特許 7356224 アデノウイルスの熱不活性化の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-26

(45)【発行日】2023-10-04

(54)【発明の名称】アデノウイルスの熱不活性化の方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/04 20060101AFI20230927BHJP

   C12N 15/864 20060101ALN20230927BHJP

【ＦＩ】

C12N7/04

C12N15/864 100Z

【請求項の数】 20

(21)【出願番号】P 2018550814

(86)(22)【出願日】2017-03-28

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-04-11

(86)【国際出願番号】 US2017024545

(87)【国際公開番号】W WO2017172772

(87)【国際公開日】2017-10-05

【審査請求日】2020-03-12

【審判番号】

【審判請求日】2022-05-19

(31)【優先権主張番号】62/314,116

(32)【優先日】2016-03-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】513252910

【氏名又は名称】ウルトラジェニックス ファーマシューティカル インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】モリソン， クリストファー ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】マラット， ジェイムズ ディー．

【合議体】

【審判長】福井 悟

【審判官】上條 肇

【審判官】吉森 晃

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５２９９１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許第５６８８６７６（ＵＳ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

C12N 7/00 - 7/08

C12N 15/00 - 15/90

ＣＡＰｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＤＸ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヘルパーウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、および緩衝液を含有する試料中のヘルパーウイルスを不活性化する方法であって、
該試料を、１分から６時間の間、４５℃を超えるまたはそれに等しい温度まで加熱すること
を含み、該緩衝液が、２５ｍＭ～５００ｍＭの濃度の二価カチオンを含む、方法。

【請求項2】

前記試料が、４５℃から６５℃の間、４５℃から６０℃の間、４５℃から５５℃の間、４７℃から５３℃の間の温度まで、または４８℃もしくは４９℃の温度まで加熱される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記試料が、１０分から１８０分の間、２０分から１８０分の間、２０分から６０分の間、または２０分から４０分の間の期間、前記温度に維持される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

３．７またはそれを超えるヘルパーウイルスの対数減少をもたらす、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記アデノ随伴ウイルス粒子が、４．７ｋｂを超えるＤＮＡ、およそ５．１ｋｂのＤＮＡ、およそ４．７ｋｂのＤＮＡ、４．０ｋｂ未満のＤＮＡ、またはおよそ３．０ｋｂのＤＮＡのゲノムを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記アデノ随伴ウイルス粒子が、実質的に自己相補性であるゲノムを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記緩衝液が、カオトロピック塩をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記カオトロピック塩が、尿素の塩またはグアニジンの塩である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記緩衝液が、グリセロール、プロピレングリコール、および１，６－ヘキサンジオールを含む群から選択されるポリオールをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記緩衝液が、４℃から７０℃の間の温度においてｐＨを３．０から１０．０の間または７．０から９．０の間に維持する、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記緩衝液が、４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記緩衝液が、トリス緩衝液、リン酸緩衝液またはトリアゾールアミン緩衝液である、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記ヘルパーウイルスが、アデノウイルスである、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

アデノウイルスが、Ａｄ５である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

二価カチオンの前記濃度が、５０ｍＭを超える、１００ｍＭを超える、２００ｍＭを超える、３０ｍＭ～３００ｍＭである、５０ｍＭ～２５０ｍＭである、または７０ｍＭ～２００ｍＭである、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記緩衝液が、２５ｍＭ～５００ｍＭの濃度の、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｃｕ^２＋およびＣｒ^２＋からなる群から選択される金属の二価カチオンを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記カチオンが、Ｍｇ^２＋である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記緩衝液が、１０ｍＭまたはそれを超える濃度の、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、および塩化セシウムを含む群から選択されるコスモトロピック塩をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項19】

前記緩衝液が、１０ｍＭまたはそれを超える濃度の硫酸アンモニウムを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

コスモトロピック塩の前記濃度が、０．１Ｍ～１Ｍ、０．２Ｍ～０．８Ｍ、０．３Ｍ～０．７Ｍ、０．４Ｍ～０．６Ｍまたは０．５Ｍである、請求項１８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互参照
本出願は、２０１６年３月２８日に出願され、「アデノウイルスの熱不活性化の方法」という表題である米国仮特許出願第６２／３１４，１１６号に対する優先権および利益を主張すし、その全開示が本明細書に参考として援用される。

【背景技術】

【0002】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、非病原性の複製欠損パルボウイルスである。ＡＡＶベクターは、それらを遺伝子治療のためのベクターとして魅力的なものとする多くの独特の特徴を有する。特に、ＡＡＶベクターは、分裂細胞および非分裂細胞に治療遺伝子を送達することができ、これらの遺伝子は、標的細胞のゲノムに組み込まれることなく、長期間存続することができる。しかしながら、ＡＡＶベクターを産生するためには、ヘルパーウイルス機能が、時にはアデノウイルス（ＡＶ）などの活性感染性ウイルスの形態で提供されなければならない。治療用ＡＡＶベクターを単離するためのＡＡＶベクター精製プロセスの間、ヘルパーウイルス粒子は不活性化されなければならない。しかしながら、ヘルパーウイルス不活性化の一般的方法、例えば、熱不活性化は、ＡＡＶベクターゲノムの破壊または分解ももたらし、不活性化プロセスから回収されうるＡＡＶベクターの質および量を減少させうる。これは、より大きなＡＡＶベクターゲノムについては特に当てはまる。したがって、ヘルパーウイルスの熱不活性化の間にＡＡＶベクターの完全性を保護する方法を開発することが当分野において必要である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本開示は、一般に、熱不活性化の間に、ＡＡＶ粒子およびヘルパーウイルス粒子の両方を含有する試料中のＡＡＶウイルス粒子のゲノムの完全性および／または生物学的活性を保護する方法に関する。これらの方法は、一般に、ＡＡＶ粒子に対するその効果よりも大きな効果をヘルパーウイルス粒子に対して有することにより、ヘルパーウイルス粒子の選択的不活性化を可能とする。方法は、ヘルパーウイルス粒子、ＡＡＶ粒子および緩衝液を含有する試料を、４５℃を超えるまたはそれに等しい温度まで加熱することを含む。緩衝液は、１０ｍＭもしくはそれを超える濃度のコスモトロピック塩および／または１０ｍＭもしくはそれを超える濃度の二価もしくは三価カチオンを含む。

【0004】

方法は、４５℃を超えるまたはそれに等しい、４６℃を超えるまたはそれに等しい、４７℃を超えるまたはそれに等しい、４８℃を超えるまたはそれに等しい、４９℃を超えるまたはそれに等しい、５０℃を超えるまたはそれに等しい、または５１℃を超えるまたはそれに等しい温度まで試料を加熱することを含む。ある特定の実施形態では、試料は、４５℃から６５℃の間、４５℃から６０℃の間、４５℃から５５℃の間、４７℃から５３℃の間、４８℃から５１℃の間または４８℃から５０℃の間の温度まで加熱される。例えば、ある特定の実施形態では、試料は、４８℃から５０℃の間まで、あるいは４８℃または４９℃まで加熱される。

