(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-09-28
(45)【発行日】2023-10-06
(54)【発明の名称】がん細胞の抗がん治療に対する感受性を増大させる方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/10 20060101AFI20230929BHJP
A61K 31/138 20060101ALI20230929BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20230929BHJP
A61K 33/243 20190101ALI20230929BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20230929BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20230929BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20230929BHJP
【ＦＩ】
A61K38/10 ZNA
A61K31/138
A61K31/704
A61K33/243
A61K39/395 T
A61K47/68
A61P35/00
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2019557632
(86)(22)【出願日】2018-05-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-07-02
(86)【国際出願番号】 IL2018050542
(87)【国際公開番号】W WO2018211514
(87)【国際公開日】2018-11-22
【審査請求日】2021-05-12
(31)【優先権主張番号】62/507,939
(32)【優先日】2017-05-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】510170992
【氏名又は名称】トゥー トゥー バイオテック リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】デバリー，ヨラム
【審査官】松浦 安紀子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１１－５０７５４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１２／０３８９５７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Recent Advances in Clinical Medicine, 2010, pp.168-173，ISBN: 978-960-474-165-6
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／１０
Ａ６１Ｋ ３１／１３８
Ａ６１Ｋ ３１／７０４
Ａ６１Ｋ ３３／２４３
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｋ ４７／６８
Ａ６１Ｐ ３５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
それを必要とする患者のトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を治療するための医薬組成物であって、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド又はその機能性誘導体、及び少なくとも１種の抗がん剤を含み、前記誘導体は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記少なくとも１種の抗がん剤は、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体若しくは複合体化抗体、タモキシフェン、ドキソルビシン又はシスプラスチンである、医薬組成物。
【請求項2】
前記単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体）、若しくはエストロゲンα受容体（ＥＲα）の発現を増加させる、又はグルタチオンの発現を減少させる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体はハーセプチンであり、ＨＥＲ２に対する複合体化抗体はカドサイラである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
それを必要とする患者の卵巣がん細胞、膵臓がん細胞、およびトリプルネガティブ乳がん細胞の、少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させるための医薬組成物であって、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド又はその機能性誘導体を含み、前記医薬組成物は、前記患者のがん細胞のグルタチオンの発現を減少させ、それにより前記がん細胞の前記少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させるために用いられ、
前記誘導体は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記少なくとも１種の抗がん剤は、ドキソルビシンである、医薬組成物。
【請求項5】
前記医薬組成物は、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を更に含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記単離されたポリペプチドが、前記少なくとも１種の抗がん剤を投与する前、同時、又は後に投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
