特許 7357086 多能性幹細胞を培養するための新規な方法および培養培地

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-27

(45)【発行日】2023-10-05

(54)【発明の名称】多能性幹細胞を培養するための新規な方法および培養培地

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/0735 20100101AFI20230928BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20230928BHJP

【ＦＩ】

C12N5/0735 ZNA

C12N5/10

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2022007129

(22)【出願日】2022-01-20

(62)【分割の表示】P 2019149488の分割

【原出願日】2011-09-07

(65)【公開番号】P2022058686

(43)【公開日】2022-04-12

【審査請求日】2022-01-20

(31)【優先権主張番号】61/380,388

(32)【優先日】2010-09-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504127647

【氏名又は名称】テクニオン リサーチ アンド ディベロップメント ファウンデーション リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100103816

【弁理士】

【氏名又は名称】風早 信昭

(74)【代理人】

【識別番号】100120927

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野 典子

(72)【発明者】

【氏名】アミット， ミカル

(72)【発明者】

【氏名】イツコヴィッツ－エルドー， ヨセフ

【審査官】小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】特表２００６－５２７９９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５－５０１５５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００８／０１５６８２（ＷＯ，Ａ２）

【文献】Cell Stem Cell，2010年06月04日，Vol.6, No.6，pp.535-546

【文献】Exp. Hematol.，2008年03月，Vol.36, No.3，pp.350-359

【文献】Dev. Biol.，1998年11月01日，Vol.203, No.1，pp.149-162

【文献】Nat. Biotechnol.，2010年03月28日，Vol.28, No.4，pp.361-364

【文献】Stem Cell Res.，2010年03月30日，Vol.5, No.1，pp.51-64

【文献】Stem Cell Rev.，2010年06月，Vol.6, No.2，pp.248-259

【文献】Trends Biotechnol.，2002年10月，Vol.20, No.10，pp.417-419

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

インターロイキン１１（ＩＬ１１）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を含む合成培養培地であって、前記合成培養培地が血清、フィーダー細胞、および細胞外マトリックス成分を含まず、前記ＩＬ１１が０．５ｎｇ／ｍｌ～５ｎｇ／ｍｌの濃度で与えられ、前記ＣＮＴＦが０．５ｎｇ／ｍｌ～５ｎｇ／ｍｌの濃度で与えられ、前記合成培養培地が、基体への接着なしに懸濁培養においてヒト多能性幹細胞を未分化状態で維持することができる、合成培養培地。

【請求項2】

塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む、請求項１に記載の合成培養培地。

【請求項3】

血清代替物をさらに含む、請求項１～２のいずれかに記載の合成培養培地。

【請求項4】

前記血清代替物は動物由来混入物を含まない、請求項３に記載の合成培養培地。

【請求項5】

前記合成培養培地はＫｏ－ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｍａｂ ＡＤＣＢ培地、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ、ＴｅＳＲおよびＴｅＳＲ２からなる群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の合成培養培地。

【請求項6】

前記合成培養培地はＫｏ－ＤＭＥＭおよびＤＭＥＭ／Ｆ１２からなる群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載の合成培養培地。

【請求項7】

基体への接着なしに懸濁培養においてヒト多能性幹細胞を未分化状態で拡大することができる、請求項１～６のいずれかに記載の合成培養培地。

【請求項8】

ヒト多能性幹細胞と、請求項１～７のいずれかに記載の合成培養培地とを含む細胞培養物。

【請求項9】

マトリックスと、請求項１～７のいずれかに記載の合成培養培地とを含む培養システム。

【請求項10】

未分化状態のヒト多能性幹細胞を拡大し、かつ維持する方法であって、前記ヒト多能性幹細胞を請求項１～７のいずれかに記載の合成培養培地で培養し、それにより前記未分化状態の前記ヒト多能性幹細胞を拡大し、かつ維持することを含む方法。

【請求項11】

前記未分化状態の前記ヒト多能性幹細胞の拡大、および維持は懸濁培養で行われる、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記培養は、前記ヒト多能性幹細胞を単一細胞として拡大することを可能にする条件下で行われる、請求項１０または１１に記載の方法。

【請求項13】

系譜特異的細胞をヒト多能性幹細胞から作製する方法であって、
（ａ）前記ヒト多能性幹細胞を請求項１０～１２のいずれかに記載の方法に従って培養し、それにより拡大された未分化幹細胞を得ること；
（ｂ）前記拡大された未分化幹細胞を系譜特異的細胞の分化および／または拡大に好適な培養条件に供し、それにより前記系譜特異的細胞を前記ヒト多能性幹細胞から作製すること、
を含む方法。

【請求項14】

血清を含まない請求項１～７のいずれかに記載の合成培養培地、および再プログラム化因子を一時的に発現するような遺伝子操作を受けたヒト人工多能性幹細胞の集団を含む細胞培養物であって、前記再プログラム化因子がｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２因子、またはＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８因子からなり、前記ヒト人工多能性幹細胞が懸濁培養において単一細胞として培養され、前記ヒト人工多能性幹細胞の集団のうちの少なくとも５０％がＯＣＴ４^＋／ＴＲＡ１－６０^－／ＴＲＡ１－８１^－／ＳＳＥＡ１^＋／ＳＳＥＡ４^－の発現シグナチャーを特徴とし、かつ内胚葉、外胚葉および中胚葉の、胚の各胚葉に分化することができ、前記集団が１ミリリットルの培養培地あたり少なくとも１０００個のヒト人工多能性幹細胞を含む、細胞培養物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、その一部の実施形態において、多能性幹細胞を、凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で培養する方法、および該方法によって作製される多能性幹細胞の単離された集団に関連し、より具体的には、これに限定はされないが、未分化状態の多能性幹細胞を維持することができる新規な培養培地、および多能性幹細胞を増殖性かつ多能性の未分化状態で維持しながら二次元培養システムまたは三次元培養システムで培養する方法に関連する。

【背景技術】

【0002】

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の特異的分化能は、それらを、初期ヒト発生、系譜関与、分化プロセスを研究するための、かつ工業目的および細胞に基づく治療として使用するための最適モデルの１つの基礎とする。

【0003】

誘導多能性（ｉＰＳ）細胞は、インビトロおよびインビボの双方で３つの胚性胚葉の代表的組織に分化する能力を有するＥＳＣ様細胞に再プログラム化される体細胞である。マウスまたはヒトｉＰＳ細胞は、体細胞における４つの転写因子、ｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２の過剰発現によって生成された。ｉＰＳ細胞は、ＥＳＣと同じコロニー形態を形成し、かつ、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｕｔｆ１、Ｔｃｌ１およびＬＩＦ受容体遺伝子などのあまり重要でないマーカー以外の、Ｍｙｂ、Ｋｉｔ、ＧＤｆ３およびＺｉｃ３などの数種の典型的なＥＳＣマーカーを発現することが示され、それにより、ｉＰＳ細胞がＥＳ細胞に類似するが同一でないことが確認された［ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、２００７年；Ｏｋｉｔａら、２００７年］。Ｙｕ Ｊｕｎｙｉｎｇら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：１９１７－１９２０頁、２００７年）は、線維芽細胞由来ｉＰＳ細胞およびｈＥＳＣに共通の遺伝子発現パターンを見出した。

【0004】

さらなる試験によれば、ｉＰＳ細胞が、体細胞をＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８で形質転換する一方、腫瘍遺伝子Ｃ－Ｍｙｃの使用を省くことによって取得可能であることが示された［Ｙｕ Ｊ．ら、２００７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７－１９２０頁；Ｎａｋａｇａｗａら、２００８年］。ｉＰＳ細胞導出方法の改善には、ウイルスベクターの代わりとしてのプラスミドの使用またはゲノムへの組込みを全く伴わない導出が含まれ、その場合、臨床用途におけるｉＰＳ細胞の将来の使用が簡素化されうる［Ｙｕ Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９年、３２４：７９７－８０１頁］。

【0005】

現在利用可能なｉＰＳ細胞は、胚性線維芽細胞［ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、２００７年］、ｈＥＳＣから形成される線維芽細胞［Ｐａｒｋら、２００８年］、胎児線維芽細胞［Ｙｕら、２００７年；Ｐａｒｋら、２００８年］、包皮線維芽細胞［Ｙｕら、２００７年；Ｐａｒｋら、２００８年］、成体皮膚および皮膚組織［Ｈａｎｎａら、２００７年；Ｌｏｗｒｙら、２００８年］、ｂ－リンパ球［Ｈａｎｎａら、２００７年］、ならびに成体肝および胃細胞［Ａｏｉら、２００８年］、に由来するものである。

【0006】

ｉＰＳ細胞は、ｈＥＳＣと同様、従来から二次元培養下で支持層を用いて培養され、それは未分化状態でのその連続的成長を可能にする。例えば、ｉＰＳ細胞は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が補充された培地の存在下で、不活性化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）または包皮線維芽細胞からなるフィーダー層上で培養された［ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年、Ｍｅｉｓｎｎｅｒら、２００７年］。培養方法のさらなる改善には、ｉＰＳ細胞を、血清代替物および１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有するより限定された培地の存在下、ＭＥＦフィーダー層上で培養することが含まれる（Ｐａｒｋら、２００８年）。しかし、臨床用途（例えば細胞に基づく治療）または工業目的としては、ｉＰＳ細胞は、制御プロセスを伴う、限定された異種成分不含（例えば動物フリー）およびスケーラブルな培養システム下で培養される必要がある。

【0007】

ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０２６３５３号パンフレットでは、ヒト胚性幹細胞を二次元培養システム下、未分化状態で維持することを目的とした、ＴＧＦβアイソフォーム、またはＩＬ６と可溶性ＩＬ６受容体の間で形成されるキメラ体（以下ＩＬ６ＲＩＬ６と称する）を含む、十分に限定された異種成分不含培地が開示されている。

【0008】

米国特許出願公開第２００５／０２３３４４６号明細書では、ｈＥＳＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）上で培養される場合に未分化状態で維持するため、ｂＦＧＦ、インスリンおよびアスコルビン酸を含む限定培地が開示されている。

【0009】

Ｌｕｄｗｉｇ Ｔ．Ｅ．ら、２００６年（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２４：１８５－７頁）では、ｈＥＳＣを、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンからなるマトリックス上で培養するためのＴｅＳＲ１限定培地が開示されている。

【0010】

米国特許出願公開第２００９／００２９４６２号明細書では、多能性幹細胞を、微小担体または細胞カプセル化を用いて懸濁液中で拡大する方法が開示されている。

【0011】

ＰＣＴ公開の国際公開第２００８／０１５６８２号パンフレットでは、ヒト胚性幹細胞を、基質接着を有しない培養条件下の懸濁培養下で拡大・維持する方法が開示されている。

【0012】

米国特許出願公開第２００７／０１５５０１３号明細書では、多能性幹細胞を、多能性幹細胞に接着する担体を使用し、懸濁液中で増殖させる方法が開示されている。

【0013】

米国特許出願公開第２００８／０２４１９１９号明細書（Ｐａｒｓｏｎｓら）では、多能性幹細胞を、無細胞マトリックスを含む細胞培養容器内の、ｂＦＧＦ、インスリンおよびアスコルビン酸を含む培地中で、懸濁培養下で培養する方法が開示されている。

【0014】

米国特許出願公開第２００８／０１５９９９４号明細書（Ｍａｎｔａｌａｒｉｓら）では、アルギン酸ビーズ内部にカプセル化された多能性ＥＳ細胞を、血清代替物およびｂＦＧＦを含む培地中の三次元培養下で培養する方法が開示されている。

【0015】

米国特許出願公開第２００７／０２６４７１３号明細書では、未分化幹細胞を、ならし培地を使用する容器内、微小担体上で懸濁培養する方法が開示されている。

【0016】

ＰＣＴ公開の国際公開第２００６／０４０７６３号パンフレットでは、拡大した胚盤胞（例えば、受精後少なくとも９日後）に由来する単離された霊長類胚細胞、ならびに、当該細胞の作製方法および使用方法が開示されている。

【0017】

追加の背景技術は、米国特許出願公開第２００９／０１３０７５９号明細書；Ｓｔａｎｋｏｆｆ Ｂ．ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２２：９２２１－９２２７頁，２００２年；Ｅｒｎｓｔ Ｍ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１：３０１３６－３０１４３頁，１９９６年；Ｒｏｅｂ Ｅら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９３年，１８：１４３７－４２頁；米国特許出願公開第２００４／０２３５１６０号明細書；Ｐｅｒａ Ｍ．Ｆ．ら、２０００年．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１３，５－１０頁．Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙを含む。

【発明の概要】

【0018】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＯＣＴ４^＋／ＴＲＡ１－６０^－／ＴＲＡ１－８１^－／ＳＳＥＡ１^＋／ＳＳＥＡ４^－の発現シグナチャー（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を特徴とするヒト多能性幹細胞を少なくとも５０％含み、前記ヒト多能性幹細胞が、内胚葉、外胚葉および中胚葉の、胚の各胚葉に分化することができる、ヒト多能性幹細胞の単離された集団が提供される。

【0019】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、未分化状態の多能性幹細胞（ＰＳＣ）を拡大し、かつ維持する方法であって、（ａ）前記ＰＳＣを、少なくとも２回、最大１０回の継代にわたってＰＳＣ凝集塊の単一細胞への機械的解離による懸濁培養で継代し、それにより凝集塊を含まないＰＳＣの懸濁培養物を得ること；および（ｂ）前記凝集塊を含まないＰＳＣの前記懸濁培養物を、前記凝集塊の解離を伴うことなく継代し、それにより前記未分化状態の前記ＰＳＣを拡大し、かつ維持することを含む方法が提供される。

【0020】

本発明の一部の実施形態によれば、上記方法はさらに、上記ＰＳＣを、上記未分化状態の上記多能性幹細胞の拡大を可能にする条件下で培養することを含む。

【0021】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、胚性幹細胞株を導出する方法であって、（ａ）胚性幹細胞（ＥＳＣ）を、着床前段階の胚盤胞、着床後段階の胚盤胞および／または胎児の生殖組織から得ること；および（ｂ）前記ＥＳＣを、少なくとも２回、最大１０回の継代にわたってＥＳＣ凝集塊の単一細胞への機械的解離による懸濁培養で継代し、それにより凝集塊を含まないＥＳＣの懸濁培養物を得ること；および（ｃ）前記凝集塊を含まないＥＳＣの前記懸濁培養物を、前記凝集塊の解離を伴うことなく継代し、それにより前記胚性幹細胞株を導出することを含む方法が提供される。

【0022】

本発明の一部の実施形態によれば、上記方法はさらに、上記ＥＳＣを、上記未分化状態の上記胚性単一幹細胞の拡大を可能にする条件下で培養することを含む。

【0023】

本発明の一部の実施形態によれば、上記継代は酵素的解離がない条件下で行われる。

【0024】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、多能性幹細胞をクローニングする方法であって、本発明の一部の実施形態の方法に従って得られる単一多能性幹細胞、または本発明の一部の実施形態の方法に従って得られる単一胚性幹細胞を、前記単一多能性幹細胞の拡大または前記単一胚性幹細胞の拡大をそれぞれ未分化状態で可能にする条件下の懸濁培養で培養し、それにより前記単一多能性幹細胞または前記単一胚性幹細胞をそれぞれクローン培養物に拡大し、それにより前記多能性幹細胞をクローニングすることを含む方法が提供される。

【0025】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養は、細胞凝集塊を解離させることなく行われる。

【0026】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、系譜特異的細胞を多能性幹細胞から作製する方法であって、（ａ）前記多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の方法に従って懸濁培養で培養し、それにより凝集塊を含まない拡大された未分化多能性幹細胞を得ること；および（ｂ）凝集塊を含まない前記拡大された未分化多能性幹細胞を系譜特異的細胞の分化および／または拡大に好適な培養条件に供し、それにより前記系譜特異的細胞を前記多能性幹細胞から作製することを含む方法が提供される。

【0027】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、胚様体を多能性幹細胞から作製する方法であって、（ａ）前記多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の方法に従って懸濁培養で培養し、それにより凝集塊を含まない拡大された未分化多能性幹細胞を得ること；および（ｂ）凝集塊を含まない前記拡大された未分化多能性幹細胞を、前記多能性幹細胞を胚様体に分化させるために好適な培養条件に供し、それにより前記胚様体を前記多能性幹細胞から作製することを含む方法が提供される。

【0028】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、系譜特異的細胞を多能性幹細胞から作製する方法であって、（ａ）前記多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の方法に従って懸濁培養で培養し、それにより凝集塊を含まない拡大された未分化多能性幹細胞を得ること；（ｂ）凝集塊を含まない前記拡大された未分化多能性幹細胞を、前記多能性幹細胞を胚様体に分化させるために好適な培養条件に供すること；および（ｃ）前記胚様体の細胞を系譜特異的細胞の分化および／または拡大に好適な培養条件に供し、それにより前記系譜特異的細胞を前記多能性幹細胞から作製することを含む方法が提供される。

【0029】

本発明の一部の実施形態によれば、凝集塊を含まない上記懸濁培養物は、単一細胞または小さいクラスターを含み、各クラスターは最大約２００個の多能性幹細胞を含む。

【0030】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養は基体接着がない培養条件下で行われる。

【0031】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養条件は、Ｒｈｏ会合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含まない。

【0032】

本発明の一部の実施形態によれば、上記多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞である。

【0033】

本発明の一部の実施形態によれば、上記ヒト多能性幹細胞は胚性幹細胞である。

【0034】

本発明の一部の実施形態によれば、上記ヒト多能性幹細胞は誘導多能性幹細胞である。

【0035】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、本発明の一部の実施形態の方法に従って得られ、かつ内胚葉、外胚葉および中胚葉の、胚の各胚葉に分化することができる、細胞凝集塊を含まない多能性幹細胞の単離された集団が提供される。

【0036】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、間葉系幹細胞を懸濁培養で作製する方法であって、本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞を多能性幹細胞の間葉系幹細胞への分化に好適な条件下の懸濁培養で培養し、それにより前記間葉系幹細胞を前記懸濁培養で作製することを含む方法が提供される。

【0037】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、本発明の一部の実施形態の方法によって作製される懸濁培養物における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の単離された集団が提供される。

【0038】

本発明の一部の実施形態によれば、上記細胞の少なくとも４０％がＣＤ７３＋／ＣＤ３１－／ＣＤ１０５＋の発現シグナチャーによって特徴づけられる。

【0039】

本発明の一部の実施形態によれば、上記ＭＳＣは、脂肪形成系譜、骨芽細胞系譜および軟骨形成系譜からなる群から選択される細胞系譜への懸濁培養での分化が可能である。

【0040】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ニューロン始原体細胞を懸濁培養で作製する方法であって、本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞をニューロン始原体細胞の分化に好適な条件下の懸濁培養で培養し、それにより前記ニューロン始原体細胞を前記懸濁培養で作製することを含む方法が提供される。

【0041】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、本発明の一部の実施形態の方法によって作製される懸濁培養物におけるニューロン始原体細胞の単離された集団が提供される。

【0042】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、内胚葉細胞を懸濁培養で作製する方法であって、本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞を前記多能性幹細胞の内胚葉細胞への分化に好適な条件下の懸濁培養で培養し、それにより前記内胚葉細胞を前記懸濁培養で作製することを含む方法が提供される。

【0043】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、本発明の一部の実施形態の方法によって作製される懸濁培養物における内胚葉細胞の単離された集団が提供される。

【0044】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、インターロイキン１１（ＩＬ１１）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を含む培養培地が提供される。

【0045】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌの濃度の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体とを含む培養培地が提供される。

【0046】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、動物由来混入物非含有の血清代替物と、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体とを含む培養培地が提供される。

【0047】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、多能性幹細胞と、本発明の一部の実施形態の培養培地とを含む細胞培養物が提供される。

【0048】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、マトリックスと、本発明の一部の実施形態の培養培地とを含む培養システムが提供される。

【0049】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、多能性幹細胞と、血清非含有の培養培地とを含み、前記培養培地が可溶性インターロイキン６受容体（ｓＩＬ６Ｒ）およびインターロイキン６（ＩＬ６）を含む細胞培養物であって、前記ｓＩＬ６Ｒの濃度が少なくとも５ｎｇ／ｍｌであり、かつ前記ＩＬ６の濃度が少なくとも３ｎｇ／ｍｌである細胞培養物が提供される。

【0050】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、多能性幹細胞と、インターロイキン１１（ＩＬ１１）およびオンコスタチンを含む培養培地とを含む細胞培養物が提供される。

【0051】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、未分化状態の多能性幹細胞を拡大し、かつ維持する方法であって、前記多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の培養培地で培養し、それにより前記未分化状態の前記多能性幹細胞を拡大し、かつ維持することを含む方法が提供される。

【0052】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、系譜特異的細胞を多能性幹細胞から作製する方法であって、（ａ）前記多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の方法に従って培養し、それにより拡大された未分化幹細胞を得ること；（ｂ）前記拡大された未分化幹細胞を系譜特異的細胞の分化および／または拡大に好適な培養条件に供し、それにより前記系譜特異的細胞を前記多能性幹細胞から作製することを含む方法が提供される。

【0053】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、本発明の一部の実施形態の方法に従って作製される多能性幹細胞の集団を含み、前記集団が１ミリリットルの培地あたり少なくとも１０００個の多能性幹細胞を含む細胞培養物が提供される。

【0054】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、細胞由来の治療を目的とする本発明の一部の実施形態の細胞培養物の使用が提供される。

【0055】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、医薬のスクリーニングを目的とする本発明の一部の実施形態の細胞培養物の使用が提供される。

【0056】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ワクチンの製造を目的とする本発明の一部の実施形態の細胞培養物の使用が提供される。

【0057】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、タンパク質の製造を目的とする本発明の一部の実施形態の細胞培養物の使用が提供される。

【0058】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ１１が、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0059】

本発明の一部の実施形態によれば、ＣＮＴＦが、少なくとも０．１ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0060】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ１１が、少なくとも１ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0061】

本発明の一部の実施形態によれば、ＣＮＴＦが、少なくとも１ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0062】

本発明の一部の実施形態によれば、ｂＦＧＦの濃度が、５０ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌの間の範囲から選択される。

【0063】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体が、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0064】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体が、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0065】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養培地はさらに、血清代替物を含む。

【0066】

本発明の一部の実施形態によれば、血清代替物が、少なくとも１０％の濃度で用いられる。

【0067】

本発明の一部の実施形態によれば、血清代替物は動物由来混入物を含まない。

【0068】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体が５０ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0069】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体が５０ｐｇ／ｍｌ～１５０ｐｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0070】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養培地はさらに、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む。

【0071】

本発明の一部の実施形態によれば、ｂＦＧＦが、少なくとも４ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0072】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養培地はさらに、アスコルビン酸を含む。

【0073】

本発明の一部の実施形態によれば、アスコルビン酸が２５μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0074】

本発明の一部の実施形態によれば、ｂＦＧＦが１００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられ、かつＩＬ６ＲＩＬ６が１００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0075】

本発明の一部の実施形態によれば、ｂＦＧＦが１００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられ、かつＩＬ６ＲＩＬ６が１００ｐｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0076】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養培地はさらに、ＴＧＦβを含む。

【0077】

本発明の一部の実施形態によれば、ＴＧＦβはＴＧＦβ１を含む。

【0078】

本発明の一部の実施形態によれば、ＴＧＦβはＴＧＦβ３を含む。

【0079】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養培地は血清非含有である。

【0080】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養培地は動物由来混入物を含まない。

【0081】

本発明の一部の実施形態によれば、上記未分化状態の上記多能性幹細胞の拡大、および維持は懸濁培養で行われる。

【0082】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養は静的な懸濁培養を含む条件下で行われる。

【0083】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養は動的な懸濁培養を含む条件下で行われる。

【0084】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養は上記多能性幹細胞を単一細胞として拡大することを可能にする条件下で行われる。

【0085】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養は細胞クラスターの酵素的解離を含まない条件下で行われる。

【0086】

本発明の一部の実施形態によれば、上記未分化状態の上記多能性幹細胞の拡大、および維持が二次元培養システムで行われる。

【0087】

本発明の一部の実施形態によれば、二次元培養システムは、マトリックスと上記培養培地とを含む。

【0088】

本発明の一部の実施形態によれば、上記多能性幹細胞は胚性幹細胞を含む。

【0089】

本発明の一部の実施形態によれば、上記多能性幹細胞は誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含む。

【0090】

本発明の一部の実施形態によれば、胚性幹細胞はヒト胚性幹細胞である。

【0091】

本発明の一部の実施形態によれば、誘導多能性幹細胞はヒト誘導多能性幹細胞である。

【0092】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養培地は未分化状態の上記多能性幹細胞を拡大することができる。

【0093】

本発明の一部の実施形態によれば、上記多能性幹細胞の少なくとも８５％が未分化状態にある。

【0094】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養条件は、インターロイキン１１（ＩＬ１１）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を含む培養培地を含む。

【0095】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養条件は、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌの濃度の塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体とを含む培養培地を含む。

【0096】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養条件は、動物由来混入物非含有の血清代替物と、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体とを含む培養培地を含む。

【0097】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養条件は、可溶性インターロイキン６受容体（ｓＩＬ６Ｒ）およびインターロイキン６（ＩＬ６）を含み、ｓＩＬ６Ｒの濃度が少なくとも５ｎｇ／ｍｌであり、かつＩＬ６の濃度が少なくとも３ｎｇ／ｍｌである血清非含有の培養培地を含む。

【0098】

本発明の一部の実施形態によれば、上記培養条件は、インターロイキン１１（ＩＬ１１）およびオンコスタチンを含む培養培地を含む。

【0099】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、血清および血清代替物を含む培養培地が提供される。

【0100】

本発明の一部の実施形態によれば、血清代替物が約１０％の濃度で用いられる。

【0101】

本発明の一部の実施形態によれば、血清が１０％の濃度で用いられる。

【0102】

本発明の一部の実施形態によれば、血清および血清代替物を含む上記培養培地はｂＦＧＦを含まない。

【0103】

本発明の一部の実施形態によれば、血清および血清代替物を含む上記培養培地はＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を含まない。

【0104】

本発明の一部の実施形態によれば、血清および血清代替物を含む上記培養培地はさらに、Ｌ－グルタミン、β－メルカプトエタノールおよび非必須アミノ酸ストック液を含む。

【0105】

本発明の一部の実施形態によれば、血清および血清代替物を含む上記培養培地は、８０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％のノックアウト血清代替物（ＳＲ）、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック液からなる。

【0106】

本発明の一部の実施形態によれば、血清および血清代替物を含む上記培養培地は、多能性幹細胞の間葉系幹細胞への懸濁状態での分化に好適である。

【0107】

本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞の間葉系幹細胞への分化に好適な条件は、血清および血清代替物を含む培養培地を含む。

【0108】

本発明の一部の実施形態によれば、上記方法はさらに、本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞を非凍結の生細胞として輸送することを含む。

【0109】

本発明の一部の実施形態によれば、上記多能性幹細胞は、当該細胞を非凍結の生細胞として輸送した後において依然として生存可能で、増殖性で、かつ未分化状態である。

【0110】

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。

【0111】

本発明の実施形態の方法および／またはシステムを実行することは、選択されたタスクを、手動操作で、自動的にまたはそれらを組み合わせて実行または完了することを含んでいる。さらに、本発明の装置、方法および／またはシステムの実施形態の実際の機器や装置によって、いくつもの選択されたステップを、ハードウェア、ソフトウェア、またはファームウェア、あるいはオペレーティングシステムを用いるそれらの組合せによって実行できる。

【0112】

例えば、本発明の実施形態による選択されたタスクを実行するためのハードウェアは、チップまたは回路として実施されることができる。ソフトウェアとして、本発明の実施形態により選択されたタスクは、コンピュータが適切なオペレーティングシステムを使って実行する複数のソフトウェアの命令のようなソフトウェアとして実施されることができる。本発明の例示的な実施形態において、本明細書に記載される方法および／またはシステムの例示的な実施形態による１つ以上のタスクは、データプロセッサ、例えば複数の命令を実行する計算プラットフォームで実行される。任意選択的に、データプロセッサは、命令および／またはデータを格納するための揮発性メモリ、および／または、命令および／またはデータを格納するための不揮発性記憶装置（例えば、磁気ハードディスク、および／または取り外し可能な記録媒体）を含む。任意選択的に、ネットワーク接続もさらに提供される。ディスプレイおよび／またはユーザ入力装置（例えば、キーボードまたはマウス）も、任意選択的にさらに提供される。

【図面の簡単な説明】

【0113】

本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。

【0114】

【図1A-1C】図１Ａ－１Ｃは、４日間続いた大西洋をまたぐ（イスラエルからボルチモア（米国）まで）生細胞の輸送後、本発明の一部の実施形態に従って懸濁培養で成長させたＩ３ ＥＳＣの写真である。Ｉ３細胞を輸送前に少なくとも２０回の継代にわたって懸濁状態で培養した。図１Ａおよび図１Ｂ－到着し、ＣＭ１００Ｆｐ培養培地を使用して懸濁状態で再置床された３日後（図１Ａ）および１日後（図１Ｂ）におけるＩ３の形態学。細胞は、未分化細胞からなる典型的な球形態学を明示する。図１Ｃ－到着し、ＭＥＦとともに再置床された３日後におけるＩ３の形態学。細胞はＥＳＣの典型的なコロニー形態学を明示する。

