(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-28
(45)【発行日】2023-10-06
(54)【発明の名称】ヒトβディフェンシン２誘導用味噌
(51)【国際特許分類】
A23L 33/10 20160101AFI20230929BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20230929BHJP
A23L 11/50 20210101ALI20230929BHJP
【ＦＩ】
A23L33/10
A23L33/135
A23L11/50 103
A23L11/50 107
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2019143549
(22)【出願日】2019-08-05
(65)【公開番号】P2021023198
(43)【公開日】2021-02-22
【審査請求日】2022-06-09
(73)【特許権者】
【識別番号】519224454
【氏名又は名称】発酵のまち横手ＦＴ事業協同組合
(74)【代理人】
【識別番号】100184767
【弁理士】
【氏名又は名称】佐々 健太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100098556
【弁理士】
【氏名又は名称】佐々 紘造
(74)【代理人】
【識別番号】100137501
【弁理士】
【氏名又は名称】佐々 百合子
(72)【発明者】
【氏名】多賀糸 敏雄
【審査官】吉岡 沙織
(56)【参考文献】
【文献】特開２００５－２７０１１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開平１１－２８６４９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－０７００１５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－０３４９６１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｌ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＦＳＴＡ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
原材料の大豆と米麹の割合が大豆１質量部に対し米麹２質量部以上である味噌、を含むヒトβディフェンシン２誘導用組成物。
【請求項2】
原材料の大豆と米麹の割合が大豆１質量部に対し米麹２質量部以上である味噌、を含むヒトβディフェンシン２誘導用食品組成物。
【請求項3】
原材料の大豆と米麹の割合が大豆１質量部に対し米麹２質量部以上であるヒトβディフェンシン２誘導用味噌。
【請求項4】
原材料の大豆と米麹の割合を、大豆１質量部に対し米麹２質量部以上とし、両者を混合後７～１５か月間室温で発酵及び熟成させる、ヒトβディフェンシン２誘導用味噌の製造方法。
【請求項5】
米麹が、麹菌３号Ｂ株（株式会社秋田今野商店 原菌番号：ＡＯＫ３８）を使った米麹である、請求項１のヒトβディフェンシン２誘導用組成物。
【請求項6】
米麹が、麹菌３号Ｂ株（株式会社秋田今野商店 原菌番号：ＡＯＫ３８）を使った米麹である、請求項２のヒトβディフェンシン２誘導用食品組成物。
【請求項7】
米麹が、麹菌３号Ｂ株（株式会社秋田今野商店 原菌番号：ＡＯＫ３８）を使った米麹である、請求項３のヒトβディフェンシン２誘導用味噌。
【請求項8】
米麹が、麹菌３号Ｂ株（株式会社秋田今野商店 原菌番号：ＡＯＫ３８）を使った米麹である、請求項４のヒトβディフェンシン２誘導用味噌の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はヒトβディフェンシン２誘導用味噌及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
秋田県横手地方で以前より生産されている横手味噌は、原材料中の大豆に対する米麹の割合が高い多麹みそで、ほんのりと甘い、味わい深い味噌である。江戸時代には大豆より米が高価であったので、麹の割合が高い横手味噌は贅沢な味噌といわれてきた。
また、近年、味噌が有する保健的機能に注目が集まっており、味噌を継続的に摂取することで、がんの発生が抑えられ、高血圧の改善、糖尿病予防などにも効果があるという報告がなされている。このように味噌一般については、様々な知見が得られつつあるが、横手味噌特有の保健的機能に関する知見は十分ではなかった。
また、近年、味噌が有する保健的機能に注目が集まっており、味噌を継続的に摂取することで、がんの発生が抑えられ、高血圧の改善、糖尿病予防などにも効果があるという報告がなされている。このように味噌一般については、様々な知見が得られつつあるが、横手味噌特有の保健的機能に関する知見は十分ではなかった。