それを必要とする患者のトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を治療するためのキットであって、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチド又はその機能性誘導体と、任意選択で、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と；
（ｉｉ）抗がん剤と、任意選択で、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と；
を含み、
前記誘導体は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記抗がん剤は、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体又は複合体化抗体、タモキシフェン、ドキソルビシン及びシスプラスチンのいずれか１つである、キット。
【請求項8】
前記キットは、使用説明書を更に含む、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
技術分野
本開示は、がんの治療に関する。より具体的には、本開示は、がん細胞の抗がん治療に対する感受性を増大させるための組成物、方法、及びキットに関する。
本開示は、がんの治療に関する。より具体的には、本開示は、がん細胞の抗がん治療に対する感受性を増大させるための組成物、方法、及びキットに関する。
【背景技術】
【0002】
背景技術
本明細書に開示する主題の背景に関連すると考えられる参考文献を以下に列挙する：
［１］Yao, H. et al. 2016, Oncotarget, DOI: 10.18632/oncotarget.12284
［２］Andre, F. and Zielinski, C. C. 2012, Annals of Oncology 23 (Supplement 6): vi46-vi51, 2012
［３］国際公開第２００９／０８３９６８号
［４］Sandler, T. et al. 2010, Recent Advances in Clinical Medicine, ISSN: 1790-5125, ISBN: 978-960-474-165-6
本明細書に開示する主題の背景に関連すると考えられる参考文献を以下に列挙する：
［１］Yao, H. et al. 2016, Oncotarget, DOI: 10.18632/oncotarget.12284
［２］Andre, F. and Zielinski, C. C. 2012, Annals of Oncology 23 (Supplement 6): vi46-vi51, 2012
［３］国際公開第２００９／０８３９６８号
［４］Sandler, T. et al. 2010, Recent Advances in Clinical Medicine, ISSN: 1790-5125, ISBN: 978-960-474-165-6
【0003】
本明細書において上記参考文献を認めることが、これらが何らかの形で本明細書に開示する主題の特許性に関連していることを意味するものと推定すべきではない。
【0004】
背景
がんには１００を超える種類があり、したがって、がんの治療にも数多くの種類が存在する。現行の抗がん療法の一部は有効性が不十分であり、その理由は、それらの療法が、転移性腫瘍が異なる器官で類似の挙動をとることを想定して設計されていたことにある。加えて、がんの細胞傷害性化学療法又は放射線療法は、感受性の高い正常細胞にも毒性を示すことから、深刻な、場合によっては生命にも関わる副作用があるため、限界がある。そのため、腫瘍関連抗原を認識する標的療法を発展させる努力が続けられている。
がんには１００を超える種類があり、したがって、がんの治療にも数多くの種類が存在する。現行の抗がん療法の一部は有効性が不十分であり、その理由は、それらの療法が、転移性腫瘍が異なる器官で類似の挙動をとることを想定して設計されていたことにある。加えて、がんの細胞傷害性化学療法又は放射線療法は、感受性の高い正常細胞にも毒性を示すことから、深刻な、場合によっては生命にも関わる副作用があるため、限界がある。そのため、腫瘍関連抗原を認識する標的療法を発展させる努力が続けられている。
【0005】
乳癌は最も多く見られるがんの形態であり、世界中の女性の癌関連死の原因としては２番目に高く、２０１５年には米国で約４０，０００人が死亡している。１年間に乳癌と診断される症例数は世界中で１～１３０万人と推定されている。その中の約１５～２０％がトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）サブタイプに分類される（１）。
【0006】
ＴＮＢＣは、エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）が発現しておらず、且つヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）が発現又は遺伝子増幅していないものと定義される。
【0007】
現在のＴＮＢＣの治療は、幅広い乳癌患者に対し承認されている多くの薬剤を基礎としている。この治療を幾つか挙げると、アントラサイクリン、タキサン、白金製剤レジメン、及び抗血管形成療法がある（２）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
しかしながら、明確な治療標的が存在しないＴＮＢＣは、現在、治療の選択肢が限られた、悪性度の高い（aggressive）がんのサブタイプと見なされており、標準治療で治療した後の予後は非常に悪い。特に、転移性疾患の患者に有効な新規な療法に対する要求は現在も満たされていない（２）。
【0009】
「ＫＴＰＡＦ５０」と称されるペプチド及びその断片が、様々な種類のがん細胞の生存度の低下及び増殖の阻害に関連していることが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びマウスにおいて既に示されている（３、４）。
