(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-21
(45)【発行日】2023-09-29
(54)【発明の名称】閉鎖系細胞培養容器
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20230922BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20230922BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 G
C12M3/00 Z
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2019130142
(22)【出願日】2019-07-12
(65)【公開番号】P2021013332
(43)【公開日】2021-02-12
【審査請求日】2022-04-30
(73)【特許権者】
【識別番号】000136354
【氏名又は名称】株式会社フコク
(74)【代理人】
【識別番号】100082876
【弁理士】
【氏名又は名称】平山 一幸
(74)【代理人】
【氏名又は名称】柿本 恭成
(74)【代理人】
【識別番号】100178906
【弁理士】
【氏名又は名称】近藤 充和
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 育美
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／２０７９０７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１４５８７０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１４－１２８２４７（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／００－ ３／１０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
培養基部及び該培養基部に接する培養空間が密封収容体の内部に設けられ、前記培養基部上又は前記培養空間内で細胞が培養される閉鎖系細胞培養容器であって、前記密封収容体は、環状枠体と、該環状枠体を外周側から移動不能に固定して少なくとも液密に覆う柔軟性フィルムと、を備え、
前記培養基部及び前記培養空間は前記環状枠体に囲まれた内側の空間内に設けられ、
前記環状枠体は、前記柔軟性フィルムよりも硬度が高く前記培養空間を所定形状に保持可能な硬質材からなる閉鎖系細胞培養容器。
【請求項2】
前記環状枠体を側周壁とし、前記培養基部を底壁とするインナーケースを含む請求項１に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項3】
前記柔軟性フィルムは、前記環状枠体の少なくとも外周面を密着して覆うとともに前記環状枠体の上部開口を覆うことで、前記環状枠体の外周全体を囲んで覆っている請求項２に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項4】
前記柔軟性フィルムは、前記環状枠体の外周面の少なくとも一部を覆う下部フィルムと、前記上部開口を覆う上部フィルムと、を備え、前記下部フィルムは、前記環状枠体の外周面より外側に突出した下鍔部を有し、
前記上部フィルムは、前記環状枠体の外周面より外側に突出した上鍔部を有し、
前記下鍔部と前記上鍔部とが少なくとも液密に溶着されている請求項３に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項5】
前記下部フィルムは、前記環状枠体の外周面に密着する側周部と前記下鍔部との間に、前記上部開口の上端面を覆う環状括れ部が設けられている請求項４に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項6】
前記培養空間と外部とを連通可能なポート部を備え、前記ポート部は、前記培養空間内に突出した内側突出部を有して前記環状枠体の上部開口付近の前記柔軟性フィルムに支持されている請求項２乃至５の何れかに記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項7】
前記ポート部の内側突出部の開口が前記培養空間内の培地に浸漬される位置と前記培地より上方の位置との間で変位可能である請求項６に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項8】
前記内側突出部が前記環状枠体の内壁の高さに対応する長さを有し、前記内側突出部の開口が前記環状枠体の内壁側で前記培地に浸漬可能である請求項７に記載の閉鎖系細胞培養容器。
【請求項9】
前記環状枠体の外周面に、当該外周面に沿ってガイド部が形成され、前記ガイド部は、前記環状枠体とともに前記柔軟性フィルムにより覆われている請求項１乃至８の何れかに記載の閉鎖系細胞培養容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、密封収容体の内部で細胞培養を行うための閉鎖系細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【0002】
従来、シャーレなどの開放系容器の内部で細胞培養を行う場合、培地（培養液）の交換や培養細胞の出し入れを無菌的に行うために、セルプロセッシングセンター（CPC）のような大掛かりな培養施設やセルプロセッシング・アイソレータのような大型装置が必要であった。
【0003】
大がかりな培養施設や装置を使用せずに細胞培養を行うために、培地や細胞の出し入れのためのアクセスポートを設けた閉鎖系培養容器が提案されている。例えば下記特許文献１では、開封可能な密閉容器と、密閉容器内に配置された細胞培養体と、を備え、細胞培養体が密閉容器から取り外し可能に設けられた閉鎖系培養容器が開示されている。
【0004】
この特許文献１には、細胞培養体を内挿して形態維持できる程度のシャーレ様の密閉容器や密閉容器の一部がフィルムにより剥離可能にヒートシールされていることなどが記載されている。また柔軟性を有する細胞培養用バッグ（細胞培養容器）内に、細胞培養用ディッシュ（細胞培養体）を導入し、開封可能にした密閉容器なども記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第ＷＯ２０１５／１９００９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
しかしながら従来の閉鎖系培養容器では、細胞を培養するための細胞培養体や基材が、これらを閉鎖系で収容配置する密封容器や枠体等に対して固定されていないため、細胞培養体や基材が密封容器や枠体等の中で動いてしまい、閉鎖系培養容器を安定して支持あるいは把持することが困難であり、例えば運搬、培地交換、観察などの各種の培養操作において細胞培養体や基材等が密封容器や枠体等の内部で変位して培養に悪影響を与えることがあるなどの問題点があった。
【0007】
そこで本発明では、無菌的に細胞培養を行うことができるとともに、安定して支持（操作者等の把持を含む）することが容易で、運搬、培地交換、観察等の各種の培養操作を無菌的に安定して行うことが可能な閉鎖系細胞培養容器を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記課題を解決する本発明の閉鎖系細胞培養容器は、培養基部及び培養基部に接する培養空間が密封収容体の内部に設けられ、培養基部上又は培養空間内で細胞が培養される閉鎖系細胞培養容器であって、密封収容体は、環状枠体と、環状枠体を外周側から移動不能に固定して少なくとも液密に覆う柔軟性フィルムと、を備え、培養基部及び培養空間は環状枠体に囲まれた内側に設けられ、環状枠体は、柔軟性フィルムよりも硬度が高く培養空間を所定形状に保持可能な硬質材からなる。
【0009】
