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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-26
(45)【発行日】2023-10-04
(54)【発明の名称】自己免疫疾患の検出剤となるタンパク質複合体、及びその使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/531 20060101AFI20230927BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20230927BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20230927BHJP
G01N 33/532 20060101ALI20230927BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20230927BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20230927BHJP
【ＦＩ】
G01N33/531 A
C12N15/13 ZNA
C12N15/62 Z
G01N33/532 A
G01N33/53 N
C12P21/08
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2019107179
(22)【出願日】2019-06-07
(65)【公開番号】P2020201087
(43)【公開日】2020-12-17
【審査請求日】2022-06-03
(73)【特許権者】
【識別番号】598121341
【氏名又は名称】慶應義塾
(74)【代理人】
【識別番号】100189131
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 拓郎
(74)【代理人】
【識別番号】100182486
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 正展
(74)【代理人】
【識別番号】100147289
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 裕子
(74)【代理人】
【氏名又は名称】牛山 直子
(72)【発明者】
【氏名】竹下 勝
(72)【発明者】
【氏名】竹内 勤
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 勝也
【審査官】西浦 昌哉
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５００５０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】OBUSE, C. et al.，A conserved Mis12 centromere complex is linked to heterochromatic HP1 and outer kinetochore protein Zwint-1，NATURE CELL BIOLOGY，2004年10月24日，vol.6/No.11，p.1135-1141
【文献】TSUKAMOTO, M. et al.，Clinical and Immunological Features of Anti-centromere Antibody-positive Primary Sjogren's Syndrome，RHEUMATOLOGY AND THERAPY，2018年09月25日，Vol.5，p.499-505
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｐ １／０８－４１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＭＩＳ１２複合体を含む、自己免疫疾患の診断及び／又は分類のための検出剤。
【請求項2】
タグが付加されたものである、請求項１に記載の検出剤。
【請求項3】
タグがオリゴペプチド、ポリペプチド、酵素、蛍光タンパク質、放射性同位元素、金属微粒子、磁性微粒子、蛍光物質、及び発光物質からなる群から選択されるものである、請求項２に記載の検出剤。
【請求項4】
自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、請求項１～３のいずれか一に記載の検出剤。
【請求項5】
生体由来の試料において、請求項１に記載の検出剤に結合する抗体が存在することを指標とする方法であって、前記生体由来の試料に対して請求項２又は３に記載のタグが付加された検出剤を接触させることを含み、自己免疫疾患の検出及び／又は分類のためのものである、方法。
【請求項6】
生体由来の試料が体液である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
生体由来の試料が生検組織である、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、請求項５～７のいずれか一に記載の方法。
【請求項9】
生体由来の試料が自己免疫疾患と診断された患者又は自己免疫疾患の疑い例と診断された患者に由来する生体試料である、請求項５～８のいずれか一に記載の方法。
【請求項10】
生体由来の試料が、抗核抗体検査で陽性反応が認められた患者に由来する生体試料である、請求項５～９のいずれか一に記載の方法。
【請求項11】
生体由来の試料が、抗核抗体検査でdiscrete speckled型の陽性反応が認められた患者に由来する生体試料である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
生体由来の試料が、ＣＥＮＰ－Ｂを用いた抗セントロメア抗体検査で陽性反応が認められた患者に由来する生体試料である、請求項５～１１のいずれか一に記載の方法。
【請求項13】
請求項１～４のいずれか一に記載の検出剤を含む組成物であって、自己免疫疾患の検出及び／又は分類用試薬である、組成物。
【請求項14】
自己免疫疾患の検出及び／又は分類用試薬が、シェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患の検出及び／又は分類用試薬である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
請求項１３又は１４に記載の組成物を含むキットであって、自己免疫疾患の検出及び／又は分類のための、キット。
【請求項16】
自己免疫疾患の検出及び／又は分類のためのキットが、シェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患の検出及び／又は分類のためのキットである、請求項１５に記載のキット。
【請求項17】
請求項１～４のいずれか一に記載の検出剤を含む組成物であって、ＭＩＳ１２複合体に対する自己抗体の検出用試薬、又はＭＩＳ１２複合体に対する抗体を産生する細胞又は組織の検出用試薬である、組成物。
【請求項18】
請求項１７記載の組成物を含むキットであって、ＭＩＳ１２複合体に対する自己抗体の検出用の、キット。
【請求項19】
請求項１７記載の組成物を含むキットであって、ＭＩＳ１２複合体に対する抗体を産生する細胞又は組織の検出用の、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、自己免疫疾患の検出剤となるタンパク質複合体、及びその使用に関する。より具体的には、シェーグレン症候群などの自己免疫疾患において発現する自己抗体と結合するタンパク質複合体であって、自己免疫疾患の検出剤となるタンパク質複合体、及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
自己免疫疾患とは、免疫系が正常に機能しなくなり、自分の免疫機能によって自身（自己組織）が攻撃されてしまう疾患である。また、全身性自己免疫疾患の患者の特徴の一つとして、内因性抗原（自己抗原）に対する自己抗体の出現が知られている。そのため、自己免疫疾患の診断には、問診、身体所見、一般的に用いられる血液検査に加えて、自己の組織に対する免疫応答を持つか、という検査が用いられる。
【0003】
内因性抗原（自己抗原）に対する自己抗体の検査とは、自己の成分（内因性抗原／自己抗原）に対する液性免疫があるかを調べるものである。代表的なもの一つが抗核抗体検査で、細胞核に存在する自己の成分と結合する抗体の存否を調べる検査である。具体的な手技の例としては、スライドグラスに貼り付けたＨＥｐ－２細胞等のヒト培養細胞に対し、希釈した被験者（患者）の血清を反応させ、ラベルした抗ヒトＩｇＧ抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体-ＦＩＴＣ）で検出する方法（間接蛍光抗体法）が挙げられる。このような手法によって、細胞の核の部分に自己抗体の存在を示すシグナルが検出された場合に「抗核抗体検査で陽性」と判断される。
【0004】
抗核抗体検査で陽性の場合、その染色パターンに応じて、homogenous型、speckled型、nucleolar型、discrete speckled型などに分類される。各パターンにおいて、それぞれ核内の何らかの対応タンパク質（内因性抗原／自己抗原）に対する抗体を検出しているとされるが、抗核抗体検査のみではどのような自己抗体が血清に含まれていたか明らかでない。そこで、抗核抗体検査で陽性となった患者に関して、どのタンパク質に対する自己抗体を持っているのかが検討される。具体的には、特定の自己タンパク質を固相に固着させ、そこに被験者（患者）由来の血清を反応させ、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体（例えば抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ）で検出するＥＬＩＳＡ法によって自己抗体の種類を同定する手法が多く用いられる。そのように調べられた自己抗体は、ある特定の疾患群で特異的に陽性になる事が知られているため、診断、治療方針の決定、予後予測に有用であり、実臨床でも頻繁に用いられている。しかしながら、なぜ自己抗体が作られるのか、なぜ核内タンパクが全身性自己免疫疾患で主要な抗原になっているのか、なぜ患者の自己抗体と臨床病型が関連するのか、自己抗体が病因となっているのか、など、いまだ解明されていないことは多い。
【0005】
抗核抗体検査でdiscrete speckled型（散剤斑紋型）に分類される場合、ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、ＣＥＮＰ－Ｃ、ＣＢＸ５（ＨＰ１α）などのセントロメア構成タンパク質に対する自己抗体が存在することが知られている。とりわけ、抗ＣＥＮＰ－Ｂ 抗体は、discrete speckled型を示す患者の９７％で陽性になると報告されている（非特許文献１）。そのため、抗核抗体検査でdiscrete speckled型と判断された患者は、通常、次にＣＥＮＰ－Ｂに対する自己抗体の有無がＥＬＩＳＡで検査される。この結果、陽性であれば、抗セントロメア抗体（ＡＣＡ）陽性と判断される。一方、discrete speckled型で抗核抗体陽性であるが、抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体陰性の場合には、対応抗原不明と分類され、それ以上の検査がなされないのが通例であった。
【0006】
以上のように、血清中の自己抗体の検査として、抗核抗体検査と抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体ＥＬＩＳＡとが存在し、これらの一致度は９７%と高いものの、少数例ながら乖離が認められており、抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体陰性の患者の病態は十分に明らかにされないままとなっている。また、従来の検査手法では、患者の患部の組織／細胞においては自己抗体が発現しているものの、血清中に自己抗体が出てくる以前の病態に関しては、自己抗体の存在を検出することができないため、その病態はほとんど調べられていないのが現状である。
【0007】
シェーグレン症候群（ＳｊＳ、またはＳＳと略称される。以下では「ＳＳ」と言うことがある。）は我が国が指定する指定難病の一つであり、外分泌腺を主病変とする自己免疫疾患で、涙腺、唾液腺などの外分泌腺に慢性のリンパ球浸潤を認め、腺破壊が起こり、乾燥症状を招く疾患である。ＳＳにおけるリンパ球浸潤は通常巣状に認められ、浸潤部位ではＢ細胞が中心に、Ｔ細胞がその周囲に存在する。２５％程度の患者では、浸潤部位に異所性リンパ濾胞の構造も認められる。ＳＳは多彩な自己抗体の出現（抗ＳＳ－Ａ抗体、抗ＳＳ－Ｂ抗体など）や高ガンマグロブリン血症を呈し、涙腺や唾液腺を標的とする臓器特異的な自己免疫疾患であると同時に、全身性の臓器病変を伴う全身性の自己免疫疾患でもある。臓器特異的な症状としては、目の乾燥（ドライアイ）、口の乾燥、鼻腔の乾燥、唾液腺の腫れと痛みなどが代表的なものとして挙げられる。また、全身症状としては、疲労感、記憶力低下、頭痛が特に多く、他にめまい、集中力の低下、気分が移ろいやすい、うつ傾向などが挙げられる。
【0008】
ＳＳは、１９９９年に改訂された厚生労働省の診断基準に基づいて、以下の４項目のうち２項目を満たすことにより診断される。
【0009】
１．生検病理組織検査で次のいずれかの陽性所見を認めること
Ａ）口唇腺組織でリンパ球浸潤が４ｍｍ２当たり１ ｆｏｃｕｓ以上
Ｂ）涙腺組織でリンパ球浸潤が４ｍｍ２当たり１ ｆｏｃｕｓ以上
Ａ）口唇腺組織でリンパ球浸潤が４ｍｍ２当たり１ ｆｏｃｕｓ以上
Ｂ）涙腺組織でリンパ球浸潤が４ｍｍ２当たり１ ｆｏｃｕｓ以上
【0010】
２．口腔検査で次のいずれかの陽性所見を認めること
Ａ）唾液腺造影でｓｔａｇｅ Ｉ（直径１ｍｍ以下の小点状陰影）以上の異常所見
Ｂ）唾液分泌量低下（ガムテスト１０分間で１０ｍＬ以下、又はサクソンテスト２分間２ｇ以下）があり、かつ唾液腺シンチグラフィーにて機能低下の所見
Ａ）唾液腺造影でｓｔａｇｅ Ｉ（直径１ｍｍ以下の小点状陰影）以上の異常所見
Ｂ）唾液分泌量低下（ガムテスト１０分間で１０ｍＬ以下、又はサクソンテスト２分間２ｇ以下）があり、かつ唾液腺シンチグラフィーにて機能低下の所見
【0011】
３．眼科検査で次のいずれかの陽性所見を認めること
Ａ）シルマー試験で５ｍｍ／５ｍｉｎ以下で、かつローズベンガルテストで陽性
Ｂ）シルマー試験で５ｍｍ／５ｍｉｎ以下で、かつ蛍光色素（フルオレセイン）試験で陽性
Ａ）シルマー試験で５ｍｍ／５ｍｉｎ以下で、かつローズベンガルテストで陽性
Ｂ）シルマー試験で５ｍｍ／５ｍｉｎ以下で、かつ蛍光色素（フルオレセイン）試験で陽性
【0012】
４．血清検査で次のいずれかの陽性所見を認めること
Ａ）抗ＳＳ－Ａ抗体陽性
Ｂ）抗ＳＳ－Ｂ抗体陽性
Ａ）抗ＳＳ－Ａ抗体陽性
Ｂ）抗ＳＳ－Ｂ抗体陽性
【0013】
ＳＳは中年女性に好発し、患者の年齢層は５０歳台にピークがあるが、子どもから８０歳台の老人まで発症例が認められている。男女比は１：１４で患者は女性の方が多い。厚生労働省研究班のデータでは、患者数は約６６，３００人とされている。しかし、医療機関で受療していない潜在的な患者を含めると、我が国のＳＳ患者数は１０～３０万人にのぼると推定されている。
【0014】
抗ＳＳ－Ａ抗体、抗ＳＳ－Ｂ抗体は、ＳＳ患者全体の６０－７０％程度で陽性になることが知られており、これらの抗体の性質に関しては多くの研究がなされてきた。例えば、ＳＳ患者の末梢血中の抗ＳＳ－Ａ抗体／抗ＳＳ－Ｂ抗体のレパトアは健常人と比べて偏りがある事、ＳＳ患者の唾液中には主にＩｇＧ型の自己抗体が分泌されること、ＳＳ患者の唾液腺ではantigen-drivenにclonalに増殖したB細胞が存在する事、ＳＳ患者の唾液腺には抗ＳＳ－Ａ抗体／抗ＳＳ－Ｂ抗体を産生する形質細胞が存在する事などが報告されている。
【0015】
ＳＳの自己抗体としては、抗ＳＳ－Ａ抗体／抗ＳＳ－Ｂ抗体以外にも、抗セントロメア抗体（ＡＣＡ）、抗α－Ｆｏｄｒｉｎ抗体、抗Ｍ３Ｒ抗体などが報告されている。ＡＣＡはＳＳ患者の３－２７％に認められているが、ＡＣＡ陽性はＳＳの診断基準には含まれていない。ＡＣＡ陽性のＳＳについては、抗ＳＳ－Ａ抗体／抗ＳＳ－Ｂ抗体陽性のＳＳとは臨床病型が異なることから、サブグループを作るのではないかという報告もある。ＡＣＡに関しては、全身性強皮症（ＳＳｃ）のサブグループである限局皮膚硬化型全身性皮膚強皮症（ｌｃＳＳｃ）患者の７０％、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）の１０－４０％でも陽性になることが知られている。ＳＳｃ（ｌｃＳＳｃを含む）やＰＢＣもＳＳと同様、自己免疫疾患であって指定難病に指定されているものであるが、ＳＳとこれらの疾患との関係はよく分かっていない。
【0016】
前記のように、ＳＳ患者の病変部位である唾液腺の組織中には抗ＳＳ－Ａ抗体／抗ＳＳ－Ｂ抗体を産生する形質細胞が見出されており、自己免疫疾患における自己抗体と病変局所との関係は以前から研究されてきた。しかしながら、ＡＣＡの出現と病変局所との関連については未だ報告が認められない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0017】
【文献】Earnshaw WC et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) vol. 84, pp. 4979-4983
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0018】
本発明は、ＳＳのような自己免疫疾患において出現する自己抗体やそれに対応する内因性抗原（自己抗原）の種類が十分に明らかにされていないこと、自己抗体の種類や存在態様と自己免疫疾患の病態との関連付けが十分にされていないこと、及び、臨床検査において内因性抗原（自己抗原）の同定が十分になされていない現状に鑑みて、自己免疫疾患において出現する自己抗体に対する内因性抗原（自己抗原）であって、自己免疫疾患の新たな検出剤の提供を課題とする。また、発明の一態様としては、当該検出剤の使用方法であって、自己免疫疾患の検出・分類のための使用方法、又は、内因性抗原（自己抗原）に対する自己抗体の検出若しくは当該自己抗体を発現する細胞・組織の検出のための使用方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0019】
本発明者らは、自己免疫疾患の病変局所に存在する形質細胞の性質を抗原特異性の面から明らかにするために、ＳＳの唾液腺組織中からリンパ球を分離し、形質細胞をシングルセルとして取得すると共に、各形質細胞が産生している抗体の核酸配列を決定した。ついで、決定された配列情報に基づいて各抗体に対応するリコンビナント抗体を作成し、その抗体の反応性を調べることによって、どのようなタンパク質に対する抗体が存在し、どのような自己免疫反応が起こっているのかを網羅的に解析した。この結果、本発明者らは、ＳＳ－ＡやＳＳ－Ｂといった既知の自己抗原に対する抗体のみならず、新規な自己抗体とそれに対応する自己抗原（タンパク質複合体）を同定することに成功すると共に、当該自己抗原を用いて血清中や病変組織において自己抗体の存否を確認し、自己免疫疾患の検出／分類をすることに成功し、本発明を完成させた。本発明者が見出したＭＩＳ１２複合体は、セントロメアに位置するＫＭＮアッセンブリ（ＫＭＮネットワーク）の構成成分としては既知のものであるが、自己免疫疾患における自己抗体に対応する自己抗原としては新たに同定されたものであり、ＳＳ等の自己免疫疾患を特徴づける新規な検出剤として本発明の一態様として提供される。
【0020】
すなわち、本発明は、以下の（１）～（８３）に関する。
（１）ＭＩＳ１２複合体を含む、自己免疫疾患の診断及び／又は分類のための検出剤。
（２）ＭＩＳ１２複合体が、ヒトのＭＩＳ１２複合体である、前記（１）に記載の検出剤。
（３）ＭＩＳ１２複合体が、ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１によって構成される複合体である、前記（１）又は（２）に記載の検出剤。
（４）タグが付加されたものである、前記（１）～（３）のいずれか一に記載の検出剤。
（５）タグがオリゴペプチド、ポリペプチド、酵素、蛍光タンパク質、放射性同位元素、金属微粒子、磁性微粒子、蛍光物質、及び発光物質からなる群から選択されるものである、前記（４）に記載の検出剤。
（６）自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、前記（１）～（５）のいずれか一に記載の検出剤。
（７）自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、前記（６）に記載の検出剤。
（１）ＭＩＳ１２複合体を含む、自己免疫疾患の診断及び／又は分類のための検出剤。
（２）ＭＩＳ１２複合体が、ヒトのＭＩＳ１２複合体である、前記（１）に記載の検出剤。
（３）ＭＩＳ１２複合体が、ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１によって構成される複合体である、前記（１）又は（２）に記載の検出剤。
（４）タグが付加されたものである、前記（１）～（３）のいずれか一に記載の検出剤。
（５）タグがオリゴペプチド、ポリペプチド、酵素、蛍光タンパク質、放射性同位元素、金属微粒子、磁性微粒子、蛍光物質、及び発光物質からなる群から選択されるものである、前記（４）に記載の検出剤。
（６）自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、前記（１）～（５）のいずれか一に記載の検出剤。
（７）自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、前記（６）に記載の検出剤。
【0021】
（８）生体由来の試料において、前記（１）～（３）のいずれか一に記載の検出剤に結合する抗体が存在することを指標とする方法であって、前記生体試料に対して前記（４）又は（５）のタグが付加された検出剤を接触させることを含む、自己免疫疾患の検出及び／又は分類方法。
（９）生体由来の試料が体液である、前記（８）に記載の方法。
（１０）体液が血清、唾液、涙及び汗からなる群から選択される体液である、前記（９）に記載の方法。
（１１）生体由来の試料が生検組織である、前記（８）に記載の方法。
（１２）生検組織が口唇腺又は涙腺由来の生検組織である、前記（１１）に記載の方法。
（１３）口唇腺が唾液腺である、前記（１２）に記載の方法。
（１４）自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、前記（８）～（１３）のいずれか一に記載の方法。
