特許 7355977 ＣＤ２４に結合する抗体、その調製および使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-26

(45)【発行日】2023-10-04

(54)【発明の名称】ＣＤ２４に結合する抗体、その調製および使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20230927BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20230927BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20230927BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20230927BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20230927BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230927BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20230927BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20230927BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20230927BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20230927BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20230927BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20230927BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K16/28

A61K39/395 N

A61K31/7088

A61K35/12

A61P35/00

A61P35/02

【請求項の数】 13

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022019864

(22)【出願日】2022-02-10

(65)【公開番号】P2023058416

(43)【公開日】2023-04-25

【審査請求日】2022-04-04

(31)【優先権主張番号】202111195246.5

(32)【優先日】2021-10-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】517342693

【氏名又は名称】イミューンオンコ バイオファーマシューティカルズ （シャンハイ） インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000877

【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ウェンジ ティアン

(72)【発明者】

【氏名】ソン リ

(72)【発明者】

【氏名】ディアンゼ チェン

(72)【発明者】

【氏名】フイチン グオ

【審査官】小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０２０／２６１２８０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／２２２０８２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０８３７３５０４（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＤ２４に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
ｉ）重鎖可変領域であって、配列番号１、２および３にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ－１（ＨＶ－ＣＤＲ１）、ＨＶ－ＣＤＲ２およびＨＶ－ＣＤＲ３を有する重鎖可変領域と、
ｉｉ）軽鎖可変領域であって、配列番号４、５および６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ－１（ＬＶ－ＣＤＲ１）、ＬＶ－ＣＤＲ２およびＬＶ－ＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域と
を備える、単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【請求項2】

前記重鎖可変領域は、配列番号７または１０に対して少なくとも９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【請求項3】

前記軽鎖可変領域は、配列番号８、９または１１に対して少なくとも９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【請求項4】

前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域は、ｉ）それぞれ配列番号７および８、ｉｉ）それぞれ配列番号７および９、またはｉｉｉ）それぞれ配列番号１０および１１に対して、少なくとも９０％または９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【請求項5】

ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１から４のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【請求項6】

それぞれ配列番号１２および１３のアミノ酸配列を有する、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を備える、請求項１から５のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【請求項7】

マウス、キメラ、またはヒト化型である、請求項１から６のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。

【請求項8】

請求項１から７のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分をエンコードする核酸分子。

【請求項9】

請求項８に記載の核酸分子を備える発現ベクター。

【請求項10】

請求項８に記載の核酸分子または請求項９に記載の発現ベクターを備える宿主細胞。

【請求項11】

治療有効量の、請求項１から７のいずれか１項に記載の単離モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分、請求項８に記載の核酸分子、請求項９に記載の発現ベクター、または請求項１０に記載の宿主細胞、および薬学的に許容されるキャリアを備える、医薬組成物。

【請求項12】

癌の治療を必要とする対象において癌を治療するのに使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記癌は、卵巣癌、乳癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、胆管癌、肺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腺癌、膵臓腺癌、神経膠芽腫、および大腸癌から成る群から選択される固形癌または血液癌である、請求項１２に記載の使用のための医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の参照による組み込み］
本出願は、２０２１年１０月１３日に出願された中国特許出願第２０２１１１１９５２４６．５号に基づく優先権を主張するものである。

【0002】

前述の出願、および同出願中またはその出願手続きにおいて引用された全ての文献（「出願引用文献」）、および本明細書において引用または参照される全ての文献（本明細書において引用される全ての文献文書、特許、公開特許出願を含むがこれらに限定されない）（「本明細書引用文献」）、および本明細書引用文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書または参照により本明細書に組み込まれるあらゆる文献において言及される、あらゆる製品に関する、あらゆる製造元の説明書、説明、製品仕様、および製品シートと共に、本明細書において参照することにより本明細書に組み込まれ、本発明の実践において利用され得る。より具体的に述べると、全ての参考文献は、各個々の文献が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ範囲まで、参照により組み込まれる。本開示において言及されるあらゆるＧｅｎｂａｎｋ配列は、本開示の最先の有効出願日時点でのＧｅｎｂａｎｋ配列を参照して組み込まれる。

【0003】

本出願は、ＣＤ２４に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分、ならびにその調製および使用、特に、腫瘍の治療における使用に関する。

【背景技術】

【0004】

癌細胞は、１）免疫細胞上のＳｉｇｌｅｃに結合し得るＣＤ２４タンパク質を高度に発現して、抗腫瘍免疫反応を阻害すること、２）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面上のＮＫＧ２Ｄタンパク質に結合するＭＩＣＡ／ＭＩＣＢの癌細胞膜からの脱離を促進し、ＮＫ細胞によるＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ^＋癌細胞の殺滅をブロックすること、および３）マクロファージ表面上のシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）に結合するＣＤ４７を高レベルで発現し、マクロファージによる癌細胞の食作用を阻害する阻害シグナルを誘導することを含め、宿主の免疫監視を回避するためのいくつかのメカニズムを発達させている。癌細胞が非常に「スマート」であり、それらの発達した回避メカニズムに応じて急速に再生することが分かる。従って、癌細胞を殺滅するための効果的な抗癌薬の開発において、これらのメカニズムを標的とすることが重視され得る。
［ＣＤ２４］

【0005】

ＣＤ２４は、免疫系の多くの細胞にあるグリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質である。これは、Ｔ細胞の共刺激性分子および自己免疫の調節因子として機能する。またＣＤ２４は、卵巣癌、乳癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、胆管癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腺癌、および神経膠芽腫の細胞を含む様々な癌細胞において高度に発現され（Ｂａｒｋａｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１９、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、癌細胞の遊走、浸潤および増殖を調節する。

【0006】

ＣＤ２４は、活性化内皮細胞および活性化血小板の表面上で細胞接着分子として機能する膜貫通タンパク質であるＰセレクチンのリガンドである。ＣＤ２４とＰセレクチンの相互作用は、腫瘍転移を増大させ得る（Ｆｒｉｅｄｅｒｉｃｈｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。ＣＤ２４は、免疫細胞で発現されるシアル酸結合受容体であるＳｉｇｌｅｃｔにも結合する。とりわけ、Ｓｉｇｌｅｃ－５およびＳｉｇｌｅｃ－１０は、単球、顆粒球、およびリンパ球上の重要な阻害性受容体である。Ｔ細胞におけるＳｉｇｌｅｃ－１０の発現は、Ｔ細胞主要組織適合抗原複合体クラスＩ（ＭＨＣ－Ｉ）ペプチド複合体の形成ならびにＴ細胞受容体関連キナーゼＬｃｋおよびＺＡＰ－７０のリン酸化を阻害することにより、Ｔ細胞活性化に干渉することが知られている（Ｙｉｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０２０）。Ｂ細胞およびＮＫ細胞におけるＳｉｇｌｅｃ－１０の発現は、それぞれ、ＢＣＲ媒介性シグナル伝達およびＮＫ細胞受容体媒介性シグナル伝達を阻害することができる（Ｙｉｎ， ｅｔ ａｌ．， ２０２０）。腫瘍細胞は、免疫攻撃から保護されるように、ＣＤ２４を利用して、Ｓｉｇｌｅｃ－１０と共に「ｄｏｎ'ｔ ｅａｔ ｍｅ」シグナルを生成し得る。

【0007】

従って、ＣＤ２４は、予後不良のバイオマーカーと考えられている。ＣＤ２４の発現は、膀胱腫瘍の再発と有意に関連している（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。卵巣癌患者において、ＣＤ２４の発現は、腫瘍病期ならびに腹膜およびリンパ節への転移と相関することが見出された。更に、ＣＤ２４陽性細胞は、浸潤性の高い表現型である増殖の増大を示し、卵巣癌細胞におけるシスプラチン抵抗性と関連することが報告された（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． ２０１７）。

【0008】

複数の研究が示すところによれば、抗ＣＤ２４モノクローナル抗体は、膀胱癌およびトリプルネガティブ乳癌のマウスモデルにおいて、肺転移を低減し、全体的な生存期間を延長させることができる。また、ＣＤ２４とＳｉｇｌｅｃ－１０の相互作用の抗体による遮断が、担腫瘍マウスにおいて、腫瘍増殖のマクロファージ依存性低減および生存期間の延長をもたらしたことも、文献で明らかにされた（Ｂａｒｋａｌ， ｅｔ ａｌ．， ２０１９、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１９、Ｏｖｅｒｄｅｖｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。加えて、以前の研究により、抗ＣＤ４７／ＣＤ２４二重抗体治療が脳内で骨髄系免疫を効果的に活性化できたことが実証された（Ｗｕ Ｈ， ｅｔ ａｌ， ２０２１）。そしてこのような二重治療は、ヒト卵巣癌細胞に対する食作用を増強することが明らかにされた（Ｂａｒｋａｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１９）。また、Ｂａｒａｋａｌらは、ＣＤ２４抗体とセツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）との併用療法が、いずれか単独による治療と比較して、膵臓腺癌細胞の食作用を更に増大させたことを見出した。