【0005】

試料が加熱される間の期間は変動しうる。例えば、ある特定の実施形態では、試料は、１分から６時間の間、例えば、１０から１８０分の間、２０から１８０分の間、２０から６０分の間または２０から４０分の間の期間、標的温度に加熱される。一般に、より高い温度またはヘルパーウイルス粒子の不活性化を促進する他の条件が、比較的短い加熱時間とともに使用され、逆もまたしかりである。

【0006】

一部の方法では、１０ｍＭまたはそれを超える濃度の二価または三価金属カチオンを含有する緩衝液が使用される。例示的なカチオンには、以下の金属：Ｍｇ、Ｃａ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｃｏ、Ｓｒ、Ｃｕ、Ｃｒ、ＦｅおよびＳｃが含まれ、これらは、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｃｒ^２＋およびＳｃ^３＋などのカチオンを形成する。ある特定の実施形態では、緩衝液は、１０ｍＭまたはそれを超える濃度のＭｇ^２＋および／またはＣａ^２＋を含む。

【0007】

１０ｍＭまたはそれを超える濃度の二価または三価金属カチオンを含有するこれらの緩衝液のサブセットにおいて、濃度は１５ｍＭを超える。例えば、カチオンの濃度は、２０ｍＭを超える、５０ｍＭを超える、１００ｍＭを超える、または２００ｍＭを超えうる。１０ｍＭまたはそれを超える濃度の二価または三価金属カチオンを含有する緩衝液の別のサブセットにおいて、濃度は、１０ｍＭから５００ｍＭである。例えば、カチオンの濃度は、２０ｍＭ～４００ｍＭ、３０ｍＭ～３００ｍＭ、５０ｍＭ～２５０ｍＭ、７０ｍＭ～２００ｍＭ、または５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭもしくは２００ｍＭの濃度でありうる。

【0008】

一部の方法では、１０ｍＭまたはそれを超える濃度のコスモトロピック塩を含む緩衝液が使用される。例示的なコスモトロピック塩としては、個別にまたは任意の組合せのいずれかで硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、および塩化セシウムが挙げられる。存在する場合、コスモトロピック塩は、典型的に、０．１Ｍから１Ｍの間；０．２Ｍから０．８Ｍの間；０．３Ｍから０．７Ｍの間；０．４Ｍから０．６Ｍの間；または０．５Ｍなどの、１０ｍＭを超える濃度で使用される。

【0009】

一部の方法では、使用される緩衝液は、カオトロピック塩を含有する。カオトロピック塩を含有する緩衝液のサブセットにおいて、カオトロピック塩は、尿素の塩またはグアニジンの塩である。一部の方法では、使用される緩衝液は、ポリオールを含有する。ポリオールを含有する緩衝液のサブセットにおいて、ポリオールは、グリセロール、プロピレングリコール、または１，６－ヘキサンジオールである。

【0010】

一部の方法では、緩衝液は、４℃から７０℃の間の温度の範囲にわたってｐＨを維持する。緩衝液のサブセットは、４℃から７０℃の間の温度においてｐＨを３．０から１０．０の間に維持する。これらの緩衝液のさらなるサブセットは、４℃から７０℃の間の温度においてｐＨを７．０から９．０の間に維持する。

【0011】

一部の方法では、緩衝液は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、トリアゾールアミン緩衝液、またはビス－トリスプロパン緩衝液である。トリスおよびビス－トリスプロパン緩衝液のサブセットにおいて、緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、シトレート、ＮａＣｌ、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含む追加の成分を含む。ビス－トリスプロパン緩衝液のサブセットにおいて、緩衝液は、４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含む。

【0012】

本明細書に開示される方法は、任意のＡＡＶ粒子のゲノムの完全性を保存するのに有用である。一部の方法では、ＡＡＶ粒子は、およそ４．７ｋｂのＤＮＡ、４．７ｋｂを超えるＤＮＡ、５．０ｋｂを超えるＤＮＡ、またはおよそ５．１ｋｂのＤＮＡのゲノムを含む。代替的に、ＡＡＶ粒子は、４．０ｋｂ未満のＤＮＡ、またはおよそ３．０ｋｂのＤＮＡのゲノムを含みうる。本明細書に開示される方法は、一本鎖であるかまたは実質的に自己相補性であるゲノムを含むＡＡＶ粒子とともに使用されうる。