本発明の閉鎖系細胞培養容器では、環状枠体を側周壁とし、培養基部を底壁とするインナーケースを含むものとするのがよい。
また、柔軟性フィルムは、環状枠体の外周面の少なくとも一部を密着して覆うとともに環状枠体の上部開口を覆うことで、環状枠体の外周全体を囲んで覆うのが好適である。
また、柔軟性フィルムは、環状枠体の外周面の少なくとも一部を密着して覆うとともに環状枠体の上部開口を覆うことで、環状枠体の外周全体を囲んで覆うのが好適である。
【0010】
本発明の閉鎖系細胞培養容器では、柔軟性フィルムが環状枠体の外周面の少なくとも一部を覆う下部フィルムと、上部開口を覆う上部フィルムと、を備え、下部フィルムが環状枠体の外周面より外側に突出した下鍔部を有し、上部フィルムが環状枠体の外周面より外側に突出した上鍔部を有し、下鍔部と上鍔部とが少なくとも液密に溶着されているのがよい。その場合、下部フィルムは、環状枠体の外周面に密着する側周部と下鍔部との間に、上部開口の上端面を覆う環状括れ部が設けられているのが好ましい。
【0011】
本発明の閉鎖系細胞培養容器では、培養空間と外部とを連通可能なポート部を備え、ポート部は、培養空間内に突出した内側突出部を有して環状枠体の上部開口付近の柔軟性フィルムに支持されることが好ましい。その場合、ポート部の内側突出部の開口が培養空間内の培地に浸漬される位置と培地より上方の位置との間で変位可能であることがより好適である。
さらに、内側突出部が環状枠体の内壁の高さに対応する長さを有し、内側突出部の開口が環状枠体の内壁側で培地に浸漬可能であるのがよい。
さらに、内側突出部が環状枠体の内壁の高さに対応する長さを有し、内側突出部の開口が環状枠体の内壁側で培地に浸漬可能であるのがよい。
【0012】
本発明の閉鎖系細胞培養容器では、柔軟性フィルムが環状枠体の外周全体を囲んで覆う場合、環状枠体の外周面に、当該外周面に沿ってガイド部が形成され、このガイド部は環状枠体とともに柔軟性フィルムにより覆われているのがよい。
【発明の効果】
【0013】
本発明の閉鎖系細胞培養容器によれば、環状枠体を柔軟性フィルムにより外周側から移動不能に固定して少なくとも液密に覆うことで、環状枠体に囲まれた内側に移動不能に培養基部及び培養空間を設けている。そのため、培養基部及び培養空間を閉鎖系に保つことができ細胞培養を無菌的に行うことができる。
同時に、培養基部及び培養空間を柔軟性フィルムに対して所定位置に固定して配置できるとともに、培養空間を所定形状に保つことができるため、細胞培養途中や終了時などに柔軟性フィルムの外側から環状枠体を安定して支持でき、培養基部及び培養空間が変位したり変形したりすることを抑えることができる。
その結果、閉鎖系のまま無菌的に細胞培養を容易に行うことができるとともに、安定して支持することが容易で、運搬、培地交換、観察等の各種の培養操作を無菌的に安定して行うことができる閉鎖系細胞培養容器を提供することができる。
同時に、培養基部及び培養空間を柔軟性フィルムに対して所定位置に固定して配置できるとともに、培養空間を所定形状に保つことができるため、細胞培養途中や終了時などに柔軟性フィルムの外側から環状枠体を安定して支持でき、培養基部及び培養空間が変位したり変形したりすることを抑えることができる。
その結果、閉鎖系のまま無菌的に細胞培養を容易に行うことができるとともに、安定して支持することが容易で、運搬、培地交換、観察等の各種の培養操作を無菌的に安定して行うことができる閉鎖系細胞培養容器を提供することができる。
【0014】
本発明の閉鎖系細胞培養容器において、培養基部がインナーケースの底壁からなり、環状枠体がインナーケースの側周壁からなるとき、当該インナーケースは培養基部及び環状枠体が一体である。そのため、培養基部及び培養空間を確実に所定位置及び所定形状に保つことができ、培養基部及び培養空間で確実に安定して無菌的に細胞培養を行うことができる。
【0015】
本発明の閉鎖系細胞培養容器において、柔軟性フィルムが環状枠体の少なくとも外周面を密着して覆うとともに、環状枠体の上部開口を覆うことにより、柔軟性フィルムが環状枠体とともに培養空間及び培養基部を確実に密封して、閉鎖系培養容器とすることができる。これにより、環状枠体の内側面は、培養空間の外側面として構成され、また、環状枠体と培養基部からなるインナーケースの側周壁の内側面及び底壁の上面は、それぞれ培養空間の外側面及び下面として構成される。
そのため、柔軟性フィルムの材質に関わらず、培養空間の外側面及び下面について、培養する細胞に応じて、所望の性状を有する培養空間の外側面及び下面を自由に選択することが可能となる。例えばインナーケースの培養基部のみに親水化などの処理を施し、このインナーケースを利用して、上述の本発明を適用することで本発明の閉鎖系細胞培養容器を得ることができる。この場合、柔軟性フィルムに何ら処理することなく、親水性を有する培養基部を備えた閉鎖系細胞培養容器とすることができる。
そのため、柔軟性フィルムの材質に関わらず、培養空間の外側面及び下面について、培養する細胞に応じて、所望の性状を有する培養空間の外側面及び下面を自由に選択することが可能となる。例えばインナーケースの培養基部のみに親水化などの処理を施し、このインナーケースを利用して、上述の本発明を適用することで本発明の閉鎖系細胞培養容器を得ることができる。この場合、柔軟性フィルムに何ら処理することなく、親水性を有する培養基部を備えた閉鎖系細胞培養容器とすることができる。
【0016】
さらに、環状枠体の外周面又はインナーケースの側周壁の外側に柔軟性フィルムが配置されるため、環状枠体又はインナーケースの側周壁の外周面の柔軟性フィルムに刃物を押し当てて柔軟性フィルムのみを切断することができる。そのため、柔軟性フィルムから環状枠体やインナーケースを取り出す際、環状枠体やインナーケース内の培地に刃物が直接接触したり、切断時に生じる異物が混入したりすることがなく、培養された細胞や培地が異物や雑菌等で汚染されることを防止できる。
【0017】
本発明の閉鎖系細胞培養容器において、柔軟性フィルムが環状枠体の外周面の少なくとも一部を覆う下部フィルムと、上部開口を覆う上部フィルムと、を備え、下部フィルムの下鍔部を環状枠体の外周面より外側に突出するように構成し、これに上部フィルムの上鍔部が対向するように構成することで、上記下鍔部と上鍔部とが環状枠体の外側に位置することから、溶着作業が容易となり、確実な密閉が可能となる。
【0018】
本発明の閉鎖系細胞培養容器において、環状枠体の外周面に密着する下部フィルムの側周部と下鍔部との間に、上部開口の上端面を覆う環状括れ部を設けることで下部フィルムが環状枠体の上端面を覆うことで、環状枠体を上下方向から柔軟性フィルムで挟み込むことになり、環状枠体を安定して固定できることに加え、環状枠体の内部の培地が外側に溢れ難くできる。特に、環状枠体の開口上端と下部フィルムを密着させることで、より好ましくは下部フィルムの側周部と連続して下部フィルムと開口上端に密着させることで、環状枠体の外周面と下部フィルムの間に培地が入り込むことを防止することができる。
さらに、柔軟性フィルムによる環状括れ部は、蛇腹状に変形容易に構成できるので、環状括れ部の上部の下鍔部に溶着された上部フィルムが変位乃至変形し易くなる。そのため閉鎖系を保ちつつ、上部フィルムを変形乃至変位させて容積を変化させることができ、例えば培地の収容排出等の操作を容易に行うことができる。
さらに、柔軟性フィルムによる環状括れ部は、蛇腹状に変形容易に構成できるので、環状括れ部の上部の下鍔部に溶着された上部フィルムが変位乃至変形し易くなる。そのため閉鎖系を保ちつつ、上部フィルムを変形乃至変位させて容積を変化させることができ、例えば培地の収容排出等の操作を容易に行うことができる。
【0019】
本発明の閉鎖系細胞培養容器において、培養空間と外部とを連通可能なポート部が柔軟性フィルムに支持されることにより、柔軟性フィルムを開封することなく、開閉可能なポート部を通じて培地や細胞の排出や導入を容易に行うことができる。このとき、柔軟性フィルムを介して環状枠体を把持して作業可能であるので、操作が容易となる。また、ポート部は、柔軟性フィルムに設けているので、環状枠体に硬質材を使用していても、ポート部の操作自由度が高い。
