特許 7356117 細胞の超音波穿通のための微小気泡の定量吐出装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-26

(45)【発行日】2023-10-04

(54)【発明の名称】細胞の超音波穿通のための微小気泡の定量吐出装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/42 20060101AFI20230927BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20230927BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20230927BHJP

【ＦＩ】

C12M1/42

C12M1/00 A

C12N15/87 Z

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2021515470

(86)(22)【出願日】2019-09-18

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-11

(86)【国際出願番号】 EP2019075075

(87)【国際公開番号】W WO2020058367

(87)【国際公開日】2020-03-26

【審査請求日】2022-06-21

(31)【優先権主張番号】1858385

(32)【優先日】2018-09-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】506316557

【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック

(73)【特許権者】

【識別番号】510107448

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ドルレアン

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【氏名又は名称】松下 満

(74)【代理人】

【識別番号】100098475

【弁理士】

【氏名又は名称】倉澤 伊知郎

(74)【代理人】

【識別番号】100130937

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 泰史

(74)【代理人】

【識別番号】100144451

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 博子

(72)【発明者】

【氏名】ドラランド アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】ルベルトル マティアス

(72)【発明者】

【氏名】ドラランド ミカエル

(72)【発明者】

【氏名】ピション シャンタル

【審査官】太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１８－０９９０５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０００９４２４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】Drug Delivery System，2014年11月25日，Vol. 29, No. 5，p. 456-458，doi:10.2745/dds.29.456

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

Ｊａｐｉｏ－ＧＰＧ／ＦＸ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞の超音波穿通のために微小気泡（３０）を定量吐出する装置（１０）において、前記装置（１０）は、
‐垂直軸線（Ｚ）に関して対称な管（１４）を有し、前記管（１４）は、微小気泡（３０）の溶液（２６）が入っているバイアル（２０）を受け入れるよう構成され、
‐前記管（１４）内に配置された少なくとも２本のカテーテル（１１，１２）を有し、前記カテーテル（１１，１２）は、少なくとも部分的に、前記垂直軸線（Ｚ）に実質的に平行に差し向けられ、前記カテーテル（１１，１２）の各々は、前記バイアル（２０）が前記管（１４）によって受け入れられると、前記バイアル（２０）中に開口するようになったオリフィスを第１の端（１１１，１２１）のところに有し、第１の前記カテーテル（１１）は、第１の空気注入源に連結されるようになっており、第２の前記カテーテル（１２）は、第２の端（１２２）を有し、
前記第１のカテーテル（１１）が前記第１の空気注入源に連結されると、空気を前記第１のカテーテル（１１）のオリフィスから前記バイアル（２０）中に注入することができ、前記注入された空気は、前記バイアル（２０）内に過剰圧力を生じさせ、その結果、前記バイアル（２０）内に入っている微小気泡（３０）が前記第２のカテーテル（１２）に該第２のカテーテルの第１の端の前記オリフィスから入り、次に前記第２のカテーテル（１２）内で該第２のカテーテルの前記第２の端（１２２）に向かって移動するようになっている、装置（１０）。

【請求項2】

前記第２のカテーテル（１２）の少なくとも一部の周りに少なくとも部分的に配置された第３のカテーテル（１３）をさらに有し、前記第３のカテーテル（１３）は、第２の空気注入源に連結されるようになっている、請求項１記載の微小気泡（３０）の定量吐出装置（１０）。

【請求項3】

請求項１または２記載の微小気泡（３０）の定量吐出装置（１０）を有する細胞超音波穿通装置。

【請求項4】

前記第１のカテーテル（１１）に連結された第１の空気注入源をさらに有するともにオプションとして前記微小気泡（３０）の定量吐出装置（１０）が第３のカテーテル（１３）を有する場合には前記第３のカテーテル（１３）に連結された第２の空気注入源をさらに有する、請求項３記載の細胞超音波穿通装置。

【請求項5】

‐少なくとも部分的に液体で満たされるようになったタンク（４０）と、
‐前記タンク（４０）内に配置された超音波変換器（５０）と、
‐トランスフェクション操作されるべき細胞を受け入れるようになった少なくとも１つの受け入れ部（６１）を備えたプレート（６０）と、
‐前記プレート（６０）を受け入れるようになった可動支持体（７０）と、
‐前記可動支持体（７０）を動かすよう構成された可動支持体（７０）移動ユニット（７１，７２）とをさらに有する、請求項３または４記載の細胞超音波穿通装置。

【請求項6】

前記移動ユニット（７１，７２）は、前記垂直軸線（Ｚ）に垂直であって水平面と呼ばれる平面を定める少なくとも２つの寸法方向に延びるレール（７１）を有し、第３の寸法方向が前記垂直軸線（Ｚ）の方向であり、前記支持体（７０）は、前記レール（７１）に沿って動かされるようになっている、請求項５記載の細胞超音波穿通装置。

【請求項7】

前記移動ユニット（７１，７２）は、前記垂直軸線（Ｚ）に垂直であって水平面と呼ばれる平面を定める少なくとも２つの寸法方向に前記支持体（７０）を動かすようになったモータをさらに含み、第３の寸法方向が前記垂直軸線（Ｚ）の方向である、請求項５または６記載の細胞超音波穿通装置。

【請求項8】

前記微小気泡（３０）の定量吐出装置（１０）は、前記垂直軸線（Ｚ）に沿って前記超音波変換器（５０）に向いた状態で位置決めされている、請求項５～７のうちいずれか一に記載の細胞超音波穿通装置。

