃＦｖが重鎖のＣ末端に連結している場合、前記Ｃ末端のアミノ酸がＫからＡに突然変異しており、２つのｓｃＦｖは軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域の構造であり、その重鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖可変領域又は２本の重鎖可変領域のＮ末端に連結している。
【0018】
前記ｓｃＦｖの数が８つの場合、４つのｓｃＦｖは軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域の構造であり、そのうち、２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖可変領域のＮ末端に、もう２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖可変領域のＮ末端に連結しており、残りの４つのｓｃＦｖは重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域の構造であり、そのうち、２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の軽鎖のＣ末端に、もう２つのｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端がそれぞれ（Ｇ４Ｓ）３を介して対称的に前記免疫グロブリンの２本の重鎖のＣ末端に連結しており、かつＣ末端のアミノ酸がＫからＡに突然変異している。
【0019】
上記の軽鎖又は重鎖のＣ末端に連結しているとは、いずれも軽鎖定常領域又は重鎖定常領域のＣ末端に連結していることである。具体的な２つ、４つ、６つ及び８つのｓｃＦｖと免疫グロブリンの連結の形態において、ｓｃＦｖの重鎖可変領域のＣ末端を介して免疫グロブリンの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＮ末端に、或いはｓｃＦｖの重鎖可変領域のＮ末端を介して免疫グロブリンの軽鎖定常領域又は重鎖定常領域のＣ末端に連結している例のみが記載されている。また、ｓｃＦｖは、軽鎖可変領域のＣ末端を介して（重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域の構造の場合）免疫グロブリンの軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のＮ末端に、或いはｓｃＦｖの軽鎖可変領域のＮ末端を介して（軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域の構造の場合）免疫グロブリンの軽鎖定常領域又は重鎖定常領域のＣ末端に連結していてもよいが（ｓｃＦｖが重鎖のＣ末端に連結している場合、重鎖のＣ末端のアミノ酸がＫからＡに突然変異している）、これらの技術方案も本発明の保護の範囲内に含まれている。
【0020】
或いは、本発明に係る二重特異性抗体はＤＶＤ－Ｉｇ（Ｄｕａｌ－ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ、二重可変領域型免疫グロブリン）の二重特異性抗体であり、その構造は正常の抗体の軽・重鎖のＮ末端にそれぞれさらにもう１つの抗体のＶＬ及びＶＨが連結しており、２つの抗体の可変領域が２つの標的に結合することにより二重機能が実現される。好ましくは、前記第二のタンパク質機能領域は正常の抗体の軽鎖及び重鎖を含み、前記第一のタンパク質機能領域は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。
【0021】
より好ましくは、前記第二のタンパク質機能領域の軽鎖と前記第一のタンパク質機能領域の軽鎖可変領域の間、前記重鎖と前記重鎖可変領域の間はいずれもリンカー３を介して連結しており、前記リンカー３は好ましくは配列番号２８のアミノ酸配列で示されるペプチド断片１、配列番号２９のアミノ酸配列で示されるペプチド断片２又は（Ｇ４Ｓ）ｎであり、前記ｎは好ましくは０～１０の間の整数であり、より好ましくは１、２、３又は４である。
【0022】
さらに好ましくは、前記第一のタンパク質機能領域の軽鎖可変領域は前記ペプチド断片１を介して前記第二のタンパク質機能領域の軽鎖可変領域のＮ末端に連結しており、前記第一のタンパク質機能領域の重鎖可変領域のＣ末端は前記ペプチド断片２を介して前記第二のタンパク質機能領域の重鎖可変領域のＮ末端に連結している。
【0023】
上記のような二重特異性抗体において、前記第二のタンパク質機能領域は好ましくは腫瘍抗原、例えばＰＤ－１を標的とするタンパク質機能領域であり、好ましくは抗ＰＤ－１抗体であり、前記抗ＰＤ－１抗体は全長抗体、抗原抗体結合領域タンパク質結合断片、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体又は単一領域抗体であり、より好ましくは抗ＰＤ－１抗体のニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｎｉｖｏと略す）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｐｅｍと略す）又はＢａ０８である。
【0024】
より好ましくは、前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号１７で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号１８で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号１７で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号１９で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２０で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２１で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２０で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２２で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２３で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２４で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２３で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号２５で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号３２で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号３３で示されるか、或いは前記二重特異性抗体の軽鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号３４で示され、かつ前記二重特異性抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表における配列番号３３で示される。
【0025】
本発明の第二の側面では、さらに、上記のような二重特異性抗体をコードするＤＮＡ配列を提供する。
本発明の第三の側面では、さらに、上記のようなＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供する。
本発明の第三の側面では、さらに、上記のようなＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供する。
【0026】
本発明の第四の側面では、さらに、上記のような発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
本発明の第五の側面では、さらに、前記二重特異性抗体の製造方法であって、上記のような宿主細胞を培養し、培養物から二重特異性抗体を得る工程を含む方法を提供する。
本発明の第五の側面では、さらに、前記二重特異性抗体の製造方法であって、上記のような宿主細胞を培養し、培養物から二重特異性抗体を得る工程を含む方法を提供する。
【0027】
本発明の第六の側面では、さらに、上記のような二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、前記医薬組成物は、さらに、ほかの抗腫瘍の薬物、及び／又は、緩衝液を含み、より好ましくは、前記緩衝液はヒスチジン又はＰＢＳ緩衝液であり、ｐＨ５．５～６．０であり、さらに好ましくは、前記ヒスチジン緩衝液は、１０～２０ｍＭのＬ－ヒスチジン、５０～７０ ｍｇ／ｍＬのショ糖、及び０．１～１．０％のツイン８０又は０．０１～０．０５％のツイン２０を含み、例えば、前記ヒスチジン緩衝液は、１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、７０ｍｇ／ｍＬのショ糖及び０．２％のツイン８０を含む。
【0028】
本発明の第七の側面では、さらに、医薬キットＡ及び医薬キットＢを含む医薬キットの組み合わせであって、前記医薬キットＡは本発明の第一の側面に記載の二重特異性抗体を含み、前記医薬キットＢは抗腫瘍の医薬を含む組み合わせを提供する。好ましくは、前記医薬キットＡを前記医薬キットＢと同時に施用するか、或いは前記医薬キットＡを前記医薬キットＢの前又は後に施用する。
【0029】
本発明の第八の側面では、さらに、癌を治療及び／又は予防する医薬の製造における本発明の第一の側面に記載の二重特異性抗体の使用であって、前記癌は好ましくは肺癌、メラノーマ、腎臓癌、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、膵臓腺癌、膀胱癌又は白血病である使用を提供する。
【0030】
また、本発明は、上記の第一の側面の二重特異性抗体、第六の側面の医薬組成物、第七の側面の医薬キットの組み合わせ及び第八の側面の遺伝子修飾された細胞で癌に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【0031】
本発明の第九の側面では、さらに、以下のような医薬の製造における本発明の第一の側面に記載の二重特異性抗体の使用を提供する：
サンプルにおけるＴＩＭ－３レベルを検出する医薬、ＴＩＭ－３活性又はレベルを調節する医薬、生体に対するＴＩＭ－３の免疫抑制を解消する医薬、末梢血の単核球及び／又はＮＫリンパ球を活性化させる医薬。
サンプルにおけるＴＩＭ－３レベルを検出する医薬、ＴＩＭ－３活性又はレベルを調節する医薬、生体に対するＴＩＭ－３の免疫抑制を解消する医薬、末梢血の単核球及び／又はＮＫリンパ球を活性化させる医薬。
【0032】
或いは、以下のような医薬の製造における本発明の第一の側面に記載の二重特異性抗体の使用を提供する：
サンプルにおけるＰＤ－１及び／又はＴＩＭ－３レベルを検出する医薬、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の結合を遮断する医薬、ＴＩＭ－３活性又はレベルを調節する医薬、ＰＤ－１活性又はレベルを調節する医薬、生体に対するＰＤ－１及び／又はＴＩＭ－３の免疫抑制を解消する医薬、Ｔ細胞を活性化させる医薬、Ｔ細胞におけるＩＬ－２の発現を向上させる医薬並びに／或いはＴ細胞におけるＩＦＮ－γの発現を向上させる医薬、或いは腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の殺傷作用を活性化させる医薬。ここで、前記二重特異性抗体の第二の機能領域は、腫瘍抗体、例えばＰＤ－１を標的とするタンパク質機能領域である。
サンプルにおけるＰＤ－１及び／又はＴＩＭ－３レベルを検出する医薬、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２の結合を遮断する医薬、ＴＩＭ－３活性又はレベルを調節する医薬、ＰＤ－１活性又はレベルを調節する医薬、生体に対するＰＤ－１及び／又はＴＩＭ－３の免疫抑制を解消する医薬、Ｔ細胞を活性化させる医薬、Ｔ細胞におけるＩＬ－２の発現を向上させる医薬並びに／或いはＴ細胞におけるＩＦＮ－γの発現を向上させる医薬、或いは腫瘍細胞に対するＮＫ細胞の殺傷作用を活性化させる医薬。ここで、前記二重特異性抗体の第二の機能領域は、腫瘍抗体、例えばＰＤ－１を標的とするタンパク質機能領域である。
【0033】
本発明において、別途に説明しない限り、本明細書で使用される科学及び技術名詞は当業者によって通常理解される意味を有する。そして、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学実験室操作手順はいずれも関連分野で幅広く使用される通常の手順である。同時に、本発明がより良く理解されるように、以下に関連用語の定義及び解釈を提供する。
【0034】
本発明において、Ｔｉｍ－３、Ｔｉｍ３、ＴＩＭ－３及びＴＩＭ３は同様の意味を表す。もちろん、本発明の「第一」、「第二」及び「リンカー１（Ｌ１）」、「リンカー２（Ｌ２）」、「リンカー３（Ｌ３）」及び「リンカー４（Ｌ４）」における「１」、「２」、「３」及び「４」はいずれも実質的な意味がなく、単に異なる位置のリンカーを区別するためのものであり、同様、類似のリンカーでも、又は異なるリンカーでもよく、例えば配列番号２８で示されるペプチド断片１、配列番号２９で示されるペプチド断片２又は（Ｇ４Ｓ）ｎであり、ｎは０～１０の間の整数か、１０よりも大きく、好ましくは１、２、３又は４である。本明細書において使用されるように、用語ＥＣ５０とは半数最大効果濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ）であり、５０％の最大効果を引き起こす濃度である。
【0035】
本明細書において使用されるように、用語「抗体」とは、通常、２対のポリペプチド鎖（各対に１本の「軽」（Ｌ）鎖及び１本の「重」（Ｈ）鎖を有する）からなる免疫グロブリン分子である。一般的に、重鎖は抗体における分子量が高い方のポリペプチド鎖であり、軽鎖は抗体における分子量が低い方のポリペプチド鎖であると理解される。軽鎖はκ及びλ軽鎖に分類できる。重鎖は、通常、μ、δ、γ、α又はεに分類でき、そしてそれぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。軽鎖及び重鎖の中で、可変領域及び定常領域は約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域を介して連結し、重鎖はさらに約３個又はそれ以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）とからなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とからなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。抗体の定常領域はグロブリンと宿主の組織又は因子の結合を仲介し、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）と古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）の結合を含む。ＶＨとＶＬ領域はさらに超可変性を有する領域［相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる］に細分してもよく、その間にフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端まで並ぶ３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。各重鎖／軽鎖に相応する可変領域（ＶＨ及びＶＬ）はそれぞれ抗体結合部位を形成する。アミノ酸から各領域又はドメインの分配はＫａｂａｔ ＥＡ．ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ，Ｍｄ．（１９８７ａｎｄ １９９１）］，又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ（１９８７）］．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３の定義に準ずる。特に、重鎖は３つ以上、例えば６、９又は１２のＣＤＲを含んでもよい。例えば、本発明の二重特異性抗体において、重鎖はＩｇＧ抗体の重鎖のＮ末端がもう１つの抗体に連結したＳｃＦｖでもよく、この場合、重鎖は９つのＣＤＲを含む。本明細書で使用されるように、用語の抗体の「抗原結合断片」とは全長抗体の断片を含むポリペプチドであり、特異的に全長抗体に結合する抗原と同様のものに結合する能力を維持し、並びに／或いは全長抗体と競争して抗原に特異的に結合し、「抗原結合部分」とも呼ばれる。通常、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ，Ｃｈ．７ （Ｐａｕｌ ，Ｗ．，ｅｄ．，第２版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照し、その全文として引用によって本明細書に取り込まれ、すべての目的に使用される。組み換えＤＮＡ技術或いは完全な抗体の酵素触媒又は化学的切断によって抗体の抗原結合断片を得ることができる。一部の場合、抗原結合断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）及びこのようなポリペプチドを含み、ポリペプチドに特異的抗原結合能力を与える抗体の少なくとも一部を含む。
【0036】