（１５）自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、前記（１４）に記載の方法。
（１６）生体由来の試料が自己免疫疾患と診断された患者、又は自己免疫疾患の疑い例と診断された患者に由来する生体試料である、前記（８）～（１５）のいずれか一に記載の方法。
（１７）生体由来の試料が、抗核抗体検査で陽性反応が認められた患者に由来する生体試料である、前記（８）～（１６）のいずれか一に記載の方法。
（１８）生体由来の試料が、抗核抗体検査でdiscrete speckled型の陽性反応が認められた患者に由来する生体試料である、前記（１７）に記載の方法。
（１９）生体由来の試料が、抗セントロメア抗体検査で陽性反応が認められた患者に由来する生体試料であって、前記抗セントロメア抗体検査は、ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、ＣＥＮＰ－Ｃ、及びＣＢＸ５（ＨＰ１α）からなる群から選択されるセントロメア構成タンパク質を用いるものである、前記（８）～（１８）のいずれか一に記載の方法。
（２０）抗セントロメア抗体検査は、ＣＥＮＰ－Ｂを用いるものである、前記（１９）に記載の方法。
（９）生体由来の試料が体液である、前記（８）に記載の方法。
（１０）体液が血清、唾液、涙及び汗からなる群から選択される体液である、前記（９）に記載の方法。
（１１）生体由来の試料が生検組織である、前記（８）に記載の方法。
（１２）生検組織が口唇腺又は涙腺由来の生検組織である、前記（１１）に記載の方法。
（１３）口唇腺が唾液腺である、前記（１２）に記載の方法。
（１４）自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、前記（８）～（１３）のいずれか一に記載の方法。
（１５）自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、前記（１４）に記載の方法。
（１６）生体由来の試料が自己免疫疾患と診断された患者、又は自己免疫疾患の疑い例と診断された患者に由来する生体試料である、前記（８）～（１５）のいずれか一に記載の方法。
（１７）生体由来の試料が、抗核抗体検査で陽性反応が認められた患者に由来する生体試料である、前記（８）～（１６）のいずれか一に記載の方法。
（１８）生体由来の試料が、抗核抗体検査でdiscrete speckled型の陽性反応が認められた患者に由来する生体試料である、前記（１７）に記載の方法。
（１９）生体由来の試料が、抗セントロメア抗体検査で陽性反応が認められた患者に由来する生体試料であって、前記抗セントロメア抗体検査は、ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、ＣＥＮＰ－Ｃ、及びＣＢＸ５（ＨＰ１α）からなる群から選択されるセントロメア構成タンパク質を用いるものである、前記（８）～（１８）のいずれか一に記載の方法。
（２０）抗セントロメア抗体検査は、ＣＥＮＰ－Ｂを用いるものである、前記（１９）に記載の方法。
【0022】
（２１）前記（１）～（７）のいずれか一に記載の検出剤を含む、組成物。
（２２）自己免疫疾患の検出及び／又は分類用試薬である、前記（２１）に記載の組成物。
（２３）自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、前記（２２）に記載の組成物。
（２４）自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、前記（２３）に記載の組成物。
（２５）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体の検出用試薬である、前記（２１）に記載の組成物。
（２６）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体を産生する細胞又は組織の検出用試薬である、前記（２５）に記載の組成物。
（２７）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体がヒト抗体である、前記（２５）又は（２６）に記載の組成物。
（２８）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体は、ＭＩＳ１２複合体に対して特異的に結合し、ＭＩＳ１２複合体を形成していない状態のＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれとも実質的に結合しないものである、前記（２５）～（２７）のいずれか一に記載の組成物。
（２２）自己免疫疾患の検出及び／又は分類用試薬である、前記（２１）に記載の組成物。
（２３）自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、前記（２２）に記載の組成物。
（２４）自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、前記（２３）に記載の組成物。
（２５）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体の検出用試薬である、前記（２１）に記載の組成物。
（２６）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体を産生する細胞又は組織の検出用試薬である、前記（２５）に記載の組成物。
（２７）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体がヒト抗体である、前記（２５）又は（２６）に記載の組成物。
（２８）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体は、ＭＩＳ１２複合体に対して特異的に結合し、ＭＩＳ１２複合体を形成していない状態のＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれとも実質的に結合しないものである、前記（２５）～（２７）のいずれか一に記載の組成物。
【0023】
（２９）前記（２１）に記載の組成物を含む、キット。
（３０）自己免疫疾患の検出及び／又は分類のための、前記（２９）に記載のキット。
（３１）自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、前記（３０）に記載のキット。
（３２）自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、前記（３１）に記載のキット。
（３３）対照用のＭＩＳ１２複合体に対する抗体を含む、前記（２９）～（３２）のいずれか一に記載のキット。
（３４）対照用のＭＩＳ１２複合体に対する抗体は、ＭＩＳ１２複合体に対して特異的に結合し、ＭＩＳ１２複合体を形成していない状態のＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれとも実質的に結合しないものである、前記（３３）に記載のキット。
（３５）ＥＬＩＳＡ法に用いられる前記（２９）～（３４）のいずれか一に記載のキット。
（３０）自己免疫疾患の検出及び／又は分類のための、前記（２９）に記載のキット。
（３１）自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、前記（３０）に記載のキット。
（３２）自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、前記（３１）に記載のキット。
（３３）対照用のＭＩＳ１２複合体に対する抗体を含む、前記（２９）～（３２）のいずれか一に記載のキット。
（３４）対照用のＭＩＳ１２複合体に対する抗体は、ＭＩＳ１２複合体に対して特異的に結合し、ＭＩＳ１２複合体を形成していない状態のＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれとも実質的に結合しないものである、前記（３３）に記載のキット。
（３５）ＥＬＩＳＡ法に用いられる前記（２９）～（３４）のいずれか一に記載のキット。
【0024】
（３６）前記（２５）～（２８）のいずれか一に記載の組成物を含む、キット。
（３７）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体の検出用の、前記（３６）に記載のキット。
（３８）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体を産生する細胞又は組織の検出用、前記（３６）に記載のキット。
（３９）対照用のＭＩＳ１２複合体に対する抗体を含む、前記（３６）～（３８）のいずれか一に記載のキット。
（４０）対照用のＭＩＳ１２複合体に対する抗体は、ＭＩＳ１２複合体に対して特異的に結合し、ＭＩＳ１２複合体を形成していない状態のＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれとも実質的に結合しないものである、前記（３９）に記載のキット。
（３７）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体の検出用の、前記（３６）に記載のキット。
（３８）ＭＩＳ１２複合体に対する抗体を産生する細胞又は組織の検出用、前記（３６）に記載のキット。
（３９）対照用のＭＩＳ１２複合体に対する抗体を含む、前記（３６）～（３８）のいずれか一に記載のキット。
（４０）対照用のＭＩＳ１２複合体に対する抗体は、ＭＩＳ１２複合体に対して特異的に結合し、ＭＩＳ１２複合体を形成していない状態のＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれとも実質的に結合しないものである、前記（３９）に記載のキット。
【0025】
（４１）リコンビナントＭＩＳ１２複合体を製造するためのｃＤＮＡを含む組成物であって、ＤＳＮ１をコードするｃＤＮＡ、ＭＩＳ１２をコードするｃＤＮＡ、ＮＳＬ１をコードするｃＤＮＡ及びＰＭＦ１をコードするｃＤＮＡを含む、組成物。
（４２）ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のうち少なくとも１つはタグにより修飾されたものである、前記（４１）に記載の組成物。
（４３）タグが、オリゴペプチドタグ、ポリペプチドタグ、酵素タンパク質タグ、及び蛍光タンパク質タグからなる群から選択されるタグを含むものである、前記（４２）に記載の組成物。
（４４）ｃＤＮＡは発現用ベクターにクローニングされたものである、前記（４１）～（４３）のいずれか一に記載の組成物。
（４２）ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のうち少なくとも１つはタグにより修飾されたものである、前記（４１）に記載の組成物。
（４３）タグが、オリゴペプチドタグ、ポリペプチドタグ、酵素タンパク質タグ、及び蛍光タンパク質タグからなる群から選択されるタグを含むものである、前記（４２）に記載の組成物。
（４４）ｃＤＮＡは発現用ベクターにクローニングされたものである、前記（４１）～（４３）のいずれか一に記載の組成物。
【0026】
（４５）リコンビナントＭＩＳ１２複合体を製造する方法であって、宿主細胞に前記（４４）の組成物をトランスフェクトする工程を含む、方法。
【0027】
（４６）リコンビナントＭＩＳ１２複合体であって、当該複合体を形成するＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１はいずれもリコンビナントタンパク質であり、かつ、ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のうち少なくとも１つはタグにより修飾されたものである、リコンビナントＭＩＳ１２複合体。
（４７）タグがストレプトアビジン結合ペプチド、及び／又は蛍光タンパク質を含むタグである、前記（４６）に記載のリコンビナントＭＩＳ１２複合体。
（４８）ストレプトアビジン結合ペプチドが、ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ（配列番号１）、又はＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号２）からなるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドである、前記（４７）に記載のリコンビナントＭＩＳ１２複合体。
（４９）蛍光タンパク質がＧＦＰである、前記（４７）又は（４８）に記載のリコンビナントＭＩＳ１２複合体。
（４７）タグがストレプトアビジン結合ペプチド、及び／又は蛍光タンパク質を含むタグである、前記（４６）に記載のリコンビナントＭＩＳ１２複合体。
（４８）ストレプトアビジン結合ペプチドが、ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ（配列番号１）、又はＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号２）からなるアミノ酸配列を含むオリゴペプチドである、前記（４７）に記載のリコンビナントＭＩＳ１２複合体。
（４９）蛍光タンパク質がＧＦＰである、前記（４７）又は（４８）に記載のリコンビナントＭＩＳ１２複合体。
【0028】
（５０）ＭＩＳ１２複合体の使用であって、自己免疫疾患の検出及び／又は分類用試薬の製造のための、使用。
（５１）自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、前記（５０）に記載の使用。
（５２）自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、前記（５０）又は（５１）に記載の使用。
（５１）自己免疫疾患がシェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎からなる群から選択される自己免疫疾患である、前記（５０）に記載の使用。
（５２）自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、前記（５０）又は（５１）に記載の使用。
【0029】
（５３）ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体、又はその機能性断片。
（５４）モノクローナル抗体である、前記（５３）に記載の抗体、又はその機能性断片。
（５５）完全ヒト抗体である、前記（５３）又は（５４）に記載の抗体、又はその機能性断片。
（５６）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域が非ヒト動物由来の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のアミノ酸配列を有する、前記（５３）又は（５４）に記載の抗体、又はその機能性断片。
（５７）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がヒト由来の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有するキメラ抗体である、前記（５６）に記載の抗体、又はその機能性断片。
（５８）非ヒト動物が、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリ、及びラクダからなる群から選択される動物である、前記（５６）又は（５７）に記載の抗体、又はその機能性断片。
（５４）モノクローナル抗体である、前記（５３）に記載の抗体、又はその機能性断片。
（５５）完全ヒト抗体である、前記（５３）又は（５４）に記載の抗体、又はその機能性断片。
（５６）重鎖定常領域及び軽鎖定常領域が非ヒト動物由来の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域のアミノ酸配列を有する、前記（５３）又は（５４）に記載の抗体、又はその機能性断片。
（５７）重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がヒト由来の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有するキメラ抗体である、前記（５６）に記載の抗体、又はその機能性断片。
（５８）非ヒト動物が、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリ、及びラクダからなる群から選択される動物である、前記（５６）又は（５７）に記載の抗体、又はその機能性断片。
【0030】
（５９）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなり、
軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６０）重鎖可変領域が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むものであり、
軽鎖可変領域が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６１）ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖からなるものである、前記（５３）～（５５）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６２）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなり、
軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６３）重鎖可変領域が配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むものであり、
軽鎖可変領域が配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６４）ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体が、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖からなるものである、前記（５３）～（５５）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６５）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなり、
軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなるものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６６）重鎖可変領域が配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むものであり、
軽鎖可変領域が配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６７）ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体が、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖からなるものである、前記（５３）～（５５）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６０）重鎖可変領域が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むものであり、
軽鎖可変領域が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６１）ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖からなるものである、前記（５３）～（５５）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６２）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなり、
軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６３）重鎖可変領域が配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むものであり、
軽鎖可変領域が配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６４）ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体が、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖からなるものである、前記（５３）～（５５）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６５）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなり、
軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３がそれぞれ配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列からなるものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６６）重鎖可変領域が配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むものであり、
軽鎖可変領域が配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むものである、前記（５３）～（５８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６７）ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体が、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖からなるものである、前記（５３）～（５５）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
【0031】
（６８）レポーター物質により標識化されたものである、前記（５３）～（６７）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（６９）レポーター物質が放射性同位元素、金属微粒子、酵素、蛍光物質、及び発光物質からなる群から選択されるものである、前記（６８）に記載の抗体、又はその機能性断片。