【請求項9】

設けられている可能性のある空気注入源ならびに前記移動ユニット（７１，７２）の少なくとも一部を収容するよう構成されている第１の部分（８１）を備えたハウジング（８０）をさらに有し、前記ハウジング（８０）は、前記微小気泡（３０）の定量吐出装置（１０）、前記タンク（４０）、前記超音波変換器（５０）、前記プレート（６０）および前記可動支持体（７０）を収容するようになった第２の部分（８２）をさらに備え、前記第２の部分（８２）は、開閉されるようになったカバー（８３）をさらに有し、前記カバー（８３）は、ユーザが少なくとも前記プレート（６０）に接近することができる開放位置にある、請求項５～８のうちいずれか一に記載の細胞超音波穿通装置。

【請求項10】

前記微小気泡（３０）の定量吐出装置（１０）、前記超音波変換器（５０）、前記移動ユニット（７１，７２）、設けられている可能性のある第１の空気注入源、設けられている可能性のある前記第２の空気注入源、および前記カバー（８３）のうちの少なくとも１つを制御するよう構成された処理ユニットをさらに有する、請求項３～９のうちいずれか一に記載の細胞超音波穿通装置。

【請求項11】

請求項１または２のうちいずれか記載の微小気泡（３０）を定量吐出する装置（１０）によって細胞の超音波穿通を行う方法であって、微小気泡（３０）の溶液（２６）の入っているバイアル（２０）が前記微小気泡（３０）の定量吐出装置（１０）内に受け入れられ、前記細胞超音波穿通方法は、空気を前記第１のカテーテル（１１）の前記第１の端（１１１）の前記オリフィスから前記バイアル（２０）中に注入するステップを含み、前記注入された空気は、バイアル（２０）内に過剰圧力を生じさせ、その結果、前記バイアル（２０）内に入っている微小気泡（３０）が前記第２のカテーテル（１２）に該第２のカテーテルの第１の端（１２１）の前記オリフィスから入り、次に、前記第２のカテーテル（１２）内で該第２のカテーテルの前記第２の端（１２２）に向かって移動するようになっている、細胞超音波穿通方法。

【請求項12】

空気を前記第２のカテーテル（１２）の少なくとも一部の周りに少なくとも部分的に配置された第３のカテーテル（１３）に注入するステップをさらに含む、請求項１１記載の細胞超音波穿通方法。

【請求項13】

前記支持体（７０）を移動させるステップをさらに含み、前記微小気泡（３０）の定量吐出装置（１０）は、前記垂直軸線（Ｚ）に沿って前記超音波変換器（５０）に向いた状態で位置決めされ、前記支持体（７０）は、前記プレート（６０）の各受け入れ部（６１）を前記垂直軸線（Ｚ）に沿って前記微小気泡（３０）の定量吐出装置（１０）と前記超音波変換器（５０）との間で連続して配置するよう動かされる、請求項１１または１２記載の細胞超音波穿通方法。

【請求項14】

コンピュータプログラム製品であって、コンピュータプログラムがプロセッサによって実行されると、請求項１１～１３のうちいずれか一に記載の細胞超音波穿通方法を実行する、コンピュータプログラム製品。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞トランスフェクション操作分野、特に気泡を用いた超音波穿通に関する。本発明は、特に、微小気泡を定量吐出する装置およびかかる装置を用いる細胞の超音波穿通（sonoporation：ソノポレーション）方法に関する。

【背景技術】

【0002】

細胞トランスフェクション（cell transfection）は、形質導入（transduction）とは異なり、ウイルスを利用しないで活性分子（例えば、核酸、化学療法剤分子、マーカ、タンパク質など）をトランスフェクション操作されるべき細胞中に導入する方法である。

【0003】

細胞超音波穿通は、超音波を用いて細胞の透過性を変えてトランスフェクション操作されるべき細胞中への活性分子の導入を可能にするトランスフェクション法である。

【0004】

既知の形式の超音波穿通装置は、例えば、国際公開第２００５／１１０９５５号パンフレットに記載されている。この装置は、液体で満たされたタンクの底部に配置されていて超音波を可動構造体上に配置されたトランスフェクション操作されるべき細胞に放出する超音波変換器を有する。

【0005】

既知のように活性分子を微小気泡内に封入することによって超音波穿通操作の効率を大幅に高めることができる。次に、活性分子を収容した微小気泡をトランスフェクション操作されるべき細胞に接触させ、これら微小気泡は、そして変換器によって放出された超音波の影響下で振動する。トランスフェクション操作されるべき細胞とのこれらの相互作用により、かかる細胞膜が透過性を有し、それにより活性分子がトランスフェクション操作されるべき細胞に入ることができる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】国際公開第２００５／１１０９５５号パンフレット

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

一問題は、トランスフェクション操作されるべき細胞上への微小気泡の定量吐出が、マイクロピペットを用いたユーザによって手動で行われるということにある。かかる定量吐出は、退屈であり、しかも超音波穿通操作の効率を貧弱にする。

【0008】

本発明の一目的は、公知形式の装置と比較して効率が向上した細胞超音波穿通のための微小気泡の定量吐出装置を提案することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

一観点によれば、本発明は、細胞の超音波穿通のために微小気泡を定量吐出する装置において、この装置は、
‐垂直軸線に関して対称な管を有し、管は、微小気泡の溶液の入ったバイアルを受け入れるよう構成され、
‐管内に配置された少なくとも２本のカテーテルを有し、カテーテルは、少なくとも部分的に、垂直軸線に実質的に平行に差し向けられ、カテーテルの各々は、バイアルが管によって受け入れられると、バイアル中に開口するようになったオリフィスを第１の端のところに有し、第１のカテーテルは、第１の空気注入源に連結されるようになっており、第２のカテーテルは、第２の端を有し、
第１のカテーテルが第１の空気注入源に連結されると、空気を第１のカテーテルのオリフィスからバイアル中に注入することができ、注入された空気は、バイアル内に過剰圧力を生じさせ、その結果、バイアル内に入っている微小気泡が第２のカテーテルに第２のカテーテルの第１の端のオリフィスから入り、次に第２のカテーテル内でこの第２のカテーテルの第２の端に向かって移動するようになっていることを特徴とする装置に関する。