【0003】
一方、植物、昆虫、両生類などにおいて、生来持っている生体防御機構として生体内の抗菌物質、特に抗菌ペプチドの存在が以前より知られている。これらは、自然免疫と呼ばれ、局所での感染防御を担っていることが解明されている。ヒトにおける抗菌ペプチドは、ディフェンシンと総称されている。ディフェンシンは、細菌、真菌等に対して、抗菌活性を有しており、生体内で種々の生体防御機構に関与していることが分かっている。
皮膚、肺、気管、腎臓、生殖器等の粘膜上皮に発現するディフェンシンとして、βディフェンシンが知られている。現在ヒトβディフェンシンとして６種のもの（ヒトβディフェンシン１、ヒトβディフェンシン２、ヒトβディフェンシン３、ヒトβディフェンシン４、ヒトβディフェンシン５、及びヒトβディフェンシン６）が単離、構造決定されている。特に、ヒトβディフェンシン２については、口腔、肺、気管、眼、鼻、消化器官等の粘膜組織及び皮膚において特に強く発現する、細菌感染や炎症性サイトカイン刺激にて発現誘導される、等の特徴があることが解明されており、肺炎等の気管感染症や炎症と密接な関係があることが示唆されている。
近年、βディフェンシンは、局所の感染防御だけでなく、上皮組織の組織修復や樹状細胞、Ｔリンパ球、単球等の細胞を遊走させることによる獲得免疫にも関与していることも報告されている。また、腫瘍免疫を誘導して、抗腫瘍効果を発揮することやガン細胞で増殖抑制作用があることも報告されている。
生体内で感染防御を司るヒトβディフェンシンの産生を促進することができれば、直接的な抗菌作用の強化ができるだけでなく、感染部位において免疫担当細胞を動員することで、生体防御機構を一層強化できると考えられる。
皮膚、肺、気管、腎臓、生殖器等の粘膜上皮に発現するディフェンシンとして、βディフェンシンが知られている。現在ヒトβディフェンシンとして６種のもの（ヒトβディフェンシン１、ヒトβディフェンシン２、ヒトβディフェンシン３、ヒトβディフェンシン４、ヒトβディフェンシン５、及びヒトβディフェンシン６）が単離、構造決定されている。特に、ヒトβディフェンシン２については、口腔、肺、気管、眼、鼻、消化器官等の粘膜組織及び皮膚において特に強く発現する、細菌感染や炎症性サイトカイン刺激にて発現誘導される、等の特徴があることが解明されており、肺炎等の気管感染症や炎症と密接な関係があることが示唆されている。
近年、βディフェンシンは、局所の感染防御だけでなく、上皮組織の組織修復や樹状細胞、Ｔリンパ球、単球等の細胞を遊走させることによる獲得免疫にも関与していることも報告されている。また、腫瘍免疫を誘導して、抗腫瘍効果を発揮することやガン細胞で増殖抑制作用があることも報告されている。
生体内で感染防御を司るヒトβディフェンシンの産生を促進することができれば、直接的な抗菌作用の強化ができるだけでなく、感染部位において免疫担当細胞を動員することで、生体防御機構を一層強化できると考えられる。
【0004】
今までに、食品とヒトβディフェンシン２の誘導の関係について検討されたことはあるが（特許文献１）、味噌とヒトβディフェンシン２誘導の関係について報告されたことはない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２００５－２７０１１７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の目的は、多麹味噌の保健的機能に関する知見を得て、多麹味噌の新たな用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者は、上記目的を達成するために種々検討の結果、驚くべきことに、本発明の多麹味噌が、ヒトの細胞株において、ヒトβディフェンシン２を高誘導することを見出し、本発明に到達した。すなわち本発明は以下の通りである
【0008】
１.原材料の大豆と米麹の割合が大豆１質量部に対し米麹２質量部以上である味噌、を含むヒトβディフェンシン２誘導用組成物。
２．原材料の大豆と米麹の割合が大豆１質量部に対し米麹２質量部以上である味噌、を含むヒトβディフェンシン２誘導用食品組成物。
３．原材料の大豆と米麹の割合が大豆１質量部に対し米麹２質量部以上であるヒトβディフェンシン２誘導用味噌。
４．原材料の大豆と米麹の割合を、大豆１質量部に対し米麹２質量部以上とし、両者を混合後７～１５か月間室温で発酵・熟成させる、ヒトβディフェンシン２誘導用味噌の製造方法。
５．米麹が、麹菌３号Ｂ株（株式会社秋田今野商店 原菌番号：ＡＯＫ３８）を使った米麹である、前記１のヒトβディフェンシン２誘導用組成物、又は前記２のヒトβディフェンシン２誘導用食品組成物、又は前記３のヒトβディフェンシン２誘導用味噌、又は前記４のヒトβディフェンシン２誘導用味噌の製造方法。