【0020】
さらに、ポート部の培養空間内に突出した内側突出部の開口が、培養空間内の培地に浸漬される位置と上方の位置との間で変位可能とすることで、ポート部の内側突出部の開口を培地に浸漬しない状態で固定して細胞培養を行うことができ、ポート部から培地へ振動が伝わったり、ポート部との接触により細胞が損傷したりすることなどを防止でき、安定した細胞培養を行える。一方、ポート部を変位させれば内側突出部の開口を培地中に浸漬でき、例えばポート部から培地の排出や導入を穏やかに行うことができ、培養する細胞に過剰に刺激を与えることを防止できる。
【0021】
さらに、ポート部の内側突出部が環状枠体又はインナーケースの側周壁の高さに応じた長さを有し、内側突出部の開口が環状枠体の内周面又はインナーケースの周壁部に沿った位置で培地に浸漬可能であるので、ポート部を変位させて内側突出部の開口を培地に浸漬させても、環状枠体又はインナーケース内で培養された細胞の中央側に内側突出部が接触することがなく、培養された細胞に損傷を与えるようなことを防止できる。
【0022】
本発明の閉鎖系細胞培養容器において、柔軟性フィルムが環状枠体又はインナーケースの外周全体を囲んで覆う場合、当該柔軟性フィルムに移動不能に固定された環状枠体又はインナーケースの外周面に、当該外周面に沿って周方向に延びる溝、突条又は段部などのガイド部を形成することにより、刃物を使用して柔軟性フィルムを切断して環状枠体又はインナーケースを取り出す際に、刃物がガイド部に案内されることで柔軟性フィルムを容易に安定的に切断することができる。また、ガイド部が環状枠体又はインナーケースの外周面に形成されているから、刃物が培養空間に入り込むことが無く、刃物による培養空間の汚染も抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】本発明の実施形態に係る閉鎖系細胞培養容器の平面図である。
【図2】本発明の実施形態に係る閉鎖系細胞培養容器の縦断面図である。
【図3】本発明の実施形態に係る閉鎖系細胞培養容器の部分拡大面図である。
【図4】本発明の実施形態に係る閉鎖系細胞培養容器を用いた細胞培養における静置状態を示す縦断面図である。
【図5】本発明の実施形態に係る閉鎖系細胞培養容器を用いた細胞培養における培地交換の状態を示す縦断面図である。
【図6】本発明の実施形態に係る閉鎖系細胞培養容器を用いた細胞培養が終了して細胞を取り出す状態を示す縦断面図である。
【図7】（ａ）は本発明の実施形態に係る閉鎖系細胞培養容器における変形例を示す縦断面図であり、（ｂ）は（ａ）とは異なる変形例に係る閉鎖系細胞培養容器の部分断面図である。
【図8】本発明の実施形態の変形例に係る閉鎖系細胞培養容器の部分拡大面図である。
【図9】本発明の実施形態における他の変形例に係る閉鎖系細胞培養容器の平面図である。
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、本発明の実施形態について図を用いて詳細に説明する。
本実施形態の閉鎖系細胞培養容器１０は、図１及び図２に示すように、密封収容体１１の内部に培養基部１３及び培養基部１３に接する培養空間１２を備えた容器であり、上部開口２１ａを有する硬質のインナーケース２１と、インナーケース２１を外周側から移動不能に固定して気密に覆う柔軟性フィルム２３と、培養空間１２と外部とを連通するためのポート部２５と、を備えている。上記インナーケース２１は、柔軟性フィルム２３が密着されることで、柔軟性フィルム２３に対して固定されている。
本実施形態の閉鎖系細胞培養容器１０は、図１及び図２に示すように、密封収容体１１の内部に培養基部１３及び培養基部１３に接する培養空間１２を備えた容器であり、上部開口２１ａを有する硬質のインナーケース２１と、インナーケース２１を外周側から移動不能に固定して気密に覆う柔軟性フィルム２３と、培養空間１２と外部とを連通するためのポート部２５と、を備えている。上記インナーケース２１は、柔軟性フィルム２３が密着されることで、柔軟性フィルム２３に対して固定されている。
【0025】
密封収容体１１は、培養対象の細胞、細胞懸濁液、培地等を密封して収容する部材であり、本実施形態ではインナーケース２１及び柔軟性フィルム２３により構成されている。培養対象の細胞は何ら限定されるものではなく、接着性細胞であっても浮遊性細胞であってもよい。
【0026】
インナーケース２１は、閉鎖系細胞培養容器１０の所定形状の培養空間１２を内側に確保可能な側周壁２１ｂからなる円形の環状枠体１５と、側周壁２１ｂの一方の端部を気密に閉塞するように側周壁２１ｂと一体に設けられた底壁２１ｃからなる平面状の培養基部１３と、を有している。
インナーケース２１は、柔軟性フィルム２３よりも硬度が高くて透明性を有する材料からなるものが好適であり、その場合、外部から人や機械（カメラ）による観察を容易に行うことができる。柔軟性フルムとインナーケースの両方が透明性を有する場合、培養操作中においても外部から観察することができるので、より好ましい。本実施形態では、インナーケース２１として既存のガラス、ポリスチレン等の透明樹脂からなるシャーレ（ディッシュ）状の培養容器等が使用されている。
インナーケース２１としては、ポリスチレン樹脂、既存のガラスからなるものの他、例えば、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、エチレン－プロピレン共重合体等のポリオレフィン系樹脂、シクロオレフィン系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、メタクリル系樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリサルホン樹脂、ポリエーテルサルホン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリエーテルイミド樹脂、ポリメチルペンテン樹脂、アクリル系樹脂等からなるものなども使用可能である。
これらの中でも、培養容器に求められる成形性及び滅菌性の点から、ポリスチレン樹脂が好ましい。また、樹脂製培養容器とした場合、ディスポーザルタイプとすることが容易である。
インナーケース２１は、柔軟性フィルム２３よりも硬度が高くて透明性を有する材料からなるものが好適であり、その場合、外部から人や機械（カメラ）による観察を容易に行うことができる。柔軟性フルムとインナーケースの両方が透明性を有する場合、培養操作中においても外部から観察することができるので、より好ましい。本実施形態では、インナーケース２１として既存のガラス、ポリスチレン等の透明樹脂からなるシャーレ（ディッシュ）状の培養容器等が使用されている。
インナーケース２１としては、ポリスチレン樹脂、既存のガラスからなるものの他、例えば、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、エチレン－プロピレン共重合体等のポリオレフィン系樹脂、シクロオレフィン系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレンテレフタレート樹脂、メタクリル系樹脂、塩化ビニル樹脂、ポリブチレンテレフタレート樹脂、ポリアリレート樹脂、ポリサルホン樹脂、ポリエーテルサルホン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、ポリエーテルイミド樹脂、ポリメチルペンテン樹脂、アクリル系樹脂等からなるものなども使用可能である。
これらの中でも、培養容器に求められる成形性及び滅菌性の点から、ポリスチレン樹脂が好ましい。また、樹脂製培養容器とした場合、ディスポーザルタイプとすることが容易である。
【0027】
柔軟性フィルム２３は、側周壁２１ｂからなる環状枠体１５を外周側から移動不能に固定して気密に覆うことができるフィルムからなる。柔軟性フィルム２３は、インナーケース２１の少なくとも側周壁２１ｂに密着するとともにインナーケース２１の上部開口２１ａを完全に閉塞するように覆っており、インナーケース２１の全体が柔軟性フィルム２３により気密に囲まれている。