【課題を解決するための手段】
【0010】
一般的な説明
本開示は、その態様の１つにより、それを必要とする患者のがんを治療するための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤と、を投与することを含む方法を提供する。
本開示は、その態様の１つにより、それを必要とする患者のがんを治療するための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤と、を投与することを含む方法を提供する。
【0011】
幾つかの実施形態において、本開示による単離されたポリペプチドは、前記患者の前記少なくとも１種の抗がん剤に対する反応性を増大させる。更なる実施形態において、本開示による単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位（cellular moiety）の発現を調節する。更なる他の実施形態において、本開示による単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を増加又は減少させる。
【0012】
幾つかの実施形態において、本開示により定義される細胞部位は、前記がん細胞の細胞表面に存在するか又は細胞内部位である。他の実施形態において、本開示により定義される細胞部位は、受容体、ポリペプチド、酵素、転写因子、又はアダプター分子（adapting molecule）である。特定の実施形態において、本開示により定義される細胞部位は、細胞表面受容体である。
【0013】
更なる他の特定の実施形態において、本開示による単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を増加させ、本明細書において定義する細胞部位は受容体である。
【0014】
幾つかの実施形態において、本開示による細胞部位は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、アンドロゲン受容体、Ｂ細胞分化抗原群ＣＤ２０（ＣＤ２０）、分化抗原群３３（ＣＤ３３）、プログラム細胞死リガンド（ＰＤ－Ｌ）、又はＳＴ２受容体の少なくとも１種である。
【0015】
他の実施形態において、本開示による少なくとも１種の抗がん剤は、前記少なくとも１種の細胞部位と直接的又は間接的に相互作用する。更なる実施形態において、本開示による抗がん剤は、免疫療法剤（immnotherapy）、化学療法剤、シグナル伝達阻害剤、受容体阻害剤、遺伝子発現調節剤、アポトーシス誘導物質、血管新生阻害剤、ホルモン療法剤（hormone therapy）、代謝阻害剤、抗自食作用剤（anti-autophagy agent）、小胞体ストレス誘導剤、活性酸素種（ＲＯＳ）誘導剤、又はこれらの組合せである。
【0016】
幾つかの実施形態において、本開示による少なくとも１種の抗がん剤は、免疫療法剤、好ましくは、モノクローナル抗体又は複合体化（conjugated）抗体である。他の実施形態において、本明細書において定義するモノクローナル抗体又は複合体化抗体は、ＨＥＲ２、ＥＲ、又はＰＲの少なくとも１種に対する抗体である。
【0017】
他の実施形態において、本明細書において定義する少なくとも１種の抗がん剤は、受容体阻害剤、好ましくは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤である。更なる実施形態において、本開示による少なくとも１種の抗がん剤は、化学療法剤、好ましくは、ドキソルビシン若しくはドキソルビシン誘導体、シスプラチン、タキソール、又は活性酸素種（ＲＯＳ）誘導剤である。
【0018】
特定の実施形態において、本開示による患者は、前記単離されたポリペプチドなしで投与された場合は、前記抗がん剤に反応性を示さない。
【0019】
幾つかの実施形態において、本明細書において定義するがんは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は膵臓癌の少なくとも１種である。様々な実施形態において、本明細書において定義するがんはトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。
【0020】
更に本開示は、それを必要とする患者のトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を治療するための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを投与することを含む、方法を提供する。幾つかの実施形態において、本開示により定義される単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞のヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）の少なくとも１種の発現を増加させる。
【0021】
幾つかの実施形態において、本開示の単離されたポリペプチドは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる。
【0022】
他の実施形態において、本明細書において定義する少なくとも１種の抗がん剤は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体、ＥＲ、又はＰＲと相互作用する。更なる実施形態において、本明細書において定義する少なくとも１種の抗がん剤は、化学療法剤、好ましくは、ドキソルビシン若しくはドキソルビシン誘導体、シスプラチン、タキソール、又は活性酸素種（ＲＯＳ）誘導剤である。
【0023】
他の一態様により、本開示は、それを必要とする患者のがん細胞の少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させる方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体を投与することを含む方法を提供し、前記単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を調節し、それにより前記がん細胞の前記少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させる。幾つかの実施形態において、がん細胞の少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させるための方法は、前記患者に、本明細書において定義する前記少なくとも１種の抗がん剤を投与することを更に含む。