【0013】

本発明の不活性化の一部の方法は、活性ヘルパーウイルスの５．０を超える対数減少を達成する。これらの方法のサブセットは、ヘルパーウイルスの６．０を超える、または６．３を超える対数減少を達成する。一部の方法では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはバキュロウイルスである。ヘルパーウイルスがアデノウイルスである方法のサブセットにおいて、アデノウイルスはＡｄ５である。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヘルパーウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、および緩衝液を含有する試料中のヘルパーウイルスを不活性化する方法であって、
該試料を、４５℃を超えるまたはそれに等しい温度まで加熱すること
を含み、該緩衝液が、１０ｍＭもしくはそれを超える濃度の二価もしくは三価カチオン、または１０ｍＭもしくはそれを超える濃度のコスモトロピック塩を含む、方法。
（項目２）
前記試料が、４５℃から６５℃の間の温度まで加熱される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記試料が、４５℃から６０℃の間の温度まで加熱される、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記試料が、４５℃から５５℃の間の温度まで加熱される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記試料が、４７℃から５３℃の間の温度まで加熱される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記試料が、４８℃まで加熱される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記試料が、４９℃まで加熱される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記試料が、１分から６時間の間の期間、前記温度に維持される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記試料が、１０分から１８０分の間の期間、前記温度に維持される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記試料が、２０分から１８０分の間の期間、前記温度に維持される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記試料が、２０分から６０分の間の期間、前記温度に維持される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記試料が、２０分から４０分の間の期間、前記温度に維持される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
６．３またはそれを超えるヘルパーウイルスの対数減少をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記アデノ随伴ウイルス粒子が、４．７ｋｂを超えるＤＮＡのゲノムを含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記アデノ随伴ウイルス粒子が、５．１ｋｂを超えるＤＮＡのゲノムを含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記アデノ随伴ウイルス粒子が、およそ４．７ｋｂのＤＮＡのゲノムを含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記アデノ随伴ウイルス粒子が、４．０ｋｂ未満のＤＮＡのゲノムを含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記アデノ随伴ウイルス粒子が、およそ３．０ｋｂのＤＮＡのゲノムを含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記アデノ随伴ウイルス粒子が、実質的に自己相補性であるゲノムを含む、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記緩衝液が、カオトロピック塩をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
前記カオトロピック塩が、尿素の塩である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記カオトロピック塩が、グアニジンの塩である、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記緩衝液が、グリセロール、プロピレングリコール、および１，６－ヘキサンジオールを含む群から選択されるポリオールをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記緩衝液が、４℃から７０℃の間の温度においてｐＨを３．０から１０．０の間に維持する、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記緩衝液が、４℃から７０℃の間の温度においてｐＨを７．０から９．０の間に維持する、項目１に記載の方法。
（項目２６）
前記緩衝液が、４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２７）
前記緩衝液が、トリス緩衝液である、項目２４に記載の方法。
（項目２８）
前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、項目２４に記載の方法。
（項目２９）
前記緩衝液が、トリアゾールアミン緩衝液である、項目２４に記載の方法。
（項目３０）
前記ヘルパーウイルスが、アデノウイルスである、項目１に記載の方法。
（項目３１）
アデノウイルスが、Ａｄ５である、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
二価または三価カチオンの前記濃度が、１５ｍＭを超える、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
二価または三価カチオンの前記濃度が、２０ｍＭを超える、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
二価または三価カチオンの前記濃度が、５０ｍＭを超える、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
二価または三価カチオンの前記濃度が、１００ｍＭを超える、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
二価または三価カチオンの前記濃度が、２００ｍＭを超える、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
二価または三価カチオンの前記濃度が、１０ｍＭ～５００ｍＭである、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
二価または三価カチオンの前記濃度が、２０ｍＭ～４００ｍＭである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
二価または三価カチオンの前記濃度が、３０ｍＭ～３００ｍＭである、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
二価または三価カチオンの前記濃度が、５０ｍＭ～２５０ｍＭである、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
二価または三価カチオンの前記濃度が、７０ｍＭ～２００ｍＭである、項目３７に記載の方法。
（項目４２）
前記緩衝液が、１０ｍＭまたはそれを超える濃度の、Ｍｇ、Ｃａ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｚｎ、Ｃｏ、Ｓｒ、Ｃｕ、Ｃｒ、ＦｅおよびＳｃからなる群から選択される金属の二価または三価カチオンを含む、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記カチオンが、二価カチオンである、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記カチオンが、Ｍｇ ^２＋ 、Ｃａ ^２＋ 、Ｍｎ ^２＋ 、Ｎｉ ^２＋ 、Ｚｎ ^２＋ 、Ｃｏ ^２＋ 、Ｓｒ ^２＋ 、Ｃｕ ^２＋ およびＣｒ ^２＋ からなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記カチオンが、Ｃａ ^２＋ である、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
前記カチオンが、Ｍｇ ^２＋ である、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
前記カチオンが、三価カチオンである、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記カチオンが、Ｓｃ ^３＋ である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記緩衝液が、１０ｍＭまたはそれを超える濃度の、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、および塩化セシウムを含む群から選択されるコスモトロピック塩を含む、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記緩衝液が、１０ｍＭまたはそれを超える濃度の硫酸アンモニウムを含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
コスモトロピック塩の前記濃度が、０．１Ｍ～１Ｍである、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５２）
コスモトロピック塩の前記濃度が、０．２Ｍ～０．８Ｍである、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５３）
コスモトロピック塩の前記濃度が、０．３Ｍ～０．７Ｍである、項目４９または５５５０に記載の方法。
（項目５４）
コスモトロピック塩の前記濃度が、０．４Ｍ～０．６Ｍである、項目４９または５０に記載の方法。
（項目５５）
コスモトロピック塩の前記濃度が、０．５Ｍである、項目４９または５０に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、曝露温度および曝露温度において費やした時間の関数としてのＡｄ５のウイルス対数減少（ｌｏｇ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｖｉｒｕｓ）（ＬＲＶ）を示す等高線プロットを示す。Ａｄ５感染力アッセイを使用してＡｄ５粒子の不活性化のレベルを決定した。実際のデータポイントは、前記データポイントの間を補間した等高線図とともに黒い点で示される。このアッセイにおけるＬＲＶの定量限界は６．３であった。６．３よりも大きい減少は検出不能であった。

【0015】

【図2AB】図２は、曝露温度および曝露温度において費やした時間の関数としての様々なＡＡＶ産物の収率（％）を示す等高線プロットを示す。図２Ａは、ＨＥＫ２９３により産生されたｈｕ３７血清型の切断型産物についての結果を示し、図２Ｂは、ＨｅＬａにより産生されたｈｕ３７血清型の特大産物についての結果を示し、図２Ｃは、ＨＥＫ２９３により産生されたＡＡＶ８血清型の一本鎖産物についての結果を示し、図２Ｄは、ＨＥＫ２９３により産生されたＡＡＶ８血清型の自己相補性産物についての結果を示す。ＤＮａｓｅ抵抗性粒子のｑＰＣＲ（ＤＲＰ－ｑＰＣＲ）アッセイを使用して、曝露前および曝露後のＡＡＶ産物のレベルを決定した。実際のデータポイントは、前記データポイントの間を補間した等高線図とともに黒い点で示される。

【図2CD】図２は、曝露温度および曝露温度において費やした時間の関数としての様々なＡＡＶ産物の収率（％）を示す等高線プロットを示す。図２Ａは、ＨＥＫ２９３により産生されたｈｕ３７血清型の切断型産物についての結果を示し、図２Ｂは、ＨｅＬａにより産生されたｈｕ３７血清型の特大産物についての結果を示し、図２Ｃは、ＨＥＫ２９３により産生されたＡＡＶ８血清型の一本鎖産物についての結果を示し、図２Ｄは、ＨＥＫ２９３により産生されたＡＡＶ８血清型の自己相補性産物についての結果を示す。ＤＮａｓｅ抵抗性粒子のｑＰＣＲ（ＤＲＰ－ｑＰＣＲ）アッセイを使用して、曝露前および曝露後のＡＡＶ産物のレベルを決定した。実際のデータポイントは、前記データポイントの間を補間した等高線図とともに黒い点で示される。

【0016】

【図3】図３は、ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイ（濃いバー）およびＴＣＩＤ５０感染力アッセイ（薄いバー）を使用して決定した回収率の結果の比較を示す。被験試料は、２０分の曝露時間について図２Ｂに示されたものと同じであった。「対照」は、実験全体を通して凍結したままの負荷試料であった。

【0017】

【図4】図４は、曝露温度および曝露温度において費やした時間の関数としての２つのＡＡＶ産物の収率（％）を示す等高線プロットを示す。図４Ａは、ＨｅＬａにより産生されたｈｕ３７血清型の特大産物についての結果を示し、図４Ｂは、ＨＥＫ２９３により産生されたｈｕ３７血清型の特大産物についての結果を示す。ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイを使用して、曝露前および曝露後のＡＡＶ産物のレベルを決定した。実際のデータポイントは、前記データポイントの間を補間した等高線図とともに黒い点で示される。

【0018】

【図5】図５は、バックグラウンド緩衝液におけるＨＥＫ２９３により産生されたｈｕ３７血清型の特大産物の収率（％）を示す等高線プロットを、曝露温度および曝露温度において費やした時間の関数として示す。図５Ａは、４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ８．０のバックグラウンド緩衝液の結果を示し、図５Ｂは、０．５Ｍ 硫酸アンモニウムを含むバックグラウンド緩衝液の結果を示す。ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイを使用して、曝露前および曝露後のＡＡＶ産物のレベルを決定した。実際のデータポイントは、前記データポイント間を補間した等高線図とともに黒い点で示される。４７℃における点線は、Ａｄ５の完全な不活性化が起こる温度を示す（実施例１において決定した。図１を参照されたい）。

【0019】

【図6】図６は、４７℃への曝露時間の関数としての、７種の異なる緩衝液中のＨＥＫ２９３により産生されたｈｕ３７血清型の特大ＡＡＶベクターの回収率の比較を示す。４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ８．０のバックグラウンド緩衝液、または０．１ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、もしくは１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を補充したバックグラウンド緩衝液のいずれかが使用された。ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイを使用して、曝露前および曝露後のＡＡＶ産物のレベルを決定した。「対照」は、実験全体を通して凍結したままの負荷試料であった。