【0010】

かかる装置は、ユーザの側での手動操作を必要とすることなく、微小気泡の正確かつ制御された量を自動的に定量吐出することができる。この装置は、ユーザが微小気泡の入ったピペットを手で保持しなければならない場合とは異なり、管およびカテーテルの位置が固定された状態で微小気泡定量吐出場所の精度を向上させることができる。

【0011】

したがって、かかる装置は、向上した微小気泡定量吐出効率をもたらす。

【0012】

さらに、かかる微小気泡の定量吐出は、微小気泡との接触を必要とせず、それにより、超音波穿通中、細胞は、何らかの生物学的汚染から保護される。

【0013】

微小気泡定量吐出装置は、第２のカテーテルの少なくとも一部の周りに少なくとも部分的に配置された第３のカテーテルをさらに有するのが良く、第３のカテーテルは、第２の空気注入源に連結されるようになっている。この第３のカテーテルにより、第２の空気注入源を経て、第２のカテーテルを第２の端まで動いた微小気泡を離脱させて微小気泡をトランスフェクション操作されるべき細胞に定量吐出することができる。この第３のカテーテルにより微小気泡の適用が迅速でありかつ正確である。

【0014】

本発明はまた、かかる微小気泡の定量吐出装置を有する細胞超音波穿通装置に関する。

【0015】

超音波穿通装置は、第１のカテーテルに連結された第１の空気注入源を有するのが良い。この第１の空気注入源により、微小気泡定量吐出装置によって受け入れられたバイアル中に空気を注入することができ、その目的は、微小気泡を第２のカテーテル中に通し、そして微小気泡が第２のカテーテルの第２の端まで移動するようにすることにある。

【0016】

超音波穿通装置は、微小気泡の定量吐出装置が第３のカテーテルを有する場合、オプションとして、第３のカテーテルに連結された第２の空気注入源を有するのが良い。このように、第２のカテーテルの第２の端まで移動した微小気泡は、トランスフェクション操作されるべき細胞に定量吐出されるようこの第２の端から自動的かつ正確に離脱させることができる。

【0017】

超音波穿通装置は、
‐少なくとも部分的に液体で満たされるようになったタンクと、
‐タンク内に配置された超音波変換器と、
‐トランスフェクション操作されるべき細胞を受け入れるようになった少なくとも１つの受け入れ部を備えたプレートと、
‐プレートを受け入れるようになった可動支持体と、
‐可動支持体を動かすよう構成された可動支持体移動ユニットとをさらに有するのが良い。

【0018】

かかる細胞超音波穿通装置により、トランスフェクション操作されるべき細胞を微小気泡定量吐出装置および超音波変換器に対して移動させることができる。したがって、微小気泡定量吐出の精度が向上し、これは、既知の装置と比較して、超音波穿通効率の向上の一因となる。

【0019】

細胞超音波穿通装置の幾つかの好ましいが非限定的な特徴は、個々にまたは組み合わされた状態で次のように示される。
‐移動ユニットは、垂直軸線に垂直であって水平面と呼ばれる平面を定める少なくとも２つの寸法方向に延びるレールを有し、第３の寸法方向が垂直軸線の方向であり、支持体は、レールに沿って動かされるようになっている。かくして、超音波穿通装置に対するトランスフェクション操作されるべき細胞を収容したプレートの配設場所を制御することができ、かくして定量吐出された微小気泡の存在場所の精度を向上させることができる。
‐移動ユニットは、垂直軸線に垂直であって水平面と呼ばれる平面を定める少なくとも２つの寸法方向に支持体を動かすようになったモータをさらに含み、第３の寸法方向が垂直軸線の方向である。このように、超音波穿通装置の配設場所に対するトランスフェクション操作されるべき細胞を収容したプレートの配設場所をユーザの側での手動操作の必要なく自動制御することができる。
‐微小気泡の定量吐出装置は、垂直軸線に沿って超音波変換器に向いた状態で位置決めされている。かくして、トランスフェクション操作されるべき細胞を超音波変換器と微小気泡の定量吐出装置の両方に対して移動させることができ、そしてこれら２つの要素と同一の軸線上に配置させることができ、かくして超音波穿通操作の効率が向上する。
‐細胞超音波穿通装置は、設けられている可能性のある空気注入源ならびに移動ユニットの少なくとも一部を収容するよう構成されている第１の部分を備えたハウジングをさらに有し、ハウジングは、微小気泡の定量吐出装置、タンク、超音波変換器、プレートおよび可動支持体を収容するようになった第２の部分をさらに備え、第２の部分は、開閉されるようになったカバーをさらに有し、カバーは、ユーザが少なくともプレートに接近することができる開放位置にある。かかるハウジングは、細胞超音波穿通装置全体をバイオセーフティキャビネット内に収容するとともにそのモジュール性を向上させるよう使用できる。閉鎖位置では、カバーは、蒸発を制限し、トランスフェクション操作されるべき細胞を隔離し、しかもユーザを支持体の運動から保護する。開放位置では、ユーザは、装置のある特定の要素に接近することができ、かくして、これら要素をモジュール方式で変更するとともに／あるいはクリーニングすることができ、それによりかかる装置の保守が容易になる。