【0009】

また、ＣＤ２４の上方制御は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（Ｔｏｕｂａｉ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．，２０１４）、代謝関連脂肪肝疾患（Ｆａｉｒｂｒｉｄｇｅ， Ｎ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ２０１５）、１型真性糖尿病（Ｅｌ－Ｍｏｋｈｔａｒ， Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ２０２０）、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（Ｔａｎ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， ２０１６）、および敗血症（Ｃｈｅｎ， Ｇ．Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， ２０１１）に関与し得る（参考文献７～１５）。

【0010】

優れた特性を有する、より多くの抗ＣＤ２４抗体が必要である。

【0011】

本出願における、いかなる文献の引用または特定も、このような文献が本開示の先行技術として利用可能であることを認めるものではない。

【発明の概要】

【0012】

本出願は、ＣＤ２４^＋細胞に結合して、ＣＤ２４^＋細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導し得る、新規の抗ＣＤ２４抗体またはその抗原結合部分を開示する。本開示の抗体またはその抗原結合部分は、強力なｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果も示した。特に、本開示の抗ＣＤ２４抗体またはその抗原結合部分を特定の用量で投与すると、動物における腫瘍が完全に消失し得、これらの動物において抗体またはその抗原結合部分の投与を止めても、腫瘍細胞の再移植が腫瘍の形成または増殖をもたらすことはない。

【0013】

具体的に述べると、一態様において、本出願は、ｉ）重鎖可変領域ＣＤＲ１（ＶＨ－ＣＤＲ１）、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３を有し得る重鎖可変領域であって、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、およびＶＨ－ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１、２、および３に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る重鎖可変領域、ならびに／またはｉｉ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１（ＶＬ－ＣＤＲ１）、ＶＬ－ＣＤＲ２、およびＶＬ－ＣＤＲ３を有し得る軽鎖可変領域であって、ＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、およびＶＬ－ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４、５、および６に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る軽鎖可変領域を備え得る、ＣＤ２４に結合する単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分を開示する。

【0014】

本開示の重鎖可変領域は、配列番号７または１０に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0015】

本開示の軽鎖可変領域は、配列番号８、９または１１に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

【0016】

本開示の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、（１）それぞれ配列番号７および８、（２）それぞれ配列番号７および９、または（３）それぞれ配列番号１０および１１に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を備え得る。

【0017】

本開示の単離モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域を備え得る。重鎖定常領域は、ＦｃＲおよび／または補体系タンパク質（Ｃ１ｑ等）の結合親和性を有する、または有するように操作されている、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４重鎖定常領域、またはその機能的断片であり得る。特定の実施形態において、重鎖定常領域は、例えば、配列番号１２に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり得る。軽鎖定常領域は、例えば、配列番号１３に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヒトカッパ軽鎖定常領域等のカッパ軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域のＮ末端は、重鎖可変領域のＣ末端に連結しており、軽鎖定常領域のＮ末端は、軽鎖可変領域のＣ末端に連結している。

【0018】

特定の実施形態において、本開示の抗体は、ジスルフィド結合によって接続された２つの重鎖および２つの軽鎖を含むかまたはそれらから成るＩｇＧ抗体であり得、ここで、各重鎖は、上記で言及した重鎖定常領域、重鎖可変領域、および／またはＣＤＲ配列を含み得、各軽鎖は、上記で言及した軽鎖定常領域、軽鎖可変領域、および／またはＣＤＲ配列を含み得る。

【0019】

本開示の抗体またはその抗原結合部分は、マウス、キメラ、ヒト、またはヒト化型であり得る。

【0020】

本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ２４に結合し、例えば、Ｓｉｇｌｅｃ－１０に対するＣＤ２４の結合をブロックし、ＣＤ２４^＋細胞に対するＡＤＣＣを誘導し、強力なｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示し得る。

【0021】

本開示は、細胞毒または抗癌剤等の治療剤に連結した、抗体またはその抗原結合部分を備える、免疫コンジュゲートも提供する。本開示は、本開示の抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能的部分（例えば、第２の抗体）に連結した、本開示の抗体またはその抗原結合部分を備える、二重特異性分子も提供する。別の態様において、本開示の抗体またはその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部にすることができる。本開示は、本開示のＣＡＲまたはＴＣＲを含む、Ｔ細胞およびＮＫ細胞等の免疫細胞を更に提供する。

【0022】

本開示は、本開示の抗体またはその抗原結合部分をエンコードする核酸分子、ならびにこのような核酸分子を備える発現ベクター、およびこのような発現ベクターを備える宿主細胞を更に提供する。本開示の宿主細胞を使用して抗ＣＤ２４抗体またはその抗原結合部分を調製する方法であって、（ｉ）抗体またはその抗原結合部分を宿主細胞において発現させる段階と、（ｉｉ）抗体またはその抗原結合部分を宿主細胞またはその細胞培養物から単離する段階とを備える方法が提供される。

【0023】

本開示は、本開示の、抗体もしくはその抗原結合部分、免疫コンジュゲート、二重特異性分子、免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、または宿主細胞、および薬学的に許容されるキャリアを備える、医薬組成物を提供する。本開示の医薬組成物は、ＳＩＲＰアルファＤ１－Ｆｃ融合タンパク質等の抗腫瘍剤、または抗炎症剤を更に備え得る。

【0024】

別の態様において、本開示は、ＣＤ２４（例えば、ＣＤ２４の過剰発現またはシグナル伝達）に関連する疾患の治療または緩和を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本開示の医薬組成物を治療有効量で対象に投与する段階を含む方法を提供する。

【0025】

疾患は癌であり得る。癌は、卵巣癌、乳癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、膵臓腺癌、胆管癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腺癌、神経膠芽腫、および大腸癌を含むがこれらに限定されない固形癌または血液癌であり得る。特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、ＣＤ４７を標的とするタンパク質といった、少なくとも１つの抗腫瘍剤と共に投与され得る。ＣＤ４７を標的とするタンパク質は、配列番号１９に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するＳＩＲＰアルファＤ１－Ｆｃ融合タンパク質であり得、配列番号１９のアミノ酸配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列によってエンコードされ得る。配列番号１９の８０位には、グリコシル化部位を除去するＮ→Ａ変異が含まれる。

【0026】

特定の実施形態において、疾患は、急性移植片対宿主病、関節リウマチ、および全身性エリテマトーデスを含むがこれらに限定されない炎症性疾患であり得る。

【0027】

疾患は、代謝関連脂肪肝疾患、真性糖尿病、多発性硬化症、および敗血症を更に含むが、これらに限定されない。

【0028】

本開示の抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ２４タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出にも使用され得る。

【0029】

本開示の他の特徴および特長は、限定と解釈されるべきではない下記の詳細な説明および例から明らかになるであろう。本出願の随所で引用される全ての参考文献、ＧｅｎＢａｎｋエントリー、特許、および公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【0030】

従って、本出願の目的は、以前から知られている製品、過程、または方法の権利を出願者が留保し、権利放棄を本明細書によって開示するように、以前から知られている製品、製品を作製する過程、または製品を使用する方法を本出願に包含することではない。更に、本出願は、以前に説明されている製品、製品を作製する過程、または製品を使用する方法の権利を出願者が留保し、権利放棄を本明細書によって開示するように、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条、第１段落）またはＥＰＯ（ＥＰＣの第８３条）の記述要件および実施可能要件を満たさない製品、過程、または製品の作製もしくは製品を使用する方法を出願の範囲に包含することを意図するものではないことを注記する。本出願の実践においては、ＥＰＣ第５３条（ｃ）ならびにＥＰＣ規則２８（ｂ）および（ｃ）に準拠することが有利であり得る。本出願の系統もしくは任意の他の系統における、または第三者が先に出願した出願における、出願者の取得済み特許の対象である任意の実施形態を明示的に放棄する全ての権利は、明示的に留保される。本明細書におけるいずれの内容も、保証と解釈されてはならない。

【0031】

本開示において、特に特許請求の範囲および／または段落において、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備えた（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などといった用語は、米国特許法においてこれに与えられた意味を有し得ること、例えば、これらは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること、そして「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」等の用語は、米国特許法においてこれらに付与された意味を有すること、例えば、これらは明示的に列挙されていない要素を許容するが、先行技術において見出される、または出願の基本もしくは新規の特性に影響する要素を除外することを注記する。