【0020】

【図7】図７は、４９℃への曝露時間の関数としての、２種の異なる緩衝液中のＨＥＫ２９３により産生されたｈｕ３７血清型の特大ＡＡＶベクターの回収率の比較を示す。１００ｍＭもしくは２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を補充した４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ８．０のバックグラウンド緩衝液が使用された。ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイを使用して、曝露前および曝露後のＡＡＶ産物のレベルを決定した。「対照」は、実験全体を通して凍結したままの負荷試料であった。

【0021】

【図8】図８は、５１℃への曝露時間の関数としての、２種の異なる緩衝液中のＨＥＫ２９３により産生されたｈｕ３７血清型の特大ＡＡＶベクターの回収率の比較を示す。１００ｍＭもしくは２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を補充した４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ８．０のバックグラウンド緩衝液が使用された。ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイを使用して、曝露前および曝露後のＡＡＶ産物のレベルを決定した。「対照」は、実験全体を通して凍結したままの負荷試料であった。

【0022】

【図9】図９は、５３℃への曝露時間の関数としての、２種の異なる緩衝液中のＨＥＫ２９３により産生されたｈｕ３７血清型の特大ＡＡＶベクターの回収率の比較を示す。１００ｍＭもしくは２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を補充した４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ８．０のバックグラウンド緩衝液が使用された。ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイを使用して、曝露前および曝露後のＡＡＶ産物のレベルを決定した。「対照」は、実験全体を通して凍結したままの負荷試料であった。

【0023】

【図10】図１０は、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を補充した４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ８．０のバックグラウンドにおけるＨＥＫ２９３により産生されたｈｕ３７血清型の特大産物の収率（％）を示す等高線プロットを示す。ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイを使用して、曝露前および曝露後のＡＡＶ産物のレベルを決定した。実際のデータポイントは、前記データポイント間を補間した等高線図とともに黒い点で示される。

【0024】

【図11】図１１は、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を補充した４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ８．０のバックグラウンドにおけるＨＥＫ２９３により産生されたｈｕ３７血清型の特大産物の収率（％）を示す等高線プロットを示す。ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイを使用して、曝露前および曝露後のＡＡＶ産物のレベルを決定した。実際のデータポイントは、前記データポイント間を補間した等高線図とともに黒い点で示される。

【発明を実施するための形態】

【0025】

ヘルパーウイルス粒子およびＡＡＶ粒子を含有する試料中のＡＶなどのヘルパーウイルスを不活性化する方法であって、インタクトなゲノムおよび／または生物学的活性を有するＡＡＶ粒子の回収増加をもたらす方法が本明細書に記載される。方法は、ヘルパーウイルス粒子を不活性化するのに十分な温度においておよび十分な時間にわたって、ヘルパーウイルス粒子およびＡＡＶ粒子および緩衝液を含有する試料を加熱することを含む。本発明による緩衝液への、二価もしくは三価金属イオンまたはコスモトロピック塩の添加が、インタクトなゲノムを含有するＡＡＶ粒子の回収増加をもたらすことが予想外に示された。
アデノ随伴ウイルス

【0026】

ＡＡＶは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ科のＤｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属の小さな非エンベロープの正二十面体ウイルスである。ＡＡＶは、およそ４．７ｋｂの一本鎖の線状ＤＮＡゲノムを有する。ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ－１～ＡＡＶ－１２だけでなく、非ヒト霊長類由来の１００を超える血清型を含む、多数の血清学的に識別可能なタイプを含む。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０５巻（１号）：１７～２４頁（２００８年）；Ｇａｏら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７８巻（１２号）、６３８１～６３８８頁（２００４年）を参照されたい。任意のＡＡＶタイプが本発明の方法で使用されうる。ＡＡＶは、異なる組織向性を示す異なるＡＡＶ血清型により、数種の組織タイプの分裂細胞および静止状態の細胞の両方に感染することができる。ＡＡＶは、非自律的に複製し、潜伏期および感染期を有する生活環を有する。潜伏期において、細胞がＡＡＶに感染した後、ＡＡＶはプロウイルスとして部位特異的に宿主のゲノムに組み込まれる。感染期は、細胞がヘルパーウイルス（例えば、ＡＶまたは単純ヘルペスウイルス）にも感染し、それによりＡＡＶの複製が可能となり、ＡＡＶ粒子およびヘルパーウイルス粒子の両方の産生がもたらされない限り生じない。このＡＡＶ粒子およびヘルパーウイルス粒子の混合集団の産生は、ＡＡＶが治療用ベクターとして使用される場合には、重大な問題を生じる。なぜなら、混入したヘルパーウイルスは、その潜在的な病原性および／または免疫原性のために除去または不活性化しなければならないからである。

【0027】

野生型ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ複製、ゲノムのカプシド形成および組込みを指示するシグナル配列を含有する、１４５ヌクレオチドの末端逆位配列（ＩＴＲ）を２つ含む。ＩＴＲに加えて、３つのＡＡＶプロモーター、ｐ５、ｐ１９およびｐ４０が、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードする２つのオープンリーディングフレームの発現を推進する。２つのｒｅｐプロモーターは、単一のＡＡＶイントロンの差示的スプライシングと相まって、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、ゲノム複製に関与する。Ｃａｐ遺伝子は、ｐ４０プロモーターから発現され、ｃａｐ遺伝子のスプライスバリアントである３つのカプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶ粒子のカプシドを形成する。

【0028】

複製、カプシド形成および組込みのためのシス作用性シグナルは、ＩＴＲ内に含有されるため、４．３ｋｂの内部ゲノムの一部またはすべてが外来ＤＮＡ、例えば、目的の外来タンパク質のための発現カセットで置き換えられうる。この場合、ｒｅｐタンパク質およびｃａｐタンパク質は、例えば、プラスミド上でトランスに提供される。ＡＡＶベクターを産生するためには、ＡＡＶ複製を許容する細胞株が、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子、ＩＴＲに隣接した発現カセットならびにヘルパーウイルスにより提供されるヘルパー機能、例えば、ＡＶ遺伝子Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ５５Ｋ、Ｅ２ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡを発現しなければならない（Ｗｅｉｔｚｍａｎら、Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１～２３頁、２０１１年）。ＡＡＶベクターの産生は、ヘルパーウイルス粒子の産生ももたらすことができ、これは、ＡＡＶベクターの使用前に除去または不活性化されなければならない。ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞だけでなく、昆虫細胞を含む、多数の細胞タイプがＡＡＶベクターの産生に好適である（例えば、米国特許第６，１５６，３０３号、米国特許第５，３８７，４８４号、米国特許第５，７４１，６８３号、米国特許第５，６９１，１７６号、米国特許第５，６８８，６７６号、米国特許第８，１６３，５４３号、ＵＳ２００２００８１７２１、ＷＯ００／４７７５７、ＷＯ００／２４９１６およびＷＯ９６／１７９４７を参照）。ＡＡＶベクターは、典型的に、ＩＴＲに隣接した発現カセットを含有する１つのプラスミドならびに追加のＡＡＶおよびヘルパーウイルス遺伝子を提供する１つまたは複数の追加のプラスミドにより、これらの細胞タイプにおいて産生される。