【0115】

【図2A-2D】図２Ａ－２Ｄは、多能性の各種マーカーに対する抗体により染色されるＩ３．２ ｈＥＳＣの蛍光像である（免疫蛍光染色）。本発明の一部の実施形態の新規な培地（例えば、この場合にはＣＭＴｅＳＲ２培地）で培養された細胞を、典型的なマーカーであるＯｃｔ４（図２Ａ）、ＳＳＥＡ４（図２Ｂ）、Ｔｒａ－１６０（図２Ｃ）およびＴＲＡ－１－８１（図２Ｄ）を使用してそれらの多能性について調べた。この例では、ｐ１９＋８３の継代でのＩ３．２（すなわち、このＩ３．２クローン細胞株は１９回目の継代におけるＩ３細胞株に由来し、分析用の細胞はクローン単離後８３回目の継代におけるものであった）を懸濁状態で５回の継代にわたってＣＭＴＥＳＲ２培地により培養し、その後、ＭＥＦ上で再培養した。細胞は、すべての試験されたマーカーについて陽性であることが見出された。

【0116】

【図3A】図３Ａは、本発明の一部の実施形態の新規な培養培地を使用して懸濁状態で培養された細胞の形態学を示す、Ｉ３．２ＥＳＣ系統の写真である。図３Ａ－ｐ１９＋８７の継代（すなわち、クローン単離後８７回の継代）でのＩ３．２を、ｃｍＴｅＳＲ２を使用して２６回の継代にわたって懸濁状態で培養し、その後、ＭＥＦとともに再置床した。典型的なＥＳＣコロニー形態学を明示する。

【図3B】図３Ｂは、本発明の一部の実施形態の新規な培養培地を使用して懸濁状態で培養された細胞の形態学を示す、Ｉ３．２ＥＳＣ系統の写真である。図３Ｂ－８０回目の継代（ｐ８０）でのＪ３細胞［遅れた（伸長した）胚盤胞細胞株］を、ＮＣＭ１００培地を使用して懸濁状態で２回の継代にわたって培養したもの。未分化細胞の典型的な球形態学を明示する。

【図3C】図３Ｃは、本発明の一部の実施形態の新規な培養培地を使用して懸濁状態で培養された細胞の形態学を示す、Ｉ３．２ＥＳＣ系統の写真である。図３Ｃ－ｐ２９＋４８でのＨ９．２細胞（すなわち、２９回目の継代でのＨ９細胞株を単一細胞クローニングに供し、単離後４８回目の継代における得られたクローンｈＥＳＣ系統を使用した）を、ＩＬＣＮＴＦ培地を使用して懸濁状態で５回の継代にわたって培養した。未分化細胞の典型的な球形態学を明示する。

【0117】

【図4A】図４Ａは、懸濁培養において単一細胞を示すＨ９ ｈＥＳＣ系統の写真である。図４Ａ－ｐ５３（５３回目の継代）でのＨ９を、ＣＭｒｂ１００Ｆｐ培地を使用して、静的培養での単一細胞としての懸濁状態で９回の継代にわたって培養したもの。これらの結果により、本発明の一部の実施形態に従って懸濁培養で培養された多能性幹細胞が単一細胞成長パターンを取ることが明らかになる。

【図4B】図４Ｂは、懸濁培養において単一細胞を示すヒトＣ２ ｉＰＳ細胞株の写真である。図４Ｂ－Ｃ２ ｉＰＳ細胞を、ＣＭ１００Ｆｐ培地を使用して単一細胞としてスピナーフラスコ（動的培養）で１．５ヶ月間にわたって培養したもの。細胞をトリパンブルーにより染色した。死細胞が青く染色される。これらの結果により、本発明の一部の実施形態に従って懸濁培養で培養された多能性幹細胞が単一細胞成長パターンを取ることが明らかになる。

【0118】

【図5A-5C】図５Ａ－５Ｃは、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｗａｖｅバイオリアクター（Ｂｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ｃｕｌｔｉｂａｇ ＲＭ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、米国）を使用して動的条件下での懸濁状態で培養された多能性幹細胞を示す顕微鏡観察写真である。誘導多能性幹細胞株Ｃ２を、波抑制型バイオリアクターにおいて５日間、単一細胞として培養し（図５Ａ）、または２００μｍ以下の小球として培養した（図５Ｂ）。図５Ｃ－単一細胞としての懸濁状態で成長させた細胞をＭＥＦ上で再培養した（Ｏｃｔ４染色）。生細胞の数が、ｉＰＳ細胞の特徴（例えば、Ｏｃｔ４発現（図５Ｃ）など）を維持しながら６４倍増大した。

【0119】

【図6A-6C】図６Ａ－６Ｃは、懸濁状態で培養された単一細胞の凍結／解凍および剪断後の多能性幹細胞を示す顕微鏡観察写真である。Ｃ２細胞株（導出後８９回目の継代での包皮線維芽細胞由来ｉＰＳであって、その細胞をｃｍｒｂ１００ｐ培養培地の存在下、懸濁培養で４８回の継代にわたって培養した）を、下記の凍結用溶液を使用して凍結した：９０％の血清代替物（ＳＲ）および１０％のＤＭＳＯ（図６Ａ）；２０％のＳＲ、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％のＤＭＳＯ（図６Ｂ）；ならびにＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ ＨａＥｍｅｋ、イスラエル）製の血清非含有凍結用溶液（図６Ｃ）。液体窒素中に５日間凍結した後細胞を解凍し、懸濁培養において再培養した。凍結／解凍および懸濁培養での再培養後の細胞が示される。細胞の７０％超がこの手順に耐え、懸濁培養に直接に回復したことに留意すること。

【0120】

【図7A-7C】図７Ａ－７Ｃは、神経系譜由来の細胞への多能性幹細胞の導かれた分化を明示する免疫蛍光染色像である。４０回を超える継代にわたって懸濁状態で培養されたＩ６をレチノイン酸の添加によって分化誘導し、下記の典型的な神経マーカーについて染色した：ネスチン（図７Ａ）、β－チューブリン（図７Ｂ）およびポリシアリル酸化（ＰＳＡ）神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）（図７Ｃ）。これらの特異的マーカーが赤く染色され、青色染色はＤＡＰＩ染色を表す。

【0121】

【図8A-8B】図８Ａ－８Ｂは、多能性幹細胞の神経系譜への分化を明示するＦＡＣＳ分析である。図８Ａ－細胞の６８％がＮＣＡＭについて陽性であることを示す、ＮＣＭ ＦＩＴＣ抗体を使用するＦＡＣＳ分析。図８Ｂ－ＮＣＡＭ ＩｇＧを使用するＦＡＣＳ分析（イソタイプコントロール）。

【0122】

【図9A】図９Ａは、神経特異的マーカーに関する半定量化ＲＴ－ＰＣＲ分析の結果を示すヒストグラムである。ＲＴ－ＰＣＲ分析を、懸濁状態で培養され、レチノイン酸によって神経細胞系譜に誘導された細胞、および未分化として懸濁状態で培養された細胞に対して行った。

【図9B-9G】図９Ｂ－９Ｇは、神経特異的マーカーに関する半定量化ＲＴ－ＰＣＲ分析の結果を示すゲル像である。ＲＴ－ＰＣＲ分析を、懸濁状態で培養され、レチノイン酸によって神経細胞系譜に誘導された細胞、および未分化として懸濁状態で培養された細胞に対して行った。ＯＣＴ－４遺伝子（図９Ｂ）、ＰＡＸ６遺伝子（図９Ｃ）、重鎖神経フィラメント（ＨＮＦ）遺伝子（図９Ｄ）、ネスチン遺伝子（図９Ｅ）およびＬＩＭホメオボックス２（ＬＨＸ２）遺伝子（図９Ｆ）およびＧＡＰＤＨ遺伝子（コントロール遺伝子、図９Ｇ）のＲＴ－ＰＣＲプライマーが下記の実施例の節において表１に記載される。結果は３回の独立した実験の平均を表す。レーン１～レーン３は３つの異なる生物学的反復に由来し、レーン４は、４０回の継代にわたって懸濁状態で培養されたＩ６の未分化細胞である。

【0123】

【図10A-10B】図１０Ａ－１０Ｂは、内胚葉系譜の細胞への多能性幹細胞の誘導を示す免疫蛍光像である。内胚葉系譜に分化誘導されたＣ２細胞株由来の細胞。分化誘導後１０日において、細胞をＰＤＸ１マーカー（β－細胞に関連づけられる転写因子）について染色し（図１０Ａ、緑色）、またＤＡＰＩ（核染色）についても染色した（図１０Ｂ、青色）。

【0124】

【図11A-11B】図１１Ａ－１１Ｂは、ＭＥＦ上に再置床された後のｈＥＳＣコロニーの形態学を示す２つの代表的な像である。単一細胞としての懸濁状態で１７回の継代にわたって培養されたＣＬ１（１３Ｅ１）細胞をＭＥＦ上に再置床し、位相差を使用して写真撮影した。フィーダー細胞（ＭＥＦ）上に再置床されたとき、細胞が様々な細胞間間隔、透明な辺縁部および大きい核対細胞質比を有する多能性細胞の典型的な形態学によって特徴づけられるコロニーを形成することに留意すること。

【0125】

【図12A-12B】図１２Ａ－１２Ｂは、多能性マーカーのＦＡＣＳ分析を示すヒストグラムである。ヒトＥＳＣを二次元（２－Ｄ）のＭＥＦ上で成長させ、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４の各マーカーの発現をＦＡＣＳによってアッセイした。図１２Ａ－２Ｄで培養され、ＴＲＡ１－６０抗体によって分けられたＨ１４細胞（青色曲線）。細胞の７４．９％がＴＲＡ１－６０陽性であることに留意すること。図１２Ｂ－２Ｄで培養され、ＴＲＡ１－８１抗体によって分けられたＨ１４細胞（青色曲線）。細胞の７１．２％がＴＲＡ１－８１陽性であることに留意すること。図１２Ａ～図１２Ｂのそれぞれにおける赤色曲線は陰性対照を表す。

【図12C-12D】図１２Ｃ－１２Ｄは、多能性マーカーのＦＡＣＳ分析を示すヒストグラムである。ヒトＥＳＣを、細胞凝集塊としての懸濁培養で成長させ、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４の各マーカーの発現をＦＡＣＳによってアッセイした。図１２Ｃ－１０回を超える継代にわたって細胞凝集塊としての懸濁状態で培養され、ＴＲＡ１－６０抗体によって分けられたＩ３細胞（青色曲線）。細胞の９４．６％がＴＲＡ１－６０陽性であることに留意すること。図１２Ｄ－１０回を超える継代にわたって細胞凝集塊としての懸濁状態で培養され、ＴＲＡ１－８１抗体によって分けられたＩ３細胞（青色曲線）。細胞の９３％がＴＲＡ１－８１陽性であることに留意すること。図１２Ｃ～図１２Ｄのそれぞれにおける赤色曲線は陰性対照を表す。

【図12E-12F】図１２Ｅ－１２Ｆは、多能性マーカーのＦＡＣＳ分析を示すヒストグラムである。ヒトＥＳＣを、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で成長させ、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４の各マーカーの発現をＦＡＣＳによってアッセイした。図１２Ｅ－１０回を超える継代にわたって単一細胞としての懸濁状態で培養され、ＴＲＡ１－６０抗体によって分けられたＨ１４細胞（青色曲線）。細胞の０．６５％のみがＴＲＡ１－６０陽性であることに留意すること。図１２Ｆ－１０回を超える継代にわたって単一細胞としての懸濁状態で培養され、ＴＲＡ１－８１抗体によって分けられたＨ１４細胞（青色曲線）。細胞の０．７％のみがＴＲＡ１－８１陽性であることに留意すること。図１２Ｅ～図１２Ｆのそれぞれにおける赤色曲線は陰性対照を表す。

【図12G-12H】図１２Ｇ－１２Ｈは、多能性マーカーのＦＡＣＳ分析を示すヒストグラムである。ヒトＥＳＣを、細胞凝集塊としての懸濁培養で成長させ、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４の各マーカーの発現をＦＡＣＳによってアッセイした。図１２Ｇ－１０回を超える継代にわたって細胞凝集塊としての懸濁状態で培養され、ＳＳＥＡ１抗体によって分けられたＩ３細胞（青色曲線）。細胞の１１．１％がＳＳＥＡ１陽性であることに留意すること。図１２Ｈ－１０回を超える継代にわたって細胞凝集塊としての懸濁状態で培養され、ＳＳＥＡ４抗体によって分けられたＩ３細胞（灰色曲線）。細胞の９８．４％がＳＳＥＡ４陽性であることに留意すること。図１２Ｇ～図１２Ｈのそれぞれにおける赤色曲線は陰性対照を表す。

【図12I-12J】図１２Ｉ～図１２Ｊは、多能性マーカーのＦＡＣＳ分析を示すヒストグラムである。ヒトＥＳＣを、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で成長させ、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１、ＳＳＥＡ１およびＳＳＥＡ４の各マーカーの発現をＦＡＣＳによってアッセイした。図１２Ｉ－１０回を超える継代にわたって単一細胞としての懸濁状態で培養され、ＳＳＥＡ１抗体によって分けられたＨ７細胞（青色曲線）。細胞の７８．５％がＳＳＥＡ１陽性であることに留意すること。図１２Ｊ－１０回を超える継代にわたって単一細胞としての懸濁状態で培養され、ＳＳＥＡ４抗体によって分けられたＨ７細胞（青色曲線）。細胞の５．４３％のみがＳＳＥＡ４陽性であることに留意すること。図１２Ｉ～図１２Ｊのそれぞれにおける赤色曲線は陰性対照を表す。

【0126】

【図13A】図１３Ａは、ＲＴ－ＰＣＲ分析を示すヒストグラムである。Ｈ７多能性幹細胞およびＣＬ１多能性幹細胞についてのリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現における平均倍数変化（それぞれから３回の反復）が示される。平均倍数変化が、ＭＥＦ上で培養されたときのＨ７多能性幹細胞およびＣＬ１多能性幹細胞における示された遺伝子の発現レベル（「１」として示される）に対する比較で計算された。図１３Ａ－Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の各多能性遺伝子についての結果が示される。図１３Ｂ－ＦＢＬＮ５、ＣＴＮＮＢ１、ＰＬＸＮＡ２、ＥＧＦＲ、ＩＴＧＡ７、ＩＧＴＡ６、ＩＴＧＡ２、ＣＬＤＮ１８、ＣＬＤＮ６、ＣＤＨ２、ＣＤＨ１およびＦＮ１の各接着分子遺伝子についての結果が示される。青色棒＝１０回を超える継代にわたって懸濁状態で培養された単一細胞（ＳＣ）；赤色棒＝１０回を超える継代にわたって懸濁状態で培養された細胞凝集塊（Ｃｌ）；緑色棒＝標準的な２Ｄ培養で、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養された多能性幹細胞。ＭＥＦ上で培養された多能性幹細胞と比較した場合に、多能性の単一幹細胞でのＮａｎｏｇ発現がわずかに低下したことや、一方で、ＭＥＦ上で培養されたか、または懸濁培養で細胞凝集塊として培養された細胞と比較した場合、単一細胞として培養された同じ細胞ではＯｃｔ４の発現が増大したことに留意すること。

【図13B】図１３Ｂは、ＲＴ－ＰＣＲ分析を示すヒストグラムである。Ｈ７多能性幹細胞およびＣＬ１多能性幹細胞についてのリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現における平均倍数変化（それぞれから３回の反復）が示される。平均倍数変化が、ＭＥＦ上で培養されたときのＨ７多能性幹細胞およびＣＬ１多能性幹細胞における示された遺伝子の発現レベル（「１」として示される）に対する比較で計算された。図１３Ａ－Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、ＮａｎｏｇおよびＯｃｔ４の各多能性遺伝子についての結果が示される。図１３Ｂ－ＦＢＬＮ５、ＣＴＮＮＢ１、ＰＬＸＮＡ２、ＥＧＦＲ、ＩＴＧＡ７、ＩＧＴＡ６、ＩＴＧＡ２、ＣＬＤＮ１８、ＣＬＤＮ６、ＣＤＨ２、ＣＤＨ１およびＦＮ１の各接着分子遺伝子についての結果が示される。青色棒＝１０回を超える継代にわたって懸濁状態で培養された単一細胞（ＳＣ）；赤色棒＝１０回を超える継代にわたって懸濁状態で培養された細胞凝集塊（Ｃｌ）；緑色棒＝標準的な２Ｄ培養で、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）上で培養された多能性幹細胞。ＭＥＦ上で培養された多能性幹細胞と比較した場合に、多能性の単一幹細胞でのＮａｎｏｇ発現がわずかに低下したことや、一方で、ＭＥＦ上で培養されたか、または懸濁培養で細胞凝集塊として培養された細胞と比較した場合、単一細胞として培養された同じ細胞ではＯｃｔ４の発現が増大したことに留意すること。

【0127】

【図14】図１４は、単一細胞としての懸濁培養で培養されたｈＥＳＣのクローニング効率を示す画像である。単一細胞クローンが、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で培養されたＨ７ ｈＥＳＣ系統の単一細胞を置床することによって形成された。それぞれの細胞を低接着性９６ウエルプレートのウエルに１個ずつ置床し、懸濁状態で培養した。単一細胞としての懸濁培養で培養されたｈＥＳＣのクローニング効率が９５％であることに留意すること。

【0128】

【図15】図１５は、単一細胞としての懸濁培養で培養されたｈＥＳＣの解凍効率を示す画像である。懸濁培養で単一細胞として培養されたヒトＥＳＣを、標準的な凍結用溶液を使用して凍結し、その後懸濁培養で解凍した。細胞が十分に回復し、少なくとも８０％の細胞が生存していた。

【0129】

【図16A-16B】図１６Ａ－１６Ｂは、単一細胞としての懸濁培養で培養されたｈＥＳＣの遺伝子操作を示す画像である。単一細胞としての懸濁培養で培養されたヒトｈＥＳＣを、ＧＦＰ遺伝子をＣＭＶプロモーター下に含む核酸構築物による電気穿孔法に供した。図１６Ａ－遺伝子操作後の細胞の位相差像。細胞のほとんど（少なくとも９０％）が電気穿孔法の手順に耐えたことに留意すること。図１６Ｂ－遺伝子操作後の細胞の蛍光顕微鏡観察像。緑色のシグナルが、組換え構築物（ＣＭＶプロモーターの転写制御下にあるＧＦＰ）を発現する細胞に対応する。

【0130】

【図17A-17C】図１７Ａ－１７Ｃは、単一細胞としての懸濁培養で培養されたヒトＥＳＣの神経始原体（ＮＰ）への分化を示す顕微鏡像である。単一細胞としての懸濁培養で培養されたヒトＥＳＣをニューロン細胞系譜に分化誘導した。図１７Ａ－星状膠細胞、ＧＦＡＰ（赤色）；図１７Ｂ－乏突起膠細胞、Ｏ４（緑色）；図１７Ｃ－ニューロン、β－チューブリン（緑色）およびネスチン（赤色）。

【0131】

【図18A-18C】図１８Ａ－１８Ｃは、単一細胞としての懸濁培養で成長させたｈＥＳＣを分化させることによって単離されたＭＳＣのＦＡＣＳ分析を示すヒストグラムである。図１８Ａ－動物由来非含有培地において成長させ、ＣＤ７３抗体によって分けられたＪ３ ｈＥＳＣ系統に由来するＭＳＣ（青色曲線）。８２．５％がＣＤ７３陽性であることに留意すること。図１８Ｂ－動物由来非含有培地において成長させ、ＣＤ３１抗体によって分けられたＪ３ ｈＥＳＣ系統に由来するＭＳＣ（青色曲線）。４．８３％のみがＣＤ３１陽性であることに留意すること。図１８Ｃ－血清含有培地において成長させ、ＣＤ１０５抗体によって分けられたＪ３ ｈＥＳＣ系統に由来するＭＳＣ（青色曲線）。９９．３％がＣＤ１０５陽性であることに留意すること。

【0132】

【図19A-19D】図１９Ａ－１９Ｄは、単一細胞としての懸濁状態で培養されるｈＥＳＣのＭＳＣへの分化を示す画像である。単一細胞としての懸濁状態で培養される単一細胞は、懸濁状態および２Ｄの両方で、分化能を有する（ｐｏｔｅｎｔ）ＭＳＣに分化することができる。図１９Ａ～図１９Ｂ－単一細胞としての懸濁状態で培養されたヒトＥＳＣから分化したＭＳＣの位相差像。ｈＥＳＣを懸濁培養において再置床し、典型的なＭＳＣ形態学を有するＭＳＣに分化させた。図１９Ａ－ＣＬ１細胞をＦｙ富化培地において分化させた。図１９Ｂ－ＣＬ１細胞をＭｅＳｕｓＩＩ培地において分化させた。図１９Ｃ－骨系譜への、（単一細胞としての懸濁状態で成長させたｈＥＳＣの分化によって形成された）分化したＭＳＣのアリザリンレッド染色。図１９Ｄ－脂肪細胞への、（単一細胞としての懸濁状態で成長させたｈＥＳＣの分化によって形成された）分化したＭＳＣのオイルレッド染色。

【0133】

【図20A-20B】図２０Ａ－２０Ｂは、単一細胞としての懸濁状態で培養されるｈＥＳＣの、内胚葉の胚葉への分化を示す画像である。Ｃ２細胞を、１０回を超える継代にわたって懸濁状態で単一細胞として培養した。内胚葉分化のために、ｂＦＧＦおよびＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を培養培地から除き、１０ｎｇ／ｍｌの濃度のアクチビンＡを懸濁培養において４８時間加えた。アクチビンＡ暴露後１０日において、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌマトリックスまたはＨＦＦマトリックスに置床し、抗ＰＤＸ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＰＤＸ１発現について染色した。図２０Ａ－ＤＡＰＩ染色（核染色）（青色）；図２０Ｂ－ＰＤＸ１（赤色）。ＤＡＰＩ（核染色）によって染色されるすべての細胞がまた、ＰＤＸ１に関しても染色されることに留意すること。

【発明を実施するための形態】

【0134】

本発明は、その一部の実施形態において、多能性幹細胞を未分化の状態で維持することができる新規の方法および培養培地、並びに細胞凝集塊を含まない単一幹細胞として懸濁培養で培養された新規の多能性幹細胞に関連し、より具体的には、これに限定はされないが、多能性幹細胞を増殖性かつ多能性の未分化状態で維持しながら二次元培養システムまたは三次元培養システムで培養する方法に関連する。

【0135】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。

【0136】

本発明者らは、骨の折れる（ｌａｂｏｒｉｏｕｓ）実験の後に、限定される培地を発見しており、それは、血清非含有および動物由来混入物非含有であり、かつ、ヒトｉＰＳおよびＥＳＣなどの多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する一方、全部で３つの胚性胚葉に分化させるその多能性能を保持することが可能である。

【0137】

したがって、以下の実施例セクションで示されるように、（例えば成体または包皮繊維芽細胞由来の）ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞は、血清非含有の限定培養培地（例えば、ｙＦＩＬ２５，ＣＭｒｂ１００Ｆ，ＣＭｒｂ１００Ｆｐ，ＩＬＣＮＴＦ）の存在下で、並びに動物由来混入物非含有の血清代替物を含む十分に限定された培養培地（例えば、ＮＣＭ１００Ｆ，ＮＣＭ１００Ｆｐ、ＮＣＭｒｂ１００Ｆ，ＮＣＭｒｂ１００Ｆｐ，ＮＩＬＣＮＴＦ，ＣｍＨＡ１３，ＣｍＨＡ１３ｐ）の存在下で二次元または三次元培養システム上で、未分化状態で培養された（上記培地は、臨床／治療用途に好適である。なぜなら、そこで培養されるヒト多能性幹細胞は、動物由来混入物を完全に欠いているからである）。さらに、以下の実施例の節の実施例４に示されるように、懸濁状態で培養された多能性幹細胞は、国を渡って移送される間も生きた細胞として生存しており、増殖性及び多能性を有したままであることができる。培養下で、多能性幹細胞は、未分化形態を示すとともに、ｉＰＳまたはｈＥＳＣに典型的な分子特性、例えば正常な核型、多能性のマーカー（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－８１、ＴＲＡ－１－６０）の発現、および３つ胚性胚葉全部への分化能（インビトロ（少なくとも１０継代後の胚様体の形成による）およびインビボ（少なくとも２０継代後の奇形腫の形成による）の双方で）を示す。また、図７～１０に示され、以下の実施例の節の実施例７に記載されるように、多能性幹細胞は、ニューロン、内胚葉、および中胚葉細胞系譜の系譜特異的な細胞を生成させるために使用された。

【0138】

加えて、本発明者らは、未分化の多能性幹細胞を、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で維持するための好適な培養条件を発見しており、また単一細胞としての懸濁培養で培養されるヒト多能性幹細胞の新規な集団を単離している。

【0139】

したがって、下記の実施例の節の実施例３において明らかにされるように、本発明者らは多能性幹細胞（例えば、ｈＥＳＣおよびヒトｉＰＳ細胞）を、トリプシンまたはＲＯＣＫ阻害剤を使用することなく、（例えば、ピペットを使用して）当該細胞を機械的に継代することによって懸濁培養で培養した。細胞凝集塊を単一細胞に機械的に分離する約３回～７回の継代後、多能性幹細胞は単一細胞様式の拡大を取り、この拡大は培養継代のための機械的分離を何ら必要とせず、したがってこれらの細胞の大量生産を可能にした。単一細胞として培養された懸濁培養物がＭＥＦ上に再置床されたとき、細胞は多能性幹細胞の典型的な形態学を有するコロニーを形成した（図１１Ａ～図１１Ｂ）。下記の実施例の節の実施例８においてさらに記載されるように、単一細胞としての懸濁培養で培養されたヒト多能性幹細胞は、ＭＥＦ上で培養されるヒトＥＳＣと比較した場合、または細胞凝集塊としての懸濁培養で培養されるｈＥＳＣと比較した場合、遺伝子発現のよりナイーブなパターンを示す。したがって、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁状態で培養される多能性幹細胞の単離された集団はＳＳＥＡ４^－／ＴＲＡ１－６０^－／ＴＲＡ１－８１^－／ＳＳＥＡ１^＋の発現シグナチャーを示し（図１２Ｅ、図１２Ｆ、図１２Ｉおよび図１２Ｊ；表３）、これは、ＭＥＦ上で培養されるか、または細胞凝集塊としての懸濁培養で培養されるヒトＥＳＣの典型的なＳＳＥＡ４^＋／ＴＲＡ１－６０^＋／ＴＲＡ１－８１^＋／ＳＳＥＡ１^－の発現シグナチャー（図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｇ、図１２Ｈ；表３）とは異なっている。対照的に、単一細胞としての懸濁培養で培養された場合、多能性幹細胞は、ＭＥＦ上（２－Ｄ）培養されるｈＥＳＣと比較した場合、または細胞凝集塊としての懸濁培養で培養されるｈＥＳＣと比較した場合、増大したレベルのＯＣＴ－４（多能性のマーカー）を示す（実施例８、図１３Ａ）。加えて、単一細胞としての懸濁状態で培養された多能性幹細胞は、２－Ｄで培養される多能性幹細胞（例えば、ＲＯＣＫ阻害剤の使用に依存して、４％～１８％の間）と比較した場合に、増大したクローニング効率（例えば、ｈＥＳＣについては約９５％の効率）を示すこと（実施例９、表４）、凍結・解凍サイクルに対する増大した生存を示すこと（実施例９、図１５）、ならびに遺伝子操作に対するより大きい生存および遺伝子操作のより高い効率を示すこと（実施例９、図１６Ａ～図１６Ｂ）が見出された。単一細胞としての懸濁状態で培養された多能性幹細胞は、胚の３つすべての胚葉への分化が可能であることが示された：すなわち、外胚葉の胚葉には、ＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質）（星状膠細胞のマーカー）、Ｏ４（乏突起膠細胞のマーカー）、ならびに、β－チューブリンおよびネスチン（ニューロンのマーカー）を発現するニューロン始原体細胞を形成することによって（実施例１０、図１７Ａ～図１７Ｃ）；中胚葉の胚葉には、ＣＤ７３およびＣＤ１０５の発現（実施例１１、図１８Ａおよび図１８Ｃ）、ならびに、ＣＤ３１の非発現（実施例１１、図１８Ｂ）を有する間葉系幹細胞を形成することによって；内胚葉の胚葉には、ＰＤＸ１を発現する内胚葉細胞を形成することによって（実施例１２、図２０Ａ～図２０Ｂ）。加えて、本発明者らは、間葉系幹細胞への多能性幹細胞の懸濁培養でのインビトロ分化を初めて明示している（実施例１１）。これらのＭＳＣは、脂肪生成細胞系譜への分化（実施例１１、図１９Ｄ）、骨形成細胞系譜への分化（実施例１１、図１９Ｃ）および軟骨形成細胞系譜への分化（実施例１１、データは示されず）が可能であった。まとめると、本明細書中において特定される新規な多能性幹細胞は、細胞由来の様々な治療、薬物スクリーニング、ワクチンの製造および／またはタンパク質の製造のための多能性の未分化幹細胞の無限の供給源として使用することができる。

【0140】

したがって、本発明の一部の実施形態の一態様によれば、未分化状態の多能性幹細胞（ＰＳＣ）を拡大し、かつ維持する方法であって、（ａ）前記ＰＳＣを、少なくとも２回、最大１０回の継代にわたってＰＳＣ凝集塊の単一細胞への機械的解離による懸濁培養で継代し、それにより凝集塊を含まないＰＳＣの懸濁培養物を得ること；および（ｂ）前記凝集塊を含まないＰＳＣの前記懸濁培養物を、前記凝集塊の解離を伴うことなく継代し、それにより前記未分化状態の前記ＰＳＣを拡大し、かつ維持することを含む方法が提供される。