用語「Ｆａｂ」とはＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１（又はＣＨ）のドメインからなる抗体断片であり、用語「Ｆ（ａｂ’）２」とはヒンジ領域におけるジスルフィド架橋で連結した２つのＦａｂ断片を含む抗体断片であり、用語「Ｆａｂ’」はＦ（ａｂ’）２断片の還元によって形成してもよく、Ｆａｂ以外、遊離チオール基を含む。
【0037】
一部の場合、抗体の抗原結合断片は一本鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、ここで、ＶＬ及びＶＨドメインによって単一のポリペプチド鎖の連結体がマッチングして１価の分子になる［例えば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）及びＨｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３（１９８８）を参照する］。このようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ又はＮＨ２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨのような一般的な構造を有してもよい。適切な既存技術のリンカーは繰り返したＧ４Ｓアミノ酸配列又はそのバリアントからなる。例えば、アミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）３を有するリンカーを使用してもよいが、そのバリアントを使用してもよい（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４～６４４８）。
【0038】
当業者に既知の通常の技術（例えば、組み換えＤＮＡ技術又は酵素触媒又は化学的切断法）によって所定の抗体から抗体の抗原結合断片（例えば、上記抗体断片）を獲得し、そして完全な抗体と同様の手段によって特異性について抗体の抗原結合断片をスクリーニングすることができる。
【0039】
本明細書において、前後文で明示しない限り、用語「抗体」に言及する場合、完全な抗体のみならず、抗体の抗原結合断片も含む。
本明細書で使用されるように、用語「分離された」とは天然の状態で人工的手段によって得られることである。自然界である「分離された」物質又は成分が現れる場合、それが存在する天然の環境が変化したか、或いは天然の環境で当該物質が分離するか、或いは両者の場合いずれも存在する。例えば、ある動物の生体内に天然的にある種の分離されていないポリヌクレオチド又はポリペプチドが存在し、このような天然の状態で分離された高純度の同様のポリヌクレオチド又はポリペプチドは「分離された」という。用語「分離された」は、人工又は合成の物質の混雑も、物質の活性に影響のないほかの不純物の存在もありうる。
本明細書で使用されるように、用語「分離された」とは天然の状態で人工的手段によって得られることである。自然界である「分離された」物質又は成分が現れる場合、それが存在する天然の環境が変化したか、或いは天然の環境で当該物質が分離するか、或いは両者の場合いずれも存在する。例えば、ある動物の生体内に天然的にある種の分離されていないポリヌクレオチド又はポリペプチドが存在し、このような天然の状態で分離された高純度の同様のポリヌクレオチド又はポリペプチドは「分離された」という。用語「分離された」は、人工又は合成の物質の混雑も、物質の活性に影響のないほかの不純物の存在もありうる。
【0040】
本明細書で使用されるように、用語「宿主細胞」とは、ベクターに導入するための細胞であり、例えば大腸菌などの原核細胞、例えば酵母細胞などの真菌細胞、例えばＳ２ショウジョウバエ細胞やＳｆ９などの昆虫細胞、或いは例えば線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞又はヒト細胞などの動物細胞を含むが、これらに限定されない。
【0041】
本明細書で使用されるように、用語「ＫＤ」とは特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数であり、抗体と抗原の間の結合親和力を表すためのものである。解離平衡定数が小さいほど、抗体－抗原の結合が緊密であり、抗体と抗原の間の親和力が高い。通常、抗体は約１０－５Ｍ未満、例えば約１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、１０－９Ｍ又は１０－１０Ｍ未満又はそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原に結合し、例えば、表面プラスモン共鳴技術（ＳＰＲ）によってＢＩＡＣＯＲＥ装置で測定される。
【0042】
本明細書で使用されるように、用語「アジュバント」とは非特異性免疫増強剤であり、抗原とともに又は予め生体に送達する場合、抗原に対する生体の免疫応答を増強するか、免疫応答の種類を変えることができる。アジュバントは多くの種類があり、アルミニウムアジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、リポ多糖、サイトカインなどを含むが、これらに限定されない。フロイントアジュバントは現在動物試験で最も使用されるアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは臨床実験で多く使用される。
【0043】
本分野の常識に合うことを前提に、上記各好適な条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好適な実例が得られる。
本発明で用いられる試薬及び原料はいずれも市販品として得られる。
本発明で用いられる試薬及び原料はいずれも市販品として得られる。
【0044】
本発明の積極的な進歩効果は以下の通りである。
本発明における二重特異性抗体では、ＴＩＭ－３を標的とするタンパク質機能領域が相応するＴＩＭ－３を標的とするＴＩＭ－３全長抗体は、キヌザル、及びヒトのＴＩＭ－３との結合活性が良い。キヌザルＴＩＭ－３との結合活性は好適に０．０５ｎＭでもよい。ヒトＴＩＭ－３との結合活性は好適に０．１１ｎＭでもよく、ＵＳ２０１７１１４１３５Ａに係るＴｉｍ－３－００２８、Ｔｉｍ－３－００３８抗体よりもヒトＴＩＭ－３との結合活性が３～１００倍以上強い。アカゲザルＴｉｍ－３とはほとんど結合しないか、非常に弱く結合する。そのため、既存技術におけるＴＩＭ－３抗体の１種類の分子と異なり、本発明のＴＩＭ－３抗体は強いヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性を有し、最高で５．２２に達する（乳酸脱水素酵素放出量の増加の百分率）。
本発明における二重特異性抗体では、ＴＩＭ－３を標的とするタンパク質機能領域が相応するＴＩＭ－３を標的とするＴＩＭ－３全長抗体は、キヌザル、及びヒトのＴＩＭ－３との結合活性が良い。キヌザルＴＩＭ－３との結合活性は好適に０．０５ｎＭでもよい。ヒトＴＩＭ－３との結合活性は好適に０．１１ｎＭでもよく、ＵＳ２０１７１１４１３５Ａに係るＴｉｍ－３－００２８、Ｔｉｍ－３－００３８抗体よりもヒトＴＩＭ－３との結合活性が３～１００倍以上強い。アカゲザルＴｉｍ－３とはほとんど結合しないか、非常に弱く結合する。そのため、既存技術におけるＴＩＭ－３抗体の１種類の分子と異なり、本発明のＴＩＭ－３抗体は強いヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性を有し、最高で５．２２に達する（乳酸脱水素酵素放出量の増加の百分率）。
【0045】
本発明における二重特異性抗体は、緩衝系で性質が安定している（特にＰＢＳ及びヒスチジン緩衝系、例えば１０ｍＭのＬ－ヒスチジン、７０ｍｇ／ｍＬのショ糖及び０．２％のツイン８０を含む緩衝液で）。本発明における二重特異性抗体は単独の抗体に近い結合活性を維持し、例えば単独のＴＩＭ－３抗体又はＰＤ－１抗体と比べ、二重特異性抗体の活性（ＥＣ５０）はやや低下し（比較的に小さい、１～３倍の範囲内）、かつ単独のＴＩＭ－３抗体が有するＰＢＭＣ（ＮＫ）の腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性を維持し、もう１つのタンパク質機能領域の元の活性も維持する。例えば、本発明の好適に設計されるＴＩＭ－３とＰＤ－１に対する二重特異性分子（１つの分子）は２つの分子の併用に相当するか、それ以上（相乗効果）のＴ細胞を活性化させる活性に達する。単剤の低コスト、投与の便宜といった明らかな優勢がありながら、本発明の二重特異性抗体（例えばＬＢ１４１）は治療においてＰＤ－１抗体の単独治療又はＴＩＭ－３抗体とＰＤ－１抗体の併用よりも優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図2a】図２ａは本発明の二重特異性抗体のゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）である。図２ａは、左からレーンＭ：分子量マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）；１：ＰＤ－１抗体（Ｎｉｖｏ）非変性（ｎｏｎ ｒｅｄｕｃｅｄ）；２：ＰＤ－１抗体（Ｎｉｖｏ）変性（ｒｅｄｕｃｅｄ）；３：ＬＢ１２１非変性；４：ＬＢ１２１変性；５：ＬＢ１２２非変性；６：ＬＢ１２２変性；７：ＬＢ１２３非変性；８：ＬＢ１２３変性である。
【図2b】図２ｂは本発明の二重特異性抗体のゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）である。図２ｂは、左からレーンＭ：分子量マーカー（Ｍａｒｋｅｒ）：１：ＰＤ－１抗体（Ｎｉｖｏ）非変性；２：ＰＤ－１抗体（Ｎｉｖｏ）変性；３：ＬＢ１２４ 非変性；４：ＬＢ１２４変性；５：ＬＢ１２６非変性；６：ＬＢ１２６変性；７：ＬＢ１２７非変性；８：ＬＢ１２７変性；９：ＬＢ１２８非変性；１０：ＬＢ１２８変性；１１：ＬＢ１２９非変性；１２：ＬＢ１２９変性である。
【図3a】図３ａは本発明の二重特異性抗体のヒトＴＩＭ－３及びヒトＰＤ－１との結合活性（ＥＬＩＳＡ）である。図３ａは、本発明の二重特異性抗体の抗ＴＩＭ－３抗体の部分に使用されるのはａｂ６配列であり、ＥＬＩＳＡではａｂ６の完全な抗体を対照とした。
【図3b】図３ｂは本発明の二重特異性抗体のヒトＴＩＭ－３及びヒトＰＤ－１との結合活性（ＥＬＩＳＡ）である。図３ｂは、二重特異性抗体の抗Ｔｉｍ－３抗体部分に使用されるのはａｂ３２の抗体配列であり、ＥＬＩＳＡではａｂ３２の完全な抗体を対照とした。
【図3c】図３ｃは本発明の二重特異性抗体のヒトＴＩＭ－３及びヒトＰＤ－１との結合活性（ＥＬＩＳＡ）である。図３ｃは、本発明の二重特異性抗体の抗ＰＤ－１抗体の部分に使用されるのはＮｉｖｏの抗体配列であり、ＥＬＩＳＡではＮｉｖｏの完全な抗体を対照とした。
【図3d】図３ｄは本発明の二重特異性抗体のヒトＴＩＭ－３及びヒトＰＤ－１との結合活性（ＥＬＩＳＡ）である。図３ｄは、二重特異性抗体の抗ＰＤ－１抗体部分に使用されるのはＢａ０８の抗体配列であり、ＥＬＩＳＡではＢａ０８の完全な抗体を対照とした。
【発明を実施するための形態】
【0047】
［具体的な実施形態］
以下、実施例の形によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を記載された実施例の範囲内に限定されるわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法及び条件、或いは商品の説明書に従って選ばれる。
以下、実施例の形によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を記載された実施例の範囲内に限定されるわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法及び条件、或いは商品の説明書に従って選ばれる。
【0048】
実施例１ 抗原、抗体のクローニング、発現及び精製
本発明で使用されるヒトＴＩＭ－３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質、－ｈｉｓタグタンパク質は本発明によってクローニング、発現及び精製して得られた。一部は以下の異なる会社から購入された：ＴＩＭ－３－ｈｉｓ（カタログ番号：ＴＭ３－Ｈ５２２９）、ＴＩＭ－３－ｈＦｃ（カタログ番号：ＴＭ３－Ｈ５２５８）は北京ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入された。ＴＩＭ－３－ｈｉｓ－ｈＦｃは北京Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入され、カタログ番号：１０３９０－Ｈ０３Ｈである。
本発明で使用されるヒトＴＩＭ－３、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１細胞外領域－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質、－ｈｉｓタグタンパク質は本発明によってクローニング、発現及び精製して得られた。一部は以下の異なる会社から購入された：ＴＩＭ－３－ｈｉｓ（カタログ番号：ＴＭ３－Ｈ５２２９）、ＴＩＭ－３－ｈＦｃ（カタログ番号：ＴＭ３－Ｈ５２５８）は北京ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入された。ＴＩＭ－３－ｈｉｓ－ｈＦｃは北京Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社から購入され、カタログ番号：１０３９０－Ｈ０３Ｈである。
【0049】
本発明で使用される抗体は、組み換え抗体、二重特異性抗体、Ｔｉｍ－３陽性対照抗体ＡＢＴＩＭ３（配列はＵＳ２０１５０２１８２７４Ａ１における配列が配列番号３４で示される重鎖、配列が配列番号２２で示される軽鎖からのものである）を含み、以下の実施例において、陽性対照又は陽性抗体又は対照抗体と略す。ＰＤ－１抗体Ｎｉｖｏ （Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ／Ｏｐｉｄｉｖｏ、配列が公開文献、例えばｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ、又はＷＯ２０１３０１９９０６からのものである）、ＰＤ－１抗体Ｐｅｍ （Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ／Ｋｅｙｔｒｕｄａ、配列がｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａからのものである）、ＰＤ－１抗体Ｂａ０８（配列が特許ＣＮ２０１４１０３６９３００、ＷＯ２０１６０１５６８５Ａ１からのものである）は、クローニング、発現及び精製がいずれも本発明によって完成される。
【0050】
発現・クローニングに使用されるベクターはｐＴＴ５ベクター（Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ，Ｃａｔ＃： １０２７６２）である。すべてのタンパク質の発現（組み換えタンパク質を含む）は、抗体の軽・重鎖がいずれもｐＴＴ５ベクターでＨＥＫ２９３Ｅ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ． Ｎｏ． １１６２５０１９）に一過性形質移入して発現させた後、精製して得られた。
【0051】
具体的に、２９３細胞はＧｉｂｃｏ ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃ １２３３８０１８）培地において増幅培養された。一過性形質移入の前、細胞濃度が６～８×１０５細胞／ｍｌになるように調整し、１％ ＦＢＳ（Ａｕｓ Ｇｅｎｅ Ｘ ＦＢＳ Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ プロバイダー：ＡｕｓＧｅｎｅＸ，Ｃｈｉｎａ，Ｃａｔ＃ ＦＢＳＳＡ５００－Ｓ）、３７℃ ８％ ＣＯ２のシェーカーで２４ｈ培養し、再度顕微鏡で検出したところ、生存率が＞９５％であり、細胞濃度が１．２×１０６ 細胞／ｍｌであった。
【0052】
３００ｍｌの培養系細胞を調製し、１５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ＃３１９８５０７０）に重鎖、軽鎖のプラスミドを１５０μｇずつ溶解させ（組み換えタンパク質の場合、単一のプラスミドの使用量が３００μｇである）、０．２２μｍでろ過して除菌をした。さらに１５ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭに１ｍｇ／ｍｌ ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃａｔ＃ ２３９６６－２）を６００μｌ入れた後、５ｍｉｎ静置した。ＰＥＩをゆっくりプラスミドに入れ、室温で１０ｍｉｎインキュベートし、培養瓶を揺らしながらゆっくりプラスミドＰＥＩ混合溶液を入れ、３７℃ ８％ ＣＯ２のシェーカーで５日培養してサンプルを収集し、３３００Ｇで１０ｍｉｎ遠心して上清を取って精製した。
【0053】
抗体又は－Ｆｃ融合タンパク質の精製：サンプルを高速遠心分離して不純物を除去し、ＰＢＳ（ｐＨ：７．４）でプロテインＡ（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ＃ ７１－５０２０－９１ ＡＥ）を含有する重力カラム（生工生物，Ｃａｔ＃ Ｆ５０６６０６－０００１）を平衡化し、２～５倍カラム体積で洗浄した。サンプルにカラムを通させた。５～１０倍カラム体積のＰＢＳ（生工生物，Ｃａｔ＃Ｂ５４８１１７－０５００）でカラムを洗浄した。さらに０．１Ｍ ｐＨが３．５の酢酸で目的のタンパク質を溶離させた後、ｐＨ ８．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌで中性に調整し、マイクロプレートリーダーで濃度を測定し、分注して使用に備えて保存した。