（７０）固体支持体に固定化されたものである、前記（５３）～（６９）のいずれか一に記載の抗体又はその機能性断片。
（７１）固体支持体がマイクロプレート、ガラス製プレート、プラスチック製プレート、シリンジ、バイアル、カラム、磁性粒子、樹脂製マイクロビーズ、多孔性膜、多孔性担体、及びマイクロチップからなる群から選択されるものである、前記（７０）に記載の抗体又はその機能性断片。
（６９）レポーター物質が放射性同位元素、金属微粒子、酵素、蛍光物質、及び発光物質からなる群から選択されるものである、前記（６８）に記載の抗体、又はその機能性断片。
（７０）固体支持体に固定化されたものである、前記（５３）～（６９）のいずれか一に記載の抗体又はその機能性断片。
（７１）固体支持体がマイクロプレート、ガラス製プレート、プラスチック製プレート、シリンジ、バイアル、カラム、磁性粒子、樹脂製マイクロビーズ、多孔性膜、多孔性担体、及びマイクロチップからなる群から選択されるものである、前記（７０）に記載の抗体又はその機能性断片。
【0032】
（７２）ＭＩＳ１２複合体は、ヒト由来のＭＩＳ１２複合体である、前記（５３）～（７１）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（７３）抗体が、ＩｇＧ又はＩｇＭの免疫グロブリン分子である、前記（５３）～（７２）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（７４）抗体が、ＩｇＧの免疫グロブリン分子である、前記（５３）～（７３）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（７３）抗体が、ＩｇＧ又はＩｇＭの免疫グロブリン分子である、前記（５３）～（７２）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
（７４）抗体が、ＩｇＧの免疫グロブリン分子である、前記（５３）～（７３）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
【0033】
（７５）前記（５３）～（７４）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片を含む、組成物。
（７６）ＭＩＳ１２複合体検出用試薬である、前記（７５）に記載の組成物。
（７７）前記（７５）又は（７６）に記載の組成物を含む、キット。
（７６）ＭＩＳ１２複合体検出用試薬である、前記（７５）に記載の組成物。
（７７）前記（７５）又は（７６）に記載の組成物を含む、キット。
【0034】
（７８）試料に対して、前記（５３）～（７４）のいずれか一に記載の抗体、若しくはその機能的断片、又は前記（７５）若しくは（７６）に記載の組成物を接触させる工程を含む、ＭＩＳ１２複合体の検出方法。
（７９）前記（７７）に記載のキットを使用して行われる、前記（７８）に記載の方法。
（８０）試料が細胞、生体組織、臓器、又は体液を含むものである、前記（７８）又は（７９）に記載の方法。
（８１）体液が血清又は血液である、前記（８０）に記載の方法。
（８２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるものである、前記（７８）～（８１）のいずれか一に記載の方法。
（７９）前記（７７）に記載のキットを使用して行われる、前記（７８）に記載の方法。
（８０）試料が細胞、生体組織、臓器、又は体液を含むものである、前記（７８）又は（７９）に記載の方法。
（８１）体液が血清又は血液である、前記（８０）に記載の方法。
（８２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われるものである、前記（７８）～（８１）のいずれか一に記載の方法。
【0035】
（８３）ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体は、ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１からなるヘテロ４量体を形成していない単体としてのＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれとも実質的な結合活性を有しないものである、前記（５３）～（６８）のいずれか一に記載の抗体、又はその機能性断片。
【発明の効果】
【0036】
本発明は、自己免疫疾患の診断や検査といった場面において、自己免疫疾患の新たな検出剤を提供するものである。より具体的には、シェーグレン症候群、全身性強皮症及び原発性胆汁性胆管炎といった自己免疫疾患の検出剤として、新たにＭＩＳ１２複合体を提供するものである。また、本発明において、当該検出剤を利用した自己免疫疾患の診断／分類用の検査キットや診断／分類のための方法が提供される。
抗核抗体検査でdiscrete speckled型に分類される場合、ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、ＣＥＮＰ－Ｃ、ＣＢＸ５（ＨＰ１α）などのセントロメア構成タンパク質に対する自己抗体が存在することが知られていたものの、discrete speckled型と判断された患者は、通常、次にＣＥＮＰ－Ｂに対する自己抗体の有無のみが従来検査されてきた。それゆえ、抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体陰性の場合には、対応抗原不明と分類され、抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体陰性の患者の病態は十分に明らかにされないままとなっているのが現状である。
本発明によれば、内因性抗原（自己抗原）として新たに見いだされたＭＩＳ１２複合体に注目し、自己抗体である抗ＭＩＳ１２複合体抗体の存否をＭＩＳ１２複合体を利用して検出することにより、ＳＳ等の自己免疫疾患の病態を新たな観点から特徴付けすることができる。
また、本発明によれば、ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体が提供される。当該抗体はＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１からなるヘテロ４量体を形成していない単体としてのＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれとも実質的な結合活性を有しないものである。当該抗体は、モノクローナル抗体であって、完全ヒト抗体であり得る。現在、ＭＩＳ１２複合体を認識する抗体として一般に入手、利用可能な抗体は、ポリクローナル抗体であり、当該抗体はＭＩＳ１２複合体のみならず、当該複合体の構成要素たるＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及び／又はＰＭＦ１とも結合活性を有する。本発明によって、初めて、ＭＩＳ１２複合体と、当該複合体の構成要素であるＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１とを免疫化学的に容易に区別することが可能となった。
抗核抗体検査でdiscrete speckled型に分類される場合、ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、ＣＥＮＰ－Ｃ、ＣＢＸ５（ＨＰ１α）などのセントロメア構成タンパク質に対する自己抗体が存在することが知られていたものの、discrete speckled型と判断された患者は、通常、次にＣＥＮＰ－Ｂに対する自己抗体の有無のみが従来検査されてきた。それゆえ、抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体陰性の場合には、対応抗原不明と分類され、抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体陰性の患者の病態は十分に明らかにされないままとなっているのが現状である。
本発明によれば、内因性抗原（自己抗原）として新たに見いだされたＭＩＳ１２複合体に注目し、自己抗体である抗ＭＩＳ１２複合体抗体の存否をＭＩＳ１２複合体を利用して検出することにより、ＳＳ等の自己免疫疾患の病態を新たな観点から特徴付けすることができる。
また、本発明によれば、ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体が提供される。当該抗体はＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１からなるヘテロ４量体を形成していない単体としてのＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれとも実質的な結合活性を有しないものである。当該抗体は、モノクローナル抗体であって、完全ヒト抗体であり得る。現在、ＭＩＳ１２複合体を認識する抗体として一般に入手、利用可能な抗体は、ポリクローナル抗体であり、当該抗体はＭＩＳ１２複合体のみならず、当該複合体の構成要素たるＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及び／又はＰＭＦ１とも結合活性を有する。本発明によって、初めて、ＭＩＳ１２複合体と、当該複合体の構成要素であるＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１とを免疫化学的に容易に区別することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【0038】
【図2】図２は、Ｋ５６２細胞溶解液とＬＢ３２－８抗体等、ＬＢ３２由来の抗体とを用いて免疫沈降（ＩＰ）を行い、沈殿物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ法で電気泳動した後、ウエスタンブロット解析を行った結果を表す。パネル最上段から順に、抗ＤＳＮ１抗体、抗ＭＩＳ１２抗体、抗ＭＩＳ１２複合体（ＭＩＳ１２Ｃ）ポリクローナル抗体、及び抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す。抗ＭＩＳ１２Ｃポリクローナル抗体を用いたパネル（下から２段目）では、ＭＩＳ１２Ｃの構成要素であるＤＳＮ１、ＮＳＬ１、ＰＭＦ１及びＭＩＳ１２に対応するバンドが示される。抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたパネル（最下段）では、ＩｇＧ抗体の重鎖（Ｈ ｃｈａｉｎ）及び軽鎖（Ｌ ｃｈａｉｎ）に対応するバンドが示される。各パネルにおいて、左端のレーンは分子量マーカー（ｌａｄｄｅｒ）、左から２番目のレーンは免疫沈降前の細胞溶解液（ｉｎｐｕｔ）を電気泳動した結果を示す。また、右端のレーンは陰性対照としてＩｇＧ１タンパク質を電気泳動した結果を示す。
【0039】
【0040】
【図4A】図４Ａは、図３と同様、ＬＢ３２由来の抗体（ＬＢ３２－８抗体、ＬＢ３２－１４抗体及びＬＢ３２－３２抗体）の反応性を抗原結合ビーズアッセイによって解析した結果を示す。抗原であるＧＦＰ、ＭＩＳ１２、ＰＭＦ１、ＤＳＮ１、ＮＳＬ１、及びＭＩＳ１２Ｃは、いずれも、ストレプトアビジンビーズと結合させた状態で使用された。抗体と各抗原結合ビーズ（図中、上から順に、ＧＦＰ、ＭＩＳ１２及びＰＭＦ１の組合せ、ＤＳＮ１及びＮＳＬ１の組合せ、及びＭＩＳ１２Ｃを示す。）との反応性は、フローサイトメトリーにより測定された。左パネルは、ＬＢ３２－８抗体がＭＩＳ１２Ｃとの間でのみ結合能を有することを示す。中パネルは、ＬＢ３２－１４抗体が、ＭＩＳ１２Ｃ、及び、ＤＳＮ１及びＮＳＬ１との間で結合能を有することを示す。右パネルは、ＬＢ３２－３２抗体が、ＭＩＳ１２Ｃ、及び、ＭＩＳ１２及びＰＭＦ１との間で結合能を有することを示す。
【0041】
【図4B】図４Ｂは、図４Ａと同様、ＬＢ３２由来の抗体（ＬＢ３２－８抗体、ＬＢ３２－１０抗体及びＬＢ３２－１９抗体）の反応性を抗原結合ビーズアッセイによって解析した結果を示す。抗原であるＧＦＰ、ＭＩＳ１２、ＰＭＦ１、ＤＳＮ１、ＮＳＬ１、及びＭＩＳ１２Ｃは、いずれも、ストレプトアビジンビーズと結合させた状態で使用された。抗体と各抗原結合ビーズ（図中、上から順に、ＤＳＮ１及びＮＳＬ１の組合せ、ＰＭＦ１及びＭＩＳ１２の組合せ、ＭＩＳ１２Ｃ、及びＧＦＰを示す。）との反応性は、フローサイトメトリーにより測定された。中パネルのＬＢ３２－１０抗体、及び、右パネルのＬＢ３２－１９抗体は、左パネルのＬＢ３２－８抗体と同様、ＭＩＳ１２Ｃとの間でのみ結合能を有することを示す。
【0042】
【図5】図５は、抗ＭＩＳ１２複合体抗体に関する血清プロファイルを示す。ＭＩＳ１２Ｃを抗原とする抗原結合ビーズと患者由来の血清ＩｇＧとの反応性が図示される。血清サンプルは、対照である健常者（ＨＣ；ｎ＝６８）、シェーグレン症候群が疑われる患者（ＳＳ；ｎ＝１１２）、全身性強皮症患者（ＳＳｃ；ｎ＝３５）、原発性胆汁性胆管炎患者（ＰＢＣ；ｎ＝１０）、および重複疾患の患者（ＯＬ；ｎ＝４５）から採取されたものであり、血清サンプルとＭＩＳ１２Ｃとの反応性が抗原結合ビーズアッセイによって解析された。ＭＩＳ１２Ｃビーズと血清ＩｇＧとの結合性をフローサイトメトリーで測定した結果が図示される。各プロットは各患者由来の血清サンプルを用いた結果に対応する。破線はＲＯＣ解析で決定したカットオフ値を表し、破線より上にあるプロットは結合陽性と判断される。パネル下の０、１９、５４、４０及び８２は、ＨＣ、ＳＳ、ＳＳｃ、ＰＢＣ及びＯＬ患者中、それぞれ０％、１９％、５４％、４０％、及び８２％が結合陽性であったことを示す。
【0043】
【発明を実施するための形態】
【0044】
本明細書においては、別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び専門用語は、当業者が一般に理解する意味を有する。さらに、状況に応じて定義することが要求されない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むことが意図されている。「又は」という用語は、代替物のみを言及することが明確に示されない限り又は代替物が相互排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用される。公知の方法及び技術は、他の例示がない限り、当技術分野で周知の通常の方法によって又は一般の参考文献において記載される方法によって実施される。
【0045】
（１）ＭＩＳ１２複合体の調製
本発明の一態様は、ＭＩＳ１２複合体である、自己免疫疾患の診断及び／又は分類のための検出剤に関する。ＭＩＳ１２複合体は、セントロメアに位置するＫＭＮアッセンブリの構成要素であって、ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１によって構成される複合体（ヘテロ４量体）である。ＭＩＳ１２複合体は、Ｍｔｗ１複合体又はＭＩＮＤ複合体とも呼ばれるものであり、動物、植物、菌類など任意の生物種に由来するものであって良いが、動物種に由来するものが好ましく、哺乳動物種に由来するものがより好ましく、ヒトに由来するものが特に好ましい。ＭＩＳ１２複合体の調製は、天然物を精製することでも、リコンビナントタンパク質を精製することでも可能である。ＭＩＳ１２複合体の各構成要素の調製も、上記ＭＩＳ１２複合体の調製と同様に行うことが可能である。
なお、ＫＭＮアッセンブリは、ＭＩＳ１２複合体の他に、ＫＮＬ１複合体及びＮＤＣ８０複合体を含む。ＫＮＬ１複合体はＫＮＬ１及びＺＷＩＮＴから構成され、ＮＤＣ８０複合体はＮＤＣ８０、ＮＵＦ２、ＳＰＣ２４及びＳＰＣ２５から構成される。ＫＮＬ１複合体及びＮＤＣ８０複合体、並びにこれらの複合体の各構成要素の調製についても、上記と同様である。
本発明の一態様は、ＭＩＳ１２複合体である、自己免疫疾患の診断及び／又は分類のための検出剤に関する。ＭＩＳ１２複合体は、セントロメアに位置するＫＭＮアッセンブリの構成要素であって、ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１によって構成される複合体（ヘテロ４量体）である。ＭＩＳ１２複合体は、Ｍｔｗ１複合体又はＭＩＮＤ複合体とも呼ばれるものであり、動物、植物、菌類など任意の生物種に由来するものであって良いが、動物種に由来するものが好ましく、哺乳動物種に由来するものがより好ましく、ヒトに由来するものが特に好ましい。ＭＩＳ１２複合体の調製は、天然物を精製することでも、リコンビナントタンパク質を精製することでも可能である。ＭＩＳ１２複合体の各構成要素の調製も、上記ＭＩＳ１２複合体の調製と同様に行うことが可能である。
なお、ＫＭＮアッセンブリは、ＭＩＳ１２複合体の他に、ＫＮＬ１複合体及びＮＤＣ８０複合体を含む。ＫＮＬ１複合体はＫＮＬ１及びＺＷＩＮＴから構成され、ＮＤＣ８０複合体はＮＤＣ８０、ＮＵＦ２、ＳＰＣ２４及びＳＰＣ２５から構成される。ＫＮＬ１複合体及びＮＤＣ８０複合体、並びにこれらの複合体の各構成要素の調製についても、上記と同様である。
【0046】
ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１の配列情報（塩基配列情報、及びアミノ酸配列情報）は、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースから適宜入手できる。例えば、ＤＳＮ１の配列情報は、ＮＭ＿００１１４５３１６．１（ｍＲＮＡ）及びＮＰ＿００１１３８７８８．１（タンパク質）、ＭＩＳ１２の配列情報は、ＮＭ＿００１２５８２１７．１（ｍＲＮＡ）及びＮＰ＿００１２４５１４６．１（タンパク質）、ＮＳＬ１の配列情報はＮＭ＿０１５４７１．３（ｍＲＮＡ）及びＮＰ＿０５６２８６．３（タンパク質）、ＰＭＦ１の配列情報はＮＭ＿００７２２１．３（ｍＲＮＡ）及びＮＰ＿００９１５２．２（タンパク質）というアクセッション番号で登録されている。前記のアクセッション番号に対応して、ＤＳＮ１のコード領域の塩基配列を配列番号５４、ＭＩＳ１２のコード領域の塩基配列を配列番号５５、ＮＳＬ１のコード領域の塩基配列を配列番号５６、ＰＭＦ１のコード領域の塩基配列を配列番号５７に、それぞれ示す。また、前記のアクセッション番号に対応して、ＤＳＮ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５８、ＭＩＳ１２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５９、ＮＳＬ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６０、ＰＭＦ１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号６１に、それぞれ示す。
一例として、Ｎ末端側から順に、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ；配列番号１）－第１のリンカーペプチド（配列番号６２）－ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ認識部位（配列番号６３）－ＧＦＰ－第２のリンカーペプチド（配列番号６４）が配置された、ＳＢＰタグ－ＧＦＰ－リンカーをコードする塩基配列（配列番号６５）を利用した組換え体タンパク質の発現を行うことができる。
配列番号６５に示される塩基配列の下流にＤＳＮ１のコード領域の塩基配列（配列番号５４）、ＭＩＳ１２のコード領域の塩基配列（配列番号５５）、ＮＳＬ１のコード領域の塩基配列（配列番号５６）、又はＰＭＦ１のコード領域の塩基配列（配列番号５７）をインフレームで配置した融合遺伝子を作成し、当該融合遺伝子から組換え体を発現させることにより、ＧＦＰ由来の蛍光を発光可能であり、かつ、ストレプトアビジンによるアフィニティ精製が可能なＤＳＮ１タンパク質（配列番号５８）、ＭＩＳ１２タンパク質（配列番号５９）、ＮＳＬ１タンパク質（配列番号６０）、又はＰＭＦ１タンパク質（配列番号６１）を調製することができる。後記実施例に示される、ＭＩＳ１２複合体の構成要素となる組換え体タンパク質は、実際にＳＢＰタグ－ＧＦＰ－リンカーとの融合タンパク質として調製されたものを含んでいる。
一例として、Ｎ末端側から順に、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ；配列番号１）－第１のリンカーペプチド（配列番号６２）－ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ認識部位（配列番号６３）－ＧＦＰ－第２のリンカーペプチド（配列番号６４）が配置された、ＳＢＰタグ－ＧＦＰ－リンカーをコードする塩基配列（配列番号６５）を利用した組換え体タンパク質の発現を行うことができる。
配列番号６５に示される塩基配列の下流にＤＳＮ１のコード領域の塩基配列（配列番号５４）、ＭＩＳ１２のコード領域の塩基配列（配列番号５５）、ＮＳＬ１のコード領域の塩基配列（配列番号５６）、又はＰＭＦ１のコード領域の塩基配列（配列番号５７）をインフレームで配置した融合遺伝子を作成し、当該融合遺伝子から組換え体を発現させることにより、ＧＦＰ由来の蛍光を発光可能であり、かつ、ストレプトアビジンによるアフィニティ精製が可能なＤＳＮ１タンパク質（配列番号５８）、ＭＩＳ１２タンパク質（配列番号５９）、ＮＳＬ１タンパク質（配列番号６０）、又はＰＭＦ１タンパク質（配列番号６１）を調製することができる。後記実施例に示される、ＭＩＳ１２複合体の構成要素となる組換え体タンパク質は、実際にＳＢＰタグ－ＧＦＰ－リンカーとの融合タンパク質として調製されたものを含んでいる。
【0047】
ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１の構造は、上記のアクセッション番号で特定される配列のものに限定されることはない。ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれについても、データベースには複数のアイソフォームが登録されており、それらのアイソフォームはいずれも本発明において好適に利用できる。また、配列上のバリアントについても、データベースへの登録の如何によらず、利用することができる。別の表現をすれば、ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１をコードする遺伝子は、いずれも、データベースへの登録されたコード配列に対して１又は数個の塩基が欠失、置換、付加又は挿入されたものであっても、ＫＭＮアッセンブリの構成要素として機能的なＭＩＳ１２複合体を構成するポリペプチドをコードする限り、任意の配列上の改変体であって良い。また、ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１は、データベースに登録されたアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたものであっても、ＫＭＮアッセンブリの構成要素として機能的なＭＩＳ１２複合体を構成するポリペプチドである限り、任意の配列上の改変体であって良い。