【0020】

細胞超音波穿通装置は、微小気泡の定量吐出装置、超音波変換器、移動ユニット、設けられている可能性のある第１の空気注入源、設けられている可能性のある第２の空気注入源、およびカバーのうちの少なくとも１つを制御するよう構成された処理ユニットをさらに有するのが良い。かかる処理ユニットにより、微小気泡定量吐出シーケンス、プレートの移動、超音波の特性ならびに超音波穿通操作のパラメータの自動制御が可能である。

【0021】

第２の観点によれば、本発明は、第１の観点に係る微小気泡を定量吐出する装置によって細胞の超音波穿通を行う方法であって、微小気泡の溶液の入っているバイアルが微小気泡の定量吐出装置内に受け入れられ、細胞超音波穿通方法は、空気を第１のカテーテルの第１の端のオリフィスからバイアル中に注入するステップを含み、注入された空気は、バイアル内に過剰圧力を生じさせ、その結果、バイアル内に入っている微小気泡が第２のカテーテルにこの第２のカテーテルの第１の端のオリフィスから入り、次に、第２のカテーテル内でこの第２のカテーテルの第２の端に向かって移動するようになっていることを特徴とする細胞超音波穿通方法に関する。

【0022】

超音波穿通方法は、以下のステップを個々の状態でまたは組み合わせた状態でさらに含むことができる。
‐空気を第２のカテーテルの少なくとも一部の周りに少なくとも部分的に配置された第３のカテーテルに注入するステップ。
‐支持体を移動させるステップ。微小気泡の定量吐出装置は、垂直軸線に沿って超音波変換器に向いた状態で位置決めされ、支持体は、プレートの各受け入れ部を垂直軸線に沿って微小気泡の定量吐出装置と超音波変換器との間で連続して配置するよう動かされる。

【0023】

第３の観点によれば、本発明は、コンピュータプログラム製品であって、このコンピュータプログラムがプロセッサによって実行されると細胞超音波穿通方法の実施を可能にするコード命令を有することを特徴とするコンピュータプログラム製品に関する。

【0024】

本発明の他の観点、他の目的および他の利点は、非限定的な例示として与えられた以下の詳細な説明を読むと明らかになろう。かかる実施例は、以下の図に示されている。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1a】本発明に係る微小記法を定量吐出する装置を示す線図である。

【図1b】本発明に係る微小記法を定量吐出する装置を示す線図である。

【図2】本発明に係る超音波穿通装置用のタンクおよび超音波変換器を示す線図である。

【図3a】本発明に係る超音波穿通装置をカバーの閉鎖位置で示す線図である。

【図3b】本発明に係る超音波穿通装置をカバーの開放位置で示す線図である。

【図4】本発明に係る超音波穿通装置を示す線図である。

【図5a】本発明に係る超音波穿通方法を示す線図である。

【図5b】本発明に係る微小気泡の移動および定量吐出シーケンスを示す線図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

微小気泡定量吐出および超音波穿通装置

【0027】

図１ａおよび図１ｂは、細胞の超音波穿通のために微小気泡３０を定量吐出する装置１０を示している。

【0028】

微小気泡３０の定量吐出装置１０は、管１４を有する。管１４は、硬質であるのが良く、実質的に形状が円筒形であるのが良く、しかも垂直軸線Ｚに関して回転対称であるのが良い。

【0029】

管１４は、微小気泡３０の溶液２６を収容したバイアル２０を受け入れるようになった空間を画定する。微小気泡３０の直径は、実施されるべき超音波穿通の形式に従って様々であって良い。

【0030】

バイアル２０は、クリンプ形バイアルであるのが良い。バイアル２０は、底部２１、実質的に円筒形の本体２２、本体２２よりも小さな寸法のネック２３、およびネック２３と比較して拡大されたヘッド２４を有するのが良く、ヘッド２４は、好ましくは、隔膜によって閉じられている。

【0031】

バイアル２０は、好ましくは、微小気泡３０の定量吐出装置１０の管１４内にヘッド２４を下にした状態で位置決めされる。このように位置決めされると、バイアル２０のヘッド２４、そのネック２３およびその本体２２の一部は、微小気泡３０を含有した溶液２６で満たされる。溶液２６で満たされていないバイアル２０の部分は、空気２５で満たされる。バイアル２０の本体２２は、微小気泡３０を定量吐出する装置１０の管１４と直接的な接触状態にあるのが良い。変形例では、本体２２と管１４との間に隙間が残ったままである。

【0032】

微小気泡３０を定量吐出する装置１０は、円筒形の下側部分１５をさらに有するのが良い。下側部分１５は、管１４の中心を通る垂直軸線Ｚに関して回転対称であり、この下側部分は、管１４と接触状態にあるのが良い。下側部分１５は、バイアル２０を受け入れるようになった管１４よりも大きな直径を有するのが良い。

【0033】

微小気泡３０を定量吐出する装置１０は、第１のカテーテル１１を有する。第１のカテーテル１１は、微小気泡３０を定量吐出する装置１０の下側部分１５内に固定されている。第１のカテーテル１１は、形状が実質的に円筒形であるのが良くかつ垂直軸線Ｚに関して回転対称であるのが良い。

【0034】

第１のカテーテル１１は、オリフィスを備えた第１の端１１１を有する。バイアル２０は、管１４内に受け入れられ、第１のカテーテル１１は、バイアル２０の隔膜を穿通し、その第１の端１１１のオリフィスは、バイアル２０中に、好ましくはバイアル２０内に入っている空気２５中に垂直に開口している。

【0035】

第１のカテーテル１１は、第１の空気注入源に連結されるようになっている。第１の空気注入源と第１のカテーテル１１との連結は、第１の空気入口パイプ１６を介して行われる。