２．原材料の大豆と米麹の割合が大豆１質量部に対し米麹２質量部以上である味噌、を含むヒトβディフェンシン２誘導用食品組成物。
３．原材料の大豆と米麹の割合が大豆１質量部に対し米麹２質量部以上であるヒトβディフェンシン２誘導用味噌。
４．原材料の大豆と米麹の割合を、大豆１質量部に対し米麹２質量部以上とし、両者を混合後７～１５か月間室温で発酵・熟成させる、ヒトβディフェンシン２誘導用味噌の製造方法。
５．米麹が、麹菌３号Ｂ株（株式会社秋田今野商店 原菌番号：ＡＯＫ３８）を使った米麹である、前記１のヒトβディフェンシン２誘導用組成物、又は前記２のヒトβディフェンシン２誘導用食品組成物、又は前記３のヒトβディフェンシン２誘導用味噌、又は前記４のヒトβディフェンシン２誘導用味噌の製造方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、多麹味噌にヒトβディフェンシン２誘導という新たな用途を提供することができる。このことは、例えば本発明の多麹味噌を摂取することにより、大腸などの消化器官のヒトβディフェンシン２誘導を高め食中毒を予防したり、誘導されたヒトβディフェンシン２が、免疫担当細胞に働きかけて抗腫瘍効果を奏する可能性を示している。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本発明の味噌の製造方法の１例を示した。
【図2】本発明の味噌のヒトβディフェンシン２（ｈＢＤ２）誘導活性を示した。
【図3】半年熟成味噌のｈＢＤ２誘導活性を示した。
【図4】1.5年熟成味噌のｈＢＤ２誘導活性を示した。
【図5】従来使用してきた麹菌を使って製造した味噌のｈＢＤ２誘導活性を示した。
【図6】半年熟成、大豆：米麹１：１（１倍）と１：2.75（３倍）の味噌のｈＢＤ２誘導活性を比較した図を示した。
【図7】麹菌３号Ｂ株及び米麹自体のｈＢＤ２誘導活性を示した。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明で用いる原材料の大豆は、味噌用の大豆に限るものではない。例えば、主に枝豆として食されている大豆品種を用いることもできる。米麹を製造する際の米にも特に制限はない。米麹を製造する際に使用する麹菌は、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギウス・ソヤ―のどちらを使用してもよいし、両者を共に用いてもよいが、ヒトβディフェンシン２誘導能をもつ味噌を製造できる麹菌である。株式会社今野商店で販売されている麹菌３号Ｂ株（株式会社秋田今野商店 原菌番号：ＡＯＫ３８）はこのような麹菌であり、この麹菌を使用するとより好ましい。ただし、麹菌３号Ｂ株、及びこれを用いて製造した米麹のみでは誘導活性が観察されないので、麹菌自体、米麹自体が効いているのではなく、この麹菌で味噌を製造する際の代謝産物が、誘導活性に効いていると思われる。
また、麹菌３号Ｂ株には、同様の作用を持った、３号Ｂ株の改良株、変異株も含まれる。
さらに、当然ながら、麹菌３号Ｂ株で米麹を製造した場合、米麹は、麹菌３号Ｂ株を含有することになる。
なお、本発明は、今まで知られていなかったヒトβディフェンシン２を誘導する味噌の発明であり、本発明の味噌は、麹菌３号Ｂ株で製造した味噌に限定されるものではない。
みそ製造では、蒸し大豆と米麹を製造後、蒸し大豆、米麹、塩、水を混合するが（以下、「仕込む」ともいう）、蒸す前の大豆と、米麹の割合は、重量比で「大豆：米麹＝１：２以上」が好ましく、「大豆：米麹＝１：２．５～３．５」がより好ましい。
仕込み時に、全体に占める蒸し大豆（蒸すことで重量がおよそ倍になっている）の割合は３０～４０重量％、米麹の割合は４０～５０重量％、食塩の割合は８～１２重量％、水の割合は重量５～１５％が好ましい。
仕込む際、耐塩性乳酸菌や耐塩性酵母を添加し、味噌に酸味や香味をつけてもよい。
本発明で用いる原材料の大豆は、味噌用の大豆に限るものではない。例えば、主に枝豆として食されている大豆品種を用いることもできる。米麹を製造する際の米にも特に制限はない。米麹を製造する際に使用する麹菌は、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギウス・ソヤ―のどちらを使用してもよいし、両者を共に用いてもよいが、ヒトβディフェンシン２誘導能をもつ味噌を製造できる麹菌である。株式会社今野商店で販売されている麹菌３号Ｂ株（株式会社秋田今野商店 原菌番号：ＡＯＫ３８）はこのような麹菌であり、この麹菌を使用するとより好ましい。ただし、麹菌３号Ｂ株、及びこれを用いて製造した米麹のみでは誘導活性が観察されないので、麹菌自体、米麹自体が効いているのではなく、この麹菌で味噌を製造する際の代謝産物が、誘導活性に効いていると思われる。
