(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-28
(45)【発行日】2023-10-06
(54)【発明の名称】新規組成物及び治療方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/706 20060101AFI20230929BHJP
A61K 31/7028 20060101ALI20230929BHJP
A61K 31/7056 20060101ALI20230929BHJP
A61K 31/7048 20060101ALI20230929BHJP
A61K 31/7034 20060101ALI20230929BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20230929BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20230929BHJP
A61K 9/12 20060101ALI20230929BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20230929BHJP
A61K 47/08 20060101ALI20230929BHJP
A61K 47/06 20060101ALI20230929BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20230929BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20230929BHJP
A61K 47/46 20060101ALI20230929BHJP
A61P 39/02 20060101ALI20230929BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20230929BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20230929BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20230929BHJP
【ＦＩ】
A61K31/706
A61K31/7028
A61K31/7056
A61K31/7048
A61K31/7034
A61K9/10
A61K9/06
A61K9/12
A61K47/10
A61K47/08
A61K47/06
A61K47/34
A61K47/14
A61K47/46
A61P39/02
A61P17/02
A61P31/04
A61P29/00
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2020139289
(22)【出願日】2020-08-20
(62)【分割の表示】P 2018549943の分割
【原出願日】2017-03-30
(65)【公開番号】P2020193215
(43)【公開日】2020-12-03
【審査請求日】2020-09-17
(31)【優先権主張番号】62/315,144
(32)【優先日】2016-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】518333214
【氏名又は名称】アユヴィス リサーチ インク．
【氏名又は名称原語表記】ＡＹＵＶＩＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100102255
【弁理士】
【氏名又は名称】小澤 誠次
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100198074
【弁理士】
【氏名又は名称】山村 昭裕
(74)【代理人】
【氏名又は名称】富田 博行
(72)【発明者】
【氏名】アチャリャ スチスミタ
(72)【発明者】
【氏名】パンダ サントシュ ケイ．
(72)【発明者】
【氏名】ダス プラニャ
(72)【発明者】
【氏名】アガルワル ビーモン
【審査官】鶴見 秀紀
(56)【参考文献】
【文献】特表２００６－５１４０７４（ＪＰ，Ａ）
【文献】 PLoS Pathogens，2012年，Vol.8,No.5,e1002717，pp.1-17
【文献】Biochemical and Biophysical Research Communications，2000年，Vol.271，pp.229-233
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｋ ９／００－９／７２
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ３１／０４
Ａ６１Ｐ ３９／０２
Ａ６１Ｐ １７／０２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）【化1】
（式中、
Ｒ＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１、アルキル、ベンジル、置換ベンジルであり、
Ｒ１＝アルキル、ピペリジンニトロキシルであり、
Ｒ２＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１、又は次の式のアシルオキシアルキルカルバメート：
Ｃ（Ｏ）ＯＣＨＲ３ＯＣ（Ｏ）ＯＲ４、又はピペリジンニトロキシルであり、
Ｒ３＝Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、イソプロピルであり、
Ｒ４＝置換アルキル基であり、
Ｘ＝Ｏであり、かつＲ立体化学を介してアノマー炭素に連結しており（ベータアノマー）、
Ｒ５＝シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ピペリジンニトロキシル、ピペリジンＮ－ヒドロキシルアミン
【化2】
ｎ＝０～７である）
の化合物又は薬学的に許容されるその塩を、敗血症、敗血症性ショック、毒血症又は創傷感染を治療するための十分な量で含む、敗血症、敗血症性ショック、毒血症又は創傷感染を治療するための医薬組成物。
【請求項2】
滅菌注射用水性又は油性懸濁液として製剤される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
滅菌局所ゲル、軟膏又は水性スプレーとして製剤される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項4】
抗炎症剤又は抗菌剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項5】
アルコール及びケトン、エモリエント、炭化水素油及びワックス、ラノリン、シリコーン油、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドエステル、脂肪族アルコール、脂肪酸アルキル及びアルケニルエステル、ジカルボン酸アルキル及びアルケニルジエステル、多価アルコール並びにそれらのエーテル及びエステル誘導体、ワックスエステル及び蜜蝋誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ジイソプロピルセバケート、イソプロピルミリステート、メチルラウレート、シリコーン、グリセリン及びそれらの混合物から選択される１又は２以上の媒体をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項6】
Ｒ＝Ｈ、又はＣ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項7】
Ｒ２＝Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項8】
化合物が、以下の：【化3】
【請求項9】
式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与し、それによって前記対象を治療することを含む、敗血症、敗血性ショック、毒血症又は創傷感染を治療するための薬剤の製造における、請求項１に記載の組成物の使用であって、前記組成物が、以下の：【化4】
【請求項10】
投与することが、約５．０ｍｇ～約１００ｍｇ若しくは１０．０ｍｇ～約１０００ｍｇの式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与し、それによって前記患者を治療することを含む、請求項９に記載の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０１６年３月３０日出願の米国仮特許出願第６２／３１５１４４号の利益を主張し、その出願は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１６年３月３０日出願の米国仮特許出願第６２／３１５１４４号の利益を主張し、その出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、新規な生成物、それらのバリアント、薬学的に許容される塩及びプロドラッグ、並びに敗血症（sepsis）、毒血症（septicemia）、敗血症性ショック（septic shock）、眼感染症、眼炎症、眼血管新生、関節リウマチ（ＲＡ，rheumatoid arthritis）、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ，inflammatory bowel diseases）、喘息、慢性閉塞性肺疾患、発熱症候群、悪液質、乾癬、自己免疫疾患、心臓病、網膜芽腫、がん、並びに／又は炎症、免疫調節及び微生物感染に関連する任意の障害の治療及び／又は管理のためのそのような化合物の医学的使用に関する。
【背景技術】
【0003】
敗血症は、米国において最も高額な入院費がかかる５つの疾患のうちの１つであると特定された。敗血症の転帰は、高齢患者、免疫不全患者及び重症患者において特に好ましくない。その臨床的課題に加えて、敗血症の治療は、世界中の医療システムに大きな経済的負担を課している。米国だけで毎年９００，０００例を超える症例が生じていると推定され、年間総費用は国全体で約２６０億ドルであると推定されている。現在、敗血症の治療には、３つの広範囲の補助的（非抗生物質）治療アプローチ：（１）支持療法の改善（すなわち、酸素治療／換気療法戦略、輸液の最適化／血管収縮薬の使用、早期目標指向型治療）、（２）細菌病原性因子へのターゲッティング（すなわち、抗エンドトキシン抗体、エンドトキシン除去カラム）、（３）宿主応答因子へのターゲッティング（すなわち、コルチコステロイド、抗サイトカイン薬、抗凝固剤）のうちの１つが典型的に使用されている。しかし、現在の療法は、敗血症及び敗血症性ショックに罹患している患者に完全には効果的でない。これらの治療法は、免疫不全患者及び高齢患者においては、さらに効果が低い。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0004】
本発明は、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ，age-related macular degeneration）の病因などの炎症性疾患を治療するのに有用な、ＴＬＲ４に対してアンタゴニスト活性を示す低分子量の水溶性オリゴ糖（化合物１～３）を提供することによって、従来技術の欠点を克服する。このような炎症状態としては、眼の炎症性疾患及び脈絡膜血管新生が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、本発明は、炎症の治療のための化合物（４、１５、１６及び２５）に関する。いくつかの実施形態では、炎症は、複数菌感染によって引き起こされる場合がある。いくつかの実施形態では、化合物は、敗血症及び重篤な敗血症、ＳＩＲＳ及び敗血症性ショックの治療に使用を見出す。
【0005】
本発明の化合物は、ＬＰＳ誘導ヒト単球アッセイにおいてＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６などの炎症性バイオマーカーを阻害し、単球において抗炎症性サイトカインＩＬ－１０を産生することにおいて優れた抗炎症活性を有することが、予想外に見出されている。本発明の化合物は、盲腸結紮穿刺モデルにおいて、大腸菌による致死的グラム陰性敗血症及び致死的複数菌敗血症の両方からマウスを保護した。したがって、本開示は、本明細書に開示される化合物を、それらを必要とする患者に投与することにより、ＬＰＳ誘導ヒト単球アッセイにおいて、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６などであるがそれらに限定されない、炎症性バイオマーカーを阻害する方法を提供する。さらに、本開示は、本明細書中に開示される化合物を、それらを必要とする患者に投与することにより、大腸菌による致死的グラム陰性敗血症からマウスを保護する方法を提供する。本発明の化合物はまた、グラム陽性菌（メチシリン感受性黄色ブドウ球菌及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌）、グラム陰性菌（大腸菌、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ（A, Baumannii）、肺炎桿菌）の両方、並びに熱傷及び敗血症性創傷に主に見られる真菌（カンジダ・アルビカンス（C. Albicans））に対して、広域スペクトル抗菌活性を有することが、予想外に見出されている。したがって、本開示は、本明細書中に開示される化合物を、それらを必要とする患者に投与することにより、グラム陽性菌（メチシリン感受性黄色ブドウ球菌及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌）、グラム陰性菌（大腸菌、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ、肺炎桿菌）の両方、並びに真菌（カンジダ・アルビカンス）によって引き起こされる感染を治療する方法を提供する。本発明の化合物はまた、黄色ブドウ球菌によって形成されたバイオフィルムを阻害及び撲滅することも、予想外に見出されている。したがって、本開示は、黄色ブドウ球菌などであるがこれに限定されない微生物によって形成されるバイオフィルムを、本明細書中に開示される化合物と表面を接触させることにより、阻害又は撲滅する方法を提供する。本発明の化合物はまた、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ，cecal ligation and puncture）誘導性の死亡及び臓器機能不全に対してマウスを保護する上で、インビボでの優れた有効性を示した。本発明の化合物はまた、マウスマクロファージにおいてＨＭＧＢ１誘導性炎症に対して優れた活性を有することが予想外に見出され、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ－１９）におけるＶＥＧＦ発現を低下させ、化合物の連日腹腔内注射により、ＣＮＶ病変の平均サイズを、媒体（vehicle）のみで処置した対照マウスのＣＮＶ病変の平均サイズの約６０％に減少させることができた。したがって、本開示は、本明細書中に開示される化合物で対象を治療することによって、その治療を必要とする前記対象を、感染症又は感染に関連する障害から保護する方法を提供する。
【0006】
前述の簡単な概要は、本発明の特定の実施形態の特徴及び技術的利点について広く記載するものである。さらなる特徴及び技術的利点は、以下の発明の詳細な説明に記載される。本発明の特徴であると考えられる新規な特徴は、任意の添付の図面と関連させて考察する場合、本発明の詳細な説明からよりよく理解されるであろう。しかし、本明細書で提供する図面は、本発明を説明するのを助けるか、又は本発明の理解を発展させるのを手助けすることを意図しており、本発明の範囲の定義を意図するものではない。
すなわち本発明は、以下に関する、
１．式（VI）
（式中、
ｎ＝０～１
Ｒ＝ベンジル、置換ベンジル、
Ｒ１＝ＣＯＣＨ３、Ｎ－ジメチルマレイミド、
Ｒ２＝シクロヘキシル、ｐ－ニトロフェニル、ピペリジンニトロキシ、ピペリジン－Ｎ－ヒドロキシル、ｐ－メトキシフェニルである）
の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物、
２．滅菌注射用水性若しくは油性懸濁液、又は滅菌局所ゲル、軟膏若しくは水性スプレーに製剤される、上記１に記載の組成物、
３．抗炎症剤、又は抗菌剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、上記１に記載の組成物、
４．式（VI）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与し、それによって前記対象を治療することを含む、敗血症、敗血性ショック、毒血症、火傷又は創傷感染を治療するための上記１に記載の組成物の使用、
５．投与することが、約５．０ｍｇ～約１００ｍｇの式（VI）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与し、それによって前記患者を治療することを含む、上記４に記載の使用、
６．投与することが、約１０．０ｍｇ～約１０００ｍｇの式（VI）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与し、それによって前記患者を治療することを含む、上記４に記載の使用、
７．式（Ｖ）
（式中、
ｎ＝０～５
Ｒ＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３，Ｃ（Ｏ）－ピペリジンニトロキシ、Ｃ（Ｏ）－ピペリジンＮ－ヒドロキシル
Ｒ１＝アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、ピペリジンニトロキシル、ピペリジンＮ－ヒドロキシルである）
の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物、
８．滅菌注射用水性若しくは油性懸濁液、又は滅菌局所ゲル、軟膏若しくは水性スプレーに製剤される、上記７に記載の組成物、
９．抗炎症剤、又は抗菌剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、上記７に記載の組成物、
１０．敗血症、敗血性ショック、毒血症、火傷又は創傷感染を治療するための上記７に記載の組成物の使用であって、それを必要とする対象に、式（Ｖ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、前記使用、
１１．医薬組成物が、それを必要とする患者に対して、約５．０ｍｇ～約１００ｍｇの式（Ｖ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含み、それによって前記患者を治療する、又は医薬組成物が、それを必要とする患者に対して、約１０．０ｍｇ～約１０００ｍｇの式（Ｖ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含み、それによって前記患者を治療する、上記１０に記載の使用、
１２．式（II）
（式中、ｎ＝５～７である）
の化合物又は薬学的に許容されるその塩の有効量、及び、ＰＬＡ又はＰＬＧＡ微粒子を含む、薬学的に許容される媒体を含む組成物、
１３．滅菌注射用水性若しくは油性懸濁液に、又は滅菌局所眼用溶液として製剤される、上記１２に記載の組成物、
１４．抗炎症剤、又は抗菌剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、上記１２に記載の組成物、
１５．医薬組成物又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量での、眼の血管新生、眼の炎症を治療するための式（II）の組成物の使用、
１６．医薬組成物が、それを必要とする患者に対して、約５．０ｍｇ～約１００ｍｇの式（II）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含み、それによって前記患者を治療する、又は医薬組成物が、それを必要とする患者に対して、約１０．０ｍｇ～約１０００ｍｇの式（II）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含み、それによって前記患者を治療する、上記１５に記載の使用。
すなわち本発明は、以下に関する、
１．式（VI）
ｎ＝０～１
Ｒ＝ベンジル、置換ベンジル、
Ｒ１＝ＣＯＣＨ３、Ｎ－ジメチルマレイミド、
Ｒ２＝シクロヘキシル、ｐ－ニトロフェニル、ピペリジンニトロキシ、ピペリジン－Ｎ－ヒドロキシル、ｐ－メトキシフェニルである）
の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物、
２．滅菌注射用水性若しくは油性懸濁液、又は滅菌局所ゲル、軟膏若しくは水性スプレーに製剤される、上記１に記載の組成物、