【図面の簡単な説明】

【0032】

下記の詳細な説明は、例として供与されるが、説明される特定の実施形態だけに本出願を限定することを意図するものではなく、添付図面と併せて最も良好に理解され得る。

【0033】

【図1】本開示の抗ＣＤ２４抗体である、ＩＭＭ４７Ｃ、ＩＭＭ４７およびＩＭＭ４７Ｈの構造の概略図である。ＩＭＭ４７Ｃは、配列番号７、１２、８、および１３に記載されるアミノ酸配列をそれぞれ有する、マウス重鎖可変領域、重鎖定常領域、マウス軽鎖可変領域、および軽鎖定常領域を備える、ＩｇＧ抗体である。ＩＭＭ４７は、配列番号７、１２、９、および１３に記載されるアミノ酸配列をそれぞれ有する、マウス重鎖可変領域、重鎖定常領域、ヒト化軽鎖可変領域、および軽鎖定常領域を備える、ＩｇＧ抗体である。ＩＭＭ４７Ｈは、配列番号１０、１２、１１、および１３に記載されるアミノ酸配列をそれぞれ有する、ヒト化重鎖可変領域、重鎖定常領域、ヒト化軽鎖可変領域、および軽鎖定常領域を備える、ＩｇＧ抗体である。

【0034】

【図2】ｈＩｇＧ－Ｆｃを陰性対照として使用した、ＣＤ２４^＋ＭＣＦ－７細胞に対するＩＭＭ４７Ｈの結合活性を示す。

【0035】

【図3】ＩＭＭ０１（ＳＩＲＰアルファＤ１－Ｆ１、配列番号１９）およびｈＩｇＧ－Ｆｃを対照として使用した、ＣＤ４７^＋ＣＤ２４^＋ＲＥＨ細胞に対するＩＭＭ４７Ｈの結合活性を示す。

【0036】

【図4】ｈＩｇＧ１－Ｆｃを陰性対照として使用した、ＣＤ２４^＋ＭＣＦ－７細胞に対する抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導するＩＭＭ４７Ｃの能力を示す。

【0037】

【図5】ｈＩｇＧ１－ＦｃおよびＩＭＭ０１を対照として使用した、ＣＤ４７^＋ＣＤ２４^＋ＲＥＨ細胞に対する抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導するＩＭＭ４７Ｃの能力を示す。

【0038】

【図6】ｈＩｇＧ１－Ｆｃを陰性対照として使用した、ヒトＣＤ２４を発現するよう操作されたＭＣ３８細胞に対する抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導するＩＭＭ４７の能力を示す。

【0039】

【図7】ＣＤ２４^＋ＣＤ４７^＋ＭＣＦ－７細胞が移植されたＣＢ１７－ＳＣＩＤマウスにおける、ＩＭＭ４７ＣおよびＩＭＭ４７Ｃ＋ＩＭＭ０１の組み合わせのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性を示す。

【0040】

【図8A】ＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞が移植されたＢ６トランスジェニックマウス（ヒトＳｉｇｌｅｃ１０を発現するよう操作された）における、各群での平均腫瘍サイズ（Ａ）および個々の腫瘍サイズ（Ｂ）によって明らかにされた、ＩＭＭ４７ＨおよびＩＭＭ４７Ｃの抗腫瘍有効性を示す。

【0041】

【図8B】ＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞が移植されたＢ６トランスジェニックマウス（ヒトＳｉｇｌｅｃ１０を発現するよう操作された）における、各群での平均腫瘍サイズ（Ａ）および個々の腫瘍サイズ（Ｂ）によって明らかにされた、ＩＭＭ４７ＨおよびＩＭＭ４７Ｃの抗腫瘍有効性を示す。

【0042】

【図9】ＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞が移植されたＢ６－Ｓｉｇｌｅｃ１０トランスジェニックマウスにおける、ＩＭＭ４７Ｃ、ＩＭＭ４７およびＩＭＭ４７Ｈの抗腫瘍効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0043】

本開示がより容易に理解され得ることを確実にするために、特定の用語をまず定義する。追加の定義は、詳細な説明の随所に記載される。

【0044】

「ＣＤ２４」という用語は、分化クラスター２４を指す。「ＣＤ２４」という用語は、バリアント、アイソフォーム、ホモログ、オーソログ、およびパラログを含む。

【0045】

本明細書において言及される「抗体」という用語は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭの全抗体、ならびにその任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）または一本鎖を含む。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を備える糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｈと略す）および重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略す）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ_Ｌで構成される。Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される保存性の高い領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性領域へと更に細分され得る。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは各々、アミノ末端からカルボキシ末端へと、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成されている。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。重鎖定常領域の「機能的断片」は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介して、例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰなどを開始する能力を保持する定常領域の一部を指す。

【0046】

抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、本明細書において使用される場合、抗原（例えば、ＣＤ２４タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって果たされ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、Ｃ_ＬおよびＣ_Ｈ１ドメインから成る一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を備え得る二価断片であるＦ（ａｂ'）_２断片、（ｉｉｉ）Ｖ_ＨドメインおよびＣ_Ｈ１ドメインから成るＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶ_ＬドメインおよびＶ_Ｈドメインから成るＦｖ断片、（ｖ）Ｖ_Ｈドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉｉ）単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含む重鎖可変領域であるナノボディを含む。更に、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶ_ＬおよびＶ_Ｈは、別個の遺伝子によってコードされるが、組換え法を使用すると、Ｖ_Ｌ領域およびＶ_Ｈ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）になることを可能にする合成リンカーにより、これらを接合させることができる。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されるよう意図される。これらの抗体断片は、当業者に知られる従来技術を使用して取得され、インタクト抗体と同じ方式で、有用性について断片がスクリーニングされる。

【0047】

本明細書において使用される「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＣＤ２４タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、ＣＤ２４タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＣＤ２４タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、他の種のＣＤ２４タンパク質といった他の抗原との交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。

【0048】

本明細書において使用される「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性および親和性を示す。

【0049】

本明細書において使用される「マウス抗体」という用語は、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の両方がマウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むよう意図される。更に、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もマウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のマウス抗体は、マウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってエンコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでランダム変異誘発もしくは部位特異的変異誘発によって、またはｉｎ ｖｉｖｏで体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される「マウス抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がマウスのフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことを意図するものではない。

【0050】

「キメラ抗体」という用語は、非ヒト起源の遺伝物質をヒトの遺伝物質と組み合わせることによって作製された抗体を指す。またはより一般的に言えば、キメラ抗体は、特定の種の遺伝物質を、別の種の遺伝物質と共に有する抗体である。

【0051】

本明細書において使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒトにおいて天然に生成される抗体バリアントとの類似性を増加させるようタンパク質配列が改変されている非ヒト種の抗体を指す。

【0052】

本開示の抗体またはその抗原結合部分における重鎖可変領域ＣＤＲおよび軽鎖可変領域ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義されている。しかしながら、本技術分野において周知であるように、ＣＤＲ領域は、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｋａｂａｔ、ＡｂＭ、またはＣｏｎｔａｃｔのナンバリングシステム／方法等、他のシステムによって決定されてもよい。

【0053】

「抗体依存性細胞毒性」、「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」、または「ＡＤＣＣ」という用語は、例えば抗ＣＤ２４抗体が結合した標的細胞を、免疫系のエフェクター細胞が能動的に溶解する、細胞媒介性免疫防御のメカニズムを指す。

【0054】

半数効果濃度としても知られる「ＥＣ_５０」という用語は、ベースラインと、規定の曝露時間後の最大値との中間の応答を誘導する、抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。

【0055】

半数阻害濃度としても知られる「ＩＣ_５０」という用語は、抗体またはその抗原結合部分が存在しない場合に比して、特定の生物学的または生化学的機能を５０％阻害する、抗体またはその抗原結合部分の濃度を指す。

【0056】

「対象」という用語は、あらゆるヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生動物、および爬虫類動物等、哺乳動物および非哺乳動物を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、およびウマ等の哺乳動物が好ましい。