ここで密着とは、一部が接着、溶着等により互いに接合されていてもよいが、対向当接面同士が離間しない状態で当接していれば接合されていなくてもよく、柔軟性フィルム２３にテンションが付された状態、すなわち、インナーケース２１の外表面にだぶつきやたぐまることなく密着し、また、インナーケース２１の底壁側及び上部開口２１ａ側では張った状態でインナーケース２１を覆うことが好ましい。例えば、柔軟性フィルム２３として、熱収縮フィルムなどを使用することにより、インナーケース２１と柔軟性フィルム２３間の密着状態を構成することができる。また、柔軟性フィルム２３の伸縮性を利用して、インナーケース２１と柔軟性フィルム２３間の密着状態を構成することもできる。この場合、側周壁２１ｂに加え、側周壁２１ｂの上下端部、すなわち、上部開口２１ａ側の端部と底壁２１ｃ側の端部に、柔軟性フィルム２３が密着することで、より確実に固定することができる。
ここで密着とは、一部が接着、溶着等により互いに接合されていてもよいが、対向当接面同士が離間しない状態で当接していれば接合されていなくてもよく、柔軟性フィルム２３にテンションが付された状態、すなわち、インナーケース２１の外表面にだぶつきやたぐまることなく密着し、また、インナーケース２１の底壁側及び上部開口２１ａ側では張った状態でインナーケース２１を覆うことが好ましい。例えば、柔軟性フィルム２３として、熱収縮フィルムなどを使用することにより、インナーケース２１と柔軟性フィルム２３間の密着状態を構成することができる。また、柔軟性フィルム２３の伸縮性を利用して、インナーケース２１と柔軟性フィルム２３間の密着状態を構成することもできる。この場合、側周壁２１ｂに加え、側周壁２１ｂの上下端部、すなわち、上部開口２１ａ側の端部と底壁２１ｃ側の端部に、柔軟性フィルム２３が密着することで、より確実に固定することができる。
【0028】
本実施形態の柔軟性フィルム２３は、図２及び図３に示すように、側周壁２１ｂ及び底壁２１ｃの外周を覆う下部フィルム２３ａと、上部開口２１ａを閉塞するように覆う上部フィルム２３ｂと、を備え、これらを互いに接着させることでインナーケース２１を気密に覆っている。ここにおいて、培養容器としては、接着剤の揮発成分の問題などが生じない熱溶着にて接着させることが好ましい。
【0029】
下部フィルム２３ａは、インナーケース２１の底壁２１ｃを覆う平坦な下端部２３ａ１と、インナーケース２１の側周壁２１ｂに対応した筒形状に形成されて側周壁２１ｂを密着して覆う側周部２３ａ２と、側周壁２１ｂより径方向外側に全周にわたり突出した下鍔部２３ａ３と、を有し、これらが立体形状を有して一体に連続している。
上部フィルム２３ｂは、インナーケース２１の上部開口２１ａを塞ぐ開口閉塞部２３ｂ１と、側周壁２１ｂより径方向外側に全周にわたり突出した上鍔部２３ｂ２と、を有し、これらが平坦に連続している。
上部フィルム２３ｂは、インナーケース２１の上部開口２１ａを塞ぐ開口閉塞部２３ｂ１と、側周壁２１ｂより径方向外側に全周にわたり突出した上鍔部２３ｂ２と、を有し、これらが平坦に連続している。
【0030】
下部フィルム２３ａと上部フィルム２３ｂとは、下鍔部２３ａ３と上鍔部２３ｂ２とを互いに対向当接した状態で周方向に連続して溶着されている。ここでは互いに同一素材の柔軟性フィルム２３同士を溶着するので、溶着条件の設定等が容易であり、確実にシール可能である。
本実施形態では、下鍔部２３ａ３及び上鍔部２３ｂ２の周方向における一部に、後述する樹脂成形体からなるポート部２５が配置されているため、下部フィルム２３ａの下鍔部２３ａ３と上部フィルムの上鍔部２３ｂ２とは、ポート部２５を除く部位で互いに溶着されており、残部はそれぞれポート部２５の外周面に溶着されている。
下鍔部２３ａ３、上鍔部２３ｂ２及びポート部２５が周方向に全周で溶着されることで下部フィルム２３ａと上部フィルム２３ｂとが気密に接合されて密封されている。
本実施形態では、下鍔部２３ａ３及び上鍔部２３ｂ２の周方向における一部に、後述する樹脂成形体からなるポート部２５が配置されているため、下部フィルム２３ａの下鍔部２３ａ３と上部フィルムの上鍔部２３ｂ２とは、ポート部２５を除く部位で互いに溶着されており、残部はそれぞれポート部２５の外周面に溶着されている。
下鍔部２３ａ３、上鍔部２３ｂ２及びポート部２５が周方向に全周で溶着されることで下部フィルム２３ａと上部フィルム２３ｂとが気密に接合されて密封されている。
【0031】
本実施形態では、さらに図３に示すように、下部フィルム２３ａの側周部２３ａ２と下鍔部２３ａ３との間には、上部開口２１ａの周囲の上端面２１ｄを密着して気密に覆って側周部２３ａ２に連続する環状括れ部２３ａ４が設けられている。
この環状括れ部２３ａ４は、筒形状の側周部２３ａ２からインナーケース２１の内径と同等又はそれ以下に縮径することで設けられており、周方向の全周に連続している。
また下部フィルム２３ａの下端部２３ａ１と環状括れ部２３ａ４との間の距離がインナーケース２１の側周壁２１ｂの内壁面の高さに対応していて、環状括れ部２３ａ４がインナーケース２１の上部開口２１ａの周縁に密着して形成されている。
この環状括れ部２３ａ４は、筒形状の側周部２３ａ２からインナーケース２１の内径と同等又はそれ以下に縮径することで設けられており、周方向の全周に連続している。
また下部フィルム２３ａの下端部２３ａ１と環状括れ部２３ａ４との間の距離がインナーケース２１の側周壁２１ｂの内壁面の高さに対応していて、環状括れ部２３ａ４がインナーケース２１の上部開口２１ａの周縁に密着して形成されている。
【0032】
このような柔軟性フィルム２３は、例えば透明性及び可撓性を有する樹脂フィルムにより構成されていてもよい。例えば、熱可塑性樹脂からなる熱収縮可能なフィルムであれば、加熱によりインナーケース２１に密着させやすい。また熱可塑性樹脂であれば溶着により密封し易く好適である。また下部フィルム２３ａと上部フィルム２３ｂとが同一材料からなるのが好適であるが、互いに溶着可能な相溶性を有する材料からなるものであれば、異素材であってもよい。例えば、互いに溶着可能な相溶性を有する材料からなるものであることを前提に、上部フィルム２３ｂをインナーケース２１と同素材から構成することとしてもよい。
本実施形態の柔軟性フィルム２３は、上述の通り、空気を透過させない気密性のフィルムを用いたが、液体だけ遮蔽できれば良い場合には、液密性のフィルムを用いても良い。
柔軟性フィルム２３は、用途、要求により適するフィルムを用いることができる。例えば、培養細胞の種類や高酸素や低酸素等の培養環境に合わせて酸素や特定ガスのガス透過性柔軟性フィルムや酸素等の透過を抑制したガス非透過性フィルムを選択できる。
上記用途、要求に合わせて、柔軟性フィルム２３としては、例えば低密度又は高密度ポリエチレン樹脂（直鎖状ポリエチレンを含む）、エチレン－酢酸ビニル共重合樹脂（ＥＶＡ）、ポリプロピレン樹脂、エチレン－プロピレン共重合樹脂、ポリブタジエン樹脂、スチレン－ブタジエン共重合樹脂およびそれらの水素添加樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリアミド系樹脂（ナイロン樹脂）ならびにそれらの樹脂の混合物などからなるものを使用してもよい。これらを単層又は複層フィルムとして用いる他、異なる素材フィルムを組み合わせた積層フィルムとして用いても良い。更には、フィルムの表層若しくは中間層にシリカ蒸着フィルム、アルミナ蒸着フィルムやポリビニルアルコールフィルム等のガスバリアー製のフィルムを用いた積層フィルム等を使用しても良い。
更に、部位により、用いるフィルムを異ならせることもできる。例えば、細胞培養においては、酸素を透過させるＥＶＡフィルムを用いることが好ましいが、上部フィルム２３ｂには下部フィルム２３ａより薄いＥＶＡフィルムを使用することで、培養空間により多くの酸素を供給しやすくすることができる。
本実施形態の柔軟性フィルム２３は、上述の通り、空気を透過させない気密性のフィルムを用いたが、液体だけ遮蔽できれば良い場合には、液密性のフィルムを用いても良い。