３．抗炎症剤、又は抗菌剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、上記１に記載の組成物、
４．式（VI）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与し、それによって前記対象を治療することを含む、敗血症、敗血性ショック、毒血症、火傷又は創傷感染を治療するための上記１に記載の組成物の使用、
５．投与することが、約５．０ｍｇ～約１００ｍｇの式（VI）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与し、それによって前記患者を治療することを含む、上記４に記載の使用、
６．投与することが、約１０．０ｍｇ～約１０００ｍｇの式（VI）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与し、それによって前記患者を治療することを含む、上記４に記載の使用、
７．式（Ｖ）
ｎ＝０～５
Ｒ＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３，Ｃ（Ｏ）－ピペリジンニトロキシ、Ｃ（Ｏ）－ピペリジンＮ－ヒドロキシル
Ｒ１＝アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、ピペリジンニトロキシル、ピペリジンＮ－ヒドロキシルである）
の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物、
８．滅菌注射用水性若しくは油性懸濁液、又は滅菌局所ゲル、軟膏若しくは水性スプレーに製剤される、上記７に記載の組成物、
９．抗炎症剤、又は抗菌剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、上記７に記載の組成物、
１０．敗血症、敗血性ショック、毒血症、火傷又は創傷感染を治療するための上記７に記載の組成物の使用であって、それを必要とする対象に、式（Ｖ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、前記使用、
１１．医薬組成物が、それを必要とする患者に対して、約５．０ｍｇ～約１００ｍｇの式（Ｖ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含み、それによって前記患者を治療する、又は医薬組成物が、それを必要とする患者に対して、約１０．０ｍｇ～約１０００ｍｇの式（Ｖ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含み、それによって前記患者を治療する、上記１０に記載の使用、
１２．式（II）
の化合物又は薬学的に許容されるその塩の有効量、及び、ＰＬＡ又はＰＬＧＡ微粒子を含む、薬学的に許容される媒体を含む組成物、
１３．滅菌注射用水性若しくは油性懸濁液に、又は滅菌局所眼用溶液として製剤される、上記１２に記載の組成物、
１４．抗炎症剤、又は抗菌剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、上記１２に記載の組成物、
１５．医薬組成物又は薬学的に許容されるその塩の治療有効量での、眼の血管新生、眼の炎症を治療するための式（II）の組成物の使用、
１６．医薬組成物が、それを必要とする患者に対して、約５．０ｍｇ～約１００ｍｇの式（II）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含み、それによって前記患者を治療する、又は医薬組成物が、それを必要とする患者に対して、約１０．０ｍｇ～約１０００ｍｇの式（II）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含み、それによって前記患者を治療する、上記１５に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【0007】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１又は２以上を参照することにより、よりよく理解され得る。
【図1】マウス内毒素血症及び敗血症モデルにおける本発明のＴＬＲ４アンタゴニスト化合物１の評価結果を示すグラフであり、化合物１が、大腸菌による致死的グラム陰性敗血症からマウスを保護することを示している。
【図2】盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）モデルにおける本発明のＴＬＲ４アンタゴニスト化合物４の評価の結果を示すグラフであり、化合物４が、ＣＬＰ誘導性複数菌敗血症及び死亡からマウスを保護することを示している。
【図3】化合物４での治療において、本発明の化合物が主要な病理学的変化を逆転し、組織が擬似群に似ていることを実証する、主要臓器の組織病理学である。
【図4】本発明の化合物４が、ＣＬＰマウスにおいてインビボで炎症性サイトカインを効果的にダウンレギュレートすることを実証した。
【図5】盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）モデルにおける本発明の化合物１５及び２５の評価の結果を示すグラフであり、両方の化合物が、ＣＬＰ誘導性複数菌敗血症及び死亡からマウスを保護することを示している。
【図6】滲出型ＡＭＤのレーザー誘導性ＣＮＶマウスモデルにおける本発明のＴＬＲ４アンタゴニスト化合物２の評価を示す。化合物２は、陽性対照と比較して、脈絡膜血管新生を約６０％減少させた。
【図7】本発明の一連の化合物がＴＬＲ４受容体に効果的に結合し、ＴＬＲ２受容体には結合しないことを示す。
【図8(A-B)】は、本発明の化合物が、ヒト単球における炎症性メディエーターのＬＰＳ誘導性産生を阻害したことを実証する。
【図9】本発明の化合物が、マウス骨髄由来マクロファージにおける炎症メディエーター（ＴＮＦ－α）のＨＭＧＢ１誘導性産生を阻害することを実証する。
【図10】本発明の化合物が、マウスマクロファージにおける炎症メディエーター（ＴＮＦ－α、ｉ－ＮＯＳ）のＨＭＧＢ１誘導性産生を阻害し、Ｍ２バイオマーカーＣＸＣＲ４をアップレギュレートすることを実証する。
【図11】本発明の化合物が、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０を産生することを示す。
【図12】本発明の化合物（１及び２）がＡＲＰＥ－１９細胞におけるＶＥＧＦのＨＭＧＢ１誘導性産生を減少させたことを示す。
【図13】本発明の化合物が広域スペクトル抗菌活性を有することを示す。
【図14】本発明の化合物が、バイオフィルム形成を阻害したことを実証する。
【図15】本発明の化合物の広域スペクトル抗菌活性が、細胞膜の破壊によるものであることを示す。
【図16】本発明の化合物が、血漿タンパク質、血清タンパク質に結合しないことを実証する。
【図17】本発明の化合物が線維芽細胞に対して毒性でないことを示す。
【図18】化合物１１を調製するための合成スキームを示す。
【図19】化合物２２～２３を調製するための合成スキームを提供する。
【図20】化合物２４～２５を調製するための合成スキームを提供する。
【発明を実施するための形態】
【0008】
グラム陰性菌によって引き起こされる敗血症において、リポ多糖（ＬＰＳ，lipopolysachharide）は、シグナル伝達受容体であるＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）を介して免疫系を活性化し、過剰炎症の原因となる炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＲＯＳ）の産生プロセスを開始する。したがって、ＴＬＲ又は下流シグナル伝達経路を介した活性化のいずれかをブロックして、炎症分子の嵐を阻害するアンタゴニストを開発しようとする研究者もいる。しかし、おそらく臨床試験設計が不十分であるという理由で臨床試験に失敗した、ＬＰＳアナログであるエリトラン（Eritoran）を除いて、標的分子は、実験的研究及び前臨床的研究以上には進展していない（Opal, S. M.; Laterre, P.; Francois, B.; et al., Effect of eritoran, an antagonist of md2-tlr4, on mortality in patients with severe sepsis: The access randomized trial. JAMA 2013, 309, 1154-1162）。大部分の他の種類の化合物の根底にある作用機序は完全には理解されていない（Leon, Carlos G.; Tory, Rita; Jia, Jessica; Sivak, Olena; Wasan, Kishor M. a.Pharmaceutical Research (2008), 25(8), 1751-1761；Savva Athina; Roger Thierry From Frontiers in Immunology (2013), 4387, Language: English, Database: MEDLINE）。
【0009】
本発明の化合物は、相乗的に炎症性微生物感染を阻害し、敗血症（sepsis）、毒血症（septicemia）及び敗血症性ショック（septic shock）を治療する治療可能性を有するIL-10などのM2バイオマーカーをアップレギュレートすることができる低分子である。
【0010】
増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ，proliferative diabetic retinopathy）、滲出性加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）及び未熟児網膜症（ＲＯＰ，retinopathy of prematurity）によって例示されるような後眼部血管新生疾患は、増大するはかりしれない健康に対する脅威であり、有効な新規治療法を必要とする。ＰＤＲに関連する網膜血管新生は、労働年齢の成人における失明の主要な原因である。脈絡膜血管新生（ＣＮＶ，choroidal neovascularization）は、米国において毎年２００，０００例の新規の滲出性ＡＭＤ症例の原因であり、この新生血管病態は、非第３世界の国々における法的盲の主要原因となっている。２０２０年のＡＭＤ患者の推定数は１億９６００万人であり、２０４０年には２億８８００万人に増加するとされている（Wong, W. L.; Su, X.; Li, X.; Cheung, C. M. G.; Klein, R.; Cheng, C.-Y.; Wong, T. Y., Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health 2014, 2, e106-e116）。ＲＯＰに関連する病理学的血管新生は、７歳未満の小児における失明の主な原因である（Harrell, S. N.; Brandon, D. H., Retinopathy of Prematurity: The Disease Process, Classifications, Screening, Treatment, and Outcomes. Neonatal Network 2007, 26, 371-378）。
【0011】
複数の証拠は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ４）シグナル伝達が、酸化脂質、リポフスチン（lipofuscin）による、及びドルーゼン成分によるＡＭＤ眼を含む、網膜疾患における病理学的変化と関連し得ることを示唆している（Cho, Y.; Wang, J. J.; Chew, E. Y.; Ferris, F. L.; Mitchell, P.; Chan, C.-C.; Tuo, J., Toll-like Receptor Polymorphisms and Age-Related Macular Degeneration: Replication in Three Case-Control Samples. Investigative Ophthalmology & Visual Science 2009, 50, 5614-5618）。いったん活性化されると、ＴＬＲ４は、ＴＮＦ－α、インターロイキン－１β、及び他の炎症誘発性メディエーターの放出などの複数の機序により、ＡＭＤの病因に寄与する可能性がある。ＴＬＲ４活性化は、Ｗｎｔシグナル伝達を抑制し、成長因子の発現、分泌を低下させ、酸化ストレスに応答して光受容体の死を増加させ、加えて光受容体の外側セグメントの酸化的損傷を引き起こす可能性がある。ＴＬＲ４は、ＭＡＰＫ、ＮＦκ－β及びＪａｋ１／Ｓｔａｔ１を含むいくつかの炎症関連シグナル伝達経路に直接作用し、カスパーゼ－３、ニューロンｉＮＯＳ及びＥＲＫ１／２、ＪＮＫ１／２及びｐ３８を介して、神経毒性を媒介することが示されている。興味深いことに、網膜炎症における内因性光受容体タンパク質によるＴＬＲ４媒介性ミクログリア細胞活性化は、網膜細胞死を悪化させる可能性がある。最後に、虚血性神経組織における高移動度群ボックス１の放出は、網膜血管新生に寄与するＴＬＲ４依存性応答を開始することが示されている（He, C.; Sun, Y.; Ren, X.; Lin, Q.; Hu, X.; Huang, X.; Su, S.-B.; Liu, Y.; Liu, X., Angiogenesis mediated by toll-like receptor 4 in ischemic neural tissue. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2013, 33(2):330-8）。
【0012】
したがって、炎症のための、特に、萎縮型及び滲出型両方のＡＭＤ病因のための、より効果的な治療の必要性が存在する。したがって、本明細書に記載の化合物及び方法は、ＴＬＲ４活性の阻害が、ＡＭＤ及び他の網膜疾患において治療的価値があることを実証した。本発明の化合物は、血管新生、炎症を相乗的に阻害し、食作用を促進することができる、ＡＭＤを治療する治療可能性を有する低分子である。
【0013】
しかしながら、本開示の前には、萎縮型／滲出型ＡＭＤ、糖尿病性網膜症、又は任意の慢性眼炎症などの眼の適応症の炎症及び血管新生を阻害するためのＴＬＲ４アンタゴニストとしての、キトヘキサオース（化合物１）、キトヘパトース（化合物２）及びキトオクタオース（化合物３）及びその誘導体の使用について発表された報告はないと思われる。
【0014】
一実施形態では、本開示の原理は、式（Ｉ）
【0015】
【化1】
Ｒ＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１、アルキル、ベンジル、置換ベンジル、
Ｒ１＝ＣＨ３、アルキル、ピペリジンニトロキシル
Ｒ２＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｒ１、又は
次の式のアシルオキシアルキルカルバメート、
Ｒ２＝Ｃ（Ｏ）ＯＣＨＲ３ＯＣ（Ｏ）ＯＲ４、ピペリジンニトロキシル
Ｒ３＝Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、イソプロピル
Ｒ４＝最適に置換されたアルキル基
Ｘ＝Ｏ、ＮＨ、Ｓ
Ｒ５＝アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクロアルキル、ピペリジンニトロキシル、ピペリジンＮ－ヒドロキシルアミン
ｎ＝０～７である）
の化合物を提供する。
【0016】
別の実施形態では、本開示は、式（II）
【0017】
【化2】
の化合物を提供する。
【0018】
本開示のさらなる化合物は、以下に示す以下の構造を含む：
【0019】
【化3】
【0020】
本開示の化合物（２、３）は、マウス骨髄由来マクロファージ及びヒト単球におけるＬＰＳ及びＨＭＧＢ１誘導性炎症バイオマーカー（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６）を阻害することにおいて、予想外に強力な活性を示した。化合物１及び２は、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるＶＥＧＦの産生を減少させる。化合物２は、滲出型ＡＭＤのレーザー誘導性マウスモデルにおいて、ＣＮＶサイズの有意な減少を示した。本発明の化合物（１～３）は、従来技術で利用可能な知識と関連して、図１９に示す合成スキームを用いて合成することができ、必要に応じて改変することができる。
【0021】
別の実施形態では、本発明は、式（III）
【0022】
【化4】
ｎ＝０～５
Ｒ＝ＣＯＲ１
Ｒ１＝ＣＨ３、アルキルである）
の化合物を提供する。
【0023】
本発明のさらなる化合物は、以下に示す以下の構造を含む：
【0024】
【化5】
【0025】
本発明の化合物（４）は、ヒト単球におけるＬＰＳ誘導性炎症バイオマーカー（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６）の阻害において、予想外に優れた活性を示した。図２～４に示すように、化合物４は、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内（IV）投与で、盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）敗血症モデルのマウスを臓器機能不全及び死亡に対して保護するのに優れた有効性を実証し、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６などの炎症性サイトカインを統計学的に有意にダウンレギュレートした。
【0026】
本発明の化合物（４～６）は、Mohamed R. E et al, Carbohydrate research, 2001, 331, 129-142に記載の報告された手順を用いて、合成することができる。
【0027】
別の実施形態では、本発明は、式（IV）
【0028】
【化6】
（式中、
Ｒ＝Ｈ及びＣ（Ｏ）Ｒ１
Ｒ１＝ピペリジンニトロキシル又はピペリジンＮ－ヒドロキシルアミン
ｎ＝０～７である）
の化合物を提供する。
【0029】
本発明のさらなる化合物は、以下に示す以下の構造を含む：
【0030】
【化7】
【0031】
【化8】
【0032】
本発明の化合物（１１）は、ヒト単球におけるＬＰＳ誘導性炎症バイオマーカー（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６）の阻害において、予想外に優れた活性を示した。したがって、化合物は、抗炎症性化合物としての用途が見出される。本発明の化合物（７～１１）は、従来技術で利用可能な知識と組み合わせて、図１８に示す合成スキームを用いて合成することができる。
【0033】
別の実施形態では、本発明は、式（Ｖ）
【0034】
【化9】
ｎ＝０～５
Ｒ＝Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３，Ｃ（Ｏ）－ピペリジンニトロキシ、Ｃ（Ｏ）－ピペリジンＮ－ヒドロキシル
Ｒ１＝アルキル、シクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、ピペリジンニトロキシル、ピペリジンＮ－ヒドロキシルである）
の化合物を提供する。
【0035】
本発明のさらなる化合物は、以下に示す以下の構造を含む：
【0036】
【化10】
【0037】
本発明の化合物（１２～２５）は、ヒト単球におけるＬＰＳ誘導性炎症バイオマーカー（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６）の阻害を示し、抗炎症性サイトカインであるＭ２バイオマーカーＩＬ－１０をアップレギュレートさせた。化合物１２はまた、グラム陰性菌、グラム陽性菌及び真菌に対して広域スペクトルの抗菌活性を示した。化合物１２は、ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡによるバイオフィルム形成を予想外に阻害した。化合物２５は、静脈内に投与した場合（１０ｍｇ／ｋｇ用量）、敗血症のＣＬＰマウスモデルにおいて高い生存率、臓器保護を実証した。したがって、本明細書に記載の化合物は、いくつかの実施形態では抗炎症分子としての用途を見出す。いくつかの実施形態では、化合物は、抗感染性又は抗菌性である。
【0038】
【化11】
ｎ＝０～１
Ｒ＝ベンジル、置換ベンジル、
Ｒ１＝ＣＯＣＨ３、Ｎ－ジメチルマレイミド、
Ｒ３＝シクロヘキシル、ｐ－ニトロフェニル、ピペリジンニトロキシ、ピペリジン－Ｎ－ヒドロキシル、ｐ－メトキシフェニルである。
【0039】
本発明のさらなる化合物は、以下に示す以下の構造を含む：
【0040】
【化12】
【0041】