また、麹菌３号Ｂ株には、同様の作用を持った、３号Ｂ株の改良株、変異株も含まれる。
さらに、当然ながら、麹菌３号Ｂ株で米麹を製造した場合、米麹は、麹菌３号Ｂ株を含有することになる。
なお、本発明は、今まで知られていなかったヒトβディフェンシン２を誘導する味噌の発明であり、本発明の味噌は、麹菌３号Ｂ株で製造した味噌に限定されるものではない。
みそ製造では、蒸し大豆と米麹を製造後、蒸し大豆、米麹、塩、水を混合するが（以下、「仕込む」ともいう）、蒸す前の大豆と、米麹の割合は、重量比で「大豆：米麹＝１：２以上」が好ましく、「大豆：米麹＝１：２．５～３．５」がより好ましい。
仕込み時に、全体に占める蒸し大豆（蒸すことで重量がおよそ倍になっている）の割合は３０～４０重量％、米麹の割合は４０～５０重量％、食塩の割合は８～１２重量％、水の割合は重量５～１５％が好ましい。
仕込む際、耐塩性乳酸菌や耐塩性酵母を添加し、味噌に酸味や香味をつけてもよい。
【0012】
本発明の味噌は、ヒトβディフェンシン２誘導用の味噌であるが、これは、味噌がヒト細胞株のｍＲＮＡレベルで、ヒトβディフェンシン２を高誘導することである。より詳細には、味噌を溶かした味噌溶液が、コントロールであるＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）よりも、ヒト大腸がん由来の上皮細胞用の細胞株であるCaco-2細胞ｍＲＮＡレベルで、ヒトβディフェンシン２を高誘導することである。Caco-2細胞は大腸由来の細胞であり、ヒトの消化管において、本発明の味噌がヒトβディフェンシン２を高誘導し、食中毒予防に効く可能性がある。
もちろん、Caco-2細胞において、ヒトβディフェンシン２の発現を蛋白質レベルで上昇させてもよいし、他のヒト細胞株で、ヒトβディフェンシン２の発現を、ｍＲＮＡレベル、蛋白質レベルで、上昇させてもよい。さらには実験動物に投与したときにその消化管の細胞などで、ヒトβディフェンシン２の発現を、ｍＲＮＡレベル、蛋白質レベルで、上昇させてもよい。
もちろん、Caco-2細胞において、ヒトβディフェンシン２の発現を蛋白質レベルで上昇させてもよいし、他のヒト細胞株で、ヒトβディフェンシン２の発現を、ｍＲＮＡレベル、蛋白質レベルで、上昇させてもよい。さらには実験動物に投与したときにその消化管の細胞などで、ヒトβディフェンシン２の発現を、ｍＲＮＡレベル、蛋白質レベルで、上昇させてもよい。
【0013】
一般に味噌は、米味噌、麦味噌、豆味噌に分類されるが、本発明の味噌は、大豆の他に米も原料とする米味噌である。もちろん、米味噌とその他の味噌を混ぜた調合味噌でもよい。
また、味噌には、麹菌などの微生物が生きている生味噌（アルコールを加え微生物の働きを抑えている味噌も含む）と、加熱滅菌して麹菌が死んでいる味噌があるが、どちらでもよい。滅菌した味噌のサンプルを用いて誘導活性を測定しているが活性は検出されるので、生きたままの麹菌やその他の微生物が人体に直接働きかけるというプロバイオティクスの機能性食品というよりは、死菌成分も含めた麹菌の代謝産物の中に、ヒト細胞に対し、ヒトβディフェンシン２を誘導する何らかの成分が含まれているバイオジェニックスの機能性食品ということができる。
なお、この観点からは、例えば、本発明の味噌の成分をサプリメントとして摂取することも考えられる。
さらに、ヒトβディフェンシン２誘導に効く、本発明の味噌の成分は１つとは限らず、２つ以上の成分が相乗効果を発揮している可能性もある。
また、味噌には、麹菌などの微生物が生きている生味噌（アルコールを加え微生物の働きを抑えている味噌も含む）と、加熱滅菌して麹菌が死んでいる味噌があるが、どちらでもよい。滅菌した味噌のサンプルを用いて誘導活性を測定しているが活性は検出されるので、生きたままの麹菌やその他の微生物が人体に直接働きかけるというプロバイオティクスの機能性食品というよりは、死菌成分も含めた麹菌の代謝産物の中に、ヒト細胞に対し、ヒトβディフェンシン２を誘導する何らかの成分が含まれているバイオジェニックスの機能性食品ということができる。
なお、この観点からは、例えば、本発明の味噌の成分をサプリメントとして摂取することも考えられる。
さらに、ヒトβディフェンシン２誘導に効く、本発明の味噌の成分は１つとは限らず、２つ以上の成分が相乗効果を発揮している可能性もある。
【0014】
以下、本発明の味噌の製造方法を説明する。
味噌の製造は常法に従って行う。まず、水を吸わせた精白米を蒸してから、そこに種麹をつけて繁殖させ米麹を製造する。次に、原材料の大豆は丸大豆のまま吸水させたものを蒸す。そして、この米麹、蒸した大豆、食塩、水を混合する。混合後、一定期間置き、発酵・熟成させる。発酵・熟成期間に、大豆のタンパク質はアミノ酸に、脂肪は脂肪酸とアルコールに、米麹のデンプンはブドウ糖へと分解され、味噌の旨味を形作られる。