柔軟性フィルム２３は、用途、要求により適するフィルムを用いることができる。例えば、培養細胞の種類や高酸素や低酸素等の培養環境に合わせて酸素や特定ガスのガス透過性柔軟性フィルムや酸素等の透過を抑制したガス非透過性フィルムを選択できる。
上記用途、要求に合わせて、柔軟性フィルム２３としては、例えば低密度又は高密度ポリエチレン樹脂（直鎖状ポリエチレンを含む）、エチレン－酢酸ビニル共重合樹脂（ＥＶＡ）、ポリプロピレン樹脂、エチレン－プロピレン共重合樹脂、ポリブタジエン樹脂、スチレン－ブタジエン共重合樹脂およびそれらの水素添加樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリアミド系樹脂（ナイロン樹脂）ならびにそれらの樹脂の混合物などからなるものを使用してもよい。これらを単層又は複層フィルムとして用いる他、異なる素材フィルムを組み合わせた積層フィルムとして用いても良い。更には、フィルムの表層若しくは中間層にシリカ蒸着フィルム、アルミナ蒸着フィルムやポリビニルアルコールフィルム等のガスバリアー製のフィルムを用いた積層フィルム等を使用しても良い。
更に、部位により、用いるフィルムを異ならせることもできる。例えば、細胞培養においては、酸素を透過させるＥＶＡフィルムを用いることが好ましいが、上部フィルム２３ｂには下部フィルム２３ａより薄いＥＶＡフィルムを使用することで、培養空間により多くの酸素を供給しやすくすることができる。
【0033】
ポート部２５は、インナーケース２１の径方向に対応する軸方向に延び、軸方向に貫通孔２５ａが設けられた樹脂成形体からなる。このポート部２５は、培養空間１２と外部とを連通し、又、キャップ２９などで閉塞可能にインナーケース２１の上部開口２１ａ付近に配置されており、柔軟性フィルム２３の下部フィルム２３ａと上部フィルム２３ｂとの間に挟み込んだ状態で気密に接合されている。
【0034】
ポート部２５の形状は、特に限定されるものではないが、厚みｔに対して幅ｗが大きい扁平形状に形成され、幅ｗ方向の中心側から両側縁に向けて厚みｔが漸減する断面形状を有している。この形状により下部フィルム２３ａと上部フィルム２３ｂとの間で容易に気密に溶着可能となっている。
【0035】
装着状態におけるポート部２５の軸方向の一端側には、培養空間１２内に突出した内側突出部２５ｂが設けられ、軸方向の他端側には、外部に突出してピペットやシリンジ等の外部器具が接続される外部接続部２５ｃが設けられている。
内側突出部２５ｂはインナーケース２１の側周壁２１ｂの高さに対応する長さを有している。内側突出部２５ｂの先端側は先細り形状に形成され、先端には貫通孔２５ａの開口２５ｄが設けられている。
一方、外部接続部２５ｃは、詳細な図示は省略しているが、例えば、ルアテーパのポートやニードルレスゴム栓等、使用する外部器具の接続形状に対応した形状を有し、外部機器を接続しない場合には、キャップ２９などで閉塞されている。
内側突出部２５ｂはインナーケース２１の側周壁２１ｂの高さに対応する長さを有している。内側突出部２５ｂの先端側は先細り形状に形成され、先端には貫通孔２５ａの開口２５ｄが設けられている。
一方、外部接続部２５ｃは、詳細な図示は省略しているが、例えば、ルアテーパのポートやニードルレスゴム栓等、使用する外部器具の接続形状に対応した形状を有し、外部機器を接続しない場合には、キャップ２９などで閉塞されている。
【0036】
このポート部２５は、柔軟性フィルム２３の下部フィルム２３ａと上部フィルム２３ｂとの間で支持されることで、図４及び図５に示すように、柔軟性フィルム２３の柔軟性により変位可能となっている。この変位により、内側突出部２５ｂは、図４のように、上部フィルム２３ｂの開口閉塞部２３ｂ１に沿って配置されて培地２７より上方の位置と、図５のように、開口２５ｄがインナーケース２１の側周壁２１ｂ側で培地２７に浸漬される位置との間で、変位することができる。ポート部２５は、培地２７より上方の位置と培地２７に浸漬しない位置に保持できるように形状維持性を有する素材から構成されることが好ましい。ポート部２５は柔軟性フィルム２３と接合可能な材料からなるものがよく、本実施形態では上部フィルム２３ｂ及び下部フィルム２３ａと溶着可能な材料からなるものを使用している。
【0037】
このような閉鎖系細胞培養容器１０を製造するには、まず培養対象の細胞に適したインナーケース２１を準備する。インナーケース２１の底壁２１ｃの表面からなる培養基部１３がそのままの状態で培養対象の細胞に適したものでない場合、インナーケース２１が単体の状態でインナーケース２１の底壁２１ｃなどを表面処理し、培養対象の細胞に適した表面の性状、例えば、親水性表面に改質して培養基部１３を作製する。
【0038】
このインナーケース２１に、例えば平坦な熱可塑性樹脂からなる柔軟性フィルムを底壁２１ｃ側から被せて加熱収縮や真空引きするなどして下端部２３ａ１、側周部２３ａ２、環状括れ部２３ａ４及び下鍔部２３ａ３を有する下部フィルム２３ａを、インナーケース２１の外周に密着させて成形する。
【0039】
次に予め作製した樹脂成形体からなるポート部２５を所定位置に配置した状態で、インナーケース２１の上部開口２１ａを閉塞する位置に平坦な上部フィルム２３ｂを配置し、下部フィルム２３ａの下鍔部２３ａ３と上部フィルム２３ｂの上鍔部２３ｂ２とを対向当接させる。
この状態で下部フィルム２３ａの下鍔部２３ａ３と上部フィルム２３ｂの上鍔部２３ｂ２とを溶着するとともに、上部フィルム２３ｂとポート部２５との間及びポート部２５と下部フィルム２３ａとの間を溶着することで、図１及び図２に示すような閉鎖系細胞培養容器１０を製造することができる。
この状態で下部フィルム２３ａの下鍔部２３ａ３と上部フィルム２３ｂの上鍔部２３ｂ２とを溶着するとともに、上部フィルム２３ｂとポート部２５との間及びポート部２５と下部フィルム２３ａとの間を溶着することで、図１及び図２に示すような閉鎖系細胞培養容器１０を製造することができる。
【0040】
このようにして製造された閉鎖系細胞培養容器１０を用いて細胞を培養するには、図２に示すような閉鎖系細胞培養容器１０を予め滅菌して準備する。所望の培養基部１３や培養空間１２を準備するために、滅菌された閉鎖系細胞培養容器１０の内部に必要に応じて各種の処理を施してもよい。例えばコラーゲンコーティングやフィブロネクチンコーティングなどのコーティングを行う場合には、図示しないシリンジにコーティング液を入れ、シリンジをポート部２５の外部接続部２５ｃに接続して注入し、培養基部１３全体にいきわたらせて所定時間放置する。その後、コーティング液をポート部２５からシリンジにより吸い出して抜き取る。
【0041】
これらの準備が完了した後、細胞播種を行う。培養対象の細胞を培地２７に懸濁させて細胞懸濁液を作製し、図示しないシリンジに細胞懸濁液を入れてポート部２５の外部接続部２５ｃに接続し、閉鎖系細胞培養容器１０に注入する。その後、所定期間インキュベータ内に静置し、培養対象の細胞を培養基部１３に接着させる。
培養基部１３に接着しなかった細胞を取り除くため、後述する培地交換と同様の作業により、閉鎖系細胞培養容器１０内の細胞懸濁液を所定量乃至全量を取り除き、新たな培地２７を注入し、培養を開始する。
培養基部１３に接着しなかった細胞を取り除くため、後述する培地交換と同様の作業により、閉鎖系細胞培養容器１０内の細胞懸濁液を所定量乃至全量を取り除き、新たな培地２７を注入し、培養を開始する。
【0042】
培養は、インキュベータ等の温度や湿度が調整された所定の培養雰囲気下に閉鎖系細胞培養容器１０を静置することで行う。このときポート部２５をキャップ２９により閉塞した状態で、図２のように培地２７や細胞懸濁液等からなる収容液の液面より上方に配置しておく。これによりポート部２５から不要な振動や刺激等が培養空間１２内の培地２７に伝達されることを防止する。
【0043】
このような培養期間中には、定期的に目視や顕微鏡による内部の観察を行い、また培地交換を行う。