本発明の化合物は、ヒト単球におけるＬＰＳ誘導性炎症バイオマーカー（ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６）の阻害を示し、ＩＬ－１０をアップレギュレートさせた。化合物１５はまた、グラム陰性菌、グラム陽性菌及び真菌に対して広域スペクトルの抗菌活性を示した。化合物１５は、ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡによるバイオフィルム形成を予想外に阻害した。化合物１５は、静脈内に投与した場合（５．０ｍｇ／ｋｇ用量）、敗血症のＣＬＰマウスモデルにおいて高い生存率、臓器保護を実証した。本発明の化合物は、従来技術で利用可能な知識と関連して本発明者らが開発した、図１９に示す合成スキームを用いて合成することができる。
【0042】
さらに、特定の実施形態は、本発明による化合物の薬学的に許容される塩を含む。薬学的に許容される塩は、アレルギー反応又は毒性などの不適当な望ましくない作用を伴うことなく、疾患を治療するのに適切である、本発明による化合物の可溶性又は分散性形態を含むが、これらに限定されない。代表的な薬学的に許容される塩としては、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩又はリン酸塩などの酸付加塩、及びリチウム、ナトリウム、カリウム又はアルミニウムなどの塩基付加塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【0043】
製剤
いくつかの実施形態では本開示の化合物は、非経口製剤に組み込まれる。本明細書で使用する「非経口」という用語には、種々の注入技術を用いた皮下、静脈内、筋肉内及び動脈内注射が含まれる。本明細書で使用する動脈内及び静脈内注射には、カテーテルによる投与が含まれる。特定の適応症に好ましいのは、内毒素血症又は敗血症の治療のための静脈内注射などの、治療する組織又は器官へ迅速なアクセスができる投与方法である。
いくつかの実施形態では本開示の化合物は、非経口製剤に組み込まれる。本明細書で使用する「非経口」という用語には、種々の注入技術を用いた皮下、静脈内、筋肉内及び動脈内注射が含まれる。本明細書で使用する動脈内及び静脈内注射には、カテーテルによる投与が含まれる。特定の適応症に好ましいのは、内毒素血症又は敗血症の治療のための静脈内注射などの、治療する組織又は器官へ迅速なアクセスができる投与方法である。
【0044】
本開示の化合物は、標的細胞のＬＰＳ活性化を適切に阻害する用量で投与し、一般に、これらの用量は、好ましくは５０～３０００ｍｇ／患者、又は１００～２５００ｍｇ／患者、又は２００～２０００ｍｇ／患者、又は５００～１０００ｍｇ／患者、又は７５０～１０００ｍｇ／患者であり、より好ましくは、５００～７５０ｍｇ／患者、最も好ましくは２５０～５００ｍｇ／患者である。用量は、好ましくは、１日１回、２８日間、より好ましくは、１日２回、１４日間、又は最も好ましくは、１日３回、７日間である。
【0045】
活性成分を含有する医薬組成物は、意図した投与方法に適切な任意の形態であり得る。
【0046】
本発明の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適切な賦形剤と混合して、活性物質を含有する。このような賦形剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアガムなどの懸濁化剤、並びに天然に存在するリン脂質（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）などの分散剤又は湿潤剤が挙げられる。水性懸濁液はまた、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エチル又はｐ－ヒドロキシ安息香酸ｎ－プロピルなどの１又は２以上の防腐剤を含有してもよい。
【0047】
本発明の医薬組成物は、好ましくは、滅菌注射用水性又は油性懸濁液のような、滅菌注射用製剤の形態である。この懸濁液は、前述の適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて、周知の技術に従って製剤することができる。滅菌注射用製剤はまた、１，３－ブタンジオール溶液などの、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁液であってもよく、又は凍結乾燥粉末として調製してもよい。使用することができる許容される媒体及び溶媒の中には、水、リンガー溶液及び等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌不揮発性油は、従来、溶媒又は懸濁媒体として使用することができる。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の低刺激性不揮発性油を使用することができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸も同様に、注射剤の調製に使用することができる。
【0048】
いくつかの実施形態では、製剤はＰＬＡ又はＰＬＧＡ微粒子を含み、さらにＮａ２ＨＰＯ４、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリソルベート８０、塩化ナトリウム及び／又はエデト酸二ナトリウムと混合することができる。
【0049】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び意図したレシピエントの血液と製剤を等張とする溶質を含有し得る水性及び非水性の等張滅菌注射用溶液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量又は複数用量の密封容器、例えば、アンプル及びバイアルで提供されてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水を加えるだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存してもよい。即時注射溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末から調製することができる。
【0050】
しかし、任意の特定の患者の具体的な用量レベルは、使用する特定の化合物の活性、治療を受ける個体の年齢、体重、全般的健康状態、及び性別、投与時間及び投与経路、排泄率、以前に投与された他の薬物、並びに治療を受けている特定の疾患の重症度を含む種々の要因に依存することが理解されるであろう。
【0051】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物はまた、約８０％～約９９．５％、好ましくは約９０又は９５％～約９８．５％の適合性のある非水性の薬学的に許容される局所媒体を含有する。一部の媒体は、本開示のために本明細書に組み込まれる米国特許第４，６２１，０７５号に記載されている。これらの媒体は水を含まないことが好ましいが、本発明の組成物は、所望のゲルの形成に有意な悪影響を与えることなく、最大で約５％の水を含有することができる。これらの非水性媒体成分はまた、製薬業界において周知であり、これらの非水性媒体成分としては（これらに限定されるものではないが）、炭化水素油及びワックス、ラノリン及びラノリン誘導体、シリコーン油、モノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリドエステル、脂肪族アルコール、脂肪酸アルキル及びアルケニルエステル、ジカルボン酸アルキル及びアルケニルジエステル、多価アルコール及びそれらのエーテル及びエステル誘導体、ワックスエステル及び蜜蝋誘導体などの短鎖アルコール及びケトン及びエモリエントが挙げられる。好ましい媒体は、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びこれらの成分の混合物を組み込む。特に好ましい媒体としては、エタノール、ｎ－プロパノール及びブタノール、特にエタノールが挙げられる。これらの好ましい溶媒はまた、ジイソプロピルセバケート、イソプロピルミリステート、メチルラウレート、シリコーン、グリセリン及びこれらの成分の混合物などの他の成分と組み合わせて、本発明にも有用な非水性媒体を提供することもできる。これらの追加成分のうち、ジイソプロピルセバケートが特に有用である。実際、好ましい媒体としては、約４：１～約１：４の重量比のエタノールとジイソプロピルセバケートの混合物が挙げられる。好ましい媒体は、約１５％～約３５％のジイソプロピルセバケート及び約６５％～約８５％のエタノールを含有する。
【0052】
本発明の組成物は、当該分野で確立された使用レベルで、局所医薬組成物の製剤において慣用的に使用する、適合性のある補助成分をさらに含有してもよい。これらの補助成分としては、薬学的活性成分（補助的抗菌成分又は抗炎症成分、例えば、ステロイドなど）、又は製剤それ自体を増強するために使用する成分（賦形剤、染料、芳香剤、皮膚浸透助剤、安定剤、防腐剤、及び抗酸化剤など）を挙げてよいが、これらに限定されない。本発明の組成物は、従来のゲル化剤の存在を必要とせずにゲル形成が可能であるので、そのような剤は好ましくは含まれない。このような剤の例としては、B.F.Goodrich Chemicals社、Cleveland、Ohioから市販されているCarbopol化合物などの、薬学的に許容される酸性のカルボキシポリマーが挙げられる。
【0053】
本発明のゲル状組成物は、上記の成分の従来の混合によって製剤することができる。ゲル形成は、使用する成分に応じて、混合後約２分～約１６時間以内に起こる。
【0054】
一実施形態では、一般的なトリガースプレー容器にパッケージ化されたクリーム、ローション又はゲルは、クリーム常用量を容器から噴霧した後に、目的の領域にしっかりと付着する。これは、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９８／５１２７３に記載されている。したがって、一態様では、本開示は、本明細書に記載の化合物を単独で又は組み合わせて含む、局所塗布用の医薬用非エアロゾルスプレー組成物を提供する。化合物は、０．１重量％～２０重量％、又はいくつかの実施形態では１重量％～１５重量％、又はいくつかの実施形態では２重量％～１０重量％の範囲の量のクリーム、ローション又はゲルで存在する。本発明で使用する化合物は、中性親水性マトリックスクリーム、ローション又はゲルに組み込むことができる。第１の好ましい実施形態では、局所塗布用のクリーム又はローションマトリックスは、ポリオキシエチレンアルキルエーテルを特徴とする。第２の好ましい実施形態では、ゲルは、架橋アクリル酸の高分子量ポリマーを特徴とする。ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、主に局所医薬製剤及び化粧品において、油中水型及び水中油型エマルション用の乳化剤として広く使用される、非イオン性界面活性剤である。これは、本発明において、トリガー噴霧可能な非エアロゾルクリーム又はローションのベースとして特徴付けられる。ゲル形成に使用する架橋アクリル酸ポリマー（カルボマー）は、本発明の別の目的である。
【0055】
したがって、非エアロゾルスプレー用の特に適切なベースは、１～２５％のポリオキシエチレンアルキルエーテル、３～４０％の保湿剤及び０．１～１％の防腐剤（１又は複数）を含有するクリーム又はローションであり、１００％に達するまでの残りは精製水である。適切には、ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル（Ａｔｌａｓ Ｇ－３７１３）、ポリオキシル２セチルエーテル（セテス－２）、ポリオキシル１０セチルエーテル（セテス－１０）、ポリオキシル２０セチルエーテル（セテス－２０）、ポリオキシル４ラウリルセチルエーテル（ラウレス－４）、ポリオキシル２３ラウリルセチルエーテル（ラウレス－２３）、ポリオキシル２オレイルエーテル（オレス－２）、ポリオキシル１０オレイルエーテル（オレス－１０）、ポリオキシル２０オレイルエーテル（オレス－２０）、ポリオキシル２ステアリルエーテル（ステアレス－２）、ポリオキシル１０ステアリルエーテル（ステアレス－１０）、ポリオキシル２０ステアリルエーテル（ステアレス－２０）及びポリオキシル１００ステアリルエーテル（ステアレス－１００）からなる群から選択される、１つ又は任意の組み合わせであり得る。適切な保湿剤は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ソルビトール又はグリセリンからなる群から選択される１つ又は任意の組み合わせであり得る。適切な防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びその塩又はフェニルエチルアルコールからなる群から選択される１つ又は任意の組み合わせである。
【0056】
非エアロゾルスプレー用の別の適切なベースは、０．１～２．０％のカルボマー、０．１～１％のアルカリ溶液、３～４０％の保湿剤及び０．１～１％の防腐剤又は防腐剤を含有するゲルであり、１００％に達するまでの残りは精製水である。適切には、カルボマーは、カルボマー９３４、カルボマー９４０又はカルボマー９４１からなる群から選択される１つ又は任意の組み合わせであり得る。ゲル用の適切な湿潤剤、防腐剤及び精製水は、クリーム又はローションの場合と同じである。他の噴霧可能な製剤は、米国特許出願公開第２００５／００２５５０４８号に記載されており、これは参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0057】
眼科用製剤（局所及び硝子体内投与）：
本発明の化合物は、典型的には、眼科用組成物全体の小さなパーセンテージを占める。本発明の化合物は、典型的には、眼科用組成物の少なくとも０．０１ｗ／ｖ％、より典型的には少なくとも０．１ｗ／ｖ％、さらにより典型的には少なくとも０．５ｗ／ｖ％である。本発明の化合物はまた、典型的には、眼科用組成物の５．０ｗ／ｖ％以下、さらにより典型的には３．０ｗ／ｖ％以下、さらにより典型的には１．５ｗ／ｖ％以下である。
本発明の化合物は、典型的には、眼科用組成物全体の小さなパーセンテージを占める。本発明の化合物は、典型的には、眼科用組成物の少なくとも０．０１ｗ／ｖ％、より典型的には少なくとも０．１ｗ／ｖ％、さらにより典型的には少なくとも０．５ｗ／ｖ％である。本発明の化合物はまた、典型的には、眼科用組成物の５．０ｗ／ｖ％以下、さらにより典型的には３．０ｗ／ｖ％以下、さらにより典型的には１．５ｗ／ｖ％以下である。
【0058】
眼科用組成物はまた、典型的には、化合物を眼に送達するための適切な眼科用媒体を含む。眼科用組成物は、眼への局所又は硝子体内適用のために構成することができ、眼科用媒体は、適用方法に応じて異なる可能性があると考えられている。一般に、局所適用又は硝子体内適用のいずれかのために、眼科用組成物は水性であり、実質的な量の水を含むことが好ましい。典型的には、組成物は少なくとも３０ｗ／ｖ％、より典型的には少なくとも８０ｗ／ｖ％、さらにより典型的には少なくとも９０ｗ／ｖ％の水（例えば精製水）を含む。
【0059】
硝子体内に適用するために、特に眼科用組成物がシリンジで眼に適用される場合、眼科用組成物は、水及び本発明の化合物のみを含むか又は本質的にそれからなることができる。持続的薬物放出のために、本発明の化合物のＰＬＧＡ又はＰＬＡミクロ粒子製剤は、Shelke et al ［Drug Deliv Transl Res. 2011, (1): 76-90］に記載のように使用する。もちろん、眼科用組成物は、Ｎａ２ＨＰＯ４、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリソルベート８０、塩化ナトリウム及びエデト酸二ナトリウムなどの他の成分も同様に含むことができる。
【0060】
特に、水が被検化合物と組み合わされた直後にその局所適用を行うか、又は組成物が汚染を防止する方法でパッケージされている場合には、媒体は、局所適用のために水のみであるか又は実質的に水からなる場合もあり得る。しかし、眼科用組成物を長期間（例えば、複数日にわたり１日１回、２回、３回又はそれ以上、点眼薬からの滴として）に複数回投与する眼科用組成物として適用する場合、眼科用組成物は、抗菌剤又は防腐剤又は系、界面活性剤、緩衝剤、等張剤、抗酸化剤、粘度改質剤、これらの組み合わせなどの追加の成分を含む可能性が高いであろう。
【0061】
局所適用のために、本発明の組成物は、典型的には、抗菌剤を含む。可能性のある抗菌剤としては、過酸化水素、塩化ベンザルコニウムなどの塩素含有防腐剤又はその他が挙げられるが、これらに限定されない。しかし、好ましい態様によれば、本発明の組成物は、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ、benzalkonium chloride）などの非高分子第四級抗菌剤
を完全に又は実質的に含まない。医薬組成物中の最も好ましい抗菌剤としては、高分子第四級アンモニウム化合物が挙げられる。
を完全に又は実質的に含まない。医薬組成物中の最も好ましい抗菌剤としては、高分子第四級アンモニウム化合物が挙げられる。
【0062】
本明細書中で使用される場合、眼科用組成物の成分に言及する際の「実質的に含まない」という句は、眼科用組成物が、その特定の成分を全く欠いていてもよいし、又はその特定の成分をごくわずかのみ含むと考えられるということを意味する。
【0063】
本発明の組成物において有用な高分子第四級アンモニウム化合物は、抗菌効果を有し、眼科的に許容される化合物である。このタイプの好ましい化合物は、米国特許第３，９３１，３１９号；第４，０２７，０２０号；第４，４０７，７９１号；第４，５２５，３４６号；第４，８３６，９８６号；第５，０３７，６４７号及び第５，３００，２８７号；並びにＰＣＴ出願公開ＷＯ９１／０９５２３（Dziaboら）に記載されており、これらは参照により本明細書に明示的に組み込まれる。最も好ましい高分子アンモニウム化合物は、２，０００～３０，０００の数平均分子量を有するポリクオタニウム１、あるいはPOLYQUAD（商標）又はONAMERM（商標）として知られている化合物である。好ましくは、数平均分子量は３，０００～１４，０００である。
【0064】
高分子第四級アンモニウム化合物は、一般に、懸濁液の約０．００００１ｗ／ｖ％より大きい、より典型的には約０．０００３ｗ／ｖ％より大きい、さらにより典型的には約０．０００７ｗ／ｖ％より大きい量で、本発明の懸濁液中で使用する。さらに、高分子第四級アンモニウム化合物は、一般に、組成物の約３ｗ／ｖ％未満、より典型的には約０．００３ｗ／ｖ％未満、さらにより典型的には約０．００１５ｗ／ｖ％未満の量で、本発明の組成物中に使用する。
【0065】
本発明の組成物の抗菌剤は、追加的に又は代替的に、ボレート／ポリオール錯体系などの抗菌系を含むことができる。本明細書で使用される「ボレート」という用語は、ホウ酸、ホウ酸塩、ホウ酸誘導体及び他の薬学的に許容されるボレート、又はそれらの組み合わせを意味する。最も適切なものは、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム、ホウ酸カルシウム、ホウ酸マグネシウム、ホウ酸マンガン、及び他のホウ酸塩である。ボレートは、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール及びマンニトールなどのポリオールと相互作用して、ボレートポリオール錯体を形成する。このような錯体のタイプ及び比率は、互いに対してトランス立体配置ではない、隣接炭素原子上のポリオールのＯＨ基の数に依存する。ポリオール及びボレートの成分の重量／体積百分率には、錯体の一部としてであってもそうでなくても、それらの量が含まれることを理解されたい。
【0066】
本明細書で使用する場合、「ポリオール」という用語は、互いに対してトランス立体配置ではない２つの隣接する炭素原子それぞれの上に、少なくとも１つのヒドロキシル基を有する任意の化合物を含む。得られる錯体が水溶性で薬学的に許容される限り、ポリオールは直鎖又は環状、置換又は非置換、又はそれらの混合物であり得る。このような化合物の例としては、糖、糖アルコール、糖酸及びウロン酸が挙げられる。好ましいポリオールは、マンニトール、グリセリン、キシリトール、ソルビトール及びプロピレングリコールを含むが、これらに限定されない糖、糖アルコール及び糖酸である。
【0067】
使用する場合、ボレート／ポリオール錯体抗菌系（すなわち、ボレートとポリオールが一緒になっている）は、典型的には、組成物の少なくとも０．０５ｗ／ｖ％、より典型的には少なくとも０．５ｗ／ｖ％、場合によっては少なくとも１又は少なくとも１．２ｗ／ｖ％を構成し、また典型的には組成物の５ｗ／ｖ％未満、より典型的には２．２ｗ／ｖ％未満、場合によっては１．６ｗ／ｖ％未満を構成する。組成物中のボレート対ポリオール比（重量対重量比）は、典型的には１対１～１対１０であり、より典型的には１対２～１対４（例えば、約１対３）である。
【0068】
チロキサポール、ポリソルベート－８０及びポリオキシル硬化ヒマシ油は、好ましい界面活性剤である。チロキサポールは非常に好ましい界面活性剤である。使用する場合、界面活性剤は、典型的には、組成物の少なくとも０．０１ｗ／ｖ％、より典型的には少なくとも０．０２５ｗ／ｖ％、場合によっては少なくとも０．１ｗ／ｖ％の濃度で存在し、また典型的には組成物の５ｗ／ｖ％未満、より典型的には２．０ｗ／ｖ％未満、場合によっては１．０ｗ／ｖ％未満の濃度である。