【0054】
Ｈｉｓタグタンパク質の精製：サンプルを高速遠心分離して不純物を除去した。ニッケルカラム（Ｎｉ ｓｍａｒｔ ｂｅａｄｓ ６ＦＦ常州天地人和生物科技有限公司 Ｃａｔ＃ ＳＡ０３６０１０ ）の平衡化：１０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ ｐＨ７．４溶液でニッケルカラムを平衡化し、２～５倍カラム体積で洗浄した。サンプルの上清をカラムにかけた。不純物タンパク質の溶離：１０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ ｐＨ７．４溶液でクロマトグラフィーカラムを洗い、非特異的に結合した不純物タンパク質を除去し、そして流出液を収集した。２５０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）で目的のタンパク質を溶離させた。緩衝液の置換：溶離させた目的のタンパク質に限外ろ過チューブを通させて１２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し（限外ろ過チューブＭｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃａｔ＃ＵＦＣ５００３０８）、さらに１ｍｌのＰＢＳを追加し、濃度を測定し、分注し保存して使用に備えた。
【0055】
本発明で発現される組み換えタンパク質の配列は以下の通りである。
ヒトＴＩＭ－３配列の詳細はＧｅｎＢａｎｋ：Ｑ８ＴＤＱ０．３の２２～１９９位のアミノ酸を参照し、－ｈＩｇＧ１ Ｆｃ又は－ｈｉｓタグと融合した。本明細書におけるＧｅｎＢａｎｋ登録番号とは、通常、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅである。
ヒトＴＩＭ－３配列の詳細はＧｅｎＢａｎｋ：Ｑ８ＴＤＱ０．３の２２～１９９位のアミノ酸を参照し、－ｈＩｇＧ１ Ｆｃ又は－ｈｉｓタグと融合した。本明細書におけるＧｅｎＢａｎｋ登録番号とは、通常、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅである。
【0056】
アカゲザル（Ｍａｃａｃａ）ＴＩＭ－３タンパク質配列の登録番号の詳細はＧｅｎＢａｎｋ： ＥＨＨ５４７０３．１を参照する。
キヌザル（Ｍａｒｍｏｓｅｔ）ＴＩＭ－３タンパク質配列の登録番号の詳細はＧｅｎＢａｎｋ： ＸＰ＿００８９８２２０３．１を参照する。
キヌザル（Ｍａｒｍｏｓｅｔ）ＴＩＭ－３タンパク質配列の登録番号の詳細はＧｅｎＢａｎｋ： ＸＰ＿００８９８２２０３．１を参照する。
【0057】
ＮｉｖｏＶＬ （Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ／Ｎｉｖｏ－軽鎖可変領域）の配列はｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａにおけるＮｉｖｏｌｕｍａｂ抗体の軽鎖配列の前の１０７のアミノ酸であり、ＮｉｖｏＶＨ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ 重鎖可変領域）の配列はｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａにおけるＮｉｖｏｌｕｍａｂ抗体の重鎖配列の前の１１３のアミノ酸である。
【0058】
Ｂａ０８ＶＬ（Ｂａ０８軽鎖可変領域）の配列は中国特許出願ＣＮ２０１４１０３６９３００の配列表における配列番号６であり、Ｂａ０８ＶＨ （Ｂａ０８重鎖可変領域）の配列は中国特許出願ＣＮ２０１４１０３６９３００の配列表における配列番号４である。
【0059】
ＰｅｍＶＬ （Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ 軽鎖可変領域）の配列はｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａにおけるＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ抗体の軽鎖配列の前の１１１のアミノ酸であり、ＰｅｍＶＨ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ重鎖可変領域）の配列はｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａにおけるＰｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ抗体の重鎖配列の前の１２０のアミノ酸である。
【0060】
ヒト抗体の軽鎖定常領域（κ鎖）の配列は中国出願ＣＮ２０１７１０３４８６９９．４の配列番号２１であり、ヒト抗体の重鎖定常領域（ｈＩｇＧ４）の配列は中国出願ＣＮ２０１７１０３４８６９９．４の配列番号２２である。
【0061】
本発明で発現される完全な抗体は、軽鎖及び重鎖からなる。軽鎖は上記の任意の軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域のκ鎖（λ鎖でもよい）からなり、重鎖は上記の任意の重鎖可変領域及び重鎖定常領域のｈＩｇＧ４（ｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ２、ｈＩｇＧ３でもよい）からなる。
【0062】
実施例２ 抗ＴＩＭ－３抗体結合のＥＬＩＳＡ実験
ｐＨが７．４のＰＢＳ緩衝液でヤギ抗ｈＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ，１０９－００５－００８）を１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に入れ、３７℃インキュベーターで２時間置いた。（或いは、直接に抗原ＴＩＭ－３で、０．５μｇ／ｍｌでプレートを被覆した後、直接被験抗体を入れた）。液を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％脱脂牛乳（光明脱脂粉乳）のブロッキング液を２００μｌ／ウェルで入れ、３７℃インキュベーターで２．５時間インキュベートするか、４℃で一晩（１６～１８時間）置くことでブロッキングした。ブロッキング液を捨て、そしてＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨが７．４のＰＢＳ含有０．０５％ツイン－２０）でプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルで０．５μｇ／ｍｌのＴＩＭ－３－ｈＦｃ（実施例１）を入れ、３７℃インキュベーターで２時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＰＢＳＴでプレートを６回洗浄した後、５０μｌ／ウェルで上清（被験抗体を含む）又は異なる濃度の被験抗体を入れ、３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１：２５００で希釈されたＨＲＰで標識された二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１５－０３５－００３）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で１０～１５ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＭＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＥＣ５０を計算し、或いは結合活性の高いクローンを選択した。
ｐＨが７．４のＰＢＳ緩衝液でヤギ抗ｈＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ，１０９－００５－００８）を１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に入れ、３７℃インキュベーターで２時間置いた。（或いは、直接に抗原ＴＩＭ－３で、０．５μｇ／ｍｌでプレートを被覆した後、直接被験抗体を入れた）。液を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％脱脂牛乳（光明脱脂粉乳）のブロッキング液を２００μｌ／ウェルで入れ、３７℃インキュベーターで２．５時間インキュベートするか、４℃で一晩（１６～１８時間）置くことでブロッキングした。ブロッキング液を捨て、そしてＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨが７．４のＰＢＳ含有０．０５％ツイン－２０）でプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルで０．５μｇ／ｍｌのＴＩＭ－３－ｈＦｃ（実施例１）を入れ、３７℃インキュベーターで２時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＰＢＳＴでプレートを６回洗浄した後、５０μｌ／ウェルで上清（被験抗体を含む）又は異なる濃度の被験抗体を入れ、３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１：２５００で希釈されたＨＲＰで標識された二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１５－０３５－００３）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で１０～１５ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＭＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＥＣ５０を計算し、或いは結合活性の高いクローンを選択した。
【0063】
実施例３ 抗ヒトＴＩＭ－３抗体のヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷活性実験（抗ヒトＴＩＭ－３抗体のヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性の実験）
ヒトＮＫ細胞はヒト末梢血の単核球（ＰＢＭＣ）由来のものであり、ＰＢＭＣは健常者によって献血された末梢血由来のものであり、本発明によって分離・抽出された。ＰＢＭＣは２．５×１０５個細胞／ウェルで、Ｋ５６２（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ－２４３（商標）、代理：上海素爾生物科技有限公司）は５×１０４個細胞／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５９９）に敷いた。被験ハイブリドーマ上清抗体、又は精製抗体を９６ウェル細胞プレートに入れ、３７℃インキュベーターで６時間インキュベートした後、ＬＤＨ検出キット（上海同仁生物科技有限公司、カタログ番号：ＣＫ１２）を使用し、説明書に従って検出し、ＭＭＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダーによって４９０ｎｍにおける吸収値（ＯＤ）を読み取り、ＬＤＨの放出量変化の百分率を計算し、被験サンプルのヒトＮＫ細胞（単なるＮＫ細胞の代わりに高投与量のヒトＰＢＭＣを使用した）の腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性の強さを比較した。
ヒトＮＫ細胞はヒト末梢血の単核球（ＰＢＭＣ）由来のものであり、ＰＢＭＣは健常者によって献血された末梢血由来のものであり、本発明によって分離・抽出された。ＰＢＭＣは２．５×１０５個細胞／ウェルで、Ｋ５６２（ＡＴＣＣカタログ番号：ＣＣＬ－２４３（商標）、代理：上海素爾生物科技有限公司）は５×１０４個細胞／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３５９９）に敷いた。被験ハイブリドーマ上清抗体、又は精製抗体を９６ウェル細胞プレートに入れ、３７℃インキュベーターで６時間インキュベートした後、ＬＤＨ検出キット（上海同仁生物科技有限公司、カタログ番号：ＣＫ１２）を使用し、説明書に従って検出し、ＭＭＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダーによって４９０ｎｍにおける吸収値（ＯＤ）を読み取り、ＬＤＨの放出量変化の百分率を計算し、被験サンプルのヒトＮＫ細胞（単なるＮＫ細胞の代わりに高投与量のヒトＰＢＭＣを使用した）の腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性の強さを比較した。
【0064】
実施例４ 本発明の抗体のＢｉａｃｏｒｅによる親和力（ＫＤ）の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）装置によって本発明の抗体と抗原（ヒトＴＩＭ－３）の親和力を測定した。ｐＨ ７．４の稼働緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％のＰ２０）を使用した（前記百分率は体積比である）。まず、プロテインＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃ ２１１８１）をバイオセンサーチップＣＭ５（Ｃａｔ． ＃ ＢＲ－１００５ －３０，ＧＥ）にカップリングし、チップを新しく調製された５０ｍＭ ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）及び２００ｍＭ ＥＤＣ［１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ］で活性化させた後、ｐＨ４．０の１０ ｍＭ ＮａＡＣで調製された１０μｇ／ｍｌのプロテインＡを注いだ。被験抗体の濃度は５μｇ／ｍｌであり、抗原ＴＩＭ－３－ｈｉｓ（又はＰＤ－１－ｈｉｓ）の濃度勾配は０ｎＭ、１．８７５ｎＭ、３．７５ｎＭ、７．５ｎＭ、１５ｎＭ及び３０ｎＭであり、流速が３０μｌ／分であり、結合時間が１８０秒であり、溶離時間が３００秒であった。実験後、１０ｍＭ グリシン－ＨＣｌ、ｐＨ １．５、３０μｌ／ｍｉｎ、３０ｓでチップを洗浄した。実験データはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０（ＧＥ）ソフトによって１：１のラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）モデルでフィッティングし、親和力の数値ＫＤを得た。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）装置によって本発明の抗体と抗原（ヒトＴＩＭ－３）の親和力を測定した。ｐＨ ７．４の稼働緩衝液ＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．０５％のＰ２０）を使用した（前記百分率は体積比である）。まず、プロテインＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ＃ ２１１８１）をバイオセンサーチップＣＭ５（Ｃａｔ． ＃ ＢＲ－１００５ －３０，ＧＥ）にカップリングし、チップを新しく調製された５０ｍＭ ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）及び２００ｍＭ ＥＤＣ［１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１－ｅｔｈｙｌ－３－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ］で活性化させた後、ｐＨ４．０の１０ ｍＭ ＮａＡＣで調製された１０μｇ／ｍｌのプロテインＡを注いだ。被験抗体の濃度は５μｇ／ｍｌであり、抗原ＴＩＭ－３－ｈｉｓ（又はＰＤ－１－ｈｉｓ）の濃度勾配は０ｎＭ、１．８７５ｎＭ、３．７５ｎＭ、７．５ｎＭ、１５ｎＭ及び３０ｎＭであり、流速が３０μｌ／分であり、結合時間が１８０秒であり、溶離時間が３００秒であった。実験後、１０ｍＭ グリシン－ＨＣｌ、ｐＨ １．５、３０μｌ／ｍｉｎ、３０ｓでチップを洗浄した。実験データはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０（ＧＥ）ソフトによって１：１のラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）モデルでフィッティングし、親和力の数値ＫＤを得た。
【0065】
実施例５ ＰＤ－１抗体とＰＤ－１タンパク質の結合のＥＬＩＳＡ実験
ｐＨが７．４のＰＢＳ緩衝液で実施例１で発現されたＰＤ－１を１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に入れ、３７℃インキュベーターで２時間置いた。液を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％脱脂牛乳（上海生工生物工程有限公司，Ａ６００６６９－０２５０）のブロッキング液を２００μｌ／ウェルで入れ、３７℃インキュベーターで３時間インキュベートするか、４℃で一晩（１６～１８時間）置くことによりブロッキングした。ブロッキング液を捨て、そしてＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４のＰＢＳ０．０５％ ツイン－２０を含有）で５回プレートを洗浄した後、５０μｌ／ウェルで１％ ＢＳＡで５倍連続希釈されたＰＤ－１抗体又は被験抗体を入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１：２５００で希釈されたＨＲＰで標識された二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１５－０３５－００３）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で５～１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＭＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＥＣ５０を計算した。