【0024】
様々な実施形態において、本開示の単離されたポリペプチド及び／又は前記少なくとも１種の抗がん剤は、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を更に任意選択的に含む医薬組成物に含まれる。
【0025】
幾つかの実施形態において、本開示による方法は、本明細書において定義する単離されたポリペプチドを、本開示の少なくとも１種の抗がん剤を投与する前、同時、又は後に投与する。
【0026】
更なる他の一態様により、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体及び少なくとも１種の抗がん剤を提供する。
【0027】
更に本開示は、それを必要とする患者のトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体及び少なくとも１種の抗がん剤を提供する。
【0028】
更に本開示は、それを必要とする患者のがん細胞の、少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させるための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体を提供し、前記単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を調節し、それにより前記がん細胞の前記少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させる。幾つかの特定の実施形態において、がん細胞の本発明による少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させるための方法に使用するための、単離されたポリペプチド及び少なくとも１種の抗がん剤は、前記方法が、前記少なくとも１種の抗がん剤を前記患者に投与することを更に含む。
【0029】
更に本開示は：
（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、任意選択で、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と；
（ｉｉ）抗がん剤と、任意選択で、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と；
を含むキットを提供する。
（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、任意選択で、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と；
（ｉｉ）抗がん剤と、任意選択で、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と；
を含むキットを提供する。
【0030】
幾つかの実施形態において、本開示によるキットは使用説明書を更に含む。
【0031】
様々な実施形態において、本明細書において定義するキットは、それを必要とする患者のがんを治療する方法に使用するためのものである。
【0032】
図面の簡単な説明
本明細書に開示する対象をより十分に理解するため、及びそれを実際にどのように実施することができるかを例示するために、ここで実施形態を、添付の図面を参照しながら、非限定的な例のみとして説明する。
本明細書に開示する対象をより十分に理解するため、及びそれを実際にどのように実施することができるかを例示するために、ここで実施形態を、添付の図面を参照しながら、非限定的な例のみとして説明する。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1A】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＨＥＲ２のＦＡＣＳ解析を示すものである。図面は、無処理の細胞（対照細胞、図１Ａ）、又はＡＰＣ１を２種類の投与量である１００μｇ／ｍｌ（図１Ｂ）及び２５０μｇ／ｍｌ（図１Ｃ）で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞上のＨＥＲ２受容体の発現をＦＡＣＳ解析したグラフを示している。細胞は、１回目投与後に２４時間及び２回目投与後に７２時間インキュベートした。図１Ｄは、陽性対照であり、ＡＰＣ１の非存在下におけるＮ８７細胞上のＨＥＲ２発現を示すものである。
【図1B】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＨＥＲ２のＦＡＣＳ解析を示すものである。図面は、無処理の細胞（対照細胞、図１Ａ）、又はＡＰＣ１を２種類の投与量である１００μｇ／ｍｌ（図１Ｂ）及び２５０μｇ／ｍｌ（図１Ｃ）で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞上のＨＥＲ２受容体の発現をＦＡＣＳ解析したグラフを示している。細胞は、１回目投与後に２４時間及び２回目投与後に７２時間インキュベートした。図１Ｄは、陽性対照であり、ＡＰＣ１の非存在下におけるＮ８７細胞上のＨＥＲ２発現を示すものである。
【図1C】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＨＥＲ２のＦＡＣＳ解析を示すものである。図面は、無処理の細胞（対照細胞、図１Ａ）、又はＡＰＣ１を２種類の投与量である１００μｇ／ｍｌ（図１Ｂ）及び２５０μｇ／ｍｌ（図１Ｃ）で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞上のＨＥＲ２受容体の発現をＦＡＣＳ解析したグラフを示している。細胞は、１回目投与後に２４時間及び２回目投与後に７２時間インキュベートした。図１Ｄは、陽性対照であり、ＡＰＣ１の非存在下におけるＮ８７細胞上のＨＥＲ２発現を示すものである。