【0057】

本明細書において使用される場合、「配列同一性」とは、対象配列と参照配列をアラインし、配列間で最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要に応じてギャップを導入した後に、参照配列におけるヌクレオチド／アミノ酸残基と同一である、対象配列におけるヌクレオチド／アミノ酸残基のパーセントを指す。２つ以上のアミノ酸または核酸配列の間の配列同一性パーセントを決定することを目的とするペアワイズ配列アラインメントおよび多重配列アラインメントは、当業者に知られている様々なやり方で、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＯｍｅｇａ、Ｔ－ｃｏｆｆｅｅ、Ｋａｌｉｇｎ、およびＭＡＦＦＴ等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。このようなソフトウェアを使用する場合、例えば、ギャップペナルティおよび延長ペナルティには、既定のパラメータを使用することが好ましい。

【0058】

「治療有効量」という用語は、疾患もしくは病状（炎症性疾患等）に関連する症状の予防もしくは寛解および／または疾患もしくは病状の重症度の軽減に十分である、本開示の抗体またはその抗原結合部分の量を意味する。治療有効量は、治療されている病状の文脈において理解され、実際の有効量は、当業者には容易に識別される。

【0059】

一実施形態において、本開示の抗体は、本開示の抗ＣＤ２４抗体のものとは１または複数の保存的修飾によって異なる、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列の重鎖および／または軽鎖可変領域配列を含む。本技術分野では、抗原結合を除去しない特定の保存的配列修飾が行われ得ることが理解されている。

【0060】

本明細書において使用される場合、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体またはその抗原結合部分の結合特性に著しく影響することも、結合特性を著しく変化させることもないアミノ酸修飾を指すことが意図される。このような保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、および欠失を含む。修飾は、部位指向性変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発といった、本技術分野で知られる標準的な技法により、本開示の抗体またはその抗原結合部分に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、本技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。よって、本開示の抗体またはその抗原結合部分のＣＤＲ領域内の１または複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置き換えてもよく、変化した抗体を、保持された機能（すなわち、上記の機能）について、本明細書に記載の機能アッセイを使用して試験してもよい。

【0061】

本開示の抗体は、改変された抗体を操作するために、本開示の抗ＣＤ２４抗体のＶ_Ｈ／Ｖ_Ｌ配列のうちの１または複数を有する抗体を出発物質として使用して、調製することができる。抗体は、一方または両方の可変領域（すなわち、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ）内の、例えば、１または複数のＣＤＲ領域内および／または１または複数のフレームワーク領域内の、１または複数の残基を修飾することにより、操作することができる。追加で、または代替的に、抗体またはその抗原結合部分は、例えば抗体のエフェクター機能を変化させるように定常領域内の残基を修飾することにより、操作することができる。

【0062】

特定の実施形態において、ＣＤＲグラフティングを使用して抗体の可変領域を操作することができる。抗体は、主に、重鎖および軽鎖の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、個々の抗体間で、ＣＤＲの外の配列よりも多様性が高い。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体－抗原相互作用を担うので、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク配列にグラフトされた、天然に存在する特定の抗体のＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、天然に存在する特定の抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である。

【0063】

従って、本開示の別の実施形態は、上述の本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を有する重鎖可変領域、ならびに／または上述の本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を有する軽鎖可変領域を備える、単離モノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関連する。これらの抗体は、本開示のモノクローナル抗体のＶ_ＨおよびＶ_ＬのＣＤＲ配列を含むが、異なるフレームワーク配列を含んでもよい。このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開されている参考文献から取得することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、ヒト生殖細胞系列配列のデータベースである「ＶＢａｓｅ」（インターネットでｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにて利用可能）に見出すことができる。別の例として、ヒト重鎖および軽鎖の可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースに見出すことができる。本開示の抗体で使用するための好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似するものである。フレームワーク配列の由来元である生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子に見出されるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に、Ｖ_ＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列をグラフトしてもよく、あるいは、生殖細胞系列配列と比較して１または複数の変異を含むフレームワーク領域に、ＣＤＲ配列をグラフトしてもよい。例えば、特定の例において、抗体の抗原結合能力を維持または増大するように、フレームワーク領域内の残基を変異させるのが有益であることが見出されている。

【0064】

別のタイプの可変領域修飾は、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_ＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させることであり、これによって目的の抗体の１または複数の結合特性（例えば、親和性）が改善する。部位指向性変異誘発またはＰＣＲ媒介性変異誘発を実行して、変異を導入することができ、抗体結合または他の目的の機能的特性に対する効果を、本技術分野で知られるｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのアッセイで評価することができる。好ましくは、保存的修飾（本技術分野で知られているとおり）が導入される。変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失であり得るが、好ましくは置換である。さらに、通常、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４、または５つ以下の残基が変化する。

【0065】

本開示の操作された抗体は、例えば、抗体の特性を改善するように、Ｖ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ内のフレームワーク残基に修飾が行われているものを含む。通常、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を減少させるために行われる。例えば、１つのアプローチは、１または複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列配列に「復帰変異」させることである。より具体的に述べると、体細胞変異を経ている抗体は、抗体の由来元である生殖細胞系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体の由来元である生殖細胞系列配列と比較することによって特定することができる。

【0066】

別のタイプのフレームワーク修飾は、フレームワーク領域内、または更には１または複数のＣＤＲ領域内の、１または複数の残基を変異させて、Ｔ細胞エピトープを除去することによって、抗体の潜在的な免疫原性を低減することを伴う。

【0067】

フレームワークまたはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、またはその代替として、本開示の抗体は、通常、血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞毒性といった、抗体の１または複数の機能的特性を変化させるために、Ｆｃ領域内に修飾を含むよう操作され得る。更に、本開示の抗体を、化学修飾してもよく（例えば、１または複数の化学部分を抗体に結合させてもよい）、または、そのグリコシル化を変化させて、やはり抗体の１または複数の機能的特性を変化させるように修飾してもよい。

【0068】

一実施形態において、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化する、例えば、増加または減少するように、Ｃ_Ｈ１領域とＣ_Ｈ２領域との間のヒンジ領域を修飾する。ヒンジ領域内のシステイン残基の数を変化させるのは、例えば、軽鎖および重鎖のアセンブリを容易にするため、または抗体の安定性を増加もしくは減少させるためである。

【0069】

別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を増加または減少させる。より具体的に述べると、抗体のブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合性が、天然Ｆｃ－ヒンジドメインＳｐＡ結合性に比して低下するように、１または複数のアミノ酸変異を、Ｆｃ－ヒンジ断片のＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメイン界面領域に導入する。

【0070】

更に別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、グリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体からグリコシル化が欠如している）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化させることができる。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内の１または複数のグリコシル化部位を変化させることによって達成され得る。例えば、１または複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の消失をもたらす、１または複数のアミノ酸置換を行い、これによって、その部位におけるグリコシル化を消失させることができる。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。追加で、または代替的に、フコシル残基の量が低減している低フコシル化抗体、または二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加している抗体といった、グリコシル化のタイプが変化している抗体を作製することができる。このような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。このような炭化水素修飾は、例えば、変化したグリコシル化機構をもつ宿主細胞において抗体を発現させることによって達成することができる。変化したグリコシル化機構をもつ細胞は、本技術分野において説明されており、本開示の組換え抗体を発現させる宿主細胞として使用することによって、グリコシル化が変化している抗体を生成することができる。

【0071】

本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５で周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技法を使用して生成することができる。モノクローナル抗体を生成するための他の実施形態は、Ｂリンパ球のウイルス性または発癌性の形質転換、およびファージディスプレイ技法を含む。キメラ抗体またはヒト化抗体も、本技術分野では周知である。

【0072】

本開示の抗体は、例えば、本技術分野（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）において周知であるような、組換えＤＮＡ技法および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて生成することもできる。一実施形態において、遺伝子が転写調節配列および翻訳調節配列に作動可能に連結されるように、標準的な分子生物学技法によって取得される部分的または完全長の軽鎖および重鎖をエンコードするＤＮＡが、１または複数の発現ベクターに挿入される。この文脈において、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写制御配列および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するという意図される機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味するよう意図される。

【0073】

「調節配列」という用語は、抗体遺伝子の転写または翻訳を制御する、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むよう意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０））によって説明されている。哺乳動物宿主細胞での発現のために好ましい調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーといった、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を誘導するウイルス性要素を含む。代替的に、ユビキチンプロモーターまたはβグロビンプロモーター等の非ウイルス性調節配列を使用してもよい。また更に、ＳＶ４０初期プロモーターの配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の末端反復配列を含むＳＲαプロモーターシステム（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）といった、起源の異なる配列から構成された調節要素を使用してもよい。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。

【0074】

抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、同じ発現ベクターに挿入してもよく、別個の発現ベクターに挿入してもよい。好ましい実施形態では、可変領域は、ベクター内でＶ_ＨセグメントがＣ_Ｈセグメントに作動可能に連結され、ベクター内でＶ_ＬセグメントがＣ_Ｌセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にエンコードしている発現ベクターに挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を作出するために使用される。追加で、または代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促すシグナルペプチドをエンコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質のシグナルペプチド）であり得る。