【0069】
局所適用に使用する本発明の組成物は、典型的には、眼に適合するように処方する。眼に直接適用することを意図した眼科用組成物は、眼に適合するｐＨ及び等張性を有するように製剤する。組成物は、典型的には、４～９、好ましくは５．５～８．５、最も好ましくは５．５～８．０の範囲のｐＨを有する。特に所望のｐＨ範囲は６．０～７．８、及びより具体的には６．４～７．６である。組成物は、２００～４００又は４５０ミリオスモル／キログラム（ｍＯｓｍ／ｋｇ）、より好ましくは２４０～３６０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する。
【0070】
本発明の好ましい組成物は、複数用量眼科用組成物であり、例えば、その組成物は点眼薬中にあり、眼に局所的に１日１回、２回、３回又はそれ以上の回数で１又は２滴以上の点眼液として投与することができる。その場合、組成物は、好ましくは、ＵＳＰ（米国薬局方）の保存効力要件並びに水性医薬組成物の他の保存効力基準を満たすのに十分な抗菌活性を有する。
【0071】
米国及び他の国／地域における複数用量の点眼液のための保存効力基準は、以下の表に記載されている：
【0072】
【表1】
【0073】
欧州薬局方には２つの保存効力基準「Ａ」及び「Ｂ」がある。
【0074】
ＵＳＰ２７について上記に記述した基準は、ＵＳＰの前の版、特にＵＳＰ２４、ＵＳＰ２５及びＵＳＰ２６に記述されている要件と実質的に同一である
【0075】
追加の利点として、本発明のＴＬＲ４アンタゴニスト化合物を含有するこれらの眼科用組成物は、眼への局所適用に適している。
【0076】
本明細書に記載の製剤はまた、上記の抗菌剤、鎮痛剤などであってこれらに限定されるものではないが、追加の活性成分を含有してもよい。
【0077】
そのようなものであるから、本明細書に記載の化合物及び製剤は、ＡＭＤ、敗血症及び重篤な敗血症、ＳＩＲＳ及び敗血症性ショックなどを含むが、これらに限定されない種々の眼炎症性疾患の治療に使用を見出す。この方法は、本明細書に記載の有効量の抗菌組成物及び抗炎症組成物を、それを必要とする患者に投与して疾患又は障害を治療することを含む。そのような化合物の医学的使用は、敗血症、新生児敗血症、毒血症、敗血症性ショック、火傷及び創傷、感染性心内膜炎、バイオフィルム阻害、眼感染症、眼炎症、眼血管新生、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、ブドウ膜炎、関節リウマチ（ＲＡ）、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、慢性閉塞性肺疾患、気管支肺異形成症、発熱症候群、悪液質、乾癬、自己免疫疾患、心臓病、網膜芽腫、がん、及び／又は炎症、免疫調節及び微生物感染に関連する任意の障害の治療及び／又は管理のためのものである。
［実施例］
［実施例］
【0078】
実施した実験及び達成した結果を含む以下の実施例は、例証の目的のためにのみ提供し、本発明を限定するものと解釈するべきではない。
【実施例1】
【0079】
本発明の一連の化合物はＴＬＲ４受容体に効果的に結合し、ＴＬＲ２受容体には結合しない：
ＥＬＩＳＡプレートを、ヒト単球溶解物（市販のLeukoPak血液サンプルから単離したもの）でコートし、続いて図６に示す一連の化合物（１０μＭ）でコートした。次いでこれをヒト単球溶解物と共にインキュベートし、次いで抗ＴＬＲ４及び抗ＴＬＲ２抗体でプローブした。抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ陽性対照を用いてプレートを展開した。化合物１～３は、ＴＬＲ４受容体に効果的に結合し、ＴＬＲ２受容体には結合しない。より大きな鎖長アナログは、より強い拮抗作用を示した（図７Ａ）。同様に、他のアナログを、図７Ｂに示すようにＴＬＲ４アンタゴニストアッセイについて評価した。要約すると、２つの２４ウェルプレートにて、１０％ＦＢＳ Ｏ／Ｎを含むＲＰＭＩで５０万個の細胞を増殖させた。翌日、下層を乱すことなく培地を取り出し、異なる濃度の化合物を加えて、総量０．５ｍｌのＲＰＭＩにして、４８時間インキュベートした。細胞を採取し、採取した培養液を、製造業者の指示（Raybiotech社）に従ってヒトＴＬＲ４ ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。
ＥＬＩＳＡプレートを、ヒト単球溶解物（市販のLeukoPak血液サンプルから単離したもの）でコートし、続いて図６に示す一連の化合物（１０μＭ）でコートした。次いでこれをヒト単球溶解物と共にインキュベートし、次いで抗ＴＬＲ４及び抗ＴＬＲ２抗体でプローブした。抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ陽性対照を用いてプレートを展開した。化合物１～３は、ＴＬＲ４受容体に効果的に結合し、ＴＬＲ２受容体には結合しない。より大きな鎖長アナログは、より強い拮抗作用を示した（図７Ａ）。同様に、他のアナログを、図７Ｂに示すようにＴＬＲ４アンタゴニストアッセイについて評価した。要約すると、２つの２４ウェルプレートにて、１０％ＦＢＳ Ｏ／Ｎを含むＲＰＭＩで５０万個の細胞を増殖させた。翌日、下層を乱すことなく培地を取り出し、異なる濃度の化合物を加えて、総量０．５ｍｌのＲＰＭＩにして、４８時間インキュベートした。細胞を採取し、採取した培養液を、製造業者の指示（Raybiotech社）に従ってヒトＴＬＲ４ ＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。
【実施例2】
【0080】
ヒト単球における炎症性メディエーターの産生を阻害するための化合物を試験した：
最適な効力及び有効性のために、ＴＬＲ４結合ポケットをプローブするための構造要件及び制限を理解するため、本発明者らは、ヒト単球におけるＬＰＳ誘導性炎症を阻害するキトオリゴマーの能力を試験した（図８Ａ－Ｂ）。化合物１～４は、１０μＭ濃度で、統計学的に有意に、ＬＰＳ誘導性サイトカインＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６を阻害した。化合物２及び４（１０μＭ）は、炎症性サイトカインのＬＰＳ媒介誘導の阻害率に関して、キトヘキサオース（化合物１）（１０μＭ）よりも強力であることが見出された（ＬＰＳ対Ｃｈｔｘではｐ＜０．００１であり、一方ＬＰＳ対化合物２又は４ではｐ＜０．０００１）。プロトコールは（Panda, S. K.; Kumar, S.; Tupperwar, N. C.; Vaidya, T.; George, A.; Rath, S.; Bal, V.; Ravindran, B., Chitohexaose Activates Macrophages by Alternate Pathway through TLR4 and Blocks Endotoxemia. PLoS Pathog 2012, 8, e1002717）に記載されている通りに行った。ヒト単球を、一連の化合物（１０μＭ）と共にＬＰＳで４８時間刺激した。培養上清中のＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６を、製造者の指示に従って定量した。同様に、ヒト単球におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦ－α産生を阻害する能力について他のアナログを評価した。化合物１２、１５、１６、３９、４０、４１、４２、２５は、１００μＭ濃度で、ＴＮＦ－αの強力な阻害剤であることが見出された（図８Ｂ）。
最適な効力及び有効性のために、ＴＬＲ４結合ポケットをプローブするための構造要件及び制限を理解するため、本発明者らは、ヒト単球におけるＬＰＳ誘導性炎症を阻害するキトオリゴマーの能力を試験した（図８Ａ－Ｂ）。化合物１～４は、１０μＭ濃度で、統計学的に有意に、ＬＰＳ誘導性サイトカインＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６を阻害した。化合物２及び４（１０μＭ）は、炎症性サイトカインのＬＰＳ媒介誘導の阻害率に関して、キトヘキサオース（化合物１）（１０μＭ）よりも強力であることが見出された（ＬＰＳ対Ｃｈｔｘではｐ＜０．００１であり、一方ＬＰＳ対化合物２又は４ではｐ＜０．０００１）。プロトコールは（Panda, S. K.; Kumar, S.; Tupperwar, N. C.; Vaidya, T.; George, A.; Rath, S.; Bal, V.; Ravindran, B., Chitohexaose Activates Macrophages by Alternate Pathway through TLR4 and Blocks Endotoxemia. PLoS Pathog 2012, 8, e1002717）に記載されている通りに行った。ヒト単球を、一連の化合物（１０μＭ）と共にＬＰＳで４８時間刺激した。培養上清中のＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６を、製造者の指示に従って定量した。同様に、ヒト単球におけるＬＰＳ誘導ＴＮＦ－α産生を阻害する能力について他のアナログを評価した。化合物１２、１５、１６、３９、４０、４１、４２、２５は、１００μＭ濃度で、ＴＮＦ－αの強力な阻害剤であることが見出された（図８Ｂ）。
【実施例3】
【0081】
化合物１、２及び２６は、マウス骨髄由来マクロファージにおける炎症メディエーター（ＴＮＦ－α）のＬＰＳ誘導産生を阻害する：
骨髄由来マウスマクロファージを、１００μＭの上記被検化合物で８時間処理した。ＴＮＦ－αなどの前炎症性サイトカインタンパク質レベルを、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって測定した。ＬＰＳ処理（１０ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した（図９）。
骨髄由来マウスマクロファージを、１００μＭの上記被検化合物で８時間処理した。ＴＮＦ－αなどの前炎症性サイトカインタンパク質レベルを、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって測定した。ＬＰＳ処理（１０ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した（図９）。
【実施例4】
【0082】
化合物２６は、マウスマクロファージにおける炎症メディエーター（ＴＮＦ－α、ｉ－ＮＯＳ）のＨＭＧＢ１誘導性産生を阻害し、Ｍ２バイオマーカーＣＸＣＲ４をアップレギュレートする：
ＴＮＦ－α及びｉＮＯＳの発現は、両方とも、マクロファージにおいて化合物２６によって阻害された。興味深いことに、Ｍ２マクロファージマーカーであるＣＸＣＲ４は化合物２６によりアップレギュレートされ、これは、マクロファージの極性化に対する潜在的な影響を示唆し、免疫調節活性を示唆している。マウス骨髄由来マクロファージを、１００μＭの化合物２６と共に又はなしで、８時間ＨＭＧＢ１で処理した。ＴＮＦ－α、ｉＮＯＳ及びＣＸＣＲ４のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって測定し、対照細胞の発現レベルに対して正規化した（図１０）。
ＴＮＦ－α及びｉＮＯＳの発現は、両方とも、マクロファージにおいて化合物２６によって阻害された。興味深いことに、Ｍ２マクロファージマーカーであるＣＸＣＲ４は化合物２６によりアップレギュレートされ、これは、マクロファージの極性化に対する潜在的な影響を示唆し、免疫調節活性を示唆している。マウス骨髄由来マクロファージを、１００μＭの化合物２６と共に又はなしで、８時間ＨＭＧＢ１で処理した。ＴＮＦ－α、ｉＮＯＳ及びＣＸＣＲ４のｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ－ＰＣＲによって測定し、対照細胞の発現レベルに対して正規化した（図１０）。
【実施例5】
【0083】
本発明の化合物は、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０を産生する：
インターロイキン１０（ＩＬ－１０）は、病原体に対する宿主の免疫応答を制限し、それにより宿主への損傷を防ぎ、正常な組織のホメオスタシスを維持する上で中心的な役割を果たす、強力な抗炎症特性を有するサイトカインである。ＩＬ－１０の調節不全は、感染に応答して増強された免疫病理学及び多くの自己免疫疾患の発症のリスク増加に関連する。ここでは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＰＢＭＣ中のＩＬ－１０レベルのアップレギュレートについて本発明の化合物を評価した（図１１）。要約すると、２つの２４ウェルプレートにて、１０％ＦＢＳ Ｏ／Ｎを含むＲＰＭＩで５０万個の細胞を増殖させた。翌日、下層を乱すことなく培地を取り出し、異なる濃度の化合物（０、１、１０、１００μＭ）を加えて、ＲＰＭＩで総量０．５ｍｌにして、これを４８時間インキュベートした。細胞を採取し、採取した培養液を、製造業者の指示（Raybiotech社）に従ってＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。
インターロイキン１０（ＩＬ－１０）は、病原体に対する宿主の免疫応答を制限し、それにより宿主への損傷を防ぎ、正常な組織のホメオスタシスを維持する上で中心的な役割を果たす、強力な抗炎症特性を有するサイトカインである。ＩＬ－１０の調節不全は、感染に応答して増強された免疫病理学及び多くの自己免疫疾患の発症のリスク増加に関連する。ここでは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＰＢＭＣ中のＩＬ－１０レベルのアップレギュレートについて本発明の化合物を評価した（図１１）。要約すると、２つの２４ウェルプレートにて、１０％ＦＢＳ Ｏ／Ｎを含むＲＰＭＩで５０万個の細胞を増殖させた。翌日、下層を乱すことなく培地を取り出し、異なる濃度の化合物（０、１、１０、１００μＭ）を加えて、ＲＰＭＩで総量０．５ｍｌにして、これを４８時間インキュベートした。細胞を採取し、採取した培養液を、製造業者の指示（Raybiotech社）に従ってＥＬＩＳＡキットを用いて分析した。
【実施例6】
【0084】
キトヘキサオース（化合物１）は、大腸菌による致死的グラム陰性敗血症からマウスを保護した：
インビボマウスモデルにおいて、キトヘキサオース（化合物１）は、大腸菌による致死的グラム陰性敗血症からマウスを保護した。以前報告した細菌性敗血症モデル［Roger etal, Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Feb 17;106(7):2348-52］を、化合物１の有効性を試験するために採用した（図１）。２ｘ１０５ ＣＦＵの大腸菌（ＡＴＣＣ－２５９２２）を、化合物１（２５０μｇ／動物）と共に又はなしで、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射した。大腸菌媒介敗血症は死亡を誘導したが、化合物１で同時処置したマウスは、敗血症誘導死から保護された（４０％）。上記の結果は、細菌誘導性敗血症及び死亡が、治療時間枠となり得る一定期間において、阻害及び遅延されることを説明した。
インビボマウスモデルにおいて、キトヘキサオース（化合物１）は、大腸菌による致死的グラム陰性敗血症からマウスを保護した。以前報告した細菌性敗血症モデル［Roger etal, Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Feb 17;106(7):2348-52］を、化合物１の有効性を試験するために採用した（図１）。２ｘ１０５ ＣＦＵの大腸菌（ＡＴＣＣ－２５９２２）を、化合物１（２５０μｇ／動物）と共に又はなしで、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射した。大腸菌媒介敗血症は死亡を誘導したが、化合物１で同時処置したマウスは、敗血症誘導死から保護された（４０％）。上記の結果は、細菌誘導性敗血症及び死亡が、治療時間枠となり得る一定期間において、阻害及び遅延されることを説明した。
【実施例7】
【0085】
化合物４、１５及び２５は、マウスをＣＬＰ誘導性複数菌感染及び敗血症から保護した：
この概念を証明し、実現可能性を実証するために、本発明者らはＣＬＰマウスモデルにおいて化合物４を試験した。ＣＬＰモデルは、盲腸の穿孔からなり、この穿孔により、糞便物質が腹腔内に放出され、複数菌感染によって免疫応答の悪化が誘導される。このモデルは、臨床的に関連するヒトの状態を満たす。以前報告されたＣＬＰ敗血症プロトコール（Toscano et al, Journal of VIsualized Experiments: 2011, (51), 2860）を、化合物４の有効性を試験するために採用した。ＣＬＰ群及びＣＬＰに生理食塩水（０．５％）及び抗生物質（primaxin，５ｍｇ／ｋｇ）を加えた群のＣ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Laboratories社、１０～１２週、Ｎ ＝ １５）に、手術１６時間後、４０時間後に、化合物４（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。結果として、ＣＬＰ媒介性敗血症は臓器機能不全及び死亡を誘導したが、化合物４でマウスを同時処置したところ、図２に示すように、敗血症誘導死（１４／１５）からマウスを保護した（約９３％）。本発明者らはまた、標準ポイントオブケア抗生物質（the standard point of care anti-biotics）primaxin（５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて、化合物４が、敗血症誘導死（１４／１５）からマウスを保護し（約９３％）、同時に体温低下、震え、体寄せ合い行動（huddling）、食欲不振、動きの減少、心拍数及び呼吸数の上昇などの臨床症状を遅延させることを実証した。
この概念を証明し、実現可能性を実証するために、本発明者らはＣＬＰマウスモデルにおいて化合物４を試験した。ＣＬＰモデルは、盲腸の穿孔からなり、この穿孔により、糞便物質が腹腔内に放出され、複数菌感染によって免疫応答の悪化が誘導される。このモデルは、臨床的に関連するヒトの状態を満たす。以前報告されたＣＬＰ敗血症プロトコール（Toscano et al, Journal of VIsualized Experiments: 2011, (51), 2860）を、化合物４の有効性を試験するために採用した。ＣＬＰ群及びＣＬＰに生理食塩水（０．５％）及び抗生物質（primaxin，５ｍｇ／ｋｇ）を加えた群のＣ５７ＢＬ／６マウス（Jackson Laboratories社、１０～１２週、Ｎ ＝ １５）に、手術１６時間後、４０時間後に、化合物４（１０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注射した。結果として、ＣＬＰ媒介性敗血症は臓器機能不全及び死亡を誘導したが、化合物４でマウスを同時処置したところ、図２に示すように、敗血症誘導死（１４／１５）からマウスを保護した（約９３％）。本発明者らはまた、標準ポイントオブケア抗生物質（the standard point of care anti-biotics）primaxin（５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて、化合物４が、敗血症誘導死（１４／１５）からマウスを保護し（約９３％）、同時に体温低下、震え、体寄せ合い行動（huddling）、食欲不振、動きの減少、心拍数及び呼吸数の上昇などの臨床症状を遅延させることを実証した。
【0086】
化合物２５（１０ｍｇ／ｋｇ）及び化合物１５（５．０ｍｇ／ｋｇ）はまた、図５に示すように、敗血症誘導性死からマウスを保護した（約６０％）。本発明者らはまた、標準的ポイントオブケア抗生物質primaxin（５ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて、両化合物が、敗血症誘導死からマウスを保護し（約６０％）、同時に体温低下、震え、体寄せ合い行動、食欲不振、動きの減少、心拍数及び呼吸数の上昇などの臨床症状を遅延させることを実証した。
【実施例8】
【0087】
ＣＬＰ後マウスの器官組織の組織病理
擬似、ＣＬＰ及び化合物４処置マウスの種々の器官のヘマトキシリンエオジン（Ｈ／Ｅ）染色を行った。要約すると、組織を採取した後、それらを１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、処理し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン－エオジンルーチン染色用に４μの切片にした。ＣＬＰマウスは、心臓、肺、肝臓、腎臓及び脳における微小血栓及び鬱血、脾臓における胚中心サイズの増大、腸内の絨毛壊死及び精巣上皮の喪失を示した。化合物４を用いた処置では、これらの変化は全て、かなりの程度逆転し、組織は擬似群に似ていた（図３）。