【0141】

本発明の一部の実施形態によれば、ＰＳＣを、ＰＳＣ凝集塊の単一細胞への機械的解離によって懸濁培養で継代することが、少なくとも２回、最大９回の継代にわたって；少なくとも２回、最大８回の継代にわたって；少なくとも２回、最大７回の継代にわたって；少なくとも２回、最大６回の継代にわたって；少なくとも２回、最大５回の継代にわたって；少なくとも２回、最大４回の継代にわたって；少なくとも３回、最大９回の継代にわたって；少なくとも３回、最大８回の継代にわたって；少なくとも３回、最大７回の継代にわたって；少なくとも３回、最大６回の継代にわたって；少なくとも３回、最大５回の継代にわたって行われる。

【0142】

本発明の一部の実施形態によれば、上記方法はさらに、上記ＰＳＣを、上記未分化状態の上記多能性幹細胞の拡大を可能にする条件下で培養することを含む。

【0143】

本明細書で使用される表現「多能性幹細胞」は、細胞を３つの胚性胚葉（すなわち、内胚葉、外胚葉および中胚葉）全部に分化する能力を有する細胞を示す。表現「多能性幹細胞」は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）および／または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を意味することができる。

【0144】

本明細書で使用される表現「胚性幹細胞」は、妊娠後に形成される胚性組織から得られる細胞（例えば胚盤胞）（着床前（すなわち着床前胚盤胞））、着床後期／原腸形成前期の胚盤胞から得られる拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）（国際公開第２００６／０４０７６３号パンフレットを参照）、および妊娠期間中の任意の時期、好ましくは妊娠の１０週以前に胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖（ＥＧ）細胞を示す。

【0145】

本発明の一部の実施形態によれば、本発明の多能性幹細胞は、例えばヒトまたは霊長動物（例えばサル）由来の胚性幹細胞である。

【0146】

本発明の胚性幹細胞は、周知の細胞培養方法を用いて入手可能である。例えば、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚盤胞から単離しうる。ヒト胚盤胞は、典型的には、ヒト体内着床前胚または体外受精（ＩＶＦ）胚から得られる。あるいは、単細胞ヒト胚は、胚盤胞期まで増殖しうる。ヒトＥＳ細胞の単離においては、透明帯が胚盤胞から除去され、内部細胞塊（ＩＣＭ）が免疫手術によって単離され、ここでは栄養外胚葉細胞が溶解され、穏やかなピペッティングによって無傷ＩＣＭから除去される。次いで、ＩＣＭは、その増殖（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を可能にする適切な培地を有する組織培養フラスコ内にプレーティングされる。９～１５日後、ＩＣＭから誘導された増殖物は、機械的解離または酵素的分解のいずれかによって塊に解離され、次いで細胞は、新しい組織培地上に再プレーティングされる。未分化形態を示すコロニーは、マイクロピペットによって個別に選択され、塊に機械的に解離され、再プレーティングされる。次いで、得られたＥＳ細胞は、４～７日ごとに定期的に分割される。ヒトＥＳ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Ｔｈｏｍｓｏｎら、［米国特許第５，８４３，７８０号明細書；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５頁、１９９８年；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３頁、１９９８年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：７８４４頁、１９９５年］；Ｂｏｎｇｓｏら［Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ４：７０６頁、１９８９年］；およびＧａｒｄｎｅｒら［Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．６９：８４頁、１９９８年］を参照のこと。

【0147】

市販の幹細胞が本発明のこの態様でも使用可能であることは理解されるであろう。ヒトＥＳ細胞は、ＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリー（ＮＩＨ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇｉｓｔｒｙ）（ｗｗｗ：／／ｅｓｃｒ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から購入することができる。市販の胚性幹細胞系の非限定例として、ＢＧ０１、ＢＧ０２、ＢＧ０３、ＢＧ０４、ＣＹ１２、ＣＹ３０、ＣＹ９２、ＣＹ１０、ＴＥ０３、ＴＥ０４およびＴＥ０６が挙げられる。

【0148】

拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）は、受精の少なくとも９日後の原腸形成前期の胚盤胞から入手可能である。胚盤胞を培養する前、内部細胞塊を露出させるため、透明帯は［例えばタイロード酸性溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））により］消化される。次いで、胚盤胞は、標準の胚性幹細胞培養方法を用い、受精後少なくとも９日から１４日以下にわたり（すなわち原腸形成事象前）、インビトロで全胚として培養される。

【0149】

胚性生殖（ＥＧ）細胞は、当業者に既知の実験技術を用い、（ヒト胎児の場合）妊娠から約８～１１週目の胎児から得られる始原生殖細胞から調製される。生殖隆起は、解離され、小塊に切断され、その後、機械的解離により、細胞に分離される。次いで、ＥＧ細胞は、適切な培地を有する組織培養フラスコ内で増殖される。細胞は、ＥＧ細胞に一致した細胞形態が認められるまで、典型的には７～３０日または１～４継代にわたり、毎日交換される培地で培養される。ヒトＥＧ細胞の調製方法に関するさらなる詳細については、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１３７２６頁、１９９８年］および米国特許第６，０９０，６２２号明細書を参照のこと。

【0150】

本明細書で使用される表現「誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞」（または胚性様幹細胞）は、体細胞（例えば成体体細胞）の脱分化によって得られる増殖性および多能性幹細胞を示す。

【0151】

本発明の一部の実施形態によれば、ｉＰＳ細胞は、ＥＳＣの場合と同様の増殖能によって特徴づけられ、それ故、ほぼ無限の時間、培養下で維持・拡大されうる。

【0152】

ＩＰＳ細胞は、細胞を再プログラム化し、胚性幹細胞特性を得る遺伝子操作により、多能性を与えられることが可能である。例えば、本発明のｉＰＳ細胞は、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年、Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、２００７年、およびＯｋｉｔａ Ｋ．ら、２００７年、Ｎａｔｕｒｅ ４４８：３１３－３１８頁）において本質的に記載のように、体細胞内でのＯｃｔ－４、Ｓｏｘ２、Ｋｆｌ４およびｃ－Ｍｙｃの発現の誘発により、体細胞から生成しうる。それに加え、またはそれに代わり、本発明のｉＰＳ細胞は、Ｙｕら、２００７年およびＮａｋａｇａｗａら、２００８年において本質的に記載のように、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の発現の誘発により、体細胞から生成しうる。体細胞の遺伝子操作（再プログラミング）は、プラスミドまたはウイルスベクターの使用などの任意の既知の方法を用いるか、またはゲノムへの組込みを全く伴わない誘導により、実施可能であることは注目されるべきである［Ｙｕ Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９年、３２４：７９７－８０１頁］。

【0153】

本発明のｉＰＳ細胞は、胚性線維芽細胞［ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、２００６年；Ｍｅｉｓｓｎｅｒら、２００７年］、ｈＥＳＣから形成される線維芽細胞［Ｐａｒｋら、２００８年］、胎児線維芽細胞［Ｙｕら、２００７年；Ｐａｒｋら、２００８年］、包皮線維芽細胞［Ｙｕら、２００７年；Ｐａｒｋら、２００８年］、成体皮膚および皮膚組織［Ｈａｎｎａら、２００７年；Ｌｏｗｒｙら、２００８年］、ｂ－リンパ球［Ｈａｎｎａら、２００７年］、ならびに成体肝および胃細胞［Ａｏｉら、２００８年］の脱分化を誘発することによって入手可能である。

【0154】

ＩＰＳ細胞系はまた、ＷｉＣｅｌｌバンクなどの細胞バンクを介して入手可能である。市販のｉＰＳ細胞系の非限定例として、ｉＰＳ包皮クローン１［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号：ｉＰＳ（包皮）－１－ＤＬ－１］、ｉＰＳＩＭＲ９０クローン１［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号：ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）－１－ＤＬ－１］、およびｉＰＳＩＭＲ９０クローン４［ＷｉＣｅｌｌカタログ番号：ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）－４－ＤＬ－１］が挙げられる。

【0155】

本発明の一部の実施形態によれば、誘導多能性幹細胞は、ヒト誘導多能性幹細胞である。

【0156】

本明細書中で使用される場合、用語「拡大する」は、多能性幹細胞の数を培養期間にわたって（少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、１００％、２００％、５００％、１０００％以上）増大させることを示す。多能性幹細胞の数は、ただ１個の多能性幹細胞から得ることができるので、多能性幹細胞の増殖能に依存することが理解されるであろう。多能性幹細胞の増殖能は、当該細胞の倍加時間（すなわち、細胞が培養において有糸分裂を受けるために必要とされる時間）と、多能性幹細胞培養が未分化状態で維持され得る期間（これは、それぞれの継代の間の日数が乗じられる継代数に等しい）とによって計算することができる。

【0157】

本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の方法は、ただ１個の多能性幹細胞（例えば、ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞）を５日で少なくとも８倍拡大すること（例えば、５日で少なくとも１６倍、例えば、５日で少なくとも３２倍、例えば、５日で少なくとも６４倍）を可能にする。

【0158】

本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の方法は、ただ１個の多能性幹細胞（例えば、ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞）、または２個～１００個の細胞の小さいクラスターを約１ヶ月のうちに少なくとも２^８倍拡大すること（例えば、２^１０倍、例えば、２^１４倍、例えば、２^１６倍、例えば、２^１８倍、例えば、２^２０倍）を可能にする。

【0159】

本明細書中で使用される場合、用語「凝集塊」は、懸濁状態において互いに接着する細胞のクラスターを示す。

【0160】

本発明の一部の実施形態によれば、細胞凝集塊は、懸濁培養の培地が凝集塊の機械的解離または酵素的解離を何ら用いることなく変えられるとき（例えば、増大されるとき、減少されるとき、または取り替えられるとき）無傷のままである。

【0161】

本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞凝集塊のそれぞれが、少なくとも約２００個の細胞（例えば、約２００個）を含み、例えば、少なくとも約５００個の細胞（例えば、約５００個）、少なくとも約６００個の細胞（例えば、約６００個）、少なくとも約７００個の細胞（例えば、約７００個）、少なくとも約８００個の細胞（例えば、約８００個）、少なくとも約９００個の細胞（例えば、約９００個）、少なくとも約１０００個の細胞（例えば、約１０００個）、少なくとも約１１００個の細胞（例えば、約１１００個）、少なくとも約１２００個の細胞（例えば、約１２００個）、少なくとも約１３００個の細胞（例えば、約１３００個）、少なくとも約１４００個の細胞（例えば、約１４００個）、少なくとも約１５００個の細胞（例えば、約１５００個）、少なくとも約５×１０^３個の細胞（例えば、約５×１０^３個）、少なくとも約１×１０^４個の細胞（例えば、約１×１０^４個）、少なくとも約５×１０^４個の細胞（例えば、約５×１０^４個）、少なくとも約１×１０^５個の細胞（例えば、約１×１０^５個）またはそれ以上を含む。

【0162】

本明細書中で使用される場合、用語「継代する」は、培養容器における細胞を２つ以上の培養容器に分けることを示し、これには典型的には、新鮮な培地を加えることが含まれる。継代は典型的には、細胞が培養においてある密度に達したときに行われる。

【0163】

本発明の一部の実施形態によれば、約１×１０^６細胞／ミリリットルの濃度で播種される細胞培養物を静的な三次元培養システムのもとで継代することが、細胞の濃度が約２倍または３倍に増大したとき（例えば、約２×１０^６細胞／ｍｌ～３×１０^６細胞／ｍｌの濃度で）であって、最大約４倍まで増大したとき（例えば、約４×１０^６細胞／ｍｌの濃度で）に行われる。

【0164】

本発明の一部の実施形態によれば、約１×１０^６細胞／ミリリットルの濃度で播種される細胞培養物を動的な三次元培養システムのもとで継代することが、細胞の濃度が約２０倍～４０倍に増大したとき（例えば、約２０×１０^６細胞／ｍｌ～４０×１０^６細胞／ｍｌの濃度で）であって、最大約５０倍まで増大したとき（例えば、約５０×１０^６細胞／ｍｌの濃度で）に行われる。

【0165】

本発明の一部の実施形態によれば、継代には細胞培養における細胞凝集塊の解離を必ずしも必要としない。

【0166】

本明細書中で使用される場合、表現「機械的解離」は、多能性幹細胞凝集塊を酵素活性ではなく、むしろ物理的な力を用いることによって単一細胞に分離することを示す。

【0167】

本明細書中で使用される場合、表現「単一細胞」は、多能性幹細胞が、それぞれのクラスターが約２００個超の多能性幹細胞を含む細胞クラスターを懸濁培養において形成しない状態を示す。

【0168】

本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞は、それぞれのクラスターが、約１５０個超、約１００個超、約９０個超、約８０個超、約７０個超、約６０個超、約５０個超、約４０個超、約３０個超、約２０個超、約１９個超、約１８個超、約１７個超、約１６個超、約１５個超、約１４個超、約１３個超、約１２個超、約１１個超、約１０個超、約９個超、約８個超、約７個超、約６個超、約５個超、約３個超、約２個超または約１個超の多能性幹細胞を含む細胞クラスターを懸濁培養において形成しない。

【0169】

本発明の一部の実施形態によれば、複数の多能性幹細胞のそれぞれは、懸濁培養されている間は別の多能性幹細胞に接着しない。

【0170】

機械的解離のために、多能性幹細胞のペレット（これは細胞の遠心分離によって達成され得る）、または単離された多能性幹細胞凝集塊を、細胞を少量の培地（例えば、０．２ｍｌ～１ｍｌ）において上下にピペッティングすることによって解離させることができる。例えば、ピペッティングを、２００μｌまたは１０００μｌのピペットのチップを使用して数回（例えば、３回～２０回の間）行うことができる。

【0171】

加えて、または代わりに、大きい多能性幹細胞凝集塊の機械的解離を、凝集塊を所定のサイズに壊すために設計されたデバイスを使用して行うことができる。そのようなデバイスを、ＣｅｌｌＡｒｔｉｓ（Ｇｏｔｅｂｏｒｇ、スウェーデン）から得ることができる。加えて、または代わりに、機械的解離を、凝集塊を倒立型顕微鏡で見ながら、ニードル（例えば、２７ｇのニードル（ＢＤ Ｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ、Ｄｒｏｇｈｅｄａ、アイルランド）など）を使用して手作業で行うことができる。

【0172】

本発明の一部の実施形態によれば、継代は酵素的解離がない条件下で行われる。

【0173】

本発明の一部の実施形態によれば、懸濁状態での培養は細胞クラスター／凝集塊の酵素的解離がない条件下で行われる。

【0174】

本発明の一部の実施形態によれば、培養条件は抗アポトーシス剤を使用することを含まない。

【0175】

本発明の一部の実施形態によれば、培養条件はＲｈｏ会合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を使用することを含まない。

【0176】

本発明の一部の実施形態によれば、培養は少なくとも１回の継代にわたって、少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回の継代にわたって、未分化の多能性状態において行われる。

【0177】

本発明者らは、懸濁培養における多能性幹細胞が、少なくとも約２回、最大約１０回の継代にわたって、細胞クラスターの酵素的解離を伴うことなく機械的に継代されるとき、多能性幹細胞が単一細胞様式の細胞成長を取ること（すなわち、多能性幹細胞が、細胞凝集塊としてではなく、単一細胞として拡大されること）を発見している。したがって、下記の実施例の節の実施例３において記載されるように、細胞凝集塊の機械的解離のみによって最初の２回～１０回の継代にわたって継代されながら懸濁状態で培養された細胞は、少なくとも約１５回、２０回または２５回のさらなる継代にわたって、単一細胞様式の拡大を取り、かつ細胞クラスターのさらなる解離を必要とすることなく成長した。

【0178】

細胞が単一細胞として培養される間、細胞は依然として、細胞の濃度が約１×１０^６細胞／ミリリットル（例えば、５ｍｌのペトリディッシュあたり５×１０^６細胞）を超えるときには希釈されることが必要であることに留意しなければならない。

【0179】

本明細書中で使用される場合、表現「懸濁培養」は、多能性幹細胞が表面に接着するのではなく、むしろ培地に懸濁される培養を示す。

【0180】

多能性幹細胞（例えば、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞など）を培養するいくつかのプロトコルは、半透過性ヒドロゲル膜の内側への細胞のマイクロカプセル化（この場合、半透過性ヒドロゲル膜により、栄養分、ガスおよび代謝産物の、カプセルを取り囲む培地全体との交換を行うことができる）を含むことに留意しなければならない（詳細については、例えば、米国特許出願公開第２００９００２９４６２号（Ｂｅａｒｄｓｌｅｙ他）を参照のこと）。

【0181】

本発明の一部の実施形態によれば、懸濁培養で培養される多能性幹細胞は、細胞のカプセル化が行われない。

【0182】

本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞を懸濁状態で培養するための条件は、基体接着がない（例えば、外部の基体（例えば、細胞外マトリックスの成分、ガラスマイクロキャリアまたはビーズなど）への接着がない）ことである。

【0183】

本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞を懸濁状態で培養するための培養培地および／または条件には、タンパク質キャリアが含まれない。

【0184】

本明細書中で使用される場合、表現「タンパク質キャリア」は、培養中の細胞へのタンパク質または栄養分（例えば、亜鉛などのミネラル）の輸送において作用するタンパク質を示す。そのようなタンパク質キャリアは、例えば、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン）、Ａｌｂｕｍａｘ（脂質富化アルブミン）またはプラスマネート（ヒト血漿の単離タンパク質）が可能である。これらのキャリアはヒト供給源または動物供給源のどちらにも由来するので、ヒトｉＰＳ細胞培養物のｈＥＳＣにおけるそれらの使用が、バッチ特異的な変動、および／または病原体への暴露によって制限される。したがって、タンパク質キャリア（例えば、アルブミン）を含まない培養培地が非常に好都合である。これは、そのような培養培地は、組換え材料または合成材料から製造することができる真に定義された培地を可能にするからである。

【0185】

本発明の一部の実施形態の方法に従って懸濁培養で培養することが、多能性幹細胞を、細胞の生存および増殖を促進させるが分化を制限する細胞密度で培養容器に置床することによって行われる。典型的には、約１×１０^３細胞／ｍｌ～約２×１０^６細胞／ｍｌの間の置床密度（または播種密度）が使用される。バイオリアクターが使用されるとき、バイオリアクターにおいて播種される細胞の濃度は約１×１０^４細胞／ｍｌから約１０^６細胞／ｍｌまでが可能である。幹細胞の単一細胞懸濁物が通常は播種されるが、小さいクラスター（例えば、１０個～２００個の細胞など）もまた使用され得ることが理解されるであろう。

【0186】

多能性幹細胞に懸濁培養中における栄養分および増殖因子の十分かつ一定した供給をもたらすために、培養培地は毎日取り換えることができ、または所定のスケジュールで、例えば、２～３日毎に取り換えることができる。例えば、培養培地の取り換えを、多能性幹細胞の懸濁培養物を８０ｇでの約３分間の遠心分離に供し、形成された多能性幹細胞ペレットを新鮮な培地に再懸濁することによって行うことができる。加えて、または代わりに、培養培地を一定したろ過または透析に供し、その結果多能性幹細胞への栄養分または増殖因子の一定した供給をもたらす培養システムを用いることができる。

【0187】

多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の方法に従って懸濁状態で培養するために使用される培養容器は、その中で培養される多能性幹細胞が内部表面に接着または付着することができないように設計された表面（例えば、表面への付着または接着を防止するための非組織培養用の処理されたセル）を有する組織培養容器（例えば、多能性幹細胞を培養するために好適な純度規格を有するもの）のいずれも可能である。好ましくは、スケール変更可能な培養を得るために、本発明の一部の実施形態に従った培養は、様々な培養パラメーター（例えば、温度、撹拌、ｐＨおよびｐＯ_２など）が好適なデバイスを使用して自動的に実施される制御された培養システム（好ましくは、コンピューター制御された培養システム）を使用して行われる。培養パラメーターが記録されると、システムは、多能性幹細胞の拡大のために必要とされる培養パラメーターの自動調節のために設定される。

【0188】

本発明の一部の実施形態によれば、培養は静的（すなわち、非動的）な懸濁培養を含む条件下で行われる。

【0189】

多能性幹細胞の非動的培養のために、多能性幹細胞は非被覆の５８ｍｍのペトリディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）で培養することができる。例えば、懸濁培養を５８ｍｍペトリディッシュで開始するために、多能性幹細胞が１×１０^６細胞／ディッシュ～５×１０^６細胞／ディッシュの細胞密度で播種される。

【0190】

非動的な懸濁培養の間、多能性幹細胞は、細胞凝集塊を上記のように解離し、培養物を約１：２～１：４の比率でさらなる培養容器に分けることによって５～７日毎に継代することができる。

【0191】

本発明の一部の実施形態によれば、培養は（例えば、Ｗａｖｅリアクターまたは撹拌型リアクターを使用して）動的な懸濁培養を含む条件下で行われる。

【0192】

多能性幹細胞の動的培養のために、多能性幹細胞は、制御装置に接続することができ、したがって制御された培養システムをもたらすスピナーフラスコ［例えば、２００ｍｌ～１０００ｍｌのスピナーフラスコ、例えば、ＣｅｌｌＳｐｉｎ（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｅｒｎｗａｌｄ、ドイツ）から得ることができる２５０ｍｌのスピナーフラスコ、Ｂｅｌｌｃｏ（Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）から得ることができる１００ｍｌのスピナーフラスコ、または１２５ｍｌの三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ、米国）］において培養することができる。培養容器（例えば、スピナーフラスコ、三角フラスコ）は絶え間なく振とうされる。本発明の一部の実施形態によれば、培養容器は、磁石プレートを使用して４０～１１０回転／分（ｒｐｍ）で振とうされ、インキュベーターの中に置かれる。加えて、または代わりに、培養容器は振とう機（Ｓ３．０２．１０Ｌ、ＥＬＭＩ ｌｔｄ（Ｒｉｇａ、ラトビア））を使用して振とうすることができる。本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は１～３日毎に、例えば、毎日交換される。培地をインペラーによって撹拌し、かつ本発明の一部の実施形態による培養培地における多能性幹細胞の動的培養のために使用することができる他の好適な制御されたバイオリアクターには、Ｂｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ａｐｌｕｓ細胞培養（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、米国）、Ｃｅｌｌ Ｌｉｆｔインペラー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ、Ｒｉｔｔｅｒｇａｓｓｅ、スイス）を備えるＣｅｌｌ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ制御型バイオリアクター（Ｗｈｅａｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ、ＮＪ、米国）、Ｉｎｆｏｒｍｓ ＨＴ Ｍｕｌｔｉｆｏｒｓ撹拌型リアクター（Ｉｎｆｏｒｍｓ ＧＡ、ＣＨ－４１０３ Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、スイス）が含まれる。

【0193】

加えて、または代わりに、多能性幹細胞の動的培養を、細胞の動力学が波のような動きによって達成される制御されたバイオリアクター、例えば、Ｂｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ｃｕｌｔｉｂａｇ ＲＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、米国）（１リットルに関しては２リットルバッグ）などを使用して達成することができる。リアクターのパラメーターには、傾動速度：１０～１６回／分（ｒｐｍ）、角度：７°、温度：３７℃、ｐＨ：７～７．４、Ｏ_２濃度：５０％が含まれ得る。別の好適なバイオリアクターが、ＷａｖｅＰｏｄシステム２０／５０ ＥＨ５ Ｗａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）であり、これは同じパラメーターを使用する一方で、１２日間で７０倍の増大を可能にする。さらなる好適なバイオリアクターが、リアクター内における最小限の剪断力を可能にする５５ｍｌのＲＷＶ／ＳＴＬＶバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ、米国）である。

【0194】

例えば、懸濁培養を動的条件下で開始するために、多能性幹細胞が約１０^４細胞／ｍｌ～１０^６細胞／ｍｌの密度で播種される。

【0195】

動的な懸濁培養の間、多能性幹細胞は、細胞凝集塊を上記のように解離させることによって５～７日毎に継代することができる。バイオリアクターは大きい容量を有するので、細胞培養はさらなる培養容器にさらに分けられることを必要とせず、培地の添加および／または新鮮な培地による培地の取り換えのみを３～１０日毎に行うことができる。

【0196】

本発明の教示は、多能性幹細胞株を導出するために使用することができる。

【0197】

用語「導出する」は、本明細書中で使用される場合、胚性幹細胞株または誘導多能性幹細胞株を少なくとも１個の胚性幹細胞または誘導多能性細胞から作製することを示す。

【0198】

本明細書中で使用される場合、表現「胚性幹細胞株」は、単一生物のただ１個の胚性幹細胞または一群の胚性幹細胞（例えば、ただ１個のヒト胚盤胞）に由来し、かつ未分化状態および多能性能力を維持しながら培養において増殖することができることによって特徴づけられる胚性幹細胞を示す。

【0199】

本明細書中で使用される場合、表現「誘導多能性幹細胞株」は、単一生物のただ１個の誘導多能性幹細胞または一群の多能性幹細胞に由来し、かつ未分化状態および多能性能力を維持しながら培養において増殖することができることによって特徴づけられる誘導多能性幹細胞を示す。

【0200】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、胚性幹細胞株を導出する方法であって、（ａ）胚性幹細胞（ＥＳＣ）を、着床前段階の胚盤胞、着床後段階の胚盤胞および／または胎児の生殖組織から得ること；および（ｂ）前記ＥＳＣを、少なくとも２回、最大１０回の継代にわたって、ＥＳＣ凝集塊の単一細胞への機械的解離によって懸濁培養で継代し、それにより凝集塊を含まないＥＳＣの懸濁培養物を得ること；および（ｃ）凝集塊を含まないＥＳＣの前記懸濁培養物を、凝集塊の解離を伴うことなく継代し、それにより前記胚性幹細胞株を導出することを含む方法が提供される。

【0201】

胚性幹細胞を、着床前段階の胚盤胞、着床後段階の胚盤胞および／または胎児の生殖組織から得ることは、この技術分野で公知の方法および本明細書中上記で記載されるような方法を使用して行うことができる。

【0202】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、胚性幹細胞株を導出する上記方法はさらに、上記ＥＳＣを上記未分化状態の上記胚性単一幹細胞の拡大を可能にする条件下で培養することを含む。

【0203】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）株を導出する方法であって、体細胞を多能性幹細胞に誘導すること、および未分化状態の前記誘導多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の方法に従って（例えば、本明細書中上記および下記の実施例の節において記載されるように）拡大し、かつ維持し、それにより前記誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）株を導出することを含む方法が提供される。

【0204】

上述されるように、また、下記の実施例の節の表４および実施例９において記載されるように、単一細胞としての懸濁状態で培養される多能性幹細胞のクローニング効率が、抗アポトーシス剤（例えば、ＲＯＣＫ阻害剤など）を使用することなく２次元培養システムで培養されるとき（例えば、ＭＥＦ上で培養されるとき）の同じ細胞のクローニング効率よりも著しく高い。

【0205】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、多能性幹細胞をクローニングする方法が提供される。この方法は、本発明の一部の実施形態の方法に従って得られる単一多能性幹細胞（すなわち、１個の細胞）、または本発明の一部の実施形態の方法に従って得られる単一胚性幹細胞（すなわち、１個の細胞）を、未分化状態の前記単一多能性幹細胞の拡大または前記単一胚性幹細胞の拡大を可能にする条件下での懸濁培養で培養し、それにより前記単一多能性幹細胞または前記胚性幹細胞をクローン培養物に拡大し、それにより前記多能性幹細胞をクローニングすることを含む方法が提供される。

【0206】

本発明の一部の実施形態によれば、単一細胞懸濁培養物の培養が、細胞凝集塊を解離させることなく行われる。

【0207】

下記の実施例の節の実施例９において記載されるように、同一アッセイ条件下では、懸濁培養において単一細胞として培養される多能性幹細胞は、凍結－解凍サイクルに対するより大きい耐性（例えば、約８０％の生存）を、同じ細胞が２－Ｄで培養されるとき（例えば、ＭＥＦ上で培養されるとき、５０％までの生存）と比較した場合に有する。

【0208】

本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞は、多能性幹細胞が懸濁培養において単一細胞として培養される場合、少なくとも１サイクル、少なくとも２サイクル、少なくとも３サイクル、少なくとも４サイクル、少なくとも５サイクル、少なくとも６サイクル、少なくとも７サイクル、少なくとも８サイクル、少なくとも９サイクル、少なくとも１０サイクル（例えば、１０サイクルまで）の凍結／解凍を、その多能性能力を保ちながら、未分化状態の細胞の増殖能を妨げることなく受けることができる。

【0209】

下記の実施例の節の実施例８において記載されるように、懸濁培養において単一細胞として本発明の一部の実施形態の方法に従って培養される多能性幹細胞は独特の発現パターンを示し、この発現パターンはｈＥＳＣの発現パターンとわずかに異なっているがマウスＥＳＣの発現パターンに類似している（ＴＲＡ１－６０^－／ＴＲＡ１－８１^－／ＳＳＥＡ１^＋／ＳＳＥＡ４^－；Ｐｅｒａ Ｍ．Ｆ．他、２０００．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１３、５～１０（ヒト胚性幹細胞、解説）を参照のこと）。したがって、表３および図１３Ａに示されるように、（細胞凝集塊を含まない）単一細胞としての懸濁培養で培養される多能性幹細胞は、ＯＣＴ４（多能性のマーカー）を、ＭＥＦ上で培養される多能性幹細胞におけるＯＣＴ４ ＲＮＡのレベルと比較した場合、または（例えば、凝集塊あたり約２００個～１×１０^５個を超える細胞を有する凝集塊を用いて）細胞凝集塊としての懸濁培養で培養される多能性幹細胞におけるＯＣＴ４ ＲＮＡのレベルと比較した場合、有意により大きいレベル（例えば、約８倍より大きいＲＮＡレベル）で発現する。

【0210】

本発明の一部の実施形態の方法に従って培養される細胞はさらに単離することができる。

【0211】

したがって、本発明の一部の実施形態の一態様によれば、本発明の一部の実施形態の方法に従って作製され、かつ内胚葉、外胚葉および中胚葉の、胚の各胚葉に分化することができる多能性幹細胞の単離された集団が提供される。