【0075】

抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）といった追加の配列、および選択可能マーカー遺伝子を保有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照されたい）。

【0076】

軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をエンコードする発現ベクターが、標準的な技法により、宿主細胞にトランスフェクトされる。様々な形態の「トランスフェクション」という用語は、原核生物または真核生物の宿主細胞に外因性ＤＮＡを導入するために一般的に使用される様々な技法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含するよう意図される。原核生物または真核生物のいずれの宿主細胞においても本開示の抗体を発現させることは理論的に可能であるが、真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。なぜなら、このような真核細胞、特に哺乳動物細胞は、適切にフォールディングし免疫学的に活性のある抗体をアセンブルして分泌する可能性が原核細胞よりも高いからである。

【0077】

本開示の組換え抗体を発現させるのに好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をエンコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されると、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞を増殖させる培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたり、宿主細胞を培養することによって、抗体が生成される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して培養培地から取り出され得る。

【0078】

本開示の抗体を治療剤とコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）等のイムノコンジュゲートを形成することができる。好適な治療剤は、細胞毒、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、および有糸分裂阻害剤を含む。ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、またはヒドラゾンリンカーといった切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｖａｌ－Ｖａｌ、Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、またはＧｌｕ等のペプチジルリンカーである。

【0079】

別の態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成するよう、少なくとも１つの他の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体または受容体リガンド）に連結した本開示の１または複数の抗体を備える、二重特異性分子を特徴とする。よって、本明細書において使用される場合、「二重特異性分子」は、３つ以上の特異性を有する分子を含む。一実施形態において、二重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性および抗ＣＤ２４結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。第３の特異性は、ＣＤ２４^＋免疫細胞といった他のＣＤ２４^＋細胞をリリースしながら、腫瘍細胞をより正確に標的とするように、ＣＤ４７に対するものであり得る。

【0080】

二重特異性分子は、多くの異なるフォーマットおよびサイズであり得る。サイズスペクトルの一端にある二重特異性分子は、同一の特異性をもつ２つの結合アームを有する代わりに、各々が異なる特異性を有する２つの結合アームを有することを除いては、従来型の抗体フォーマットを保持する。もう一端にあるのは、ペプチド鎖によって連結された２つの一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）から成る二重特異性分子、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）_２構築物である。中間サイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカーによって連結された２つの異なるＦ（ａｂ）断片を含む。これらおよび他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子工学、体細胞ハイブリダイゼーション、または化学的方法によって調製することができる。

【0081】

本明細書では、抗ＣＤ２４ ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も提供され、この抗ＣＤ２４ ｓｃＦｖは、本明細書に記載のＣＤＲおよび重鎖／軽鎖可変領域を備える。

【0082】

抗ＣＤ２４ ＣＡＲは、（ａ）抗ＣＤ２４ ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを備え得る。

【0083】

別の態様において、本開示は、本開示の抗体の、重鎖および／または軽鎖可変領域、またはＣＤＲをエンコードする、核酸分子を提供する。核酸は、全細胞中に、細胞可溶化物中に、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸が「単離される」または「実質的に純粋にされる」のは、他の細胞成分または他の混入物、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から、標準的な技法によって精製されたときである。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。

【0084】

本開示の核酸は、標準的な分子生物学技法を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、下記で更に説明するような、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体の場合、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖および重鎖をエンコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技法によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技法を使用して）取得される抗体の場合、このような抗体をエンコードする核酸は、遺伝子ライブラリから取り出され得る。

【0085】

本開示の好ましい核酸分子は、抗ＣＤ２４モノクローナル抗体のＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列またはＣＤＲをエンコードするものを含む。Ｖ_ＨセグメントおよびＶ_ＬセグメントをエンコードするＤＮＡ断片が取得されたら、これらのＤＮＡ断片を、標準的な組換えＤＮＡ技法によって更に操作して、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子に、Ｆａｂ断片遺伝子に、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作において、Ｖ_ＬまたはＶ_ＨをエンコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域または可動性リンカーといった別のタンパク質をエンコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈で使用される「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によってエンコードされるアミノ酸配列がインフレームに留まるように、２つのＤＮＡ断片が接合されることを意味するよう意図される。

【0086】

Ｖ_Ｈ領域をエンコードする単離ＤＮＡは、Ｖ_ＨをエンコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３）をエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、本技術分野では知られており、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤの定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２の定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、Ｖ_ＨをエンコードするＤＮＡは、重鎖Ｃ_Ｈ１定常領域のみをエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。

【0087】

Ｖ_Ｌ領域をエンコードする単離ＤＮＡは、Ｖ_ＬをエンコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域Ｃ_Ｌをエンコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することにより、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、本技術分野では知られており、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、カッパ定常領域またはラムダ定常領域であり得る。

【0088】

ｓｃＦｖ遺伝子を作出するには、Ｖ_Ｌ領域およびＶ_Ｈ領域が可動性リンカーによって接合されて連続した一本鎖タンパク質としてＶ_Ｈ配列およびＶ_Ｌ配列が発現され得るように、Ｖ_ＨおよびＶ_ＬをエンコードするＤＮＡ断片を、可動性リンカーをエンコードする別の断片に作動可能に連結する。

【0089】

別の態様において、本開示は、薬学的に許容されるキャリアと共に製剤化された、本開示の１または複数の抗体もしくはその抗原結合部分、イムノコンジュゲート、二重特異性物、ＣＡＲ発現免疫細胞、核酸分子、発現ベクター、あるいは宿主細胞を含み得る、医薬組成物を提供する。組成物は、場合により、ＳＩＲＰアルファＤ１－Ｆｃ融合タンパク質であるＩＭＭ０１等の抗腫瘍剤といった、１または複数の追加の薬学的有効成分を含み得る。

【0090】

医薬組成物は、任意の数の賦形剤を含み得る。使用され得る賦形剤は、キャリア、界面活性剤、増粘剤または乳化剤、固体結合剤、分散助剤または懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、防腐剤、等張剤、およびこれらの組み合わせを含む。

【0091】

医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または上皮への投与（例えば、注射または注入）に好適であり得る。有効成分は、投与経路に応じて、有効成分を不活性化し得る酸および他の天然条件の作用から有効成分を保護する材料でコーティングされてもよい。本明細書において使用される「非経口投与」という語句は、経腸投与および局所投与以外の、通常は注射による投与形式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸腔内への注射および注入を含むが、これらに限定されない。代替的に、本開示の医薬組成物は、局所、上皮または経粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下、または局所といった、非経口ではない経路を介して投与され得る。

【0092】

医薬組成物は、無菌水溶液または分散液の形態であり得る。高い薬物濃度に好適なマイクロエマルション、リポソーム、または他の秩序構造で製剤化されてもよい。

【0093】

単一剤形を生成するためにキャリア材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療されている対象および特定の投与形式に応じて変わり、一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。一般に、１００パーセントのうち、この量は、薬学的に許容されるキャリアとの組み合わせにおいて、有効成分約０．０１％～約９９％の範囲である。

【0094】

投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性が示すのに比例して用量を低減もしくは増加させてもよい。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を単位用量形態で製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される単位用量形態とは、治療される対象のための単位用量として適した、物理的に分かれた単位を指し、各単位が、必要な薬学的キャリアとの関連で所望の治療効果をもたらすよう算出された所定量の有効成分を含む。代替的に、抗体は、持続放出製剤として投与されてもよく、この場合には、より低頻度の投与が必要とされる。

【0095】

抗体またはその抗原結合部分の投与において、投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。

【0096】

医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、徐放性製剤とすることができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸といった、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊ． Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８を参照されたい。

【0097】

治療用組成物は、（１）無針皮下注射デバイス（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、および同第４，５９６，５５６号）、（２）微量注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮デバイス（米国特許第４，４８６，１９４号）、（４）注入装置（米国特許第４，４４７，２３３号および同第４，４４７，２２４号）、および（５）浸透圧デバイス（米国特許第４，４３９，１９６号および同第４，４７５，１９６号）等の医療デバイスを介して投与され得る。これらの開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0098】

特定の実施形態において、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、ｉｎ ｖｉｖｏで適切な分布を確実にするように製剤化され得る。例えば、本開示の治療用抗体またはその抗原結合部分は、血液脳関門を確実に通過するように、特定の細胞または器官への選択的輸送を増大する標的化部分を追加で含んでもよいリポソームにおいて製剤化され得る。