擬似、ＣＬＰ及び化合物４処置マウスの種々の器官のヘマトキシリンエオジン（Ｈ／Ｅ）染色を行った。要約すると、組織を採取した後、それらを１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、処理し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン－エオジンルーチン染色用に４μの切片にした。ＣＬＰマウスは、心臓、肺、肝臓、腎臓及び脳における微小血栓及び鬱血、脾臓における胚中心サイズの増大、腸内の絨毛壊死及び精巣上皮の喪失を示した。化合物４を用いた処置では、これらの変化は全て、かなりの程度逆転し、組織は擬似群に似ていた（図３）。
【実施例9】
【0088】
ＣＬＰ後血清のバイオマーカー試験：
手術４８時間後に尾静脈から採取した血漿を－３０℃で保存し、擬似群、ＣＬＰ群、ＣＬＰ＋化合物４群、ＣＬＰ＋プリマキシン群、ＣＬＰ＋プリマキシン＋化合物４群及び対照（生理食塩水を注射）群の、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、及びＩＬ－βレベルについて分析した。化合物４は、単独又は抗生物質プリマキシンと組み合わせて、ＣＬＰマウス群と比較して、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６のレベルを統計的に有意に減少させた（ｎ＝４、ｐ＜０．０００５）（図４）。要約すると、市販されているＥＬＩＳＡキットを用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により上記サイトカインを推定した。ＥＬＩＳＡプレートを捕捉抗体でコートし、続いて被検試料及び適切な標準物質と共にインキュベートした。次いでそれをビオチン標識二次抗体及びアビジン－ペルオキシダーゼでプローブした。ＴＭＢを用いて発色させ、光学濃度（ＯＤ、optical density）を記録した。
手術４８時間後に尾静脈から採取した血漿を－３０℃で保存し、擬似群、ＣＬＰ群、ＣＬＰ＋化合物４群、ＣＬＰ＋プリマキシン群、ＣＬＰ＋プリマキシン＋化合物４群及び対照（生理食塩水を注射）群の、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、及びＩＬ－βレベルについて分析した。化合物４は、単独又は抗生物質プリマキシンと組み合わせて、ＣＬＰマウス群と比較して、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－６のレベルを統計的に有意に減少させた（ｎ＝４、ｐ＜０．０００５）（図４）。要約すると、市販されているＥＬＩＳＡキットを用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡ法により上記サイトカインを推定した。ＥＬＩＳＡプレートを捕捉抗体でコートし、続いて被検試料及び適切な標準物質と共にインキュベートした。次いでそれをビオチン標識二次抗体及びアビジン－ペルオキシダーゼでプローブした。ＴＭＢを用いて発色させ、光学濃度（ＯＤ、optical density）を記録した。
【実施例10】
【0089】
本発明の化合物は、広域スペクトル抗菌活性を有する：
選択されたグラム陰性菌（大腸菌、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ、肺炎桿菌）、グラム陽性菌（ＭＲＳＡ）並びに熱傷及び敗血症性創傷に主に見られる真菌（カンジダ・アルビカンス）に対して、化合物をスクリーニングした。それらの大部分は、ＭＩＣ９０が５０～２００ｍｇ／Ｌの抗菌活性を示した（図１３）。全ての調製化合物は、ブロス微量希釈感受性試験のためのClinical Laboratory Standards Institute（CLSI）のガイドラインに従って、被検物質及び対照物質の両方を用いた最少阻害濃度（ＭＩＣ、Minimum Inhibitory Concentrations）アッセイで評価した。要約すると、被検化合物及び対照化合物をＤＭＳＯに溶解し、適切な濃度に希釈し、９６ウェル微量希釈トレイに加えた。黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌、アシネトバクター・バウマンニ及びカンジダ・アルビカンスなどの細菌株を用いる試験には、ブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ、Brain Heart Infusion Broth）を用いた。化合物を２００μｇ／ｍｌから０．０６２５μｇ／ｍｌまで連続的に希釈して、９６ウェルプレートにプレーティングし、各生物約１ｘ１０５ ＣＦＵを播種した。ＭＩＣ終末点は、微量希釈において生物の増殖を完全に阻害する被検化合物又は対照化合物の最低濃度として、２４時間後の各化合物について決定した。
選択されたグラム陰性菌（大腸菌、緑膿菌、アシネトバクター・バウマンニ、肺炎桿菌）、グラム陽性菌（ＭＲＳＡ）並びに熱傷及び敗血症性創傷に主に見られる真菌（カンジダ・アルビカンス）に対して、化合物をスクリーニングした。それらの大部分は、ＭＩＣ９０が５０～２００ｍｇ／Ｌの抗菌活性を示した（図１３）。全ての調製化合物は、ブロス微量希釈感受性試験のためのClinical Laboratory Standards Institute（CLSI）のガイドラインに従って、被検物質及び対照物質の両方を用いた最少阻害濃度（ＭＩＣ、Minimum Inhibitory Concentrations）アッセイで評価した。要約すると、被検化合物及び対照化合物をＤＭＳＯに溶解し、適切な濃度に希釈し、９６ウェル微量希釈トレイに加えた。黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌、アシネトバクター・バウマンニ及びカンジダ・アルビカンスなどの細菌株を用いる試験には、ブレインハートインフュージョンブロス（ＢＨＩ、Brain Heart Infusion Broth）を用いた。化合物を２００μｇ／ｍｌから０．０６２５μｇ／ｍｌまで連続的に希釈して、９６ウェルプレートにプレーティングし、各生物約１ｘ１０５ ＣＦＵを播種した。ＭＩＣ終末点は、微量希釈において生物の増殖を完全に阻害する被検化合物又は対照化合物の最低濃度として、２４時間後の各化合物について決定した。
【実施例11】
【0090】
本発明の化合物はバイオフィルム形成を阻害した：
インビトロ抗菌ＭＩＣデータに基づいて、我々はＭＲＳＡに対するさらなる試験のために３つの化合物１、１２及び１５を選択した。３種の化合物全ては、陽性対照として使用したコリスチン（標準治療用抗生物質）と比較して、ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ株に対してより良好な活性を示した（図１４）。さらに、以前記載されたように（Ceri, H.; Olson, M. E.; Stremick, C.; Read, R. R.; Morck, D.; Buret, A., The CalgaryBiofilm Device: New Technology for Rapid Determination of Antibiotic Susceptibilities of Bacterial Biofilms. Journal of Clinical Microbiology 1999, 37, 1771-1776）、バイオフィルム細胞に対するバイオフィルム阻害及び撲滅活性（eradication activities）を試験した。ＭＲＳＡに対する化合物１５のバイオフィルム最小撲滅濃度（ＭＢＩＣ、minimum biofilm eradication concentrations）は、コリスチンよりも優れていた。したがって、黄色ブドウ球菌バイオフィルムに対する活性を有するこれらの化合物は、撲滅が難しいバイオフィルム媒介性血管内感染のコントロールに有意な影響を及ぼす［Li et al, J InfectDis. 2016 Nov 1;214(9):1421-1429；Archer, N. K.; Mazaitis, M. J.; Costerton, J.W.; Leid, J. G.; Powers, M. E.; Shirtliff, M. E., Staphylococcus aureus biofilms: Properties, regulation and roles in human disease. Virulence 2011, 2, 445-459］。要約すると、化合物に対するバイオフィルム感受性のためにカルガリーバイオフィルムデバイス（ＣＢＤ，Calgary Biofilm Device）技術を使用した。ＣＢＤは、標準９６ウェル技術により、抗生物質感受性アッセイ用に９６等量のバイオフィルムを生成する。標準群の化合物及び抗生物質に対する感受性は、以前記載されたように、国立臨床検査標準委員会（ＮＣＣＬＳ，National Committee for Clinical Laboratory Standards）により決定された。
インビトロ抗菌ＭＩＣデータに基づいて、我々はＭＲＳＡに対するさらなる試験のために３つの化合物１、１２及び１５を選択した。３種の化合物全ては、陽性対照として使用したコリスチン（標準治療用抗生物質）と比較して、ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡ株に対してより良好な活性を示した（図１４）。さらに、以前記載されたように（Ceri, H.; Olson, M. E.; Stremick, C.; Read, R. R.; Morck, D.; Buret, A., The CalgaryBiofilm Device: New Technology for Rapid Determination of Antibiotic Susceptibilities of Bacterial Biofilms. Journal of Clinical Microbiology 1999, 37, 1771-1776）、バイオフィルム細胞に対するバイオフィルム阻害及び撲滅活性（eradication activities）を試験した。ＭＲＳＡに対する化合物１５のバイオフィルム最小撲滅濃度（ＭＢＩＣ、minimum biofilm eradication concentrations）は、コリスチンよりも優れていた。したがって、黄色ブドウ球菌バイオフィルムに対する活性を有するこれらの化合物は、撲滅が難しいバイオフィルム媒介性血管内感染のコントロールに有意な影響を及ぼす［Li et al, J InfectDis. 2016 Nov 1;214(9):1421-1429；Archer, N. K.; Mazaitis, M. J.; Costerton, J.W.; Leid, J. G.; Powers, M. E.; Shirtliff, M. E., Staphylococcus aureus biofilms: Properties, regulation and roles in human disease. Virulence 2011, 2, 445-459］。要約すると、化合物に対するバイオフィルム感受性のためにカルガリーバイオフィルムデバイス（ＣＢＤ，Calgary Biofilm Device）技術を使用した。ＣＢＤは、標準９６ウェル技術により、抗生物質感受性アッセイ用に９６等量のバイオフィルムを生成する。標準群の化合物及び抗生物質に対する感受性は、以前記載されたように、国立臨床検査標準委員会（ＮＣＣＬＳ，National Committee for Clinical Laboratory Standards）により決定された。
【実施例12】
【0091】
本発明の化合物の広域スペクトル抗菌活性は、細胞膜の破壊によるものである：
指数関数的に増殖するＭＲＳＡ及び膜の完全性に対するＡＶＲ化合物の効果を評価した。リン酸塩緩衝生理食塩水に再懸濁したＭＲＳＡを、ブレインハートインフュージョンブロス中でＭＩＣ値の抗生物質並びにＡＶＲ化合物１、１２及び１５に、３０分及び１時間曝露した後、培養濾液中の漏出細胞物質の吸光度を２６０ｎｍの光学濃度で検出して測定した（図１５）。
指数関数的に増殖するＭＲＳＡ及び膜の完全性に対するＡＶＲ化合物の効果を評価した。リン酸塩緩衝生理食塩水に再懸濁したＭＲＳＡを、ブレインハートインフュージョンブロス中でＭＩＣ値の抗生物質並びにＡＶＲ化合物１、１２及び１５に、３０分及び１時間曝露した後、培養濾液中の漏出細胞物質の吸光度を２６０ｎｍの光学濃度で検出して測定した（図１５）。
【実施例13】
【0092】
本発明の化合物は、血漿タンパク質、血清タンパク質に結合しない。
全身、経口又は局所用の薬物候補を設計する際の主要な困難の１つは、血漿タンパク質、血清タンパク質へ薬物が結合することによるそれらの血漿／組織生物学的利用能の不良である。したがって、我々は、１０％ウシ血清（GIBCO社、MA）を含有するＤＭＥＭ中における微量希釈ＭＩＣにより化合物活性に対する血清の影響を試験した（Hurdle, J. G.; Lee, R. B.; Budha, N. R.; Carson, E. I.; Qi, J.; Scherman, M. S.; Cho, S. H.; McNeil, M. R.; Lenaerts, A. J.; Franzblau, S. G.; Meibohm, B.; Lee, R. E., A microbiological assessment of novel nitrofuranylamides as anti-tuberculosis agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2008, 62, 1037-1045）。結果は、全ての化合物がＭＲＳＡに対して活性であり、血清タンパク質に結合せず、それらが標的組織において良好な生物学的利用能を有することを示唆した（図１６）。
全身、経口又は局所用の薬物候補を設計する際の主要な困難の１つは、血漿タンパク質、血清タンパク質へ薬物が結合することによるそれらの血漿／組織生物学的利用能の不良である。したがって、我々は、１０％ウシ血清（GIBCO社、MA）を含有するＤＭＥＭ中における微量希釈ＭＩＣにより化合物活性に対する血清の影響を試験した（Hurdle, J. G.; Lee, R. B.; Budha, N. R.; Carson, E. I.; Qi, J.; Scherman, M. S.; Cho, S. H.; McNeil, M. R.; Lenaerts, A. J.; Franzblau, S. G.; Meibohm, B.; Lee, R. E., A microbiological assessment of novel nitrofuranylamides as anti-tuberculosis agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2008, 62, 1037-1045）。結果は、全ての化合物がＭＲＳＡに対して活性であり、血清タンパク質に結合せず、それらが標的組織において良好な生物学的利用能を有することを示唆した（図１６）。
【実施例14】
【0093】
本発明の化合物は、線維芽細胞に対して毒性ではない：
細胞毒性及び治療指数をまた、MEFマウス線維芽細胞株（ATCC、Manassas、VA）を抗生物質コリスチン及びＡＶＲ化合物に２４時間曝露し、続いて以前記載されたＭＴＴ［３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウムブロミド、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ社、ＭＡ］アッセイにより評価した。ＭＥＦマウス線維芽細胞株における全てのＡＶＲ化合物の細胞毒性を図１７に示し、これは、ＡＶＲ化合物が、創傷治癒過程において決定的に重要な線維芽細胞の増殖を損なうことなく、ＭＲＳＡの増殖を選択的に阻害することを示している。
細胞毒性及び治療指数をまた、MEFマウス線維芽細胞株（ATCC、Manassas、VA）を抗生物質コリスチン及びＡＶＲ化合物に２４時間曝露し、続いて以前記載されたＭＴＴ［３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウムブロミド、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ社、ＭＡ］アッセイにより評価した。ＭＥＦマウス線維芽細胞株における全てのＡＶＲ化合物の細胞毒性を図１７に示し、これは、ＡＶＲ化合物が、創傷治癒過程において決定的に重要な線維芽細胞の増殖を損なうことなく、ＭＲＳＡの増殖を選択的に阻害することを示している。
【実施例15】
【0094】
化合物１及び２は、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるＶＥＧＦの産生を減少させた：
光受容体の生存及び機能の中心であるＲＰＥは血管新生因子ＶＥＧＦの主要な供給源であり、したがって、ＡＭＤをもたらす脈絡膜血管新生の調節及び成長においてに中心的役割を果たす（Spilsbury, K.; Garrett, K. L.; Shen, W.-Y.; Constable, I. J.; Rakoczy, P. E., Overexpression of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in the Retinal Pigment Epithelium Leads to the Development of Choroidal Neovascularization. The American Journal of Pathology 2000, 157, 135-144；Betts, B. S.; Parvathaneni, K.; Yendluri, B. B.; Grigsby, J.; Tsin, A. T. C., Ginsenoside-Rb1 Induces ARPE-19 Proliferation and Reduces VEGF Release. ISRN Ophthalmology 2011, 2011, 184295）。化合物１及び２がＨＭＧＢ１（ＴＬＲ４の内因性リガンド）を阻害できるかどうかを評価するための本発明者らの予備的結果の一部として、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるＶＥＧＦ産生を誘導した。図１２は、化合物１及び２（５０μｇ／ｍＬ）が、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるＨＭＧＢ１誘導ＶＥＧＦ産生を、統計的に有意に（ｐ＜０．０１）、効果的に減少させることを示した。２×１０５個のＡＲＰＥ－１９細胞を、２４時間、２４ウェルプレート中の、１０％血清を含む完全培地に播種し、その後血清を含まない培地でさらに２４時間維持した。５０μｇ／ｍＬの被検化合物と共に又はそれなしで、細胞を０μｇ／ｍＬ（培地）又は１００ｎｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１で２４時間処理した。上清を採取し、Peprotech社製のヒトＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキットを用いて製造者の指示に従って、アッセイを行った。ＲＰＥ細胞は、脈絡膜毛細血管及び眼の他の主要な脈管構造に隣接して位置する。したがって、これらの知見は、化合物１及び２がＡＭＤ及び網膜症の発症に寄与する脈絡膜及び網膜毛細血管の血管新生の阻害（ＴＬＲ４の阻害及びＶＥＧＦの減少を介して）に有意な効果を有し得ることを示唆する。