【0048】
リコンビナントタンパク質の合成及び精製は、当業者に公知の手法により行うことができる。ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のリコンビナントタンパク質はそれぞれ別異に調製し、それらを混合してＭＩＳ１２複合体を形成させてもよいが、一の宿主細胞においてＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のリコンビナントタンパク質を同時に発現させ、当該宿主細胞内でＭＩＳ１２複合体を形成させることの方が簡便、かつ効率的にＭＩＳ１２複合体を調製でき、望ましい。同時に発現させる場合は、４種類の遺伝子をそれぞれ別異の発現ベクターにクローニングしてコトランスフェクションしても良いが、ポリシストロニックなベクターを利用して一のベクターに２以上、好ましくは４種類すべての遺伝子を搭載させ、宿主細胞にトランスフェクションすることが望ましい。ベクターには、プロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を適宜配置することができる。ベクターとしては、細菌、酵母又は動物細胞等の宿主細胞中で複製可能なものを用いればどのようなものでも良く、宿主に応じて市販のベクターが適宜利用できる。発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換することができる。例えば、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法等がある。宿主細胞は特に限定されないが、真核細胞を用いることが好ましい。酵母、又は動物由来の培養細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＥＦ等）が挙げられる。
【0049】
ＭＩＳ１２複合体の精製は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を用いて行うことができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜組み合わせて行うことができる。アフィニティ精製を適用することが好ましく、アフィニティ精製には、ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれかに対する抗体又はそれらの組合せが利用できる。また、後述の実施例において言及するＭＩＳ１２複合体と特異的に抗体を利用することもできる。あるいは、リコンビナントタンパク質の調製において、ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１の一つ又は複数について、タグが付加された融合タンパク質として発現させ、当該ダグを利用した精製法を適用しても良い。例えば、ストレプトアビジン結合ペプチド（以下、「ＳＢＰタグ」と言うことがある。）との融合タンパク質として発現させた場合、ＭＩＳ１２複合体又はその各構成要素は、ストレプトアビジンを担持した固相（ストレプトアビジン結合ビーズ等）を用いることにより、容易にアフィニティ精製することができる。
【0050】
タグとしては、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、６ｘＨｉｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩなどのペプチドタグ（オリゴペプチドタグ）、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、チオレドキシンタグなどのポリペプチドタグが例示できるが、アフィニティ精製に使用できるタグである限り、任意のタグが利用できる。また、タグの利用において、アフィニティ精製用でない別異のタグ（例えば、酵素による切断用のプロテアーゼ認識配列）の一又は複数を更に組み合わせてリコンビナントタンパク質を構築しても良い。更に、タグの片端又は両端には、リンカー部位を任意に付加又は挿入しても良い。プロテアーゼ認識配列の例として、ＬＥＶＬＦＱＧＰ（ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ認識部位；配列番号６３）を挙げることができる。また、リンカーの例として、配列番号６２及び６４のオリゴペプチドを挙げることができる。
【0051】
ＭＩＳ１２複合体の精製用に付加するタグの好ましい一例として、ＳＢＰタグ、及びＳｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩが挙げられる。当該タグ（具体的なアミノ酸配列としては、ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ（ＳＢＰタグ；配列番号１）、及び、ＷＳＨＰＱＦＥＫ（Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ；配列番号：２））を付加することにより、ストレプトアビジンとの特異的な結合性を利用してＭＩＳ１２複合体を効率よく精製することができる。磁性微粒子等の固相に担持させたストレプトアビジンを利用し、懸濁液中でストレプトアビジンとＳＢＰタグ（又は、Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩタグ）－リコンビナントＭＩＳ１２複合体とを接触させ、次いで磁力を用いて分離を行うことにより、液層中のＭＩＳ１２複合体を効率よく精製することができる。リコンビナントタンパク質としてＭＩＳ１２複合体を調製するために、公知の文献、例えば、Petrovic A et al., J. Cell Biol. (2010) vol. 190, pp. 835-852を参考とすることもできる。細胞中に存在する天然のＭＩＳ１２複合体は、生体由来の細胞を含む試料から核画分を分離し、限外濾過やアフィニティ精製などを適宜組み合わせることで調製できる。調製に至る各工程は、当業者に公知の手法が適用できる。
【0052】
タグを利用して精製する場合、ＭＩＳ１２複合体の精製後にタグを切断しても良いが、タグ付きのＭＩＳ１２複合体が標的となる抗ＭＩＳ１２複合体抗体との特異的な結合に実質的な支障のない限り、タグをあえて切断する必要はない。通常、Ｎ末端又はＣ末端に付加されたペプチドタグであれば、いずれの種類のペプチドタグを使用した場合であっても、抗体との結合に実質的な支障は生じない。
【0053】
自己免疫疾患に伴って出現する抗ＭＩＳ１２複合体抗体の検出や定量などにＭＩＳ１２複合体を用いる場合、ＭＩＳ１２複合体に付加するタグは、前記の精製用のタグに代えて、あるいは前記の精製用タグに加えて、別異のタグを利用することもできる。例えば、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、金属微粒子、酵素、磁性微粒子などは、ＭＩＳ１２複合体に付加するタグとして利用することができる。
【0054】
放射性同位元素としては、３Ｈ、１２５Ｉなどが挙げられる。蛍光物質としては、ＧＦＰ、ＲＦＰのような蛍光タンパク質、フルオレセイン及びその誘導体（例えば、ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びその誘導体（例えば、ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、フィコエリスリン（ＰＥ）、量子ドットなどが挙げられる。発光物質としては、ルミノール誘導体、アクリジニウム誘導体、エクオリン、ルテニウム錯体等が挙げられる。金属微粒子としては、金ナノ粒子や金と白金との合金からなるナノ粒子が挙げられる。金属微粒子の平均粒子径は、５ｎｍ～２００ｎｍの範囲から適宜決定できる。酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β－ガラクトシダーゼ（β－ＧＡＬ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ルシフェラーゼ、エクオリンなどが挙げられる。それぞれの酵素について、適切な基質と組み合わせて使用することにより、発光法、比色法、又は蛍光法による解析が可能となる。磁性微粒子としては、磁気を帯びた粒子であって、液相中に分散又は懸濁することができ、分散液又は懸濁液から磁場の適用により分離することができる粒子であれば任意の粒子を使用することができる。例えば、鉄、コバルト、マンガン、クロム若しくはニッケルのような金属、該金属の合金、又は該金属の塩、酸化物、ホウ化物若しくは硫化物、高い磁化率を有する稀土類元素（例えば、ヘマタイト又はフェライト）等の磁性体を含む微粒子を挙げることができる。好ましい一例は、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）の微粒子である。磁性微粒子の平均粒子径は、１０ｎｍ～１０μｍの範囲から適宜決定できる。このようなタグを利用することにより、免疫組織化学的な解析等により抗ＭＩＳ１２複合体抗体の局在性を明らかにすることや抗ＭＩＳ１２複合体抗体の定量的な解析を容易に行うことができる。精製用とは別異のタグは、前記のように様々な物質が利用できるが、好ましい一例としてＧＦＰのような蛍光タンパク質を挙げることができる。
【0055】
（２）検出剤として使用されるＭＩＳ１２複合体
ＭＩＳ１２複合体は、ＮＤＣ８０複合体及びＫＮＬ１複合体と共にＫＭＮアッセンブリを構成し、ＫＭＮアッセンブリを含むキネトコアの構成要素として細胞分裂時の染色体分配に関与することが知られている。ＭＩＳ１２複合体の細胞核局在性は知られているが、自己免疫疾患の患者に認められる抗核抗体の抗原（内因性抗原／自己抗原）としての報告はなく、ＭＩＳ１２複合体の自己免疫疾患の検出剤としての用途は、本発明により新たに提供されるものである。後述の実施例で開示されるとおり、ＭＩＳ１２複合体は、少なくともシェーグレン症候群（ＳＳ）、全身性強皮症（ＳＳｃ）及び原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）の検出剤として使用できる。ＳＳｃとしては、特に、限局皮膚型全身性皮膚強皮症（ｌｃＳＳｃ）の検出剤として有用である。ＳＳ、ｌｃＳＳＣ及びＰＢＣはいずれも自己免疫疾患であるが、これらの疾患についての特別な共通性はこれまで見出されていなかった。本発明を通じて抗ＭＩＳ１２複合体抗体陽性を示す自己免疫疾患という新たな疾患概念が提唱され、当該新たな疾患概念を特徴づける抗ＭＩＳ１２複合体抗体に対応する検出剤として本発明のＭＩＳ１２複合体が提供される。
ＭＩＳ１２複合体は、ＮＤＣ８０複合体及びＫＮＬ１複合体と共にＫＭＮアッセンブリを構成し、ＫＭＮアッセンブリを含むキネトコアの構成要素として細胞分裂時の染色体分配に関与することが知られている。ＭＩＳ１２複合体の細胞核局在性は知られているが、自己免疫疾患の患者に認められる抗核抗体の抗原（内因性抗原／自己抗原）としての報告はなく、ＭＩＳ１２複合体の自己免疫疾患の検出剤としての用途は、本発明により新たに提供されるものである。後述の実施例で開示されるとおり、ＭＩＳ１２複合体は、少なくともシェーグレン症候群（ＳＳ）、全身性強皮症（ＳＳｃ）及び原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）の検出剤として使用できる。ＳＳｃとしては、特に、限局皮膚型全身性皮膚強皮症（ｌｃＳＳｃ）の検出剤として有用である。ＳＳ、ｌｃＳＳＣ及びＰＢＣはいずれも自己免疫疾患であるが、これらの疾患についての特別な共通性はこれまで見出されていなかった。本発明を通じて抗ＭＩＳ１２複合体抗体陽性を示す自己免疫疾患という新たな疾患概念が提唱され、当該新たな疾患概念を特徴づける抗ＭＩＳ１２複合体抗体に対応する検出剤として本発明のＭＩＳ１２複合体が提供される。
【0056】
（３）自己免疫疾患の検出及び／又は分類方法
本発明の一態様は、生体由来の試料において、前記の検出剤に結合する抗体が存在することを、前記生体試料に対して標識化された前記検出剤を接触させることを含む、自己免疫疾患の検出及び／又は分類方法である。より具体的に言えば、抗ＭＩＳ１２複合体抗体が生体由来の試料に存在するか否かを、当該試料と標識化されたＭＩＳ１２複合体とを接触させる工程を含む、抗ＭＩＳ１２抗体陽性の自己免疫疾患の検出方法及び／又は自己免疫疾患の分類方法である。
本発明の一態様は、生体由来の試料において、前記の検出剤に結合する抗体が存在することを、前記生体試料に対して標識化された前記検出剤を接触させることを含む、自己免疫疾患の検出及び／又は分類方法である。より具体的に言えば、抗ＭＩＳ１２複合体抗体が生体由来の試料に存在するか否かを、当該試料と標識化されたＭＩＳ１２複合体とを接触させる工程を含む、抗ＭＩＳ１２抗体陽性の自己免疫疾患の検出方法及び／又は自己免疫疾患の分類方法である。
【0057】
生体由来の試料としては、血液（全血、血漿、血清）、リンパ液、唾液、尿、汗、粘液、涙、随液、鼻汁、組織・細胞等の抽出液や破砕液等の生体液を含む、ほとんど全ての生体由来の液体試料が挙げられる。液体試料の好ましい例として、血清、唾液、涙及び汗からなる群から選択される体液を挙げることができる。体液試料は、生体から採取した体液をそのまま使用しても良く、必要に応じて希釈や濾過等の前処理をしたものを使用しても良い。体液試料又は前処理済みの体液試料に対して検出剤であるＭＩＳ１２複合体と接触させることにより、試料中の抗ＭＩＳ１２複合体抗体の存否や抗ＭＩＳ１２複合体抗体の含有レベルがアッセイできる。当該存否や含有レベルは、例えば、後記実施例のように、フローサイトメトリーを使用した解析により、試料中の抗ＭＩＳ１２複合体抗体とＭＩＳ１２複合体との反応性の程度として明らかにすることができる。
【0058】
生体由来の試料の別の例として、生検組織を挙げることができる。生検組織の例は、口唇腺、涙腺、顎下腺、及び腎臓由来の生検組織であるが、これに限定されない。口唇腺には唾液腺が含まれる。生検組織を試料とする場合、抗ＭＩＳ１２複合体抗体は細胞内、特に細胞核内に存在しており、外から添加したＭＩＳ１２複合体（標識化ＭＩＳ１２複合体）が容易に接触できない可能性がある。そのため、生検組織を試料とする場合には、試料を固定するか、一部可溶化する前処理をすることが望ましい。例えば、検出剤としてＧＦＰラベルしたＭＩＳ１２複合体を使用する場合、生検組織試料に対して検出剤を接触させ、適宜洗浄後、蛍光顕微鏡下で観察することにより、試料中の抗ＭＩＳ１２複合体抗体の存否やその含有量のレベルを可視的に確認することができる。また、蛍光強度の測定による定量的な解析を行うことも可能である。
【0059】
ＭＩＳ１２複合体の標識化は、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、金属微粒子、酵素、及び磁性微粒子等のラベルをＭＩＳ１２複合体に付加することにより行うことができる。放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、金属微粒子、酵素、及び磁性微粒子の具体的な例は、前記したとおりである。ラベルの付与は、いずれの種類のラベルについても公知の手法を適用することにより当業者が適宜実施できる。また、ラベルを利用した検出や定量的な測定も、ラベルの種類に応じて公知の手法により適宜実施することができる。
【0060】
本発明の自己免疫疾患の検出及び／又は分類方法を通じて、抗ＭＩＳ１２複合体抗体陽性の自己免疫疾患を検出することができる。そのような自己免疫疾患の例として、シェーグレン症候群（ＳＳ）、全身性強皮症（ＳＳｃ）及び原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）が挙げられる。ＳＳｃについては、特に限局皮膚硬化型全身性強皮症（ｌｃＳＳｃ）の検出が好ましく実施できる。ＳＳの特徴や現行の診断基準については、公知のとおりであり、本件明細書でも背景技術欄で既に（［０００７］～［００１６］段落で）記載されるとおりであるので、当該記載等にある診断基準に基づき、ＳＳの検出は適宜実施できる。
【0061】
ＰＢＣは、胆汁うっ滞型の慢性肝疾患で、小葉間レベルの胆管の炎症性破壊を特徴とし、最終的には肝硬変に至る慢性進行性の肝疾患である。検査では抗ミトコンドリア抗体が８４－９９％で陽性に、ＡＣＡが１０－４０％で陽性になると報告されている。「難治性の肝・胆道疾患に関する調査研究」班による「原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）の診療ガイドライン（2017年）」には、以下のいずれか１つに該当するものをＰＢＣと診断する、という診断基準（平成２７年版）が示されている（http://minds4.jcqhc.or.jp/minds/primary-billary-cholangiti/primary-billary-cholangiti.pdf）。
１）組織学的に慢性非化膿性破壊性胆管炎（ＣＮＳＤＣ）を認め、検査所見がＰＢＣとして矛盾しないもの。
２）抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）が陽性で、組織学的にはＣＮＳＤＣの所見を認めないが、ＰＢＣに矛盾しない（Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）組織像を示すもの。
３）組織学的検索の機会はないが、ＡＭＡが陽性で、しかも臨床像及び経過からＰＢＣと考えられるもの。
１）組織学的に慢性非化膿性破壊性胆管炎（ＣＮＳＤＣ）を認め、検査所見がＰＢＣとして矛盾しないもの。
２）抗ミトコンドリア抗体（ＡＭＡ）が陽性で、組織学的にはＣＮＳＤＣの所見を認めないが、ＰＢＣに矛盾しない（Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）組織像を示すもの。
３）組織学的検索の機会はないが、ＡＭＡが陽性で、しかも臨床像及び経過からＰＢＣと考えられるもの。
【0062】
ＳＳｃは、手指から始まる皮膚硬化が全身に及び、舌小帯の短縮や食道や肺などの内臓諸臓器の線維化を特徴とする自己免疫疾患である。American college of rheumatology (ACR)/European league against rheumatism collaborative initiative (EULAR)が2013年に公表した新分類基準（van den Hoogen et al., Ann. Rheum. Dis. (2013) vol. 72, pp. 1747-1755）によれば、以下の８つの観点から評価し、合計で９点以上であればＳＳｃと診断される。
１）両側中手指節間関節（ＭＰ関節）より中枢の皮膚硬化（９点）
２）手指皮膚硬化：腫脹のみ（２点）、近位指節間（ＰＩＰ）－ＭＰ関節間の皮膚硬化（４点）
３）指尖部病変：潰瘍（２点），陥凹性瘢痕（３点）
４）毛細血管拡張症（２点）
５）爪郭部毛細血管異常（２点）
６）肺高血圧症／間質性肺炎（２点）
７）レイノー現象（３点）
８）抗セントロメア抗体、抗トポイソメラーゼI抗体、抗ＲＮＡポリメラーゼIII抗体（３点）
１）両側中手指節間関節（ＭＰ関節）より中枢の皮膚硬化（９点）
２）手指皮膚硬化：腫脹のみ（２点）、近位指節間（ＰＩＰ）－ＭＰ関節間の皮膚硬化（４点）
３）指尖部病変：潰瘍（２点），陥凹性瘢痕（３点）
４）毛細血管拡張症（２点）
５）爪郭部毛細血管異常（２点）
６）肺高血圧症／間質性肺炎（２点）
７）レイノー現象（３点）
８）抗セントロメア抗体、抗トポイソメラーゼI抗体、抗ＲＮＡポリメラーゼIII抗体（３点）
【0063】
ＳＳｃの病型はびまん性皮膚硬化と限局性皮膚硬化の２タイプに分かれる。限局性皮膚硬化のＳＳｃ（ｌｃＳＳｃ）では抗セントロメア抗体が７０％で陽性となることが報告されている。
【0064】
前記方法は、自己免疫疾患と診断された患者に由来する試料を用いて行うことにより、当該患者が抗ＭＩＳ１２複合体抗体陽性の病態であるのか、抗ＭＩＳ１２複合体抗体陰性の病態であるのかを分類することができる。また、抗核抗体検査で陽性と診断された患者に由来する試料を用いて行うことにより、当該患者が抗核抗体陽性であって抗ＭＩＳ１２複合体抗体陽性の病態であるのか、抗核抗体陽性ではあるが抗ＭＩＳ１２複合体抗体陰性の病態であるのかを分類することができる。ここで、抗核抗体陽性は、discrete speckled型で陽性反応を示したものに限定して前記方法を実施しても良い。また、ＣＥＮＰ－Ｂに対する自己抗体陽性を指標とする抗セントロメア抗体（ＡＣＡ）陽性と診断された患者に由来する試料を用いて行うことにより、当該患者がＡＣＡ陽性であって抗ＭＩＳ１２複合体抗体陽性の病態であるのか、抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体陽性としてのＡＣＡ陽性ではあるが抗ＭＩＳ１２複合体抗体陰性の病態であるのかを分類することができる。抗セントロメア抗体検査は、ＣＥＮＰ－Ｂに対する自己抗体の検査に限定されず、これに加えて、あるいはこれに代えてＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｃ、及びＣＢＸ５（ＨＰ１α）からなる群から選択されるセントロメア構成因子に対する自己抗体の検査としても良い。
【0065】
後記実施例の結果に基づけば、ＳＳなどの自己免疫疾患において、抗ＭＩＳ１２複合体抗体は、病変部位においてantigen drivenに増殖した形質細胞から産生されるため、抗ＭＩＳ１２複合体抗体の存在は当初は病変部位においてのみ検出できるものと考えられる。しかしながら、時間の経過又は病態の進展に従って抗ＭＩＳ１２複合体抗体は体液中へも拡散されるようになるので、血清、唾液、涙といった体液成分を用いても検出可能となる。それゆえ、前記方法において、試料は必ずしも病変部位の生検試料でなくて良く、体液試料のように低侵襲的に採取可能な試料を用いても実施できる。
【0066】
標識化物質が定量的に測定することができるシグナルを生ずるものであれば、標的となる抗ＭＩＳ１２複合体抗体の存否のみならず、自己抗体（抗ＭＩＳ１２複合体抗体）の存在量を定量的に測定することも可能である。当該目的のために、本発明のタグ付き（標識化された）検出剤は、抗ＭＩＳ１２複合体抗体の定量的な測定用試薬として提供される。
【0067】
（４）検出剤としてのＭＩＳ１２複合体を含む組成物