【図1D】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＨＥＲ２のＦＡＣＳ解析を示すものである。図面は、無処理の細胞（対照細胞、図１Ａ）、又はＡＰＣ１を２種類の投与量である１００μｇ／ｍｌ（図１Ｂ）及び２５０μｇ／ｍｌ（図１Ｃ）で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞上のＨＥＲ２受容体の発現をＦＡＣＳ解析したグラフを示している。細胞は、１回目投与後に２４時間及び２回目投与後に７２時間インキュベートした。図１Ｄは、陽性対照であり、ＡＰＣ１の非存在下におけるＮ８７細胞上のＨＥＲ２発現を示すものである。
【図2A】ＡＰＣ１を投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の免疫蛍光である。図面は、ＡＰＣ１の単回投与（２５０μｇ／ｍｌ）を行わずに（図２Ａ）、又は行った（図２Ｂ）後に、４８時間インキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の免疫蛍光顕微鏡写真を示すものである。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２に対する抗体を用いた免疫蛍光を示し；ＤＡＰＩは、ＤＡＰＩ染色による免疫蛍光を示し；Ｍｅｒｇｅは、ＨＥＲ２及びＤＡＰＩの両方の免疫蛍光を示す。
【図2B】ＡＰＣ１を投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の免疫蛍光である。図面は、ＡＰＣ１の単回投与（２５０μｇ／ｍｌ）を行わずに（図２Ａ）、又は行った（図２Ｂ）後に、４８時間インキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の免疫蛍光顕微鏡写真を示すものである。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２に対する抗体を用いた免疫蛍光を示し；ＤＡＰＩは、ＤＡＰＩ染色による免疫蛍光を示し；Ｍｅｒｇｅは、ＨＥＲ２及びＤＡＰＩの両方の免疫蛍光を示す。
【図3A】ＡＰＣ１を反復投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の免疫蛍光である。図面は、ＡＰＣ１の反復投与（各２５０μｇ／ｍｌ）を行わずに（図３Ａ）、又は行った（図３Ｂ）後に、１４４、９６、及び７２時間インキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の免疫蛍光顕微鏡写真を示すものである。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２に対する抗体を用いた免疫蛍光を示し；ＤＡＰＩは、ＤＡＰＩ染色による免疫蛍光を示し；Ｍｅｒｇｅは、ＨＥＲ２及びＤＡＰＩの両方の免疫蛍光を示す。
【図3B】ＡＰＣ１を反復投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の免疫蛍光である。図面は、ＡＰＣ１の反復投与（各２５０μｇ／ｍｌ）を行わずに（図３Ａ）、又は行った（図３Ｂ）後に、１４４、９６、及び７２時間インキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の免疫蛍光顕微鏡写真を示すものである。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２に対する抗体を用いた免疫蛍光を示し；ＤＡＰＩは、ＤＡＰＩ染色による免疫蛍光を示し；Ｍｅｒｇｅは、ＨＥＲ２及びＤＡＰＩの両方の免疫蛍光を示す。
【図4A】ＡＰＣ１を投与したＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の免疫蛍光である。図面は、ＡＰＣ１の反復投与（各１００μｇ／ｍｌ）を行わずに（図４Ａ）又は行った後に（図４Ｂ）、２４及び７２時間インキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の免疫蛍光顕微鏡写真を示すものである。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２に対する抗体を用いた免疫蛍光を示し；ＤＡＰＩは、ＤＡＰＩ染色による免疫蛍光を示し；Ｍｅｒｇｅは、ＨＥＲ２及びＤＡＰＩの両方の免疫蛍光を示す。
【図4B】ＡＰＣ１を投与したＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の免疫蛍光である。図面は、ＡＰＣ１の反復投与（各１００μｇ／ｍｌ）を行わずに（図４Ａ）又は行った後に（図４Ｂ）、２４及び７２時間インキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の免疫蛍光顕微鏡写真を示すものである。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２に対する抗体を用いた免疫蛍光を示し；ＤＡＰＩは、ＤＡＰＩ染色による免疫蛍光を示し；Ｍｅｒｇｅは、ＨＥＲ２及びＤＡＰＩの両方の免疫蛍光を示す。
【図5A】ＡＰＣ１及びカドサイラを投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のアポトーシス解析である。図面は、まずＡＰＣ１を投与し（各２５０μｇ／ｍｌを２回投与し、投与後にそれぞれ２４及び７２時間インキュベート）、次いでカドサイラを５若しくは１０μｇ／ｍｌを７２時間（図５Ａ）、又は５、１０、若しくは２５μｇ／ｍｌを７２時間（図５Ｂ）投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞がアポトーシスした割合を棒グラフで示したものである。細胞は、上に詳述した、指定した濃度のＡＰＣ１の存在下又はカドサイラの存在下においてもインキュベートした。略称：対照：無処理；Ｋａｄ：カドサイラ。