【0029】

任意の血清型のＡＡＶベクターが、本発明において使用されうる。同様に、任意の（ａｎｄ）ＡＶタイプが使用されうることが企図され、当業者はその所望のＡＡＶベクターの産生に好適なＡＡＶタイプおよびＡＶタイプを特定することができる。ＡＡＶ粒子およびＡＶ粒子は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオジキサノール（ｉｏｄｉｘｏｎａｌ）勾配、またはＣｓＣｌ勾配により、最小限に精製されうる。さらに精製されたＡＡＶ粒子およびＡＶ粒子を含有する試料も、精製度が低い試料と同様に本発明の方法において使用されうる。

【0030】

野生型ＡＡＶのゲノムは、一本鎖ＤＮＡであり、４．７ｋｂである。ＡＡＶベクターは、サイズが４．７ｋｂであるか、または５．２ｋｂ規模の特大ゲノムもしくは３．０ｋｂほどの小さなゲノムを含む、４．７ｋｂよりも大きいかもしくは小さい一本鎖ゲノムを有しうる。さらに、ベクターゲノムは、ウイルス内でゲノムが実質的に二本鎖であるように、実質的に自己相補性でありうる。ここで示したとおり、特大ゲノムを含むＡＡＶベクターは、熱分解に対する感受性が増加している。したがって、特大ゲノムを含むＡＡＶベクターは、本発明の方法における使用に好ましい。しかしながら、当業者は、すべてのタイプのＡＡＶベクターの熱不活性化の間の安定性を増加させることは、ますますストリンジェントな不活性化条件を可能とするため、価値があることを理解する。したがって、すべてのタイプのゲノムを含有するＡＡＶベクターが、本発明の方法における使用に好適である。
ヘルパーウイルス

【0031】

上で論じたとおり、ＡＡＶは、その生活環の感染期に入るために、ヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。ヘルパーウイルスは、アデノウイルス（ＡＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含み、バキュロウイルスを使用して昆虫細胞中でＡＡＶを産生するためのシステムが存在する。パピローマウイルスもＡＡＶのためのヘルパー機能を提供しうることも提案された。Ｈｅｒｍｏｎａｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ９巻、Ｓ２８９～Ｓ２９０頁（２００４年）を参照されたい。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶを作り出し、複製を可能とする（ｃｒｅａｔｉｎｇ ａｎ ａｌｌｏｗｉｎｇ ＡＡＶ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）ことができる任意のウイルスを含む。ＡＡＶよりも低い熱安定性を示すという条件で、任意のヘルパーウイルスが本発明において使用されうる。ＡＶは、およそ３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを含む、非エンベロープの核ＤＮＡウイルスである。ＡＶは、ＡＡＶの複製およびカプシド形成を可能とするＥ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ５５Ｋ遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、Ｅ４ｏｒｆ６遺伝子、およびＶＡ遺伝子を提供することにより、細胞内の潜伏ＡＡＶプロウイルスをレスキューすることができる。

【0032】

ＨＳＶは、脂質二重層エンベロープに包まれた、正二十面体カプシドにカプシド封入された比較的大きな二本鎖線状ＤＮＡゲノムを有するウイルスの科である。ＨＳＶは、感染性であり、伝染性が高い。ヘルパー機能を亢進する他のタンパク質とともに以下のＨＳＶ－１複製タンパク質：ヘリカーゼ／プライマーゼ複合体（ＵＬ５、ＵＬ８およびＵＬ５２）およびＵＬ２９遺伝子によりコードされるＤＮＡ結合タンパク質ＩＣＰ８が、ＡＡＶ複製のために必要であると同定された。

【0033】

バキュロウイルスなどの他のヘルパーウイルスが、それらが自然にまたは改変形態のいずれかでＡＡＶ複製を支援することができ、ＡＡＶよりも低いレベルの熱安定性を示すという条件で、本発明とともに使用されうる。
ＡＡＶベクターの産生

【0034】

ＡＡＶベクターは、当分野で公知の多くの方法により、哺乳動物または昆虫細胞中で産生されうる。産生方法の結果がＡＡＶおよびヘルパーウイルスの両方を含有する試料であるという条件で、任意の産生方法が本発明のための出発材料を産生するのに好適である。製造プロセスは、細胞に、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子の機能だけでなく追加のヘルパー機能を有するＡＡＶベクターゲノムを含有するプラスミドを提供することを含む。追加のヘルパー機能は、例えば、ＡＶ感染により、必要なＡＶヘルパー機能遺伝子のすべてを保有するプラスミドにより、またはＨＳＶもしくはバキュロウイルスなどの他のウイルスにより提供されうる。本発明の方法とともに使用されるのに好適なＡＡＶ産生方法は、Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、６巻：１３２９～１３４１頁（１９９５年）；Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４巻：２５３～２６９頁（２０１３年）；Ｔｈｏｒｎｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：７０７～７１４頁（２００９年）；Ｆｒａｓｅｒ Ｗｒｉｇｈｔ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：６９８～７０６頁（２００９年）；Ｖｉｒａｇら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０巻：８０７～８１７頁（２００９年）に開示されたものを含む。

【0035】

ＡＡＶ産物は、細胞溶解物からまたは細胞培養培地から収集される。一次精製ステップは、細胞混入物を除去するためのアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーを含む。精製された試料は、ろ過され、－６０℃以下で貯蔵される。
細胞溶解
［００２３］
ＡＡＶ粒子は、細胞を溶解することにより、感染細胞から得られうる。ＡＡＶ感染細胞の溶解は、感染性（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）ウイルス粒子を放出するために細胞を化学的にまたは酵素的に処理する方法により達成されうる。これらの方法は、ベンゾナーゼもしくはＤＮＡｓｅなどのヌクレアーゼ、トリプシンなどのプロテアーゼ、または洗剤もしくは界面活性剤の使用を含む。ホモジナイゼーションもしくは粉砕などの物理的破壊、またはマイクロフルイダイザー圧力セルによる加圧、または凍結融解サイクルも使用されうる。代替的に、細胞溶解を必要とせずに、上清がＡＡＶ感染細胞から採取されうる。
ウイルス粒子の精製

【0036】

本発明の不活性化方法の前に、例えば、細胞溶解の結果として生じた細胞残屑を除去するために、ＡＡＶ粒子およびヘルパーウイルス粒子を含有する試料を精製することが必要であり得る。ヘルパーウイルス粒子およびＡＡＶ粒子の最小限の精製の方法は、当分野で公知であり、本発明の方法における使用のためのＡＡＶ粒子およびヘルパーウイルス粒子の両方を含有する試料を準備するために、任意の適切な方法が使用されうる。２つの例示的な精製方法は、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）およびイオジキサノールに基づく密度勾配精製である。両方法は、Ｓｔｒｏｂｅｌら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２６巻（４号）：１４７～１５７頁（２０１５年）に記載されている。最小限の精製は、例えば、ＡＶＢセファロース親和性樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して達成することもできる。ＡＶＢセファロース親和性樹脂を使用するＡＡＶ精製の方法は、例えば、Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．、２巻：１５０４０頁（２０１５年）に記載されている。
熱不活性化