本発明の別の一態様は、検出剤としてのＭＩＳ１２複合体を含む組成物である。当該組成物に含まれるＭＩＳ１２複合体は、前記のとおり、天然物であっても、リコンビナントタンパク質の複合体であっても良い。また、タグの付加されたＭＩＳ１２複合体や標識化されたＭＩＳ１２複合体であっても良い。タグや標識化については前記のとおりである。タグ又は標識化物質の一例は、ＧＦＰのような蛍光タンパク質である。ＭＩＳ１２複合体を構成する要素となるＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１が由来する生物種はヒトが好ましいが、その他の生物種でも良いことは、前記のとおりである。ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１の配列情報としてデータベースのアクセッション番号で特定されたある種の配列が例示されるが、それに限定されず、アイソフォーム、バリアント等、ＭＩＳ１２複合体としての機能を保持する限り一定範囲の配列上の改変は許容されることも前記のとおりである。ここでＭＩＳ１２複合体としての機能を保持するとは、ＭＩＳ１２複合体を構成し、ＫＭＮアッセンブリを構築できること、及び／又は自己免疫疾患において出現する抗ＭＩＳ１２複合体抗体と特異的に結合できることと言える。
本発明の別の一態様は、検出剤としてのＭＩＳ１２複合体を含む組成物である。当該組成物に含まれるＭＩＳ１２複合体は、前記のとおり、天然物であっても、リコンビナントタンパク質の複合体であっても良い。また、タグの付加されたＭＩＳ１２複合体や標識化されたＭＩＳ１２複合体であっても良い。タグや標識化については前記のとおりである。タグ又は標識化物質の一例は、ＧＦＰのような蛍光タンパク質である。ＭＩＳ１２複合体を構成する要素となるＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１が由来する生物種はヒトが好ましいが、その他の生物種でも良いことは、前記のとおりである。ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１の配列情報としてデータベースのアクセッション番号で特定されたある種の配列が例示されるが、それに限定されず、アイソフォーム、バリアント等、ＭＩＳ１２複合体としての機能を保持する限り一定範囲の配列上の改変は許容されることも前記のとおりである。ここでＭＩＳ１２複合体としての機能を保持するとは、ＭＩＳ１２複合体を構成し、ＫＭＮアッセンブリを構築できること、及び／又は自己免疫疾患において出現する抗ＭＩＳ１２複合体抗体と特異的に結合できることと言える。
【0068】
前記の組成物の一つの用途として、自己免疫疾患の検出及び／又は分類用試薬としての用途を挙げることができる。ＭＩＳ１２複合体を検出剤として自己免疫疾患の検出及び／又は分類を行う方法は、前記したとおりである。ＭＩＳ１２複合体に水、緩衝剤、安定化剤等を適宜配合することにより、当該方法に好適な試薬を調製することができる。
【0069】
検出剤としてのＭＩＳ１２複合体を含む組成物の別の用途として、ＭＩＳ１２複合体に対する抗体の検出用試薬やＭＩＳ１２複合体に対する抗体を産生する細胞又は組織の検出用試薬としての用途を挙げることができる。後記の実施例において具体的に開示されるとおり、ＳＳ等のある種の自己免疫疾患の患者の中には、ＭＩＳ１２複合体を内因性抗原（自己抗原）とする抗ＭＩＳ１２複合体抗体が産生されていることが本発明者らによって明らかとなった。また、抗ＭＩＳ１２複合体抗体は、病変部位のみならず、体液成分である血清にも認められた。ＭＩＳ１２複合体を利用することで、こうしたの抗ＭＩＳ１２複合体抗体を産生する細胞又は組織、及び抗ＭＩＳ複合体抗体を検出する方法を実施することができる。ＭＩＳ１２複合体に水、緩衝剤、安定化剤等を適宜配合することにより、当該方法に好適な試薬を調製することができる。検出対象となる抗ＭＩＳ１２複合体抗体の例は、抗ＭＩＳ１２複合体ヒト抗体である。自己免疫疾患の患者から見出された抗ＭＩＳ１２複合体抗体には、ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１からなるＭＩＳ１２複合体と特異的に結合し（ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識し）、複合体の各構成要素であるＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１の単体（あるいは、これら４者のうち、ＤＳＮ１とＮＳＬ１との混合物（又はＤＳＮ１とＮＳＬ１とからなるサブコンプレックス）やＰＭＦ１とＭＩＳ１２との混合物（又はＰＭＦ１とＭＩＳ１２とからなるサブコンプレックス））とはいずれも実質的に結合しない（一般的な実験条件下で行うウエスタンブロッティングでバンドが認められないか、仮にフェイントなバンドが認められることはあっても、特異的な結合であるとまでは認められない程度にしか結合しない）ものが含まれていた。それゆえ、当該方法で検出対象とする抗ＭＩＳ１２複合体抗体の一つの例は、ＭＩＳ１２複合体と特異的に結合し、ＭＩＳ１２複合体を形成していない状態のＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれとも実質的に結合しないものであるが、ＭＩＳ１２複合体と結合活性を有する抗ＭＩＳ１２複合体抗体であれば、特に限定されるものでない。
【0070】
（５）ＭＩＳ１２複合体を含む組成物を構成要素として含むキット
前記のとおり、検出剤としてのＭＩＳ１２複合体を含む組成物の用途としては、自己免疫疾患の検出及び／又は分類用試薬としての用途、ＭＩＳ１２複合体に対する抗体の検出用試薬としての用途、及びＭＩＳ１２複合体に対する抗体を産生する細胞又は組織の検出用試薬としての用途を挙げることができる。これらの試薬は、それぞれの目的に応じて、更なる成分と共にキットを構築することができる。これらの各用途に向けた、ＭＩＳ１２複合体を含む組成物を構成要素として含むキットは、本発明の別の一態様である。
キットには、必須の構成要素としての濃度既知のＭＩＳ１２複合体に加えて、ポジティブコントロール用の抗ＭＩＳ１２複合体抗体、緩衝液、保存料、希釈剤、ブロッキング液、洗浄液、使用説明書等の任意の構成要素が適宜組み合わされる。試料中の抗ＭＩＳ１２複合体の存在を、ＥＬＩＳＡ法で検出するためのキットとして構築することもできる。
前記のとおり、検出剤としてのＭＩＳ１２複合体を含む組成物の用途としては、自己免疫疾患の検出及び／又は分類用試薬としての用途、ＭＩＳ１２複合体に対する抗体の検出用試薬としての用途、及びＭＩＳ１２複合体に対する抗体を産生する細胞又は組織の検出用試薬としての用途を挙げることができる。これらの試薬は、それぞれの目的に応じて、更なる成分と共にキットを構築することができる。これらの各用途に向けた、ＭＩＳ１２複合体を含む組成物を構成要素として含むキットは、本発明の別の一態様である。
キットには、必須の構成要素としての濃度既知のＭＩＳ１２複合体に加えて、ポジティブコントロール用の抗ＭＩＳ１２複合体抗体、緩衝液、保存料、希釈剤、ブロッキング液、洗浄液、使用説明書等の任意の構成要素が適宜組み合わされる。試料中の抗ＭＩＳ１２複合体の存在を、ＥＬＩＳＡ法で検出するためのキットとして構築することもできる。
【0071】
ＭＩＳ１２複合体を構成するＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれかにＨＲＰ等の酵素をタグとして融合させておいた場合、キットには当該酵素に対する基質（ＨＲＰに対しては、ＴＭＢ、ＯＰＤ、ＡＢＴＳ等）を含めることによりＥＬＩＳＡ法に好適なキットとすることができる。また、ＭＩＳ１２複合体を構成するＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１のいずれかに酵素以外のタグを付加した場合には、当該タグと特異的に結合する物質（抗体等）とＨＲＰ等の酵素とのコンジュゲート、及び、当該コンジュゲート中の酵素に対する基質（ＨＲＰに対しては、ＴＭＢ、ＯＰＤ、ＡＢＴＳ等）を構成要素として加入することにより、サンドイッチＥＬＩＳＡ法に好適なキットとすることができる。ＥＬＩＳＡ法に関して、上記においては酵素としてＨＲＰを例示し、基質としてＴＭＢ、ＯＰＤ及びＡＢＴＳを例示したが、酵素－基質特異性を利用したアッセイが成立する限り、どのような酵素－基質の組合せであっても良い。別異の組合せとして、アルカリフォスファターゼとＰＮＰＰとの組合せ、及び、ガラクトシダーゼとＯＮＰＧとの組合せが例示できる。また、基質はケミルミネッセンスを発生させるものであっても良く、ＨＲＰに対してＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＥＬＩＳＡ（商標）等、アルカリフォスファターゼに対してＣＤＰ－Ｓｔａｒ（商標）等の基質を組み合わせても良い。
【0072】
（６）ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体、又はその機能性断片の調製
後記実施例で記載されるように、抗核抗体陽性の自己免疫症患者の生検試料を材料として抗体分泌細胞を単離し、単離された細胞からシングルセルｃＤＮＡライブラリーを構築して解析したところ、患者の組織には、ＭＩＳ１２複合体を自己抗原とする抗ヒトＭＩＳ１２複合体ヒト抗体（自己抗体）を産生する抗体分泌細胞が存在することが明らかとなった。さらに、自己抗体としての抗ヒトＭＩＳ１２複合体ヒト抗体には、ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体、すなわち、ＭＩＳ１２複合体とは結合するが、ＭＩＳ１２複合体の構成要素であるＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１の単体（あるいは、これら４者のうち、ＤＳＮ１とＮＳＬ１との混合物（又はＤＳＮ１とＮＳＬ１とからなるサブコンプレックス）やＰＭＦ１とＭＩＳ１２との混合物（又はＰＭＦ１とＭＩＳ１２とからなるサブコンプレックス））とはいずれも実質的に結合しない抗体が存在することが明らかとなった。このようなＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗ＭＩＳ１２複合体抗体やその機能的断片は、ＭＩＳ１２複合体の生化学的な解析や免疫化学的な解析等のための試薬として利用可能である。
一方、現在、ＭＩＳ１２複合体を認識する抗体として一般に入手、利用可能な抗体は、ポリクローナル抗体である。当該抗体はＭＩＳ１２複合体のみならず、当該複合体の構成要素たるＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及び／又はＰＭＦ１とも結合活性を有する。このような事情に鑑みて、本発明の抗体、又はその機能性断片は、前例がないものであって、極めて有用なものである。
後記実施例で記載されるように、抗核抗体陽性の自己免疫症患者の生検試料を材料として抗体分泌細胞を単離し、単離された細胞からシングルセルｃＤＮＡライブラリーを構築して解析したところ、患者の組織には、ＭＩＳ１２複合体を自己抗原とする抗ヒトＭＩＳ１２複合体ヒト抗体（自己抗体）を産生する抗体分泌細胞が存在することが明らかとなった。さらに、自己抗体としての抗ヒトＭＩＳ１２複合体ヒト抗体には、ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体、すなわち、ＭＩＳ１２複合体とは結合するが、ＭＩＳ１２複合体の構成要素であるＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１の単体（あるいは、これら４者のうち、ＤＳＮ１とＮＳＬ１との混合物（又はＤＳＮ１とＮＳＬ１とからなるサブコンプレックス）やＰＭＦ１とＭＩＳ１２との混合物（又はＰＭＦ１とＭＩＳ１２とからなるサブコンプレックス））とはいずれも実質的に結合しない抗体が存在することが明らかとなった。このようなＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗ＭＩＳ１２複合体抗体やその機能的断片は、ＭＩＳ１２複合体の生化学的な解析や免疫化学的な解析等のための試薬として利用可能である。
一方、現在、ＭＩＳ１２複合体を認識する抗体として一般に入手、利用可能な抗体は、ポリクローナル抗体である。当該抗体はＭＩＳ１２複合体のみならず、当該複合体の構成要素たるＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及び／又はＰＭＦ１とも結合活性を有する。このような事情に鑑みて、本発明の抗体、又はその機能性断片は、前例がないものであって、極めて有用なものである。
【0073】
本発明の抗体として、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、及び、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体、並びにこれらの何れかの抗体の機能性断片を例示することができる。これらの抗体又はその機能性断片は、前記の配列情報と当業者に周知の技術に基づいて、組換えタンパク質として適宜調製することができる。
この際、抗体遺伝子をクローニングした発現用ベクターには、プロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を適宜配置することができる。ここで、発現ベクターとしては、細菌、酵母又は動物細胞等の宿主細胞中で複製可能なものを用いればどのようなものでも良く、宿主に応じて市販のベクターが適宜利用できる。発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換することができる。例えば、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法等がある。
宿主細胞は特に限定されないが、真核細胞を用いることが好ましい。酵母、又は動物由来の培養細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＥＦ等）が挙げられる。
産生された抗体の精製は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を用いて行うことができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜組み合わせて行うことができる。当該抗体は、完全ヒト配列のモノクローナル抗体として調製することができる。
この際、抗体遺伝子をクローニングした発現用ベクターには、プロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を適宜配置することができる。ここで、発現ベクターとしては、細菌、酵母又は動物細胞等の宿主細胞中で複製可能なものを用いればどのようなものでも良く、宿主に応じて市販のベクターが適宜利用できる。発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換することができる。例えば、エレクトロポレーション法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法等がある。
宿主細胞は特に限定されないが、真核細胞を用いることが好ましい。酵母、又は動物由来の培養細胞（ＨＥＫ２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＥＦ等）が挙げられる。
産生された抗体の精製は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を用いて行うことができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜組み合わせて行うことができる。当該抗体は、完全ヒト配列のモノクローナル抗体として調製することができる。
【0074】
本発明の抗体として、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２１に示される配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２９に示される配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、及び、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３７に示される配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体、並びにこれらの何れかの抗体の機能性断片を例示することができる。これらの抗体及びその機能性断片も、前記と同様、前記の配列情報と当業者に周知の技術に基づいて、適宜調製することができる。
【0075】
本発明の抗体として、配列番号１４、１５及び１６に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖、及び、配列番号１７、１８及び１９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を有する抗体、配列番号２２、２３及び２４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖、及び、配列番号２５、２６及び２７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を有する抗体、及び、配列番号３０、３１及び３２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖、及び、配列番号３３、３４及び３５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖を有する抗体、並びにこれらの何れかの抗体の機能性断片を例示することができる。これらの抗体及びその機能性断片も、前記と同様、前記の配列情報と当業者に周知の技術に基づいて、適宜調製することができる。
【0076】
本発明のＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗ＭＩＳ１２複合体抗体は、ＬＢ３２－８抗体、ＬＢ３２－１０抗体、及びＬＢ３２－１９抗体と互いに配列の異なる少なくとも３種類の抗体が後記実施例で取得されたように、実施例の開示及び当業者に周知の技術を適用することにより、新たに適宜入手することが可能である。抗体は、後記実施例のように、抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子をそれぞれ発現ベクターにクローニングし、組換えタンパク質として調製することができる。また、単離した抗体分泌細胞を材料の一つとしてハイブリドーマを作成し、クローン化したハイブリドーマからモノクローナル抗体を産生させても良い。
【0077】
（７）抗体分子の可変領域、及び可変領域中の相補性決定領域
免疫グロブリン分子は、基本的に２本の重鎖ポリペプチドと２本の軽鎖ポリペプチドからなるヘテロ４量体分子である。重鎖及び軽鎖は、それぞれ可変領域と定常領域とを含む。抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）と４個のフレームワーク領域（ＦＲ）で構成され、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置されている。抗体分子のアミノ酸配列情報を公知の手法により決定すれば、当該配列情報に基づいて可変領域や定常領域の部位を推定することができる。また、可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を推定することも、同様に周知の手法により行える。よって、前記段落のように、抗ＭＩＳ１２複合体抗体を新たに選抜する場合であっても、抗体分子中の可変領域や相補性決定領域は、適宜決定することができる。
免疫グロブリン分子は、基本的に２本の重鎖ポリペプチドと２本の軽鎖ポリペプチドからなるヘテロ４量体分子である。重鎖及び軽鎖は、それぞれ可変領域と定常領域とを含む。抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）と４個のフレームワーク領域（ＦＲ）で構成され、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置されている。抗体分子のアミノ酸配列情報を公知の手法により決定すれば、当該配列情報に基づいて可変領域や定常領域の部位を推定することができる。また、可変領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３の配列を推定することも、同様に周知の手法により行える。よって、前記段落のように、抗ＭＩＳ１２複合体抗体を新たに選抜する場合であっても、抗体分子中の可変領域や相補性決定領域は、適宜決定することができる。
【0078】
（８）抗体分子の改変体
本発明の抗体は、上記の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列、又は上記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体の配列上の改変体であっても良い。例えば、重鎖可変領域が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むものであり、軽鎖可変領域が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むものである抗体を改変元として、ＭＩＳ１２複合体の立体構造に特異的な結合能を実質的に維持する範囲（改変元抗体の有する特異的結合能と実質的に同等の特異的結合能を有する範囲）で、重鎖及び軽鎖それぞれの可変領域内や定常領域内に改変があっても良い。前記それぞれのアミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されていても良い。また、ＢＬＡＳＴ等のツールを用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の配列同一性を有する範囲で改変があっても良い。ただし、いずれの改変体についても、ＣＤＲにおけるアミノ酸配列の改変は有しない（各ＣＤＲは、改変前の抗体と同一のアミノ酸配列を有する）ものである。すなわち、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の改変体ポリペプチドにおいては、配列番号１４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３においては、配列上の改変を有しないものとする。同様に、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の改変体ポリペプチドにおいては、配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３においては、配列上の改変を有しないものとする。配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の改変体ポリペプチド、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の改変体ポリペプチド、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の改変体ポリペプチド、及び配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の改変体ポリペプチドにおいても同様である。