【図5B】ＡＰＣ１及びカドサイラを投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のアポトーシス解析である。図面は、まずＡＰＣ１を投与し（各２５０μｇ／ｍｌを２回投与し、投与後にそれぞれ２４及び７２時間インキュベート）、次いでカドサイラを５若しくは１０μｇ／ｍｌを７２時間（図５Ａ）、又は５、１０、若しくは２５μｇ／ｍｌを７２時間（図５Ｂ）投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞がアポトーシスした割合を棒グラフで示したものである。細胞は、上に詳述した、指定した濃度のＡＰＣ１の存在下又はカドサイラの存在下においてもインキュベートした。略称：対照：無処理；Ｋａｄ：カドサイラ。
【図6】ＡＰＣ１及びカドサイラを投与し長時間インキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のアポトーシス解析である。棒グラフは、まずＡＰＣ１を投与し（各２５０μｇ／ｍｌを２回投与し、投与後に、それぞれ２４及び７２時間インキュベート）、次いでカドサイラを５、１０、又は２５μｇ／ｍｌ投与し、９６時間インキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞がアポトーシスした割合を示している。細胞は、上に詳述した、指定した濃度のＡＰＣ１の存在下又はカドサイラの存在下においてもインキュベートした。略称：対照：無処理；Ｋａｄ：カドサイラ。
【図7】ＡＰＣ１及びカドサイラを投与したＢＴＳ４９及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のアポトーシス解析である。棒グラフは、まずＡＰＣ１を投与し（各２５０μｇ／ｍｌを２回投与した後、それぞれ２４及び７２時間インキュベート）、次いでカドサイラを５、１０、又は２５μｇ／ｍｌ投与し、９６時間インキュベートしたＢＴＳ４９及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のアポトーシスの割合を示している。細胞は、上に詳述した、指定した濃度のＡＰＣ１の存在下又はカドサイラの存在下においてもインキュベートした。略称：対照：無処理；Ｋａｄ：カドサイラ。
【図8A】ヌードマウスのＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍のＨＥＲ２免疫組織染色である。図面は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍を注射し、ＡＰＣ１を反復投与（３５０μｇ／匹）したＢａｌｂ／Ｃヌードマウスから摘出したＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍切片のＭＤＡ－ＭＢ－２３１の免疫蛍光顕微鏡写真を示すものである。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２に対する抗体を用いた免疫蛍光であり；ＤＡＰＩは、ＤＡＰＩによる染色の免疫蛍光であり；Ｍｅｒｇｅは、ＨＥＲ２及びＤＡＰＩの両方の免疫蛍光を示す。
【図8B】ヌードマウスのＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍のＨＥＲ２免疫組織染色である。図面は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍を注射し、ＡＰＣ１を反復投与（３５０μｇ／匹）したＢａｌｂ／Ｃヌードマウスから摘出したＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍切片のＭＤＡ－ＭＢ－２３１の免疫蛍光顕微鏡写真を示すものである。ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２に対する抗体を用いた免疫蛍光であり；ＤＡＰＩは、ＤＡＰＩによる染色の免疫蛍光であり；Ｍｅｒｇｅは、ＨＥＲ２及びＤＡＰＩの両方の免疫蛍光を示す。
【図9】ＡＰＣ１及びハーセプチンを投与したＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のアポトーシス解析である。棒グラフは、無処理（対照）、ハーセプチン（１２μｇ／ｍｌ）投与後、ＡＰＣ１（２５０μｇ／ｍｌ）投与後、又は上の量のＡＰＣ１及びハーセプチンの両方を投与後のＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のアポトーシスレベルを示すものである。ハーセプチン（１００μｇ／ｍｌ）の非存在下及び存在下におけるＮ８７細胞のアポトーシスレベルも示す。
【図10】ＡＰＣ１を投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞膜上のＮｏｔｃｈ３受容体量である。棒グラフは、ＡＰＣ１（２５０μｇ／ｍｌ）を、１時間（縦棒２）、３時間（縦棒３）、５時間（縦棒４）、又は２４時間（縦棒５）投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞膜上のＮｏｔｃｈ３受容体の量（任意単位で表した密度）を示すものである。縦棒１は対照である。
【図11A】ＡＰＣ１及びタモキシフェンを投与（２４時間インキュベート）したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の生存率である。棒グラフは、培地（「０」で示す）又はタモキシフェン１０、５０、若しくは１００ｎＭの存在下に２４時間インキュベートした、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１１Ａ）、ＡＰＣ１で処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１１Ｂ）、及び抗ＰＲＴ３で処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１１Ｃ）の細胞生存率（レサズリンアッセイ使用）を示すものである。対照：無処理。