ｐＨが７．４のＰＢＳ緩衝液で実施例１で発現されたＰＤ－１を１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に入れ、３７℃インキュベーターで２時間置いた。液を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％脱脂牛乳（上海生工生物工程有限公司，Ａ６００６６９－０２５０）のブロッキング液を２００μｌ／ウェルで入れ、３７℃インキュベーターで３時間インキュベートするか、４℃で一晩（１６～１８時間）置くことによりブロッキングした。ブロッキング液を捨て、そしてＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４のＰＢＳ０．０５％ ツイン－２０を含有）で５回プレートを洗浄した後、５０μｌ／ウェルで１％ ＢＳＡで５倍連続希釈されたＰＤ－１抗体又は被験抗体を入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１：２５００で希釈されたＨＲＰで標識された二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１５－０３５－００３）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で５～１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＭＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＥＣ５０を計算した。
【0066】
実施例６ ＰＤ－１抗体のＰＤ－１タンパク質とそのリガンドＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する実験（ブロッキングアッセイ、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙ）
ｐＨが７．４のＰＢＳ緩衝液で実施例１で発現されたＰＤ－１を２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に入れ、３７℃インキュベーターで２時間置いた。液を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％脱脂牛乳（上海生工生物工程有限公司，Ａ６００６６９－０２５０）のブロッキング液を２００μｌ／ウェルで入れ、３７℃インキュベーターで３時間インキュベートするか、４℃で一晩（１６～１８時間）置くことでブロッキングした。ブロッキング液を捨て、そしてＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４のＰＢＳ含有る０．０５％ ツイン－２０）で５回プレートを洗浄した後、各ウェルに２５μｌの１％ ＢＳＡで５倍連続希釈された被験ＰＤ－１抗体又は被験抗体及び２５μｌの最終濃度が１０μｇ／ｍｌのビオチンで標識されたＰＤ－Ｌ１（本発明によって発現・精製された）を入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１：１０００で希釈されたＨＲＰで標識された二次抗体（ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社，Ｍ０００９１）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で５～１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＭＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＩＣ５０を計算した。
ｐＨが７．４のＰＢＳ緩衝液で実施例１で発現されたＰＤ－１を２μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＣＬＳ３５９０－１００ＥＡ）に入れ、３７℃インキュベーターで２時間置いた。液を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％脱脂牛乳（上海生工生物工程有限公司，Ａ６００６６９－０２５０）のブロッキング液を２００μｌ／ウェルで入れ、３７℃インキュベーターで３時間インキュベートするか、４℃で一晩（１６～１８時間）置くことでブロッキングした。ブロッキング液を捨て、そしてＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４のＰＢＳ含有る０．０５％ ツイン－２０）で５回プレートを洗浄した後、各ウェルに２５μｌの１％ ＢＳＡで５倍連続希釈された被験ＰＤ－１抗体又は被験抗体及び２５μｌの最終濃度が１０μｇ／ｍｌのビオチンで標識されたＰＤ－Ｌ１（本発明によって発現・精製された）を入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１：１０００で希釈されたＨＲＰで標識された二次抗体（ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社，Ｍ０００９１）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で５～１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＭＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＩＣ５０を計算した。
【0067】
ビオチン標識のキットはＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２で、東仁化学科技（上海）有限公司から購入され、カタログ番号はＬＫ０３である。操作方法は説明書に従って行われ、標識された抗体はＭｕｌｔｉｓｋａｎ ＧＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）マイクロプレートリーダーによって濃度を検出して使用された。
【0068】
実施例７ 抗ヒトＴＩＭ－３抗体の発見
本発明では、ヒトＴＩＭ－３を抗原とし、マウスを免疫させ、異なる融合をスクリーニングし（ｍａｂ５、ｍａｂ１５、ｍａｂ３５及びｍａｂ５０など）、数十万のハイブリドーマを得、これらのハイブリドーマからさらにスクリーニングして好適なクローンを得た。非常に意外なことに、先後に多くの異なるハイブリドーマ融合から、いくつかのモノクローナル細胞株をスクリーニングし、それぞれ融合番号はｍａｂ５、ｍａｂ１５、ｍａｂ３５及びｍａｂ５０などで、中国特許出願ＣＮ２０１７１０３４８６９９．４及びＣＮ２０１８１０１９７８８５．７を参照する。
本発明では、ヒトＴＩＭ－３を抗原とし、マウスを免疫させ、異なる融合をスクリーニングし（ｍａｂ５、ｍａｂ１５、ｍａｂ３５及びｍａｂ５０など）、数十万のハイブリドーマを得、これらのハイブリドーマからさらにスクリーニングして好適なクローンを得た。非常に意外なことに、先後に多くの異なるハイブリドーマ融合から、いくつかのモノクローナル細胞株をスクリーニングし、それぞれ融合番号はｍａｂ５、ｍａｂ１５、ｍａｂ３５及びｍａｂ５０などで、中国特許出願ＣＮ２０１７１０３４８６９９．４及びＣＮ２０１８１０１９７８８５．７を参照する。
【0069】
本実施例に記載の本発明のＴＩＭ－３抗体の発見過程は、抗原免疫からハイブリドーマ融合でスクリーニングして得られたｍａｂ５、ｍａｂ１５及びｍａｂ３５などの異なる融合ハイブリドーマクローンをさらにスクリーニングし、最適化し、モノクローナル細胞株を得ることを含む。中からマウス由来抗体を抽出してコンピューターによる最適化、ヒト化設計などでヒト化抗体を得、最適化し、スクリーニングして得られた好適なヒト化抗体はマウス由来抗体と同様の良い結合活性を維持する。結合活性は本発明用陽性対照よりも良い。より意外なことに、ヒト血細胞の殺傷活性を活性化させ、単独で又はＰＤ－１抗体と併用してヒト血細胞Ｔ細胞を活性化させる活性が良い。そして、抗原との結合は快結合、慢解離の特性を示し、医薬開発、腫瘍治療に非常に優れた優勢を提供する。
【0070】
具体的に、実験用ＳＪＬ白マウス（雌、４週齢）は北京ＶＩＴＡＬ ＲＩＶＥＲ実験動物技術有限公司から購入され、動物生産許可証番号：ＳＣＸＫ（京） ２０１６－００１１である。マウスを購入した後、実験室の環境で１週間飼育し、昼夜で明暗の周期を調節し、温度は２０～２５℃であり、湿度は４０～６０％であった。マウスは３匹／群／籠で分けた。実施例１で用意された抗原で免疫させた。アジュバントはＱｕｉｃｋａｎｔｉｂｏｄｙ（北京博奥龍免疫技術有限公司（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｂｉｏｄｒａｇｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）、カタログ番号ＫＸ０２１００４１）又はＴｉｔｅｒｍａｘ（ｓｉｇｍａ，Ｔ２６８４－１ＭＬ）である。抗原とアジュバントの比率は１：１であった。１００μｌ／１０μｇ／匹で、初めて免疫させ、脛に筋肉内注射した。融合の３日前に、１００μｌ／２５μｇ／匹で強化免疫させた。免疫時間は０、１４、２８、４２、５６及び５９日目であった（免疫強化）。それぞれ２２、３６、５０及び６４日目に、上記実施例３のＥＬＩＳＡ方法によってマウス血清抗体の力価を検出し、血清における抗体力価が高くて力価がプラトー期にあるマウスを選んで脾臓細胞の融合を行い、脾臓リンパ球を骨髄腫細胞Ｓｐ２／０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－８２８７（商標））と融合して得られたハイブリドーマ細胞を９６ウェルプレートに敷き、実施例３のＥＬＩＳＡ方法によって好適なクローンをスクリーニングした。
【0071】
最初の好適なクローンに対し、さらに有限希釈を行い、毎回の希釈後、７～１０日でクローンが増殖すると、上記実施例２のＥＬＩＳＡ方法、及び実施例３のＮＫ実験方法によって各クローンによって分泌される抗体（上清）の結合及びＮＫ細胞の活性を検出した。複数の有限希釈後、得られたモノクローナル細胞株は、分泌上清が良い結合活性及びヒトＮＫ細胞の活性を維持した。このモノクローナル細胞株から抗体配列を抽出し、本発明に使用される好適なマウス由来抗体配列を得た。
【0072】
実施例８ マウス由来抗ヒトＴＩＭ－３抗体の配列の同定
ハイブリドーマから好適に得られたモノクローナル細胞株から抗体配列を抽出する過程は当業者によく使用される方法である。具体的に、上記モノクローナル細胞株を収集し、増幅培養した後、１×１０６個の細胞を取り、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５５９６－０１８）でＲＮＡを抽出し（キットの説明書の手順に従った）、抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、逆転写キットは生工生物技術（上海）股フン有限公司から購入され、Ｃａｔ ＃ Ｂ５３２４３５であった。逆転写して得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ増幅を行った。増幅産物をシークエンシングすることにより、ハイブリドーマのモノクローナル細胞株における抗体の軽・重鎖可変領域の塩基（コード）配列及びコードされる軽・重鎖のタンパク質配列を得た。使用されたプライマーはＮｏｖａｇｅｎによって発表されたマニュアルＴＢ３２６ Ｒｅｖ． Ｃ０３０８を参照する。本分野のＣＤＲ定義方法は下記表及びＣＣＧ定義により本発明の抗体のＣＤＲ配列を確認することを含む。
ハイブリドーマから好適に得られたモノクローナル細胞株から抗体配列を抽出する過程は当業者によく使用される方法である。具体的に、上記モノクローナル細胞株を収集し、増幅培養した後、１×１０６個の細胞を取り、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１５５９６－０１８）でＲＮＡを抽出し（キットの説明書の手順に従った）、抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、逆転写キットは生工生物技術（上海）股フン有限公司から購入され、Ｃａｔ ＃ Ｂ５３２４３５であった。逆転写して得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ増幅を行った。増幅産物をシークエンシングすることにより、ハイブリドーマのモノクローナル細胞株における抗体の軽・重鎖可変領域の塩基（コード）配列及びコードされる軽・重鎖のタンパク質配列を得た。使用されたプライマーはＮｏｖａｇｅｎによって発表されたマニュアルＴＢ３２６ Ｒｅｖ． Ｃ０３０８を参照する。本分野のＣＤＲ定義方法は下記表及びＣＣＧ定義により本発明の抗体のＣＤＲ配列を確認することを含む。
【0073】
【表1】
【0074】
実施例９ 本発明のＴＩＭ－３抗体のヒト化
本実施例には、本発明の抗体のヒト化の過程が記載され、当該過程及び方法は本分野の多くの文献で開示された方法によって行われた。
本実施例には、本発明の抗体のヒト化の過程が記載され、当該過程及び方法は本分野の多くの文献で開示された方法によって行われた。
【0075】
具体的に、抗体の番号付けシステムにより、上記実施例に記載のように、抗体の軽・重鎖のＣＤＲ領域を標識・識別した。マウス由来抗体の配列をヒト抗体種データベース（ｖ－ｂａｓｅ）と比較し、相同性の高いヒト抗体種を見つけ、例えば本発明のマウス由来モノクローナル抗体の軽鎖と相同性の高いヒト抗体種はＩＧＫＶ１Ｄ－３９＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ１－１２＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ１－３９＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ１－１２＊０２（Ｆ）、ＩＧＫＶ１－１７＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ１－２７＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ１－３９＊０２（Ｐ）、ＩＧＫＶ１－６＊０１（Ｆ）、ＩＧＫＶ１－ＮＬ１＊０１（Ｆ）及びＩＧＫＶ１Ｄ－１２＊０１（Ｆ）などを含み、好適に相同性、種の好適な頻度などの要素で、好ましくはＩＧＫＶ１－３９＊０１（Ｆ）はヒト化用種の軽鎖である。軽鎖のＪ遺伝子はｈＪＫ１、ｈＪＫ２．１、ｈＪＫ２．２、ｈＪＫ２．３、ｈＪＫ２．４及びｈＪＫ３などから相同性が高く、配列アラインメントではｈＪＫ２．１が好ましい。抗体の重鎖と相同性が高いヒト抗体種はＩＧＨＶ３－７＊０１（Ｆ）、ＩＧＨＶ３－７＊０２（Ｆ）、ＩＧＨＶ３－７＊０３（Ｆ）、ＩＧＨＶ３－４８＊０１（Ｆ）、ＩＧＨＶ３－４８＊０２（Ｆ）、ＩＧＨＶ３－４８＊０３（Ｆ）、ＩＧＨＶ３－２１＊０１（Ｆ）、ＩＧＨＶ３－２１＊０２（Ｆ）、ＩＧＨＶ３－２１＊０３（Ｆ）などがあり、ＩＧＨＶ３－２１＊０１（Ｆ）が好ましい。抗体の重鎖のＪ遺伝子及びヒト抗体種ｈＪＨ１、ｈＪＨ２、ｈＪＨ３．１、ｈＪＨ３．２、ｈＪＨ４．１、ｈＪＨ４．２及びｈＪＨ４．３などであり、ｈＪＨ４．１が好ましい。マウス由来抗体のＣＤＲ領域を、選ばれたヒト抗体種の軽・重鎖の鋳型に移植し、さらにＩｇＧの軽・重鎖の定常領域と組み換えた。その後、コンピューターでシミュレーションされた抗体の３次元構造を元に、残基を包埋し、ＣＤＲ領域と直接相互作用がある残基、及びＶＬとＶＨの配座に大きく影響する残基に対して復帰突然変異を行い、そしてＣＤＲ領域の化学的に不安定なアミノ酸残基を最適化し、本発明の最適化された抗ＴＩＭ－３ヒト化抗体分子を得た。
【0076】
実施例１０ 本発明のＴＩＭ－３ヒト化抗体ａｂ６の配列の解析
上記実施例７～９の方法によってハイブリドーマｍａｂ５から得られた単一クローンから抽出されたマウス由来抗体をヒト化及び最適化して好適なヒト化抗体ａｂ６を得た。
上記実施例７～９の方法によってハイブリドーマｍａｂ５から得られた単一クローンから抽出されたマウス由来抗体をヒト化及び最適化して好適なヒト化抗体ａｂ６を得た。
【0077】
本発明のｍａｂ５ヒト化最適化抗体ａｂ６の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の好適な配列はそれぞれ以下のものである。
ａｂ６ＶＬ：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＧＩＳＳＮＩＧＷＬＱＱＫＰＧＫＡＦＫＧＬＩＹＱＧ ＳＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＦＡＱＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１４）
ａｂ６ＶＨ：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ ＡＮＩＮＹＤＧＳＮＴＹＹＬＤＳＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＹＹＹＧＧＮＹＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）
上記抗体は上記表１及びＣＣＧの方法によってそのＣＤＲ領域を表２に示すように定義した。