【0037】

熱不活性化技術は、ＡＡＶ粒子およびヘルパーウイルス粒子の異なる熱安定性に基づく。例えば、ＡＡＶ粒子は、５６℃もの高い温度まで加熱されうるが、依然としてインタクトなままであり、一方、ＡＶ粒子は不活性にされる。Ｃｏｎｗａｙら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６巻、９８６～９９３頁、１９９９年は、ＡＡＶを含有する試料中のＨＳＶの示差熱不活性化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を記載している。熱不活性化は、任意の公知の方法論により達成されうる。以下に記載の例において、熱不活性化は、３００μＬまたはそれ未満の試料容積を急速に加熱および冷却するために、サーモサイクラーを使用して達成された。このシステムは、主に伝導性の熱伝達に依拠するという理由で選択され、連続フローシステムおよび能動的混合を採用するより大きなバッチシステムの両方のための実行可能なモデルとなっている。連続フローシステムの例としては、Ｂｉｏ－ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇのためのＤＨＸ（商標）Ｓｉｎｇｌｅ－Ｕｓｅ Ｈｅａｔ Ｅｘｃｈａｎｇｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍｉｌｌｅｒｓｂｅｒｇ、ＰＡ）などの、連続フロー熱交換器を通る試料の通過が挙げられる。そのようなシステムは、熱交換器を通る試料の流速を制御し、その結果として加熱プロセスの持続時間および熱交換器の温度を制御し、その結果として熱不活性化の温度を制御することにより、オペレーターが熱不活性化プロセスを制御することを可能にする。

【0038】

代替的に、熱不活性化は、様々なサイズのバッチシステムを使用して達成されうる。例えば、熱不活性化は、ＡＡＶを含有する試料を１ＬのＰＥＴＧボトル中に置き、そのボトルを所望の不活性化温度に設定した水浴中に所望の期間、混合しながら置くことにより１Ｌスケールで達成可能であり、例えば、試料は、４７℃に２０分間加熱されうる。より大きなスケールでは、熱不活性化は、５Ｌのバイオプロセシングバッグ中のＡＡＶを含有する試料を、所望の不活性化温度に設定した温度制御ロッキングプラットフォーム上に所望の期間置くことにより達成されうる。例えば、ロッキングプラットフォームは、１２°の混合角度、３０ＲＰＭのロッキングスピード、４９℃で４０分間に設定されうる。

【0039】

熱不活性化は、ＡＡＶ粒子とヘルパーウイルス粒子の間で安定性が十分に異なるために、ヘルパーウイルス粒子が実質的に不活性化される一方、活性なＡＡＶ粒子が残存する、任意の温度で行いうる。本発明では、ＡＡＶ粒子およびヘルパーウイルス粒子を含有する試料が、４５℃を超えるまたはそれに等しい温度、一般には４５℃から５５℃の間の温度まで加熱され、最も頻繁に４９℃±２℃の温度が使用される。一般に、試料を１分から６０分までの期間、温度を保持し、１０～４０分間が最も頻繁に使用される。しかしながら、図１に示されるように、熱不活性化は、時間にほとんど依存しないため、加熱ステップの持続時間が、試料全体をその温度にするために必要な時間の関数となる。例えば、３００μＬの試料サイズは数秒以内で均一温度にされうるが、マルチリットルタンクは均一温度に到達するのに何分もかかりうる（ｍａｙ ｍａｎｙ ｍｉｎｕｔｅｓ）。さらに、当業者は、より大きなレベルのＡＶ低減を達成するためにはより高い温度が必要とされうることを理解する。
不活性化効力の測定

【0040】

熱不活性化が達成されると、不活性化の効率を決定することが必要または望ましい場合がある。不活性化プロトコールの効力は、プラークアッセイなどの複製可能なヘルパーウイルスの存在を検出するアッセイにより決定される。ＡＶ、ＨＳＶ、バキュロウイルスなどのためのプラークアッセイを含む、ヘルパーウイルスのためのプラークアッセイは、当業者に周知である。アデノウイルスのプラークアッセイは、任意の適切な細胞タイプ、例えば、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ２９３細胞を使用して実行されうる。標準的なプラークアッセイプロトコールは、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００３年に記載されている。アデノウイルス力価を測定するための代替アッセイは、免疫細胞化学染色を使用してヘキソンタンパク質などのウイルスタンパク質を検出することによる、培養物中の感染細胞の同定を可能とするものを含む。そのようなアッセイは、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む。一般に、不活性化の効率は、ウイルスの対数減少（ＬＲＶ）として報告される。
ＡＡＶ粒子の定量

【0041】

ＡＡＶ粒子の定量は、ＡＡＶ感染がｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞変性効果をもたらさず、したがって、感染力価を決定するためにプラークアッセイが使用できないという事実により、複雑である。しかしながら、ＡＡＶ粒子は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（Ｃｌａｒｋら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０巻、１０３１～１０３９頁（１９９９年））もしくはドットブロットハイブリダイゼーション（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６３巻、３８２２～３８２８頁（１９８９年））を含むいくつかの方法を使用して、または高度に精製されたベクター調製物の光学密度により（Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、７巻、１２２～１２８頁（２００３年））定量可能である。ＤＮａｓｅ抵抗性粒子（ＤＲＰ）は、サーモサイクラー（例えば、ｉＣｙｃｌｅｒ ｉＱ ９６ウエルブロックフォーマットサーモサイクラー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））におけるリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）（ＤＲＰ－ｑＰＣＲ）により、定量可能である。ＡＡＶ粒子を含有する試料が、ＤＮａｓｅＩ（１００Ｕ／ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の存在下、３７℃で６０分間インキュベートされ、続いて、５０℃で６０分間のプロテイナーゼＫ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）消化（１０Ｕ／ｍｌ）、次いで、９５℃で３０分間、変性させる。使用されるプライマープローブセットは、ＡＡＶベクターゲノムの非天然部分、例えば、目的のタンパク質のポリ（Ａ）配列に特異的であるべきである。ＰＣＲ産物は、プライマー、プローブおよび増幅された配列の長さおよび組成に基づく、任意の適切なサイクリングパラメータのセットを使用して増幅されうる。代替プロトコールは、例えば、Ｌｏｃｋら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５巻（２号）：１１５～１２５頁（２０１４年）に開示されている。

【0042】

ＡＡＶ粒子の感染力は、例えば、Ｚｈｅｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１５巻：７０９～７１５頁（２００４年）に記載のＴＣＩＤ_５０（５０％の組織培養感染量）アッセイを使用して決定されうる。このアッセイでは、ＡＡＶベクター粒子が連続的に希釈され、９６ウエルプレート中でＡＶ粒子とともにＲｅｐ／Ｃａｐ発現細胞株に共感染するために使用される。感染後４８時間で、感染させたウエルおよび対照ウエルからの全細胞内ＤＮＡが抽出される。次いで、導入遺伝子特異的プローブおよびプライマーとともにｑＰＣＲを使用して、ＡＡＶベクターの複製が測定される。１ミリリットルあたりのＴＣＩＤ_５０感染力（ＴＣＩＤ_５０／ｍｌ）は、１０倍の連続希釈でのＡＡＶ陽性のウエルの比を使用して、Ｋａｅｒｂｅｒ方程式により計算される。
バックグラウンド緩衝液