光受容体の生存及び機能の中心であるＲＰＥは血管新生因子ＶＥＧＦの主要な供給源であり、したがって、ＡＭＤをもたらす脈絡膜血管新生の調節及び成長においてに中心的役割を果たす（Spilsbury, K.; Garrett, K. L.; Shen, W.-Y.; Constable, I. J.; Rakoczy, P. E., Overexpression of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in the Retinal Pigment Epithelium Leads to the Development of Choroidal Neovascularization. The American Journal of Pathology 2000, 157, 135-144；Betts, B. S.; Parvathaneni, K.; Yendluri, B. B.; Grigsby, J.; Tsin, A. T. C., Ginsenoside-Rb1 Induces ARPE-19 Proliferation and Reduces VEGF Release. ISRN Ophthalmology 2011, 2011, 184295）。化合物１及び２がＨＭＧＢ１（ＴＬＲ４の内因性リガンド）を阻害できるかどうかを評価するための本発明者らの予備的結果の一部として、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるＶＥＧＦ産生を誘導した。図１２は、化合物１及び２（５０μｇ／ｍＬ）が、ＡＲＰＥ－１９細胞におけるＨＭＧＢ１誘導ＶＥＧＦ産生を、統計的に有意に（ｐ＜０．０１）、効果的に減少させることを示した。２×１０５個のＡＲＰＥ－１９細胞を、２４時間、２４ウェルプレート中の、１０％血清を含む完全培地に播種し、その後血清を含まない培地でさらに２４時間維持した。５０μｇ／ｍＬの被検化合物と共に又はそれなしで、細胞を０μｇ／ｍＬ（培地）又は１００ｎｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１で２４時間処理した。上清を採取し、Peprotech社製のヒトＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキットを用いて製造者の指示に従って、アッセイを行った。ＲＰＥ細胞は、脈絡膜毛細血管及び眼の他の主要な脈管構造に隣接して位置する。したがって、これらの知見は、化合物１及び２がＡＭＤ及び網膜症の発症に寄与する脈絡膜及び網膜毛細血管の血管新生の阻害（ＴＬＲ４の阻害及びＶＥＧＦの減少を介して）に有意な効果を有し得ることを示唆する。
【実施例16】
【0095】
化合物２は、滲出型ＡＭＤのレーザー誘導ＣＮＶマウスモデルにおいて、陽性対照と比較して約６０％脈絡膜血管新生を減少させた：
ＡＶＲ化合物のインビボ血管新生抑制効果を実証するために、本発明者らは、レーザー誘導ＣＮＶマウスモデルにおいて化合物を試験した（図５）。レーザーインジェクタ（Phoenix Research Laboratories社、Pleasanton、CA）を用いたMicronIV眼底イメージングシステムに接続したIridex Oculight GL 532nmダイオードレーザー（Mountain View、CA）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６（１０～１２週）に、レーザーＣＮＶを誘導した。成功したレーザースポット（ブルッフ膜の破裂を示すガス泡の形成によって確認される）を再現可能に得るために使用したパラメータは、３５０ｍＷ、７５ｍｓｅｃ、及び５０μｍのスポットサイズであった。４つのレーザースポットを適用した。視神経から２～３の乳頭径。レーザー照射後、２、４及び６日目にマウスをＰＢＳ（陰性対照）、化合物１、２及び２６、又は陽性対照（抗ＶＥＧＦ抗体）のいずれかで処置した（ｎ＝４～６マウス／群）。化合物１、２及び２６及びＢＳＳ（媒体）を、１日１回腹腔内注射により投与し、この注射をレーザー照射の１日前に開始し、レーザー照射後１０日間続けた。実験の終了までに、マウスの眼を、フルオレセイン眼底血管造影及び／又は光干渉断層撮影（ＯＣＴ、optical coherence tomography）で検査して、ＣＮＶ病変を視覚化した。その後、動物を犠死させ、ＲＰＥ／脈絡膜／強膜フラットマウントを調製し、ＦＩＴＣ結合イソレクチンＢ４及び抗ＩＣＡＭ－２抗体の両方で染色して、ＣＮＶのサイズを定量的に測定した。レーザー誘導ＣＮＶに対する１、２、２６の効果を試験するために、２つの実験を行った。図５に示すように、化合物２を毎日２００μｇ腹腔内注射することにより、ＣＮＶ病変の平均サイズを、媒体のみ（平衡塩緩衝液）で処置した対照マウスのＣＮＶ病変の平均サイズの約６０％に減少させることができ、陽性対照と同等であった。
ＡＶＲ化合物のインビボ血管新生抑制効果を実証するために、本発明者らは、レーザー誘導ＣＮＶマウスモデルにおいて化合物を試験した（図５）。レーザーインジェクタ（Phoenix Research Laboratories社、Pleasanton、CA）を用いたMicronIV眼底イメージングシステムに接続したIridex Oculight GL 532nmダイオードレーザー（Mountain View、CA）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６（１０～１２週）に、レーザーＣＮＶを誘導した。成功したレーザースポット（ブルッフ膜の破裂を示すガス泡の形成によって確認される）を再現可能に得るために使用したパラメータは、３５０ｍＷ、７５ｍｓｅｃ、及び５０μｍのスポットサイズであった。４つのレーザースポットを適用した。視神経から２～３の乳頭径。レーザー照射後、２、４及び６日目にマウスをＰＢＳ（陰性対照）、化合物１、２及び２６、又は陽性対照（抗ＶＥＧＦ抗体）のいずれかで処置した（ｎ＝４～６マウス／群）。化合物１、２及び２６及びＢＳＳ（媒体）を、１日１回腹腔内注射により投与し、この注射をレーザー照射の１日前に開始し、レーザー照射後１０日間続けた。実験の終了までに、マウスの眼を、フルオレセイン眼底血管造影及び／又は光干渉断層撮影（ＯＣＴ、optical coherence tomography）で検査して、ＣＮＶ病変を視覚化した。その後、動物を犠死させ、ＲＰＥ／脈絡膜／強膜フラットマウントを調製し、ＦＩＴＣ結合イソレクチンＢ４及び抗ＩＣＡＭ－２抗体の両方で染色して、ＣＮＶのサイズを定量的に測定した。レーザー誘導ＣＮＶに対する１、２、２６の効果を試験するために、２つの実験を行った。図５に示すように、化合物２を毎日２００μｇ腹腔内注射することにより、ＣＮＶ病変の平均サイズを、媒体のみ（平衡塩緩衝液）で処置した対照マウスのＣＮＶ病変の平均サイズの約６０％に減少させることができ、陽性対照と同等であった。
【実施例17】
【0096】
化合物１１の合成：
メタノール５ｍＬ中のキトトリオース（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）に、４－カルボキシ－ＴＥＭＰＯのメタノール溶液（４．５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を加えた。これに、ＤＣＣ（４．６６ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）及びｃａｔ ＤＭＡＰのメタノール溶液を加え、室温で４８時間撹拌し、２℃で１２時間冷却した。エーテルを加えて白色固体を沈殿させ、濾過し、乾燥させて４．０ｍｇの白色粉末を得た。ＬＣ／ＭＳ＝６８４（Ｍ＋１）、１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－Ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ １．１５（ｓ，１２Ｈ）
、１．３５～１．５５（ｍ，４Ｈ）、１．９７～２．０５（ｂｓ，１０Ｈ）、２．４３（ｍ，１Ｈ）、２．８０～３．２３（ｍ，４Ｈ）、３．２５～３．６６（ｍ，１１Ｈ）、４．０７（ｓ，２Ｈ）、４．４１（ｓ，２Ｈ）、４．６５（ｓ，２Ｈ）、５．１８（ｄ，１Ｈ）、５．５２（ｂｓ，２Ｈ）、８．１５（ｄ，１Ｈ，ＮＨ）。
メタノール５ｍＬ中のキトトリオース（１０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）に、４－カルボキシ－ＴＥＭＰＯのメタノール溶液（４．５ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を加えた。これに、ＤＣＣ（４．６６ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）及びｃａｔ ＤＭＡＰのメタノール溶液を加え、室温で４８時間撹拌し、２℃で１２時間冷却した。エーテルを加えて白色固体を沈殿させ、濾過し、乾燥させて４．０ｍｇの白色粉末を得た。ＬＣ／ＭＳ＝６８４（Ｍ＋１）、１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－Ｄ６，５００ＭＨｚ）：δ １．１５（ｓ，１２Ｈ）
、１．３５～１．５５（ｍ，４Ｈ）、１．９７～２．０５（ｂｓ，１０Ｈ）、２．４３（ｍ，１Ｈ）、２．８０～３．２３（ｍ，４Ｈ）、３．２５～３．６６（ｍ，１１Ｈ）、４．０７（ｓ，２Ｈ）、４．４１（ｓ，２Ｈ）、４．６５（ｓ，２Ｈ）、５．１８（ｄ，１Ｈ）、５．５２（ｂｓ，２Ｈ）、８．１５（ｄ，１Ｈ，ＮＨ）。
【0097】
化合物３０の合成：
ＥｔＯＨ（５００ｍＬ）中のＤ－グルコサミン２９（１００ｇ、０．５５ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、ＮａＯＥｔ（３０ｇ、０．５５ｍｏｌ）を加えた。１０分後、混合物をジメチルマレイン酸無水物（０．５当量）で処理し、２０分間撹拌した。トリエチルアミン（６５．２ｍＬ、０．４６５ｍｏｌ）を加え、反応混合物を再び残りのジメチルマレイン酸無水物（０．５当量）で処理した。反応混合物を２時間撹拌しながら６０℃に温め、ＥｔＯＨを蒸発させ、乾燥させた。残留物をピリジン、無水酢酸で処理し、室温で２０時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、溶媒を蒸発させ、残留物を氷に注ぎ、クロロホルム（３×１Ｌ）で抽出し、塩酸水溶液（３％）１Ｌ、飽和重炭酸ナトリウム溶液（１Ｌ）、蒸留水（１Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。残留物を、溶出液として石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２０～３０％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３０（８０ｇ、約３７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．９１（３Ｈ，ｓ）、１．９４（６Ｈ，ｓ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、３．９２～３．９６（ｍ，１Ｈ）、４．０～４．１２（ｄｄ，１Ｈ）、４．１８～４．２３（ｄｄ，１Ｈ）、４．３０～４．３３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ）、５．１４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．６９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）。
ＥｔＯＨ（５００ｍＬ）中のＤ－グルコサミン２９（１００ｇ、０．５５ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、ＮａＯＥｔ（３０ｇ、０．５５ｍｏｌ）を加えた。１０分後、混合物をジメチルマレイン酸無水物（０．５当量）で処理し、２０分間撹拌した。トリエチルアミン（６５．２ｍＬ、０．４６５ｍｏｌ）を加え、反応混合物を再び残りのジメチルマレイン酸無水物（０．５当量）で処理した。反応混合物を２時間撹拌しながら６０℃に温め、ＥｔＯＨを蒸発させ、乾燥させた。残留物をピリジン、無水酢酸で処理し、室温で２０時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、溶媒を蒸発させ、残留物を氷に注ぎ、クロロホルム（３×１Ｌ）で抽出し、塩酸水溶液（３％）１Ｌ、飽和重炭酸ナトリウム溶液（１Ｌ）、蒸留水（１Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。残留物を、溶出液として石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２０～３０％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３０（８０ｇ、約３７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．９１（３Ｈ，ｓ）、１．９４（６Ｈ，ｓ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０３（ｓ，３Ｈ）、２．０９（ｓ，３Ｈ）、３．９２～３．９６（ｍ，１Ｈ）、４．０～４．１２（ｄｄ，１Ｈ）、４．１８～４．２３（ｄｄ，１Ｈ）、４．３０～４．３３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ）、５．１４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．６９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）。
【0098】
化合物３１の合成：
３０（１００ｇ、０．２１９ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に、２３℃でヒドラジン水和物（１２ｍｌ、０．２１９ｍｏｌ）をゆっくり加え、同じ温度で５～６時間撹拌し、ＴＬＣでモニターした。反応混合物を酢酸エチル（２Ｌ）で希釈し、水（３×１Ｌ）、ブライン（１Ｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて、化合物３１（６５ｇ、約７１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．８５（ｓ，３Ｈ）、１．９
０（ｓ，６Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、２．０５（ｓ，３Ｈ）、３．７９～３．８４（ｍ，１Ｈ）、３．９５～４．０６（ｄｄ，１Ｈ）、４．１０～４．１３（ｄｄ，１Ｈ）、４．２０～４．２４（ｄｄ，１Ｈ）、５．０６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、５．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．６０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）。
３０（１００ｇ、０．２１９ｍｏｌ）のＤＭＦ溶液に、２３℃でヒドラジン水和物（１２ｍｌ、０．２１９ｍｏｌ）をゆっくり加え、同じ温度で５～６時間撹拌し、ＴＬＣでモニターした。反応混合物を酢酸エチル（２Ｌ）で希釈し、水（３×１Ｌ）、ブライン（１Ｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて、化合物３１（６５ｇ、約７１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．８５（ｓ，３Ｈ）、１．９
０（ｓ，６Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、２．０５（ｓ，３Ｈ）、３．７９～３．８４（ｍ，１Ｈ）、３．９５～４．０６（ｄｄ，１Ｈ）、４．１０～４．１３（ｄｄ，１Ｈ）、４．２０～４．２４（ｄｄ，１Ｈ）、５．０６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、５．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．６０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）。
【0099】
化合物３２の合成：
化合物３１（３５ｇ、０．０８４ｍｏｌ）及びイミダゾール（１４．４ｇ、０．２１１ｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ溶液に、２３℃でＴＢＤＭＳＣｌ（１５．２ｇ、０．１０１ｍｏｌ）を少しずつ加え、同じ温度で１６時間撹拌し、ＴＬＣでモニターし、ＤＣＭ（１Ｌ）で希釈し、水（２×１Ｌ）、ブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して粗生成物を得た。残留物を、溶出液として石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（１５～２０％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３２（２７ｇ、約６１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．０１（ｓ，３Ｈ）、０．０５（ｓ，３Ｈ）、０．７６（ｓ，９Ｈ）、１．９１（ｓ，３Ｈ）、１．９３（ｓ，６Ｈ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、３．８０～３．８３（ｍ，１Ｈ）、３．９８～４．０３（ｄｄ，１Ｈ）、４．１０～４．１４（ｄｄ，１Ｈ）、４．２０～４．２４（ｄｄ，１Ｈ）、５．０５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、５．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．６６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）。
化合物３１（３５ｇ、０．０８４ｍｏｌ）及びイミダゾール（１４．４ｇ、０．２１１ｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ溶液に、２３℃でＴＢＤＭＳＣｌ（１５．２ｇ、０．１０１ｍｏｌ）を少しずつ加え、同じ温度で１６時間撹拌し、ＴＬＣでモニターし、ＤＣＭ（１Ｌ）で希釈し、水（２×１Ｌ）、ブライン（５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮して粗生成物を得た。残留物を、溶出液として石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（１５～２０％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３２（２７ｇ、約６１％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．０１（ｓ，３Ｈ）、０．０５（ｓ，３Ｈ）、０．７６（ｓ，９Ｈ）、１．９１（ｓ，３Ｈ）、１．９３（ｓ，６Ｈ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、３．８０～３．８３（ｍ，１Ｈ）、３．９８～４．０３（ｄｄ，１Ｈ）、４．１０～４．１４（ｄｄ，１Ｈ）、４．２０～４．２４（ｄｄ，１Ｈ）、５．０５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）、５．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．６６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．６Ｈｚ）。
【0100】
化合物３３の合成：
化合物３２（２７ｇ、０．０５１ｍｏｌ）の撹拌ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）溶液に、２３℃でＮａＯＭｅ（２．７６ｇ、０．０５２ｍｏｌ）を少しずつ加え、同じ温度で３～４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、ＭｅＯＨを減圧下で濃縮し、水５０ｍＬで希釈し、ｐＨを６．５～７．０に調整し、固体を濾過し、乾燥させて、純粋な化合物３３（１６ｇ、約７７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．０３（ｓ，３Ｈ）、０．０５（ｓ，３Ｈ）、０．７６（ｓ，９Ｈ）、１．９４（ｓ，６Ｈ）、３．４５～３．４７（ｍ，１Ｈ）、３．５７～３．６１（ｍ，１Ｈ）、３．７７～３．９０（ｍ，３Ｈ）、４．２１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、５．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）。
化合物３２（２７ｇ、０．０５１ｍｏｌ）の撹拌ＭｅＯＨ（１００ｍＬ）溶液に、２３℃でＮａＯＭｅ（２．７６ｇ、０．０５２ｍｏｌ）を少しずつ加え、同じ温度で３～４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、ＭｅＯＨを減圧下で濃縮し、水５０ｍＬで希釈し、ｐＨを６．５～７．０に調整し、固体を濾過し、乾燥させて、純粋な化合物３３（１６ｇ、約７７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．０３（ｓ，３Ｈ）、０．０５（ｓ，３Ｈ）、０．７６（ｓ，９Ｈ）、１．９４（ｓ，６Ｈ）、３．４５～３．４７（ｍ，１Ｈ）、３．５７～３．６１（ｍ，１Ｈ）、３．７７～３．９０（ｍ，３Ｈ）、４．２１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、５．２３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）。
【0101】