ａｂ６ＶＬ：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＧＩＳＳＮＩＧＷＬＱＱＫＰＧＫＡＦＫＧＬＩＹＱＧ ＳＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＦＡＱＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１４）
ａｂ６ＶＨ：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶ ＡＮＩＮＹＤＧＳＮＴＹＹＬＤＳＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＹＹＹＧＧＮＹＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１３）
上記抗体は上記表１及びＣＣＧの方法によってそのＣＤＲ領域を表２に示すように定義した。
【0078】
【表2】
【0079】
【表3】
【0080】
実施例１１ ＴＩＭ－３ヒト化抗体ａｂ３２の配列の解析
上記実施例７～９の方法によってハイブリドーマｍａｂ１５から得られた単一クローンから抽出されたマウス由来抗体をヒト化した後、最適化し（例えば異なる復帰突然変異部位の組み合わせであり、下記表を参照する）、好適なヒト化抗体ａｂ３２を得た。
上記実施例７～９の方法によってハイブリドーマｍａｂ１５から得られた単一クローンから抽出されたマウス由来抗体をヒト化した後、最適化し（例えば異なる復帰突然変異部位の組み合わせであり、下記表を参照する）、好適なヒト化抗体ａｂ３２を得た。
【0081】
ｍａｂ１５ヒト化最適化抗体ａｂ３２の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の好適な配列はそれぞれ以下のものである。
ａｂ３２ＶＬ：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＮ ＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＧＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１６）
ａｂ３２ＶＨ：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷ ＶＳＳＩＮＹＤＧＲＮＴＹＹＬＤＳＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＹＹＹＧＳＳＰＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５）
上記抗体は上記表１及びＣＣＧの方法によってそのＣＤＲ領域を下記表のように定義した。
ａｂ３２ＶＬ：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＮＩＹＳＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＮ ＡＫＴＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＧＴＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１６）
ａｂ３２ＶＨ：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷ ＶＳＳＩＮＹＤＧＲＮＴＹＹＬＤＳＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＹＹＹＧＳＳＰＮＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１５）
上記抗体は上記表１及びＣＣＧの方法によってそのＣＤＲ領域を下記表のように定義した。
【0082】
【表4】
【0083】
【表5】
【0084】
実施例１３ ＴＩＭ－３ヒト化抗体ａｂ６及びａｂ３２の活性評価（当該実施例で言及した「陽性抗体」は上記で言及した対照抗体ＡＢＴＩＭ３である）
上記実施例９で得られたヒト化抗体の軽・重鎖可変領域に対して実施例１の方法によってクローニング、発現・精製を行って完全な抗体を得た。これらの可変領域は異なる軽・重鎖定常領域と組み合わせることができ、本発明はＩｇＧ４－κ鎖（ｈＩｇＧ４）の定常領域が好ましい。発現された好適なヒト化抗体ａｂ６及びａｂ３２の活性を前記実施例によってそれぞれ検出した評価結果は以下の通りである。
上記実施例９で得られたヒト化抗体の軽・重鎖可変領域に対して実施例１の方法によってクローニング、発現・精製を行って完全な抗体を得た。これらの可変領域は異なる軽・重鎖定常領域と組み合わせることができ、本発明はＩｇＧ４－κ鎖（ｈＩｇＧ４）の定常領域が好ましい。発現された好適なヒト化抗体ａｂ６及びａｂ３２の活性を前記実施例によってそれぞれ検出した評価結果は以下の通りである。
【0085】
【表6】
【0086】
表６の結果から、ａｂ３２には復帰突然変異がなく、即ち、マウス由来抗体の活性を維持し、つまり、当該抗体は完全にヒト化されたものであり、一方、ａｂ６の軽・重鎖はいずれも復帰突然変異があったことが示された。
【0087】
上記Ｂｉａｃｏｒｅ実施例の方法により、本発明の抗体と抗原の親和力（ＫＤ）を検出したところ、結果を以下に示す。
【0088】
【表7】
【0089】
【表8】
【0090】
表８から、本発明のヒト化抗体ａｂ６、ａｂ３２はヒトＴＩＭ－３といずれも良い結合活性を有し、かつ陽性抗体（対照分子、Ｒｅｆ）よりも良いことが示された。ａｂ６はアカゲザルＴＩＭ－３とは全然結合しなかった。ａｂ３２はアカゲザルＴＩＭ－３と非常に弱い結合活性を有し、検出できない（ＮＤ）レベルに近い。これは陽性分子と異なり、陽性分子はアカゲザルＴＩＭ－３と良い結合活性を有し、ＥＣ５０＝０．１４ｎＭであった。
【0091】
公開特許ＵＳ２０１７０１１４１３５Ａ１におけるＰＤ－１／ＴＩＭ－３二重特異性抗体に使用されるＴＩＭ－３抗体（当該特許の表２ａを参照する）はアカゲザルＴＩＭ－３（Ｍａｃａｃａ、即ち、特許で言及したｃｙＴｉｍ３で、特許の表２ａを参照する）とＢｉａｃｏｒｅによって結合（～１０－７ ～１０－８ Ｍ）が検出され、或いは「ｎｆ」（該当なしで、結合がなく、又は弱い可能性が高い）である。アカゲザルＴＩＭ－３に結合する抗体は本発明と異なる抗体で（本発明の抗体はアカゲザルＴＩＭ－３に結合せず、キヌザルＴＩＭ－３と強い結合がある）、ｎｆ抗体はいくつかあり、Ｔｉｍ３－００２８、Ｔｉｍ３－００３８を含み、ここで、Ｔｉｍ３－００２８は当該特許のｃｒｏｓｓｍａｂ二重特異性に使用されるＴＩＭ－３抗体であり、当該特許の実施例１８におけるｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用される二重特異性抗体を含む。さらに本発明の抗ＴＩＭ－３抗体の特徴（ヒトＴＩＭ－３と強く結合し、アカゲザルＴＩＭ－３と結合せず、キヌザルＴＩＭ－３と強く結合する）を確認するため、本発明では、ＵＳ２０１７０１１４１３５Ａ１における抗体Ｔｉｍ３－００２８及びＴｉｍ３－００３８を発現させた。その後、本発明の抗体と同時にアカゲザル、及びキヌザルＴＩＭ－３との活性の検出を行ったが、結果は下記表９及び図１に示す。
【0092】
【表9】
【0093】
上記結果から、陽性抗体はアカゲザルＴＩＭ－３とＥＣ５０＝０．０５ｎＭと高い結合活性を有し、本発明の抗体ａｂ６及びａｂ３２はアカゲザルＴＩＭ－３とほとんど結合しなかったか、非常に弱く結合し、検出できない（ＮＤ）レベルに近かったが（図１ａ）、この点において陽性抗体と異なることが分かる。公開特許ＵＳ２０１７０１１４１３５Ａ１におけるＴｉｍ３－００２８及びＴｉｍ３－００３８抗体もアカゲザルＴＩＭ－３と全然結合しなかった。一方、本発明の抗ＴＩＭ－３抗体（ａｂ６、ａｂ３２）は共通の特徴があり、キヌザルＴＩＭ－３と優れた結合活性を有し、それぞれ０．０５ｎＭ、０．０８ｎＭであり、陽性抗体（０．５１ｎＭ）よりも１０倍近く強かった。公開特許ＵＳ２０１７０１１４１３５Ａ１におけるＴｉｍ３－００２８抗体はキヌザルＴＩＭ－３とほとんど結合がなく（ＮＤ）、そのＥＣ５０＝３６．２ｎＭであり、これは本発明の抗体よりも５００倍以上弱く、２桁以上の差があり、Ｔｉｍ３－００３８はキヌザルＴＩＭ－３と全然結合しなかったが、図１ｂを参照する。
【0094】
また、ヒトＴＩＭ－３－ｈｉｓとのＥＬＩＳＡの結果から、Ｔｉｍ３－００２８は結合が非常に弱く（１１．６ｎＭ）、Ｔｉｍ３－００３８は結合が０．４４３ｎＭであり、同じ実験において本発明の抗体ａｂ６は０．１１ｎＭであったことが分かる。これによって、本発明の抗体はヒトＴＩＭ－３との結合がＴｉｍ３－００２８、Ｔｉｍ３－００３８の結合活性よりも３～１００倍以上優れることが示された。同時に、本発明でＥＬＩＳＡ方法によって検出されたＴｉｍ３－００２８のヒトＴＩＭ－３との結合活性がＴｉｍ３－００３８よりもずっと弱かったが、この結果はＵＳ２０１７０１１４１３５Ａ１で公開されたｂｉａｃｏｒｅデータとも一致する。本発明のＴＩＭ－３抗体はＴｉｍ３－００２８、Ｔｉｍ－００３８とともに実施例３の方法によって同時に行われたＮＫ実験の結果は下記表９ａに示す。
【0095】
【表10】
【0096】
表９ａの結果から、同じ抗体濃度において、陰性抗体のＮＫ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性の増加（抗体のない場合に対して）百分率が０．１９％であり、即ち、バックグラウンド（０％）レベルに近かったことが分かる。ａｂ６及びａｂ３２はいずれも優れた腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性を示し、それぞれ３．５５％及び５．２２％増加した。これはＴｉｍ３－００２８及びＴｉｍ３－００３８の活性よりも少なくとも４０％以上（［３．５５～２．５３］／２．５３）から２２０％以上（［５．２２～１．６１］／１．６１）強かった。
【0097】
上記結果から、本発明は陽性抗体とも異なり、公開特許ＵＳ２０１７０１１４１３５Ａ１におけるＴＩＭ－３抗体とも異なり、独特な結合特性及び結合部位を有することが分かる。本発明の抗体のこのような共有の特性は、これらの抗体のヒト以外の霊長類種における臨床前研究に異なるヒト以外の霊長類種の選択を提供する。
【0098】
また、本発明の好適な抗体ａｂ６、ａｂ３２は対照抗体と異なる抗原結合部位を有し、相応する抗体医薬の開発は異なる効果を示すことができ、これらの抗体のヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる機能活性（下記を参照する）によって証明された。
【0099】
実施例３の方法によって本発明の抗体のヒト血細胞の腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性を検出したが、結果は下記表に示す。
【0100】
【表11】
【0101】
上記結果から、ａｂ３２及び陽性対照は０μｇ／ｍｌの濃度において、基本的に活性を示さず（バックグランドに近い）、５μｇ／ｍｌの濃度において、ａｂ３２及び陽性対照はヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性がそれぞれ１２．６％及び５．９％であり、１０μｇ／ｍｌの濃度において、ａｂ３２及び陽性対照は活性がそれぞれ１４．９％及び１０．１％であったことが分かる。ａｂ３２は当該濃度において活性が飽和値に達したことが示された。同時に、本発明の抗体ａｂ３２は５μｇ／ｍｌにおけるヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性が１０μｇ／ｍｌにおける対照抗体に相当したことが示された。つまり、ａｂ３２はヒトＰＢＭＣを活性化させる活性が陽性対照よりも少なくとも１倍以上強かった。Ａｂ６も同様に陽性対照抗体よりも強いＰＢＭＣ殺傷活性を示したが、下記表１１に示す。
【0102】
【表12】
【0103】
表１１から、ａｂ６及び陽性対照は０μｇ／ｍｌの濃度において、基本的に活性を示さず（バックグランドの１．８％に近い）、５μｇ／ｍｌの濃度において、ａｂ６及び陽性対照はヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性がそれぞれ３．９７％及び３．９１％であり、１０μｇ／ｍｌの濃度において、ａｂ６及び陽性対照は活性がそれぞれ８．３３％及び３．９５％であったことが示された。陽性対照抗体は１０μｇ／ｍｌの濃度において活性が飽和値に達したことが示された。同時に、本発明の抗体ａｂ６は５μｇ／ｍｌにおけるヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性（３．９７％）が１０μｇ／ｍｌにおける対照抗体に相当した（３．９５％）ことが示された。つまり、ａｂ６はヒトＮＫを活性化させる活性が陽性対照よりも少なくとも１倍以上強かった。
【0104】
上記結果から、本発明の抗体ａｂ６及びａｂ３２は、独特で、陽性対照とも異なり、公開特許ＵＳ２０１７０１１４１３５Ａ１におけるＴＩＭ－３抗体とも異なるヒト及びキヌザルＴＩＭ－３に結合する特徴があり、そしてこれらの抗体は、さらに、陽性対照、Ｔｉｍ３－００２８及びＴｉｍ３－００３８のいずれよりも優れたヒトＮＫ細胞の腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性を有する。
【0105】
上記実施例１～１３（Ｔｉｍ３－００２８、Ｔｉｍ３－００３８の取り扱い以外）は、本出願者の中国特許出願ＣＮ２０１７１０３４８６９９．４及びＣＮ２０１８１０１９７８８５．７を参照する。
【0106】
実施例１４ 二重特異性抗体の設計における本発明のＴＩＭ－３抗体の使用
本発明の抗ＴＩＭ－３抗体はＰＤ－１を含むほかの様々な標的の抗体と様々な形で二重特異性抗体に設計することができる。設計される二重特異性抗体は、二重機能抗体とも呼ばれ、同時にＴＩＭ－３及びもう１つの標的をターゲティングすることができる。本発明では、ＴＩＭ－３標的及びＰＤ－１標的を例とし、いくつかの好適な設計プランで様々な好適な設計を得た。具体的な設計プランの一つは以下の通りである。
本発明の抗ＴＩＭ－３抗体はＰＤ－１を含むほかの様々な標的の抗体と様々な形で二重特異性抗体に設計することができる。設計される二重特異性抗体は、二重機能抗体とも呼ばれ、同時にＴＩＭ－３及びもう１つの標的をターゲティングすることができる。本発明では、ＴＩＭ－３標的及びＰＤ－１標的を例とし、いくつかの好適な設計プランで様々な好適な設計を得た。具体的な設計プランの一つは以下の通りである。
【0107】
【表13】
【0108】
上記表に示すように、軽鎖を含む配列及び重鎖を含む配列を構築する過程において、そのＮ末端にシグナルペプチド配列ＳＰが含まれており、発現後、シグナルペプチドが切断される。軽鎖を含む配列とは、軽鎖の配列以外、さらに、軽鎖の配列と連結したｓｃＦｖを含んでもよい。重鎖を含む配列とは、重鎖の配列以外、さらに、重鎖の配列と連結したｓｃＦｖを含んでもよい。
【0109】
上記Ｔ１はＰＤ－１抗体であり、Ｐｅｍ、Ｎｉｖｏ又はＢａ０８でもよい。Ｔ２は本発明のＴＩＭ－３抗体であり、例えばａｂ６又はａｂ３２である。Ｔ１（ｓｃＦｖ）はＰＤ－１抗体に対するｓｃＦｖ配列を表し、Ｔ２（ｓｃＦｖ）はＴＩＭ－３抗体のｓｃＦｖ配列を表す。（ｓｃＦｖ）ｎ１、（ｓｃＦｖ）ｎ２、（ｓｃＦｖ）ｎ３及び（ｓｃＦｖ）ｎ４におけるｎ１、ｎ２、ｎ３及びｎ４はそれぞれ自然数であり、０、１、２、３などでもよく、本発明の具体的な実施例において、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４のうち、少なくとも１つの数値は１であり、残りは０である。Ｌ１、Ｌ２はそれぞれ柔軟性リンカーであり、複数のＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）、即ち、（Ｇ４Ｓ）ｎでもよく、ｎは０～１０又は１０超であり、好ましくは１、２、３又は４である。
【0110】
Ｔ１（ｓｃＦｖ）及びＴ２（ｓｃＦｖ）は軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域の構造でもよく、重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域の構造でもよく（左から右はＮ末端からＣ末端である）、例えばａｂ６ＶＬ－リンカー－ａｂ６ＶＨ、ａｂ３２ＶＬ－リンカー－ａｂ３２ＶＨ、ａｂ６ＶＨ－リンカー－ａｂ６ＶＬ及びａｂ６ＶＨ－リンカー－ａｂ６ＶＬでもよい。ＶＬは、抗体の軽鎖可変領域の配列を表し、ＶＨは、抗体の重鎖可変領域の配列を表す。Ｌｃはヒト抗体κ型軽鎖定常領域又はλ型軽鎖定常領域であるため、本明細書において、ＶＬ－Ｌｃとは１本の完全な軽鎖であって、ＶＬ－κ及びＶＬ－λなどの形を含む。Ｈｃは重鎖定常領域であって、ヒト抗体の重鎖ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４などのサブタイプの定常領域を含み、ＶＨ－Ｈｃは１本の完全な重鎖を表す。「－」は明確に本発明の二重特異性抗体の構造を示して異なるドメインを分別するため、自身は何らの分子構造も表さず、例えば、ａｂ６ＶＬ－リンカー－ａｂ６ＶＨはａｂ６軽鎖可変領域（アミノ酸）及び重鎖可変領域（アミノ酸）がリンカーを介して融合して発現されるアミノ酸配列を表す。
【0111】
上記表１２で設計されるように、本実施例において、具体的な分子の軽鎖はヒトκ鎖の定常領域とし、重鎖はヒト重鎖の定常領域（Ｈｃ）、例えばヒトＩｇＧ４（ｈＩｇＧ４）とした。重鎖におけるＬ１配列は（Ｇ４Ｓ）３であり、Ｌ２配列はＧ４Ｓであり、即ち、具体的な配列は表１２ａに示した。
【0112】
【表14】
【0113】
上記分子の軽鎖のＮ末端は、さらに、配列番号３０で示される、シグナルペプチドＳＰ１の配列を含み、重鎖のＮ末端は、さらに、配列番号３１で示される、シグナルペプチドＳＰ２の配列を含み、発現の最終産物には、シグナルペプチドの配列が含まれないため（切断された）、表に示されていない。
【0114】
【表15】
【0115】