【0099】

本開示の医薬組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで複数の用途を有し得る。例えば、医薬組成物は、腫瘍を治療するために、またはより一般的に言うと、腫瘍患者における免疫反応を増大させるために使用され得る。医薬組成物は、例えば、腫瘍増殖を阻害するために、ヒト対象に投与され得る。

【0100】

腫瘍細胞の増殖および生存を阻害する医薬組成物の能力を所与として、本出願は、腫瘍細胞の増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行う方法であって、腫瘍増殖が対象において阻害されるように、本開示の医薬組成物を対象に投与する段階を備える方法を提供する。本開示の医薬組成物によって治療され得る腫瘍は、卵巣癌、乳癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、膵臓腺癌、胆管癌、膀胱癌、膵臓癌、胃腺癌、神経膠芽腫、および大腸癌を含むがこれらに限定されない、原発性または転移性の固形腫瘍または血腫であり得る。本開示の医薬組成物は、ＣＤ４７およびＦｃＲに結合し、良好な抗腫瘍有効性を示すＳＩＲＰアルファ－Ｆｃ融合タンパク質であるＩＭＭ０１といった、追加の抗腫瘍剤と共に投与されてもよい。

【0101】

更に、ＣＤ２４と炎症性疾患との間の相関を所与として、本出願は、炎症性疾患の治療または寛解を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本開示の医薬組成物を対象に投与する段階を備える方法を提供する。炎症性疾患は、急性移植片対宿主病、関節リウマチ、または全身性エリテマトーデスであり得る。

【0102】

本開示の医薬組成物によって治療され得るＣＤ２４関連疾患は、代謝関連脂肪肝疾患、真性糖尿病、多発性硬化症、および敗血症を更に含むが、これらに限定されない。

【0103】

本開示の医薬組成物は、対象における腫瘍増殖を効果的に阻害することまたは炎症を低減／消失させることができる、１または複数の追加の薬剤と共に投与されてもよい。特定の実施形態において、本出願は、腫瘍増殖の阻害を必要とする対象においてそれを行う方法であって、本開示の医薬組成物と、ＳＩＲＰアルファＤ１－Ｆｃ融合タンパク質であるＩＭＭ０１とを対象に投与する段階を備える方法を提供する。

【0104】

本明細書で説明される治療剤を組み合わせて、薬学的に許容されるキャリア中の単一の組成物として同時に投与するか、または薬学的に許容されるキャリアに各薬剤を含む別個の組成物として同時に投与してもよい。別の実施形態では、治療剤の組み合わせを連続的に投与してもよい。

【0105】

更に、１用量を超える併用療法が連続的に投与される場合、連続投与の順序は、投与の各時点で逆転しても同じ順序のままでもよく、連続投与を同時投与と組み合わせるか、またはそれらの任意の組み合わせでもよい。

【0106】

ここで、下記の非限定的な例を用い、本出願を更に説明する。
［実施例］

【0107】

本開示の例示的な抗ＣＤ２４抗体であるＩＭＭ４７Ｃ、ＩＭＭ４７、およびＩＭＭ４７Ｈの構造を図１に示し、下記で更に詳細に説明する。

【0108】

ＩＭＭ４７Ｃは、配列番号７、１２、８、および１３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、マウス重鎖可変領域、ヒトＩｇＧ１定常領域、マウス軽鎖可変領域、およびヒトカッパ定常領域を備える、ＩｇＧ抗体である。

【0109】

ＩＭＭ４７は、配列番号７、１２、９、および１３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、マウス重鎖可変領域、ヒトＩｇＧ１定常領域、ヒト化軽鎖可変領域、およびヒトカッパ定常領域を備える、ＩｇＧ抗体である。

【0110】

ＩＭＭ４７Ｈは、配列番号１０、１２、１１、および１３のアミノ酸配列をそれぞれ有する、ヒト化重鎖可変領域、ヒトＩｇＧ１定常領域、ヒト化軽鎖可変領域、およびヒトカッパ定常領域を備える、ＩｇＧ抗体である。

【0111】

ＩＭＭ０１は、ＵＳ２０２１／００２４５９８Ａ１に開示されているように、ＣＤ４７に結合するＳＩＲＰαＤ１－Ｆｃ融合タンパク質であり、２つのＦｃ断片に連結した２つのＳＩＲＰαＤ１変異体を備え、形成された二量体の各単量体は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する。ＩＭＭ０１のＳＩＲＰαＤ１変異体は、グリコシル化部位を除去するＮ８０Ａ変異を配列番号１９に含む。
［実施例１］ 抗ＣＤ２４抗体の生成およびヒト化、ならびに抗体発現のためのベクター構築

【0112】

マウスをヒトＣＤ２４タンパク質で免疫し、良好な力価を有するものを抗体調製のために選択した。簡潔に述べると、選択されたマウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させ、高いＣＤ２４結合能力を有する抗ＣＤ２４抗体を分泌したハイブリドーマコロニーを選定し、限界希釈によってサブクローニングした。モノクローナル抗体を生成してシーケンシングした。ＩＭＭ４７Ｃと呼ばれる１つの抗体は、配列番号７および８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列をもつ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有していた。

【0113】

その後、十分に確立されたＣＤＲグラフティング法を使用して、ＩＭＭ４７Ｃをヒト化した。例示的な部分ヒト化抗体ＩＭＭ４７および例示的なヒト化抗体ＩＭＭ４７Ｈを取得した。ＩＭＭ４７は、配列番号７および９に記載されるアミノ酸配列をそれぞれ有するマウス重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域を備え、ＩＭＭ４７Ｈは、配列番号１０および１１に記載されるアミノ酸配列をそれぞれ有するヒト化重鎖可変領域およびヒト化軽鎖可変領域を備えていた。

【0114】

例示的な抗体の完全長コード配列を人工的に設計した。

【0115】

具体的に述べると、ＩＭＭ４７Ｃの重鎖には、マウスＩｇＧ１重鎖のシグナルペプチドをエンコードする５７ヌクレオチド（配列番号２１）を、ＩＭＭ４７Ｃの重鎖可変領域と定常領域とのコード配列（配列番号１４）の５'末端に付加し、Ｋｏｚａｋ配列（配列番号２２）をシグナルペプチド配列の５'末端に付加した。最後に、結果として生じた配列の５'末端および３'末端に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位をそれぞれ付加した。ＩＭＭ４７Ｃの軽鎖には、同じシグナル配列ならびにＫｏｚａｋ配列を、ＩＭＭ４７Ｃの軽鎖可変領域と定常領域とのコード配列（配列番号１５）の５'末端に付加し、結果として生じた配列の５'末端および３'末端に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位をそれぞれ付加した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって配列を合成し、それぞれｐＭａｃ－ＨベクターおよびｐＭａｃ－Ｌベクター中にクローニングした。

【0116】

ＩＭＭ４７の重鎖には、マウスＩｇＧ１重鎖のシグナルペプチドをエンコードする５７ヌクレオチド（配列番号２１）を、ＩＭＭ４７の重鎖可変領域と定常領域とのコード配列（配列番号１４）の５'末端に付加し、Ｋｏｚａｋ配列（配列番号２２）をシグナルペプチド配列の５'末端に付加した。最後に、結果として生じた配列の５'末端および３'末端に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位をそれぞれ付加した。ＩＭＭ４７の軽鎖には、同じシグナル配列ならびにＫｏｚａｋ配列を、ＩＭＭ４７の軽鎖可変領域と定常領域とのコード配列（配列番号１６）の５'末端に付加し、結果として生じた配列の５'末端および３'末端に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位をそれぞれ付加した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって配列を合成し、それぞれｐＭａｃ－ＨベクターおよびｐＭａｃ－Ｌベクター中にクローニングした。

【0117】

ＩＭＭ４７Ｈの重鎖には、マウスＩｇＧ１重鎖のシグナルペプチドをエンコードする５７ヌクレオチド（配列番号２１）を、ＩＭＭ４７Ｈの重鎖可変領域と定常領域とのコード配列（配列番号１７）の５'末端に付加し、Ｋｏｚａｋ配列（配列番号２２）をシグナルペプチド配列の５'末端に付加した。最後に、結果として生じた配列の５'末端および３'末端に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限部位をそれぞれ付加した。ＩＭＭ４７Ｈの軽鎖には、同じシグナル配列ならびにＫｏｚａｋ配列を、ＩＭＭ４７Ｈの軽鎖可変領域と定常領域とのコード配列（配列番号１８）の５'末端に付加し、結果として生じた配列の５'末端および３'末端に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位をそれぞれ付加した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって配列を合成し、それぞれｐＭａｃ－ＨベクターおよびｐＭａｃ－Ｌベクター中にクローニングした。