【0212】

図１２Ａ～図１２Ｊに示されるように、また下記の実施例の節の実施例８において記載されるように、単一細胞としての懸濁状態で培養された多能性幹細胞は、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１またはＳＳＥＡ－４を発現しないが、ＳＳＥＡ１を発現する。

【0213】

したがって、本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ＯＣＴ４^＋／ＴＲＡ１－６０^－／ＴＲＡ１－８１^－／ＳＳＥＡ１^＋／ＳＳＥＡ４^－の発現シグナチャーによって特徴づけられるヒト多能性幹細胞を少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％（例えば、７０％）、少なくとも約７５％（例えば、７５％）、少なくとも約８０％（例えば、８０％）、少なくとも約８１％（例えば、８１％）、少なくとも約８２％（例えば、８２％）、少なくとも約８３％（例えば、８３％）、少なくとも約８４％（例えば、８４％）、少なくとも約８５％（例えば、８５％）、少なくとも約８６％（例えば、８６％）、少なくとも約８７％（例えば、８７％）、少なくとも約８８％（例えば、８８％）、少なくとも約８９％（例えば、８９％）、少なくとも約９０％（例えば、９０％）、少なくとも約９１％（例えば、９１％）、少なくとも約９２％（例えば、９２％）、少なくとも約９３％（例えば、９３％）、少なくとも約９４％（例えば、９４％）、少なくとも約９５％（例えば、９５％）、少なくとも約９６％（例えば、９６％）、少なくとも約９７％（例えば、９７％）、少なくとも約９８％（例えば、９８％）、少なくとも約９９％（例えば、９９％）、例えば、１００％含む、ヒト多能性幹細胞の単離された集団が提供され、ここでヒト多能性幹細胞は、内胚葉、外胚葉および中胚葉の、胚の各胚葉に分化することができる。

【0214】

本発明の一部の実施形態によれば、単離された細胞集団は、同一アッセイ条件下では、Ｒｅｘ１、Ｓｏｘ２、ＥＧＦＲ、ＴＧＡ７、ＴＧＡ６、ＩＴＧＡ２、ＣＴＮＮＢ１、ＣＤＨ１を、ＭＥＦ上で培養されるｈＥＳＣと（同じ桁の範囲内での）匹敵し得るレベルで発現する細胞と、ＭＥＦ上で培養されるｈＥＳＣと比較した場合には有意により大きいレベルのＦＢＬＮ５およびＰＬＸＮＡ２を発現する細胞とを含む。

【0215】

下記の実施例の節の実施例１および実施例２において記載されるように、本発明者らは、多能性幹細胞を増殖性の未分化状態で維持し、かつ拡大するために使用することができる新規な培養培地を発見している。

【0216】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、多能性幹細胞を、二次元培養システムまたは三次元培養システムのもと、フィーダー細胞支持体の非存在下、増殖性かつ多能性の未分化状態で維持し、かつ拡大するために好適な定義された培養培地が提供される。

【0217】

本明細書で使用される表現「培養培地」は、多能性幹細胞の増殖を支持し、それらを未分化状態で維持するのに使用される液体物質を示す。一部の実施形態に従う本発明によって使用される培養培地は、水に基づく培地であることができ、それは、塩、栄養素、ミネラル、ビタミン、アミノ酸、核酸、タンパク質、例えば、サイトカイン、増殖因子およびホルモンなどの物質の組み合わせを含み、それらのすべては、細胞増殖にとって必要であり、多能性幹細胞を未分化状態で維持する能力を有する。例えば、本発明の一部の実施形態の態様に従う培養培地は、合成組織培養培地、例えば、以下にさらに記載のように、必要な添加物が補充された、Ｋｏ－ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ））、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｉｅｔ Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ））、Ｍａｂ ＡＤＣＢ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｕｔａｈ，ＵＳＡ））、Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ（商標）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｂｅｉｔ ＨａＥｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ；Ｓｔｅｍｅｄｉａ（商標）ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商標）ＸＦ／ＦＦ培養培地，ＳＴＥＭＧＥＮＴ，ＵＳＡとしても知られている），ＴｅＳＲ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＴｅＳＲ２（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でありうる。

【0218】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、８０～９０％の範囲、例えば約８５％の濃度のＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む。

【0219】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は血清を含有しない。

【0220】

本明細書で使用される表現「血清非含有」は、ヒトまたは動物血清を含まないことを示す。

【0221】

培養プロトコル上での血清の機能が、培養細胞を、インビボで存在する場合と同様の環境（すなわち、細胞が由来する生物の内部、例えば胚の胚盤胞）に提供することであることは注目されるべきである。しかし、動物源（例えばウシ血清）またはヒト源（ヒト血清）のいずれかに由来する血清の使用は、ドナー個体間（それらから血清が得られる）での血清成分中の有意な差異と異種成分由来混入物を有するリスク（動物血清が使用される場合）とによる制限を受ける。

【0222】

本発明の一部の実施形態によれば、血清非含有培養培地は、血清またはその一部を含まない。

【0223】

本発明の一部の実施形態によれば、本発明の血清非含有培養培地は、血清アルブミン（例えば、ヒト血清または動物血清から精製されたアルブミン）を含まない。

【0224】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、血清代替物を含む。

【0225】

本明細書で使用される表現「血清代替物」は、血清の機能を、多能性幹細胞に増殖および生存にとって必要とされる成分を提供することによって代替する、限定された製剤を示す。

【0226】

様々な血清代替物製剤（ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）は、当該技術分野で既知であり、市販されている。

【0227】

例えば、ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）、カタログ番号１０８２８０２８）は、培養下で未分化ＥＳ細胞を増殖および維持するように最適化された、限定された無血清製剤である。ＧＩＢＣＯ（商標）Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔの製剤が、動物源に由来するＡｌｂｕｍａｘ（脂質を豊富に含有するウシ血清アルブミン）を含むことは注目されるべきである（国際特許公開番号、国際公開第９８／３０６７９号パンフレット（Ｐｒｉｃｅ Ｐ．Ｊ．らに付与））。しかし、Ｃｒｏｏｋら、２００７年による最近の出版物（Ｃｒｏｏｋ Ｊ．Ｍ．ら、２００７年、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１：４９０－４９４頁）は、ｃＧＭＰに基づいて作製されたＫｎｏｃｋｏｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ、カタログ番号０４－００９５）中のＦＤＡで承認された臨床グレードの包皮線維芽細胞を使用して生成された６つの臨床グレードのｈＥＳＣ系について記載している。

【0228】

別の市販されている血清代替物は、Ｇｉｂｃｏ－Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ ＵＳＡ、カタログ番号１２５８７－０１０から入手可能である、ビタミンＡを有しないＢ２７補給物である。Ｂ２７補給物は、ｄ－ビオチン、脂肪酸遊離画分Ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カタラーゼ、Ｌ－カルニチンＨＣｌ、コルチコステロン、エタノールアミンＨＣ１、Ｄ－ガラクトース（Ａｎｈｙｄ．）、グルタチオン（還元）、組換えヒトインスリン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレッシン－２－ＨＣｌ、亜セレン酸ナトリウム、超過酸化物不均化酵素、Ｔ－３／アルブミン複合体、ＤＬα－トコフェロール、および酢酸ＤＬαトコフェロールを含む血清非含有製剤である。しかし、Ｂ２７補給物の使用は、それが動物源由来のアルブミンを含むことから、限定される。

【0229】

本発明の一部の実施形態によれば、血清代替物は動物由来混入物を含まない（全く含有しない）。そのような混入物は、ヒト細胞に感染し得る病原体、動物の細胞成分または無細胞成分（流体）であり得る。

【0230】

動物由来混入物非含有の血清代替物が、ヒト細胞を培養するために使用されるとき、そのような血清代替物は「異種非含有」であるとして示されることに留意しなければならない。

【0231】

用語「異種（ｘｅｎｏ）」は、ギリシャ語「クセノス（Ｘｅｎｏｓ）」、すなわちストレンジャー（ｓｔｒａｎｇｅｒ）に基づく接頭辞である。本明細書で使用される表現「異種成分不含（ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）」は、クセノス（すなわち同一でない、外来）種に由来する一切の成分／混入物を含有しないことを示す。

【0232】

例えば、ヒト細胞と共に使用するための異種成分非含有血清代替物（即ち、動物由来混入物非含有血清代替物）は、インスリン、トランスフェリンおよびセレンの組み合わせを含みうる。それに加え、またはそれに代わり、異種成分非含有血清代替物は、ヒトまたは組換え生成アルブミン、トランスフェリンおよびインスリンを含みうる。

【0233】

市販の異種成分非含有血清代替物組成物の非限定例として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能なＩＴＳ（インスリン、トランスフェリンおよびセレン）の予混合物（ＩＴＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号５１５００－０５６）；ヒト血清アルブミン、ヒトトランスフェリンおよびヒト組換えインスリンを含み、かつ、増殖因子、ステロイドホルモン、グルココルチコイド、細胞接着因子、検出可能なＩｇおよびマイトジェンを含有しないＳｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ３（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ２６４０）、ヒト由来のタンパク質またはヒト組換えタンパク質のみを含むＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標） ＳＲ ＸｅｎｏＦｒｅｅ（カタログ番号 Ａ１０９９２－０１，Ａ１０９９２－０２、パート番号１２６１８－０１２または１２６１８－０１３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧＩＢＣＯ）が挙げられる。

【0234】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＳＲ３（Ｓｉｇｍａ）異種成分非含有血清代替製剤は、×１の作用濃度に達するように、１：１００比に希釈される。

【0235】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地における血清代替物［例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）ＳＲ ＸｅｎｏＦｒｅｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］の濃度が約１％［体積／体積（ｖ／ｖ）］から約５０％（ｖ／ｖ）までの範囲であり、例えば、５％（ｖ／ｖ）～約４０％（ｖ／ｖ）の範囲、例えば、約５％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）の範囲、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）～約３０％（ｖ／ｖ）の範囲、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）～約２５％（ｖ／ｖ）の範囲、例えば、１０％（ｖ／ｖ）～約２０％（ｖ／ｖ）の範囲、例えば、約１０％（ｖ／ｖ）、例えば、約１５％（ｖ／ｖ）、例えば、約２０％（ｖ／ｖ）、例えば、約３０％（ｖ／ｖ）である。

【0236】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、多能性幹細胞を、少なくとも５回の継代にわたって、少なくとも１０回の継代にわたって、少なくとも１５回の継代にわたって、少なくとも２０回の継代にわたって、少なくとも２５回の継代にわたって、少なくとも３０回の継代にわたって、少なくとも３５回の継代にわたって、少なくとも４０回の継代にわたって、少なくとも４５回の継代にわたって、少なくとも５０回の継代にわたって（例えば、培養において少なくとも２５日間、５０日間、７５日間、１００日間または２５０日間）増殖性の多能性未分化状態で維持することができる。

【0237】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、多能性幹細胞を未分化状態で拡大する能力を有する。

【0238】

例えば、以下の実施例の節の実施例１に記載のように、ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞は、懸濁培養される場合、二次元培養システムで少なくとも２０回の継代にわたって、または三次元培養システムで少なくとも５０回の継代にわたって未分化状態で維持されることができた。各継代が５～７日（例えば１４４時間）毎に生じ、観察される倍加時間が約２５～３６時間であると仮定すると、これらの条件下で培養された単一のｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞は、２^４～２^５個の細胞に（６日以内で）拡大されることができた。制御されたバイオリアクター中で培養された場合、多能性幹細胞の拡大能力は、５日以内で約６４倍に増大することに注意すべきである。従って、一ヶ月（即ち７２０時間）以内の培養で、単一の多能性幹細胞は、２^２０（１×１０^６）個のｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞に拡大されることができる。

【0239】

本発明者らは、増殖因子の組合せ、すなわち、インターロイキン１１（ＩＬ１１）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）の組合せ、またはインターロイキン１１（ＩＬ１１）およびオンコスタチンの組合せが、増殖性の未分化多能性状態での多能性幹細胞の成長および拡大を支援するために使用され得ることを発見している。

【0240】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、インターロイキン１１（ＩＬ１１）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を含む培養培地、またはインターロイキン１１およびオンコスタチンを含む培養培地が提供される。

【0241】

本明細書中で使用される場合、用語「インターロイキン１１」は、サイトカインのｇｐ１３０ファミリーのタンパク質メンバーを示す（これはまた、ＡＧＩＦおよびＩＬ－１１として知られている）。インターロイキン１１［例えば、ヒトＩＬ－１１ポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００６３２．１（配列番号３２）；ヒトＩＬ－１１ポリヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００６４１．２（配列番号３３）］を様々な市販供給元から得ることができ、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、またはＰｅｐｒｏＴｅｃｈなどから得ることができる。

【0242】

本明細書中で使用される場合、用語「毛様体神経栄養因子」（これはまた、ＨＣＮＴＦとして知られている；ＣＮＴＦ）は、その作用が、ある種のニューロン集団における神経伝達物質の合成および神経突起の成長がそれによって促進される神経系に限定されるポリペプチドホルモンを示す。このタンパク質はニューロンおよび乏突起膠細胞のための強力な生存因子であり、炎症性攻撃の期間中における組織破壊を軽減することに関連し得る。ＣＮＴＦ［例えば、ヒトＣＮＴＦポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００６０５．１（配列番号３４）；ヒトＣＮＴＦポリヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００６１４（配列番号３５）］を様々な市販供給元から得ることができ、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、またはＰｅｐｒｏＴｅｃｈなどから得ることができる。

【0243】

本明細書中で使用される場合、用語「オンコスタチン」（これはまた、ＯＳＭオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）として知られている）は、白血病阻害因子、顆粒球コロニー刺激因子およびインターロイキン６を含むサイトカインファミリーのポリペプチドメンバーを示す。オンコスタチン［例えば、ヒトオンコスタチンポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０６５３９１．１（配列番号３６）または同Ｐ１３７２５（配列番号３７）；ヒトポリヌクレオチド、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０２０５３０．３（配列番号３８）］を様々な市販供給元から得ることができ、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得ることができる（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号２９５－ＯＭ－０１０）。

【0244】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を含まない。

【0245】

ＧＳＫ３阻害剤の限定されない例には、ＧＳＫ－アルファまたはＧＳＫ－ベータの阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ ９８０１４、ＣＨＩＲ ９９０２１、ＡＲ－ＡＯ１４４－１８、ＳＢ２１６７６３およびＳＢ４１５２８６などが含まれる。ＧＳＫ３阻害剤の例が、Ｂｅｎｎｅｔｔ Ｃ他、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２７７巻、第３４号（２００２年８月２３日）、３０９９８頁～３１００４頁、および、Ｒｉｎｇ ＤＢ他、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、第５２巻（２００３年３月）、５８８頁～５９５頁に記載されている（これらのそれぞれが参照によって本明細書中に全面的に組み込まれる）。

【0246】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ１１が、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍｌ、かつ最大約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられ、例えば、少なくとも約０．２ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．３ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．４ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも約０．６ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．７ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．８ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．９ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約１ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0247】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ１１が、約０．５ｎｇ／ｍｌ～約５ｎｇ／ｍｌの間の濃度で用いられる。

【0248】

本発明の一部の実施形態によれば、ＣＮＴＦが、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍｌ、かつ最大約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられ、例えば、少なくとも約０．２ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．３ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．４ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも約０．６ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．７ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．８ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．９ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約１ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0249】

本発明の一部の実施形態によれば、ＣＮＴＦが、約０．５ｎｇ／ｍｌ～約５ｎｇ／ｍｌの間の濃度で用いられる。

【0250】

本発明の一部の実施形態によれば、オンコスタチンが、少なくとも約０．１ｎｇ／ｍｌ、かつ最大約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられ、例えば、少なくとも約０．２ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．３ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．４ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で、少なくとも約０．６ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．７ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．８ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約０．９ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約１ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられる。

【0251】

本発明の一部の実施形態によれば、オンコスタチンが、約０．５ｎｇ／ｍｌ～約５ｎｇ／ｍｌの間の濃度で用いられる。

【0252】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ１１およびＣＮＴＦを含む培地、またはＩＬ１１およびオンコスタチンを含む培地はさらに、血清代替物（例えば、動物由来混入物非含有の血清代替物）を約１０％～約２０％の間の濃度で含み、例えば、約１５％の濃度で含む。

【0253】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ１１およびＣＮＴＦを含む培養培地、またはＩＬ１１およびオンコスタチンを含む培養培地はさらに、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む。

【0254】

塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２またはＦＧＦ－βとしても既知）は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。ｂＦＧＦ［（例えば、ヒトｂＦＧＦポリペプチドＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１９９７．５（配列番号３９）；ヒトｂＦＧＦポリヌクレオチドＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２００６．４（配列番号４０）は、Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）（Ｃａｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）（例えば、カタログ番号ＣＲＦ００１ＡおよびＣＲＦ００１Ｂ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製品（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ ＮＹ，ＵＳＡ）（例えば、カタログ番号：ＰＨＧ０２６１、ＰＨＧ０２６３、ＰＨＧ０２６６およびＰＨＧ０２６４）、ＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．（Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）（例えば、カタログ番号：ＣＹＴ－２１８）、およびＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）（例えば、カタログ番号：Ｆ０２９１）などの様々な市販源から入手しうる。

【0255】

ＩＬ１１およびＣＮＴＦを含む培養培地、またはＩＬ１１およびオンコスタチンを含む培養培地におけるｂＦＧＦの濃度は、少なくとも約４ｎｇ／ｍｌ、かつ最大１００ｎｇ／ｍｌであることが可能であり、例えば、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約６ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約７ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約８ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約９ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌであることが可能である。

【0256】

ＩＬ１１およびＣＮＴＦを含む培養培地の限定されない例には、下記の実施例の節において記載されるＩＬＣＮＴＦ培地、ＮＩＬＣＮＴＦ培地が含まれ、これらは、増殖性の多能性未分化状態でのｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞の成長を二次元培養システムでは少なくとも１２回の継代にわたって、懸濁培養では少なくとも１０回の継代にわたって支援することができることが示された。

【0257】

本発明者らは、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体が、ヒト多能性幹細胞の未分化状態での成長を支援するために、動物由来混入物を全く含まない培養培地において使用され得ることを発見している。

【0258】

したがって、本発明の一部の実施形態の一態様によれば、動物由来混入物非含有の血清代替物と、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体とを含む培養培地が提供される。

【0259】

本明細書で使用される表現「ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体」は、インターロイキン－６受容体の可溶性部分［ＩＬ－６－Ｒ、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ８９４１０（配列番号４１）によって示されるヒトＩＬ－６－Ｒ；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ８９４１０のアミノ酸１１２～３５５（配列番号４２）によって示される可溶性ＩＬ６受容体の一部］およびインターロイキン－６（ＩＬ６；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ２９２９２（配列番号４３）によって示されるヒトＩＬ－６）またはその生物活性画分（例えば受容体結合ドメイン）を含むキメラ体ポリペプチドを示す。

【0260】

ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を構築するとき、その２つの機能的部分（すなわち、ＩＬ６およびその受容体）が互いに直接に融合され得ること（例えば、結合され得るか、または翻訳融合され得ること、すなわち、ただ１つのオープンリーディングフレームによってコードされ得ること）、または好適なリンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）を介してコンジュゲートされ得ること（結合され得るか、または翻訳融合され得ること）に留意しなければならない。本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体ポリペプチドは、天然に存在するＩＬ６およびＩＬ６受容体と類似する量およびパターンのグリコシル化を示す。例えば、好適なＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体が、配列番号１９および国際公開ＷＯ９９／０２５５２（Ｒｅｖｅｌ Ｍ．他）（これは参照によって本明細書中に全面的に組み込まれる）の図１１に示される通りである。

【0261】

血清代替物が動物由来混入物を全く含まないとすれば、さらなる培養培地成分もまた、動物由来混入物を含むことなく選択することができ（例えば、合成物、組換え物、またはヒト起源からの精製物が可能である）、その結果、培養培地全体が動物由来混入物を含まず、臨床／治療目的に好適な、ヒト多能性幹細胞を培養するための異種非含有培地として使用され得ることに留意しなければならない。

【0262】

本発明者らは、培地が未分化状態の多能性幹細胞の成長を支援し得ることを依然として維持しながら、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体が高濃度（すなわち、５０ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌの間）または低濃度（すなわち、５０ｐｇ／ｍｌ～１５０ｐｇ／ｍｌの間）のどちらにおいてでも用いられ得ることを発見している。

【0263】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体の濃度は、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、かつ最大約３５０ｎｇ／ｍｌであり、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌの間であり、例えば、約５５ｎｇ／ｍｌ～約１９５ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約６０ｎｇ／ｍｌ～約１９０ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約６５ｎｇ／ｍｌ～約１８５ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約７０ｎｇ／ｍｌ～約１８０ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約７５ｎｇ／ｍｌ～約１７５ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約８０ｎｇ／ｍｌ～約１７０ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約８５ｎｇ／ｍｌ～約１６５ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９０ｎｇ／ｍｌ～約１４０ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９０ｎｇ／ｍｌ～約１３０ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９０ｎｇ／ｍｌ～約１２０ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９０ｎｇ／ｍｌ～約１１０ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９５ｎｇ／ｍｌ～約１０５ｎｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９８ｎｇ／ｍｌ～約１０２ｎｇ／ｍｌの範囲であり、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体である。

【0264】

約５０ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌの間のＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を含む動物由来混入物非含有の培養培地の限定されない例には、ｃｍＴｅＳＲ２、ＮＣＭｒｂ１００Ｆ、ＮＣＭ１００Ｆ、ｃｍＶ５ｂおよびｃｍＨＡ１３が含まれる。

【0265】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体の濃度は、少なくとも約５０ｐｇ／ｍｌ、かつ最大約１５０ｐｇ／ｍｌであり、例えば、約５０ｐｇ／ｍｌ～２００ｐｇ／ｍｌの間であり、例えば、約５５ｐｇ／ｍｌ～約１９５ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約６０ｐｇ／ｍｌ～約１９０ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約６５ｐｇ／ｍｌ～約１８５ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約７０ｐｇ／ｍｌ～約１８０ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約７５ｐｇ／ｍｌ～約１７５ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約８０ｐｇ／ｍｌ～約１７０ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約８５ｐｇ／ｍｌ～約１６５ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９０ｐｇ／ｍｌ～約１５０ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９０ｐｇ／ｍｌ～約１４０ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９０ｐｇ／ｍｌ～約１３０ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９０ｐｇ／ｍｌ～約１２０ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９０ｐｇ／ｍｌ～約１１０ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９５ｐｇ／ｍｌ～約１０５ｐｇ／ｍｌの範囲、例えば、約９８ｐｇ／ｍｌ～約１０２ｐｇ／ｍｌの範囲であり、例えば、約１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体である。

【0266】

約５０ｐｇ／ｍｌ～２００ｐｇ／ｍｌの間のＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を含む異種非含有の培養培地の限定されない例には、ｃｍＴｅＳＲ２ｐ、ＮＣＭｒｂ１００Ｆｐ、ＮＣＭ１００Ｆｐ、ｃｍＶ５ｂｐおよびｃｍＨＡ１３ｐが含まれる。

【0267】

例えば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を、ＴｅＳＲ（商標）２ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ＃０５８６０／０５８８０）培養培地に加えることができる。ＴｅＳＲ（商標）２培地は、組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈｂＦＧＦ）および組換えヒト形質転換増殖因子β（ｒｈＴＧＦβ）を含有する、動物タンパク質非含有かつ血清非含有の定義された完全な配合物である。

【0268】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を含む動物由来混入物非含有の培養培地はさらに、ｂＦＧＦを含む。

【0269】

ｂＦＧＦを低濃度（例えば、約４ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌの間）または高濃度（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌの間）のどちらにおいてでも用いることができる。

【0270】

本発明の一部の実施形態によれば、動物由来混入物非含有の血清代替物と、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体とを含む培養培地はさらに、ｂＦＧＦを少なくとも約４ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約６ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約７ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約８ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約９ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌの濃度で含む。そのような培養培地の限定されない例には、ｃｍＶ５ｂ、ＮＣＭ１００Ｆｐ、ＮＣＭ１００ＦおよびｃｍＶ５ｂｐが含まれる。

【0271】

本発明の一部の実施形態によれば、動物由来混入物非含有の血清代替物と、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体とを含む培養培地はさらに、ｂＦＧＦを少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ～約１μｇの濃度で、例えば、約６０ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約７０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約８０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約９０ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ～約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ～約１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約６０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約７０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約８０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約９０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約１１０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約１２０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約１３０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約１４０ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含む。そのような培養培地の限定されない例には、ＮＣＭｒｂ１００Ｆ、ＮＣＭｒｂ１００Ｆｐ、ｃｍＴｅＳＲ２、およびｃｍＴｅＳＲ２ｐが含まれる。

【0272】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を含む動物由来混入物非含有の培養培地はさらに、アスコルビン酸を含む。

【0273】

アスコルビン酸（これはまた、ビタミンＣとして知られている）は、抗酸化性を有する糖酸（Ｃ_６Ｈ_８Ｏ_６；分子量、１７６．１２グラム／モル）である。本発明の一部の実施形態の培養培地によって使用されるアスコルビン酸は、天然のアスコルビン酸、合成アスコルビン酸、アスコルビン酸塩（例えば、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸カリウム）、アスコルビン酸のエステル形態（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル）、その機能的誘導体（本発明の培養培地において使用されるとき、同じ活性／機能を示す、アスコルビン酸に由来する分子）、またはその類似体（例えば、本発明の培養培地において使用されるとき、アスコルビン酸について認められる活性と類似する活性を示す、アスコルビン酸の機能的等価体）が可能である。本発明の一部の実施形態の培養培地において使用することができるアスコルビン酸処方物の限定されない例には、Ｌ－アスコルビン酸およびアスコルビン酸３－リン酸が含まれる。

【0274】

アスコルビン酸を様々な製造者から得ることができ、例えば、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から得ることができる（例えば、カタログ番号：Ａ２２１８、Ａ５９６０、Ａ７５０６、Ａ０２７８、Ａ４４０３、Ａ４５４４、Ａ２１７４、Ａ２３４３、９５２０９、３３０３４、０５８７８、９５２１０、９５２１２、４７８６３、０１－６７３０、０１－６７３９、２５５５６４、Ａ９２９０２、Ｗ２１０９０１）。

【0275】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を含む動物由来混入物非含有の培養培地におけるアスコルビン酸の濃度が約２５μｇ／ｍｌ～２００μｇ／ｍｌの間であり、例えば、２５μｇ／ｍｌ～１５０μｇ／ｍｌの間、例えば、３０μｇ／ｍｌ～１５０μｇ／ｍｌの間、例えば、約４０μｇ／ｍｌ～１２０μｇ／ｍｌの間、例えば、約４０μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの間、例えば、約４０μｇ／ｍｌ～８０μｇ／ｍｌの間、例えば、約４０μｇ／ｍｌ～６０μｇ／ｍｌの間であり、例えば、約５０μｇ／ｍｌである。そのような培養培地の限定されない例には、下記の実施例の節において記載されるｃｍＨＡ１３ｐ培地およびｃｍＨＡ１３培地が含まれる。

【0276】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を含む動物由来混入物非含有の培養培地はさらに、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）のイソ型を含む。

【0277】

本明細書中で使用される場合、表現「形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）」は、多くの細胞タイプにおける増殖、分化および他の機能の制御において同じ受容体シグナル伝達系を介して機能する形質転換増殖因子ベータ（β）のイソ型のいずれも示す。ＴＧＦβは、形質転換を誘導することにおいて作用し、また負のオートクリン増殖因子としても作用する。

【0278】

本発明の一部の実施形態によれば、ＴＧＦβの用語は、ＴＧＦβ_１［ヒトＴＧＦβ１のｍＲＮＡ配列：ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００６６０．４（配列番号４４）、ポリペプチド配列：ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００６５１．３（配列番号４５）］、ＴＧＦβ_２［ヒトＴＧＦβ２のｍＲＮＡ配列：ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００１１３５５９９．１ イソ型１（配列番号４６）またはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００３２３８．２ イソ型２（配列番号４７）、ポリペプチド配列：ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００１１２９０７１．１ イソ型２（配列番号４８）またはＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００３２２９．１ イソ型２（配列番号４９）］、またはＴＧＦβ_３［ヒトＴＧＦβ３のｍＲＮＡ配列：ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００３２３９．２（配列番号５０）、ポリペプチド配列：ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００３２３０．１（配列番号５１）］を示す。ＴＧＦβのイソ型を様々な市販供給元から得ることができ、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）およびＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）などから得ることができる。

【0279】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地に含まれるＴＧＦβはＴＧＦβ１である。

【0280】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地におけるＴＧＦβ_１の濃度は約０．０５ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌの範囲であり、例えば、０．１ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、例えば、約０．５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌである。

【0281】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地におけるＴＧＦβ_１の濃度は少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌであり、例えば、少なくとも約０．６ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約０．８ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約０．９ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１．２ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１．４ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１．６ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１．８ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２ｎｇ／ｍｌである。

【0282】

ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体、ｂＦＧＦおよびＴＧＦβ１を含む動物由来混入物非含有の培養培地の限定されない例は、下記の実施例の節において記載されるｃｍＶ５ｂ、ｃｍＶ５ｂｐ、ｃｍＴｅＳＲ２およびｃｍＴｅＳＲ２ｐである。

【0283】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地に含まれるＴＧＦβはＴＧＦβ１である。

【0284】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地におけるＴＧＦβ_３の濃度は約０．０５ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌの範囲であり、例えば、０．１ｎｇ／ｍｌ～約１μｇ／ｍｌ、例えば、約０．５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌである。

【0285】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地におけるＴＧＦβ_３の濃度は少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌであり、例えば、少なくとも約０．６ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約０．８ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約０．９ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１．２ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１．４ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１．６ｎｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも約１．８ｎｇ／ｍｌ、例えば、約２ｎｇ／ｍｌである。