発酵・熟成は、室温で放置するいわゆる自然発酵が好ましい。発酵・熟成期間は、７～１５か月が好ましく、９～１５か月であればより好ましい。なお、発酵・熟成期間とは、大豆、米麹、塩、水を混合してから、即ち仕込んでから、味噌ができあがるまでの期間をいう。できあがるまでとは、より具体的には、例えば、検査、包装のために、発酵・熟成期間に置かれていた仕込み蔵から出すときのことをいう。なお、生味噌の場合、商品出荷後も多少発酵・熟成は進むがその期間は含めない。秋に仕込んだ味噌は、冬期間の低温のため発酵・熟成期間はやや長めとなり、春に仕込んだ味噌は夏期間の高温のため発酵・熟成が早く進むので、発酵・熟成期間はやや短めとなる。
味噌の製造は常法に従って行う。まず、水を吸わせた精白米を蒸してから、そこに種麹をつけて繁殖させ米麹を製造する。次に、原材料の大豆は丸大豆のまま吸水させたものを蒸す。そして、この米麹、蒸した大豆、食塩、水を混合する。混合後、一定期間置き、発酵・熟成させる。発酵・熟成期間に、大豆のタンパク質はアミノ酸に、脂肪は脂肪酸とアルコールに、米麹のデンプンはブドウ糖へと分解され、味噌の旨味を形作られる。
発酵・熟成は、室温で放置するいわゆる自然発酵が好ましい。発酵・熟成期間は、７～１５か月が好ましく、９～１５か月であればより好ましい。なお、発酵・熟成期間とは、大豆、米麹、塩、水を混合してから、即ち仕込んでから、味噌ができあがるまでの期間をいう。できあがるまでとは、より具体的には、例えば、検査、包装のために、発酵・熟成期間に置かれていた仕込み蔵から出すときのことをいう。なお、生味噌の場合、商品出荷後も多少発酵・熟成は進むがその期間は含めない。秋に仕込んだ味噌は、冬期間の低温のため発酵・熟成期間はやや長めとなり、春に仕込んだ味噌は夏期間の高温のため発酵・熟成が早く進むので、発酵・熟成期間はやや短めとなる。
【実施例】
【0015】
以下に、本発明を実施例で説明する。
【0016】
実施例１
［味噌の製造］
以下、サンプルを製造した蔵の一つである蔵４での味噌の製造方法を記載する。なお、他の蔵でもほぼ同様に味噌を製造した。
１．米麹と蒸し大豆の準備
（１）原材料として大豆30 kg、米75 kg、麹菌３号Ｂ株（株式会社秋田今野商店 原菌番号：ＡＯＫ３８）を使用した。
（２）米麹の製造
図１の１の流れで米麹を製造した。米を水で浸漬し、蒸かした。蒸かした後、放熱し、種付を行い、しばらく麹室に引き込んで、米麹を製造した。できた米麹は82.5 kgであった。
（３）蒸した大豆の製造
図１の２の流れで蒸し大豆を製造した。大豆30 kgを、16時間以上、水に浸漬した後、圧力釜で蒸し、冷却、潰しを経て、蒸し大豆を製造した。蒸し大豆の重さは、蒸す前に比べおよそ２倍になり、できた蒸し大豆の重さは60 kg弱であった。
２．上で製造した米麹82.5 kg、蒸し大豆60 kg弱（蒸す前の大豆30 kgに相当）、食塩18 kg、水20 Lを混合した（「仕込む」ともいう）。混合後、室温で放置し、一定期間、発酵・熟成させた。
［味噌の製造］
以下、サンプルを製造した蔵の一つである蔵４での味噌の製造方法を記載する。なお、他の蔵でもほぼ同様に味噌を製造した。
１．米麹と蒸し大豆の準備
（１）原材料として大豆30 kg、米75 kg、麹菌３号Ｂ株（株式会社秋田今野商店 原菌番号：ＡＯＫ３８）を使用した。
（２）米麹の製造
図１の１の流れで米麹を製造した。米を水で浸漬し、蒸かした。蒸かした後、放熱し、種付を行い、しばらく麹室に引き込んで、米麹を製造した。できた米麹は82.5 kgであった。
（３）蒸した大豆の製造
図１の２の流れで蒸し大豆を製造した。大豆30 kgを、16時間以上、水に浸漬した後、圧力釜で蒸し、冷却、潰しを経て、蒸し大豆を製造した。蒸し大豆の重さは、蒸す前に比べおよそ２倍になり、できた蒸し大豆の重さは60 kg弱であった。
２．上で製造した米麹82.5 kg、蒸し大豆60 kg弱（蒸す前の大豆30 kgに相当）、食塩18 kg、水20 Lを混合した（「仕込む」ともいう）。混合後、室温で放置し、一定期間、発酵・熟成させた。
【0017】
実施例２
［多麹味噌をCaco-2細胞に供したときのヒトβディフェンシン２（以下、ｈＢＤ２）誘導活性の測定］
１．実験例１ ＜多麹味噌のｈＢＤ２誘導活性の測定＞
（１）原料は大豆：米麹＝１：２．７５、麹菌は、麹菌３号Ｂ株、発酵・熟成期間は1年とし、実施例１と同様の方法で多麹味噌を製造しサンプルとした。コントロールとしてＰＢＳを用いた。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡの発現強度は、以下の方法で測定した。
ＲＮＡの抽出はRNeasy Mini kit (Qiagen社）（Ｉ）、ｃＤＮＡの合成はSuper Script III First-Strand kit (Invitrogen社）で行った（ＩＩ）。また、ｃＤＮＡ合成後のＰＣＲは各目的遺伝子に対応するプライマー（FASMAC社、配列表は表１）を使用し、増幅はKOD-Multi&Epi（東洋紡社）を使用して行った（ＩＩＩ）。