【0036】

かくして、第１の空気注入源により注入された空気は、第１の空気入口パイプ１６を通り、次に、第１のカテーテル１１を通って第１のカテーテル１１の第１の端１１１のオリフィス経由でバイアル２０中に注入され、それにより、バイアル２０内に過剰圧力が生じる。

【0037】

微小気泡３０を定量吐出する装置１０は、第２のカテーテル１２を有する。第２のカテーテル１２は、微小気泡３０を定量吐出する装置１０の下側部分１５内に固定されている。第２のカテーテル１２は、形状が実質的に円筒形であるのが良くかつ垂直軸線Ｚに関して回転対称であるのが良い。

【0038】

第２のカテーテル１２は、オリフィスを備えた第１の端１２１を有する。バイアル２０が管１４内に受け入れられると、第２のカテーテル１２は、バイアル２０の隔膜を穿通し、その第１の端１２１のオリフィスは、バイアル２０中に、好ましくはバイアル２０内に入れられている微小気泡３０の溶液２６中に垂直に開口する。

【0039】

第２のカテーテル１２は、第２の端１２２を有する。第２のカテーテル１２の第２の端１２２は、好ましくは、微小気泡３０を定量吐出する装置１０の管１４および下側部分１５の外部に開口する。

【0040】

かくして、バイアル２０内に生じた過剰圧力により、バイアル２０内に入っている微小気泡３０が押されてその第１の端１２１のオリフィスを経て第２のカテーテル１２に入り、次に第２のカテーテル１２内でその第２の端１２２の方へ移動する。

【0041】

好ましい実施形態によれば、微小気泡３０を定量吐出する装置１０は、第３のカテーテル１３を有する。第３のカテーテル１３は、形状が実質的に円筒形であるのが良く、この垂直軸線Ｚに関して回転対称であるのが良い。

【0042】

第３のカテーテル１３は、第２のカテーテル１２の少なくとも一部の周りに配置されている。第３のカテーテルは、微小気泡３０を定量吐出する装置１０の下側部分１５内に固定されるとともに配置されるのが良い。第３のカテーテル１３の一端は、微小気泡３０を定量吐出する装置１０の管１４および下側部分１５の外側にかつ第２のカテーテル１２の第２の端１２２の近くに開口するのが良い。

【0043】

第３のカテーテル１３は、第２の空気注入源に連結されるようになっている。第２の空気注入源と第３のカテーテル１３との連結は、第２の空気入口パイプ１７を介して行われる。

【0044】

かくして、第２の空気注入源を通って空気を第３のカテーテル１３中に注入することができ、注入された空気は、第２のカテーテル１２の第２の端１２２まで動いている微小気泡３０を離脱させてこれら微小気泡をトランスフェクション操作される細胞に定量吐出する。

【0045】

好ましい実施形態によれば、微小気泡３０を定量吐出する装置１０は、固定される。変形例では、微小気泡３０を定量吐出する装置１０は、この装置を１つまたは２つの方向に特に並進状態で動かすことができる移動ユニットを有するのが良い。微小気泡３０を定量吐出する装置１０のかかる移動は、微小気泡３０の局所化および定量吐出の精度向上に寄与する。

【0046】

微小気泡３０を定量吐出する装置１０を陰イオン微小気泡３０に用いるのが良く、これら陰イオン微小気泡は、細胞の超音波穿通操作のための現時点において最も一般的に用いられている微小気泡３０である。

【0047】

変形例では、微小気泡３０を定量吐出する装置１０を陽イオン微小気泡３０に用いることができる。かかる陽イオン微小気泡３０は、陰イオンであり、次に、微小気泡３０の外側に結合する活性分子、例えば核酸と静電相互作用を行うことができる。これら陽イオン微小気泡３０は、脂質を陰イオン微小気泡３０に負荷することによって得られる。これら微小気泡は、陰イオン微小気泡３０で得られる効率の５倍以上の超音波穿通効率の実現を可能にする。

【0048】

図２、図３ａ、図３ｂおよび図４は、一実施形態にかかる微小気泡の定量吐出装置１０を有する細胞の超音波穿通装置を記載している。

【0049】

超音波穿通装置は、第１のカテーテル１１に連結された第１の空気注入源をさらに有するのが良い。超音波穿通装置は、微小気泡３０を定量吐出する装置１０が第３のカテーテル１３を有する場合、第３のカテーテル１３に連結される第２の空気注入源をさらに有するのが良い。第１および第２の空気注入源は、例えば、ポンプまたは圧縮機である。

【0050】

好ましい実施形態によれば、細胞超音波穿通装置は、
‐少なくとも部分的に液体で満たされるようになったタンク４０と、
‐タンク４０内に配置された超音波変換器５０と、
‐トランスフェクション操作されるべき細胞を受け入れるようになった少なくとも１つの受け入れ部６１を備えたプレート６０と、
‐プレート６０を受け入れるようになった可動支持体７０と、
‐可動支持体７０を動かすよう構成された可動支持体７０移動ユニット７１，７２とをさらに有する。

【0051】

好ましい実施形態によれば、タンク４０は、垂直軸線Ｚ周りに実質的に円筒形である。タンク４０は、半透明であるのが良くかつ超音波を変換器５０から伝搬するよう液体、例えば水で満たされるのが良い。タンク４０の寸法は、プレート６０および支持体７０の寸法形状に合わせられている。タンク４０は、液位がタンク４０内の超音波の適正な伝搬を可能にするのに十分であることを確認することができる液位検出手段をさらに有するのが良い。タンク４０は、これが収容している液体を排出させることができるドレン弁をさらに有するのが良い。さらに、タンク４０は、超音波変換器５０とタンクが収容している液体との間の封止を保証するシール、例えば二重Ｏリングシールを有するのが良い。