【0286】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌの濃度（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌの間）のｂＦＧＦと、高濃度（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌの間）または低濃度（例えば、５０ｐｇ／ｍｌ～２００ｐｇ／ｍｌの間）のどちらかでのＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体とを含む培養培地が提供される。そのような培養培地の限定されない例には、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞を二次元培養システムでは少なくとも５回の継代にわたって、三次元培養システムでは少なくとも１５回の継代にわたって増殖性の多能性未分化状態で維持することができることが示されたＣＭｒｂ１００Ｆ、ＣＭｒｂ１００Ｆｐ、ＮＣＭｒｂ１００ＦおよびＮＣＭｒｂ１００Ｆｐの培養培地が含まれる。

【0287】

本発明者らは、高濃度の可溶性インターロイキン６受容体（ｓＩＬ６Ｒ）およびインターロイキン６（ＩＬ６）を含む培養培地が、増殖性の未分化多能性状態での多能性幹細胞の成長を支援するために使用され得ることを発見している。

【0288】

したがって、本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ｓＩＬ６ＲおよびＩＬ６を含む培養培地であって、ｓＩＬ６Ｒの濃度が少なくとも約５ｎｇ／ｍｌであり、かつＩＬ６の濃度が少なくとも約３ｎｇ／ｍｌである培養培地が提供される。

【0289】

本発明の一部の実施形態によれば、ｓＩＬ６Ｒの濃度は少なくとも約５ｎｇ／ｍｌであり、例えば、少なくとも約６ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌであり、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌの範囲であり、例えば、２０ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌの間であり、例えば、約２５ｎｇ／ｍｌである。

【0290】

本発明の一部の実施形態によれば、ＩＬ６の濃度は少なくとも約３ｎｇ／ｍｌであり、例えば、少なくとも約４ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約６ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約８ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約９ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌであり、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌの範囲であり、例えば、２０ｎｇ／ｍｌ～４０ｎｇ／ｍｌの間であり、例えば、約２５ｎｇ／ｍｌである。

【0291】

本発明の一部の実施形態によれば、ｓＩＬ６ＲおよびＩＬ６を含む培地はさらに、ｂＦＧＦを少なくとも約４ｎｇ／ｍｌの濃度で、かつ最大１００ｎｇ／ｍｌの濃度で含み、例えば、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約６ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約７ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約８ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約９ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で含む。

【0292】

本発明の一部の実施形態によれば、ｓＩＬ６ＲおよびＩＬ６を含む培地はさらに、血清代替物を１０％～３０％の間の濃度で含み、例えば、約１５％の濃度で含む。血清代替物の濃度は、使用される血清代替物のタイプに依存して変化し得ることに留意しなければならない。

【0293】

ｓＩＬ６ＲおよびＩＬ６を含む培養培地の限定されない例には、下記の実施例の節において記載されるｙＦＩＬ２５培地が含まれる。

【0294】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地はさらにインスリンを含む。インスリンを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から得ることができる。

【0295】

培養培地におけるインスリンの濃度は０．０００１グラム／リットル～１グラム／リットルの間で可能である（例えば、約０．００１μｇ／μｌ～約０．１μｇ／μｌの間、例えば、約０．００５μｇ／μｌ～約０．０５μｇ／μｌの間、例えば、約０．０１μｇ／μｌ）。

【0296】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地はさらにアルブミンを含む。アルブミンを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から得ることができる。

【0297】

培養培地におけるアルブミンの濃度は約０．１％～約５％の間で可能である。

【0298】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地はさらにトランスフェリンを含む。トランスフェリンを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、米国）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）から得ることができる。

【0299】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地は、脂質混合物をさらに含む。

【0300】

本明細書で使用される表現「脂質混合物」は、多能性幹細胞を培養するのに必要とされる、規定された（例えば化学的に規定された）脂質組成物を示す。脂質混合物は、通常、血清または血清代替物を含有しない培養培地に添加され、それにより、通常は血清または血清代替物の調合物に添加される脂質を代替することは注目されるべきである。

【0301】

本発明の一部の実施形態の培養培地中で使用可能である、市販の脂質混合物の非限定例として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅ Ｌｉｐｉｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（カタログ番号１１９０５－０３１）が挙げられる。

【0302】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地中の脂質混合物の濃度は、約０．５％［容量／容量（ｖ／ｖ）］～約３％ ｖ／ｖ、例えば約０．５％ ｖ／ｖ～約２％ ｖ／ｖ、例えば約０．５％ ｖ／ｖ～約１％ ｖ／ｖ、例えば約１％ ｖ／ｖである。

【0303】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地はさらに重炭酸ナトリウムを含む。重炭酸ナトリウムを、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（Ｂｅｉｔ ＨａＥｍｅｋ、イスラエル）から得ることができる。

【0304】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地における重炭酸ナトリウムの濃度が約５％～約１０％であり、例えば、約６％～約９％、例えば、約７％～約８％であり、例えば、約７．５％である。

【0305】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地はさらにＬ－グルタミンを含む。培養培地におけるＬ－グルタミンの濃度は、約０．５ミリモル（ｍＭ）から約１０ｍＭまでが可能であり、例えば、約１ｍＭ～５ｍＭ、例えば、２ｍＭが可能である。

【0306】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地はさらに非必須アミノ酸を含む。非必須アミノ酸を様々な供給元から、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）などから１０ｍＭのストック液として得ることができる。培養培地における非必須アミノ酸の濃度は約０．１％～１０％が可能であり、例えば、約０．２％～５％、例えば、０．５％～２％、例えば、約１％が可能である。

【0307】

本発明の一部の実施形態によれば、培養培地はさらに還元剤（例えば、ベータ－メルカプトエタノール（β－メルカプトエタノール）など）を約０．０１ｍＭ～１ｍＭの間の濃度範囲で、例えば、０．１ｍＭで含む。

【0308】

述べられるように、本発明の培養培地において使用されるタンパク質性因子（例えば、インターロイキン１１、ＣＮＴＦ、オンコスタチン、ｂＦＧＦ、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ_３、インスリン、アルブミン、トラスフェリン）のどれもが組換え発現され得るか、または生化学的に合成され得る。加えて、天然に存在するタンパク質性因子（例えば、ｂＦＧＦおよびＴＧＦβなど）を、この技術分野で広く公知の方法を使用して生物学的サンプル（例えば、ヒト血清、細胞培養物）から精製することができる。動物由来混入物非含有の培養培地を調製するために、タンパク質性因子は好ましくはヒト供給源から精製されるか、または組換え発現されることに留意にしなければならない。

【0309】

本発明のタンパク質性因子（例えばＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体）の生化学的合成は、標準の固相技術を用いて行いうる。これらの方法は、排他的固相合成法、部分固相合成法、断片縮合および古典的溶液合成を含む。

【0310】

本発明のタンパク質性因子の組換え発現は、Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７年） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４頁、Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９９０年） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０－８９頁、Ｂｒｉｓｓｏｎら（１９８４年） Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１－５１４頁、Ｔａｋａｍａｔｓｕら（１９８７年） ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７－３１１頁、Ｃｏｒｕｚｚｉら（１９８４年） ＥＭＢＯ Ｊ．３：１６７１－１６８０頁、Ｂｒｏｇｌｉら（１９８４年） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８－８４３頁、Ｇｕｒｌｅｙら（１９８６年） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９－５６５頁およびＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、１９８８年、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ、４２１－４６３頁によって記載の組換え技術を用いて行いうる。詳細には、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体は、ＰＣＴ公開の国際公開第９９／０２５５２号パンフレット（Ｒｅｖｅｌ Ｍ．らおよびＣｈｅｂａｔｈ Ｊ．らに付与、１９９７年）（全体として参照により本明細書中に援用される）中に記載のように生成しうる。

【0311】

したがって、本発明の一部の実施形態の一態様によれば、本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞（例えば、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁状態で培養されるｈＥＳＣまたはｉＰＳＣ；細胞凝集塊としての懸濁状態で培養されるｈＥＳＣまたはｉＰＳＣ；２次元培養システムで培養される多能性幹細胞など）と、本発明の一部の実施形態の培養培地とを含む細胞培養物が提供される。

【0312】

本発明の一部の実施形態によれば、細胞培養物はフィーダー細胞非含有である（フィーダー細胞支持体を含まない）。

【0313】

本明細書で使用される表現「フィーダー細胞支持体」は、フィーダー細胞（例えば線維芽細胞）が、多能性幹細胞がフィーダー細胞上で共培養される場合、または多能性幹細胞が、フィーダー細胞によって生成されるならし培地の存在下でマトリックス（例えば、細胞外マトリックス、合成マトリックス）上で培養される場合に、多能性幹細胞を増殖性および未分化状態で維持する能力を示す。フィーダー細胞の支持体は、培養下でありながらのフィーダー細胞の構造（例えば、フィーダー細胞を組織培養プレート内で培養することによって形成される三次元マトリックス）、フィーダー細胞の機能（例えば、フィーダー細胞による増殖因子、栄養素およびホルモンの分泌、フィーダー細胞の増殖速度、フィーダー細胞の老化前の拡大能）、および／または多能性幹細胞のフィーダー細胞層への付着、に依存する。

【0314】

本明細書で使用される表現「フィーダー細胞支持体の不在」は、フィーダー細胞を含まない培養培地および／または細胞培養物、ならびに／あるいはそれによって生成されるならし培地を示す。

【0315】

本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の細胞培養物中に含まれる多能性幹細胞は、培養期間中、例えば少なくとも２回の継代、例えば少なくとも４回の継代、例えば少なくとも８回の継代、例えば少なくとも１５回の継代、例えば少なくとも２０回の継代、例えば少なくとも２５回の継代、例えば少なくとも３０回の継代、例えば少なくとも３５回の継代、例えば少なくとも４０回の継代、例えば少なくとも４５回の継代、例えば少なくとも５０回の継代にわたり、安定な核型（染色体安定性）を示す。

【0316】

本発明の一部の実施形態によれば、本発明の細胞培養物は、少なくとも２０時間の倍加時間、例えば２０～４０時間の間（例えば約３６時間）の倍加時間を示すことから、非腫瘍形成性の遺伝的に安定な多能性幹細胞（例えばｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞）を示す。

【0317】

本発明の一部の実施形態によれば、本発明の細胞培養物は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の未分化多能性幹細胞によって特徴づけられる。

【0318】

本発明の一部の実施形態の細胞培養物は１ミリリットル（ｍｌ）の培養培地あたり少なくとも１０００個の多能性の未分化幹細胞を含む。一部の適用のためには、例えば、多能性幹細胞の単一細胞クローニングのためには、細胞の濃度は１００μｌ～２００μｌの培地あたり約１個とすることができ、それぞれの細胞が別個のディッシュに、好ましくはディッシュへの細胞の接着を防止するために非被覆のディッシュ（例えば、非培養処理ディッシュ）に置床（播種）されることに留意しなければならない。

【0319】

２－Ｄで培養された多能性幹細胞または細胞凝集塊としての懸濁状態で培養された多能性幹細胞の分化状態または未分化状態を、公知の方法を使用して決定することができる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他（１９９８）に記載される通り）。例えば、分化状態を様々な手法を使用して決定することができ、そのような手法には、例えば、形態学的評価（例えば、図１Ａ～図１Ｃおよび図３Ａ～図３Ｃに示される）、および／または未分化状態の典型的なマーカーの発現パターンを、免疫学的技術（例えば、膜結合マーカーについてはフローサイトメトリー、細胞外マーカーおよび細胞内マーカーについては免疫組織化学または免疫蛍光、ならびに分泌された分子マーカーについては酵素免疫アッセイなど）を使用して検出することが含まれる。例えば、本発明の一部の実施形態による培養培地において培養されたｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞に対して用いられる免疫蛍光では、Ｏｃｔ４、発達段階特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）４、腫瘍拒絶抗原（ＴＲＡ）－１－６０およびＴＲＡ－１－８１の発現が明示された（例えば、図２Ａ～図２Ｄ）。加えて、特異的な未分化マーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、Ｃｘ４３、ＦＧＦ４）または分化マーカー（例えば、アルブミン、グルカゴン、α－心臓アクチン、β－グロブリン、Ｆｌｋ１、ＡＣ１３３およびニューロフィラメント）の転写物のレベルを、ＲＮＡに基づく技術、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ分析および／またはｃＤＮＡマイクロアレイ分析などを使用して検出することができる。

【0320】

ＥＳ細胞分化の決定はまた、アルカリホスファターゼ活性の測定により行うことができる。未分化のヒトＥＳ細胞は、細胞を４％パラホルムアルデヒドにより固定処理し、Ｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｄ基質キットを製造者の説明書（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）に従って用いて発色させることによって検出することができるアルカリホスファターゼ活性を有する。

【0321】

本発明の一部の実施形態によれば、細胞培養物は、多能性幹細胞と、異種非含有培地とを含み、したがって培地は、多能性幹細胞の生物種とは異なる生物種に由来する混入物を何ら含有しない。例えば、細胞培養物がヒト多能性幹細胞を含むとき、培地は動物由来混入物を含まない。同様に、細胞培養物が霊長類の多能性幹細胞（例えば、サル）を含むとき、培養培地は他の動物またはヒト由来の混入物を含まない。

【0322】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、多能性未分化状態の多能性幹細胞を拡大し、かつ維持する方法が提供される。

【0323】

本発明の一部の実施形態によれば、未分化状態の多能性幹細胞を拡大し、かつ維持する方法は、多能性幹細胞を（本明細書中に記載される）本発明の新規な培養培地のいずれかにおいて培養することによって行われる。

【0324】

本発明の一部の実施形態によれば、未分化状態の多能性幹細胞を拡大し、かつ維持することが懸濁培養において行われる。

【0325】

本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞を懸濁培養で培養することが、血清非含有かつフィーダー細胞非含有の培養培地において行われる。

【0326】

多能性幹細胞の大きいクラスターは細胞分化を生じさせることがあるので、様々な対策が大きい多能性幹細胞凝集物を避けるために取られる。本発明の一部の実施形態によれば、形成された多能性幹細胞凝集塊が５～７日毎に解離させられ、そして単一細胞、または細胞の小さい凝集塊がさらなる培養容器に分けられる（すなわち、継代される）か、またはさらなる培養培地を伴うが、同じ培養容器に入れられたままであるかのどちらかである。

【0327】

本発明の一部の実施形態によれば、培養は多能性幹細胞を単一細胞として拡大することを可能にする条件下で行われる。

【0328】

本明細書中上記で記載されるように、多能性幹細胞の継代を細胞凝集塊の機械的解離を使用して行うことができる。

【0329】

加えて、および／または代わりに、多能性幹細胞の懸濁培養での継代を、酵素消化を、その後の機械的解離を伴って、または伴うことなく使用して行うことができる。

【0330】

多能性幹細胞凝集塊の酵素消化を、凝集塊を酵素（例えば、ＩＶ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ、米国）および／またはディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）など）に供することによって行うことができる。酵素とのインキュベーション時間は、懸濁培養において存在する細胞凝集塊のサイズに依存する。典型的には、多能性幹細胞凝集塊が懸濁培養の間に５～７日毎に解離させられるとき、１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼとの２０分～６０分のインキュベーションにより、未分化状態でさらに培養することができる小さい細胞凝集塊が生じる。あるいは、多能性幹細胞凝集塊は、１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼとの約２５分のインキュベーション、続いて、１ｍｇ／ｍｌのディスパーゼとの５分間のインキュベーションに供することができる。ヒトＥＳＣをトリプシンとともに継代することは染色体の不安定性および異常をもたらし得ることに留意しなければならない（例えば、Ｍｉｔａｌｉｐｏｖａ ＭＭ．他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２３：１９～２０、２００５、および、Ｃｏｗａｎ ＣＡ他、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．、３５０：１３５３～１３５６、２００４を参照のこと）。本発明の一部の実施形態によれば、ｈＥＳＣ細胞またはｉＰＳ細胞をトリプシンとともに継代することは避けなければならない。

【0331】

本発明の一部の実施形態によれば、大きい細胞凝集塊の酵素的解離または機械的解離後、解離させられた多能性幹細胞凝集塊はさらに、２００μｌのＧｉｌｓｏｎピペットチップを使用して（例えば、細胞を上下にピペッティングすることによって）小さい凝集塊に壊される。

【0332】

本発明の一部の実施形態によれば、未分化状態の多能性幹細胞を拡大し、かつ維持する方法は、二次元培養システムにおいて行われる。

【0333】

二次元培養システムはマトリックスまたはフィーダー細胞層を含むことができる。

【0334】

例えば、二次元培養システム上での培養は、多能性幹細胞をマトリックスまたはフィーダー細胞層上に、細胞の生存および増殖を促進するが、分化を制限する細胞密度でプレーティングすることによって行いうる。典型的には、約１５，０００細胞／ｃｍ^２～約３，０００，０００細胞／ｃｍ^２の間のプレーティング密度が使用される。

【0335】

多能性幹細胞の単細胞懸濁液が通常播種されるが、小塊も使用可能であることは理解されるであろう。このため、塊の破壊に使用される（例えばＩＶ型コラゲナーゼによる）酵素的消化（以下の実施例の節における「Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照）は、幹細胞が完全にばらばらになる前に終了し、細胞は、塊（すなわち１０～２００個の細胞）が形成される程度にピペットで粉砕される。しかし、細胞分化を誘発しうる大塊を回避するための手段がとられる。

【0336】

本発明の一部の実施形態によれば、培養システムは、マトリックスと、本発明の一部の実施形態の培養培地とを含む。

【0337】

本明細書で使用される用語「マトリックス」は、多能性幹細胞が、付着可能であり、それ故にフィーダー細胞の細胞付着機能を代替しうる任意の物質を示す。かかるマトリックスは、典型的には、多能性幹細胞が付着可能な細胞外成分を含有し、それ故、好適な培養基質を提供する。

【0338】

本発明の一部の実施形態によれば、マトリックスは、細胞外マトリックスを含む。

【0339】

細胞外マトリックスは、基底膜に由来する成分または接着分子受容体－リガンドカップリングの一部を形成する細胞外マトリックス成分からなりうる。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＳＡ）は、本発明での使用に適した市販のマトリックスの一例である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、室温でゲル化し、再構成基底膜を形成するＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞に由来する可溶性調製物である一方、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）はまた、増殖因子低下調製物として使用可能である。本発明での使用に適した他の細胞外マトリックス成分および成分混合物は、包皮マトリックス、ラミニンマトリックス、フィブロネクチンマトリックス、プロテオグリカンマトリックス、エンタクチンマトリックス、ヘパラン硫酸マトリックス、コラーゲンマトリックスなどを、単独でまたはそれらの様々な組み合わせで、含む。

【0340】

本発明の一部の実施形態によれば、マトリックスは動物由来混入物を含まない（ヒト多能性幹細胞を培養するための異種非含有マトリックスである）。

【0341】

完全な動物フリーの培養条件が所望される場合、マトリックスは、好ましくは、ヒト源に由来するか、または上記のような組換え技術を用いて合成される。かかるマトリックスとして、例えば、ヒト由来フィブロネクチン、組換えフィブロネクチン、ヒト由来ラミニン、包皮線維芽細胞マトリックスまたは合成フィブロネクチンマトリックス、が挙げられる。ヒト由来フィブロネクチンは、血漿フィブロネクチンまたは細胞フィブロネクチンに由来することができ、それらの双方は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手可能である。ヒト由来ラミニンおよび包皮線維芽細胞マトリックスは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手可能である。合成フィブロネクチンマトリックスは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手可能である。

【0342】

フィーダー細胞層が所望される場合、ヒト多能性幹細胞は、ヒト包皮繊維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されることができる。

【0343】

本発明者らは、多能性幹細胞が、生の非凍結細胞として輸送され得ること、そして、なおも依然として生存可能で、未分化で、かつ多能性であることを発見している。

【0344】

本発明の一部の実施形態によれば、細胞は、少なくとも４日間続く輸送（航空輸送または海上輸送）後において依然として生存可能で、未分化で、かつ多能性である。

【0345】

本発明者らは、本発明の新規な培養培地が、新しい多能性幹細胞株を導出するために使用され得ることを発見している。

【0346】

本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞株は胚性幹細胞株であり、胚性幹細胞株を導出する方法が、（ａ）胚性幹細胞を、着床前段階の胚盤胞、着床後段階の胚盤胞および／または胎児の生殖組織から得ること；および（ｂ）胚性幹細胞を本発明の一部の実施形態の培養培地において培養し、それにより胚性幹細胞株を導出することを含む。

【0347】

本発明の一部の実施形態によれば、多能性幹細胞株は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）株であり、ｉＰＳ細胞株を導出する方法が、（ａ）体細胞を多能性幹細胞に誘導すること；および（ｂ）多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の培養培地において培養し、それにより誘導多能性幹細胞株を導出することを含む。

【0348】

得られるとすぐに、ＥＳＣまたはｉＰＳ細胞はさらに、本質的には本明細書中上記で記載されるように、未分化状態の多能性幹細胞の拡大を可能にする本明細書中上記で記載される培養培地のいずれかにおいて培養される。

【0349】

確立された多能性幹細胞株（例えば、胚性幹細胞株または誘導多能性幹細胞株）は、未分化状態の細胞の増殖能を妨げることなく、一方でそれらの多能性能力を保ちながら、凍結／解凍サイクルを受けることができることが理解されるであろう。例えば、図６Ａ～図６Ｃに示されるように、また下記の実施例の節の実施例６において記載されるように、血清代替物（１０％～９５％）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；５％～１０％）を使用した場合、ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞が首尾よく凍結および解凍され、細胞の７０％超が生き残り、懸濁培養に直接に回復した。

【0350】

本明細書中上記で記載される新規な培養培地のいずれもが、多能性の未分化幹細胞を、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で培養し、維持し、かつ拡大するために使用され得ることに留意しなければならない。

【0351】

本発明の一部の実施形態によれば、未分化状態の多能性幹細胞を、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養において拡大および維持するための培養条件は、インターロイキン１１（ＩＬ１１）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を含む培養培地を含む。

【0352】

本発明の一部の実施形態によれば、未分化状態の多能性幹細胞を、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で拡大し、かつ維持するための培養条件は、少なくとも５０ｎｇ／ｍｌの濃度での塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体とを含む培養培地を含む。

【0353】

本発明の一部の実施形態によれば、未分化状態の多能性幹細胞を、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で拡大し、かつ維持するための培養条件は、動物由来混入物非含有の血清代替物と、ＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体とを含む培養培地を含む。

【0354】

本発明の一部の実施形態によれば、未分化状態の多能性幹細胞を、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で拡大し、かつ維持するための培養条件は、可溶性インターロイキン６受容体（ｓＩＬ６Ｒ）およびインターロイキン６（ＩＬ６）を含み、ｓＩＬ６Ｒの濃度が少なくとも５ｎｇ／ｍｌであり、かつＩＬ６の濃度が少なくとも３ｎｇ／ｍｌである血清非含有の培養培地を含む。

【0355】

本発明の一部の実施形態によれば、未分化状態の多能性幹細胞を、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で拡大し、かつ維持するための培養条件は、インターロイキン１１（ＩＬ１１）およびオンコスタチンを含む培養培地を含む。

【0356】

下記は、分化した細胞系譜を本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞から製造する方法の限定されない記載である。

【0357】

下記の実施例の節の実施例２において記載されるように、本明細書中上記の培養培地のいずれかにおいて拡大され、かつ維持されたｈＥＳＣおよびヒトｉＰＳ細胞は、二次元培養システム（例えば、フィーダー非含有マトリックス）または三次元培養システム（例えば、静的または動的な懸濁培養）における長期の培養期間（例えば、少なくとも１０回または３０回の継代の期間）後、インビトロで（ＥＢの形成によって）、またインビボで（奇形腫の形成によって）立証されるように、多能性である（すなわち、胚の３つの胚葉（外胚葉、内胚葉および中胚葉）のすべての細胞タイプに分化することができる）。

【0358】

したがって、本発明の教示に従って培養されるｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞は、分化した系譜特異的な細胞を作製するための供給源として使用することができる。そのような細胞は、多能性幹細胞から、ＥＳＣを様々な分化シグナル（例えば、サイトカイン、ホルモン、増殖因子）に供することによって直接に得ることができ、または胚様体の形成、およびそれに続くＥＢの細胞の系譜特異的な細胞への分化により間接的に得ることができる。

【0359】

したがって、本発明の一部の実施形態の態様によれば、胚様体を多能性幹細胞から生成する方法が提供される。本方法は、（ａ）本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の方法に従って培養し、それによって拡大された未分化多能性幹細胞を得るステップ、および（ｂ）拡大された未分化多能性幹細胞を、幹細胞の胚様体への分化に適した培養条件下に置くステップによって実施され、それによって胚様体を多能性幹細胞から生成する。

【0360】

本明細書で使用される表現「胚様体」は、分化を経ている、ＥＳＣ、拡張胚盤胞細胞（ＥＢＣ）、胚性生殖細胞（ＥＧＣ）および／または誘導多能性幹細胞の集団からなる形態学的構造を示す。ＥＢの形成は、多能性幹細胞培養物からの分化遮断因子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）の除去後に開始される。ＥＢの形成の第１ステップにおいては、多能性幹細胞が、小細胞塊に増殖し、次いで分化を進める。分化の第１相においては、ヒトＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞のいずれかに対する培養下で１～４日後、内胚葉細胞層が小塊の外部層上に形成される結果、「単純な（ｓｉｍｐｌｅ）ＥＢ」が得られる。第２相においては、分化後の３～２０日後、「複雑な（ｃｏｍｐｌｅｘ）ＥＢ」が形成される。複雑なＥＢは、外胚葉および中胚葉細胞および誘導組織（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ）の広範な分化によって特徴づけられる。

【0361】

したがって、本発明の一部の実施形態に従う方法は、拡大された未分化多能性幹細胞を得るための上記の培養培地（例えば、細胞凝集塊もしくは細胞凝集塊を有さない単一細胞としての懸濁培養で、または二次元培養システムで）のいずれかの中で本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞を培養することと、それに続き、拡大された未分化多能性幹細胞（例えば、ＥＳＣまたはｉＰＳ細胞）を、多能性幹細胞の胚様体への分化に適した培養条件下に置くこととを含む。かかる分化促進培養条件は、多能性幹細胞が未分化状態で増殖されるべきである場合に使用される分化阻害因子、例えば、ＴＧＦβ_１、ＴＧＦβ_３、アスコルビン酸、ＩＬ－１１、ＣＮＴＦ、オンコスタチン、ｂＦＧＦおよび／またはＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を実質的に有しない。

【0362】

ＥＢの形成においては、多能性幹細胞（ＥＳＣまたはｉＰＳ細胞）は、そのフィーダー非含有培養システムまたは懸濁培養物から取り出され、血清または血清代替物を含有しかつ分化阻害因子を含有しない培養培地の存在下で懸濁培養に移される。例えば、ＥＢの形成に適した培養培地は、２０％ＦＢＳｄ（ＨｙＣｌｏｎｅ（Ｕｔａｈ，ＵＳＡ））、１ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール、および１％非必須アミノ酸ストックが補充された塩基性培地（例えば、Ｋｏ－ＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２）を含みうる。

【0363】

ＥＢの形成のモニタリングは、当業者の能力の範囲内であり、形態学的評価（例えば組織学的染色）および分化特異的マーカーの発現の判定［例えば、免疫学的技術またはＲＮＡに基づく分析（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、ｃＤＮＡマイクロアレイ）を使用］により、実施できる。

【0364】

系譜特異的細胞をＥＢから得るため、ＥＢの細胞は、さらに系譜特異的細胞に適した培養条件下に置くことが可能であることは理解されるであろう。

【0365】

多能性幹細胞から系譜特異的細胞を生成するための本発明の一部の実施形態によれば、方法は、（ｃ）胚様体の細胞を系譜特異的細胞の分化および／または拡大に適した培養条件下に置くステップをさらに含み、それにより、系譜特異的細胞が胚性幹細胞から生成される。

【0366】

本明細書で使用される表現「系譜特異的細胞の分化および／または拡大に適した培養条件」は、培養システム、例えば、フィーダー非含有マトリックスまたは懸濁培養物と、ＥＢの細胞に由来する特異的細胞系譜の分化および／または拡大に適した培養培地との組み合わせを示す。さらに、かかる培養条件の非限定例が、以下に記載される。

【0367】

本発明の一部の実施形態によれば、本発明のこの態様の方法は、ステップ（ｂ）後に系譜特異的細胞を単離するステップをさらに含む。

【0368】

本明細書で使用される表現「系譜特異的細胞を単離する」は、主に特異的系譜表現型に関連した少なくとも１つの特性を示す細胞を有する培養下での細胞の混合集団の集積を示す。すべての細胞系譜が、３つの胚性胚葉から誘導されることは理解されるであろう。したがって、例えば、肝細胞および膵臓細胞は、内胚葉、骨、軟骨、弾性繊維結合組織、筋細胞、心筋細胞、骨髄細胞、血管細胞（すなわち内皮および平滑筋細胞）から誘導され、また造血細胞は、胚性中胚葉から分化され、神経、網膜および表皮細胞は、胚性外胚葉から誘導される。

【0369】

本発明の一部の好ましい実施形態によれば、系譜特異的細胞の単離は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）によるＥＢの細胞のソーティングによって行われる。