ＣＤＲの配列は、抗体のエピトープを決定する中心的な要素であることが広く知られている。本発明の抗体は、上記の配列上改変体であっても、重鎖及び軽鎖に含まれる合計６箇所のＣＤＲは完全に保存されているので、改変前の抗ＭＩＳ１２複合体抗体と同じエピトープに対して特異的な結合能を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造に対する特異的な結合能を維持することが合理的に推認できる。
本発明の抗体は、上記の重鎖及び軽鎖アミノ酸配列、又は上記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を有する抗体の配列上の改変体であっても良い。例えば、重鎖可変領域が配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むものであり、軽鎖可変領域が配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むものである抗体を改変元として、ＭＩＳ１２複合体の立体構造に特異的な結合能を実質的に維持する範囲（改変元抗体の有する特異的結合能と実質的に同等の特異的結合能を有する範囲）で、重鎖及び軽鎖それぞれの可変領域内や定常領域内に改変があっても良い。前記それぞれのアミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されていても良い。また、ＢＬＡＳＴ等のツールを用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の配列同一性を有する範囲で改変があっても良い。ただし、いずれの改変体についても、ＣＤＲにおけるアミノ酸配列の改変は有しない（各ＣＤＲは、改変前の抗体と同一のアミノ酸配列を有する）ものである。すなわち、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の改変体ポリペプチドにおいては、配列番号１４のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３においては、配列上の改変を有しないものとする。同様に、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の改変体ポリペプチドにおいては、配列番号１７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３においては、配列上の改変を有しないものとする。配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の改変体ポリペプチド、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の改変体ポリペプチド、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の改変体ポリペプチド、及び配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域の改変体ポリペプチドにおいても同様である。
ＣＤＲの配列は、抗体のエピトープを決定する中心的な要素であることが広く知られている。本発明の抗体は、上記の配列上改変体であっても、重鎖及び軽鎖に含まれる合計６箇所のＣＤＲは完全に保存されているので、改変前の抗ＭＩＳ１２複合体抗体と同じエピトープに対して特異的な結合能を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造に対する特異的な結合能を維持することが合理的に推認できる。
【0079】
（９）分泌型抗体、及び非分泌型抗体の調製
抗体は、重鎖及び軽鎖それぞれの可変領域においてシグナル配列を有しないアミノ酸配列からなる、非分泌型の抗体として調製することも、重鎖及び軽鎖それぞれの可変領域においてシグナル配列を有するアミノ酸配列からなる、分泌型の抗体として調製することも可能である。
シグナル配列が除去された組換え体抗体は、当該組換え体抗体を発現する細胞から分泌されることなく、当該細胞内に蓄積するので、当該細胞から適宜分離、精製して利用できる。
シグナル配列を有する組換え体抗体は、当該組換え体抗体を発現する細胞から分泌されるので、当該細胞の培養上清などから適宜分離、精製して利用できる。シグナル配列は、抗体を産生する細胞において分泌シグナルとして機能する限り、どのような配列であっても良い。シグナル配列の非限定的な例として、ＭＤＰＫＧＳＬＳＷＲＩＬＬＦＬＳＬＡＦＥＬＳＹＧＬＥ（配列番号１３）を挙げることができる。当該シグナル配列を重鎖及び軽鎖アミノ酸配列のＮ末端に配置することにより、抗体タンパク質を分泌型のタンパク質とすることができる。
抗体は、重鎖及び軽鎖それぞれの可変領域においてシグナル配列を有しないアミノ酸配列からなる、非分泌型の抗体として調製することも、重鎖及び軽鎖それぞれの可変領域においてシグナル配列を有するアミノ酸配列からなる、分泌型の抗体として調製することも可能である。
シグナル配列が除去された組換え体抗体は、当該組換え体抗体を発現する細胞から分泌されることなく、当該細胞内に蓄積するので、当該細胞から適宜分離、精製して利用できる。
シグナル配列を有する組換え体抗体は、当該組換え体抗体を発現する細胞から分泌されるので、当該細胞の培養上清などから適宜分離、精製して利用できる。シグナル配列は、抗体を産生する細胞において分泌シグナルとして機能する限り、どのような配列であっても良い。シグナル配列の非限定的な例として、ＭＤＰＫＧＳＬＳＷＲＩＬＬＦＬＳＬＡＦＥＬＳＹＧＬＥ（配列番号１３）を挙げることができる。当該シグナル配列を重鎖及び軽鎖アミノ酸配列のＮ末端に配置することにより、抗体タンパク質を分泌型のタンパク質とすることができる。
【0080】
（１０）抗体の機能性断片
本発明の抗体は、ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識することができれば、必ずしも免疫グロブリン分子全体の構造が維持されていなくてもよく、抗体の機能的断片（抗原結合性断片）であってもよい。抗体の抗原結合能は、抗体の可変部に支配されているので、免疫グロブリン分子のうち定常領域の部分は必ずしも存在しなくてもよい。従って、本発明の抗体の機能的断片としては、免疫グロブリン分子の可変部からなる断片である、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂからＶＬを取り除いたＦｄ、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）及びその二量体であるｄｉａｂｏｄｙを挙げることができる。あるいは、ｓｃＦｖからＶＬを取り除いた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などを用いることができるが、抗体の機能性断片はこれらに限定されない。
抗体の機能性断片は、公知の手法により調製することができる。例えば、免疫グロブリン分子を酵素処理することにより断片化できる。免疫グロブリン分子をパパインにより分解することでＦａｂが得られ、ペプシンにより分解することでＦ（ａｂ’）２が得られ、Ｆ（ａｂ’）２を還元処理することによりＦａｂ’が得られる。また、遺伝子工学的手法により、抗体の重鎖可変部（ＶＨ）と軽鎖可変部（ＶＬ）を可動性に富むリンカーペプチドで連結することによりｓｃＦｖを作製することもできる。
本発明の抗体は、ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識することができれば、必ずしも免疫グロブリン分子全体の構造が維持されていなくてもよく、抗体の機能的断片（抗原結合性断片）であってもよい。抗体の抗原結合能は、抗体の可変部に支配されているので、免疫グロブリン分子のうち定常領域の部分は必ずしも存在しなくてもよい。従って、本発明の抗体の機能的断片としては、免疫グロブリン分子の可変部からなる断片である、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂからＶＬを取り除いたＦｄ、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）及びその二量体であるｄｉａｂｏｄｙを挙げることができる。あるいは、ｓｃＦｖからＶＬを取り除いた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などを用いることができるが、抗体の機能性断片はこれらに限定されない。
抗体の機能性断片は、公知の手法により調製することができる。例えば、免疫グロブリン分子を酵素処理することにより断片化できる。免疫グロブリン分子をパパインにより分解することでＦａｂが得られ、ペプシンにより分解することでＦ（ａｂ’）２が得られ、Ｆ（ａｂ’）２を還元処理することによりＦａｂ’が得られる。また、遺伝子工学的手法により、抗体の重鎖可変部（ＶＨ）と軽鎖可変部（ＶＬ）を可動性に富むリンカーペプチドで連結することによりｓｃＦｖを作製することもできる。
【0081】
（１１）キメラ抗体、非ヒト化抗体
本発明の抗体として、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、及び、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を揺する抗体は、いずれも、抗ヒトＭＩＳ１２複合体ヒト配列抗体であって、当該抗体分子中の定常領域は、重鎖のものも、軽鎖のものもヒト配列を有する。よって、当該抗体の存在を免疫学的に検出する場合の一手段は、抗ヒトＩｇ抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体。）を利用することである。しかしながら、抗ヒトＩｇ抗体、特に、二次抗体として利用するようなラベル化された抗ヒトＩｇ抗体は、抗マウスＩｇ抗体、抗ウサギＩｇ抗体、抗ヤギＩｇ抗体といった抗非ヒトＩｇ抗体と比べて、市場における供給が乏しく、比較的入手困難である。また、抗ヒトＩｇ抗体は、入手可能であるとしても、抗非ヒトＩｇ抗体よりも高価であることが、利用における不都合となり得る。そこで、本発明の抗体の存在を容易かつ安価に免疫学的に検出できるように、本発明の抗体の少なくとも定常領域を、非ヒト動物由来の免疫グロブリンの定常領域配列とすることができる。
マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリ、及びラクダといった非ヒト動物に由来する免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖定常領域のアミノ案配列は公知であり、そうしたアミノ酸配列をコードする核酸も当業者は容易に入手、又は作成することができる。それゆえ、本発明の抗体であって、抗ＭＩＳ１２複合体ヒト配列抗体については、少なくとも重鎖及び軽鎖可変領域を非ヒト動物由来の重鎖及び軽鎖可変領域とスワップすることにより、キメラ抗体とすること（非ヒト化すること）ができる。
また、非ヒト化抗体は、ヒト抗体のＣＤＲを非ヒト抗体のＣＤＲへ移植（ＣＤＲグラフト）することで調製可能である。その調製は、一般的な遺伝子組換え手法を適用して適宜実施することができる。例えば、抗ヒトＭＩＳ１２ヒト抗体の各ＣＤＲと非ヒト抗体（例えばマウス抗体）のフレームワーク領域とを連結するアミノ酸配列をコードするように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した複数のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成すれば良い。
本発明の抗体として、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体、及び、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を揺する抗体は、いずれも、抗ヒトＭＩＳ１２複合体ヒト配列抗体であって、当該抗体分子中の定常領域は、重鎖のものも、軽鎖のものもヒト配列を有する。よって、当該抗体の存在を免疫学的に検出する場合の一手段は、抗ヒトＩｇ抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体。）を利用することである。しかしながら、抗ヒトＩｇ抗体、特に、二次抗体として利用するようなラベル化された抗ヒトＩｇ抗体は、抗マウスＩｇ抗体、抗ウサギＩｇ抗体、抗ヤギＩｇ抗体といった抗非ヒトＩｇ抗体と比べて、市場における供給が乏しく、比較的入手困難である。また、抗ヒトＩｇ抗体は、入手可能であるとしても、抗非ヒトＩｇ抗体よりも高価であることが、利用における不都合となり得る。そこで、本発明の抗体の存在を容易かつ安価に免疫学的に検出できるように、本発明の抗体の少なくとも定常領域を、非ヒト動物由来の免疫グロブリンの定常領域配列とすることができる。
マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギ、ロバ、ニワトリ、及びラクダといった非ヒト動物に由来する免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖定常領域のアミノ案配列は公知であり、そうしたアミノ酸配列をコードする核酸も当業者は容易に入手、又は作成することができる。それゆえ、本発明の抗体であって、抗ＭＩＳ１２複合体ヒト配列抗体については、少なくとも重鎖及び軽鎖可変領域を非ヒト動物由来の重鎖及び軽鎖可変領域とスワップすることにより、キメラ抗体とすること（非ヒト化すること）ができる。
また、非ヒト化抗体は、ヒト抗体のＣＤＲを非ヒト抗体のＣＤＲへ移植（ＣＤＲグラフト）することで調製可能である。その調製は、一般的な遺伝子組換え手法を適用して適宜実施することができる。例えば、抗ヒトＭＩＳ１２ヒト抗体の各ＣＤＲと非ヒト抗体（例えばマウス抗体）のフレームワーク領域とを連結するアミノ酸配列をコードするように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した複数のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成すれば良い。
【0082】
（１２）レポーター物質により標識化された抗体
本発明の抗ＭＩＳ１２複合体抗体又はその機能性断片は、場合によりレポーター物質により標識化された状態で使用される。レポーター物質は、抗ＭＩＳ１２複合体抗体又はその機能性断片を所望の機能（ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識すること）が維持された状態でラベル化できるものであればどのようなものでも良い。例えば、ラベルであって、ＭＩＳ１２複合体の存在を定量的に測定することができるシグナルを発生することができる物質はより好ましい。例えば、放射性同位元素、金属微粒子、酵素、蛍光物質、及び発光物質を挙げることができる。レポーター物質として、放射性同位元素、蛍光物質、又は発光物質を用いた場合には、それらが発生する放射線、蛍光、又は発光をシグナルとして定量的に測定することができる。レポーター物質が酵素の場合には、適切な基質を作用させ、最終的に生成した色素、蛍光物質、又は発光物質に由来する色、蛍光、又は発光をシグナルとして測定する。放射性同位元素としては、３Ｈ、１２５Ｉなどが挙げられる。蛍光物質としては、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、フルオレセイン及びその誘導体（例えば、ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びその誘導体（例えば、ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、フィコエリスリン（ＰＥ）、量子ドットなどが挙げられる。発光物質としては、ルミノール誘導体、アクリジニウム誘導体、エクオリン、ルテニウム錯体等が挙げられる。金属微粒子としては、金ナノ粒子や金と白金との合金からなるナノ粒子が挙げられる。酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β－ガラクトシダーゼ（β－ＧＡＬ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ルシフェラーゼ、エクオリンなどが挙げられる。それぞれの酵素について、適切な基質と組み合わせて使用することにより、発光法、比色法、又は蛍光法による解析が可能となる。定量的な解析には、レポーター物質により標識化された本発明の抗体又はその機能性断片が好ましく用いられる。
本発明の抗ＭＩＳ１２複合体抗体又はその機能性断片は、場合によりレポーター物質により標識化された状態で使用される。レポーター物質は、抗ＭＩＳ１２複合体抗体又はその機能性断片を所望の機能（ＭＩＳ１２複合体との結合活性を有し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識すること）が維持された状態でラベル化できるものであればどのようなものでも良い。例えば、ラベルであって、ＭＩＳ１２複合体の存在を定量的に測定することができるシグナルを発生することができる物質はより好ましい。例えば、放射性同位元素、金属微粒子、酵素、蛍光物質、及び発光物質を挙げることができる。レポーター物質として、放射性同位元素、蛍光物質、又は発光物質を用いた場合には、それらが発生する放射線、蛍光、又は発光をシグナルとして定量的に測定することができる。レポーター物質が酵素の場合には、適切な基質を作用させ、最終的に生成した色素、蛍光物質、又は発光物質に由来する色、蛍光、又は発光をシグナルとして測定する。放射性同位元素としては、３Ｈ、１２５Ｉなどが挙げられる。蛍光物質としては、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質、フルオレセイン及びその誘導体（例えば、ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びその誘導体（例えば、ＴＲＩＴＣ）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、フィコエリスリン（ＰＥ）、量子ドットなどが挙げられる。発光物質としては、ルミノール誘導体、アクリジニウム誘導体、エクオリン、ルテニウム錯体等が挙げられる。金属微粒子としては、金ナノ粒子や金と白金との合金からなるナノ粒子が挙げられる。酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β－ガラクトシダーゼ（β－ＧＡＬ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、ルシフェラーゼ、エクオリンなどが挙げられる。それぞれの酵素について、適切な基質と組み合わせて使用することにより、発光法、比色法、又は蛍光法による解析が可能となる。定量的な解析には、レポーター物質により標識化された本発明の抗体又はその機能性断片が好ましく用いられる。
【0083】
（１３）固体支持体に固定化された抗体
本発明の抗ＭＩＳ１２複合体抗体又はその機能性断片は、場合により固体支持体に固定化された状態で使用される。固体支持体とは、抗体又はその機能性断片を所望の活性が維持された状態で固定化できるものであれば、どのような物質でも良い。抗体を用いた生物学的な解析に影響を与えない不活性な材質からなる物質が好ましい。例えば、マイクロプレート、ガラス製プレート、プラスチック製プレート、シリンジ、バイアル、カラム、磁性粒子、樹脂製マイクロビーズ、多孔性膜、多孔性担体、及びマイクロチップを例示することができる。マイクロプレート、シリンジ、バイアル、カラム及びマイクロチップは、いずれも不活性な樹脂製のものが好ましい。ガラス製であっても良い。固体支持体にストレプトアビジンを担持させ、抗体又はその機能性断片にはストレプトアビジン結合性ペプチド（例えば、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）を含めることにより、ストレプトアビジンとストレプトアビジン結合性ペプチドとの親和性を利用して抗体又はその機能性断片を固体支持体に固定することもできる。
本発明の抗ＭＩＳ１２複合体抗体又はその機能性断片は、場合により固体支持体に固定化された状態で使用される。固体支持体とは、抗体又はその機能性断片を所望の活性が維持された状態で固定化できるものであれば、どのような物質でも良い。抗体を用いた生物学的な解析に影響を与えない不活性な材質からなる物質が好ましい。例えば、マイクロプレート、ガラス製プレート、プラスチック製プレート、シリンジ、バイアル、カラム、磁性粒子、樹脂製マイクロビーズ、多孔性膜、多孔性担体、及びマイクロチップを例示することができる。マイクロプレート、シリンジ、バイアル、カラム及びマイクロチップは、いずれも不活性な樹脂製のものが好ましい。ガラス製であっても良い。固体支持体にストレプトアビジンを担持させ、抗体又はその機能性断片にはストレプトアビジン結合性ペプチド（例えば、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）を含めることにより、ストレプトアビジンとストレプトアビジン結合性ペプチドとの親和性を利用して抗体又はその機能性断片を固体支持体に固定することもできる。
【0084】
（１４）ＭＩＳ１２複合体検出用試薬
本発明の抗ＭＩＳ１２複合体抗体、又はその機能性断片は、ＭＩＳ１２複合体と結合し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する能力を有することから、当該抗体、又はその機能性断片を含む組成物が提供できる。当該組成物は、ＭＩＳ１２複合体検出用試薬として提供できる。ここで、試薬に含まれる抗体又はその機能性断片は、上記（１２）に記載されるようなレポーター物質により標識化されたものであっても良い。レポーター物質により標識化されたものであれば、二次抗体を用いることなく検出を行うことができる。別の態様として、試薬に含まれる抗体又はその機能性断片は、磁性微粒子のような固体支持体上に結合又は吸着されたものであっても良い。試薬中で溶液として本発明の抗ＭＩＳ１２複合体抗体又はその機能性断片が包含される場合、その濃度は目的や使用態様に応じて適宜決定できる。例えば、１ｎｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬの範囲で決定することが挙げられる。また、試薬は原液のまま使用しても良いが、目的に応じて１０倍～１０，０００倍程度に希釈した状態でも好ましく使用される。溶媒は水又は緩衝液を適宜使用できる。当該組成物を試薬として含み、ＭＩＳ１２複合体を検出するためのキットを構築することもできる。試薬は、目的に応じて、更なる成分と共にキットの構成要素とされる。キットには、ポジティブコントロール用のＭＩＳ１２複合体、標準試料としての濃度既知のＭＩＳ１２複合体、二次抗体、酵素の基質、コファクター、補助成分、ネガティブコントロール用の非特異的蛋白質試料、緩衝液、保存料、希釈剤、使用説明書等の構成要素が適宜組み合わされる。さらに、ブロッキングや洗浄用の緩衝液等も適宜キットの構成要素として任意に追加できる。