【0043】

本発明の方法は、バックグラウンド緩衝液の使用を含む。バックグラウンド緩衝液は、広い温度範囲にわたって安定なｐＨを維持することができる、例えば、緩衝液が４℃から７０℃の間で温度変化する場合に、３．０～１０．０の範囲にｐＨを維持することができる、任意の緩衝液でありうる。緩衝液は、緩衝液が４℃から７０℃の間で温度変化する場合に、７．０から９．０の間のｐＨにも維持しうる。例示的なバックグラウンド緩衝液としては、グリシン、シトレート、サクシネート、アセテート、ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、ビス－トリス（ビス－（２－ヒドロキシエチル）－イミノ－トリス－（ヒドロキシメチル）－メタン）、ホスフェート、ｐｉｐｅｓ（１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸）、ｍｏｐｓｏ（３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＢＴＰ（１，３－ビス（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）プロパン）、ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸）、ＴＥＳ２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸）、ＴＥＡ（トリス塩基、酢酸およびＥＤＴＡ）、トリス、トリシン、ビシン、ラクテート、ホルメート、およびＭＭＡ（２－メチルプロパン二酸）により緩衝されるシステムが挙げられる。１つの例示的なバックグラウンド緩衝液は、４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、および０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含み、室温でｐＨ８．０である。
二価および三価金属イオン

【0044】

本発明において使用される緩衝液のサブセットは、さらなる二価または三価金属カチオン、例えば、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｎ^２＋、Ｎｉ^２＋、Ｚｎ^２＋、Ｃｏ^２＋、Ｓｒ^２＋、Ｃｕ^２＋、Ｃｒ^２＋およびＳｃ^３＋を含有する。上記カチオンの塩も採用されうる。本発明において採用される場合、二価または三価カチオンは、１０ｍＭを超える総濃度で存在する。以下の実施例に示されるとおり、試験された１０ｍＭを超える二価または三価カチオンを含有するすべての緩衝液は、対照緩衝液中で加熱された試料に比べて有意な保護を提供した。最高レベルの保護は、５０ｍＭ～２００ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液で観察された。ＣａまたはＭｇのカチオンなどの高度に可溶な金属イオンについては、ＡＡＶの最大の保護を達成するために必要な量を超えてカチオンの濃度を増加させることが、ＡＡＶの保護に負の効果を有さず、等価な結果をもたらすことが当業者に理解される。本発明の緩衝液は、尿素またはグアニジンの塩を含む、カオトロピック塩も含みうる。緩衝液は、ポリオールも含むことができ、好ましいポリオールは、グリセロール、プロピレングリコール、および１，６－ヘキサンジオールである。
コスモトロピック塩

【0045】

本発明において使用される緩衝液のサブセットは、コスモトロピック塩を含有する。コスモトロピック塩は、水－水相互作用（ｗａｔｅｒ－ｗａｔｅｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の安定性および構造に寄与する共溶媒である。コスモトロピック塩は、溶液中のタンパク質、膜、および疎水性凝集体も安定化する。本発明の一実施形態では、緩衝液は、１つまたは複数のコスモトロピック塩、特に、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸カリウム、および塩化セシウムなどの強力なコスモトロピック塩を含む。コスモトロピック塩は、１０ｍＭを超える濃度、例えば、０．１Ｍ～１Ｍ、０．２Ｍ～０．８Ｍ、０．３Ｍ～０．７Ｍ、０．４Ｍ～０．６Ｍ、または０．５Ｍの濃度で、本発明において有用である。

【実施例】

【0046】

以下の実施例は、決して本発明の範囲を限定することを意図せず、開示された方法の態様を例示するために提供される。本発明の多くの他の実施形態が当業者に明らかである。
（実施例１）

【0047】

標準的な技術を使用してＡｄ５ ＡＶ粒子を産生し、ＣｓＣｌ勾配により最小限に精製した。Ａｄ５粒子をバックグラウンド緩衝液（４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ８．０）中に透析した。直ちに所望の温度に試料を加熱するためにサーモサイクラーを使用して加熱を行い、所望の温度で保持し、次いで、直ちに試料を冷却した。緩衝液中のＡｄ５粒子の試料はポリプロピレン管内に含まれ、容積は３００μＬまたはそれ未満であった。５１℃に加熱し、その温度に１０分間保持したのみであったＡｄ５ ＡＶ試料以外は、Ａｄ５ ＡＶ試料を、１０分、１５分、または４０分のいずれかの持続時間にわたって、４５℃、４７℃、４９℃、または５１℃に加熱した。次いで、加熱処理に続いて、ＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ（商標）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｔｉｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造者の指示に従って使用して、Ａｄ５感染力を測定した。

【0048】

Ａｄ５ ＡＶの熱不活性化データを、Ａｄ５ウイルスのウイルス対数減少（ＬＲＶ）として図１に示すが、６ＬＲＶを超えることが望ましい。図１に見られるとおり、Ａｄ５材料の不活性化は、高度に温度依存性であり、温度における時間は不活性化に大きな影響を有さない。これらのデータに基づいて、４７℃またはそれより高い温度で不活性化ステップを実行することが望ましい。
（実施例２）

【0049】

血清型が異なり、異なるゲノムタイプおよびサイズを含有するＡＡＶベクターを、ＡＡＶゲノムの安定性に対するＡＶ熱不活性化プロトコールの効果について試験した。３つの異なるゲノムを有するＡＡＶ８およびｈｕ３７の２つの血清型を試験した。以下のＡＡＶベクター：
（Ａ）一本鎖構築物（４．７ｋｂ）を含有するｈｕ３７カプシド
（Ｂ）特大一本鎖構築物（５．１ｋｂ）を含有するｈｕ３７カプシド
（Ｃ）小さな一本鎖構築物（４．１ｋｂ）を含有するＡＡＶ８カプシド
（Ｄ）自己相補性構築物（４．６ｋｂ）を含有するＡＡＶ８カプシド
を試験した。ＡＡＶベクター（Ａ）（Ｃ）および（Ｄ）をＨＥＫ２９３細胞中で産生し、粒子（Ｂ）はＨｅＬａ細胞中で産生した。標準的な技術を使用するアフィニティークロマトグラフィーまたはイオジキサノール勾配により、すべてのベクターを最小限に精製した。ベクターをバックグラウンド緩衝液（４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ８．０）中に透析した。ベクター試料を所望の温度まで直ちに加熱するために、サーモサイクラーを使用して加熱を行い、所望の温度に保持し、次いで、直ちに試料を冷却した。ベクター試料はポリプロピレン管に含まれ、容積は３００μＬまたはそれ未満であった。ベクター試料を以下の熱不活性化条件に曝露した：ベクター（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）を４５℃、４７℃、または４９℃に加熱し、ベクター（Ｂ）を４５℃、４７℃、４９℃、５１℃、または５３℃に加熱した。１０、２０、または４０分間の加熱後、すべてのベクターを試験した。ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイにより、ゲノム安定性について熱処理後の試料を分析した。