【0118】

これらの本開示の抗体は、上記で構築したベクターを含むＣＨＯ－Ｓ細胞を使用して発現させた。簡潔に述べると、ＣＨＯ－Ｓ細胞を、６ｍＭグルタミンを含むＴｒａｎｓＦｘ－ＣＴＭＣＨＯ一過性トランスフェクション培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中、１×１０^６細胞／ｍｌの密度で、一過性トランスフェクションの１日前に播種した。１μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ量と１：１の質量比における重鎖および軽鎖の発現ベクターを、使用したＴｒａｎｓＦｘ－ＣＴＭＣＨＯ一過性トランスフェクション培地の１／２０の体積のＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に添加した。１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ（ポリエチレンイミン、分子量４７，０００、カタログ番号２４７６５－１、ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、使用したＴｒａｎｓＦｘ－ＣＴＭＣＨＯ一過性トランスフェクション培地の１／２０の体積のＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に添加した。ＰＥＩ希釈物を、希釈したＤＮＡに、４：１のＰＥＩ：ＤＮＡ質量比でゆっくり添加し、混合し、室温で２０分間インキュベートした。次に、ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を細胞培養物に添加し、３７℃および５％ＣＯ_２の細胞培養インキュベータで細胞を１１０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。トランスフェクションエンハンサー（１ｍＭ酪酸ナトリウム、０．２５％Ｖ／Ｖ ＤＭＳＯ）を２日後に添加し、温度を３３℃に低下させた。細胞生存率が約５０％に低下したとき、３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞培養上清を採取し、プロテインＡクロマトグラフィを使用したタンパク質精製に供した。
［実施例２］例示的な抗体は、ＣＤ２４^＋ＭＣＦ－７細胞に結合した

【0119】

１００μｌの培養培地中で１×１０^６／ｍｌの細胞密度のＣＤ２４^＋ＭＣＦ－７細胞を、４℃で１時間、ＩＭＭ４７ＨおよびｈＩｇＧ－Ｆｃの連続希釈物それぞれ１００μｌ（３０μｇ／ｍｌから開始した３倍希釈物）と共にインキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、次に、ヒトＩｇＧ－Ｆｃに対する１００μｌのＦＩＴＣ標識二次抗体（カタログ番号Ｆ９５１２、Ｓｉｇｍａ）と共に４５分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。次に、フローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ）を使用し、細胞をＦＡＣＳ解析に供した。

【0120】

図２に示すように、抗ＣＤ２４抗体は、ＩＭＭ４７Ｈを含め、ＣＤ２４^＋ＭＣＦ－７細胞に特異的に結合した。
［実施例３］例示的な抗体は、ＣＤ２４^＋ＲＥＨ細胞に結合した

【0121】

１００μｌの培養培地中で１×１０^６／ｍｌの細胞密度のＣＤ２４^＋ＣＤ４７^＋ＲＥＨ細胞を、４℃で１時間、ＩＭＭ４７Ｈ、ＩＭＭ０１、およびｈＩｇＧ－Ｆｃの連続希釈物それぞれ１００μｌ（３０μｇ／ｍｌから開始した３倍希釈物）と共にインキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、次に、ヒトＩｇＧ－Ｆｃに対する１００μｌのＦＩＴＣ標識二次抗体（カタログ番号Ｆ９５１２、Ｓｉｇｍａ）と共に４５分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。次に、フローサイトメーター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ ５ＨＴ）を使用し、細胞をＦＡＣＳ解析に供した。

【0122】

図３に示すように、ＩＭＭ４７Ｈの結合能力は、ＣＤ４７結合タンパク質であるＩＭＭ０１よりもわずかに高かった。
［実施例４］例示的な抗体は、ＣＤ２４^＋ＭＣＦ－７細胞に対する高い抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導した

【0123】

１ｍＭのＣＦＳＥ（カタログ番号２１８８８－２５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）を１：５００に希釈し、ＭＣＦ－７細胞を標識するために使用した。

【0124】

標的細胞である、６×１０^５／ｍｌのＣＦＳＥ標識ＭＣＦ－７細胞５０μｌを、エフェクター細胞である、ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）を安定的に発現する６×１０^５／ｍｌのＮＫ９２ＭＩ細胞１００μｌと、２：１のエフェクター：標的比で混合した。混合した細胞を、３７℃で４時間、５％ＣＯ_２下で、ＩＭＭ４７ＣおよびｈＩｇＧ－Ｆｃの連続希釈物それぞれ５０μｌ（１０００ｎｇ／ｍｌから開始した３倍希釈物）と共に培養した。次に、細胞培養物に５μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（カタログ番号Ｐ４１７０、Ｓｉｇｍａ）を添加し、次に、ＰＩシグナルについてのＦＡＣＳ解析に供した。ＡＤＣＣにより引き起こされた細胞溶解パーセントを、次式に基づいて算出した：
溶解％＝（ＩＭＭ４７Ｃで処置したＰＩ陽性標的細胞の％－陰性対照で処置したＰＩ陽性標的細胞の％）／（１００－陰性対照で処置したＰＩ陽性標的細胞の％）＊１００

【0125】

図４によると、ＩＭＭ４７Ｃは、ＣＤ２４^＋ＭＣＦ－７細胞に対する高いＡＤＣＣを誘導した。
［実施例５］例示的な抗体は、ＣＤ２４^＋ＲＥＨ細胞に対する高い抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導した

【0126】

１ｍＭのＣＦＳＥ（カタログ番号２１８８８－２５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）を１：５００に希釈し、ＣＤ２４^＋ＣＤ４７^＋ＲＥＨ細胞を標識するために使用した。

【0127】

標的細胞である、６×１０^５／ｍｌのＣＦＳＥ標識ＲＥＨ細胞５０μｌを、エフェクター細胞である、ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）を安定的に発現する６×１０^５／ｍｌのＮＫ９２ＭＩ細胞１００μｌと、２：１のエフェクター：標的比で混合した。混合した細胞を、３７℃で４時間、５％ＣＯ_２下で、ＩＭＭ４７Ｃ、ＩＭＭ０１、およびｈＩｇＧ－Ｆｃの連続希釈物それぞれ５０μｌ（１０００ｎｇ／ｍｌから開始した３倍希釈物）と共に培養した。次に、細胞培養物に５μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（カタログ番号Ｐ４１７０、Ｓｉｇｍａ）を添加し、次に、ＰＩシグナルについてのＦＡＣＳ解析に供した。

【0128】

図５によると、ＩＭＭ４７Ｃは、ＣＤ２４^＋ＲＥＨ細胞に対する高いＡＤＣＣを誘導した。
［実施例６］例示的な抗体は、ＣＤ２４^＋ＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞に対する高い抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導した

【0129】

１ｍＭのＣＦＳＥ（カタログ番号２１８８８－２５ｍｇ、Ｓｉｇｍａ）を１：５００に希釈し、ヒトＣＤ２４タンパク質を発現するＭＣ３８細胞を標識するために使用した。

【0130】

標的細胞である、６×１０^５／ｍｌのＣＦＳＥ標識ＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞５０μｌを、エフェクター細胞である、ＦｃγＲＩＩＩａ（１５８Ｖ）を安定的に発現する６×１０^５／ｍｌのＮＫ９２ＭＩ細胞１００μｌと、２：１のエフェクター：標的比で混合した。混合した細胞を、３７℃で４時間、５％ＣＯ_２下で、ＩＭＭ４７およびｈＩｇＧ－Ｆｃの連続希釈物それぞれ５０μｌ（１０００ｎｇ／ｍｌから開始した３倍希釈物）と共に培養した。次に、細胞培養物に５μｇ／ｍｌの濃度のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（カタログ番号Ｐ４１７０、Ｓｉｇｍａ）を添加し、次に、ＰＩシグナルについてのＦＡＣＳ解析に供した。

【0131】

図６によると、ＩＭＭ４７は、ＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞に対する高いＡＤＣＣを誘導した。
［実施例７］例示的な抗体は、乳癌モデルで強力な抗腫瘍活性を示した