閉鎖系細胞培養容器１０内の観察を行うには、図２のように培養雰囲気下に配置されている閉鎖系細胞培養容器１０を、柔軟性フィルム２３の外側から人手又は機械腕により支持して所定位置に運搬し、目視や顕微鏡で観察する。このとき柔軟性フィルム２３により培養空間の無菌状態が確保できるため無菌状態が確保されていない外部空間にて行うことができる。
閉鎖系細胞培養容器１０内の観察を行うには、図２のように培養雰囲気下に配置されている閉鎖系細胞培養容器１０を、柔軟性フィルム２３の外側から人手又は機械腕により支持して所定位置に運搬し、目視や顕微鏡で観察する。このとき柔軟性フィルム２３により培養空間の無菌状態が確保できるため無菌状態が確保されていない外部空間にて行うことができる。
【0044】
培地交換を行うには、まず図４に示すように、ポート部２５のキャップ２９を取り外して外部接続部２５ｃを露出させ、この外部接続部２５ｃに図示しないシリンジを接続し、図５のように柔軟性フィルム２３の柔軟性により、インナーケース１の上部開口２１ａ付近を支点にして変位させる。ポート部２５の内側突出部２５ｂの長さがインナーケース２１の側周壁２１ｂの高さに対応するため、変位により内側突出部２５ｂの先端、すなわち開口２５ｄをインナーケース２１の側周壁２１ｂ側で培地２７内に浸漬することができ、底壁２１ｃの角部に届くことができる。
【0045】
この状態で閉鎖系細胞培養容器１０を傾斜させて排出しようとする使用済みの培地２７を集めて、ポート２５の開口２５ｄから図示しないシリンジにより吸引し、吸引操作終了後、ポート２５の開口２５ｄを上部開口２１ａ付近まで戻し、使用済みの培地２７が液戻りしないように配慮しつつ、図示しないシリンジを取り外すことで、無菌的に使用済みの培地２７を容易且つ確実に排出する。
次いで、滅菌処理された新たな培地２７をシリンジに必要量とり、図５のように変位させた状態で、シリンジをポート２５の外部接続部２５ｃに接続して、新たな培地をインナーケース２１の側周壁２１ｂ側における底壁２１ｃの角部に穏やかに注ぎ入れる。
その後、培養雰囲気下で静置して培養を継続する。培養期間は目的や細胞種により適宜設定することができる。
このようにして１乃至複数回の観察や培地交換を無菌的に行いつつ、培養期間を経過することで培養を終了する。
次いで、滅菌処理された新たな培地２７をシリンジに必要量とり、図５のように変位させた状態で、シリンジをポート２５の外部接続部２５ｃに接続して、新たな培地をインナーケース２１の側周壁２１ｂ側における底壁２１ｃの角部に穏やかに注ぎ入れる。
その後、培養雰囲気下で静置して培養を継続する。培養期間は目的や細胞種により適宜設定することができる。
このようにして１乃至複数回の観察や培地交換を無菌的に行いつつ、培養期間を経過することで培養を終了する。
【0046】
培養終了後には、閉鎖系細胞培養容器１０から培養した細胞を回収する。まず培地交換と同様にして、閉鎖系細胞培養容器１０内の培地２７を十分に取り除き、培地交換と同様の方法で、リン酸緩衝液洗浄を行う。
所定量のリン酸緩衝液をシリンジにより閉鎖系細胞培養容器１０内に注入し、インナーケース２１内によくいきわたらせる。その後、リン酸緩衝液を十分に吸引して、閉鎖系細胞培養容器１０内から十分に取り除く。このリン酸緩衝液洗浄を１乃至複数繰り返して行う。
所定量のリン酸緩衝液をシリンジにより閉鎖系細胞培養容器１０内に注入し、インナーケース２１内によくいきわたらせる。その後、リン酸緩衝液を十分に吸引して、閉鎖系細胞培養容器１０内から十分に取り除く。このリン酸緩衝液洗浄を１乃至複数繰り返して行う。
【0047】
次いで、トリプシン溶液を用いて培地交換と同様の方法で処理する。トリプシン溶液をシリンジにより閉鎖系細胞培養容器１０内に注入し、インナーケース２１内によくいきわたらせる。数十秒～数分間、室温またはインキュベータ内で静置し、トリプシンを効かせる。
次いでトリプシン溶液を排出し、血清入のリン酸緩衝液や培地２７等を注入し、細胞懸濁液や細胞シートの状態で回収可能にする。このとき培養された細胞を培養基部１３から剥がしたり、細胞同士の接着を切ったりすることを目的として、適宜ピペッティングなどを行うことができる。
次いでトリプシン溶液を排出し、血清入のリン酸緩衝液や培地２７等を注入し、細胞懸濁液や細胞シートの状態で回収可能にする。このとき培養された細胞を培養基部１３から剥がしたり、細胞同士の接着を切ったりすることを目的として、適宜ピペッティングなどを行うことができる。
【0048】
その後、培養された細胞の細胞懸濁液をシリンジに吸引するなどして、閉鎖系細胞培養容器１０を開封してインナーケース２１の上部開口２１ａから取り出して使用する。
閉鎖系細胞培養容器１０を開封する場合、柔軟性フィルム２３を切断してインナーケース２１の上部開口２１ａを開口させることができる。その場合、図４に仮想線で示すように、インナーケース２１の側周壁２１ｂに対応する部位に刃物３１を当てて外側から柔軟性フィルム２３を切断する。
閉鎖系細胞培養容器１０を開封する場合、柔軟性フィルム２３を切断してインナーケース２１の上部開口２１ａを開口させることができる。その場合、図４に仮想線で示すように、インナーケース２１の側周壁２１ｂに対応する部位に刃物３１を当てて外側から柔軟性フィルム２３を切断する。
【0049】
刃物３１を側周壁２１ｂに沿って１周移動させることで、図６に示すように、柔軟性フィルム２３の上部フィルム２３ｂ側を切断分離し、上部フィルム２３ｂをインナーケース２１の上部開口２１ａから除去する。このとき上部フィルム２３ｂがインナーケース２１に接着や溶着することなく密着した状態で配置されていたことで、切断後にインナーケース２１の上部開口２１ａから容易に除去することができる。
その後、インナーケース２１の上部開口２１ａから細胞を取り出して使用する。
その後、インナーケース２１の上部開口２１ａから細胞を取り出して使用する。
【0050】
以上のような本実施形態の閉鎖系細胞培養容器１０によれば、まず、インナーケース２１の側周壁２１ｂを柔軟性フィルム２３により外周側から移動不能に固定して気密に覆うことで、環状枠体１５である側周壁に囲まれた内側に移動不能に培養空間１２及び培養基部１３を設けている。そのため培養空間１２及び培養基部１３を閉鎖系に保つことができ細胞培養を無菌的に行うことができる。
【0051】
同時に培養空間１２及び培養基部１３を柔軟性フィルム２３に対して所定位置に固定して配置できるとともに培養空間１２を所定形状に保つことができ、またインナーケース２１の外側面と柔軟性フィルム２３とが密着しているので、細胞培養途中や終了時などに、柔軟性フィルム２３に比べて硬度の高いインナーケース２１を外側から柔軟性フィルム２３を介して確実に把持することができ、培養空間１２及び培養基部１３が変位したり変形したりすることを抑えることができる。
【0052】
その結果、閉鎖系のまま無菌的に細胞培養を容易に行うことができるとともに人手であっても機械腕であっても安定して支持することができる。そのため安定した運搬や、培地交換、観察等の各種の培養操作が無菌的に安定して行うことができ、機械による自動化にも対応可能である。
【0053】
本実施形態の閉鎖系細胞培養容器１０では、培養基部１３がインナーケース２１の底壁２１ｃからなるとともに、環状枠体１５がインナーケース２１の側周壁２１ｂからなるので、インナーケース２１に培養基部１３及び環状枠体１５が一体に設けられている。そのため培養基部１３及び培養空間１２を確実に所定位置及び所定形状に保つことができ、培養基部１３及び培養空間１２で確実に安定して無菌的に細胞培養を行うことができる。
【0054】
本実施形態の閉鎖系細胞培養容器１０では、柔軟性フィルム２３がインナーケース２１の外周全体を覆っているため、インナーケース２１に関わらずに柔軟性フィルム２３により培養空間１２及び培養基部１３を確実に密封できる。そのため、インナーケース２１の材質を柔軟性フィルム２３の材質に関わらず自由に選択でき、例えばインナーケース２１と柔軟性フィルム２３との相溶性が低くて溶着できない組み合わせであっても使用可能である。
【0055】