【0370】

ＦＡＣＳ分析によるＥＢ由来の分化細胞を単離する方法は、当該技術分野で既知である。一方法によれば、ＥＢは、トリプシンおよびＥＤＴＡの溶液（それぞれ０．０２５％および０．０１％）を用いて分離され、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄され、特異的細胞系譜に対する細胞表面抗原特性に特異的な蛍光標識抗体とともに氷上で３０分間インキュベートされる。例えば、内皮細胞は、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ Ｓ．ら（「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００２年、９９：４３９１－４３９６頁）に記載のように、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））から入手可能な蛍光標識ＰＥＣＡＭ１抗体（３０８８４Ｘ）など、血小板内皮細胞接着分子－１（ＰＥＣＡＭ１）に特異的な抗体に付着させることによって単離される。造血細胞は、蛍光標識抗体、例えば、ＣＤ３４－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５－ＰＥ、ＣＤ３１－ＰＥ、ＣＤ３８－ＰＥ、ＣＤ９０－ＦＩＴＣ、ＣＤ１１７－ＰＥ、ＣＤ１５－ＦＴＴＣ、クラスＩ－ＦＩＴＣ（それら全部におけるＩｇＧ１はＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから入手可能）、ＣＤ１３３／１－ＰＥ（ＩｇＧ１）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）から入手可能）、およびグリコホリンＡ－ＰＥ（ＩｇＧ１）（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）から入手可能）を使用して単離される。生細胞（すなわち固定を伴わない）が、ヨウ化プロピジウムの使用によるＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分析され、死細胞が、ＰＣ－ＬＹＳＩＳまたはＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウェアのいずれかを用いて除去される。単離細胞は、Ｋａｕｆｍａｎ Ｄ．Ｓ．ら、（「Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００１年、９８：１０７１６－１０７２１頁）によって記載のように、磁気標識二次抗体および磁気分離カラム（ＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用し、さらに集積されうることは理解されるであろう。

【0371】

本発明の一部の実施形態によれば、系譜特異的細胞の単離は、ＥＢ内部に含まれる細胞、組織および／または組織様構造の機械的分離によって行われる。

【0372】

例えば、拍動する心筋細胞は、米国特許出願公開第２００３／００２２３６７号明細書（Ｘｕらに付与）中に開示のように、ＥＢから単離されうる。本発明の４日齢ＥＢは、ゼラチンコートされたプレートまたはチャンバースライドに移され、結合および分化が可能になる。分化の８日目に認められる自発的収縮細胞は、機械的に分離され、低カルシウム媒体またはＰＢＳを含有する１５ｍＬのチューブに回収される。細胞は、コラゲナーゼ活性に依存し、コラゲナーゼＢによる消化を用いて、３７℃で６０～１２０分間解離される。次いで、解離された細胞は、分化用ＫＢ培地（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ＫＢ ｍｅｄｕｉｕｍ）（８５ｍＭ ＫＣｌ、３０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１ｍＭ ＥＧＴＡ、５ｍＭクレアチン、２０ｍＭグルコース、２ｍＭ Ｎａ_２ＡＴＰ、５ｍＭピルビン酸塩、および２０ｍＭタウリン、ｐＨ７．２に緩衝化、Ｍａｌｔｓｅｖら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５：２３３頁、１９９４年）に再懸濁され、３７℃で１５～３０分間インキュベートされる。解離後、細胞がチャンバースライドに播種され、分化培地中で培養され、拍動可能な単一の心筋細胞が生成される。

【0373】

本発明の一部の実施形態によれば、系譜特異的細胞の単離は、ＥＢに分化因子を施し、それにより、ＥＢの系譜特異的分化細胞への分化を誘発することによって行われる。

【0374】

以下は、ＥＢの系譜特異的細胞への分化を誘発するための手順およびアプローチの非限定的説明である。

【0375】

本発明の一部の実施形態のＥＢを神経前駆体に分化させるため、４日齢ＥＢは、５ｍｇ／ｍｌのインスリン、５０ｍｇ／ｍｌのトランスフェリン、３０ｎＭの塩化セレン、および５ｍｇ／ｍｌのフィブロネクチンを有するＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ＩＴＳＦｎ培地、Ｏｋａｂｅ Ｓ．ら、１９９６年、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．５９：８９－１０２頁）を含む組織培養皿内で５～１２日間培養される。さらに、得られた神経前駆体は、移植され、神経細胞がインビボで生成されうる（Ｂｒｕｅｓｔｌｅ Ｏ．ら、１９９７年、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ－ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｎｅｕｒａｌ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９４：１４８０９－１４８１４頁）。神経前駆体は、その移植前、０．１％ＤＮａｓｅの存在下で、トリプシン処理され、単細胞懸濁液に粉砕されることは理解されるであろう

【0376】

本発明の一部の実施形態のＥＢは、オリゴデンドロサイトに分化し、細胞を、修飾ＳＡＴＯ培地、すなわち、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ピルビン酸塩、プロゲステロン、プトレッシン、チロキシン、トリヨードチロニン、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、アミノ酸、ニューロトロフィン３、毛様体神経栄養因子およびヘペスを有するＤＭＥＭ中で培養することにより、細胞を有髄化しうる（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ Ｊ．Ｅ．およびＳａｔｏ Ｇ．Ｈ．、１９７９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６、５１４－５１７頁；Ｒａｆｆ Ｍ．Ｃ．、Ｍｉｌｌｅｒ Ｒ．Ｈ．、およびＮｏｂｌｅ Ｍ．、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ ３０３：３９０－３９６頁］。要するに、ＥＢは、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを使用して解離され（３７℃で５分間）、単一の細胞懸濁液に粉砕される。懸濁された細胞は、５％ウマ血清および５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）が補充されたＳＡＴＯ培地を有するフラスコ内にプレーティングされる。培養下で４日後、フラスコは穏やかに振とうされ、接着が弱い細胞（主にオリゴデンドロサイト）が懸濁される一方、星状細胞は、フラスコに接着し、さらにならし培地を生成する状態が維持される。一次オリゴデンドロサイトは、ＳＡＴＯ培地を有する新しいフラスコにさらに２日間移される。培養下で全体で６日経過後、オリゴスフェアー（ｏｌｉｇｏｓｐｈｅｒｅ）は、細胞移植のため、部分的に解離され、ＳＡＴＯ培地に再懸濁されるか、または完全に解離され、先行する振とうステップから得られるオリゴスフェアーならし培地中にプレーティングされる［Ｌｉｕ Ｓ．ら、（２０００年） 「Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｍｙｅｌｉｎａｔｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７：６１２６－６１３１頁］。

【0377】

肥満細胞の分化においては、本発明の一部の実施形態の２週齢ＥＢは、１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２０％（ｖ／ｖ）のＷＥＨＩ－３細胞ならし培地および５０ｎｇ／ｍｌの組換えラット幹細胞因子が補充されたＤＭＥＭ培地を含む組織培養皿に移される（ｒｒＳＣＦ、Ｔｓａｉ Ｍ．ら、２０００年、「Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｖｅｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｌｅｔｈａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍｉｃｅ ｉｎ ｖｉｖｏ．」 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９７：９１８６－９１９０頁）。培養物は、週に１回、細胞を新しいフラスコに移し、かつ培地の半分を交換することにより、拡大される。

【0378】

血液－リンパ系細胞を本発明の一部の実施形態のＥＢから生成するため、２～３日齢ＥＢは、調節可能な酸素含量を有するインキュベーターを使用し、７．５％ＣＯ_２および５％Ｏ_２の存在下で、ガス透過性培養皿に移される。分化の１５日後、細胞は採取され、コラゲナーゼ（０．１単位／ｍｇ）およびディスパーゼ（０．８単位／ｍｇ）（双方はＦ．Ｈｏｆｆｍａｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手可能）での穏やかな消化によって解離される。ＣＤ４５陽性細胞は、Ｐｏｔｏｃｎｉｋ Ａ．Ｊ．ら、（「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｈｅｍａｔｏ－ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ．」 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９７年、９４：１０２９５－１０３００頁）に記載のように、ヤギ抗ラット免疫グロブリンに複合された抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｍ１／９．３．４．ＨＬ．２および常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用し、単離される。単離されたＣＤ４５陽性細胞は、ＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）全体にわたる単回通過を用いて、さらに集積しうる。

【0379】

単離された系譜特異的細胞の分化および拡大に適した培養条件は、様々な組織培養培地、増殖因子、抗生物質、アミノ酸などを含み、また、特定の細胞種および／または細胞系譜を拡大しかつ分化させるため、いずれの条件が適用されるべきかを判定することが当業者の能力の範囲内にあることは理解されるであろう。

【0380】

上述のように、系譜特異的細胞は、ＥＳＣまたはｉＰＳ細胞などの拡大された未分化多能性幹細胞を特異的細胞系譜の分化に適した培養条件に直接誘発することによって得ることができる。

【0381】

例えば、下記の実施例の節の実施例１０、実施例１１および実施例１２において記載されるように、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で拡大され、かつ維持された多能性幹細胞は、多能性幹細胞の、外胚葉細胞系譜のニューロン始原体への直接的な分化（図１７Ａ～図１７Ｃ、実施例１０）、中胚葉系譜の間葉系幹細胞への直接的な分化（図１８Ａ～図１８Ｃ、実施例１１）、および内胚葉細胞系譜のＰＤＸ１発現細胞への直接的な分化（図２０Ａ～図２０Ｂ、実施例１２）によってインビトロで立証されるように多能性である。

【0382】

本発明の一部の実施形態の側面によれば、系譜特異的細胞を多能性幹細胞から生成する方法が提供される。本方法は、（ａ）多能性幹細胞を本発明の一部の実施形態の方法に従って培養し、それによって拡大された未分化幹細胞を得るステップと、（ｂ）拡大された未分化幹細胞を、系譜特異的細胞の分化および／または拡大に適した培養条件下に置くステップと、によって実施され、それにより、系譜特異的細胞が多能性幹細胞から生成される。

【0383】

以下は、系譜特異的細胞の多能性幹細胞（例えばＥＳＣおよびｉＰＳ細胞）からの分化および／または拡大に適した培養条件の非限定例である。

【0384】

ＣＤ７３陽性およびＳＳＥＡ－４陰性である間葉間質細胞は、Ｔｒｉｖｅｄｉ ＰおよびＨｅｍａｔｔｉ Ｐ．Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．２００８年、３６（３）：３５０－９頁に本質的に記載のように、ｈＥＳＣの培養物中に形成された線維芽細胞様分化細胞の画分を機械的に増大させることにより、ｈＥＳＣから生成されうる。要するに、ｈＥＳＣの分化を誘発するため、培地の変更の間隔は、３～５日に延長され、ＥＳＣコロニーの周辺部の細胞は、紡錘状の線維芽細胞様細胞になる。これらの条件下で９～１０日後、培養下の約４０～５０％の細胞が線維芽細胞様の外見を得る場合、ＥＳＣコロニーの未分化部分は、物理的に除去され、残りの分化細胞は、同じ条件下で新しい培養プレートを通過される。

【0385】

ｈＥＳＣのドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンへの分化を誘発するため、Ｖａｚｉｎ Ｔ．ら、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００９年８月１２日；４（８）：ｅ６６０６；およびＥｌｋａｂｅｔｚ Ｙ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００８年１月１５日；２２：１５２－１６５頁に本質的に記載のように、細胞は、マウス間質細胞系ＰＡ６またはＭＳ５とともに共培養するか、あるいは、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ－１／ＣＸＣＬ１２）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ２）およびエフリンＢｌ（ＥＦＮＢ１）の組み合わせとともに培養しうる。

【0386】

中脳ドーパミン（ｍｅｓＤＡ）ニューロンを生成するため、Ｆｒｉｌｉｎｇ Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００９年、１０６：７６１３－７６１８頁に本質的に記載のように、ｈＥＳＣは、遺伝子組換えにより、転写因子Ｌｍｘ１ａを発現しうる（例えば、ＰＧＫプロモーターおよびＬｍｘ１ａを有するレンチウイルスベクターを使用）。

【0387】

肺上皮（ＩＩ型肺胞上皮）をｈＥＳＣから生成するため、ＥＳＣは、Ｒｉｐｐｏｎ Ｈ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ Ａｍ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｏｃ．２００８年；５：７１７－７２２頁に記載のように、市販の細胞培養培地（Ｓｍａｌｌ Ａｉｒｗａｙ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ；Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐａｒｋ，ＭＤ））の存在下、またはその代わり、肺細胞の細胞系（例えばＡ５４９ヒト肺腺癌細胞系）から採取されたならし培地の存在下で培養しうる。

【0388】

ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞の神経細胞への分化を誘導するため、多能性幹細胞は、Ｃｈａｍｂｅｒｓ Ｓ．Ｍ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９年、２７：２７５－２８０頁に本質的に記載のように、ＴＧＦ－ｂ阻害剤（ＳＢ４３１５４２、Ｔｏｃｒｉｓ；例えば１０ｎＭ）およびＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ；例えば５００ｎｇ／ｍｌ）が補充された血清代替培地の存在下で約５日間培養することができ、その後、細胞は、５００ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎの存在下で、漸増量（例えば、２５％、５０％、７５％、２日ごとに変更）のＮ２培地（Ｌｉ Ｘ．Ｊ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年、２３：２１５－２１頁）とともに培養される。

【0389】

ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞の神経始原体への分化を誘導するために、細胞が懸濁状態で培養され、その後分化阻害因子が培養培地から除かれ、５×１０^－５Ｍのレチノイン酸が２１日間加えられる。その後、細胞はフィブロネクチン被覆プレートに移され、細胞を分析のために集める前にさらに５日間培養される。ｑ－ＰＣＲおよび免疫染色により、ニューロン始原体細胞の存在が確認される（下記の実施例の節の実施例７を参照のこと）。

【0390】

ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞の内胚葉細胞（インスリン産生細胞を含む）への分化を誘導するために、分化阻害因子が多能性幹細胞の培養培地から除かれ、細胞が、ｃＡＭＰ増加剤（例えば、フォルスコリン、８－ブロモｃＡＭＰ、ＧＡＢＡ、ＩＢＭＸおよびＤＢＣなど）を含有する培地において、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンに４８時間さらされる。１０日後、細胞が内胚葉のマーカーについて分析される。Ｓｏｘ１７についてのｑ－ＰＣＲにより、非処理の対照との比較において、処理細胞でのＳｏｘ１７発現における有意な増大が明示される（下記の実施例の節の実施例７を参照のこと）。

【0391】

ｈＥＳＣまたはヒトｉＰＳ細胞の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化を誘導するために、多能性幹細胞が血清含有培地に１４日間移され、その後ゼラチンまたはＭａｔｒｉｇｅｌのどちらかに置床される。７～１４日後、細胞がＭＳＣに分化させられ、このＭＳＣは凍結することができるか、またはトリプシンを使用しながら継代することができる。

【0392】

系譜特異的一次培養物に加え、本発明のＥＢを使用し、培養下で無限の拡大能を有する系譜特異的細胞系を生成しうる。

【0393】

本発明の細胞系は、例えば、細胞内でのテロメラーゼ遺伝子の発現（Ｗｅｉ Ｗ．ら、２００３年、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２３：２８５９－２８７０頁）または同細胞とＮＩＨ３Ｔ３ ｈｐｈ－ＨＯＸｌｌレトロウイルス産生細胞との共培養（Ｈａｗｌｅｙ Ｒ．Ｇ．ら、１９９４年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：１－１２頁）を含む当該技術分野で既知の方法によってＥＢ由来細胞を不死化することにより、生成されうる。

【0394】

下記の実施例の節の実施例１１において記載されるように、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁状態で培養される多能性幹細胞はさらに、中胚葉系譜の細胞に懸濁培養（３－Ｄ）または２次元培養システムにおいて分化することができる。

【0395】

下記の実施例の節の実施例１１において記載されるように、本発明者らは、多能性幹細胞を懸濁状態において間葉系幹細胞に分化させる新規な方法を発見している。

【0396】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、間葉系幹細胞を懸濁培養で作製する方法が提供される。この方法は、本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞（例えば、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁状態で培養されるＰＳＣ、または細胞凝集塊としての懸濁状態で培養されるＰＳＣ）を多能性幹細胞の間葉系幹細胞への分化に好適な条件下での懸濁培養で培養し、それにより間葉系幹細胞を懸濁培養で作製することを含む。

【0397】

多能性幹細胞をＭＳＣに分化させるために好適な公知の培養培地はどれも使用することができる。

【0398】

本発明者らは、下記の培養培地が多能性幹細胞の間葉系幹細胞への分化に好適であることを発見している：
（１）Ｆｙ富化培地；８０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）からなり、１０％のノックアウト血清代替物、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅまたはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック液を含有する（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）；
（２）ＭｅＳｕｓ Ｉ培地；８０％のＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）からなり、２０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅまたはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、２ｍＭのＬ－グルタミンを含有する（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）；
（３）ＭｅＳｕｓ ＩＩ培地；８０％のαＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）からなり、２０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅまたはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、２ｍＭのＬ－グルタミンを含有する（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）；
（４）ＭｅＳｕｓ ＩＩＩ培地；ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）、１％のＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および２ｍＭのＬ－グルタミンからなる（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）。

【0399】

本発明者らは、培養条件に、多能性幹細胞を未分化用培地による懸濁培養からＭＳＣ分化用培地による懸濁培養に徐々に移すことを含めなければならないことを発見している。下記は、多能性幹細胞を分化用培地に移すための限定されない方法である：
Ｉ．（ｉ）１回の継代について２５％分化培地／７５％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｉ）１回の継代について５０％分化培地／５０％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｉｉ）１回の継代について７５％分化培地／２５％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｖ）１００％分化培地。
ＩＩ．（ｉ）１回の継代について５０％分化培地／５０％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｉ）１回の継代について７５％分化培地／２５％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｉｉ）１００％分化培地。
ＩＩＩ．（ｉ）１回の継代について５０％分化培地／５０％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｉ）１００％分化培地。

【0400】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、本発明の一部の実施形態の方法によって作製される懸濁培養物における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の単離された集団が提供される。

【0401】

本発明の一部の実施形態によれば、本発明の一部の実施形態の方法によって作製されるＭＳＣの少なくとも約３０％（例えば、３０％）、少なくとも約３５％（例えば、３５％）、少なくとも約４０％（例えば、４０％）、少なくとも約４５％（例えば、４５％）、少なくとも約５０％（例えば、５０％）、少なくとも約５５％（例えば、５５％）、少なくとも約６０％（例えば、６０％）、少なくとも約６５％（例えば、６５％）、少なくとも約７０％（例えば、７０％）、少なくとも約７５％（例えば、７５％）、少なくとも約８０％（例えば、８０％）、少なくとも約８１％（例えば、８１％）、少なくとも約８２％（例えば、８２％）、少なくとも約８３％（例えば、８３％）、少なくとも約８４％（例えば、８４％）、少なくとも約８５％（例えば、８５％）、少なくとも約８６％（例えば、８６％）、少なくとも約８７％（例えば、８７％）、少なくとも約８８％（例えば、８８％）、少なくとも約８９％（例えば、８９％）、少なくとも約９０％（例えば、９０％）、少なくとも約９１％（例えば、９１％）、少なくとも約９２％（例えば、９２％）、少なくとも約９３％（例えば、９３％）、少なくとも約９４％（例えば、９４％）、少なくとも約９５％（例えば、９５％）、少なくとも約９６％（例えば、９６％）、少なくとも約９７％（例えば、９７％）、少なくとも約９８％（例えば、９８％）、少なくとも約９９％（例えば、９９％）、例えば、１００％が、ＣＤ７３＋／ＣＤ３１－／ＣＤ１０５＋の発現シグナチャーによって特徴づけられる。

【0402】

本発明の一部の実施形態によれば、ＭＳＣは、脂肪形成系譜、骨芽細胞系譜および軟骨形成系譜からなる群から選択される細胞系譜への懸濁培養での分化が可能である。

【0403】

下記の実施例の節の実施例１０において記載されるように、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁状態で培養される多能性幹細胞はさらに、外胚葉系譜の細胞に懸濁培養（３－Ｄ）または２次元培養システムにおいて分化することができる。

【0404】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、ニューロン始原体細胞を懸濁培養で作製する方法であって、本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞（例えば、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で培養された多能性幹細胞）をニューロン始原体細胞への分化に好適な条件下での懸濁培養で培養し、それによりニューロン始原体細胞を懸濁培養で作製することを含む方法が提供される。

【0405】

多能性幹細胞をニューロン始原体細胞に分化させるために好適な公知の培養培地はどれも使用することができる。限定されない例には、本質的には「一般的な材料および実験方法」で記載されるような、レチノイン酸（１０^－３Ｍ）またはノギン（１０ｎｇｒ／ｍｌ）を含有する培地が含まれる。

【0406】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、本発明の一部の実施形態の方法によって作製される懸濁培養物におけるニューロン始原体細胞の単離された集団が提供される。

【0407】

下記の実施例の節の実施例１２において記載されるように、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁状態で培養される多能性幹細胞はさらに、内胚葉系譜の細胞に懸濁培養（３－Ｄ）または２次元培養システムにおいて分化することができる。

【0408】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、内胚葉細胞を懸濁培養で作製する方法であって、本発明の一部の実施形態の多能性幹細胞（例えば、細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で培養された多能性幹細胞）を多能性幹細胞の内胚葉細胞への分化に好適な条件下での懸濁培養で培養し、それにより内胚葉細胞を懸濁培養で作製することを含む方法が提供される。

【0409】

多能性幹細胞を内胚葉細胞に分化させるために好適な公知の培養培地はどれも使用することができる。限定されない例には、本質的には「一般的な材料および実験方法」で記載されるように、２４時間～４８時間、アクチビンＡを（例えば、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で）含有する培地が含まれる。

【0410】

本発明の一部の実施形態の一態様によれば、本発明の一部の実施形態の方法によって作製される懸濁培養物における内胚葉細胞の単離された集団が提供される。

【0411】

本発明の教示に従って得られる系譜特異的な細胞または細胞株は、ヒト胚において天然で生じる分化プロセスと類似する分化プロセスによって発達するので、それらはさらに、ヒト細胞由来の治療および組織再生のために使用され得ることが理解されるであろう。

【0412】

したがって、本発明では、本発明の一部の実施形態の拡大および／または分化させられた系譜特異的な細胞または細胞株を、細胞置換治療（細胞由来の治療）を必要とする障害を処置するために使用することが想定される。

【0413】

例えば、乏突起膠細胞前駆体を、ミエリン障害を処置するために使用することができ（ミエリン疾患の治療：動物モデルにおける戦略および進歩、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ、１９９７、５５４頁～５６１頁）、軟骨細胞または間葉系細胞を骨欠損および軟骨欠損の処置において使用することができ（米国特許第４６４２１２０号）、また上皮系譜の細胞を創傷または火傷の皮膚再生において使用することができる（米国特許第５７１６４１１号）。

【0414】

ある種の障害、例えば、特定の遺伝子産物が失われている遺伝性障害［例えば、嚢胞性線維症患者におけるＣＦＴＲ遺伝子産物の欠如（Ｄａｖｉｅｓ ＪＣ、２００２、嚢胞性線維症肺疾患のための新しい治療法、Ｊ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｍｅｄ．、９５ Ｓｕｐｐｌ．、４１：５８～６７）］などについては、ＥＳＣ由来細胞またはｉＰＳ細胞由来細胞が好ましくは、個体へのそれらの投与に先立って、変異遺伝子を過剰発現させるために操作される。他の障害については、ＥＳＣ由来細胞またはｉＰＳ由来細胞は、ある種の遺伝子を除外するために操作されなければならないことが理解されるであろう。

【0415】

遺伝子の過剰発現または除外を、ノックイン構築物および／またはノックアウト構築物を使用して行うことができる［例えば、Ｆｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ．およびＩｋｅｄａ，Ｊ．Ｅ．：Ｃｒｅ－ｌｏｘ部位特異的組換えによる哺乳動物プロモーターの捕獲、ＤＮＡ Ｒｅｓ、３（１９９６）、７３～５０；Ｂｅｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．、Ｊｅｒｋｉｎｓ，Ｎ．Ａ．およびＣｏｐｅｌａｎｄ，Ｎ．Ｇ．：ヒト疾患のマウスモデル Ｐａｒｔ Ｉ：マウスにおける遺伝子分析のための技術および資源、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１１（１９９７）、１～１１；Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｊ．Ｊ．、Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．Ｓ．、Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，Ｓ．、Ａｒｒｏｙｏ，Ｅ．、Ｋａｌｌａ，Ｋ．Ａ．、Ｐｏｗｅｌｌ，Ｆ．Ｌ．およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ｇ．：Ｔｓｔ－１／Ｏｃｔ－６／ＳＣＩＰが末梢ミエリン形成における特有の段階を調節し、正常な呼吸のために必要である、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、１０（１９９６）、１７５１～６２を参照のこと］。

【0416】

本発明の一部の実施形態の系譜特異的な細胞は、多量のタンパク質（例えば、ホルモン、サイトカイン、増殖因子および薬物など）を産生させるために利用することができる（大量生産）。例えば、タンパク質を産生させるために、細胞は、例えば、トランスフェクションによって、タンパク質を過剰発現するように誘導されなければならず、また拡大後にタンパク質が培養培地から単離され得る。

【0417】

本発明の一部の実施形態の系譜特異的な細胞は、ｃＤＮＡライブラリーを調製するために利用することができる。ｍＲＮＡが系譜特異的細胞から標準的な技術によって調製され、ｃＤＮＡを形成するためにさらに逆転写される。ｃＤＮＡ調製物は、サブトラクション処理されたｃＤＮＡライブラリーをこの技術分野で公知の技術によって作製するために、望まれない特異性の胚性線維芽細胞および他の細胞からのヌクレオチドを用いたサブトラクションに供することができる。

【0418】

本発明の一部の実施形態の系譜特異的な細胞は、系譜前駆体の最終分化細胞への分化に影響を与える因子（例えば、小分子薬物、ペプチドおよびポリヌクレオチドなど）または条件（例えば、培養条件または培養操作など）についてスクリーニングするために使用することができる（例えば、薬物スクリーニング）。例えば、成長影響物質、毒素または潜在的な分化因子を、培養培地へのそれらの添加によって調べることができる。

【0419】

本発明の一部の実施形態の系譜特異的な細胞は、ワクチンを調製するために使用することができる。例えば、多能性幹細胞または多能性幹細胞から分化した細胞をウイルス粒子とともに接種し、さらに細胞溶解が生じ、かつ新しく産生されたウイルス粒子が培地に放出されるまで、好適な培地において培養することができる。これらの細胞は、ポックスウイルス科に属する弱毒化ウイルスの産生のために使用することができる：具体的には、カナリアポックスウイルス、鶏痘ウイルスおよびワクシニアウイルス（例えば、天然型または組換え型のワクシニアウイルス［例えば、改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ－１５０８で入手可能なＭＶＡなど）または他のオルトポックスウイルス］。さらなる記載については、米国特許出願公開第２００４００５８４４１号を参照のこと（これは全面的に参照によって本明細書中に組み込まれる）。

【0420】

本発明の一部の実施形態の細胞培養物、またはそれから作製される系譜特異的な細胞は、目的とするポリヌクレオチドの感染またはトランスフェクションのどちらかを使用して遺伝子操作を受けることができる。ポリヌクレオチドは、プロモーターの調節下にある核酸構築物に含めることができる。

【0421】

ポリヌクレオチドを細胞に導入する方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）］、Ａｕｓｕｂｅｌ他［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）］、Ｃｈａｎｇ他［Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ（１９９５）］、Ｖｅｇａ他［Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ（１９９５）］、Ｖｅｃｔｏｒｓ［Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ（１９８８）］、およびＧｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４（６）：５０４～５１２（１９８６）］に記載され、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス由来のベクターＡｄ－ＴＫ、Ｓａｎｄｍａｉｒら、２０００、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：２１９７～２２０５）、レトロウイルス成分とアデノウイルス成分を組み合わせたキメラアデノウイルス／レトロウイルスベクター（Ｐａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １８４：１７９～１８８、２００２）を使用した）安定的または一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、中枢神経系を伴うベクターについては米国特許第４８６６０４２号を参照のこと。また、相同組換えを誘導するための陽性・陰性の選択方法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。

【0422】

一部の実施形態では、そこに記載される数字には約が付けられている。

【0423】

用語「ｎｇ」はナノグラムを示す。用語「ｐｇ」はピコグラムを示す。用語「ｍｌ」はミリリットルを示す。用語「ｍＭ」はミリモルを示す。用語「μＭ」はマイクロモルを示す。

【0424】

本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。

【0425】

用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。

【0426】

用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」ことを意味する。

【0427】

表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。

【0428】

本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。

【0429】

本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１～６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。

【0430】

数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。

【0431】

本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。

【0432】

本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。

【0433】

明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。

【0434】

本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。

【実施例】

【0435】

次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。

【0436】

本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ～ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ」１～４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ～ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ～ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１～３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。

【0437】

一般的な材料および実験方法
誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞株－ｉＰＳ細胞株のＪ１．２－３（包皮線維芽細胞由来；Ｐａｒｋ他、Ｎａｔｕｒｅ、４５１：Ｐ１４１－１４７、２００８）、Ｃ２およびＣ３（包皮線維芽細胞由来；Ｇｅｒｍａｎｇｕｚ他、ＪＣＭＭ、２００９）、ｉＦ４（成人皮膚線維芽細胞由来）［Ｐａｒｋ他、２００８；Ｇｅｒｍａｎｇｕｚ他、２００９］、ＫＴＮ７およびＫＴＮ３（ケラチノサイト由来、Ｎｏｖａｃ－Ｐｅｔｒａｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ、印刷中）、ならびにＫＴＲ１３およびＫＴＲ１３．４（ケラチノサイト由来、Ｎｏｖａｃ－Ｐｅｔｒａｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ、印刷中）を前述［Ｐａｒｋ他、２００８］のように不活化ＭＥＦとともに培養した。

【0438】

ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株－ヒトＥＳＣ株のＨ９．２、Ｉ３、Ｉ３．２およびＩ６．２（Ａｍｉｔ他、Ｊ．Ａｎａｔｏｍｙ（２００２）に記載される）、ならびにヒトＥＳＣ株のＨ１４、Ｈ７、Ｈ９（Ｗｉｎｓｃｏｎｓｉｎ細胞株）を前述［Ａｍｉｔ他、２０００］のように培養した。