【0132】

６～８週齢のＳＣＩＤマウス３２匹各々の背部左側に０．３６ｍｇベータ－エストラジオール遅延放出錠を埋め込み、３日後、マウス１匹当たり１×１０^７細胞でＭＣＦ－７細胞を右腋窩に皮下注射した。腫瘍サイズが１００～１５０ｍｍ^３に達したら、１群当たりマウス８匹の４群にマウスを無作為に割り付け、この日を０日目と指定した。この日以降、マウスそれぞれに、ＰＢＳ、ＩＭＭ４７Ｃ（２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ０１（２．５ｍｇ／ｋｇ）、およびＩＭＭ０１＋ＩＭＭ４７Ｃ（２．５ｍｇ／ｋｇ＋２．５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を、４週間にわたり、週２回与えた。４週目の終わりに投与を停止し、ＰＢＳ群の平均腫瘍体積が３０００ｍｍ^３に達したときに実験を終了するまでマウスを観察した。腫瘍サイズおよび体重は３～４日毎に測定した。

【0133】

腫瘍体積（Ｖ）は、（長さ×幅^２）／２として算出した。腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）は、次式によって算出した：ＴＧＩ（％）＝（１－投与群における腫瘍体積の変化／ビヒクル対照群における腫瘍体積の変化）×１００％。

【0134】

この試験体制および結果を表１にまとめた。
表１．ＩＭＭ４７Ｃおよび他の薬剤の抗腫瘍効果

【表1】

【0135】

２８日目において、第１群（ＰＢＳ）のマウスの平均腫瘍サイズは６４６．８７ｍｍ^３であった。ビヒクル対照群と比較して、ＩＭＭ４７ＣおよびＩＭＭ０１による処置はいずれも、腫瘍増殖速度を緩徐化した。２８日目において、これら２群は、それぞれ、４６３．２６ｍｍ^３（Ｔ／Ｃ＝７１．６０％、ＴＧＩ＝３７．３０％、ｐ＝０．００９）および５６２．２４ｍｍ^３（Ｔ／Ｃ＝８６．９２％、ＴＧＩ＝１７．１９％、ｐ＝０．３７５）の平均腫瘍サイズを有していた。ＩＭＭ４７Ｃ＋ＩＭＭ０１の投与が最も良好な腫瘍抑制効果を示し、２８日目において、この群のマウスは、１９２．６３ｍｍ^３（Ｔ／Ｃ＝２９．８１％、ＴＧＩ＝９２．２２％、ｐ＝０．００１）の平均腫瘍サイズを有していた。

【0136】

ＩＭＭ４７が、強力な抗腫瘍効果を有し、ＩＭＭ０１と相乗作用して、ＩＭＭ４７単独およびＩＭＭ０１単独よりも遥かに良好な抗腫瘍効果をもたらしたことが、表１および図７から分かる。
［実施例８］例示的な抗体は、大腸癌モデルで強力な抗腫瘍活性を示した

【0137】

雄のＢ６トランスジェニックマウス（ヒトＳｉｇｌｅｃ１０を発現するよう操作された）の各々の右腋窩に、１．０×１０^７／ｍｌのＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞１００μｌを注射した。腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３に達したら、１群当たりマウス１０匹の３群にマウスを無作為に割り付け、この日を０日目と指定した。この日以降、マウスそれぞれに、ＰＢＳ、ＩＭＭ４７Ｈ（１０ｍｇ／ｋｇ）、およびＩＭＭ４７Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を、週２回与えた。４回投与後、７匹のマウスを各群から無作為に選定し、再度１．０×１０^６個のＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞を左腋窩に注射し、抗体処置の投与を止めた。マウスの健康状態および腫瘍増殖を週２回観察した。サイズが３０００ｍｍ^３を超える腫瘍を有するマウスは試験から除外し、安楽死の対象とした。

【0138】

この試験体制を表２および図８Ｂにまとめた。
表２．ＩＭＭ４７Ｈ、ＩＭＭ４７Ｃ、および他の薬剤の抗腫瘍効果

【表2】

【0139】

表２および図８Ａ～８Ｂに示すように、ＩＭＭ４７ＨまたはＩＭＭ４７Ｃの４回投与後、マウスの腫瘍は完全に消失したが、ビヒクル対照群は９６９．９２±１４３．９３ｍｍ^３の平均腫瘍サイズを有していた。１８日目のＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞の２回目の注射後、ＰＢＳ群では７匹中５匹のマウスにおいて新たな腫瘍が生じたが、ＩＭＭ４７Ｈ群またはＩＭＭ４７Ｃ群のマウスでは、腫瘍は生じなかった。

【0140】

ＩＭＭ４７ＣおよびＩＭＭ４７Ｈは、ＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞が移植されたＢ６－Ｓｉｇｌｅｃ１０トランスジェニックマウスにおいて腫瘍増殖を著しく抑制することができ、ＩＭＭ４７Ｈ処置群およびＩＭＭ４７Ｃ処置群のマウスに腫瘍細胞の２回目の注射を与えたとき、適応免疫反応が誘発され得ることが、データにより示唆された。
［実施例９］例示的な抗体は、大腸癌モデルで強力な抗腫瘍活性を示した

【0141】

２４匹の雄のＢ６トランスジェニックマウス（ヒトＳｉｇｌｅｃ１０を発現するよう操作された）の各々の右腋窩に、１．０×１０^７／ｍｌのＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞１００μｌを注射した。腫瘍サイズが約１００ｍｍ^３に達したら、１群当たりマウス６匹の４群にマウスを無作為に割り付け、この日を０日目と指定した。この日以降、マウスそれぞれに、ＰＢＳ、ＩＭＭ４７（３ｍｇ／ｋｇ）、ＩＭＭ４７Ｈ（３ｍｇ／ｋｇ）、およびＩＭＭ４７Ｃ（３ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を、４週間にわたり、週２回与えた。

【0142】

２１日目に一部のマウスの腫瘍サイズが既定の閾値を超えたので、０日目～２１日目のデータを解析に使用した。

【0143】

この試験体制および結果を表３および図９にまとめた。
表３．ＩＭＭ４７、ＩＭＭ４７Ｈ、ＩＭＭ４７Ｃ、および他の薬剤の抗腫瘍効果

【表3】

【0144】

表３および図９に示すように、ＩＭＭ４７、ＩＭＭ４７Ｃ、およびＩＭＭ４７Ｈは、ＭＣ３８－ｈＣＤ２４細胞が移植されたＢ６－Ｓｉｇｌｅｃ１０トランスジェニックマウスにおいて腫瘍増殖を著しく抑制することができる。具体的に述べると、３ｍｇ／ｋｇの用量において、ＩＭＭ４７Ｃ群のマウス全６匹、ＩＭＭ４７群の４匹、およびＩＭＭ４７Ｈ群の５匹から腫瘍が完全に除去され、ＩＭＭ４７群のマウス２匹では、腫瘍がゆっくり増殖した。

【0145】

本出願の配列を以下に記載した。

【表4】

【0146】

本出願を１または複数の実施形態との関連で上述したが、本出願はこれらの実施形態に限定されず、説明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれ得るものとして全ての代替物、改変物、および均等物をカバーするよう意図されることが理解されるべきである。本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全体において参照により更に組み込まれる。
［参考文献］
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ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０４０９５８５８？ｔｅｒｍ＝ＣＤ２４＆ｄｒａｗ＝２＆ｒａｎｋ＝９
８． Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ＬＤＬ， ＨｂＡ１ｃ， ｈｅｐａｔｉｃ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ， ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：
ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０３９６０５４１？ｔｅｒｍ＝ＣＤ２４＆ｄｒａｗ＝２＆ｒａｎｋ＝２
９． Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｆａｔｔｙ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ：
ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０４７２０５６０？ｔｅｒｍ＝ＣＤ２４＆ｄｒａｗ＝４＆ｒａｎｋ＝２３
１０． Ｔｙｐｅ １ Ｄｉａｂｅｔｅｓ：
ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２８０１９４２？ｔｅｒｍ＝ＣＤ２４＆ｄｒａｗ＝４＆ｒａｎｋ＝２５
１１． Ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ：
ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０２６９４５７５？ｔｅｒｍ＝ＣＤ２４＆ｄｒａｗ＝５＆ｒａｎｋ＝３４
１２． Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：
ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０３７９３２７０？ｔｅｒｍ＝ＣＤ２４＆ｄｒａｗ＝４＆ｒａｎｋ＝２４
１３． Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｌｕｐｕｓ Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ：
ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０３１７８７２１？ｔｅｒｍ＝ＣＤ２４＆ｄｒａｗ＝５＆ｒａｎｋ＝３２
１４． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ
ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０３２５７３５８？ｔｅｒｍ＝ＣＤ２４＆ｄｒａｗ＝５＆ｒａｎｋ＝３５
１５． Ｓｅｐｓｉｓ：
ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ２／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０１９９５４４８？ｔｅｒｍ＝ＣＤ２４＆ｄｒａｗ＝５＆ｒａｎｋ＝３６
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【配列表】

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