化合物３４の合成：
トルエン（４００ｍＬ）中の化合物３３（３０ｇ、０．０７４ｍｏｌ）及びジブチルスズオキシド（３７．２５ｇ、０．１４９ｍｏｌ）の懸濁液を還流下で１２時間加熱し、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（５５．２ｇ、０．１４９ｍｏｌ）及び臭化ベンジル（２５．５ｇ、０．１４９ｍｏｌ）を加え、混合物を３時間穏やかに還流し、反応混合物を冷却し、濃縮して粗生成物を得た。残留物を石油エーテル中の１５～２０％ＥｔＯＡｃを用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３４（２５ｇ、約６０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．０６（ｓ，３Ｈ）、０．０２（ｓ，３Ｈ）、０．７３（ｓ，９Ｈ）、１．８３～１．９３（ｂｓ，６Ｈ）、３．５６～３．６１（ｍ，１Ｈ）、３．７２～３．８０（ｍ，２Ｈ）、３．８６～３．８９（ｄｄ，１Ｈ）、４．０９～４．１４（ｄｄ，１Ｈ）、４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、４．５６～４．６３（ｄｄ，２Ｈ）、４．６９～４．７６（ｄｄ，２Ｈ）、５．１６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．１５～７．２４（ｍ，５Ｈ）、７．３３～７．３７（ｍ，５Ｈ）。
トルエン（４００ｍＬ）中の化合物３３（３０ｇ、０．０７４ｍｏｌ）及びジブチルスズオキシド（３７．２５ｇ、０．１４９ｍｏｌ）の懸濁液を還流下で１２時間加熱し、ヨウ化テトラブチルアンモニウム（５５．２ｇ、０．１４９ｍｏｌ）及び臭化ベンジル（２５．５ｇ、０．１４９ｍｏｌ）を加え、混合物を３時間穏やかに還流し、反応混合物を冷却し、濃縮して粗生成物を得た。残留物を石油エーテル中の１５～２０％ＥｔＯＡｃを用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３４（２５ｇ、約６０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ０．０６（ｓ，３Ｈ）、０．０２（ｓ，３Ｈ）、０．７３（ｓ，９Ｈ）、１．８３～１．９３（ｂｓ，６Ｈ）、３．５６～３．６１（ｍ，１Ｈ）、３．７２～３．８０（ｍ，２Ｈ）、３．８６～３．８９（ｄｄ，１Ｈ）、４．０９～４．１４（ｄｄ，１Ｈ）、４．５３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、４．５６～４．６３（ｄｄ，２Ｈ）、４．６９～４．７６（ｄｄ，２Ｈ）、５．１６（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．１５～７．２４（ｍ，５Ｈ）、７．３３～７．３７（ｍ，５Ｈ）。
【0102】
化合物３５の合成：
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物３１（５ｇ、０．０１２ｍｏｌ）及びＣＣｌ３ＣＮ（２．０６ｇ、０．０１４ｍｏｌ）の混合物にＤＢＵ（０．３７ｇ、０．００２ｍｏｌ）を加え、室温で１５～１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮して粗生成物を得た。この粗生成物を、石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２５～３５％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３５（３．８ｇ、５５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．９１（ｓ，３Ｈ）、１．９３（ｓ，６Ｈ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、３．９３～４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．９８～４．０３（ｄｄ，１Ｈ）、４．３３～４．４０（ｍ，２Ｈ）、５．２０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．７３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、８．６７（ｓ，１Ｈ）。
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物３１（５ｇ、０．０１２ｍｏｌ）及びＣＣｌ３ＣＮ（２．０６ｇ、０．０１４ｍｏｌ）の混合物にＤＢＵ（０．３７ｇ、０．００２ｍｏｌ）を加え、室温で１５～１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮して粗生成物を得た。この粗生成物を、石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２５～３５％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３５（３．８ｇ、５５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．９１（ｓ，３Ｈ）、１．９３（ｓ，６Ｈ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、３．９３～４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．９８～４．０３（ｄｄ，１Ｈ）、４．３３～４．４０（ｍ，２Ｈ）、５．２０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．７３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、８．６７（ｓ，１Ｈ）。
【0103】
化合物３６の合成：
活性分子篩粉末（４Ａｏ）を入れたオーブン乾燥した丸底フラスコに、化合物３５（４ｇ、０．００７ｍｏｌ）と化合物３４（３．３ｇ、０．００５７ｍｏｌ）との混合物を入れる。次いで、ＲＢにアルゴンを２回充填し、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）を加え、２３℃で２時間撹拌した。次いで、得られた反応混合物を－１０℃に冷却し、０．１ＭのＴｆＯＨのＤＣＭ溶液を加え、さらに１６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して粗混合物を得、これを石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２５～３５％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３６（２ｇ、３０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ －０．００５（ｓ，３Ｈ）、－０．１１（ｓ，３Ｈ）、０．７１（ｓ，９Ｈ）、１．７６（ｂｓ，６Ｈ）、１．９０（ｓ，３Ｈ）、１．９５（ｂｓ，６Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、３．３６～３．４４（ｍ，３Ｈ）、３．４８～３．５５（ｍ，３Ｈ）、３．８０～３．８３（ｍ，２Ｈ）、３．９０～３．９３（ｄｄ，１Ｈ）、４．０４～４．１２（ｍ，３Ｈ）、４．１４～４．２０（ｄｄ，１Ｈ）、４．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ）、４．５７～４．６４（ｄｄ，２Ｈ）、４．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ）、５．０３～５．０８（ｍ，２Ｈ）、５．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、７．１３～７．１９（ｍ，５Ｈ）、７．３３～７．３９（ｍ，５Ｈ）。
活性分子篩粉末（４Ａｏ）を入れたオーブン乾燥した丸底フラスコに、化合物３５（４ｇ、０．００７ｍｏｌ）と化合物３４（３．３ｇ、０．００５７ｍｏｌ）との混合物を入れる。次いで、ＲＢにアルゴンを２回充填し、乾燥ＤＣＭ（１０ｍＬ）を加え、２３℃で２時間撹拌した。次いで、得られた反応混合物を－１０℃に冷却し、０．１ＭのＴｆＯＨのＤＣＭ溶液を加え、さらに１６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して粗混合物を得、これを石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２５～３５％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３６（２ｇ、３０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ －０．００５（ｓ，３Ｈ）、－０．１１（ｓ，３Ｈ）、０．７１（ｓ，９Ｈ）、１．７６（ｂｓ，６Ｈ）、１．９０（ｓ，３Ｈ）、１．９５（ｂｓ，６Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、３．３６～３．４４（ｍ，３Ｈ）、３．４８～３．５５（ｍ，３Ｈ）、３．８０～３．８３（ｍ，２Ｈ）、３．９０～３．９３（ｄｄ，１Ｈ）、４．０４～４．１２（ｍ，３Ｈ）、４．１４～４．２０（ｄｄ，１Ｈ）、４．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ）、４．５７～４．６４（ｄｄ，２Ｈ）、４．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ）、５．０３～５．０８（ｍ，２Ｈ）、５．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、７．１３～７．１９（ｍ，５Ｈ）、７．３３～７．３９（ｍ，５Ｈ）。
【0104】
化合物３７の合成：
化合物３６（５．５ｇ、０．００５６ｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液にＡｃＯＨ（０．３６ｍＬ、０．００６３ｍｏｌ）を加え、－５℃に冷却した。次いで、－５℃の１Ｍ ＴＢＡＦ（６．３ｍＬ、０．００６３ｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を加え、室温で１６時間撹拌した。反応の完了後、反応混合物を飽和ＮａＣｌ溶液でクエンチし、ＤＣＭで抽出し、減圧下で濃縮して、粗化合物３７（３ｇ、粗製）を得、これを精製することなくさらに反応に用いた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．７６（ｓ，６Ｈ）、１．８９（ｓ，３Ｈ）、１．９５（ｂｓ，６Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、３．３８～３．５５（ｍ，３Ｈ）、３．６２～３．６６（ｍ，１Ｈ）、３．７６～３．８０（ｍ，１Ｈ）、３．９０～３．９４（ｍ，１Ｈ）、４．０６～４．２２（ｍ，６Ｈ）、４．１４～４．２０（ｄｄ，１Ｈ）、４．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ）、４．５７～４．６４（ｄｄ，２Ｈ）、４．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ）、５．０１～５．０７（ｍ，２Ｈ）、５．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．５５～５．６３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、７．１１～７．２０（ｍ，５Ｈ）、７．２９～７．４２（ｍ，５Ｈ）。
化合物３６（５．５ｇ、０．００５６ｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液にＡｃＯＨ（０．３６ｍＬ、０．００６３ｍｏｌ）を加え、－５℃に冷却した。次いで、－５℃の１Ｍ ＴＢＡＦ（６．３ｍＬ、０．００６３ｍｏｌ）のＴＨＦ溶液を加え、室温で１６時間撹拌した。反応の完了後、反応混合物を飽和ＮａＣｌ溶液でクエンチし、ＤＣＭで抽出し、減圧下で濃縮して、粗化合物３７（３ｇ、粗製）を得、これを精製することなくさらに反応に用いた。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．７６（ｓ，６Ｈ）、１．８９（ｓ，３Ｈ）、１．９５（ｂｓ，６Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、３．３８～３．５５（ｍ，３Ｈ）、３．６２～３．６６（ｍ，１Ｈ）、３．７６～３．８０（ｍ，１Ｈ）、３．９０～３．９４（ｍ，１Ｈ）、４．０６～４．２２（ｍ，６Ｈ）、４．１４～４．２０（ｄｄ，１Ｈ）、４．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ）、４．５７～４．６４（ｄｄ，２Ｈ）、４．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ）、５．０１～５．０７（ｍ，２Ｈ）、５．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．５５～５．６３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、７．１１～７．２０（ｍ，５Ｈ）、７．２９～７．４２（ｍ，５Ｈ）。
【0105】
化合物３８の合成：
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物３７（４ｇ、０．００４５ｍｏｌ）及びＣＣｌ３ＣＮ（０．５４ｍＬ、０．００５４ｍｏｌ）の混合物にＤＢＵ（０．１３ｍＬ，０．０００９ｍｏｌ）を加え、室温で１５～１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮して粗生成物を得た。この粗生成物を、石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２５～３５％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３８（１ｇ、２０％）を得た。
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物３７（４ｇ、０．００４５ｍｏｌ）及びＣＣｌ３ＣＮ（０．５４ｍＬ、０．００５４ｍｏｌ）の混合物にＤＢＵ（０．１３ｍＬ，０．０００９ｍｏｌ）を加え、室温で１５～１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮して粗生成物を得た。この粗生成物を、石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２５～３５％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３８（１ｇ、２０％）を得た。
【0106】
化合物３９～４２の合成：
活性分子篩粉末（４Ａｏ）を入れたオーブン乾燥した丸底フラスコに、化合物３８（１ｇ、０．８９ｍｍｏｌ）とＲ－ＯＨ（０．７当量）との混合物を入れ、次いで、ＲＢにアルゴンを２回充填し、乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。次いで、得られた反応混合物を－１０℃に冷却し、０．１Ｍ ＴｆＯＨ（１．３ｍＬ、０．１３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液を加え、さらに１６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して粗混合物を得た。この粗生成物を、石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２５～３５％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３９～４２（約４０～４５％）を得た。
活性分子篩粉末（４Ａｏ）を入れたオーブン乾燥した丸底フラスコに、化合物３８（１ｇ、０．８９ｍｍｏｌ）とＲ－ＯＨ（０．７当量）との混合物を入れ、次いで、ＲＢにアルゴンを２回充填し、乾燥ＤＣＭ（２０ｍＬ）を加え、室温で２時間撹拌した。次いで、得られた反応混合物を－１０℃に冷却し、０．１Ｍ ＴｆＯＨ（１．３ｍＬ、０．１３ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液を加え、さらに１６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して粗混合物を得た。この粗生成物を、石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２５～３５％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物３９～４２（約４０～４５％）を得た。
【0107】
化合物３９：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．７６（ｓ，６Ｈ）、１．８９（ｓ，３Ｈ）、１．９５（ｂｓ，６Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、３．４９～３．５１（ｍ，２Ｈ）、３．６４～３．７１（ｍ，２Ｈ）、３．９４～３．９６（ｍ，１Ｈ）、４．１５～４．１９（ｍ，６Ｈ）、４．４０（ｍ，１Ｈ）、４．５６～４．６５（ｍ，２Ｈ）、４．８６～４．９１（ｍ，１Ｈ）、５．０６～５．０９（ｍ，１Ｈ）、５．３３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、５．５５～５．６３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．１２～７．２１（ｍ，５Ｈ）、７．２９～７．４２（ｍ，５Ｈ）、８．０６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋＝９８２。
【0108】
化合物４０：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．２１～１．４８（ｍ，１０Ｈ）、１．７６（ｂｓ，６Ｈ）、１．８９（ｓ，３Ｈ）、１．９５～１．９６（ｓ，９Ｈ）、１．９８（ｓ，３Ｈ）、３．３６～３．３８（ｍ，１Ｈ）、３．４３～３．４６（ｍ，３Ｈ）、３．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、３．８９～３．９２（ｍ，２Ｈ）、４．０４～４．０８（ｍ，４Ｈ）、４．４１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、４．６０（ｓ，２Ｈ）、４．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、４．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．０４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、５．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．５７～５．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．１３～７．１９（ｍ，５Ｈ）、７．２８～７．４０（ｍ，５Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋－２＝９４３。
【0109】
化合物４１：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．２１～１．３５（ｍ，８Ｈ）、１．４５～１．６２（ｂｓ，８Ｈ）、１．７６（ｂｓ，６Ｈ）、１．９０（ｓ，３Ｈ）、１．９５～２．２２（ｍ，１２Ｈ）、３．４３～３．４６（ｍ，４Ｈ）、３．６０～３．７１（ｍ，１Ｈ）、３．９４（ｄ，１Ｈ）、４．０４～４．１２（ｍ，４Ｈ）、４．２０（ｍ，１Ｈ）、４．５５～４．５９（ｍ，１Ｈ）、４．６２～４．７０（ｍ，２Ｈ）、４．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、４．９３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ）、５．３０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、５．３５（ｍ，１Ｈ）、５．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．１３～７．１９（ｍ，５Ｈ）、７．２８～７．４０（ｍ，５Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋－２＝１０１５。
【0110】