またインナーケース２１に各種の処理を施して柔軟性フィルム２３により密封することが容易にでき、例えば接着性細胞を培養するインナーケース２１の場合、インナーケース２１単体の状態で培養基部１３に親水化処理を施すなど、培養対象の細胞や環境等に応じてインナーケース２１に各種の処理を施すことが可能である。つまり、必要な部位に所望の処理を施した閉鎖系細胞培養容器１０を容易に得ることができる。
【0056】
さらに側周壁２１ｂの外側に柔軟性フィルム２３が配置されるため、側周壁２１ｂの外周側で柔軟性フィルム２３を刃物３１により切断できる。そのため柔軟性フィルム２３からインナーケース２１を取り出す際、インナーケース２１内の培地２７に刃物３１が直接接触したり、切断時に生じる異物がインナーケース２１内に落下したりすることがなく、培養された細胞や培地２７が異物や雑菌等で汚染されることを防止できる。
【0057】
本実施形態の閉鎖系細胞培養容器１０では、柔軟性フィルム２３が、側周壁２１ｂを覆う下部フィルム２３ａと、上部開口２１ａを覆う上部フィルム２３ｂと、を備え、インナーケース２１の側周壁２１ｂより径方向外側に突出した下部フィルム２３ａの下鍔部２３ａ３と上部フィルム２３ｂの上鍔部２３ｂ２とが気密に溶着されている。インナーケース２１が存在していても、下鍔部２３ａ３と上鍔部２３ｂ２とがインナーケース２１の外側に位置し、溶着作業が容易となり、確実な密閉が可能となる。そのため、インナーケース２１内の培養空間１２及び培養基部１３を容易且つ確実に密封することが可能である。
【0058】
本実施形態の閉鎖系細胞培養容器１０では、下部フィルム２３ａの側周壁２１ｂに密着する側周部２３ａ２と下鍔部２３ａ３との間に、上部開口２１ａの上端面２１ｄを覆う環状括れ部２３ａ４が設けられている。そのため下部フィルム２３ａがインナーケース２１の上端面２１ｄを覆うことで、インナーケース２１を上下方向から挟み込むことになり、インナーケース２１を安定して固定できることに加え、インナーケース２１内の培地２７が外側に溢れ難くできる。特に、上部開口２１ａの上端面２１ｄに下部フィルム２３ａを密着させることで、インナーケース２１と下部フィルム２３ａの間に培地２７が入り込むことを防止できる。
【0059】
しかも、側周壁２１ｂに密着して固定されている下部フィルム２３ａの側周部２３ａ２に対し、環状括れ部２３ａ４が蛇腹状に変形容易になるので、下鍔部に溶着された上部フィルム２３ｂが変位乃至変形し易くなる。そのため、インナーケース２１が硬質であっても、上部フィルム２３ｂと下部フィルム２３ａとが溶着して形成された閉鎖系を保ちつつ、上部フィルム２３ｂを変形乃至変位させて容積を変化でき、例えば培地２７の収容排出等の操作を容易に行うことができる。
【0060】
本実施形態の閉鎖系細胞培養容器１０では、培養空間１２と外部とを連通するポート部２５が柔軟性フィルム２３に変位可能に支持されることにより、柔軟性フィルムを開封することなく、開閉可能なポート部２５を通じて培地や細胞の排出や導入を容易に行うことができる。このときポート部２５が柔軟性フィルム２３に設けられているので、ポート部２５の操作自由度が高い。
【0061】
本実施形態の閉鎖系細胞培養容器１０では、ポート部２５の培養空間１２内に突出した内側突出部２５ｂの開口２５ｄが、培養空間１２内の培地２７に浸漬される位置と上方の位置との間で変位可能となっている。そのため、ポート部２５の内側突出部２５ｂの開口２５ｄを培地２７より上方の位置に配置して細胞培養を行うことができ、ポート部２５から培地２７へ振動が伝わったり、ポート部２５との接触により細胞が損傷したりすることなどを防止でき、安定した細胞培養を行うことができる。一方、ポート部２５を変位させれば、内側突出部２５ｂの開口２５ｄを培地２７中に浸漬でき、例えばポート部２５から培地２７の排出や導入を穏やかに行うことができ、培養する細胞に過剰に刺激を与えることを防止できる。
【0062】
本実施形態の閉鎖系細胞培養容器１０では、内側突出部２５ｂが側周壁２１ｂの高さに応じた長さを有し、内側突出部２５ｂの開口２５ｄがインナーケース２１の周壁部に沿った位置で培地２７に浸漬可能であるので、ポート部２５を変位させて内側突出部２５ｂの開口２５ｄを培地２７に浸漬させても、インナーケース２１内で膜状に培養された細胞の中央側に内側突出部２５ｂが接触することがなく、培養された細胞に損傷を与えるようなことを防止できる。
また、培地２７の排出または導入に合わせてポート２５を変位させたり、インナーケース２１を傾けたりすることで、培地の出し入れなどを行うことができるため、培地２７が上部フィルム２３ｂの内面などに触れる機会を低減することができる。上部フィルム２３ｂの内面は、当然に減菌処理されているが、触れる必要がない部位に培地２７が触れる機会を低減することで、培地２７の汚染リスクをより下げることができる。
また、培地２７の排出または導入に合わせてポート２５を変位させたり、インナーケース２１を傾けたりすることで、培地の出し入れなどを行うことができるため、培地２７が上部フィルム２３ｂの内面などに触れる機会を低減することができる。上部フィルム２３ｂの内面は、当然に減菌処理されているが、触れる必要がない部位に培地２７が触れる機会を低減することで、培地２７の汚染リスクをより下げることができる。
【0063】
［変形例］
以下、本実施形態の変形例について説明する。
図７（ａ）（ｂ）は、上記実施形態の一変形例の閉鎖系細胞培養容器１０を示している。図７（ａ）の閉鎖系細胞培養容器１０は、インナーケース２１の側周壁２１ｂの外周側の全周にガイド部材３３が配置されていて、このガイド部材３３がインナーケース２１の側周壁２１ｂとともに、柔軟性フィルム２３の下部フィルム２３ａにより連続して密着して覆われている。
以下、本実施形態の変形例について説明する。
図７（ａ）（ｂ）は、上記実施形態の一変形例の閉鎖系細胞培養容器１０を示している。図７（ａ）の閉鎖系細胞培養容器１０は、インナーケース２１の側周壁２１ｂの外周側の全周にガイド部材３３が配置されていて、このガイド部材３３がインナーケース２１の側周壁２１ｂとともに、柔軟性フィルム２３の下部フィルム２３ａにより連続して密着して覆われている。
【0064】
ここではガイド部材３３が筒形の硬質リングからなり、インナーケース２１の側周壁２１ｂの底壁２１ｃ側端部における外周側にずれない程度に遊嵌されている。これにより、側周壁２１ｂの外周に側周壁２１ｂとガイド部材３３との間に、全周に連続するガイド部としての段差部３５が形成される。そしてガイド部材３３と側周壁２１ｂとが段差部３５を介して柔軟性フィルム２３により連続して密着して覆われている。
なお、ガイド部材３３の外周に環状に溝部が設けられていてもよく、その場合には溝部の外周も柔軟性フィルム２３により覆われている。
その他は上記実施形態と同様である。
なお、ガイド部材３３の外周に環状に溝部が設けられていてもよく、その場合には溝部の外周も柔軟性フィルム２３により覆われている。
その他は上記実施形態と同様である。
【0065】
このような閉鎖系細胞培養容器１０であっても上記実施形態と同様の作用効果が得られる。しかもこの変形例では、側周壁２１ｂの外周側にガイド部材３３が配置され、段差部３５が全周に形成されて柔軟性フィルム２３により覆われている。
そのため、側周壁２１ｂの外周側で刃物３１により柔軟性フィルム２３を切断する際、刃物３１をガイド部材３３の段差部３５に当てた状態で、刃物３１を側周壁２１ｂに沿って移動させることで、柔軟性フィルム２３を容易に切断することができる。すなわち、上記段差部３５が、ガイド部として、柔軟性フィルム２３を切断する際に刃物３１を案内する。
そのため、側周壁２１ｂの外周側で刃物３１により柔軟性フィルム２３を切断する際、刃物３１をガイド部材３３の段差部３５に当てた状態で、刃物３１を側周壁２１ｂに沿って移動させることで、柔軟性フィルム２３を容易に切断することができる。すなわち、上記段差部３５が、ガイド部として、柔軟性フィルム２３を切断する際に刃物３１を案内する。
【0066】