【0052】

超音波変換器５０は、好ましくは、タンク４０の中央に固定されるとともに配置される。超音波変換器は、実質的にタンク４０の中間部内に配置されるのが良い。超音波変換器５０は、タンク４０のオリフィスを介してケーブルによって電源に接続される。超音波変換器５０は、超音波の特性を例えば用いられる微小気泡３０のサイズ、活性分子および／またはトランスフェクション操作されるべき細胞の性状、超音波穿通操作の所望の効率および／または速度などの関数として適合させるために交換可能であるのが良い。

【0053】

プレート６０は、好ましくは、水平面を呼ばれる垂直軸線Ｚに垂直な平面内で延びる。プレート６０は、寸法が同一の実質的に長方形の下側および上側を有するのが良い。プレート６０の寸法は、セーフティキャビネットのエンクロージャ内に収納可能に構成されているのが良い。プレート６０は、その上側上に均等に分布して配置された幾つかの受け入れ部６１を有するのが良く、受け入れ部６１は、トランスフェクション操作されるべき細胞を収容するようになっている。受け入れ部６１は、円筒形であるのが良く、この受け入れ部は、垂直軸線Ｚに沿ってプレート６０の深さ中に延びるのが良い。プレート６０の下側と受け入れ部６１の底部との間の距離は、１ミリメートルオーダのものであるのが良い。プレート６０は、超音波変換器５０と微小気泡３０を垂直軸線Ｚに沿って定量吐出する装置１０との間に配置されるのが良い。超音波変換器５０は、プレート６０の下側上に、好ましくはこれから固定された距離を置いたところに配置されるのが良い。微小気泡３０を定量吐出する装置１０は、プレート６０の上側に、好ましくはこれから固定された距離を置いたところに配置されるのが良い。

【0054】

支持体７０は、プレート６０の一貫した寸法を有するのが良く、かつその周りにぐるりと全体にわたって延びるのが良い。支持体７０は、例えばプレート６０を凹ませることによってまたは締結具、例えばねじによってプレート６０を固定するのが良い。

【0055】

移動ユニット７１，７２は、水平面と呼ばれる垂直軸線Ｚに垂直な平面を定める少なくとも２つの寸法方向に延びた走行レール７１を含むのが良く、第３の寸法方向は、垂直軸線Ｚの方向である。移動ユニット７１，７２は、レール７１に沿って摺動するようになった移動要素７２をさらに含むのが良い。可動支持体７０は移動要素７２に取り付けられるのが良く、この可動支持体をレール７１に沿って水平面内で並進状態でかつ必要ならば垂直軸線Ｚに沿って動かすことができる。

【0056】

移動ユニット７１，７２は、支持体７０を上記において定められた寸法方向のうちの少なくとも１つに動かすようになった１つまたは２つ以上のモータをさらに含むのが良い。かくして、支持体７０の移動をモータによって自動的に実施することができる。変形例では、移動ユニット７１，７２は、手動移動手段、例えばマイクロメートルねじを備えても良い。変形例では、移動ユニットは、モータと手動移動手段の両方を備えても良い。例えば、支持体７０をモータによって水平面内で自動的に動かすとともにマイクロメートルねじにより手動で垂直軸線Ｚに沿って動かすことができる。

【0057】

好ましい実施形態によれば、微小気泡３０を定量吐出する装置１０は、垂直軸線Ｚに沿って超音波変換器５０に向いた状態で位置決めされている。この場合、移動ユニット７１，７２は、支持体７０およびかくしてプレート６０を動かして各受け入れ部６１を垂直軸線Ｚ上で超音波変換器５０と微小気泡３０の定量吐出装置１０との間で連続的に配置することができる。次に、第２のカテーテル１２の第２の端１２２からいったん離脱した微小気泡３０を重力の作用下で受け入れ部６１に定量吐出することができる。

【0058】

先の段落で記載した超音波穿通装置では、バイアル２０は、第２のカテーテル１２の第２の端１２２の近くに配置され、この第２の端は、それ自体、トランスフェクション操作されるべき細胞を収容した受け入れ部６１の近くに配置される。かかる装置は、バイアル２０とトランスフェクション操作されるべき細胞との間で微小気泡３０の動く距離を制限し、特に第２のカテーテル１２の寸法を制限し、それにより高い超音波穿通効率が得られる。

【0059】

変形例では、微小気泡３０を収容したバイアル２０は、例えば装置の一方の側で、トランスフェクション操作されるべき細胞からさらに遠ざかって位置決めされても良い。

【0060】

超音波穿通装置は、超音波変換器５０に電力供給することができる電源をさらに有するのが良い。

【0061】

好ましい実施形態では、超音波穿通装置は、ハウジング８０をさらに有する。微小気泡３０を定量吐出する装置１０の管１４は、ハウジング８０に取り付けられるとともにこれから突き出るのが良い。かくして、管１４中へのバイアル２０の導入は、ハウジング８０の外側から実施できる。微小気泡３０を定量吐出する装置１０が移動ユニットを有する場合、この移動ユニットは、例えば、ハウジング８０に取り付けられた走行レールを有するのが良く、微小気泡３０を定量吐出する装置１０は、この走行レールに沿って動くことができる。次に、微小気泡３０を定量吐出する装置１０の管１４をハウジング８０ではなくレールに取り付けることができる。

【0062】

変形例では、ある特定の要素、例えばタンク４０および超音波変換器５０、または微小気泡３０を定量吐出する装置１０は、ハウジング８０の外部に配置されても良い。

【0063】

好ましい実施形態によれば、ハウジング８０は、第１の部分８１と第２の部分８２とから成る。第１の部分８１は、不透明であるのが良く、第２の部分８２は、透明であるのが良い。第１の部分８１は、２つの空気注入源と、電源と、移動ユニット７１，７２のモータと、走行レール７１のうちの幾つかまたは全てとを有するのが良い。第２の部分８２は、微小気泡３０を定量吐出する装置１０と、タンク４０と、超音波変換器５０と、プレート６０と、このプレートの支持体７０と、走行レール７１のうちの幾つかまたは全てとを有するのが良い。