本発明の抗ＭＩＳ１２複合体抗体、又はその機能性断片は、ＭＩＳ１２複合体と結合し、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する能力を有することから、当該抗体、又はその機能性断片を含む組成物が提供できる。当該組成物は、ＭＩＳ１２複合体検出用試薬として提供できる。ここで、試薬に含まれる抗体又はその機能性断片は、上記（１２）に記載されるようなレポーター物質により標識化されたものであっても良い。レポーター物質により標識化されたものであれば、二次抗体を用いることなく検出を行うことができる。別の態様として、試薬に含まれる抗体又はその機能性断片は、磁性微粒子のような固体支持体上に結合又は吸着されたものであっても良い。試薬中で溶液として本発明の抗ＭＩＳ１２複合体抗体又はその機能性断片が包含される場合、その濃度は目的や使用態様に応じて適宜決定できる。例えば、１ｎｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬの範囲で決定することが挙げられる。また、試薬は原液のまま使用しても良いが、目的に応じて１０倍～１０，０００倍程度に希釈した状態でも好ましく使用される。溶媒は水又は緩衝液を適宜使用できる。当該組成物を試薬として含み、ＭＩＳ１２複合体を検出するためのキットを構築することもできる。試薬は、目的に応じて、更なる成分と共にキットの構成要素とされる。キットには、ポジティブコントロール用のＭＩＳ１２複合体、標準試料としての濃度既知のＭＩＳ１２複合体、二次抗体、酵素の基質、コファクター、補助成分、ネガティブコントロール用の非特異的蛋白質試料、緩衝液、保存料、希釈剤、使用説明書等の構成要素が適宜組み合わされる。さらに、ブロッキングや洗浄用の緩衝液等も適宜キットの構成要素として任意に追加できる。
【実施例】
【0085】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【0086】
実施例１ 唾液腺組織に存在する形質細胞（抗体分泌細胞）の分離
シェーグレン症候群が疑われた９例の患者から、シェーグレン症候群の診断目的でバイオプシーを行い、小唾液腺の生検検体を得た。当該生検検体の一部を材料として、検体中に存在する形質細胞（抗体分泌細胞；ＡＳＣ）をシングルセルで分離した。
具体的には、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含むＤＭＥＭ液体培地中で小唾液腺組織を機械的、及び酵素的に分解した。分解処理は、３７℃で、５％ＣＯ２環境下で３０分間行った。次いで、孔径４０μｍの細胞濾過フィルターを通した後、蛍光色素がコンジュゲートされた抗体（抗ＣＤ３抗体（ＡＰＣ／Ｃｙ７，ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４抗体（ＰＥ／Ｃｙ７，ＳＫ３）、抗ＣＤ８抗体（ＢＶ５１０，ＲＰＡ－Ｔ８）、抗ＣＤ１９抗体（ＢＶ４２１，ＨＩＢ１９）、抗ＣＤ３８抗体（ＦＩＴＣ，ＨＩＴ２）、及び抗ＣＤ３２６抗体（ＰＥ，９Ｃ４））、及び７－アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ，ベイバイオサイエンス社、神戸）で細胞を染色した。そして、７ＡＡＤ－ＣＤ３－ＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３２６－ＣＤ１９＋ＣＤ３８ｈｉｇｈを指標として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社））で形質細胞の生細胞を分離した。
結果として、９例の患者由来の組織から合計３５２細胞がソートされた。
シェーグレン症候群が疑われた９例の患者から、シェーグレン症候群の診断目的でバイオプシーを行い、小唾液腺の生検検体を得た。当該生検検体の一部を材料として、検体中に存在する形質細胞（抗体分泌細胞；ＡＳＣ）をシングルセルで分離した。
具体的には、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼを含むＤＭＥＭ液体培地中で小唾液腺組織を機械的、及び酵素的に分解した。分解処理は、３７℃で、５％ＣＯ２環境下で３０分間行った。次いで、孔径４０μｍの細胞濾過フィルターを通した後、蛍光色素がコンジュゲートされた抗体（抗ＣＤ３抗体（ＡＰＣ／Ｃｙ７，ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ４抗体（ＰＥ／Ｃｙ７，ＳＫ３）、抗ＣＤ８抗体（ＢＶ５１０，ＲＰＡ－Ｔ８）、抗ＣＤ１９抗体（ＢＶ４２１，ＨＩＢ１９）、抗ＣＤ３８抗体（ＦＩＴＣ，ＨＩＴ２）、及び抗ＣＤ３２６抗体（ＰＥ，９Ｃ４））、及び７－アミノアクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ，ベイバイオサイエンス社、神戸）で細胞を染色した。そして、７ＡＡＤ－ＣＤ３－ＣＤ４－ＣＤ８－ＣＤ３２６－ＣＤ１９＋ＣＤ３８ｈｉｇｈを指標として、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社））で形質細胞の生細胞を分離した。
結果として、９例の患者由来の組織から合計３５２細胞がソートされた。
【0087】
実施例２ ＡＳＣのシングルセルｃＤＮＡライブラリーの構築
実施例１で分取したＡＳＣ細胞を材料として、Ｃ１システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）又はＳｍａｒｔ－ｓｅｑ２を使用し、シングルセルｃＤＮＡライブラリーの構築した。Ｃ１システムは、マニュアルに従って適用した。また、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２は、論文に公表された手順（Picelli S et al., Nat. Protocols (2014) vol. 9, pp. 171-181）に従った。
実施例１で分取したＡＳＣ細胞を材料として、Ｃ１システム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）又はＳｍａｒｔ－ｓｅｑ２を使用し、シングルセルｃＤＮＡライブラリーの構築した。Ｃ１システムは、マニュアルに従って適用した。また、Ｓｍａｒｔ－ｓｅｑ２は、論文に公表された手順（Picelli S et al., Nat. Protocols (2014) vol. 9, pp. 171-181）に従った。
【0088】
実施例３ 抗体発現ベクターの調製
実施例２で調製したｃＤＮＡライブラリーを材料として、ライブラリー中に含まれるＩｇＨ遺伝子、Ｉｇλ遺伝子、及びＩｇκ遺伝子をＰＣＲ法で増幅させた。手法は、基本的に、論文に公表された手順（Tiller T et al., J. Immunol. Methods (2008) vol. 329, pp. 112-114）に従った。ＰＣＲ増幅は、１ｓｔＰＣＲ及び２ｎｄＰＣＲの２段階、又は３ｒｄＰＣＲを含む３段階で行い、増幅産物を発現ベクターにクローニングした。重鎖用発現ベクターには、シグナルペプチド（配列番号１３）をコードする塩基配列、及び、重鎖定常領域をコードする塩基配列が含まれる。また、軽鎖用発現ベクターには、シグナルペプチド（配列番号１３）をコードする塩基配列が含まれる。一方、軽鎖λ定常領域又は軽鎖κ定常領域をコードする塩基配列は、ＰＣＲ増幅産物中に含まれる。ベクター中のインサートＤＮＡは配列決定が行われた。
当該実施例により、２５９細胞から抗体の配列が得られた（抗体の配列情報は、後記実施例１２に開示される。）。
実施例２で調製したｃＤＮＡライブラリーを材料として、ライブラリー中に含まれるＩｇＨ遺伝子、Ｉｇλ遺伝子、及びＩｇκ遺伝子をＰＣＲ法で増幅させた。手法は、基本的に、論文に公表された手順（Tiller T et al., J. Immunol. Methods (2008) vol. 329, pp. 112-114）に従った。ＰＣＲ増幅は、１ｓｔＰＣＲ及び２ｎｄＰＣＲの２段階、又は３ｒｄＰＣＲを含む３段階で行い、増幅産物を発現ベクターにクローニングした。重鎖用発現ベクターには、シグナルペプチド（配列番号１３）をコードする塩基配列、及び、重鎖定常領域をコードする塩基配列が含まれる。また、軽鎖用発現ベクターには、シグナルペプチド（配列番号１３）をコードする塩基配列が含まれる。一方、軽鎖λ定常領域又は軽鎖κ定常領域をコードする塩基配列は、ＰＣＲ増幅産物中に含まれる。ベクター中のインサートＤＮＡは配列決定が行われた。
当該実施例により、２５９細胞から抗体の配列が得られた（抗体の配列情報は、後記実施例１２に開示される。）。
【0089】
実施例４ 組換え体抗体の製造及び精製
実施例３で得られた発現ベクターについて、Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてコトランスフェクションを行い、抗体のＨ鎖とＬ鎖を宿主細胞（ＨＥＫ２９３細胞）中で同時発現させ、組換え体抗体を製造した。手順は製造者のマニュアルに従った。７日間の培養後、培養上清を回収し、Ａｂ Ｃａｐｃｈｅｒ Ｍａｇ（Ｐｒｏｔｅｎｏｖａ）を用いて抗体を精製した。
当該実施例の結果として、２５６細胞分に由来する精製組換え体抗体が得られた。抗体作成成功効率は約７５％と非常に高率であった。
実施例３で得られた発現ベクターについて、Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてコトランスフェクションを行い、抗体のＨ鎖とＬ鎖を宿主細胞（ＨＥＫ２９３細胞）中で同時発現させ、組換え体抗体を製造した。手順は製造者のマニュアルに従った。７日間の培養後、培養上清を回収し、Ａｂ Ｃａｐｃｈｅｒ Ｍａｇ（Ｐｒｏｔｅｎｏｖａ）を用いて抗体を精製した。
当該実施例の結果として、２５６細胞分に由来する精製組換え体抗体が得られた。抗体作成成功効率は約７５％と非常に高率であった。
【0090】
実施例５ 抗体の反応性の検討
臨床検体に由来する抗体では、特に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の様な自己免疫疾患では、複数の抗原に結合するpolyreactiveな抗体が含まれることが知られている。そこで、まず精製された抗体の中にpolyreactiveな抗体が含まれるか、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）、インスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｄｓＤＮＡ（プラスミド）に対する反応を調べ、２つ以上に反応したものをpolyreactiveとして検討した。具体的には、これらの物質でコートしたマイクロタイタープレートを調製し、洗浄、ブロッキングの後に希釈した組換え体抗体と反応させた。反応後に洗浄し、ＨＲＰでコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）で反応させ、ＴＭＢを基質（ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｅｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））としたＥＬＩＳＡ法を実施した。
結果、２５６種類の抗体の中で、ＬＢ２０－３４、ＬＢ２０－８０、及びＬＢ２４－９の３種類のみがpolyreactiveであり、その余の抗体は非特異的な結合が見られなかった。
次にそれらの抗体の反応性を抗ＳＳ－Ａ５２抗体、抗ＳＳ－Ａ６０抗体、抗ＳＳ－Ｂ抗体のＥＬＩＳＡ（ＯＲＧＥＮＴＥＣ）を用いて調べた。さらに、立体構造を持ったタンパク質抗原との反応性を見るため、ビーズ上に固定した抗原タンパクに対する抗体の反応（Antigen-binding beads assay）も調べた。
当該実施例において、ＳＳ－Ａ５２及びＳＳ－Ｂは、それぞれＳＢＰタグ付きのリコンビナントタンパク質として調製し、使用した。また、ＳＳ－Ａ６０はビオチン化リコンビナントＳＳ－Ａ６０（ＤＩＡＲＥＣＴ社）を使用した。
ＥＬＩＳＡとビーズの反応性ではビーズの方が反応性が高く、ＳＳ－ＢはＥＬＩＳＡが陰性でもビーズ上のＳＳ－Ｂには結合する抗体を６種認めた。また、ＳＳ－Ａ６０はＥＬＩＳＡが陰性でもビーズ上のＳＳ－Ａ６０には結合する抗体を１５種認めた。ＥＬＩＳＡとビーズでどちらかで反応性が認められたものを陽性とみなした。ＳＳ－Ａ５２はＦｃレセプターであり、立体構造を持つＳＳ－Ａ５２には全ての抗体が結合するため、抗体の反応性の検討はできなかった。
ＳＳ－Ａ５２、ＳＳ－Ａ６０及びＳＳ－Ｂのうち複数に結合する抗体は、最も抗体価が高いものとしてカウントした。Polyreactiveな抗体のうち２つは３種の抗原全部に結合したため、最も抗体価が高かった抗ＳＳ－Ｂ抗体とした。
作成した組換え体抗体の中に含まれる自己抗体のプロファイル、患者の血清において認められた自己抗体のプロファイルをまとめ、コホート中の患者のプロファイルと共に解析したところ、血清抗ＳＳ－Ａ抗体陽性の患者のみから抗ＳＳ－Ａ抗体が、血清抗ＳＳ－Ｂ抗体陽性の患者のみから抗ＳＳ－Ｂ抗体が検出された。この結果は既報と矛盾しない。平均すると、抗ＳＳ－Ａ／ＳＳ－Ｂ抗体陽性患者の唾液腺中のＡＳＣのうち、２７％が抗ＳＳ－Ａ抗体／ＳＳ－Ｂ抗体を産生していた。
臨床検体に由来する抗体では、特に全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の様な自己免疫疾患では、複数の抗原に結合するpolyreactiveな抗体が含まれることが知られている。そこで、まず精製された抗体の中にpolyreactiveな抗体が含まれるか、ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）、インスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｄｓＤＮＡ（プラスミド）に対する反応を調べ、２つ以上に反応したものをpolyreactiveとして検討した。具体的には、これらの物質でコートしたマイクロタイタープレートを調製し、洗浄、ブロッキングの後に希釈した組換え体抗体と反応させた。反応後に洗浄し、ＨＲＰでコンジュゲートされた抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）で反応させ、ＴＭＢを基質（ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｅｔ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ））としたＥＬＩＳＡ法を実施した。
結果、２５６種類の抗体の中で、ＬＢ２０－３４、ＬＢ２０－８０、及びＬＢ２４－９の３種類のみがpolyreactiveであり、その余の抗体は非特異的な結合が見られなかった。
次にそれらの抗体の反応性を抗ＳＳ－Ａ５２抗体、抗ＳＳ－Ａ６０抗体、抗ＳＳ－Ｂ抗体のＥＬＩＳＡ（ＯＲＧＥＮＴＥＣ）を用いて調べた。さらに、立体構造を持ったタンパク質抗原との反応性を見るため、ビーズ上に固定した抗原タンパクに対する抗体の反応（Antigen-binding beads assay）も調べた。
当該実施例において、ＳＳ－Ａ５２及びＳＳ－Ｂは、それぞれＳＢＰタグ付きのリコンビナントタンパク質として調製し、使用した。また、ＳＳ－Ａ６０はビオチン化リコンビナントＳＳ－Ａ６０（ＤＩＡＲＥＣＴ社）を使用した。
ＥＬＩＳＡとビーズの反応性ではビーズの方が反応性が高く、ＳＳ－ＢはＥＬＩＳＡが陰性でもビーズ上のＳＳ－Ｂには結合する抗体を６種認めた。また、ＳＳ－Ａ６０はＥＬＩＳＡが陰性でもビーズ上のＳＳ－Ａ６０には結合する抗体を１５種認めた。ＥＬＩＳＡとビーズでどちらかで反応性が認められたものを陽性とみなした。ＳＳ－Ａ５２はＦｃレセプターであり、立体構造を持つＳＳ－Ａ５２には全ての抗体が結合するため、抗体の反応性の検討はできなかった。
ＳＳ－Ａ５２、ＳＳ－Ａ６０及びＳＳ－Ｂのうち複数に結合する抗体は、最も抗体価が高いものとしてカウントした。Polyreactiveな抗体のうち２つは３種の抗原全部に結合したため、最も抗体価が高かった抗ＳＳ－Ｂ抗体とした。
作成した組換え体抗体の中に含まれる自己抗体のプロファイル、患者の血清において認められた自己抗体のプロファイルをまとめ、コホート中の患者のプロファイルと共に解析したところ、血清抗ＳＳ－Ａ抗体陽性の患者のみから抗ＳＳ－Ａ抗体が、血清抗ＳＳ－Ｂ抗体陽性の患者のみから抗ＳＳ－Ｂ抗体が検出された。この結果は既報と矛盾しない。平均すると、抗ＳＳ－Ａ／ＳＳ－Ｂ抗体陽性患者の唾液腺中のＡＳＣのうち、２７％が抗ＳＳ－Ａ抗体／ＳＳ－Ｂ抗体を産生していた。
【0091】
実施例６ 血清セントロメア抗体陽性の患者由来の自己抗体の対応抗原の同定
実施例１で用いた９例からなるコホートには、血清中の抗ＳＳ－Ａ抗体／抗ＳＳ－Ｂ抗体陰性であるが、抗核抗体（ＡＮＡ）陽性かつ抗セントロメア（ＡＣＡ）抗体陽性（抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体陽性）の患者が１名（患者ＩＤ；ＬＢ３２）含まれていた。
ＳＳの疾患標識抗体は抗ＳＳ－Ａ抗体／抗ＳＳ－Ｂ抗体とされているが、一部のＳＳ患者では血清中で抗セントロメア抗体（ＡＣＡ）が陽性になる事が知られている。そこで、本発明者らはこの患者に着目し、ＡＣＡも唾液腺で作られているかを検討した。初めに代表的なＡＣＡ抗原であり、ＡＮＡ検査におけるＡＣＡと一致率も高い抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体に関して検討した。まずＥＬＩＳＡを用いて、ＬＢ３２から得られた抗体がＣＥＮＰ－Ｂ（ＯＲＧＥＮＴＥＣ）に反応するのかを調べたが、意外なことに、３９個の抗体は全てＣＥＮＰ－Ｂに反応しなかった。念のため、臨床で用いられている別の製造業者のＥＬＩＳＡ（ＭＢＬ）でも確認したが、同様に一つもＣＥＮＰ－Ｂと反応しなかった。
次にこれらの抗体が何に反応しているのかを調べるため、Ｋ５６２細胞溶解液及びＬＢ３２由来の組換え体抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行った。
その結果、３９個の抗体の一つであるＬＢ３２－８抗体でＩＰを行い、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥ及銀染色を行ったところ、銀染色で複数のバンドが得られた（図１右パネル）。これらのバンドを分離し、質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ，ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク同定を行ったところ、ＤＳＮ１、ＺＷＩＮＴ、ＮＳＬ１、ＰＭＦ１、ＭＩＳ１２及びＳＰＣ２４に由来するペプチド断片が検出された（図１）。これらは、いずれもＫＭＮアッセンブリーを構成するタンパク質であって、ＫＭＮアッセンブリーはＭＩＳ１２複合体、ＫＮＬ１複合体、ＮＤＣ８０複合体の３つの複合体からなる事が知られている。ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１はＭＩＳ１２複合体の構成要素であり、ＺＷＩＮＴはＫＮＬ１複合体の構成要素であり、ＳＰＣ２４はＮＤＣ８０複合体の構成要素である。前記質量分析法で同定されたタンパク質について検討すると、ＫＮＬ１複合体及びＮＤＣ８０複合体は、いずれも複合体の構成要素の一つのみが同定されたのに対し、ＭＩＳ１２複合体は４種類の全ての構成要素が同定されていた。
そこで、抗ＤＳＮ１抗体（バイオアカデミア社、大阪）、抗ＭＩＳ１２抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、及び抗ＭＩＳ１２複合体ウサギ抗体（ＡＢＥ２５８５，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を用いて、前記ＩＰで得られたサンプル、およびＬＢ３２由来の複数の抗体を用いて同様にＩＰして得られたサンプルについてウエスタンブロット解析を行った（図２）。
その結果、ＬＢ３２由来の抗体のうち、ＬＢ３２－８、ＬＢ３２－９、ＬＢ３２－１０、ＬＢ３２－１４、ＬＢ３２－１７、ＬＢ３２－１９、ＬＢ３２－２０、ＬＢ３２－２１、及びＬＢ３２－３２の１０種類の抗体は、いずれもＤＳＮ１、ＮＳＬ１、及びＰＭＦ１及びＭＩＳ１２と特異的な反応性を示した（図２の上３段のパネル）。これにより、ＬＢ３２の患者由来の生検サンプルには、ＭＩＳ１２複合体を内因性抗原とする自己抗体を分泌するＡＳＣが存在し、抗ＭＩＳ１２複合体抗体が陽性となっていると考えられた。これまで、自己免疫疾患におけるＡＣＡとして抗ＭＩＳ１２複合体抗体が報告されたことはなく、新規な抗セントロメア抗体が見出されたことになる。
実施例１で用いた９例からなるコホートには、血清中の抗ＳＳ－Ａ抗体／抗ＳＳ－Ｂ抗体陰性であるが、抗核抗体（ＡＮＡ）陽性かつ抗セントロメア（ＡＣＡ）抗体陽性（抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体陽性）の患者が１名（患者ＩＤ；ＬＢ３２）含まれていた。
ＳＳの疾患標識抗体は抗ＳＳ－Ａ抗体／抗ＳＳ－Ｂ抗体とされているが、一部のＳＳ患者では血清中で抗セントロメア抗体（ＡＣＡ）が陽性になる事が知られている。そこで、本発明者らはこの患者に着目し、ＡＣＡも唾液腺で作られているかを検討した。初めに代表的なＡＣＡ抗原であり、ＡＮＡ検査におけるＡＣＡと一致率も高い抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体に関して検討した。まずＥＬＩＳＡを用いて、ＬＢ３２から得られた抗体がＣＥＮＰ－Ｂ（ＯＲＧＥＮＴＥＣ）に反応するのかを調べたが、意外なことに、３９個の抗体は全てＣＥＮＰ－Ｂに反応しなかった。念のため、臨床で用いられている別の製造業者のＥＬＩＳＡ（ＭＢＬ）でも確認したが、同様に一つもＣＥＮＰ－Ｂと反応しなかった。
次にこれらの抗体が何に反応しているのかを調べるため、Ｋ５６２細胞溶解液及びＬＢ３２由来の組換え体抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）を行った。