【0439】

ヒト伸長胚盤胞細胞（ｈＥＢＣ）株－ヒト伸長胚盤胞細胞株（国際公開ＷＯ２００６／０４０７６３に記載される）のＪ３およびＪ６を、Ａｍｉｔ他、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ（２０００）に記載されるように培養した。

【0440】

培養培地－下記の培養培地組合せを、ｉＰＳ株、ｈＥＳＣ株およびｈＥＢＣ株の付着（２Ｄ）培養、または懸濁培養（三次元、３Ｄ）における成長を支援するそれらの能力について調べた：

【0441】

ｙＦ１０－８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）からなる基本培養培地で、１５％のノックアウト血清代替物（ＳＲ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック液および１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する基本培養培地（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）。この基本培養培地を対照として使用し、また不活化ＭＥＦまたは包皮線維芽細胞を２Ｄ培養におけるフィーダー層として用いるｉＰＳ細胞およびｈＥＳＣの日常的培養のために使用した。

【0442】

ｙＦＩＬ２５－２５ｎｇ／ｍｌのインターロイキン６（ＩＬ６）およびＩＬ６可溶性受容体（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）が添加される基本培地（ｙＦ１０）。いずれのｇｐ１３０アゴニストも、例えばオンコスタチン、ＩＬ１１などがＩＬ６の代わりに使用され得ることは言及されるべきである。

【0443】

ＮＣＭ１００Ｆ－ノックアウト血清代替物の代わりに、血清代替物が動物由来物非含有血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＳＲ（異種非含有）、カタログ番号１２６１８）である基本培地（ｙＦ１０）。加えて、ＮＣＭ１００Ｆ培地には、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６［ＩＬ６－ＩＬ６受容体キメラ体（配列番号１９；Ｃｈｅｂａｔｈ Ｊ．他（１９９７）および国際公開ＷＯ９９／０２５５２（Ｒｅｖｅｌ Ｍ．他）に記載される）が含まれた。８５ＫｄａのＩＬ６ＲＩＬ６が製造および精製され（Ｓｅｒｏｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＳＡ、Ｇｅｎｅｖａ、スイス）、Ｍｅｒｃｋ－Ｓｅｒｏｎｏグループ（Ｎｅｓ－Ｚｉｏｎａ（イスラエル）およびＧｅｎｅｖａ（スイス））より寄贈された。

【0444】

ＮＣＭ１００Ｆｐ－ノックアウト血清代替物の代わりに、血清代替物が動物由来物非含有血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＳＲ（異種非含有）、カタログ番号１２６１８）である基本培地（ｙＦ１０）。加えて、ＮＣＭ１００Ｆｐ培地には、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６が含まれた。

【0445】

ＩＬＣＮＴＦ－１ｎｇ／ｍｌのインターロイキン１１（ＩＬ１１；Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１８－ＩＬ）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ；Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２５７－ＮＴ）が補充される基本培地（ｙＦ１０）。

【0446】

ＮＩＬＣＮＴＦ－ノックアウト血清代替物の代わりに、血清代替物が動物由来物非含有血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＳＲ（異種非含有）、カタログ番号１２６１８）であり、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ１１およびＣＮＴＦ（Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が補充される基本培地（ｙＦ１０）。

【0447】

ｃｍＶ５ｂ－Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）における１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＩＬ６受容体キメラ体。

【0448】

ｃｍＶ５ｂｐ－Ｎｕｔｒｉｓｔｅｍ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）における１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＩＬ６受容体キメラ体。

【0449】

ｃｍＴｅＳＲ－ｍＴｅＳＲ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＩＬ６受容体キメラ体。

【0450】

ｃｍＴｅＳＲｐ－ｍＴｅＳＲ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＩＬ６受容体キメラ体。

【0451】

ｃｍＴｅＳＲ２－ＴｅＳＲ２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＩＬ６受容体キメラ体。

【0452】

ｃｍＴｅＳＲ２ｐ ＴｅＳＲ２（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＩＬ６受容体キメラ体。

【0453】

ｃｍＨＡ１３ ８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）で、１％のＳＲ３血清代替物（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、１％の脂質混合物および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、ならびに１００ｎｇ／ｍｌでのＩＬ６ＩＬ６受容体キメラ体を含有する。８５ＫｄａのＩＬ６ＲＩＬ６が記載の通りに製造および精製され、Ｍｅｒｃｋ－Ｓｅｒｏｎｏグループより寄贈された。（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）。

【0454】

ｃｍＨＡ１３ｐ ８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）で、１％のＳＲ３血清代替物（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）、１％の脂質混合物および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、ならびに１００ｐｇ／ｍｌでのＩＬ６ＩＬ６受容体キメラ体を含有する。８５ＫｄａのＩＬ６ＲＩＬ６が記載の通りに製造および精製され、Ｍｅｒｃｋ－Ｓｅｒｏｎｏグループより寄贈された。（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）。

【0455】

ＣＭｒｂ１００Ｆ－下記を含む基本培地（ｙＦ１０）：ｂＦＧＦ濃度が１００ｎｇ／ｍｌに増大された；１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６（ＩＬ６－ＩＬ６受容体キメラ体；Ｃｈｅｂａｔｈ Ｊ．他（１９９７）および国際公開ＷＯ９９／０２５５２（Ｒｅｖｅｌ Ｍ．他）に記載される）。８５ＫｄａのＩＬ６ＲＩＬ６が製造および精製され（Ｓｅｒｏｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＳＡ、Ｇｅｎｅｖａ、スイス）、Ｍｅｒｃｋ－Ｓｅｒｏｎｏグループ（Ｎｅｓ－Ｚｉｏｎａ（イスラエル）およびＧｅｎｅｖａ（スイス））より寄贈された。

【0456】

ＣＭｒｂ１００Ｆｐ－下記を含む基本培地（ｙＦ１０）：ｂＦＧＦ濃度が１００ｎｇ／ｍｌに増大された；１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６（ＩＬ６－ＩＬ６受容体キメラ体；Ｃｈｅｂａｔｈ Ｊ．他（１９９７）および国際公開ＷＯ９９／０２５５２（Ｒｅｖｅｌ Ｍ．他）に記載される）。８５ＫｄａのＩＬ６ＲＩＬ６が製造および精製され（Ｓｅｒｏｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＳＡ、Ｇｅｎｅｖａ、スイス）、Ｍｅｒｃｋ－Ｓｅｒｏｎｏグループ（Ｎｅｓ－Ｚｉｏｎａ（イスラエル）およびＧｅｎｅｖａ（スイス））より寄贈された。

【0457】

ＮＣＭｒｂ１００Ｆ－ノックアウト血清代替物の代わりに、血清代替物が動物由来物非含有血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＳＲ（異種非含有）、カタログ番号１２６１８）であり、かつｂＦＧＦ濃度が１００ｎｇ／ｍｌに増大された基本培地（ｙＦ１０）。加えて、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６（ＩＬ６－ＩＬ６受容体キメラ体；Ｃｈｅｂａｔｈ Ｊ．他（１９９７）および国際公開ＷＯ９９／０２５５２（Ｒｅｖｅｌ Ｍ．他）に記載される）。８５ＫｄａのＩＬ６ＲＩＬ６が製造および精製され（Ｓｅｒｏｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＳＡ、Ｇｅｎｅｖａ、スイス）、Ｍｅｒｃｋ－Ｓｅｒｏｎｏグループ（Ｎｅｓ－Ｚｉｏｎａ（イスラエル）およびＧｅｎｅｖａ（スイス））より寄贈された。

【0458】

ＮＣＭｒｂ１００Ｆｐ－ノックアウト血清代替物の代わりに、血清代替物が動物由来物非含有血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＳＲ（異種非含有）、カタログ番号１２６１８）であり、かつｂＦＧＦ濃度が１００ｎｇ／ｍｌに増大された基本培地（ｙＦ１０）。加えて、ＮＣＭｒｂ１００Ｆｐ培地には、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６（ＩＬ６－ＩＬ６受容体キメラ体；Ｃｈｅｂａｔｈ Ｊ．他（１９９７）および国際公開ＷＯ９９／０２５５２（Ｒｅｖｅｌ Ｍ．他）に記載される）が含まれた。８５ＫｄａのＩＬ６ＲＩＬ６が製造および精製され（Ｓｅｒｏｎｏ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＳＡ、Ｇｅｎｅｖａ、スイス）、Ｍｅｒｃｋ－Ｓｅｒｏｎｏグループ（Ｎｅｓ－Ｚｉｏｎａ（イスラエル）およびＧｅｎｅｖａ（スイス））より寄贈された。

【0459】

２次元培養システムにおける培養－フィーダー層非含有の培養システムのために、細胞外マトリックスであるＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはヒトフィブロネクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を使用した。

【0460】

懸濁培養の開始－懸濁培養を開始するために、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞を、１．５ｍｇ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ、米国）を使用して、またはスクレーパーを使用してそれらの培養ディッシュから取り出し、２００μｌ～１０００μｌのＧｉｌｓｏｎピペットチップを使用して小さい凝集塊にさらに壊し、１×１０^６細胞／ディッシュ～５×１０^６細胞／ディッシュの細胞密度で５８ｍｍのペトリディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）において懸濁状態で培養した。ペトリディッシュを５％ＣＯ_２において３７℃でインキュベーターの中に静置した。懸濁培養における培地を毎日交換し、細胞を、２７ｇのニードルを使用する凝集塊の手作業による細断（１回目～３回目の継代においてのみ）によって、または２００μｌ～１０００μｌのＧｉｌｓｏｎピペットチップを使用する穏和なピペッティングによってのどちらかで５～７日毎に継代した。あるいは、細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．２５％、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を、トリプシンとのインキュベーションに先立って、１０ＭのＲＯＣＫ阻害剤（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、米国）による１時間の処理との組み合わせで使用して継代した。

【0461】

スピナーフラスコにおける培養－ペトリディッシュで少なくとも１回の継代にわたって培養された細胞凝集塊を試験培地において２５０ｍｌのスピナーフラスコに移し、磁石プレートを使用して４０～１１０回／分（ｒｐｍ）で絶え間なく振とうし、インキュベーターの中に置いた。培地を１～３日毎に交換した。５～７日毎に、凝集塊を１：２～１：４の比率で分けた。

【0462】

制御されたバイオリアクターにおける培養－細胞を制御型バイオリアクターのＢｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ｃｕｌｔｉｂａｇ ＲＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、米国）（１リットルに関しては２リットルバッグ）において培養した。リアクターのパラメーターには、傾動速度：１６回／分（ｒｐｍ）、角度：７°、温度：３７℃、ｐＨ：７～７．４、Ｏ_２濃度：５０％が含まれた。

【0463】

免疫組織化学－蛍光免疫染色のために、懸濁状態で成長させたか、またはＭＥＦ上で再培養された未分化ｈＥＳＣを４％パラホルムアルデヒドにより固定処理し、一次抗体に４℃で一晩さらした。Ｃｙｓ３コンジュゲート化抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国）を二次抗体として使用した（１：２００の希釈）。一次抗体（１：５０の希釈）には、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３およびＳＳＥＡ４（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、Ｉｏｗａ、米国）、ＴＲＡ１－６０およびＴＲＡ１－８１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国）、Ｏｃｔ４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、米国）、乏突起膠細胞マーカー（Ｏ４；Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られる）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）から得られる）、β－チューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、米国）、ネスチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｎｌ，Ｉｎｃ．、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国）、ＰＤＸ１（一次抗体はヤギ抗ヒトＰＤＸ１である；２つの二次抗体が使用された：ＦＬＵＯＲにコンジュゲートされたウサギ抗ヤギＩｇＧ（緑色）、またはロバ抗ヤギＮＬ５５７（赤色）、すべてがＲ＆Ｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られる）が含まれる。

【0464】

フローサイトメトリー分析－懸濁状態で培養されたｈＰＳＣの球体を、ｔｒｙｐＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）を使用して単一細胞に解離した。単一細胞を、２００μｌのピペットチップを用いて上下にピペッティングした。細胞を、フィコエリトリンにコンジュゲートされた抗ｈ／ｍＳＳＥＡ４ Ａｂ、抗ｈ／ｍＳＳＥＡ１ Ａｂ、ｈ／ｍＴＲＡ１－１６０ Ａｂ、ｈ／ｍＴＲＡ１－８１ Ａｂにより染色し、フィコエリトリンコンジュゲート化ラットＩｇＧ２Ｂをイソタイプ対照として使用した（別途述べられる場合を除き、すべての抗体をＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）から購入した）。その後、染色された細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを製造者の説明書に従って使用してＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、米国）により分析した。抗ＣＤ７３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１４６（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１０５（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４４（ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ４５およびＣＤ３１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の各抗体。

【0465】

核型分析－核型分析（Ｇバンド法）を、前述［Ａｍｉｔ他、２００３］のように、それぞれのサンプル（試験あたり２つのサンプル）から少なくとも１０個の細胞に対して行った。核型が分析され、“Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”（ＩＳＣＮ）に従って報告された。

【0466】

胚様体（ＥＢ）の形成－ＥＢの形成のために、ｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞を記載されるように継代し、５８ｍｍのペトリディッシュ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）に移した。ＥＢを、８０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）からなり、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｕｔａｈ、米国）、１０％の血清代替物（ＳＲ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノールおよび１％の非必須アミノ酸ストック液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）が補充される培地において成長させた。１０日齢～１４日齢のＥＢをＲＮＡ単離および組織学的試験のために集めた。組織学的分析のために、ＥＢを１０％中性緩衝化ホルマリンで固定処理し、段階的アルコール（７０％～１００％）において脱水し、パラフィンに包埋した。１μｍ～５μｍの切片を脱パラフィンし、ヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）により染色した。

【0467】

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）－総ＲＮＡを、試験された培地において懸濁状態（三次元、３Ｄ）または２次元（２Ｄ）で少なくとも５回の継代にわたって成長させたｈＥＳＣおよびｉＰＳ細胞から、また（懸濁状態で成長させた細胞、または２Ｄで培養された細胞から形成される）１０日齢～２１日齢のＥＢから、Ｔｒｉ－Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を製造者の説明書に従って使用して単離した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ＭＭＬＶ逆転写酵素ＲＮａｓｅ Ｈ ｍｉｎｕｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を使用して１μｇの総ＲＮＡから合成した。ＰＣＲ反応では、下記の工程が含まれた：９４℃での５分間の変性、その後下記工程の繰り返しサイクル（サイクル数が下記の表１に示される）：９４℃での３０秒間の変性、特定のアニーリング温度（下記の表１に示される通り）で、かつ特定のＭｇＣｌ_２濃度（下記の表１に示される通り）の存在下での３０秒間のアニーリング、および７２℃での３０秒間の伸長。使用されたＰＣＲプライマーおよび反応条件が表１に記載される。ＰＣＲ生成物を、２％アガロースゲル電気泳動を使用してサイズ分画した。ＤＮＡマーカーを使用して、生じたフラグメントのサイズを確認した。

【0468】

リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ－ＲＮＡを、２－Ｄ、細胞凝集塊としての懸濁培養、または単一細胞としての懸濁培養で培養された細胞から、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｔａｌｒｏｎ）を使用して抽出した。その後、ＲＮＡを、ＲＴミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と、本明細書中下記の表２に提供されるプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とを製造者の説明書に従って使用してリアルタイムＲＴ－ＰＣＲに供した。

【0469】

奇形腫形成－４枚～６枚の５８ｍｍディッシュ（６ウエルプレートにおいて３つ～６つのウエル）から得られる細胞、または２０ｍｌの懸濁培養物から得られる細胞を集め、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）ベージュマウスの４週齢オスの後肢筋肉に注射した。注射後１０週において、生じた奇形腫を集め、ＥＢについて述べた同じ方法を使用して組織学的分析のために調製した。

【0470】

多能性幹細胞（ＰＳＣ）のクローニング効率の試験－ＰＳＣを、２－Ｄ、細胞凝集塊としての懸濁培養、または単一細胞としての懸濁培養で培養し、下記のようにそれらのクローニング能について試験した。ここで、それぞれの処置群について、９６個の細胞の６回の繰り返しを行った。

【0471】

ＭＥＦとの２Ｄ培養からのクローニング－Ｈ７細胞を０．０５％のトリプシン／０．５３ｍＭのＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりトリプシン処理して単一細胞にした。それぞれの個々の細胞を、有糸分裂不活化ＭＥＦで覆われた９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）における別々のウエルに置床した。それぞれの生物学的反復物における９６個の細胞を、１０μＭ／ｍｌのＲｏｃｋ阻害剤を加えながらクローニングした。置床後１０日に生じたコロニーの数を計算した。３つのコロニーを、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ型および１０ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（両方がＧｉｂｃｏＢＲＬから得られる）を使用する継代によって選んだ。クローニングされた培養物をｐＣＭ１００Ｆ培地［８５％のＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を含有し、１５％のノックアウト血清代替物（ＳＲ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのｂ－メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック液および４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有し（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）、１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体が補充される］において成長させ、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ型により５～７日毎に日常的に継代した。培養での拡大後、生じた３つのクローンをＥＳＣ特徴について調べた。

【0472】

単一細胞としての３Ｄ培養物からのクローニング－懸濁状態で単一細胞として培養されたＨ７細胞を使用した。それぞれの個々の細胞を９６ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）における別々の低付着ウエルに、またはＭＥＦで覆われたプレートに置床した。それぞれの生物学的反復物における９６個の細胞を、下記の実施例の節の実施例９における表４に記載されるように、１０μＭ／ｍｌのＲｏｃｋ阻害剤の添加を伴って、または伴うことなくクローニングした。置床後１０日で、生じたコロニーの数を計算した。３つのコロニーを２００μＬのチップによって選んだ。クローニングされた培養物を、血清代替物、ＩＬ６ＩＬ６受容体キメラ体および４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含有するｐＣＭ１００Ｆ培地において成長させ、ピペットによって５～７日毎に日常的に継代した。培養での拡大後、生じた３つのクローンをＥＳＣ特徴について調べた。

【0473】

凍結・解凍効率－細胞を、下記の凍結用溶液の１つを使用して凍結した：
１．血清および動物凍結用溶液（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）。
２．１０％のＤＭＳＯおよび２０％のＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ。
３．１０％のＤＭＳＯおよび３０％のＳＲが補充されたＤＭＥＭ。

【0474】

（冷凍ボックスを使用して）－８０℃の冷凍庫における１日～７日後、バイアルを液体窒素に移した。細胞を解凍し、生存性をトリパンブルー染色によって調べた。３回の別個の実験を行った。

【0475】

遺伝子操作－細胞を、下記のベクターを使用してトランスフェクションした：ＣＭＶプロモーター－ＧＦＰ（Ｎ１プラスミドに基づく）。下記の方法を使用した：
１．下記のパラメーターによる、ＢＴＸ ＥＣＭ２００１電気穿孔器を使用する電気穿孔法：４０μｇｒのＤＮＡ、１０^７個の細胞、３ｍＳｃ～６ｍＳｃ、２２０Ｖ。
２．製造者の説明書に従うトランスフェクション試薬のＦｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）（１０^６個の細胞について４０μｇｒのＤＮＡ）。

【0476】

神経分化－神経分化を誘導するために、懸濁状態で培養された単一細胞を、ｂＦＧＦおよびＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を含まない培地に移した。レチノイン酸（１０^－３Ｍ）またはノギン（１０ｎｇｒ／ｍｌ）のどちらかを３日間～７日間加えた。分化誘導後３週間で、細胞をフィブロネクチンとともに染色のために置床した。細胞を、Ｏ４（乏突起膠細胞マーカー）、ＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質）、ネスチンおよびβ－チューブリンについて染色した。

【0477】

脂肪生成細胞系譜、骨形成細胞系譜および軟骨形成細胞系譜への懸濁ＭＳＣの分化のために使用される培地：
脂肪生成培地－１０％のＦＢＳ、１ｍＭのＬ－グルタミン、０．５ｍＭのＩＢＭＸ、１０μｇ／ｍｌのインスリン、１０^－６Ｍのデキサメタゾン、０．１ｍＭのインドメタシンが補充されるＤＭＥＭ Ｆ１２。

【0478】

骨形成培地－１０％のＦＢＳ、１％のピルビン酸ナトリウム、１％の非必須アミノ酸、５０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１０ｍＭのβ－グリセロールリン酸および０．１μＭのデキサメタゾンが補充されるＧＭＥＭ ＢＨＫ－２１。

【0479】

軟骨形成培地－１０^－７Ｍのデキサメタゾン、１％のＩＴＳ、５０μｇ／ｍｌのＬ－アスコルビン酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、４ｍＭのＬ－プロリンおよび１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ３が補充されるＤＭＥＭ。

【0480】

脂肪生成細胞系譜、骨形成細胞系譜および軟骨形成細胞系譜への懸濁ＭＳＣの分化プロトコル：
脂肪生成分化の分化手順およびオイルレッドＯ染色－ＭＳＣを６ウエルプレートにおいて２００００細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、培地交換を１週間に２回行いながら４週間、脂肪生成培地において成長させた。

【0481】

脂肪生成分化を、脂質を多量に含む液胞の細胞内の蓄積をオイルレッドＯ染色後に観察することによって評価した。

【0482】

オイルレッドＯ染色－細胞をＰＢＳにより１回ゆすぎ、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により２０分間固定処理し、再びゆすぎ、オイルレッドＯ溶液により室温で１０分間染色した。染色溶液を除き、細胞を水により５回洗浄した。

【0483】

骨形成分化の分化手順およびアリザリンレッド染色－ＭＳＣを６ウエルプレートにおいて２０００細胞／ｃｍ^２～３０００細胞／ｃｍ^２の密度で播種し、培地交換を１週間に２回行いながら４週間、骨形成培地において成長させた。細胞培養物をアリザリンレッド染色によって無機質含有量についてアッセイした。

【0484】

アリザリンレッド染色－細胞をＰＢＳにより１回ゆすぎ、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により２０分間固定処理し、再びゆすぎ、２％アリザリンレッド溶液により室温で１５分間染色した。染色溶液を除き、細胞を水により数回洗浄した。

【0485】

軟骨形成分化の分化手順、ヘマトキシリン・エオシン染色およびアルシアンブルー染色－軟骨形成分化のために、２×１０^５個のＭＳＣを１５ｍｌのポリプロピレン製ファルコンチューブにおいて３００ｇで５分間遠心分離して、細胞ペレットを形成した。細胞を、細胞塊を乱すことなく培地交換を１週間に２回行いながら９週間、軟骨形成培地において成長させた。細胞切片を、細胞ペレットを４％のＰＦＡにより固定処理し、低融点アガロース（１．５％）に包埋した後で作製した。

【0486】

ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色およびアルシアンブルー染色－これらは、Ｒａｍｂａｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒの病理学研究室において行われた。

【0487】

懸濁状態でのＭＳＣの分化プロトコル－（本明細書中上記で記載される）同一の脂肪生成培地、骨形成培地および軟骨形成培地を使用して、ＭＳＣを２－Ｄ培養システムに播種することなく、ＭＳＣを懸濁状態で分化させた。

【0488】

実施例１
本発明の一部の実施形態の新規な培養培地における多能性幹細胞の懸濁培養
多能性細胞の懸濁状態での培養は、多量の細胞を細胞移植および組織移植のために得ようとするときには特に、従来の培養を上回る著しい利点を有している。懸濁培養を、ＭＥＦとともに成長させた多能性細胞またはフィーダー層非含有条件下で成長させた多能性細胞［Ａｍｉｔ他、２００４］から開始するために、数多くの増殖因子およびサイトカインが用いられた。種々の供給源から得られる多能性細胞が使用された：新生児（包皮線維芽細胞）から得られるｉＰＳ細胞、成人（線維芽細胞）から得られるｉＰＳ細胞、および、ｈＥＳＣ。

【0489】

実験結果
懸濁培養－下記の培養培地：ｙＦＩＬ２５、ＮＣＭ１００Ｆ、ＮＣＭ１００Ｆｐ、ＩＬＣＮＴＦ、ＮＩＬＣＮＴＦ、ｃｍＶ５ｂ、ｃｍＶ５ｂｐ、ｃｍＴｅＳＲ、ｃｍＴｅＳＲｐ、ｃｍＴｅＳＲ２、ｃｍＴｅＳＲ２ｐ、ｃｍＨＡ１３、ＣＭｒｂ１００Ｆ、ＣＭｒｂ１００Ｆｐ、ＮＣＭｒｂ１００ＦまたはＮＣＭｒｂ１００Ｆｐの存在下で懸濁培養に置かれた２４時間後において、多能性細胞は、組織学的試験で大きい核を有する小さい細胞の均一な集団を明らかにした球状の凝集塊または円盤様の構造物をもたらした。球状体は成長し、それらの形態学を維持しながら５～７日毎に機械的に分けられることによって懸濁培養物の拡大を可能にした。これらのタイプの培地のすべてが、ＥＳＣおよびｉＰＳ細胞を、単一細胞としての、または１００個未満の細胞の小さい凝集塊としての懸濁状態で培養するために好都合であることが見出された。

【0490】

あるいは、トリプシン－ＥＤＴＡおよびＲＯＣＫ阻害剤の処理を使用することによって、懸濁された細胞は単一細胞に解離することができ、また依然として、同じ形態学および特徴の球状体を形成し、したがって効率的な細胞拡大を可能にした。試験された培養培地による懸濁培養に供された細胞は、類似する挙動および球状の形態学および組織学を示した。ＭＥＦまたはフィブロネクチンを用いた２Ｄ培養に懸濁状態での少なくとも５回の継代後で戻されたとき、球状凝集塊のすべてがＭＥＦまたはフィブロネクチンマトリックスにそれぞれ接着し、２４時間後～４８時間後、典型的な多能性細胞のコロニー形態学を明示し、大きい核対細胞質比を、１個～３個の核小体の顕著な存在を伴って、かつ典型的な細胞間間隔を伴って示した。

【0491】

未分化幹細胞表現型の維持－霊長類の未分化のＥＳＣおよびｉＰＳ細胞に典型的ないくつかの表面マーカーを、本質的にはＴｈｏｍｓｏｎ他（１９９８）、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ他（２００４）、Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他（２００５）に記載されるような免疫蛍光染色を使用して調べた（それらのそれぞれが全面的に参照によって本明細書中に組み込まれる）。少なくとも５回の継代にわたって試験培地により懸濁状態で培養されたヒト多能性細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－６０およびＴＲＡ－１－８１およびＯｃｔ４について依然として強く陽性であることが見出された。他の霊長類ＥＳＣ［Ｔｈｏｍｓｏｎ他、１９９５および１９９６］の場合のように、またＭＥＦとともに培養された細胞と同様に、ＳＳＥＡ３についての染色は弱く、ＳＳＥＡ１についての染色は陰性であった。幹細胞マーカーについての染色が、懸濁状態で培養された細胞がＭＥＦフィーダー細胞層での２Ｄ培養に戻されたときには依然として高いままであった。ＲＴ－ＰＣＲ分析では、ＭＥＦとともに培養された細胞と同様に、少なくとも５回の継代にわたって懸濁状態で培養された多能性細胞が、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１およびＦＧＦ４を含む多能性の遺伝マーカーを発現することが示された［Ｋｉｎｇ他、２００６］。遺伝子発現における有意な差が、懸濁状態で培養された細胞の間において、または懸濁状態での連続培養後でＭＥＦとともに再培養された細胞に関して何ら検出されなかった。

【0492】

核型の維持－ギムザバンディングによる核型分析を懸濁状態での少なくとも７回の継代後における細胞に対して行った。細胞は、正常な４６，ＸＹ核型または４６，ＸＸ核型を示すことが見出された。したがって、懸濁細胞培養物の核型は安定なままであった。

【0493】

多能性－試験培地による懸濁培養での長期にわたる拡大後、多能性細胞はそれらの多能性分化能を保っていた。細胞の発達能力を最初にＥＢの形成によってインビトロで調べた。５回を超える継代にわたって懸濁状態で培養された多能性細胞を、増殖因子の添加を伴わない血清含有培地に移したとき、嚢胞性ＥＢの形成が７日後～１０日後に認められ（これは、空洞形成したＥＢが培養で１０日後に現れた、ＭＥＦとともに培養された細胞と同様であった［Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ他、２０００］）、また嚢胞性ＥＢが１４日後～２０日後に認められた。これらのＥＢの内部には、多能性細胞分化に典型的な胚の３つの胚葉を代表する細胞タイプが存在した。

【0494】

懸濁多能性細胞の多能性がさらに、奇形腫の形成によってインビボで明示された。約１０回の継代にわたって懸濁状態で培養された細胞がＳＣＩＤベージュマウスに注射され、１０週間後、腫瘍が形成された。これらの奇形腫の内部には、３つの胚葉を代表する組織が認められた。

【0495】

振とう懸濁培養－多能性細胞を、試験された培地を使用して少なくとも１ヶ月間、スピナーフラスコにおいて懸濁状態で培養した。１ヶ月後での試験では、形態学的には、細胞によって形成された球状の凝集塊が、ペトリディッシュを使用して静的に培養された細胞に関して認められる凝集塊と類似したままであることが示された。ＭＥＦ上で再培養されたとき、凝集塊における細胞は再接着し、多能性細胞の典型的なコロニーを再び形成した。スピナーフラスコで１ヶ月間培養された細胞の核型は正常であることが見出された。