上記表において、軽鎖を含む配列とは当該配列が正常の完全な軽鎖配列以外、ほかのアミノ酸断片、例えばもう１つの軽鎖可変領域の配列を含むことである。重鎖を含む配列とは、当該配列が正常の完全な重鎖配列以外、ほかのアミノ酸断片、例えばもう１つの重鎖可変領域の配列を含むことである。軽鎖可変領域と完全な軽鎖の間、重鎖可変領域と完全な重鎖の間はそれぞれリンカーＬ３及びＬ４を介して連結している。Ｌ３、Ｌ４はそれぞれ柔軟性リンカーであり、配列番号２８で示されるペプチド断片１、又は配列番号２９で示されるペプチド断片２でもよく、複数のＧＧＧＧＳ（Ｇ４Ｓ）、即ち、（Ｇ４Ｓ）ｎでもよく、ｎは０～１０の間又は１０超の整数であり、好ましくは１、２、３又は４である。重鎖定常領域ｈＩｇＧはヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４でもよい。具体的な実施例は特定の値及び特定のリンカーを使用してもよい。
【0116】
具体的に、本実施例において、当該プラン２で本発明によって設計されるＬＢ１２６、ＬＢ１２７、ＬＢ２５３、ＬＢ１２８、ＬＢ１２９及びＬＢ２５４分子におけるＬ３配列はＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰ（配列番号２８）であり、Ｌ４配列はＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰ（配列番号２９）である。標的ＰＤ－１に対する抗体はＮｉｖｏ、Ｂａ０８又はＰｅｍであり、標的ＴＩＭ－３に対する抗体は本発明のａｂ６又はａｂ３２である。軽鎖定常領域はヒトκ鎖定常領域であり、重鎖定常領域はｈＩｇＧ４であり、具体的な配列は表１３ａに示す。
【0117】
【表16】
【0118】
上記分子の軽鎖のＮ末端は、さらに、配列番号３０で示される、シグナルペプチドＳＰ１の配列を含み、重鎖のＮ末端は、さらに、配列番号３１で示される、シグナルペプチドＳＰ２の配列を含み、発現の最終産物には、シグナルペプチドの配列が含まれないため（切断された）、表に示されていない。
【0119】
実施例１５ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の安定性の評価
本発明によって設計される上記ＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体は実施例１の方法によってクローニング、発現・精製された。精製サンプルはＰＢＳ（ｐＨ７．４）に保存され、３μｇのサンプルを取り、順に６μｌの５×タンパク質仕込み緩衝液（生工生物工程（上海）股フン有限公司、Ｃａｔ＃Ｃ５０８３２０－０００１）を入れ、非還元サンプルに６μｌのＤＴＴのない５×タンパク質仕込み緩衝液（生工生物工程（上海）股フン有限公司、Ｃａｔ＃Ｃ５１６０３０－０００５）を入れ、水で３０μｌまで追加し、９５℃以上の水浴で５ｍｉｎ処理した。仕込み、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を１４０ｖで７０ｍｉｎ行い、クマシーブリリアントブルーで室温で染色した。結果は図２に示した。
本発明によって設計される上記ＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体は実施例１の方法によってクローニング、発現・精製された。精製サンプルはＰＢＳ（ｐＨ７．４）に保存され、３μｇのサンプルを取り、順に６μｌの５×タンパク質仕込み緩衝液（生工生物工程（上海）股フン有限公司、Ｃａｔ＃Ｃ５０８３２０－０００１）を入れ、非還元サンプルに６μｌのＤＴＴのない５×タンパク質仕込み緩衝液（生工生物工程（上海）股フン有限公司、Ｃａｔ＃Ｃ５１６０３０－０００５）を入れ、水で３０μｌまで追加し、９５℃以上の水浴で５ｍｉｎ処理した。仕込み、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を１４０ｖで７０ｍｉｎ行い、クマシーブリリアントブルーで室温で染色した。結果は図２に示した。
【0120】
図２ａ、図２ｂ（図におけるレーン１、２はＰＤ－１抗体Ｎｉｖｏであり、抗体の軽鎖、重鎖の対照とした）の結果から、ＬＢ１２１、ＬＢ１２２、ＬＢ１２３、ＬＢ１２４及びＬＢ１２６、ＬＢ１２７、ＬＢ１２８、ＬＢ１２９はＰＡＧＥでは６０ｋＤ以下であり、そして正常の抗体の重鎖の大きさに近い箇所に１本のバンドがあったことから、これらの分子の重鎖に異なる程度の断裂があったことが示された。そして、ＬＢ１２１～ＬＢ１２４はＬＢ１２６～ＬＢ１２９よりもずっと軽かった。中では、ＬＢ１２１の断裂は最も軽かった。それに、ＬＢ１２６～ＬＢ１２９は正常の軽鎖の大きさ（３０ＫＤ）の近くにも１本のバンドがあったことから、これらの分子の軽鎖に異なる程度の断裂があったことが示された。
【0121】
電気泳動の結果をまとめて分析したところ、ＬＢ１２１～ＬＢ１２４はこのような分子構造及び特異的設計が発現の純度において最も優れたことが示された。上記二重特異性抗体はＰＢＳ（ｐＨ７．４緩衝系）及びＨＡＣ（酢酸緩衝系、ｐＨ３．５）、３μｇ／ｍｌ、４℃の条件において、初期の段階で７日観察し、安定性を評価したが、結果は下記表に示した。
【0122】
【表17】
【0123】
上記表において、あり、なし及び少量はそれぞれ沈殿あり、沈殿なし及び沈殿少量を表す。結果から、本発明の二重特異性抗体はＨＡＣ緩衝系ではすこし沈殿があったが、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）の緩衝系ではいずれも安定したことが分かる。
【0124】
実施例１６ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の結合活性の評価
上記本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体に対し、実施例３及び実施例５の方法により、それぞれそのＴＩＭ－３及びＰＤ－１との結合活性を検出したが、結果は表１５及び図３に示す。
上記本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体に対し、実施例３及び実施例５の方法により、それぞれそのＴＩＭ－３及びＰＤ－１との結合活性を検出したが、結果は表１５及び図３に示す。
【0125】
【表18】
【0126】
上記結果から、本発明のＴＩＭ－３に対する二重特異性抗体、本発明によって設計されたＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体は、いずれもＴＩＭ－３抗体及びＰＤ－１抗体の活性を維持していることが分かる。単独のＴＩＭ－３抗体又はＰＤ－１抗体と比べ、二重特異性抗体の活性（ＥＣ５０）がやや低下し、例えばＬＢ１２１はＴＩＭ－３との結合がＥＣ５０＝０．２３５ｎＭであったのに対し、ａｂ６はＴＩＭ－３との結合活性がＥＣ５０＝０．０９５であり、そのＰＤ－１に対する結合活性がＥＣ５０＝０．１５３ｎＭであったのに対し、ＮｉｖｏのＥＣ５０＝０．０５７ ｎＭであった。ＬＢ１２３はＰＤ－１との結合活性がＥＣ５０＝０．２１６ｎＭであったのに対し、Ｂａ０８１のＥＣ５０＝０．１２７ｎＭであった。そのため、本発明の二重特異性抗体は相応する単独の完全な抗体よりも相応する標的との結合活性がやや低下するが、１～３倍と比較的に低い範囲内である。
【0127】
実施例１７ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計
上記結果から、特に上記二重特異性の設計プラン１及び２（表１２及び表１３）によって設計される二重特異性抗体に生じる重鎖の断裂（図２を参照する）に対し、本発明の最適化設計は下記表１６に示す。
上記結果から、特に上記二重特異性の設計プラン１及び２（表１２及び表１３）によって設計される二重特異性抗体に生じる重鎖の断裂（図２を参照する）に対し、本発明の最適化設計は下記表１６に示す。
【0128】
【表19】
【0129】
上記分子の軽鎖のＮ末端は、さらに、配列番号３０で示される、シグナルペプチドＳＰ１の配列を含み、重鎖のＮ末端は、さらに、配列番号３１で示される、シグナルペプチドＳＰ２の配列を含み、発現の最終産物には、シグナルペプチドの配列が含まれないため（切断された）、表に示されていない。
【0130】
前記配列はいずれも発現の最終産物（二重特異性抗体）であり、その軽・重鎖のシグナルペプチド配列が切断された。上記設計が表す分子の軽・重鎖は以下の通りである：
ＬＢ１３３の軽鎖のアミノ酸配列：配列番号１７；ＬＢ１３３の重鎖のアミノ酸配列：配列番号１８；
ＬＢ１３４の軽鎖のアミノ酸配列：配列番号１７；ＬＢ１３４の重鎖のアミノ酸配列：配列番号１９；
ＬＢ１３５の軽鎖のアミノ酸配列：配列番号２０；ＬＢ１３５の重鎖のアミノ酸配列：配列番号２１；
ＬＢ１３６の軽鎖のアミノ酸配列：配列番号２０；ＬＢ１３６の重鎖のアミノ酸配列：配列番号２２；
ＬＢ１４１の軽鎖のアミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨ ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）
ＬＢ１４１の重鎖のアミノ酸配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＧＩＳＳＮＩＧＷＬＱＱ ＫＰＧＫＡＦＫＧＬＩＹＱＧＳＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＦＡＱＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＮＹＤＧＳＮＴＹＹＬＤＳＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＹＹＹＧＧＮＹＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２４）
ＬＢ１４３の軽鎖のアミノ酸配列：配列番号２３；ＬＢ１４３の重鎖のアミノ酸配列：配列番号２５。
ＬＢ１３３の軽鎖のアミノ酸配列：配列番号１７；ＬＢ１３３の重鎖のアミノ酸配列：配列番号１８；
ＬＢ１３４の軽鎖のアミノ酸配列：配列番号１７；ＬＢ１３４の重鎖のアミノ酸配列：配列番号１９；
ＬＢ１３５の軽鎖のアミノ酸配列：配列番号２０；ＬＢ１３５の重鎖のアミノ酸配列：配列番号２１；
ＬＢ１３６の軽鎖のアミノ酸配列：配列番号２０；ＬＢ１３６の重鎖のアミノ酸配列：配列番号２２；
ＬＢ１４１の軽鎖のアミノ酸配列：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨ ＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＬＡＳＹＬＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＨＳＲＤＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２３）
ＬＢ１４１の重鎖のアミノ酸配列：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＨＡＳＱＧＩＳＳＮＩＧＷＬＱＱ ＫＰＧＫＡＦＫＧＬＩＹＱＧＳＮＬＥＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＡＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＶＱＦＡＱＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＮＩＮＹＤＧＳＮＴＹＹＬＤＳＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＬＹＹＹＧＧＮＹＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＶＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮＲＶＴＬＴＴＤＳＳＴＴＴＡＹＭＥＬＫＳＬＱＦＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号２４）
ＬＢ１４３の軽鎖のアミノ酸配列：配列番号２３；ＬＢ１４３の重鎖のアミノ酸配列：配列番号２５。
【0131】
上記最適化設計のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体は実施例１の方法によってクローニング、発現・精製され、実施例１５と同様の方法によって電気泳動（ＰＡＧＥ）で軽・重鎖の状況を分析し、図４に示した。結果から、最適化設計の分子ＬＢ１３２、ＬＢ１３３、ＬＢ１３４、ＬＢ１３６、ＬＢ１４１、ＬＢ１４３及びＬＢ１３５は変性の条件において、いずれもＬＢ１２１～ＬＢ１２４（図２）に現れた重鎖、及びＬＢ１２６～ＬＢ１２９（図２）に現れた重鎖、軽鎖が断裂した断片が見られなかったことが分かる。この意外に発見された結果から、本発明の設計パターン及び配列の組み合わせは非常に優れた発現の特徴を有し、後続の生産、プロセスの開発に大きな優勢をもたらす。
【0132】
実施例１８ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計分子の結合活性の評価
上記本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計に対し、実施例２及び実施例５の方法により、それぞれそのＴＩＭ－３及びＰＤ－１との結合活性を検出し、結果は表１７に示した。
上記本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計に対し、実施例２及び実施例５の方法により、それぞれそのＴＩＭ－３及びＰＤ－１との結合活性を検出し、結果は表１７に示した。
【0133】
【表20】
【0134】
上記結果から、本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計分子は、単独の抗ＴＩＭ－３抗体（ａｂ６、ａｂ３２）に近い（差が１～２倍）結合活性、及び単独のＰＤ－１抗体（Ｎｉｖｏ、Ｐｅｍ、Ｂａ０８）に近い（差が１倍以内）結合活性を維持していることが分かる。
【0135】
実施例１９ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計分子のヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性の評価
本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計分子は実施例３の方法によってそのヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性（ＴＩＭ－３抗体活性）を評価し、結果は表１８に示した。
本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計分子は実施例３の方法によってそのヒトＰＢＭＣの腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性（ＴＩＭ－３抗体活性）を評価し、結果は表１８に示した。
【0136】
【表21】
【0137】
上記結果から、本発明の最適化設計の二重特異性抗体はａｂ６、ａｂ３２の単独の抗体が有するＰＢＭＣ（ＮＫ）の腫瘍細胞に対する殺傷を活性化させる活性を維持しているが分かる。
【0138】
実施例２０ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計分子のＰＤ－１タンパク質とＰＤ－Ｌ１リガンドの結合を阻害する活性の評価
本発明の最適化設計の二重特異性抗体のＰＤ－１抗体活性を評価するため、上記実施例６の方法によってそのＰＤ－１とＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）の結合を阻害する活性を評価した。結果を下記表に示した。
本発明の最適化設計の二重特異性抗体のＰＤ－１抗体活性を評価するため、上記実施例６の方法によってそのＰＤ－１とＰＤ－１リガンド（ＰＤ－Ｌ１）の結合を阻害する活性を評価した。結果を下記表に示した。
【0139】
【表22】
【0140】
上記結果から、本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計分子は、単独のＰＤ－１抗体（Ｎｉｖｏ、Ｐｅｍ、Ｂａ０８）と同様のＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する活性を維持していることが分かる。
【0141】
実施例２１ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計分子の混合リンパ球反応（ＭＬＲアッセイ）における機能活性の評価
混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲアッセイ）でＩＮＦ－γ分泌を検出する方法によって、本発明の一連の二重特異性抗体のヒト血細胞を活性化させる活性を評価した。即ち、本発明の分離されたヒト血細胞ＰＢＭＣ（健常なボランティアによって献血された末梢血から分離されたもの）で誘導して樹状細胞（ＤＣ）を得た後、さらに別のボランティアからのＴ細胞を刺激した。
混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲアッセイ）でＩＮＦ－γ分泌を検出する方法によって、本発明の一連の二重特異性抗体のヒト血細胞を活性化させる活性を評価した。即ち、本発明の分離されたヒト血細胞ＰＢＭＣ（健常なボランティアによって献血された末梢血から分離されたもの）で誘導して樹状細胞（ＤＣ）を得た後、さらに別のボランティアからのＴ細胞を刺激した。
【0142】