この変形例では、ガイド部材３３を側周壁２１ｂの外周側に配置することでガイド部としての段差部３３を形成したが、ガイド部を別の構成にすることも可能である。例えば、図７（ｂ）に示すように、側周壁２１ｂの外周面に、切断の想定ラインに沿ってガイド部として突条３６を単数又は複数設けることで、押し当てる刃物３１を突条３６により案内するようにしてもよい。
ガイド部は押し当てる刃物３１を側周壁２１ｂの外周面で案内できればよいので、上記突条３６の他にも、溝や複数の凸部などで形成することもできる。
ガイド部は押し当てる刃物３１を側周壁２１ｂの外周面で案内できればよいので、上記突条３６の他にも、溝や複数の凸部などで形成することもできる。
【0067】
なお、上記実施形態及び変形例は、本発明の範囲内において適宜変更可能である。
上記実施形態では、底壁２１ｃ及び側周壁２１ｂを有するインナーケース２１を、柔軟性フィルム２３で少なくとも液密に覆った閉鎖系細胞培養容器１０の例について説明したが、特に限定されるものではない。
例えば図８に示すように、両端が開口した環形状を有する環状枠体１５を、柔軟性フィルム２３で少なくとも液密に覆うことで、閉鎖系細胞培養容器１０とすることも可能である。その場合、環状枠体１５に囲まれた内側の空間内の柔軟性フィルム２３における内側表面が培養基部１３となり、環状枠体１５の内側の空間が培養空間１２となる。このような構成にしても、上記実施形態と同様に、運搬、培地交換、観察等の各種の培養操作を無菌的に安定して行うことが可能な閉鎖系細胞培養容器１０として使用することができる。
上記実施形態では、底壁２１ｃ及び側周壁２１ｂを有するインナーケース２１を、柔軟性フィルム２３で少なくとも液密に覆った閉鎖系細胞培養容器１０の例について説明したが、特に限定されるものではない。
例えば図８に示すように、両端が開口した環形状を有する環状枠体１５を、柔軟性フィルム２３で少なくとも液密に覆うことで、閉鎖系細胞培養容器１０とすることも可能である。その場合、環状枠体１５に囲まれた内側の空間内の柔軟性フィルム２３における内側表面が培養基部１３となり、環状枠体１５の内側の空間が培養空間１２となる。このような構成にしても、上記実施形態と同様に、運搬、培地交換、観察等の各種の培養操作を無菌的に安定して行うことが可能な閉鎖系細胞培養容器１０として使用することができる。
【0068】
さらに培養基部１３は、インナーケース２１の底壁２１ｃや柔軟性フィルム２３等の密封収容体自体の表面でなくてもよく、密封収容体１１の内部に、板材、フィルム、メッシュ等のような別部材からなる培養基部１３を収容して構成してもよい。
【0069】
また上記実施形態では、環状枠体１５は上面視円形であるが、上面視で楕円形、四角形、六角形等の多角形など、内側に培養空間１２を保持できる形状であればよい。
さらに内側が複数に区画された環状枠体１５を用いることもできる。例えば図９に示すように、内部が複数に仕切られた環状枠体１５を柔軟性フィルム２３により少なくとも液密に覆うことで、複数に区画された培養空間１２や培養基部１３を設けてもよい。これにより、シート状に培養された培養細胞群（細胞シート）を区画毎に取り出すことができ操作性がよい。
また変位自在なポート部２５を各区画に対応して１つ或いは複数配置することで、区画された培養基部１３に適するように培地の供給や排出を行うことができる。場合によっては、ポート部２５からの培地の噴流によって、培養細胞群（細胞シート）を底壁から剥離する操作などを行うこともできる。
さらに内側が複数に区画された環状枠体１５を用いることもできる。例えば図９に示すように、内部が複数に仕切られた環状枠体１５を柔軟性フィルム２３により少なくとも液密に覆うことで、複数に区画された培養空間１２や培養基部１３を設けてもよい。これにより、シート状に培養された培養細胞群（細胞シート）を区画毎に取り出すことができ操作性がよい。
また変位自在なポート部２５を各区画に対応して１つ或いは複数配置することで、区画された培養基部１３に適するように培地の供給や排出を行うことができる。場合によっては、ポート部２５からの培地の噴流によって、培養細胞群（細胞シート）を底壁から剥離する操作などを行うこともできる。
【0070】
また上記実施形態では、柔軟性フィルム２３がインナーケース２１の全体を覆うように構成された例について説明したが、インナーケース２１の内側の空間を少なくとも液密に密封できる限り、インナーケース２１の一部を覆うように構成することも可能である。即ち、柔軟性フィルム２３によりインナーケース２１の側周壁２１ｂの外周面だけを覆うことで密着させた状態で、上部開口２１ａを閉塞することで少なくとも液密に密封できれば、インナーケース２１の残部を柔軟性フィルム２３により覆わなくてもよい。
【0071】
さらに上記実施形態では、柔軟性フィルム２３が下部フィルム２３ａと上部フィルム２３ｂとの２分割構造を有する例について説明したが、一体の柔軟性フィルム２３や３分割以上に分割された柔軟性フィルム２３により、インナーケース２１や環状枠体１５を覆うように構成してもよい。
【0072】
上記実施形態では、柔軟性フィルム２３が下鍔部２３ａ３と上鍔部２３ｂ２との加熱による溶着によって密封された例について説明したが、接着等の他の方法で接合して密封することも可能である。接着剤等を用いる場合、培養対象の細胞、細胞懸濁液、培地２７等に直接接触しない部位で接合するのがよく、例えば環状枠体１５の外周側で接着してもよい。
また、柔軟性フィルム２３の下鍔部２３ａ３と上鍔部２３ｂ２とを溶着により密封する場合において、少なくとも液密性を確保できる程度の弱シール、所謂イージーピールを採用してもよい。その場合、培養空間の培養細胞などを取り出す際に上部フィルムの剥離を容易にするため、例えば舌片状の剥離用つまみ部を形成しておくことが望ましい。
さらに上記実施形態では、ポート部２５が柔軟性フィルム２３に変位可能に支持されることで、内側突出部２５ｂの開口２５ｄを変位可能にした例について説明したが、これに限定されるものではなく、例えば柔軟性フィルム２３の伸縮等によって内側突出部２５ｂの開口２５ｄを変位可能に構成してもよい。
また、柔軟性フィルム２３の下鍔部２３ａ３と上鍔部２３ｂ２とを溶着により密封する場合において、少なくとも液密性を確保できる程度の弱シール、所謂イージーピールを採用してもよい。その場合、培養空間の培養細胞などを取り出す際に上部フィルムの剥離を容易にするため、例えば舌片状の剥離用つまみ部を形成しておくことが望ましい。
さらに上記実施形態では、ポート部２５が柔軟性フィルム２３に変位可能に支持されることで、内側突出部２５ｂの開口２５ｄを変位可能にした例について説明したが、これに限定されるものではなく、例えば柔軟性フィルム２３の伸縮等によって内側突出部２５ｂの開口２５ｄを変位可能に構成してもよい。
【符号の説明】
【0073】
１０ 閉鎖系細胞培養容器
１１ 密封収容体
１２ 培養空間
１３ 培養基部
１５ 環状枠体
２１ インナーケース
２１ａ 上部開口
２１ｂ 側周壁
２１ｃ 底壁
２１ｄ 上端面
２３ 柔軟性フィルム
２３ａ 下部フィルム
２３ｂ 上部フィルム
２３ａ１ 下端部
２３ａ２ 側周部
２３ａ３ 下鍔部
２３ａ４ 環状括れ部
２３ｂ１ 開口閉塞部
２３ｂ２ 上鍔部
２５ ポート部
２５ａ 貫通孔
２５ｂ 内側突出部
２５ｃ 外部接続部
２５ｄ 開口
２７ 培地
２９ キャップ
３１ 刃物
３３ ガイド部材
３５ 段差部（ガイド部）
３６ 突条（ガイド部）
ｔ 厚み
ｗ 幅
１１ 密封収容体
１２ 培養空間
１３ 培養基部
１５ 環状枠体
２１ インナーケース
２１ａ 上部開口
２１ｂ 側周壁
２１ｃ 底壁
２１ｄ 上端面
２３ 柔軟性フィルム
２３ａ 下部フィルム
２３ｂ 上部フィルム
２３ａ１ 下端部
２３ａ２ 側周部
２３ａ３ 下鍔部
２３ａ４ 環状括れ部
２３ｂ１ 開口閉塞部
２３ｂ２ 上鍔部
２５ ポート部
２５ａ 貫通孔
２５ｂ 内側突出部
２５ｃ 外部接続部
２５ｄ 開口
２７ 培地
２９ キャップ
３１ 刃物
３３ ガイド部材
３５ 段差部（ガイド部）
３６ 突条（ガイド部）
ｔ 厚み
ｗ 幅
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】