［多麹味噌をCaco-2細胞に供したときのヒトβディフェンシン２（以下、ｈＢＤ２）誘導活性の測定］
１．実験例１ ＜多麹味噌のｈＢＤ２誘導活性の測定＞
（１）原料は大豆：米麹＝１：２．７５、麹菌は、麹菌３号Ｂ株、発酵・熟成期間は1年とし、実施例１と同様の方法で多麹味噌を製造しサンプルとした。コントロールとしてＰＢＳを用いた。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡの発現強度は、以下の方法で測定した。
ＲＮＡの抽出はRNeasy Mini kit (Qiagen社）（Ｉ）、ｃＤＮＡの合成はSuper Script III First-Strand kit (Invitrogen社）で行った（ＩＩ）。また、ｃＤＮＡ合成後のＰＣＲは各目的遺伝子に対応するプライマー（FASMAC社、配列表は表１）を使用し、増幅はKOD-Multi&Epi（東洋紡社）を使用して行った（ＩＩＩ）。
【0018】
【表1】
イ. 1×PBSに溶かした各サンプルをCaco-2細胞(1.6×106 cell/dishとなるよう前日にセルカウント済)に1 mg/mlずつ添加して37℃で3時間共インキュベートした。サンプル溶液は100℃で5分間滅菌したものを使用した。
ロ．細胞をBuffer RLT Lysis 600 μlで溶解し、続いて21Gシリンジで10回ストロークして細胞を破砕した。
ハ．あらかじめ調製しておいた70%エタノールを600 μl加えて青チップで10回パイペティングし、エタノール沈殿を作った。これをスピンカラムに600 μl取り、10,000 rpmで15秒遠心した。ろ液は除去し、残りの溶液も同じスピンカラムに再度600 μl加え、同様に遠心した。エタノールを加えてからの作業は素早く行った。
ニ．スピンカラムにBuffer RW1を700 μl加えて10,000 rpmで15秒遠心し、ろ液を排除した。
ホ．スピンカラムにBuffer RPEを500 μl加えて10,000 rpmで15秒遠心し、ろ液を除去した。その後、再度Buffer RPEを500 μl加えて10,000 rpmで2分遠心し、ろ液を排除した。
ヘ．新しいふた無しチューブを用意し、カラムをセットして何も加えずに15,000 rpmで1分遠心した。
ト．新しい1.5 mlチューブにカラムをセットし、RNase-free waterを30 μl加えて10,000 rpmで1分遠心した。得られたサンプルは直ちに氷上に保存した。
（ＩＩ）ｃＤＮＡの合成
（イ）（Ｉ）のRNAの抽出で得られたRNAサンプルの濃度をナノドロップおよびQ5000を用いて測定した。
（ロ）Super Script III First-Strand kitを用いて表２に示すとおりに調製した。
【0019】
【表2】
（ニ）インキュベートしている間に表３のcDNA Synthesis Mixを調製し、氷上に保存しておいた。
【0020】
【表3】
【0021】
【表4】
ト．作製したcDNAは－20℃で保存した。
（ＩＩＩ）目的遺伝子の増幅
目的遺伝子の増幅にはSuper Script III First-Strand kit (Invitrogen) を用いた。
（イ）目的DNAの増幅ために表５のとおりに調製し、PCRを行った。PCR条件は表６、表７のとおりにした。なお、本実験では内部コントロールとしてβ-actinの遺伝子の増幅も行った。
【0022】
【表5】
【0023】
【表6】
【0024】
【表7】
（ＩＶ）解析
電気泳動後のゲルは紫外線を当てて撮影し、得られた画像は画像解析ソフト「ImageJ」を用いて解析した。
（３）結果
多麹味噌を供したときのｈＢＤ２ ｍＲＮＡの発現強度を図２に示した。蔵５、４、３の味噌は、ｈＢＤ２誘導活性を示した。蔵２と蔵６についても、誘導活性が高い傾向があった。
【0025】
実施例３
［発酵・熟成期間とｈＢＤ２誘導活性の関係についての検討］
ｈＢＤ２誘導活性に対する発酵・熟成期間の影響を調べるため、発酵・熟成期間半年、1.5年のときの誘導活性について調べた
１．実験例２ ＜半年発酵・熟成多麹味噌のｈＢＤ２誘導活性の測定＞
（１）原材料は大豆：米麹＝１：２．７５、麹菌は３号Ｂ株、発酵・熟成期間は半年として、実施例１と同様の方法で製造した多麹味噌をサンプルとした。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡ発現強度の測定は実験例1（２）と同様に行った。
（３）結果
半年発酵・熟成味噌を供したときのｈＢＤ２ ｍＲＮＡの発現強度を図３に示した。蔵１～６の味噌のｈＢＤ２誘導活性は、蔵３、４、６でやや高い傾向はあるものの、ＰＢＳを供したときと比べて高いことは確認できなかった。なお、Ｅ１２はＩＬ－１２誘導乳酸菌サプリメントで、結果と関係ないサンプルである。