具体的に、樹状細胞（Ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）の培養は、実験の１日目に、１０％ ＦＢＳ ＲＰＭＩ １６４０培地で、ＰＢＭＣを６ウェルプレートに２ｍｌ、２×１０６／ｍｌで接種し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで２～４時間培養した後、軽く懸濁細胞を吸い出し、付着細胞に２ｍｌの培地及び１００ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃：３００－０３）及び１００ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ＃： ２００－０４）を入れ、続いて２日培養した後、各ウェルに１ｍｌの新鮮な培地を追加した。５日目に、各ウェルに３μｌの１００μｇ／ｍｌのＴＮＦ－αを追加し、最終濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるようにし（ＴＮＦ－αはＰｅｐｒｏｔｅｃｈから購入，Ｃａｔ＃：ＡＦ－３００－０１Ａ）、続いて２日培養し、得られた樹状細胞（ＤＣ）を以下の実験に使用した。
【0143】
ＤＣによるＰＢＭＣ／Ｔ細胞に対する刺激（ＭＬＲ）アッセイ：１０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｔ＃：１３０－０９３－３８７）で、１００μｌ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートをコーティングし、３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄した。上記培養の７日目のＤＣ細胞を収集し、遠心分離し、１０％ＦＢＳのＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁させ、計数し、５×１０４細胞／ｍｌになるように調製し、９０μｌ／ウェルで上記抗ＣＤ３抗体でコーティングされた９６ウェルプレートに入れた。異なるボランティアからのＰＢＭＣ細胞を取って、計数し、５×１０５細胞／ｍｌになるように調製し、９０μｌ／ウェルで上記抗ＣＤ３抗体でコーティングされた９６ウェルプレートに入れた。ＰＢＳで比率に従って陰性抗体、対照抗体、ＰＤ－１抗体を含む被験サンプル（公開された配列から、本発明によって実施例１に従ってクローニング、発現・精製されたもの）を調製し、上記９６ウェルプレートに２０μｌ／ウェルで入れた。被験抗体の２００μｌ系における濃度が必要な濃度勾配になるようにした。対照群＝９０μｌ ＰＢＭＣ細胞＋９０μｌ ＤＣ＋２０μｌ ＰＢＳ。細胞培養プレートを３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターで６日インキュベートした後、細胞培養プレートを取り出し、３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、各ウェルから１５０μｌの上清を取り出してＩＦＮ－γの検出を行った。
【0144】
ＩＦＮ－γのＥＬＩＳＡ検出方法は、キット（深セン欣博盛生物科技有限公司；ｃａｔ： ＥＨＣ１０２ｇ）の説明書に従って操作したが、手順は以下の通りである。
（１）取り出された１５０μｌの細胞培養上清を適切な希釈倍数（実験ごとに希釈倍数が異なり、予備実験で希釈倍数が決定され、本実施例における希釈倍数は２５倍であった）で希釈した後、マイクロプレートに入れた（１００μｌ／ウェル）。標準品はサンプル共通希釈液で異なる濃度の勾配：１０００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌ、１２５ｐｇ／ｍｌ、６２．５ｐｇ／ｍｌ、３１．２５ｐｇ／ｍｌ、１５．６２５ｐｇ／ｍｌにし、各ウェルに１００μｌ入れた。ブランクウェルにサンプル共通希釈液を入れた。
（１）取り出された１５０μｌの細胞培養上清を適切な希釈倍数（実験ごとに希釈倍数が異なり、予備実験で希釈倍数が決定され、本実施例における希釈倍数は２５倍であった）で希釈した後、マイクロプレートに入れた（１００μｌ／ウェル）。標準品はサンプル共通希釈液で異なる濃度の勾配：１０００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、２５０ｐｇ／ｍｌ、１２５ｐｇ／ｍｌ、６２．５ｐｇ／ｍｌ、３１．２５ｐｇ／ｍｌ、１５．６２５ｐｇ／ｍｌにし、各ウェルに１００μｌ入れた。ブランクウェルにサンプル共通希釈液を入れた。
【0145】
（２）シールで反応ウェルを封じ、３７℃で９０分間インキュベートした。
（３）プレートを５回洗浄し、毎回３分間で、各ウェルに１００μｌのビオチン抗体作業液を入れ、ブランクウェルにビオチン化抗体希釈液を入れ、新たなシールで反応ウェルを封じ、３７℃で６０分間インキュベートした。
（３）プレートを５回洗浄し、毎回３分間で、各ウェルに１００μｌのビオチン抗体作業液を入れ、ブランクウェルにビオチン化抗体希釈液を入れ、新たなシールで反応ウェルを封じ、３７℃で６０分間インキュベートした。
【0146】
（４）プレートを５回洗浄し、毎回３分間で、各ウェルに１００μｌの酵素結合使用液を入れ、ブランクウェルに酵素結合希釈液を入れ、新たなシールで反応ウェルを封じ、３７℃で光を避けて３０分間インキュベートした。
【0147】
（５）プレートを５回洗浄し、毎回３分間で、各ウェルに１００μｌの呈色基質ＴＭＢを入れ、３６℃で光を避けて１５分間インキュベートした。
（６）停止液を１００μｌ／ウェルで入れ、均一に混合した後、３分間内でマイクロプレートリーダーによってＯＤ４５０を読み取った。
（６）停止液を１００μｌ／ウェルで入れ、均一に混合した後、３分間内でマイクロプレートリーダーによってＯＤ４５０を読み取った。
【0148】
結果分析：ＩＦＮ－γ値を計算し、そしてブランク対照と比べ、増加百分率（％）に換算して本発明の二重特異性抗体のＭＬＲ検出における活性を評価した。結果は図５に示す。
【0149】
図５ａ、ｂ、ｃの結果から、本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１に対する二重特異性抗体の最適化設計分子は、混合リンパ球反応試験において、いずれも活性を示したことが分かる。そして、その活性がＴＩＭ－３＋ＰＤ－１の２つの抗体の併用に近かったか、又はそれ以上であった。即ち、本発明の好適に設計されるＴＩＭ－３とＰＤ－１に対する二重特異性分子（１つの分子）は２つの分子の併用に相当するか、それ以上（相乗効果）のＴ細胞を活性化させる活性に達する。単剤の低コスト、投与の便宜といった明らかな優勢があることで、本発明の二重特異性抗体は体内において相当するか、それ以上の医薬効果が予想することができる。
【0150】
実施例２２ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体のさらなる設計の最適化及びスクリーニング
本発明のＴｉｍ－３抗体配列及びＰＤ－１に対してさらに二重特異性抗体を設計したが、下記表に示す。
本発明のＴｉｍ－３抗体配列及びＰＤ－１に対してさらに二重特異性抗体を設計したが、下記表に示す。
【0151】
【表23】
【0152】
前記実施例１、実施例２、実施例５で発現・精製して上記異なる二重特異性抗体のＴｉｍ－３、ＰＤ－１との結合活性、及び各設計の発現量を検出したが、結果は下記表に示した。
【0153】
【表24】
【0154】
上記データから、本発明のＴｉｍ－３抗体は、異なる設計で、ａｂ６、ａｂ３２ ｓｃＦｖの位置、ＩｇＧのＮ末端、又はＣ末端を含み、ｓｃＦｖのコピー数が２個、４個、６個ひいては８個（例えばＬＢ２４６）であり、２つの標的の結合活性に対する影響が異なることが分かる。意外なことに、ＬＢ１４１、ＬＢ１４１３、ＬＢ２４２、ＬＢ１４７などの好適な設計は同時にＴｉｍ－３及びＰＤ－１に対する結合活性を維持している。
【0155】
【表25】
【0156】
上記結果から、本発明のＴｉｍ－３抗体配列及びＰＤ－１抗体で設計された二重特異性抗体分子は、異なる配列、ｓｃＦｖ位置、コピー数により、活性、発現量が大きく異なることが分かる。ＬＢ１４１、ＬＢ１４１３、ＬＢ２４２、ＬＢ１４７は活性が最も良く、ＬＢ１３３、ＬＢ１４１、ＬＢ１４１３、ＬＢ１４１２、ＬＢ１４７は発現量が最も良かった。本発明では、当該配列特異的で構造がＩｇＧと類似（対称）する二重特異性抗体（ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ＩｇＧ ｌｉｋｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の設計は、ＳＢｏｄｙと略される。代表的な分子の構造は図６を参照する。一部の設計（代表的なもの）の配列番号は以下の通りである。
【0157】
ＬＢ１４１３ 軽鎖：配列番号３２；ＬＢ１４１３重鎖：配列番号３３；
ＬＢ１４７ 軽鎖：配列番号３４；ＬＢ１４７重鎖（ＬＢ１４１３重鎖と同じであり、配列番号３３）。
ＬＢ１４７ 軽鎖：配列番号３４；ＬＢ１４７重鎖（ＬＢ１４１３重鎖と同じであり、配列番号３３）。
【0158】
実施例２３ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の最適化設計分子の動物体内における薬効の評価
ヒトｈＰＤ－１／ｈＴＩＭ３二重遺伝子組み換えＢａｌｂ／ｃ系マウスＢａｌｂ／ｃ－ｈＰＤ－１／ｈＴＩＭ３（江蘇集萃薬康生物科技有限公司から購入、生産許可証番号：ＳＣＸＫ（蘇）２０１８－０００８）で動物薬効モデルを構築し、本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１に対して体内における薬効の評価を行った。
ヒトｈＰＤ－１／ｈＴＩＭ３二重遺伝子組み換えＢａｌｂ／ｃ系マウスＢａｌｂ／ｃ－ｈＰＤ－１／ｈＴＩＭ３（江蘇集萃薬康生物科技有限公司から購入、生産許可証番号：ＳＣＸＫ（蘇）２０１８－０００８）で動物薬効モデルを構築し、本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１に対して体内における薬効の評価を行った。
【0159】
ＣＴ２６細胞（中国科学院細胞生物学研究所から購入）を１０％ウシ胎児血清（上海博昇生物科技有限公司，カタログ番号：ＢＳ－０００２－５００）を含有するＰＲＩＭ１６４０培地（上海源培生物科技股フン有限公司，カタログ番号：Ｌ１１０ＫＪ）において培養し、５％ ＣＯ２を含有する３７℃の細胞インキュベーターで培養し続けた。Ｂａｌｂ／ｃ－ｈＰＤ－１／ｈＴＩＭ３雌マウスを、５匹／籠でＳＰＦ級の環境下で飼育し、温度２０～２５℃、湿度４０％～６０％で、自由に摂取、飲水をさせ、定期的に敷材を交換した。ＣＴ２６細胞が対数期（コンフルエント８０％～９０％）まで増殖した時点で、０．２５％トリプシンで消化し、細胞を収集し、そして無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄し、最後に無血清のＰＲＩＭ１６４０培地で再懸濁させ、細胞を計数し、細胞濃度が５×１０６ 細胞／ｍｌになるように調整して接種に使用した。ＣＴ２６細胞懸濁液（０．５×１０６個）１００μｌをマウスの右脇部の皮下に接種し、体積が約１００～１２０ ｍｍ３まで成長した腫瘍細胞を選んでランダムに６匹ずつ群分けした。
【0160】
被験サンプル及び陽性対照はＰＢＳで無菌で調製した。ブランク群はＰＢＳである。ＰＤ－１抗体（Ｐｅｍ、本発明の実施例１の方法によってクローニングして発現させた）は単独投与の対照群である。ＰＤ－１抗体＋ａｂ６抗体は併用投与の対照群である。ＬＢ１４１は被験薬物群である。投与形態は腹腔内注射であり、ＰＤ－１抗体の投与量は１２０μｇ／２００μｌ／匹であり、ＰＤ－１抗体及びａｂ６抗体併用投与群の投与量はＰＤ－１抗体 １２０μｇ＋ａｂ６抗体（Ｔｉｍ３抗体）１２０μｇで計２００μｌ／匹マウスであり、ＬＢ１４１の投与量は１６０μｇ／２００μｌ／匹であった（併用群のＰＤ－１抗体、ＴＩＭ３抗体と等モルである）。各群の投与頻度はいずれも２回／週であり、連続２週であった。
【0161】
各注射のサンプル投与の当日は０日目である。毎回の投与前に、体重と腫瘍体積を測定し、データを記録した。今回の実験の実際の投与周期は２週であり、測定周期は１９日である。また、腫瘍の投与、測定が終了した後、続いてマウスの生存時間を記録し、５０日目にすべての腫瘍担持マウスの死亡が観察され、分析して各群のマウス生存率（％）を計算した。
【0162】
腫瘍の大きさの計算式：腫瘍体積ＴＶ（ｍｍ３）＝０．５×（腫瘍長径×腫瘍短径２）；腫瘍相対体積（ＲＴＶ）＝ Ｔ／Ｔ０又はＣ／Ｃ０。相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ％）＝１００％×（Ｔ－Ｔ０）／（Ｃ－Ｃ０）；腫瘍抑制率（ＴＧＩ）＝（１－Ｔ／Ｃ）×１００％；ここで、Ｔ０、Ｔはそれぞれサンプル群の実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積であり、Ｃ０、Ｃはそれぞれ対照群の実験開始時及び実験終了時の腫瘍体積である。
【0163】
図７ａの結果から、ＴＩＭ－３抗体ａｂ６と等量のＰＤ－１抗体を併用する場合、薬効が単独のＰＤ－１抗体と比べて、差異がなかったことが分かる（併用の場合、ａｂ６の薬効の確認にはａｂ６の投与量を増加する必要がある）。意外なことに、本発明のＴＩＭ３及びＰＤ－１の二重特異性抗体ＬＢ１４１は等モルの投与量のＴＩＭ３抗体ａｂ６とＰＤ－１抗体の併用よりも優れた薬効を示した。特に、ＬＢ１４１は腫瘍担持マウスに生存率の優勢を示した（図７ｂ）。図７ｂの結果から、ＬＢ１４１によって治療された腫瘍担持マウスの生存率（生存時間）がＴＩＭ３とＰＤ－１抗体の併用よりも優れ、単独のＰＤ－１抗体による治療よりも優れ、治療されなかった（ＰＢＳで処理された）マウスよりも優れたことが分かる。
【0164】
実施例２４ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体のＰＫの評価
実施例２３と同様のヒトＴＩＭ－３及びＰＤ－１二重遺伝子組み換えマウスを使用し、同様の飼育条件において本発明の二重特異性抗体のＰＫの評価を行った。マウスを無作為にＡ、Ｂ群に３匹ずつ分けた。マウスの尾静脈にＬＢ１４１を２０ｍｇ／ｋｇ／匹／２００μｌで注射した。注射前０時間、注射後５分、１５分、４５分、２、６、２３、３０、４７、５３、９７、１２２、１４３、１６６、１９６、２１４、２３２、２３８時間で目縁から採血した。採取された血液サンプルを遠心分離し、上清を取り、－２０℃で保存し、測定に備えた。血液サンプルを全部収集した後、二重サンドイッチＥＬＩＳＡ及びＰＤ－１のＥＬＩＳＡによってそれぞれＬＢ１４１のＴＩＭ３及びＰＤ－１との結合を検出して（二重特異性抗体はＴＩＭ３とも、ＰＤ－１とも結合できる）、ＬＢ１４１のＰＫの特徴を評価した。ＥＸＣＥＬソフトによってＰＫデータを分析し、ＬＢ１４１のＴ１／２を計算したが、結果は下記表に示した。
実施例２３と同様のヒトＴＩＭ－３及びＰＤ－１二重遺伝子組み換えマウスを使用し、同様の飼育条件において本発明の二重特異性抗体のＰＫの評価を行った。マウスを無作為にＡ、Ｂ群に３匹ずつ分けた。マウスの尾静脈にＬＢ１４１を２０ｍｇ／ｋｇ／匹／２００μｌで注射した。注射前０時間、注射後５分、１５分、４５分、２、６、２３、３０、４７、５３、９７、１２２、１４３、１６６、１９６、２１４、２３２、２３８時間で目縁から採血した。採取された血液サンプルを遠心分離し、上清を取り、－２０℃で保存し、測定に備えた。血液サンプルを全部収集した後、二重サンドイッチＥＬＩＳＡ及びＰＤ－１のＥＬＩＳＡによってそれぞれＬＢ１４１のＴＩＭ３及びＰＤ－１との結合を検出して（二重特異性抗体はＴＩＭ３とも、ＰＤ－１とも結合できる）、ＬＢ１４１のＰＫの特徴を評価した。ＥＸＣＥＬソフトによってＰＫデータを分析し、ＬＢ１４１のＴ１／２を計算したが、結果は下記表に示した。
【0165】
【表26】
【0166】
上記結果から、本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１をマウス体内に注射した後、ＴＩＭ３及びＰＤ－１のＥＬＩＳＡで得られたｔｍａｘが一致し、Ｔ１／２はそれぞれ４１．７６時間及び４５．５３時間で、非常に近かった。ＬＢ１４１は体内で安定的であり、その中のＴＩＭ－３に結合する部分（ｓｃＦｖ）が血液（体内）で脱離していないことが示された。表において、Ｃｍａｘの違いは定量方法に使用された二次抗体（１つはＴｉｍ３に対応し、もう１つはＰＤ－１に対するものである）の違いによるものである。
実施例２５ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の製剤配合の安定性の評価
本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１をそれぞれ製剤緩衝液及びｐＨ７．４のＰＢＳ（上海源培生物科技股フン有限公司，Ｃａｔ＃Ｂ３２０ＫＪ）で１５ｍｇ／ｍＬになるように調製し、均等に分けた。－８０℃で凍結保存し、３７℃で７日、１４日置いた後、各サンプルに対して結合活性の検出（ＥＬＩＳＡ、方法は前記実施例と同様）、及びゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を行った。結果を下記表に示した。
実施例２５ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の製剤配合の安定性の評価
本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１をそれぞれ製剤緩衝液及びｐＨ７．４のＰＢＳ（上海源培生物科技股フン有限公司，Ｃａｔ＃Ｂ３２０ＫＪ）で１５ｍｇ／ｍＬになるように調製し、均等に分けた。－８０℃で凍結保存し、３７℃で７日、１４日置いた後、各サンプルに対して結合活性の検出（ＥＬＩＳＡ、方法は前記実施例と同様）、及びゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を行った。結果を下記表に示した。
【0167】