【0050】

この実験からのデータを図２に示す。ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイにより不活性化プロトコール後のＡＡＶ産物のゲノム分解を決定し、ｑＰＣＲ収率（％）として表した。昇温に曝露せず、４℃に保持した出発試料に対して比較することにより、ｑＰＣＲ収率（％）を決定した。図に認められるとおり、長さが４．７ｋｂ未満の一本鎖または自己相補性構築物（それぞれ、図２Ｃおよび図２Ｄ）を含む血清型ＡＡＶ８について、昇温およびその温度にあった時間は、ＡＡＶ材料を有意に分解しなかった。対照的に、一本鎖構築物（４．７ｋｂ）を含むｈｕ３７血清型は、ＡＡＶ８中で産生された同様のサイズの構築物と比較して、熱および加熱時間に対してより感受性であった（図２Ａ対図２Ｃ）。最終的に、ｈｕ３７血清型については、特大構築物（５．１ｋｂ）は、正常なゲノムサイズ（４．７ｋｂ）の構築物と比較して、熱に対する安定性に対して有意な負の影響を有した（図２Ｂ対図２Ａ）。これらの結果は、異なる血清型が異なる熱安定性プロファイルを有すること、しかしより重要なことには、構築物サイズがカプシドの熱安定性に対して（ｈｅａｔ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ）有意な影響を有することを示している。
（実施例３）

【0051】

ＡＡＶベクターのゲノムの完全性を決定する２つの方法を比較した。特大ゲノム（５．１ｋｂ）を含有するｈｕ３７ベクターの試料を、２２℃、４５℃、４７℃、４９℃、５１℃、または５３℃に２０分間加熱し、ＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイによりまたはＴＣＩＤ_５０感染力アッセイにより回収率を測定した。対照試料はゲノムの完全性の測定を行うまで凍結したままとした。

【0052】

図３は、ＤＲＰ－ｑＰＣＲ対ＴＣＩＤ_５０感染力アッセイを使用して収集したデータの比較を表す。図中に認められるように、２つの技術により結果として得られた回収率は、質的に同様の結果をもたらし、温度上昇とともにカプシドの質が低下する同じ傾向を生じさせた。これらのデータは、それにより、昇温に曝露された場合にカプシドの分解を軽減することを調べる予備的調査を実行するためのモデルとしてのＤＲＰ－ｑＰＣＲアッセイの使用を強固にする。
（実施例４）

【0053】

異なる細胞タイプを使用して産生したＡＡＶベクターの熱安定性を比較することにより、熱感受性に対する細胞産生システムの効果を試験した。特大ゲノム（５．１ｋｂ）を含有する血清型ｈｕ３７のベクターを、ＨｅＬａ細胞またはＨＥＫ２９３細胞のいずれかを使用して産生した。ベクター試料を４５℃、４７℃、４９℃、５１℃、または５３℃に、１０、２０または４０分間加熱した。ＤＲＰ－ｑＰＣＲにより、ゲノムの完全性を測定した。図４に示すように、両ベクタータイプについて反復したのはすべてのデータポイントではなかった。しかしながら、２つの実験からの結果は定性的に同様であった。これらのデータは、ＡＡＶ材料を作り出すために使用した細胞株産生システムが、結果として生じたＡＡＶの熱安定性に対して有意な影響を有さなかったことを示唆している。加えて、これらのデータは、特大構築物材料を含有するｈｕ３７血清型が、Ａｄ５不活性化のために必要とされる加熱条件に対して感受性が高いという全体的な知見を支持している（図１に示すように）。
（実施例５）

【0054】

特大ゲノムを含有するｈｕ３７血清型のＡＡＶベクター試料を、実施例２に記載のとおりに産生した。（Ａ）標準的バックグラウンド緩衝液（４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ８．０）または（Ｂ）０．５Ｍの硫酸アンモニウムを含有する標準的バックグラウンド緩衝液のいずれか中で試料を透析した。試料を以下のとおりに加熱した：４５℃で１０および４０分間、４７℃で２０分間、４９℃で１０分間および４０分間、ならびに５１℃で２０分間。ＤＲＰ－ｑＰＣＲによりゲノムの完全性を測定した。

【0055】

図５に示すとおり、バックグラウンド緩衝液に０．５Ｍの硫酸アンモニウムを添加することにより、ＡＡＶベクターの熱安定性が改善した（図５Ａ対図５Ｂ）。これらのデータは、熱不活性化ステップの間に使用した緩衝液調合物に強力なコスモトロピック塩を添加することにより、ＡＡＶベクターが昇温の分解性の影響に対して保護されうることを示している。

【0056】

これらのデータは、ＡＡＶがＡｄ５ウイルスの熱不活性化に必要な条件に対して感受性でありうることを実証している。ＡＡＶの安定性は、血清型依存性であるようであり、（長さが４．７ｋｂまたはそれより大きい構築物と定義される特大の）特大構築物の使用は、ＡＡＶ材料の安定性に対して有意に有害な影響を有しうる。この報告中に示すデータは、コスモトロピック塩の添加が、昇温に曝露された場合にＡＡＶ材料の安定性を増加させる、有益な影響を有しうることも示唆している。
（実施例６）

【0057】

特大ゲノムを含有するｈｕ３７血清型のＡＡＶベクター試料を実施例２に記載のとおりに産生した。（Ａ）標準的バックグラウンド緩衝液（４０ｍＭ ビス－トリスプロパン、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭシトレート、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．００１％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、ｐＨ８．０）、（Ｂ）０．１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、（Ｃ）１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、（Ｄ）２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、（Ｅ）５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、（Ｆ）１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２、または（Ｇ）２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する標準的バックグラウンド緩衝液のいずれか中で試料を透析した。試料を表１に示す温度まで、かつ表１に示す持続時間にわたって、加熱した。ＤＲＰ－ｑＰＣＲによりＡＡＶ粒子のゲノムの完全性を測定した。実験の結果を表２に表す。昇温に曝露せず、４℃に保持した出発試料と比較することにより、残存力価を決定し、パーセンテージとして報告する。変動係数（％ＣＶ）も報告する。

【0058】

図６は、０から１００ｍＭまでのＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液中のＡＡＶベクターの４７℃での４０分間にわたる回収率を示す。２５ｍＭ未満のＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液中の試料は、すべての時点で有意により低い回収率を有した。

【0059】

図７は、１００ｍＭまたは２００ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液中のＡＡＶベクターの４９℃での１８０分間にわたる回収率を示す。図８は、１００ｍＭまたは２００ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液中のＡＡＶベクターの５１℃での１８０分間にわたる回収率を示す。図９は、１００ｍＭまたは２００ｍＭのＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液中のＡＡＶベクターの５３℃での１８０分間にわたる回収率を示す。全体的に、これらのデータは、２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液が、長期の加熱中の分解に対してわずかに良好な保護を提供することを示唆している。これらの差異を図１０および１１に示すが、そこでは、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液対２００ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液について、持続時間および温度の増加とともにわずかに増加したベクターの損失が示される。

【表1】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

均等物

【0060】

本明細書に示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な変形およびその多くのさらなる実施形態が、本明細書中で引用された科学文献および特許文献への参照を含む本文書の内容全体から当業者に明らかとなる。本明細書の主題は、その様々な実施形態およびその等価物における本発明の実践に適合されうる重要な情報、例証およびガイダンスを含有する。

【図1】

【図2AB】

【図2CD】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】