【0064】

ハウジング８０の第２の部分８２は、開閉されるようになったカバー８３をさらに有するのが良い。カバー８３は、透明であるのが良い。閉鎖位置では、カバー８３は、蒸発を制限し、トランスフェクション操作されるべき細胞を隔離し、ユーザを支持体７０の移動から保護する。開放位置では、ユーザは、装置のある特定の要素、例えばプレート６０、支持体７０、タンク４０およびその変換器５０に接近することができる。かくして、幾つかの要素をモジュール方式で交換することができるとともに／あるいはクリーニングすることができ、それによりかかる装置の保守が容易になる。好ましくは、カバー８３は、自動的に操作されるようになった閉鎖手段を有する。

【0065】

好ましい実施形態では、細胞の超音波穿通装置は、ソフトウェアにより以下の要素、すなわち、微小気泡３０を定量吐出する装置１０、超音波変換器５０、移動ユニット７１，７２、第１の空気注入源、第２の空気注入源、カバー８３を閉鎖する手段のうちの少なくとも１つを制御するよう構成された処理ユニットまたは処理装置をさらに有する。

【0066】

処理ユニットは、超音波穿通ハウジング８０の内側または外側に配置可能である。処理ユニットは、例えば、ＵＳＢによって、ユーザが超音波穿通操作を制御することができるマンマシンインターフェースを備えたコンピュータに接続されるのが良い。

【0067】

かかる処理ユニットは、微小気泡３０の定量吐出の特性（定量吐出体積、定量吐出位置および時間、定量吐出された各微小気泡３０相互間の時間、定量吐出操作の回数など）、超音波のパラメータ（周波数、振幅、電力、伝送時間など）、支持体７０の移動（移動方向、移動速度、位置）、カバー８０の開閉などを自動的に制御する。

【0068】

上記段落において説明した超音波穿通装置は、生体外で使用されるようになっている。変形例では、この装置は、生体内で使用でき、超音波穿通操作は、生体外使用の場合と同一の処理ユニットで制御される。この場合、超音波変換器５０は、生体内使用に必要な振幅と適合性があるよう選択され、かかる振幅は、生体外使用の場合の振幅よりも大きい。タンク４０は、その寸法が生体外超音波穿通の寸法よりも小さいように選択されるのが良く、このタンクは、観察されるべき組織、例えば動物の皮膚上に配置される。微小気泡３０は、血流中に静注される。

【0069】

超音波穿通方法

【0070】

先の段落で説明した微小気泡３０を定量吐出する装置１０を用いた超音波穿通方法が図５ａに示されている。

【0071】

第１のステップＳ１によれば、微小気泡３０を含有した溶液２６を準備する。このステップＳ１は、陰イオンまたは陽イオン微小気泡３０の生成、これら微小気泡３０内への活性分子の配置および微小気泡を含有した溶液２６の準備を含む。

【0072】

第２のステップＳ２によれば、バイアル２０に微小気泡３０を含有した溶液２６を少なくとも部分的に満たす。バイアル２０をこのステップＳ２の間、揺さぶるのが良い。バイアル２０の充填レベルは、トランスフェクション操作されるべき活性分子の量、プレート６０上の受け入れ部６１の個数、トランスフェクション操作されるべき細胞の個数、カテーテル１１，１２，１３の寸法などで決まるといえる。

【0073】

第３のステップＳ３によれば、ヘッド２４を下にした状態で微小気泡３０の定量吐出装置１０の管１４内にバイアル２０を位置決めする。次に、バイアル２０の隔膜を第１および第２のカテーテル１１，１２によって穿通する。

【0074】

第４のステップＳ４によれば、空気を第１の空気注入源から注入する。注入された空気は、第１の空気入口パイプ１６および第１のカテーテル１１を通り、そして第１のカテーテル１１の第１の端１１１のオリフィスを通ってバイアル２０内に入っている空気２５中に開口する。空気の注入量は、１マイクロリットルのオーダである。このようにして注入された空気は、バイアル２０内に入っている空気２５の過剰圧力を生じさせる。この過剰圧力により、溶液２６内に含まれている微小気泡３０が第２のカテーテル１２にその第１の端１２２のオリフィスを通って入り、次に、第２のカテーテル１２内でその第２の端１２２に向かって移動する。

【0075】

第５のステップＳ５によれば、空気を第２の空気注入源から注入する。空気は、第２の空気入口パイプ１７および第３のカテーテル１３を通過し、第３のカテーテル１３は、第２のカテーテル１２の少なくとも一部の周りに配置されている。注入された空気は、第２のカテーテル１２の第２の端１２２のところに生じた微小気泡３０を離脱させ、これら微小気泡をトランスフェクション操作されるべき細胞に定量吐出する。

【0076】

先の段落で説明した超音波穿通装置による微小気泡３０の移動および定量吐出のシーケンスが図５ｂに示されている。

【0077】

第１のステップＳ１１によれば、ユニット７１，７２を動かすことにより支持体７０を動かしてプレート６０（プレート６０は、ｎ個の受け入れ部６１を有する）の受け入れ部６１ｉの幾何学的中心を垂直軸線Ｚ上で超音波変換器５０と微小気泡３０を定量吐出する装置１０との間に配置する。