使用された製剤緩衝液の配合は２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（上海生工生物工程有限公司，Ｃａｔ＃Ａ６０４３５１－００５０）、５０ｍｇ／ｍＬ ショ糖（上海生工生物工程有限公司，Ｃａｔ＃Ａ６１０４９８－０５００）及び０．０２％ ツイン２０（上海生工生物工程有限公司，Ｃａｔ＃ Ａ６００５６０－０５００）で、ｐＨ６．０である。
【0168】
【表27】
【0169】
上記結果から、本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１は高濃度（１５ｍｇ／ｍＬ）で、３７℃で７日保存しても安定で、ＰＤ－１及びＴＩＭ－３に対する結合活性が０日と比べ、大きく変化しなかったことが分かる。３７℃で１４日保存した後、ＰＤ－１及びＴＩＭ－３に対する結合活性がいずれも低下し、特にＴＩＭ３との結合活性は、製剤緩衝液で、４７倍低下した。ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の結果から、ＬＢ１４１は２つの溶解系で７日保存した後、ＰＡＧＥ分析では分解が見られなかったことが分かる。１４日保存した後、ＰＡＧＥ分析ではいずれも分解が見られた。そして、製剤緩衝液で１４日保存したサンプルはＰＢＳで１４日保存したサンプルよりも分解がひどかったことが分かった。
【0170】
これらの結果から、本発明の二重特異性抗体は高濃度の条件下で、３７℃で７日安定して保存できることが示された。意外に、ＰＢＳでの保存は製剤緩衝液（２０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、５０ｍｇ／ｍＬ ショ糖、０．０２％ ツイン ２０、ｐＨ６．０）よりも安定的であることが分かった。
【0171】
実施例２６ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体の異なるｐＨ値における製剤安定性の評価
本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１を製剤緩衝液で１５ｍｇ／ｍＬになるように調製し、ｐＨ＝５．５又はｐＨ＝６であり、均等に分けた。－８０℃で凍結保存したか、３７℃で７日置いた後、各サンプルに対して結合活性の検出（ＥＬＩＳＡ、方法は前記実施例と同様）、及びゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を行った。結果を下記表に示した。
本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１を製剤緩衝液で１５ｍｇ／ｍＬになるように調製し、ｐＨ＝５．５又はｐＨ＝６であり、均等に分けた。－８０℃で凍結保存したか、３７℃で７日置いた後、各サンプルに対して結合活性の検出（ＥＬＩＳＡ、方法は前記実施例と同様）、及びゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を行った。結果を下記表に示した。
【0172】
使用された製剤緩衝液の配合は１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（上海生工生物工程有限公司，Ｃａｔ＃Ａ６０４３５１－００５０）、７０ｍｇ／ｍＬ ショ糖（上海生工生物工程有限公司，Ｃａｔ＃Ａ６１０４９８－０５００）及び０．２％ ポリソルベート８０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ＃５９９２４－１００ｇ－Ｆ）であり、ｐＨ５．５又はｐＨ６．０である。
【0173】
【表28】
【0174】
上記結果から、意外に、本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１は高濃度（１５ｍｇ／ｍＬ）下、ｐＨ５．５及びｐＨ６．０の製剤緩衝液で、３７℃で７日保存した後、活性がいずれも安定的であり、ＰＤ－１及びＴＩＭ－３に対する結合活性が０日と比べ、大きく変化しなかったことが分かる。ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の結果から、ＬＢ１４１は２つのｐＨの製剤で７日保存した後、ＰＡＧＥ分析では分解が見られなかったことが分かる。
【0175】
これらの結果から、本発明の二重特異性抗体は高濃度の条件下で、ｐＨ５．５及びｐＨ６．０の製剤緩衝液（１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、７０ｍｇ／ｍＬ ショ糖、０．２％ ポリソルベート８０）で３７℃で７日安定して保存できることが示された。
【0176】
実施例２７ 本発明のＴＩＭ－３及びＰＤ－１の二重特異性抗体のｐＨ５．５製剤における温度安定性の評価
本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１を製剤緩衝液で２８．５ｍｇ／ｍＬになるように調製し（ｐＨ＝５．５の緩衝液）、均等に分けた。－８０℃で凍結保存したか、３７℃で５日及び１０日置いたか、又は４０℃で５日及び１０日置いた後、各サンプルに対して結合活性の検出（ＥＬＩＳＡ、方法は前記実施例と同様）、及びゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を行った。結果を下記表に示した。
本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１を製剤緩衝液で２８．５ｍｇ／ｍＬになるように調製し（ｐＨ＝５．５の緩衝液）、均等に分けた。－８０℃で凍結保存したか、３７℃で５日及び１０日置いたか、又は４０℃で５日及び１０日置いた後、各サンプルに対して結合活性の検出（ＥＬＩＳＡ、方法は前記実施例と同様）、及びゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析を行った。結果を下記表に示した。
【0177】
使用された製剤緩衝液の配合は１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン（上海生工生物工程有限公司，Ｃａｔ＃Ａ６０４３５１－００５０）、７０ｍｇ／ｍＬ ショ糖（上海生工生物工程有限公司，Ｃａｔ＃Ａ６１０４９８－０５００）及び０．２％ ポリソルベート８０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ＃５９９２４－１００ｇ－Ｆ）で、ｐＨ５．５である。
【0178】
【表29】
【0179】
上記結果から、非常に意外に、本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１は高濃度（２８．５ｍｇ／ｍＬ）下、ｐＨ５．５の製剤緩衝液で、３７℃で５日及び１０日並びに４０℃で５日及び１０日保存した後、活性がいずれも安定的であり、ＰＤ－１及びＴＩＭ－３に対する結合活性が０日と比べ、活性が変化しなかったことが分かる。ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の結果から、ＬＢ１４１はｐＨ５．５の製剤において５日及び１０日並びに４０℃で５日及び１０日保存した後、ＰＡＧＥ分析ではいずれも分解が見られなかったことが分かる。
【0180】
これらの結果から、本発明の二重特異性抗体は高濃度の条件下で、ｐＨ５．５の製剤緩衝液（１０ｍＭ Ｌ－ヒスチジン、７０ｍｇ／ｍＬ ショ糖、０．２％ ポリソルベート８０）で、３７℃及び４０℃下で１０日安定的で保存できることが示された。
【0181】
実施例２８ 本発明の二重特異性抗体の親和力の評価
前記実施例４の方法によって本発明の二重特異性抗体の親和力を検出し、結果は下記表に示した。
前記実施例４の方法によって本発明の二重特異性抗体の親和力を検出し、結果は下記表に示した。
【0182】
【表30】
【0183】
上記結果から、本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１のＴｉｍ－３、ＰＤ－１との親和力がＥ－０９、ｎＭのレベルに維持し、単独のＰｅｍ、Ｎｉｖｏ、単独のＴｉｍ３抗体の親和力に近かったことが示された（前記表７）。ＬＢ１３３はＰＤ－１に対する親和力がＥ－０８、１０ｎＭのレベルに達し、即ち、Ｐｅｍ、Ｎｉｖｏと比べて親和力が大きく低下した。４コピーのｓｃＦｖ ａｂ６を持つＬＢ２４７は２つの標的に対する結合活性を維持しているが、Ｔｉｍ－３の結合活性を強化していない。これらの結果から、本発明で設計された配列特異的な二重特異性抗体ＬＢ１４１は意外な活性の利点を示し、即ち、２つの標的に対する親和力を維持していることが分かる。
【0184】
実施例２９ 本発明の二重特異性抗体のサンドイッチＥＬＩＳＡ検出
ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液でＰＤ－１（実施例１で用意された）を１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレートに入れ、３７℃インキュベーターで２時間置いた。液を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％脱脂牛乳（上海生工生物工程有限公司，Ａ６００６６９－０２５０）のブロッキング液を２００μｌ／ウェルで入れ、４℃で一晩（１６～１８時間）置くことでブロッキングした。ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４のＰＢＳは０．０５％ ツイン－２０を含有する）でプレートを５回洗浄した後、１０μｇ／ｍｌから、１％ ＢＳＡで５倍連続希釈されたＬＢ１４１を５０μｌ／ウェルで入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１μｇ／ｍｌのＢｉｏ－ＴＩＭ－３－ｈｉｓ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＴＭ－Ｈ５２２９）を入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１：１０００で希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰ二次抗体（南京ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社，Ｍ０００９１）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で５～１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＥＣ５０を計算した。
ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液でＰＤ－１（実施例１で用意された）を１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、５０μｌ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレートに入れ、３７℃インキュベーターで２時間置いた。液を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％脱脂牛乳（上海生工生物工程有限公司，Ａ６００６６９－０２５０）のブロッキング液を２００μｌ／ウェルで入れ、４℃で一晩（１６～１８時間）置くことでブロッキングした。ブロッキング液を捨て、ＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４のＰＢＳは０．０５％ ツイン－２０を含有する）でプレートを５回洗浄した後、１０μｇ／ｍｌから、１％ ＢＳＡで５倍連続希釈されたＬＢ１４１を５０μｌ／ウェルで入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１μｇ／ｍｌのＢｉｏ－ＴＩＭ－３－ｈｉｓ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＴＭ－Ｈ５２２９）を入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１：１０００で希釈されたストレプトアビジン－ＨＲＰ二次抗体（南京ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社，Ｍ０００９１）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で５～１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＥＣ５０を計算した。
【0185】
ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液でＴＩＭ－３－ｈＦｃ（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，２２－１４２）を５μｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌ／ウェルの体積で９６ウェルマイクロプレートに入れ、３７℃で２時間インキュベートした。液を捨てた後、ＰＢＳで希釈された５％脱脂牛乳のブロッキング液を２００μｌ／ウェルで入れ、４℃で一晩（１６～１８時間）置くことでブロッキングした。ブロッキング液を捨て、そしてＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ７．４のＰＢＳが０．０５％ ツイン－２０を含有する）でプレートを５回洗浄した後、１０μｇ／ｍｌから、１％ ＢＳＡで５倍連続希釈されたＬＢ１４１を５０μｌ／ウェルで入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０ μｌ／ウェルで１０μｇ／ｍｌのＰＤ－１－ｈｉｓ（実施例１で用意された）を入れ、３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄し、５０μｌ／ウェルで１：２５００で希釈された抗ｈｉｓ－ＨＲＰ二次抗体（南京ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社，Ａ００６１２）を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴでプレートを５回洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ呈色基質（ＫＰＬ，５２－００－０３）を入れ、室温で５～１０ｍｉｎインキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を入れて反応を中止させ、ＭＵＬＴＩＳＫＡＮ Ｇｏマイクロプレートリーダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，５１１１９２００）によって４５０ｎｍにおいて吸収値を読み取り、ＯＤ値からＥＣ５０を計算した。結果を下記表に示した。
【0186】
【表31】
【0187】
上記結果から、本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１は同時にＴｉｍ－３及びＰＤ－１に結合することができることが分かる。その一方の標的との結合はそのもう一方の標的との結合を顕著に阻害していなかった。
【0188】
実施例３０ 本発明の二重特異性抗体の分子量分析（ＬＣ－ＭＳ）
ＬＢ１４１を製剤配合（実施例２７を参照する）で１９ｍｇ／ｍＬになるように調製した（ｐＨ＝５．５）。１０μｌのＬＢ１４１を１．５ｍｌ遠心管に取り、無菌水で１μｇ／μＬに希釈した。１μＬのＰＮＧａｓｅＦ（Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｐ０７０４Ｌ）を入れ、均一に混合し、３７℃で１６ｈ反応させた後、１μＬの１Ｍ ＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃で１ｈインキュベートした。Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（ｔｈｅｒｍｏ，ＭＳ－Ｂ２０－０３），（ＨＰＬＣ，Ａｇｉｌｅｎｔ，５１８８－２７８８）によって質量分析を行った。結果を下記表に示した。
ＬＢ１４１を製剤配合（実施例２７を参照する）で１９ｍｇ／ｍＬになるように調製した（ｐＨ＝５．５）。１０μｌのＬＢ１４１を１．５ｍｌ遠心管に取り、無菌水で１μｇ／μＬに希釈した。１μＬのＰＮＧａｓｅＦ（Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｐ０７０４Ｌ）を入れ、均一に混合し、３７℃で１６ｈ反応させた後、１μＬの１Ｍ ＤＴＴを入れ、均一に混合した後、３７℃で１ｈインキュベートした。Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（ｔｈｅｒｍｏ，ＭＳ－Ｂ２０－０３），（ＨＰＬＣ，Ａｇｉｌｅｎｔ，５１８８－２７８８）によって質量分析を行った。結果を下記表に示した。
【0189】
【表32】
【0190】
上記結果から、本発明の二重特異性抗体ＬＢ１４１の軽鎖は検出分子量が理論分子量と一致することが分かる。重鎖は検出分子量と理論分子量との差は２．９５Ｄａであり、装置の誤差範囲内にある（＜５０ｐｐｍ）。本発明により設計、発現・精製された二重特異性抗体ＬＢ１４１は予想／設計の配列と一致することが示された。
【0191】
以上、本発明の具体的な実施形態を記述したが、当業者にとって、これらは例示の説明だけで、本発明の原理と実質に反しないという前提下において、これらの実施形態に対して様々な変更や修正をすることができる。そのため、本発明の保護範囲は添付の請求の範囲によって限定される。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図3c】
【図3d】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【配列表】