【0496】

実施例２
本発明の一部の実施形態の新規な培養培地における多能性幹細胞の二次元培養
血清非含有かつ異種非含有の支援層非含有システムを使用する２Ｄ培養における多能性細胞の培養－いくつかの可能な培地の組み合わせを、多能性細胞のフィーダー層非含有培養または動物由来非含有（異種非含有）培養（例えば、包皮線維芽細胞をフィーダーとして使用する）を支援する能力について試験した。すべての試験された培地（すなわち、ｙＦＩＬ２５、ＮＣＭ１００Ｆ、ＮＣＭ１００Ｆｐ、ＩＬＣＮＴＦ、ＮＩＬＣＮＴＦ、ｃｍＶ５ｂ、ｃｍＶ５ｂｐ、ｃｍＴｅＳＲ、ｃｍＴｅＳＲｐ、ｃｍＴｅＳＲ２、ｃｍＴｅＳＲ２ｐ、ｃｍＨＡ１３、ＣＭｒｂ１００Ｆ、ＣＭｒｂ１００Ｆｐ、ＮＣＭｒｂ１００ＦまたはＮＣＭｒｂ１００Ｆｐ）が、未分化多能性細胞の培養を支援するために好適であることが見出された。多能性細胞を、未分化増殖、核型安定性および多能性を含むそれらの幹性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）特徴を維持しながら、少なくとも５回の継代にわたって連続して培養した。形態学的な差が、試験された培養システムで成長させたコロニーと、基本培地とともにＭＥＦ上で成長させたコロニーとの間において何ら認めることができず、それに対応して、形態学的特徴が一細胞レベルで変化しないままであり、細胞を小さくかつ丸くしており、大きい核対細胞質比を、１個～３個の核小体の顕著な存在および典型的な細胞間間隔を伴って示した。ＭＥＦ上で成長させた細胞と同様に、細胞を１／２または１／３の同じ比率で５～７日毎に日常的に継代した。これは、類似する集団倍加時間を示した。細胞が約１００万細胞／１０ｃｍ^２の同じ播種効率で継代され、これは９０％を超えて同じ生存率を有した。

【0497】

本発明の一部の実施形態の新規な培養培地の存在下において２－Ｄ培養システムで培養される多能性幹細胞は未分化細胞の発現パターンを維持する－霊長類の未分化のＥＳＣおよびｉＰＳ細胞に典型的ないくつかの表面マーカーを、本質的にはＴｈｏｍｓｏｎ他（１９９５、１９９６、１９９８）に記載されるような免疫蛍光染色を使用して調べた（それらのそれぞれが全面的に参照によって本明細書中に組み込まれる）。少なくとも７回の継代（例えば、１０回、１５回の継代）にわたって試験培地により培養された細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１およびＯｃｔ４の表面マーカーに対して強く陽性であることが見出された。他の霊長類ＥＳＣの場合のように、ＳＳＥＡ３に関する染色は弱く、ＳＳＥＡ１については陰性であった。

【0498】

本発明の一部の実施形態の新規な培養培地の存在下において２－Ｄ培養システムで培養される多能性幹細胞は、胚の３つの胚葉に由来する細胞系譜へのインビトロおよびインビボでの分化が可能である－試験された条件での長期にわたる培養後における細胞の発達能力を胚様体（ＥＢ）の形成によってインビトロで調べた。試験された条件で培養された多能性細胞は、ＭＥＦ上で成長させたＥＳＣによって生じるＥＢと類似するＥＢを形成した。これらのＥＢの内部において、幹細胞は胚の３つの胚葉を代表する細胞タイプに分化した（データは示されず）。

【0499】

加えて、これらの多能性幹細胞はインビボでの分化が可能であることが示された。したがって、試験された条件下で培養された細胞は、ＳＣＩＤベージュマウスへのそれらの注射後、胚の３つの胚葉（すなわち、外胚葉、内胚葉および中胚葉）を代表する細胞タイプを含有する奇形腫を形成する（データは示されず）。

【0500】

実施例３
酵素的継代を伴わない懸濁状態での単一細胞としての多能性幹細胞の培養
実験結果
単一細胞の懸濁培養での培養－多能性細胞を単一細胞として、試験された培地のすべて（ｙＦＩＬ２５、ＮＣＭ１００Ｆ、ＮＣＭ１００Ｆｐ、ＩＬＣＮＴＦ、ＮＩＬＣＮＴＦ、ｃｍＶ５ｂ、ｃｍＶ５ｂｐ、ｃｍＴｅＳＲ、ｃｍＴｅＳＲｐ、ｃｍＴｅＳＲ２、ｃｍＴｅＳＲ２ｐ、ｃｍＨＡ１３、ＣＭｒｂ１００Ｆ、ＣＭｒｂ１００Ｆｐ、ＮＣＭｒｂ１００ＦまたはＮＣＭｒｂ１００Ｆｐ）を使用して少なくとも１ヶ月間、スピナーフラスコまたはペトリディッシュにおいて懸濁状態で培養した。１ヶ月後での試験では、細胞が、安定な核型、特異的マーカーに関する発現および分化能を含む多能性細胞の特徴を示すことが示された。細胞が、ＲＯＣＫ阻害剤の使用を伴うことなく、かつトリプシンの使用を伴うことなく継代され、ピペットを使用して機械的に分けられた。ヒトのＥＳＣまたはｉＰＳが、酵素的継代を必要とすることなく、単一細胞としての懸濁培養で培養され得ることが示されたのは初めてである。これは、細胞が単一細胞培養様式を取ったからである。このシステムは継代を用いることなく、工業的プロセスのために使用することができる。

【0501】

単一細胞としての懸濁培養で培養されるヒトＥＳＣは２次元培養システムにおいて再置床することができ、これにより典型的なｈＥＳＣの形態学が明示される－単一細胞としての懸濁状態で１７回の継代にわたって培養されたＣＬ１（１３Ｅ１）を不活化ＭＥＦとともに再置床した。１回目の継代の期間中はコロニーの形態学が明瞭でない。数週間後、細胞は、多能性細胞の形態学の細胞間間隔、透明な辺縁部および大きい核対細胞質比を有するコロニーを形成した（図１１Ａ～図１１Ｂ）。

【0502】

実施例４
ヒトのＥＳＣおよびｉＰＳ細胞は懸濁培養中に輸送することができる
生細胞の輸送－記述の方法を使用して細胞凝集塊としての懸濁状態で培養された細胞は室温または０℃～１５℃での輸送に耐える。２０ｍｌ～４０ｍｌの培養培地（通気または非通気）を含む５０ｍｌチューブを使用すれば、チューブあたり２００万個～１０００万個の細胞を輸送することができる。細胞の少なくとも５０％が生存し、すべての多能性特徴を維持しながら成長し続けた。他のチューブサイズが使用され得る。培地には、抗酸化剤およびＲｏＣＫ剤または他の抗アポトーシス剤が補充され得る。

【0503】

実施例５
本発明の一部の実施形態の新規な培養培地の存在下における動的培養条件下での多能性幹細胞の拡大
本発明者らは、本発明の一部の実施形態の新規な培養培地が多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣおよびＥＳＣなど）の成長および拡大を支援し得るかを、多能性幹細胞が、（細胞凝集塊を含まない）単一細胞として培養されるとき、または細胞凝集塊を伴う懸濁状態で培養されるときの動的培養条件下で調べた。

【0504】

実験方法
細胞株および播種濃度：Ｃ２ ＩＰＳ細胞株を７７回目の継代で使用した。ただし、そのうちの３７回の継代は動的培養条件への播種前の懸濁状態においてであった。ＩＰＳＣを３．７×１０^４細胞／ｍｌの濃度で播種（接種）した。

【0505】

培養培地および条件：下記の培養培地を動的懸濁培養のために使用した：ＣＭ１００Ｆｐ。細胞を５日間連続してスピナーフラスコまたは制御されたバイオリアクターにおいて培養した。バイオリアクターで培養されたとき、培地は培養プロセス期間中に交換されなかった。スピナーフラスコで培養されたときは、培地を毎日交換した。

【0506】

懸濁状態での動的成長のための培養条件：
制御されたバイオリアクターにおける培養－細胞を制御型バイオリアクターＢｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ｃｕｌｔｉｂａｇ ＲＭ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、米国）（１リットルに関しては２リットルバッグ）で培養した。リアクターのパラメーターには、傾動速度：１６回／分（ｒｐｍ）、角度：７°、温度：３７℃、ｐＨ：７～７．４、Ｏ_２濃度：５０％が含まれた。

【0507】

スピナーフラスコにおける培養－少なくとも１回の継代にわたってペトリディッシュで培養された細胞凝集塊を試験培地において２５０ｍｌのスピナーフラスコに移し、磁石プレートを使用して４０～１１０回／分（ｒｐｍ）で絶え間なく振とうし、インキュベーターの中に置いた。培地を１～３日毎に交換した。５～７日毎に、凝集塊を１：２～１：４の比率で分けた。

【0508】

実験結果
本発明の一部の実施形態による培養培地を使用する懸濁培養での多能性幹細胞の拡大－動的培養条件を受けた多能性幹細胞は、細胞凝集塊を伴う懸濁培養で成長させたときは、スピナーフラスコにおける培養の１１日以内に細胞数が約２６倍にまで拡大し、また細胞凝集塊を含まない単一細胞としての懸濁培養で成長させたときは、スピナーフラスコにおける培養の１１日以内に細胞数が約５０倍にまで拡大した。加えて、多能性幹細胞は、単一細胞として成長させたとき、制御されたバイオリアクターにおける培養の５日以内に細胞数が約６４倍にまで拡大した（図５Ａ～図５Ｃ、データは示されず）。これらの結果から、本発明の一部の実施形態の新規な培養培地は、多能性細胞が動的培養条件下での懸濁状態で培養されるとき、多能性細胞の拡大を支援し得ることが明示される。

【0509】

実施例６
懸濁状態で培養された多能性幹細胞は凍結／解凍サイクルから十分に回復する
本発明の一部の実施形態の新規な培養培地の存在下での懸濁状態で培養された多能性幹細胞が再凍結／解凍サイクルから回復し得るかを調べるために、細胞を下記の凍結用溶液を使用することによって液体窒素で凍結した：
（１）１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）１０％ＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、７０％ＤＭＥＭ
（２）５％ＤＭＳＯ、１０％ＦＢＳ、１０％ＳＲ、７５％ＤＭＥＭ
（３）１０％ＤＭＳＯ、９０％ＳＲ
（４）５％ＤＭＳＯ、９５％ＳＲ
（５）市販の血清非含有凍結用溶液（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ ＨａＥｍｅｋ、イスラエル）

【0510】

凍結された細胞は最初、－８０℃の冷凍庫において凍結されており、１２時間～３日後、保存用の液体窒素タンクに移した。

【0511】

実験結果
多能性幹細胞は、上記の凍結用溶液を使用する凍結条件を受け、その後解凍され、懸濁状態において再培養された。図６Ａ～図６Ｃは、３つの異なる凍結用溶液を使用して解凍した後、ｃｍｒｂ１００ｐ培地による懸濁状態で４８回の継代にわたって培養されたＣ２細胞を明示する。

【0512】

実施例７
系譜特異的細胞の多能性幹細胞からの作製
ニューロン細胞への分化－４つの試験された細胞株（Ｉ３、Ｉ４、Ｉ６およびＨ９．２）からの細胞を、少なくとも２５回の継代にわたって細胞凝集塊を伴う懸濁状態で培養した。その後、因子を培養培地から除き、５×１０^－５Ｍのレチノイン酸を２１日間加えた。その後、細胞をフィブロネクチン被覆プレートに移し、細胞を分析のために集める前にさらに５日間培養した。定量的ＲＴ－ＰＣＲ、免疫染色（免疫蛍光およびＦＡＣＳ）を行った。結果はニューロン細胞系譜の遺伝子（例えば、ＰＡＸ６、ＨＮＦ、ネスチン、β－チューブリンおよびＰＳＡ－ＮＣＡＭなど）の発現を示す（図７Ａ～図７Ｃ、図８Ａ～図８Ｂ、図９Ａ～図９Ｇ）。

【0513】

内胚葉細胞への分化－Ｃ２細胞株（包皮線維芽細胞に由来するｉＰＳ細胞株）から得られる、細胞凝集塊を伴う懸濁状態で培養された細胞を少なくとも１０回の継代にわたって懸濁状態で培養した。その後、因子を培養培地から除き、細胞を、ｃＡＭＰ増加剤（例えば、フォルスコリン、８－ブロモｃＡＭＰ、ＧＡＢＡ、ＩＢＭＸおよびＤＢＣなど）を含有する培地において、１０ｎｇ／ｍｌのアクチビンに４８時間さらした。１０日後、細胞を内胚葉のマーカーについて分析した。Ｓｏｘ１７についての定量的ＲＴ－ＰＣＲでは、非処理の対照との比較において、処理された細胞でのＳｏｘ１７発現における有意な増大が明示される（データは示されず）。図１０Ａ～図１０Ｂに示されるように、分化した細胞はＰＤＸ１（転写因子）を発現し、これは内胚葉系譜（主にβ－細胞）への分化を示している。

【0514】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）への分化－細胞凝集塊が懸濁されている懸濁状態で培養された細胞を血清含有培地に１４日間移し、その後ゼラチンまたはＭａｔｒｉｇｅｌのどちらかに置床した。７日後～１４日後、生じたＭＳＣは凍結されたか、またはトリプシンを使用しながら継代されたかのどちらかであった。

【0515】

実施例８
単一細胞としての懸濁培養で培養されるヒト多能性胚性幹細胞の発現パターンの特徴づけ
単一細胞としての懸濁培養で培養される新規なｈＥＳＣを特徴づけるための研究設計
培養された多能性幹細胞（ＰＳＣ）の３つの群を調べた：
１．二次元の標準的条件（２Ｄ）でＭＥＦとともに培養されるｈＥＳＣ。
２．懸濁培養（３Ｄ）で凝集塊（球状、２００個超の細胞）として培養されるｈＥＳＣ。
３．懸濁状態（３Ｄ）で単一細胞（ＳＣ、５０個未満の細胞、それらのほとんどが単一細胞としてである）として培養されるｈＥＳＣ。

【0516】

細胞を、上記条件における少なくとも１５回の継代培養後、フローサイトメトリーを使用して多能性マーカーの発現について調べた。

【0517】

実験結果
単一細胞としての懸濁培養で培養されるヒトＥＳＣは、「ナイーブ」なマウスＥＳＣの発現パターンと類似する特有の発現パターンを示す－図１２Ａ～図１２Ｊに示されるように、単一細胞としての懸濁状態で培養された多能性幹細胞のＦＡＣＳ分析では、２Ｄで培養されるか、または細胞凝集塊としての懸濁培養で培養されるｈＥＳＣと比較した場合、変化した発現パターンが明示される。例えば、２Ｄで培養されるか、または細胞凝集塊としての懸濁培養で培養されるｈＥＳＣの大部分が、多能性のマーカーであるＴＲＡ１－６０（図１２Ａ、図１２Ｃ）、ＴＲＡ１－８１（図１２Ｂ、図１２Ｄ）およびＳＳＥＡ４（図１２Ｈ）を発現する一方で、単一細胞としての懸濁培養で培養される多能性ｈＥＳＣの大部分は、ＴＲＡ１－６０（図１２Ｅ）、ＴＲＡ１－８１（図１２Ｆ）およびＳＳＥＡ４（図１２Ｊ）の各マーカーを発現しない。対照的に、２Ｄで培養されるか、または細胞凝集塊としての懸濁培養で培養されるｈＥＳＣの１１％のみがＳＳＥＡ１（図１２Ｇ）を発現する一方で、単一細胞としての懸濁培養で培養されるｈＥＳＣの大部分がＳＳＥＡ１（図１２Ｉ）を発現する。このように、単一細胞としての懸濁状態で培養されたｈＥＳＣは、２Ｄで培養されたか、または細胞凝集塊としての懸濁培養で培養されたｈＥＳＣと比較した場合、改変された発現パターンを示す。そのような発現パターンは、より「ナイーブ」なマウスＥＳＣ細胞（ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１およびＳＳＥＡ４を発現せず、しかしＳＳＥＡ１を発現する）の発現パターンと似ている。

【0518】

本明細書中下記の表３には、ＦＡＣＳ分析の結果がまとめられる。

【0519】

単一細胞としての懸濁状態で培養された細胞はＯＣＴ－４の増大したレベルを示す－リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析を、本明細書中上記の「一般的な材料および実験方法」における表２に列挙されるプライマーを使用して、２－Ｄ、細胞凝集塊としての懸濁培養、または単一細胞としての懸濁培養で培養されたｈＥＳＣに対して行った。図１３Ａに示されるように、Ｎａｎｏｇの発現レベルが、２－Ｄで成長させたｈＥＳＣと比較した場合、単一細胞懸濁培養ではわずかに低下している。他方で、ＯＣＴ４の発現は、２Ｄで培養されたｈＥＳＣと比較した場合、ＳＣとしての懸濁状態で培養されたｈＥＳＣでは約８倍増大していることが見出された。

【0520】

実施例９
単一細胞としての懸濁培養で培養されるヒト多能性胚性幹細胞のクローニング効率の特徴づけ
実験結果
単一細胞としての懸濁状態で培養されるヒトＥＳＣ、または２－Ｄで培養されたｈＥＳＣをそれらのクローニング効率について調べた。２－Ｄで培養された細胞をトリプシン処理し、（本明細書中上記の「一般的な材料および実験方法」で記載されるように）ＭＥＦで覆われる９６ウエルプレートのウエルに１個ずつ、単一細胞として置床し、また、懸濁状態で単一細胞として成長させた細胞を、（本明細書中上記の「一般的な材料および実験方法」で記載されるように）低接着性の９６ウエルプレートのウエルに１個ずつ置床した。

【0521】

単一細胞としての懸濁状態で培養されるヒトＥＳＣは、２－Ｄで培養されるｈＥＳＣと比較した場合、著しくより大きいクローニング効率を示す－表４に示されるように、著しくより大きいクローニング効率が、２－Ｄで培養されたｈＥＳＣ（４．３３％）と比較して、単一細胞としての懸濁状態で培養されたｈＥＳＣについて認められた（９５．６３％）。加えて、ＲＯＣＫ阻害剤の添加によって、２－Ｄで培養されたｈＥＳＣのクローニング効率を増大した一方で、単一細胞としての懸濁状態で培養されたｈＥＳＣのクローニング効率はＲＯＣＫ阻害剤の存在下では増大しなかった。

【0522】

単一細胞としての懸濁状態で培養されるヒトＥＳＣは、２－Ｄで培養されるｈＥＳＣと比較した場合、凍結・解凍サイクルに対するより大きい生存を示す－多能性幹細胞が凍結・解凍サイクルに耐え得るかを調べるために、（単一細胞としての懸濁状態で培養された）ｈＥＳＣを、下記の凍結用溶液のいずれかを使用する凍結サイクルに供した：
Ｉ． 血清および動物凍結用溶液（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）。
ＩＩ． １０％のＤＭＳＯおよび２０％のＦＢＳが補充されるＤＭＥＭ。
ＩＩＩ． １０％のＤＭＳＯおよび３０％のＳＲ（血清代替物）が補充されるＤＭＥＭ。

【0523】

－８０℃で約１日間～７日間凍結した後、バイアルを液体窒素に移した。細胞を解凍し、生存性をトリパンブルー染色によって調べた。凍結－解凍サイクルに対するｈＥＳＣの生存は、単一細胞としての懸濁状態で培養されたｈＥＳＣについては約８０％であった。これは２－Ｄで培養されるｈＥＳＣの、同一アッセイ条件下での凍結－解凍サイクルに対する生存（最大５０％、データは示されず）よりも著しく大きい。図１５は、凍結－解凍サイクル後、懸濁培養で単一細胞として培養されたヒトＥＳＣの代表的な像である。

【0524】

単一細胞としての懸濁状態で培養されるヒトＥＳＣは、２－Ｄで培養されるｈＥＳＣと比較した場合、遺伝子操作のより大きい生存および効率を示す－細胞を、「一般的な材料および実験方法」で記載されるように、ＣＭＶプロモーター－ＧＦＰ核酸構築物（Ｎ１プラスミドに基づく）を使用してトランスフェクションした。遺伝子操作後、細胞の生存を、位相差顕微鏡観察を使用して評価した。図１６Ａに示されるように、懸濁された単一細胞の９０％超がこの手順に耐えた。対照的に、ＭＥＦとともに培養された２Ｄ細胞からは、（１０^７個の細胞のうち）最大で１７個の細胞が回復しただけであった（データは示されず）。その上、２－Ｄで培養されたｈＥＳＣのどれもが緑色ではなかった（データは示されず）一方で、単一細胞として３－Ｄで培養されたｈＥＳＣの少数が緑色であり、すなわち、導入遺伝子のＣＭＶ－ＧＦＰ構築物を発現した（図１６Ｂ）。

【0525】

実施例１０
単一細胞としての懸濁培養で培養されるヒト多能性胚性幹細胞は神経細胞系譜への分化が可能である
実験結果
単一細胞としての懸濁状態で培養されるヒトＥＳＣはニューロン細胞系譜への分化が可能である－神経分化を誘導するために、単一細胞としての懸濁状態で培養されるｈＥＳＣを、本明細書中上記の「一般的な材料および実験方法」で記載されるように、レチノイン酸（１０^－３Ｍ）またはノギン（１０ｎｇｒ／ｍｌ）のどちらかを含んだニューロン分化用培地（これはｂＦＧＦおよびＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を含まない）に移した。分化を、（１０ｃｍ^２のＨＦＰあたり５０μｇｒの濃度での）ヒト血漿フィブロネクチン（ＨＰＦ）被覆プレートにおける置床による２－Ｄで、または懸濁培養でのどちらかで誘導した。分化誘導後３週間で、細胞を、フィブロネクチン、Ｏ４、ＧＦＡＰ、ネスチンおよびβ－チューブリンに関する染色のために置床した。図１７Ａ～図１７Ｃに示されるように、細胞は、ＧＦＡＰ（グリア線維酸性タンパク質）（星状膠細胞のマーカー）、Ｏ４（乏突起膠細胞のマーカー）、ならびにβ－チューブリンおよびネスチン（ニューロンのマーカー）に関して陽性に染色されたニューロン始原体細胞に分化した。これらの結果は、単一細胞としての懸濁状態で培養されるｈＥＳＣは、胚の胚葉である外胚葉に分化し得ることを決定的に示す。

【0526】

実施例１１
間葉系幹細胞を懸濁状態で分化させるための新規な方法
本発明者らは、下記のように、多能性幹細胞を懸濁状態で間葉系幹細胞に分化させるための新規な方法を開発している。

【0527】

ＭＳＣへの分化を誘導するために、懸濁状態で培養された単一細胞を下記の培地の１つに徐々に移した：
（１）Ｆｙ富化；８０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）からなり、１０％のノックアウト血清代替物（ＳＲ）、１０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅまたはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、０．１ｍＭのβ－メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸ストック液を含有する（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）。
（２）ＭｅＳｕｓ Ｉ：８０％のＤＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）からなり、２０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅまたはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、２ｍＭのＬ－グルタミンを含有する（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）。
（３）ＭｅＳｕｓ ＩＩ：８０％のαＭＥＭ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）からなり、２０％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅまたはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、２ｍＭのＬ－グルタミンを含有する（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）。
（４）ＭｅＳｕｓ ＩＩＩ：ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）、１％のＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２ｍＭのＬ－グルタミンからなる（すべてが、別途示される場合を除き、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、米国）から得られる）。

【0528】

単一細胞としての懸濁培養で培養されたヒトＥＳＣを、下記の方法のいずれか１つを使用して徐々にＭＳＣ分化培地に移した：
Ｉ．（ｉ）１回の継代について２５％分化培地／７５％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｉ）１回の継代について５０％分化培地／５０％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｉｉ）１回の継代について７５％分化培地／２５％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｖ）１００％分化培地。
ＩＩ．（ｉ）１回の継代について５０％分化培地／５０％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｉ）１回の継代について７５％分化培地／２５％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｉｉ）１００％分化培地。
ＩＩＩ．（ｉ）１回の継代について５０％分化培地／５０％ｐＣＭ１００Ｆ；（ｉｉ）１００％分化培地。

【0529】

上記の培地および移行方法のすべてがＭＳＣへの効率的な分化をもたらした。

【0530】

その後、細胞を懸濁状態（ペトリディッシュ、スピナーフラスコおよび／またはバイオリアクター）で培養し、ピペットによって５～１０日毎に継代した。細胞を分化培地により少なくとも１回の継代にわたって培養した後、ＭＳＣの特徴を調べた。図１９Ａ～図１９Ｂは、少なくとも１０回の継代にわたって単一細胞としての懸濁状態で培養されたＰＳＣから分化させたＭＳＣの像を示す。細胞がゼラチン上に再置床されたとき、細胞は典型的なＭＳＣの形態学を明示する。図１９ＡはＦｙ富化培地において分化させたＣＬ１細胞を示し、図１９ＢはＭｅＳｕｓＩＩ培地において分化させたＣＬ１細胞を示す。

【0531】

ＭＳＣ集団を濃縮するために、磁石活性化細胞分取（ＭＡＣＳ）を、抗ＣＤ７３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｉｙ）を製造者の説明書に従って使用して用いた。ＣＤ７３－ＭＡＣＳは、約４０％のＣＤ７３陽性細胞から８０％超のＣＤ７３陽性細胞へのＭＳＣの濃縮をもたらした。

【0532】

ＭＳＣは、単一細胞としての懸濁状態で培養されたｈＥＳＣの分化によって作製された場合、典型的なＭＳＣ発現パターンを示す－図１８Ａ～図１８Ｃに示されるように、ＦＡＣＳ分析は、細胞が動物由来非含有培地において成長させられたとき、ＭＳＣの８２．５％がＣＤ７３陽性であり、４．８３％のみがＣＤ３１陽性であることを示す。加えて、ＭＳＣが血清含有培地において成長させられるとき、９９．３％がＣＤ１０５陽性である。

【0533】

懸濁ＭＳＣの脂肪形成細胞系譜への分化－懸濁状態でのＭＳＣを、本明細書中上記の「一般的な材料および実験方法」で記載されるように、２－Ｄ培養システムまたは懸濁培養のどちらかでの脂肪形成系譜への分化プロトコルに供した。簡潔には、ＭＳＣを６ウエルプレートにおいて２００００細胞／ｃｍ^２の密度で、または懸濁培養において１×１０^６細胞／ｍｌ～５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で播種し、培地交換を１週間に２回行いながら４週間、脂肪形成培地の存在下で成長させた。図１９Ｄに示されるように、（単一細胞としての懸濁状態で培養されたｈＥＳＣの分化により作製された）ＭＳＣは、脂質を多量に含む液胞を細胞内に示す脂肪形成細胞系譜への分化が可能であった。

【0534】

懸濁ＭＳＣの骨形成細胞系譜への分化－懸濁状態でのＭＳＣを、本明細書中上記の「一般的な材料および実験方法」で記載されるように、２－Ｄ培養システムまたは懸濁培養のどちらかでの骨形成系譜への分化プロトコルに供した。簡潔には、ＭＳＣを６ウエルプレートにおいて２０００細胞／ｃｍ^２～３０００細胞／ｃｍ^２の密度で、または懸濁培養において１×１０^６細胞／ｍｌ～５×１０^６細胞／ｍｌの濃度で播種し、培地交換を１週間に２回行いながら４週間、骨形成培地の存在下で成長させた。図１９Ｃに示されるように、（単一細胞としての懸濁状態で培養されたｈＥＳＣの分化により作製された）ＭＳＣは、アリザリンレッド染色によって検出される無機化した細胞を示す骨形成細胞系譜への分化が可能であった。

【0535】

懸濁ＭＳＣの軟骨形成細胞系譜への分化－懸濁状態でのＭＳＣを、本明細書中上記の「一般的な材料および実験方法」で記載されるように、２－Ｄ培養システムまたは懸濁培養のどちらかでの軟骨形成系譜への分化プロトコルに供した。簡潔には、２×１０^５個のＭＳＣを、１５ｍｌのポリプロピレン製ファルコンチューブにおいて３００ｇで５分間遠心分離して、細胞ペレットを形成した。細胞を、細胞塊を乱すことなく培地交換を１週間に２回行いながら９週間、チューブにおいてペレットとして軟骨形成培地で成長させた。細胞切片を、細胞ペレットを４％のＰＦＡにより固定処理し、低融点アガロース（１．５％）に包埋した後で作製した。細胞が、軟骨形成細胞系譜の軟骨細胞のマトリックスを染色するアルシアンブルーにより染色された（データは示されず）。これにより、ＭＳＣが軟骨形成細胞系譜に分化し得ることが明示される。

【0536】

実施例１２
単一細胞としての懸濁培養で培養されるヒト多能性胚性幹細胞は内胚葉細胞系譜への分化が可能である
実験結果
Ｃ２細胞をｐＣＭ１００Ｆ培養培地において懸濁状態で単一細胞として１０回超の継代にわたって培養した。内胚葉分化のために、ｂＦＧＦおよびＩＬ６ＲＩＬ６キメラ体を培養培地から除き、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でのアクチビンＡを懸濁培養において４８時間加えた。アクチビンＡへの暴露後１０日で、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはＨＦＦ（ヒト包皮線維芽細胞）マトリックスに置床したか、あるいは（懸濁状態での）３次元培養システムで培養し、ＰＤＸ１に対して染色した。ＳＯＸ１７遺伝子の発現レベルがリアルタイムＰＣＲによって調べられると、アクチビンＡへの暴露後２日目から１０日目までの分化期間中に増大を認めることができるであろう（データは示されず）。図２０Ａ～図２０Ｂは細胞におけるＰＤＸ１の発現を示し、これにより内胚葉細胞への分化が明示される。

【0537】

本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。

【0538】

本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。

【0539】

【図1A-1C】

【図2A-2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A-5C】

【図6A-6C】

【図7A-7C】

【図8A-8B】

【図9A】

【図9B-9G】

【図10A-10B】

【図11A-11B】

【図12A-12B】

【図12C-12D】

【図12E-12F】

【図12G-12H】

【図12I-12J】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16A-16B】

【図17A-17C】

【図18A-18C】

【図19A-19D】

【図20A-20B】

【配列表】

0007357086000001.app