化合物４２：１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．７６（ｓ，６Ｈ）、１．９０（ｓ，３Ｈ）、１．９５（ｓ，３Ｈ）、１．９８（ｓ，６Ｈ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、３．４３～３．４９（ｍ，３Ｈ）、３．６２～３．６４（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，３Ｈ）、３．９１～３．９４（ｍ，１Ｈ）、４．０７～４．２１（ｍ，５Ｈ）、４．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ）、４．５９（ｓ，２Ｈ）、４．８５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ）、５．０５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ）、５．３４～５．３７（ｍ，２Ｈ）、５．６０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ）、６．６９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、７．１１～７．２１（ｍ，５Ｈ）、７．２９～７．４２（ｍ，５Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋＝９８６。
【0111】
化合物１５の合成：
化合物１５は、ＨＣｌ中のヒドラジン水和物を用いてＮＤＭＭ基を除去し、続いてＡｃ２Ｏで処理してＮＨＡｃ基を導入したことにより、化合物３９（０．５ｇ）から合成した。最後に、以前記載されたように［Mohamed R.E et al, Carbohydrate research, 2001, 331, 129-142］、室温でＮａＯＣＨ３／ＭｅＯＨにより－ＯＡｃ基を除去して、化合物１５（２２ｍｇの白色固体）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．９８（ｓ，６Ｈ）、３．４３～３．４９（ｍ，３Ｈ）、３．６２～３．６４（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，３Ｈ）、３．９１～３．９４（ｍ，１Ｈ）、４．２３～４．４２（ｍ，３Ｈ）、４．６２（ｍ，４Ｈ）、５．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ）、６．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ）、６．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．１２～７．２１（ｍ，５Ｈ）、７．２９～７．４２（ｍ，５Ｈ）、８．０６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋＝７１０。
化合物１５は、ＨＣｌ中のヒドラジン水和物を用いてＮＤＭＭ基を除去し、続いてＡｃ２Ｏで処理してＮＨＡｃ基を導入したことにより、化合物３９（０．５ｇ）から合成した。最後に、以前記載されたように［Mohamed R.E et al, Carbohydrate research, 2001, 331, 129-142］、室温でＮａＯＣＨ３／ＭｅＯＨにより－ＯＡｃ基を除去して、化合物１５（２２ｍｇの白色固体）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．９８（ｓ，６Ｈ）、３．４３～３．４９（ｍ，３Ｈ）、３．６２～３．６４（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｓ，３Ｈ）、３．９１～３．９４（ｍ，１Ｈ）、４．２３～４．４２（ｍ，３Ｈ）、４．６２（ｍ，４Ｈ）、５．９０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ）、６．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ）、６．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．１２～７．２１（ｍ，５Ｈ）、７．２９～７．４２（ｍ，５Ｈ）、８．０６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋＝７１０。
【0112】
化合物－４３の合成：
ピリジン中のＤ－グルコサミン２９（２００ｇ、０．９３ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、無水酢酸（７２０ｍＬ、７．４ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１２時間撹拌して（ＴＬＣでモニターしながら）６０℃に温め、反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物を氷に注ぎ、クロロホルム（３×１Ｌ）で抽出し、塩酸水溶液（３％）１Ｌ、飽和重炭酸ナトリウム溶液（１Ｌ）、蒸留水（１Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗混合物４３を、さらに精製することなく次のステップに進めた。
ピリジン中のＤ－グルコサミン２９（２００ｇ、０．９３ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、無水酢酸（７２０ｍＬ、７．４ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１２時間撹拌して（ＴＬＣでモニターしながら）６０℃に温め、反応混合物を減圧下で濃縮した。残留物を氷に注ぎ、クロロホルム（３×１Ｌ）で抽出し、塩酸水溶液（３％）１Ｌ、飽和重炭酸ナトリウム溶液（１Ｌ）、蒸留水（１Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗混合物４３を、さらに精製することなく次のステップに進めた。
【0113】
化合物４４の合成：
粗混合物４３（３０ｇ、７７．０９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液に、室温でＭｅＯＨ（２Ｍ、７７ｍＬ、１５４．１ｍｍｏｌ）中のメチルアミンをゆっくり加え、ＴＬＣでモニターしながら、同温度で１２時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（２Ｌ）で希釈し、水（３×１Ｌ）、ブライン（１Ｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させた。化合物４４（２０ｇ）を得た。
粗混合物４３（３０ｇ、７７．０９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液に、室温でＭｅＯＨ（２Ｍ、７７ｍＬ、１５４．１ｍｍｏｌ）中のメチルアミンをゆっくり加え、ＴＬＣでモニターしながら、同温度で１２時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（２Ｌ）で希釈し、水（３×１Ｌ）、ブライン（１Ｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させた。化合物４４（２０ｇ）を得た。
【0114】
化合物－４５の合成：
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物４４（２０ｇ、０．０５７ｍｏｌ）、ＣＣｌ３ＣＮ（１１ｍＬ、０．１１４ｍｏｌ）及びＤＢＵ（２．５ｍＬ、０．００１４ｍｏｌ）の混合物を、室温で１５～１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮して粗生成物を得た。この粗生成物を、石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２５～３５％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物４５（５ｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．９１（ｓ，３Ｈ）、１．９３（ｓ，３Ｈ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、３．９３～４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．９８～４．０３（ｄｄ，１Ｈ）、４．３３～４．４０（ｍ，２Ｈ）、５．２０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．７３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、８．６７（ｓ，１Ｈ）。
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２中の化合物４４（２０ｇ、０．０５７ｍｏｌ）、ＣＣｌ３ＣＮ（１１ｍＬ、０．１１４ｍｏｌ）及びＤＢＵ（２．５ｍＬ、０．００１４ｍｏｌ）の混合物を、室温で１５～１６時間撹拌した。反応混合物を濃縮して粗生成物を得た。この粗生成物を、石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（２５～３５％）を用いるシリカゲルクロマトグラフィーにより精製して、化合物４５（５ｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．９１（ｓ，３Ｈ）、１．９３（ｓ，３Ｈ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、３．９３～４．０１（ｍ，１Ｈ）、３．９８～４．０３（ｄｄ，１Ｈ）、４．３３～４．４０（ｍ，２Ｈ）、５．２０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．７３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、８．６７（ｓ，１Ｈ）。
【0115】
化合物－２４の合成：
ＤＣＭ中の化合物４５（２ｇ、５．１４ｍｍｏｌ）と４－ＯＨ－ＴＥＭＰＯＬ（０．７ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）との撹拌懸濁液に、分子篩粉末を加えて室温で２時間撹拌し、これにトリフル酸（０．１１ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。ＲＭ（反応混合物）を蒸留し、５％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液で溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物２４（３００ｍｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．１４（ｓ，１２Ｈ）、１．４１～１．６６（ｍ，４Ｈ）、１．９１（ｓ，３Ｈ）、１．９３（ｓ，３Ｈ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、４．１５～４．３６（ｍ，４Ｈ）、５．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．７３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）。ＴＬＣ系：ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ：０．３。
ＤＣＭ中の化合物４５（２ｇ、５．１４ｍｍｏｌ）と４－ＯＨ－ＴＥＭＰＯＬ（０．７ｇ、４．１１ｍｍｏｌ）との撹拌懸濁液に、分子篩粉末を加えて室温で２時間撹拌し、これにトリフル酸（０．１１ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。ＲＭ（反応混合物）を蒸留し、５％ＭｅＯＨのＤＣＭ溶液で溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物２４（３００ｍｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．１４（ｓ，１２Ｈ）、１．４１～１．６６（ｍ，４Ｈ）、１．９１（ｓ，３Ｈ）、１．９３（ｓ，３Ｈ）、２．０１（ｓ，３Ｈ）、２．０７（ｓ，３Ｈ）、４．１５～４．３６（ｍ，４Ｈ）、５．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．７３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）。ＴＬＣ系：ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ：０．３。
【0116】
化合物２５の合成：
化合物２４（０．３ｇ、０．７９ｍｍｏｌ）の撹拌ＭｅＯＨ溶液に、室温でＮａＯＭｅ（０．０４ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を加え、同じ温度で３～４時間撹拌した。反応混合物をＴＬＣでモニターし、ＭｅＯＨを濃縮し、ＨＣｌ中の１Ｍジオキサンで中和した。ＲＭを濃縮し、溶出液としてＤＣＭ中の７％ＭｅＯＨを用いるカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物２５（５０ｍｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．１４（ｓ，１２Ｈ）、１．４１～１．６６（ｍ，４Ｈ）、１．９３（ｓ，３Ｈ）、４．１５～４．３６（ｍ，４Ｈ）、５．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．７３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋＝３７４。ＴＬＣ系：ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ：０．２。
化合物２４（０．３ｇ、０．７９ｍｍｏｌ）の撹拌ＭｅＯＨ溶液に、室温でＮａＯＭｅ（０．０４ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を加え、同じ温度で３～４時間撹拌した。反応混合物をＴＬＣでモニターし、ＭｅＯＨを濃縮し、ＨＣｌ中の１Ｍジオキサンで中和した。ＲＭを濃縮し、溶出液としてＤＣＭ中の７％ＭｅＯＨを用いるカラムクロマトグラフィーにより精製して、化合物２５（５０ｍｇ）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ １．１４（ｓ，１２Ｈ）、１．４１～１．６６（ｍ，４Ｈ）、１．９３（ｓ，３Ｈ）、４．１５～４．３６（ｍ，４Ｈ）、５．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、５．７３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）、６．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋＝３７４。ＴＬＣ系：ＤＣＭ中１０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ：０．２。
【実施例18】
【0117】
局所／硝子体内製剤
以下の表は、本発明による局所又は硝子体内眼科用組成物の例示的な範囲を表す：
以下の表は、本発明による局所又は硝子体内眼科用組成物の例示的な範囲を表す：
【0118】
【表2】
【実施例19】
【0119】
注射剤
以下の表は、本発明による静脈内（ＩＶ）組成物の例示的な範囲を表す：本発明の化合物を大部分の水（３５℃～４０℃）に溶解し、必要に応じて塩酸又は水酸化ナトリウムでｐＨを４．０～７．０に調整する。次いで、バッチを水で容量調整し、滅菌マイクロポアフィルターを通して滅菌１０ｍＬアンバーガラスバイアル（タイプ１）に濾過し、滅菌クロージャー及びシールで密封する。
以下の表は、本発明による静脈内（ＩＶ）組成物の例示的な範囲を表す：本発明の化合物を大部分の水（３５℃～４０℃）に溶解し、必要に応じて塩酸又は水酸化ナトリウムでｐＨを４．０～７．０に調整する。次いで、バッチを水で容量調整し、滅菌マイクロポアフィルターを通して滅菌１０ｍＬアンバーガラスバイアル（タイプ１）に濾過し、滅菌クロージャー及びシールで密封する。
【0120】
【表3】
【実施例20】
【0121】
以下の表は、本発明による局所ゲル、ローション及びスプレー組成物の例示的な範囲を表す：
【0122】
ゲル製剤：
以下の表は、本発明によるゲル組成物の例示的な範囲を表す：カルボマー９３４を水の総量の約４０％に均一に分散させる。アンモニア溶液を撹拌しながら徐々に分散液に加えて、透明ゲルを形成する。別の容器中でメチルパラベンをプロリレングリコールに溶解し、次いで１０．０ｇの化合物１５をこの溶液に分散させて均質な懸濁液にする。懸濁液を撹拌しながら徐々にゲルに加えて、均一な白色不透明ゲルを得る。
以下の表は、本発明によるゲル組成物の例示的な範囲を表す：カルボマー９３４を水の総量の約４０％に均一に分散させる。アンモニア溶液を撹拌しながら徐々に分散液に加えて、透明ゲルを形成する。別の容器中でメチルパラベンをプロリレングリコールに溶解し、次いで１０．０ｇの化合物１５をこの溶液に分散させて均質な懸濁液にする。懸濁液を撹拌しながら徐々にゲルに加えて、均一な白色不透明ゲルを得る。
【0123】
【表4】
【0124】
クリーム又はローション製剤：
以下の表は、本発明によるクリーム又はローション組成物の例示的な範囲を示す：メチルパラベンをプロピレングリコールの総量の約８０％に溶解させる。この溶液にポロキシル２セチルエーテルを、撹拌しながら加える。別の処理容器で、２０％のプロピレングリコール、精製水の一部及び１０．０ｇの化合物１５を混合して、均一な懸濁液を形成する。均質で柔らかい白色のクリームが得られるまで、懸濁液を、適度に撹拌しながら第１の処理容器に徐々に加える。クリームをコロイドミルに通し、バッチの質量を目標量にする。
以下の表は、本発明によるクリーム又はローション組成物の例示的な範囲を示す：メチルパラベンをプロピレングリコールの総量の約８０％に溶解させる。この溶液にポロキシル２セチルエーテルを、撹拌しながら加える。別の処理容器で、２０％のプロピレングリコール、精製水の一部及び１０．０ｇの化合物１５を混合して、均一な懸濁液を形成する。均質で柔らかい白色のクリームが得られるまで、懸濁液を、適度に撹拌しながら第１の処理容器に徐々に加える。クリームをコロイドミルに通し、バッチの質量を目標量にする。
【0125】
【表5】
【0126】
非エアロゾルスプレー製剤：
以下の表は、本発明による非エアロゾルスプレー組成物の例示的な範囲を表す：５．００ｇのポリオキシル１０オレイルエーテルを、１８８．７５ｇのヒマシ油に穏やかに撹拌しながら溶解する。２５．０ｇの化合物１５及び２５．０ｇの酸化亜鉛を、適度に撹拌しながらスラリーに懸濁し、続いて１．２５ｇのヒュームドシリカゲルを懸濁させた。スラリーを、均一で滑らかになるまで高せん断応力下で混合し、スプレーボトルにパッケージ化する。
以下の表は、本発明による非エアロゾルスプレー組成物の例示的な範囲を表す：５．００ｇのポリオキシル１０オレイルエーテルを、１８８．７５ｇのヒマシ油に穏やかに撹拌しながら溶解する。２５．０ｇの化合物１５及び２５．０ｇの酸化亜鉛を、適度に撹拌しながらスラリーに懸濁し、続いて１．２５ｇのヒュームドシリカゲルを懸濁させた。スラリーを、均一で滑らかになるまで高せん断応力下で混合し、スプレーボトルにパッケージ化する。
【0127】
本発明及びその実施形態について詳細に説明した。しかしながら、本発明の範囲は、本明細書に記載されたプロセス、製造、物質の組成、化合物、手段、方法及び／又はステップの特定の実施形態に限定することを意図するものではない。本発明の精神及び／又は本質的な特徴から逸脱することなく、開示された材料に対して様々な改変、置換及び変形を行うことができる。したがって、当業者であれば、本明細書に記載された実施形態と実質的に同じ機能を果たし、又は実質的に同じ結果を達成する後の改変、置換、及び／又は変形を、本発明の関連するこのような実施形態に従って利用し得ることを、開示から容易に理解するであろう。したがって、以下の特許請求の範囲は、本明細書に開示されるプロセス、製造物、物質の組成、化合物、手段、方法、及び／又はステップに対する改変、置換、及び変形をその範囲内に包含することを意図する。
【0128】
【表6】
【0129】
上記の説明及び添付の図面が任意の追加の主題を開示している限り、本発明は一般に提供されて（dedicated to the public）おらず、そのような追加の発明を請求する１つ又
は２以上の出願を提出する権利が留保される。
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