その結果、３９個の抗体の一つであるＬＢ３２－８抗体でＩＰを行い、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥ及銀染色を行ったところ、銀染色で複数のバンドが得られた（図１右パネル）。これらのバンドを分離し、質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ，ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてタンパク同定を行ったところ、ＤＳＮ１、ＺＷＩＮＴ、ＮＳＬ１、ＰＭＦ１、ＭＩＳ１２及びＳＰＣ２４に由来するペプチド断片が検出された（図１）。これらは、いずれもＫＭＮアッセンブリーを構成するタンパク質であって、ＫＭＮアッセンブリーはＭＩＳ１２複合体、ＫＮＬ１複合体、ＮＤＣ８０複合体の３つの複合体からなる事が知られている。ＤＳＮ１、ＭＩＳ１２、ＮＳＬ１及びＰＭＦ１はＭＩＳ１２複合体の構成要素であり、ＺＷＩＮＴはＫＮＬ１複合体の構成要素であり、ＳＰＣ２４はＮＤＣ８０複合体の構成要素である。前記質量分析法で同定されたタンパク質について検討すると、ＫＮＬ１複合体及びＮＤＣ８０複合体は、いずれも複合体の構成要素の一つのみが同定されたのに対し、ＭＩＳ１２複合体は４種類の全ての構成要素が同定されていた。
そこで、抗ＤＳＮ１抗体（バイオアカデミア社、大阪）、抗ＭＩＳ１２抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、及び抗ＭＩＳ１２複合体ウサギ抗体（ＡＢＥ２５８５，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を用いて、前記ＩＰで得られたサンプル、およびＬＢ３２由来の複数の抗体を用いて同様にＩＰして得られたサンプルについてウエスタンブロット解析を行った（図２）。
その結果、ＬＢ３２由来の抗体のうち、ＬＢ３２－８、ＬＢ３２－９、ＬＢ３２－１０、ＬＢ３２－１４、ＬＢ３２－１７、ＬＢ３２－１９、ＬＢ３２－２０、ＬＢ３２－２１、及びＬＢ３２－３２の１０種類の抗体は、いずれもＤＳＮ１、ＮＳＬ１、及びＰＭＦ１及びＭＩＳ１２と特異的な反応性を示した（図２の上３段のパネル）。これにより、ＬＢ３２の患者由来の生検サンプルには、ＭＩＳ１２複合体を内因性抗原とする自己抗体を分泌するＡＳＣが存在し、抗ＭＩＳ１２複合体抗体が陽性となっていると考えられた。これまで、自己免疫疾患におけるＡＣＡとして抗ＭＩＳ１２複合体抗体が報告されたことはなく、新規な抗セントロメア抗体が見出されたことになる。
【0092】
実施例７ 自己抗体の免疫組織化学的検出
実施例６に続いて、抗セントロメア抗体検査で陽性を示した患者（ＬＢ３２）から得られた唾液腺の生検試料を用いて、自己抗体の免疫組織化学的検出を試みた。
生検組織からクライオスタットを用いて４μｍ厚の凍結切片を作成し、アセトンで固定した。続いてＢＳＡ入りのＰＢＳでブロッキングした後、切片にＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、ＣＥＮＰ－Ｃ、ＭＩＳ－１２複合体、ＣＢＸ５又は抗ＣＤ１３８マウス抗体を加え、インキュベートした（ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、ＣＥＮＰ－Ｃ、ＭＩＳ－１２複合体及びＣＢＸ－５は、いずれもＳＢＰ－ＧＦＰタグを融合させた組換え体タンパク質として調製し、使用した。）。洗浄後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４－結合抗マウスＩｇＧ抗体を加えてインキュベートし、次いで洗浄した。
ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、ＣＥＮＰ－Ｃ、ＭＩＳ－１２複合体、及びＣＢＸ５に対する自己抗体の存在をＧＦＰ蛍光により、ＣＤ１３８の存在をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４由来の蛍光により、それぞれ検出を試みた。
その結果、抗ＣＥＮＰ－Ａ抗体、抗ＣＥＮＰ－Ｃ抗体及び抗ＭＩＳ－１２複合体抗体の存在を示すＧＦＰの蛍光シグナルは、組織中の同一の領域で認められた。また、当該領域には、抗体分泌細胞のマーカーであるＣＤ１３８の存在も認められた（結果は図示せず）。これにより、自己免疫疾患患者又は自己免疫疾患疑い例の患者に由来する組織を試料とした免疫組織化学的試験により、抗ＭＩＳ１２複合体抗体、抗ＣＥＮＰ－Ａ抗体、抗ＣＥＮＰ－Ｃ抗体といった自己抗体の発現を確認できることが明らかとなった。すなわち、ＭＩＳ１２複合体等が、自己免疫疾患の検出及び／又は分類用の検出剤として利用できることが確認された。
なお、上記ＬＢ３２由来の唾液腺組織を用いた検出試験においては、抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体及び抗ＣＢＸ５抗体の存在を示す明確なシグナルは認められなかった。
実施例６に続いて、抗セントロメア抗体検査で陽性を示した患者（ＬＢ３２）から得られた唾液腺の生検試料を用いて、自己抗体の免疫組織化学的検出を試みた。
生検組織からクライオスタットを用いて４μｍ厚の凍結切片を作成し、アセトンで固定した。続いてＢＳＡ入りのＰＢＳでブロッキングした後、切片にＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、ＣＥＮＰ－Ｃ、ＭＩＳ－１２複合体、ＣＢＸ５又は抗ＣＤ１３８マウス抗体を加え、インキュベートした（ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、ＣＥＮＰ－Ｃ、ＭＩＳ－１２複合体及びＣＢＸ－５は、いずれもＳＢＰ－ＧＦＰタグを融合させた組換え体タンパク質として調製し、使用した。）。洗浄後、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４－結合抗マウスＩｇＧ抗体を加えてインキュベートし、次いで洗浄した。
ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、ＣＥＮＰ－Ｃ、ＭＩＳ－１２複合体、及びＣＢＸ５に対する自己抗体の存在をＧＦＰ蛍光により、ＣＤ１３８の存在をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４由来の蛍光により、それぞれ検出を試みた。
その結果、抗ＣＥＮＰ－Ａ抗体、抗ＣＥＮＰ－Ｃ抗体及び抗ＭＩＳ－１２複合体抗体の存在を示すＧＦＰの蛍光シグナルは、組織中の同一の領域で認められた。また、当該領域には、抗体分泌細胞のマーカーであるＣＤ１３８の存在も認められた（結果は図示せず）。これにより、自己免疫疾患患者又は自己免疫疾患疑い例の患者に由来する組織を試料とした免疫組織化学的試験により、抗ＭＩＳ１２複合体抗体、抗ＣＥＮＰ－Ａ抗体、抗ＣＥＮＰ－Ｃ抗体といった自己抗体の発現を確認できることが明らかとなった。すなわち、ＭＩＳ１２複合体等が、自己免疫疾患の検出及び／又は分類用の検出剤として利用できることが確認された。
なお、上記ＬＢ３２由来の唾液腺組織を用いた検出試験においては、抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体及び抗ＣＢＸ５抗体の存在を示す明確なシグナルは認められなかった。
【0093】
実施例８ フローサイトメトリーによる抗原－抗体特異性の解析［１］
前記実施例６を受けて、抗体の特異性に関する検討をさらに行った。組換え体タンパク質であるＧＦＰ（陰性対照）、ＳＰＣ２４、ＳＰＣ２５、ＺＷＩＮＴ、ＮＵＦ２、ＤＳＮ１、ＮＳＬ１、ＭＩＳ１２、及びＰＭＦ１をＨＥＫ２９３細胞中で発現させてビーズに結合し、それぞれをＬＢ３２－８抗体、ＬＢ３２－９抗体又はＬＢ３２－２０抗体と反応させ、フローサイトメトリーで解析した（図３）。また、ＬＢ３２由来の抗体ではなく、抗ヒトＩｇＧ１抗体を用いた対照の解析も併せて行った（図３左端パネル）。その結果、ＳＰＣ２４、ＳＰＣ２５、ＺＷＩＮＴ、及びＮＵＦ２は、いずれのＬＢ３２由来の抗体とも全く反応性を示さなかった（図３上パネル）。一方、ＤＳＮ１、ＮＳＬ１、ＭＩＳ１２、及びＰＭＦ１は、いずれも僅かな反応性を示した（図３下パネルの中央４段）。モノクローナル抗体であるＬＢ３２－８抗体、ＬＢ３２－９抗体及びＬＢ３２－２０抗体が、ＭＩＳ１２複合体の構成要素である４つのタンパク質のそれぞれと反応性を示すことは考えにくいので、組換え体タンパク質であるＭＩＳ１２複合体の一構成要素が、宿主ＨＥＫ２９３細胞の内生である他の三構成要素と共にＭＩＳ１２複合体を構成しており、当該ＭＩＳ１２複合体がＬＢ３２－８抗体、ＬＢ３２－９抗体及びＬＢ３２－２０抗体と反応性を示す可能性が考えられた。そこで、ＭＩＳ１２複合体の全ての構成要素が同時発現するようにコトランスフェクションを行い、組換え体タンパク質によってＭＩＳ１２複合体を発現させたところ、ＬＢ３２－８抗体、ＬＢ３２－９抗体及びＬＢ３２－２０抗体との反応性は顕著に増大した（図３下パネル最下段）。これにより、ＬＢ３２の患者由来の生検サンプルには、ＭＩＳ１２複合体を内因性抗原とする自己抗体を分泌するＡＳＣが存在し、抗ＭＩＳ１２複合体抗体が陽性となっていることが確認された。
さらに、ＬＢ３２－９抗体、及びＬＢ３２－２０抗体を用いて抗核抗体検査を行ったところ、いずれの抗体を用いた場合でもdiscrete speckled型で陽性反応が確認された（データは示さず）。
前記実施例６を受けて、抗体の特異性に関する検討をさらに行った。組換え体タンパク質であるＧＦＰ（陰性対照）、ＳＰＣ２４、ＳＰＣ２５、ＺＷＩＮＴ、ＮＵＦ２、ＤＳＮ１、ＮＳＬ１、ＭＩＳ１２、及びＰＭＦ１をＨＥＫ２９３細胞中で発現させてビーズに結合し、それぞれをＬＢ３２－８抗体、ＬＢ３２－９抗体又はＬＢ３２－２０抗体と反応させ、フローサイトメトリーで解析した（図３）。また、ＬＢ３２由来の抗体ではなく、抗ヒトＩｇＧ１抗体を用いた対照の解析も併せて行った（図３左端パネル）。その結果、ＳＰＣ２４、ＳＰＣ２５、ＺＷＩＮＴ、及びＮＵＦ２は、いずれのＬＢ３２由来の抗体とも全く反応性を示さなかった（図３上パネル）。一方、ＤＳＮ１、ＮＳＬ１、ＭＩＳ１２、及びＰＭＦ１は、いずれも僅かな反応性を示した（図３下パネルの中央４段）。モノクローナル抗体であるＬＢ３２－８抗体、ＬＢ３２－９抗体及びＬＢ３２－２０抗体が、ＭＩＳ１２複合体の構成要素である４つのタンパク質のそれぞれと反応性を示すことは考えにくいので、組換え体タンパク質であるＭＩＳ１２複合体の一構成要素が、宿主ＨＥＫ２９３細胞の内生である他の三構成要素と共にＭＩＳ１２複合体を構成しており、当該ＭＩＳ１２複合体がＬＢ３２－８抗体、ＬＢ３２－９抗体及びＬＢ３２－２０抗体と反応性を示す可能性が考えられた。そこで、ＭＩＳ１２複合体の全ての構成要素が同時発現するようにコトランスフェクションを行い、組換え体タンパク質によってＭＩＳ１２複合体を発現させたところ、ＬＢ３２－８抗体、ＬＢ３２－９抗体及びＬＢ３２－２０抗体との反応性は顕著に増大した（図３下パネル最下段）。これにより、ＬＢ３２の患者由来の生検サンプルには、ＭＩＳ１２複合体を内因性抗原とする自己抗体を分泌するＡＳＣが存在し、抗ＭＩＳ１２複合体抗体が陽性となっていることが確認された。
さらに、ＬＢ３２－９抗体、及びＬＢ３２－２０抗体を用いて抗核抗体検査を行ったところ、いずれの抗体を用いた場合でもdiscrete speckled型で陽性反応が確認された（データは示さず）。
【0094】
実施例９ フローサイトメトリーによる抗原－抗体特異性の解析［２］
前記実施例の、フローサイトメトリーによる抗原－抗体特異性の解析をさらに行った。
ＭＩＳ１２複合体は、ＭＩＳ１２－ＰＭＦ１からなるサブコンプレックスと、ＤＳＮ１－ＮＳＬ１からなるサブコンプレックスとで構成されることが知られている。そこで、ＭＩＳ１２とＰＭＦ１との組合せ、ＤＳＮ１とＮＳＬ１との組合せ、又は全４構成要素の組合せが発現するよう、ＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクションを行い、ＬＢ３２由来の抗体との反応性を前記実施例と同様に解析した。
結果の一部を図４Ａ及び図４Ｂに示す。図４Ａに示されるように、ＤＳＮ１－ＮＳＬ１からなるサブコンプレックスと反応性を示す抗体（ＬＢ３２－１４）やＭＩＳ１２－ＰＭＦ１からなるサブコンプレックスと反応性を示す抗体（ＬＢ３２－３２）が見出された一方、ＭＩＳ１２複合体全体にのみ特異的な反応性を示し、いずれのサブコンプレックスとも実質的な反応性を示さなかった抗体（図４ＡにおいてＬＢ３２－８、図４ＢにおいてＬＢ３２－８、ＬＢ３２－１０、及びＬＢ３２－１９）が見出された。
以上の結果から、複合体中の多様な部位を認識する多様な抗体が存在していることが明らかとなった。
前記実施例の、フローサイトメトリーによる抗原－抗体特異性の解析をさらに行った。
ＭＩＳ１２複合体は、ＭＩＳ１２－ＰＭＦ１からなるサブコンプレックスと、ＤＳＮ１－ＮＳＬ１からなるサブコンプレックスとで構成されることが知られている。そこで、ＭＩＳ１２とＰＭＦ１との組合せ、ＤＳＮ１とＮＳＬ１との組合せ、又は全４構成要素の組合せが発現するよう、ＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクションを行い、ＬＢ３２由来の抗体との反応性を前記実施例と同様に解析した。
結果の一部を図４Ａ及び図４Ｂに示す。図４Ａに示されるように、ＤＳＮ１－ＮＳＬ１からなるサブコンプレックスと反応性を示す抗体（ＬＢ３２－１４）やＭＩＳ１２－ＰＭＦ１からなるサブコンプレックスと反応性を示す抗体（ＬＢ３２－３２）が見出された一方、ＭＩＳ１２複合体全体にのみ特異的な反応性を示し、いずれのサブコンプレックスとも実質的な反応性を示さなかった抗体（図４ＡにおいてＬＢ３２－８、図４ＢにおいてＬＢ３２－８、ＬＢ３２－１０、及びＬＢ３２－１９）が見出された。
以上の結果から、複合体中の多様な部位を認識する多様な抗体が存在していることが明らかとなった。
【0095】
実施例１０ 血清中の抗セントロメア抗体プロファイルの解析
様々なセントロメア関連タンパク質のそれぞれについて、当該セントロメア関連タンパク質に対する抗体が血清中に検出できるか、解析を行った。セントロメア関連タンパク質としては、ＭＩＳ１２複合体、ＣＢＸ５、ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、及びＣＥＮＰ－Ｃを対象とした。サンプルは、１１２名の乾燥症候群を示すＳＳ疑い例（ＳＳ）、３５名のＳＳｃ患者（ＳＳｃ）、１０名のＰＢＣ患者（ＰＢＣ）、及び、４４名のＳＳ、ＳＳｃ及びＰＢＣの合併症（左記のうち２以上の疾患が合併している）患者（ＯＬ）、並びに、６８名の健常者（ＨＣ）のコホートから得られた血清が使用された。抗原に対する反応性を、抗原結合ビーズアッセイで評価し、血清中にＭＩＳ１２複合体、ＣＢＸ５、ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ及びＣＥＮＰ－Ｃのそれぞれに特異的な抗体（ＩｇＧ抗体）が存在するかどうか検査した。
ＭＩＳ１２複合体に関する結果を図５に示す。
図中の各プロットはコホート中の個々の患者の結果に対応し、図の下の数値は各コホート中でカットオフ値以上の反応性が認められた陽性率（％）を示す。
図５に示されるとおり、ＭＩＳ１２複合体に対して特異的な抗体の陽性率は、ＨＣで０％、ＳＳで１９％、ＳＳｃで５４％、ＰＢＣで４０％、ＯＬで８２％であった。ＭＩＳ１２複合体に対する自己抗体は、ＨＣで全く認められない一方、discrete speckled型の抗核抗体陽性が特徴として知られる疾患であるＳＳ、ＳＳｃ及びＰＢＣではいずれも検出された。また、合併症患者では特に高い率で自己抗体の存在が認められた。これにより、ＭＩＳ１２複合体に対する自己抗体陽性が、自己免疫疾患の新たな特徴点であることが示された。
一方、抗ＣＢＸ５抗体の陽性率は、７％（ＨＣ）、４５％（ＳＳ）、４０％（ＳＳｃ）、１０％（ＰＢＣ）、及び６６％（ＯＬ）であり、抗ＣＥＮＰ－Ａ抗体の陽性率は、０％（ＨＣ）、１８％（ＳＳ）、３４％（ＳＳｃ）、３０％（ＰＢＣ）、及び６４％（ＯＬ）であり、抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体の陽性率は、０％（ＨＣ）、１３％（ＳＳ）、３４％（ＳＳｃ）、３０％（ＰＢＣ）、及び７３％（ＯＬ）であり、抗ＣＥＮＰ－Ｃ抗体の陽性率は、４％（ＨＣ）、１７％（ＳＳ）、２９％（ＳＳｃ）、６０％（ＰＢＣ）、及び７０％（ＯＬ）であった（結果はいずれも図示せず）。
様々なセントロメア関連タンパク質のそれぞれについて、当該セントロメア関連タンパク質に対する抗体が血清中に検出できるか、解析を行った。セントロメア関連タンパク質としては、ＭＩＳ１２複合体、ＣＢＸ５、ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ、及びＣＥＮＰ－Ｃを対象とした。サンプルは、１１２名の乾燥症候群を示すＳＳ疑い例（ＳＳ）、３５名のＳＳｃ患者（ＳＳｃ）、１０名のＰＢＣ患者（ＰＢＣ）、及び、４４名のＳＳ、ＳＳｃ及びＰＢＣの合併症（左記のうち２以上の疾患が合併している）患者（ＯＬ）、並びに、６８名の健常者（ＨＣ）のコホートから得られた血清が使用された。抗原に対する反応性を、抗原結合ビーズアッセイで評価し、血清中にＭＩＳ１２複合体、ＣＢＸ５、ＣＥＮＰ－Ａ、ＣＥＮＰ－Ｂ及びＣＥＮＰ－Ｃのそれぞれに特異的な抗体（ＩｇＧ抗体）が存在するかどうか検査した。
ＭＩＳ１２複合体に関する結果を図５に示す。
図中の各プロットはコホート中の個々の患者の結果に対応し、図の下の数値は各コホート中でカットオフ値以上の反応性が認められた陽性率（％）を示す。
図５に示されるとおり、ＭＩＳ１２複合体に対して特異的な抗体の陽性率は、ＨＣで０％、ＳＳで１９％、ＳＳｃで５４％、ＰＢＣで４０％、ＯＬで８２％であった。ＭＩＳ１２複合体に対する自己抗体は、ＨＣで全く認められない一方、discrete speckled型の抗核抗体陽性が特徴として知られる疾患であるＳＳ、ＳＳｃ及びＰＢＣではいずれも検出された。また、合併症患者では特に高い率で自己抗体の存在が認められた。これにより、ＭＩＳ１２複合体に対する自己抗体陽性が、自己免疫疾患の新たな特徴点であることが示された。
一方、抗ＣＢＸ５抗体の陽性率は、７％（ＨＣ）、４５％（ＳＳ）、４０％（ＳＳｃ）、１０％（ＰＢＣ）、及び６６％（ＯＬ）であり、抗ＣＥＮＰ－Ａ抗体の陽性率は、０％（ＨＣ）、１８％（ＳＳ）、３４％（ＳＳｃ）、３０％（ＰＢＣ）、及び６４％（ＯＬ）であり、抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体の陽性率は、０％（ＨＣ）、１３％（ＳＳ）、３４％（ＳＳｃ）、３０％（ＰＢＣ）、及び７３％（ＯＬ）であり、抗ＣＥＮＰ－Ｃ抗体の陽性率は、４％（ＨＣ）、１７％（ＳＳ）、２９％（ＳＳｃ）、６０％（ＰＢＣ）、及び７０％（ＯＬ）であった（結果はいずれも図示せず）。
【0096】
実施例１１ 抗セントロメア抗体検査間の結果の一致性についての解析
抗核抗体検査、ＥＬＩＳＡ法による抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体検査、及び抗原結合ビーズアッセイによる抗ＭＩＳ１２複合体抗体検査の間でどのぐらい結果が一致するか（裏返せば、検査結果間にどれ程の乖離が認められるか）解析を行った。
結果を図６（ベン図）に示す。
図中の数字は患者数を示す。最も多くのケース（５７名）で３種類の検査結果は一致していたものの、２１名の患者は抗ＭＩＳ１２複合体抗体検査でのみ陽性を示すことが明らかとなった。
以上の結果から、自己免疫疾患の検出において、ＭＩＳ１２複合体を内因性抗原とする抗ＭＩＳ１２複合体抗体の存否についての自己抗体検査を行うことが有用であることが示された。
抗核抗体検査、ＥＬＩＳＡ法による抗ＣＥＮＰ－Ｂ抗体検査、及び抗原結合ビーズアッセイによる抗ＭＩＳ１２複合体抗体検査の間でどのぐらい結果が一致するか（裏返せば、検査結果間にどれ程の乖離が認められるか）解析を行った。
結果を図６（ベン図）に示す。
図中の数字は患者数を示す。最も多くのケース（５７名）で３種類の検査結果は一致していたものの、２１名の患者は抗ＭＩＳ１２複合体抗体検査でのみ陽性を示すことが明らかとなった。
以上の結果から、自己免疫疾患の検出において、ＭＩＳ１２複合体を内因性抗原とする抗ＭＩＳ１２複合体抗体の存否についての自己抗体検査を行うことが有用であることが示された。
【0097】
実施例１２ ＭＩＳ１２複合体を認識する抗体の配列解析
実施例６に示される、ＭＩＳ１２複合体を認識する５種類の抗体（ＬＢ３２－８、ＬＢ３２－１０、ＬＢ３２－１９、ＬＢ３２－１４及びＬＢ３２－３２）のそれぞれについて、重鎖及び軽鎖の配列解析を行った。
結果を以下の表に示す。
実施例６に示される、ＭＩＳ１２複合体を認識する５種類の抗体（ＬＢ３２－８、ＬＢ３２－１０、ＬＢ３２－１９、ＬＢ３２－１４及びＬＢ３２－３２）のそれぞれについて、重鎖及び軽鎖の配列解析を行った。
結果を以下の表に示す。
【0098】
【表1】
【0099】
【表2】
【0100】
【表3】
【0101】
【表4】
【0102】
【表5】
【0103】
【表6】
【0104】
上記に示される重鎖全長配列、軽鎖全長配列、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、いずれも分泌シグナルとなるシグナル配列を含んでいない。よって、これらの重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を含む抗体分子は、基本的に非分泌型のタンパク質となる。しかしながら、例えば、これらＬＢ３２由来の抗体をクローニングした発現ベクターに含まれるシグナルペプチド（配列番号１３）をコードする塩基配列を用い、当該塩基配列の下流に抗体遺伝子（重鎖及び軽鎖遺伝子）をインフレームで挿入した融合遺伝子から組換え体を発現させることにより、抗体タンパク質は、分泌型の抗体として適宜調製することもできる。
【産業上の利用可能性】
【0105】
本発明は、病態の理解が十分でない自己免疫疾患の分野において、シェーグレン症候群、全身性強皮症、及び原発性胆汁性胆管炎を含む自己免疫疾患に対する新たな検出剤としてＭＩＳ１２複合体を提供するものである。また、当該検出剤を利用した自己免疫疾患の検出及び／又は分類方法、並びに当該方法のための組成物やキットを提供するものである。本発明によれば、自己免疫疾患の病態に新たな理解が与えられると共に、新規な臨床検査が可能となるので、本発明は医学分野において有用であり、特に臨床検査の分野に有用であって、産業上の利用可能性を有している。また、本発明によって提供される、ＭＩＳ１２複合体の立体構造を特異的に認識する抗体は、ＭＩＳ１２複合体の生化学的解析や免疫化学的解析等を行う上で有用であるから、産業上の利用可能性を有している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【配列表】