【0078】

第２のステップＳ１２によれば、超音波を超音波変換器５０によって放出して受け入れ部６１ｉの中心を刺激し、この間、微小気泡３０の第１の分量を微小気泡３０の定量吐出装置１０によって受け入れ部６１内に定量吐出する。超音波の放出および微小気泡３０の定量吐出をある特定の時間後に停止させる。

【0079】

変形例では、微小気泡３０の定量吐出を超音波の放出と同時にではなく、これとは別個にまたはこの放出に対して時間をずらして実施しても良い。

【0080】

これらステップＳ１１，Ｓ１２を微小気泡３０の移動および定量吐出の所望のシーケンスに従ってこの受け入れ部６１ｉについてｐ回繰り返すのが良く、すなわち、支持体７０を動かして受け入れ部６１ｉの別の部分（例えば、受け入れ部６１の上端、下端、右端または左端）を垂直軸線Ｚ上で超音波変換器５０と微小気泡３０の定量吐出装置１０との間に配置し、次に、微小気泡３０の第２の部分を定量吐出している間、超音波を放出する。

【0081】

ステップＳ１２で定量吐出された微小気泡３０の分量は、ステップＳ１１，Ｓ１２の繰り返し回数ｐに反比例するのが良い。例えば、最初に受け入れ部６１ｉの中央、次に上端、次に右端、次に下端、そして最後に左端を垂直軸線Ｚ上で超音波変換器５０と微小気泡３０を定量吐出する装置１０との間に配置することから成る移動シーケンスにおいてステップＳ１１，Ｓ１２を５回繰り返す場合、各ステップＳ１２で定量吐出される微小気泡３０の分量は、受け入れ部６１ｉ内に定量吐出されるべき微小気泡３０の全量の１／５に一致するのが良い。かくして、このシーケンスの終わりでは、受け入れ部６１ｉ内に定量吐出されるべき微小気泡３０の量全体が定量吐出されることになる。

【0082】

受け入れ部６１ｉを移動させる他のシーケンスは、当然のことながら可能である。例えば、支持体７０をステップＳ１１において動かして受け入れ部６１の中心ではなく、一端を超音波変換器５０と微小気泡３０を定量吐出する装置１０との間に配置しても良い。受け入れ部６１の移動シーケンスは、螺旋パターンをなしてまたは任意他の所望のパターンをなして実施可能である。このシーケンスを各受け入れ部６１について数回繰り返すことができる。受け入れ部６１の移動回数ｐもまた、様々であって良い。例えば、活性分子が核酸であり、受け入れ部６１ｉ中に定量吐出されるべき核酸の量が１グラムである場合、ステップＳ１１，Ｓ１２を３回繰り返し、そして０．３３ｇの核酸を３つのステップＳ１２の各々で定量吐出することによって核酸を定量吐出するのが良い。

【0083】

変形例では、支持体７０が受け入れ部６１ｉを動かしてその中心を垂直軸線Ｚ上で超音波変換器４０と微小気泡３０を定量吐出する装置１０との間に位置決めした状態でかつ微小気泡３０の全てがステップＳ１２の間に定量吐出される状態で、微小気泡３０の全てを一度に受け入れ部６１中に定量吐出しても良い。

【0084】

ステップＳ１１，Ｓ１２のｐ回の繰り返しが実施されたとき、受け入れ部６１ｉの微小気泡３０の移動および定量吐出のシーケンスが実施される。支持体７０を動かしてプレート６０の受け入れ部６１ｉ＋１を垂直軸線Ｚ上で超音波変換器４０と微小気泡３０を定量吐出する装置１０との間に位置決めする。次に、微小気泡３０の新たな移動および定量吐出シーケンスを実施する。微小気泡３０のこの新たな移動および定量吐出シーケンスは、ステップＳ１１，Ｓ１２の繰り返し回数ｑから成るのが良く、この場合ｑは、ｐに等しくても良くこれとは異なっていても良い。かくして、各受け入れ部６１は、微小気泡３０の特定の移動および定量吐出シーケンスから恩恵を受ける。

【0085】

このシーケンスをプレート６０のｎ個の受け入れ部６１の各々について繰り返すのが良く、この場合、支持体７０を動かしてプレート６０の各受け入れ部６１を微小気泡３０を定量吐出する装置１０と超音波変換器５０との間に連続して配置する。かくして、超音波穿通操作をトランスフェクション操作されるべき細胞を収容したｎ個の受け入れ部６１について実施するのが良い。変形例では、このシーケンスをプレート６０のｎ個の受け入れ部６１の幾つかについてのみ実施しても良い。

【0086】

超音波穿通プロセスをプロセッサ上でランするコンピュータプログラム製品によって実施することができる。かかるソフトウェアは、微小気泡３０の定量吐出の特性（定量吐出体積、定量吐出位置および時間、定量吐出された各微小気泡３０相互間の時間、定量吐出操作の回数など）、超音波のパラメータ（周波数、振幅、電力、伝送時間など）、支持体７０の移動（移動方向、移動速度、位置）、微小気泡３０の移動及び定量吐出シーケンス、カバー８３の開閉などを自動的に制御するために処理ユニットと情報のやり取りをするのが良い。かくして、超音波穿通操作をプレート６０の各受け入れ部６１に関する特定のパラメータにより自動的に、再現可能に実施することができる。したがって、かかる超音波穿通効率は、現在の効率と比較して高められる。

【0087】

微小気泡３０の移動および定量吐出シーケンスは、超音波穿通作業の実施前にあらかじめ定められるのが良く、この場合、ユーザは、処理ユニットのインターフェースを介して操作中、このシーケンスを変えることができる。変形例では、微小気泡３０の移動および定量吐出シーケンスをユーザによって操作中に選択することができる。

【図1a】

【図1b】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図4】

【図5a】

【図5b】