２．実験例３ ＜1.5年発酵・熟成多麹味噌のｈＢＤ２発現活性の測定＞
（１）原料は大豆：米麹＝１：２．７５、麹菌は３号Ｂ株、発酵・熟成期間は1.5年とし、実施例１と同様の方法で多麹味噌を製造しサンプルとした。なお、２つのサンプルがある蔵は、それぞれ異なる品種の大豆を使用している。
また、参考までに、一般的な味噌として、麹菌３号Ｂ株を使用せず、大豆：米麹＝１：２未満、発酵・熟成期間不明の市販品の味噌もサンプルとした。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡ発現強度の測定は実験例1（２）と同様に行った。
（３）結果
1.5年発酵・熟成味噌を供したときのｈＢＤ２の発現強度を図４に示した。蔵６の５、蔵２の７、の味噌は、やや弱いｈＢＤ２誘導活性を示したが、他の９つのサンプルからは誘導活性は確認できなかった。
また、市販品のサンプルからは、ｈＢＤ２誘導活性を確認できなかったので、実験例１で本発明の多麹味噌に誘導活性が確認された結果と併せると、本発明の多麹味噌の優位性が示唆された。
３．結果まとめ
蔵によって結果に多少のばらつきがあるものの、発酵・熟成期間１年の味噌はｈＢＤ２誘導活性を持つあるいはその傾向がある（実験例１、図２）一方、半年、1.5年の味噌は、一部を除いて、ｈＢＤ２誘導活性を示さなかった。このことから、発酵・熟成期間は、１年程度であればより好ましいことが示唆された。
［発酵・熟成期間とｈＢＤ２誘導活性の関係についての検討］
ｈＢＤ２誘導活性に対する発酵・熟成期間の影響を調べるため、発酵・熟成期間半年、1.5年のときの誘導活性について調べた
１．実験例２ ＜半年発酵・熟成多麹味噌のｈＢＤ２誘導活性の測定＞
（１）原材料は大豆：米麹＝１：２．７５、麹菌は３号Ｂ株、発酵・熟成期間は半年として、実施例１と同様の方法で製造した多麹味噌をサンプルとした。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡ発現強度の測定は実験例1（２）と同様に行った。
（３）結果
半年発酵・熟成味噌を供したときのｈＢＤ２ ｍＲＮＡの発現強度を図３に示した。蔵１～６の味噌のｈＢＤ２誘導活性は、蔵３、４、６でやや高い傾向はあるものの、ＰＢＳを供したときと比べて高いことは確認できなかった。なお、Ｅ１２はＩＬ－１２誘導乳酸菌サプリメントで、結果と関係ないサンプルである。
２．実験例３ ＜1.5年発酵・熟成多麹味噌のｈＢＤ２発現活性の測定＞
（１）原料は大豆：米麹＝１：２．７５、麹菌は３号Ｂ株、発酵・熟成期間は1.5年とし、実施例１と同様の方法で多麹味噌を製造しサンプルとした。なお、２つのサンプルがある蔵は、それぞれ異なる品種の大豆を使用している。
また、参考までに、一般的な味噌として、麹菌３号Ｂ株を使用せず、大豆：米麹＝１：２未満、発酵・熟成期間不明の市販品の味噌もサンプルとした。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡ発現強度の測定は実験例1（２）と同様に行った。
（３）結果
1.5年発酵・熟成味噌を供したときのｈＢＤ２の発現強度を図４に示した。蔵６の５、蔵２の７、の味噌は、やや弱いｈＢＤ２誘導活性を示したが、他の９つのサンプルからは誘導活性は確認できなかった。
また、市販品のサンプルからは、ｈＢＤ２誘導活性を確認できなかったので、実験例１で本発明の多麹味噌に誘導活性が確認された結果と併せると、本発明の多麹味噌の優位性が示唆された。
３．結果まとめ
蔵によって結果に多少のばらつきがあるものの、発酵・熟成期間１年の味噌はｈＢＤ２誘導活性を持つあるいはその傾向がある（実験例１、図２）一方、半年、1.5年の味噌は、一部を除いて、ｈＢＤ２誘導活性を示さなかった。このことから、発酵・熟成期間は、１年程度であればより好ましいことが示唆された。
【0026】
比較例４
［麹菌の菌株の種類とｈＢＤ２誘導活性の関係についての検討］
比較実験例４
（１）麹菌の菌株の違いの影響を検討するため、麹菌３号Ｂ株でなく従来使用されてきた各種麹菌を使って味噌を製造し、サンプルとした。大豆：米麹＝１：２．７５、麹菌３号Ｂ株との違いを見やすいように、発酵・熟成期間１年とし、麹菌以外は、実施例１と同様の方法で多麹味噌を製造した。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡ発現強度の測定は実験例1（２）と同様に行った。
（３）結果
従来の麹菌を使用して製造した１年発酵・熟成多麹味噌のｈＢＤ２誘導活性を、図５に示した。いずれの蔵の１年発酵・熟成多麹味噌も、ｈＢＤ２誘導活性を示さなかった。麹菌３号Ｂ株を使った実験例1（図２）では、いずれの１年発酵・熟成多麹味噌も、ｈＢＤ２誘導活性を示すか、あるいはその傾向はあったので、麹菌３号Ｂ株を使用することが重要であることがわかった。
［麹菌の菌株の種類とｈＢＤ２誘導活性の関係についての検討］
比較実験例４
（１）麹菌の菌株の違いの影響を検討するため、麹菌３号Ｂ株でなく従来使用されてきた各種麹菌を使って味噌を製造し、サンプルとした。大豆：米麹＝１：２．７５、麹菌３号Ｂ株との違いを見やすいように、発酵・熟成期間１年とし、麹菌以外は、実施例１と同様の方法で多麹味噌を製造した。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡ発現強度の測定は実験例1（２）と同様に行った。
（３）結果
従来の麹菌を使用して製造した１年発酵・熟成多麹味噌のｈＢＤ２誘導活性を、図５に示した。いずれの蔵の１年発酵・熟成多麹味噌も、ｈＢＤ２誘導活性を示さなかった。麹菌３号Ｂ株を使った実験例1（図２）では、いずれの１年発酵・熟成多麹味噌も、ｈＢＤ２誘導活性を示すか、あるいはその傾向はあったので、麹菌３号Ｂ株を使用することが重要であることがわかった。
【0027】
参考例５
［米麹の割合とｈＢＤ２誘導活性の関係についての検討］
参考実験例５
（１）米麹の割合とｈＢＤ２誘導活性の関係を調べるため、大豆：米麹＝１：１のサンプル（以下、１倍）と１：２．７５（以下、３倍）の味噌をサンプルとし、誘導活性を比較した。コントロールとしてＰＢＳを置き、同じ蔵の１倍と３倍サンプルをペアとして、1倍と3倍のｈＢＤ２誘導活性を比較した。
麹菌は３号Ｂ株、発酵・熟成期間は半年とし、大豆に対する米麹の割合以外は、実験例１（２）と同様に、サンプルを製造した。蔵４、蔵２でそれぞれ２セットのサンプルがあるが（図６）、セットごとに大豆の種類が異っている。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡ発現強度の測定は実験例1（２）と同様に行った。
（３）結果及び考察
発酵・熟成期間が半年なので、３倍サンプルのｈＢＤ２誘導活性がはっきりしないので、あくまで参考にとどまるが、いずれのセットでも、1倍よりも3倍のサンプルが、ｈＢＤ２誘導活性が大きい傾向があった（図６）。なおマル２のサンプルは結果とは関係ないサンプルである。
［米麹の割合とｈＢＤ２誘導活性の関係についての検討］
参考実験例５
（１）米麹の割合とｈＢＤ２誘導活性の関係を調べるため、大豆：米麹＝１：１のサンプル（以下、１倍）と１：２．７５（以下、３倍）の味噌をサンプルとし、誘導活性を比較した。コントロールとしてＰＢＳを置き、同じ蔵の１倍と３倍サンプルをペアとして、1倍と3倍のｈＢＤ２誘導活性を比較した。
麹菌は３号Ｂ株、発酵・熟成期間は半年とし、大豆に対する米麹の割合以外は、実験例１（２）と同様に、サンプルを製造した。蔵４、蔵２でそれぞれ２セットのサンプルがあるが（図６）、セットごとに大豆の種類が異っている。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡ発現強度の測定は実験例1（２）と同様に行った。
（３）結果及び考察
発酵・熟成期間が半年なので、３倍サンプルのｈＢＤ２誘導活性がはっきりしないので、あくまで参考にとどまるが、いずれのセットでも、1倍よりも3倍のサンプルが、ｈＢＤ２誘導活性が大きい傾向があった（図６）。なおマル２のサンプルは結果とは関係ないサンプルである。
【0028】
比較例６
［麹菌と米麹のｈＢＤ２誘導活性の測定］
比較実験例６
（１）麹菌自体、又は米麹自体にｈＢＤ２誘導活性があるか確認するために、麹菌又は米麹をサンプルとした。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡ発現強度の測定は実験例1（２）と同様に行った。
（３）結果
麹菌と米麹を供したときのｈＢＤ２誘導活性を図７に示した。いずれもｈＢＤ２誘導活性を示さなかったので、麹菌や米麹自体にｈＢＤ２誘導活性があるのではなく、これらを使用した味噌にｈＢＤ２誘導活性があることがわかった。
［麹菌と米麹のｈＢＤ２誘導活性の測定］
比較実験例６
（１）麹菌自体、又は米麹自体にｈＢＤ２誘導活性があるか確認するために、麹菌又は米麹をサンプルとした。
（２）ｈＢＤ２ ｍＲＮＡ発現強度の測定は実験例1（２）と同様に行った。
（３）結果
麹菌と米麹を供したときのｈＢＤ２誘導活性を図７に示した。いずれもｈＢＤ２誘導活性を示さなかったので、麹菌や米麹自体にｈＢＤ２誘導活性があるのではなく、これらを使用した味噌にｈＢＤ２誘導活性があることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【0029】
本発明のヒトβディフェンシン２誘導用味噌は、多麹味噌の新たな用途を提供するもので、多麹味噌の需要拡大に貢献でき、多麹味噌を製造する食品業界に資するものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】