【図11B】ＡＰＣ１及びタモキシフェンを投与（２４時間インキュベート）したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の生存率である。棒グラフは、培地（「０」で示す）又はタモキシフェン１０、５０、若しくは１００ｎＭの存在下に２４時間インキュベートした、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１１Ａ）、ＡＰＣ１で処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１１Ｂ）、及び抗ＰＲＴ３で処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１１Ｃ）の細胞生存率（レサズリンアッセイ使用）を示すものである。対照：無処理。
【図11C】ＡＰＣ１及びタモキシフェンを投与（２４時間インキュベート）したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の生存率である。棒グラフは、培地（「０」で示す）又はタモキシフェン１０、５０、若しくは１００ｎＭの存在下に２４時間インキュベートした、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１１Ａ）、ＡＰＣ１で処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１１Ｂ）、及び抗ＰＲＴ３で処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１１Ｃ）の細胞生存率（レサズリンアッセイ使用）を示すものである。対照：無処理。
【図12A】ＡＰＣ１及びタモキシフェンを投与（４８時間インキュベート）したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の生存率解析である。棒グラフは、培地（「０」で示す）又はタモキシフェン１０、５０、若しくは１００ｎＭの存在下に４８時間インキュベートした、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１２Ａ）、ＡＰＣ１処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１２Ｂ）、又は抗ＰＲＴ３で処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１２Ｃ）の細胞生存率（レサズリンアッセイ）を示すものである。対照：無処理。
【図12B】ＡＰＣ１及びタモキシフェンを投与（４８時間インキュベート）したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の生存率解析である。棒グラフは、培地（「０」で示す）又はタモキシフェン１０、５０、若しくは１００ｎＭの存在下に４８時間インキュベートした、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１２Ａ）、ＡＰＣ１処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１２Ｂ）、又は抗ＰＲＴ３で処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１２Ｃ）の細胞生存率（レサズリンアッセイ）を示すものである。対照：無処理。
【図12C】ＡＰＣ１及びタモキシフェンを投与（４８時間インキュベート）したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の生存率解析である。棒グラフは、培地（「０」で示す）又はタモキシフェン１０、５０、若しくは１００ｎＭの存在下に４８時間インキュベートした、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１２Ａ）、ＡＰＣ１処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１２Ｂ）、又は抗ＰＲＴ３で処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図１２Ｃ）の細胞生存率（レサズリンアッセイ）を示すものである。対照：無処理。
【図13】ＡＰＣ１と一緒にインキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＥＲα発現のウェスタンブロット解析である。図面は、ＡＰＣ１（２５０μｇ／ｍｌ）で、１週間、週１回（左から３レーン目～７レーン目）、又は３若しくは４週間、週２回（左から９、１０レーン目）処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の、表示した時点におけるエストロゲンα受容体の発現を、抗エストロゲン受容体α（ＥＲα）抗体を用いて試験したウェスタンブロット解析を示すものである。略称：Ｍ：タンパク質パーカー；ｃ：対照；ｈ：時間；ｗ：週。
【図14A】ＴＮＢＣ細胞をＡＰＣ１及び化学療法剤により処理したものである。グラフは、ＡＰＣ１で前処理し、次いで指示された濃度のドキソルビシン（図１４Ａ）又はシスプラチン（図１４Ｂ）の存在下にインキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の相対細胞生存率を示すものである。略称：Ｄｏｘ：ドキソルビシン；ＣｉｓＰｔ：シスプラチン。
【図14B】ＴＮＢＣ細胞をＡＰＣ１及び化学療法剤により処理したものである。グラフは、ＡＰＣ１で前処理し、次いで指示された濃度のドキソルビシン（図１４Ａ）又はシスプラチン（図１４Ｂ）の存在下にインキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の相対細胞生存率を示すものである。略称：Ｄｏｘ：ドキソルビシン；ＣｉｓＰｔ：シスプラチン。
【図15】ヒトＴＮＢＣ腫瘍に対するＡＰＣ１及びドキソルビシンの効果である。グラフは、ＴＮＢＣ細胞を接種し、ＡＰＣ１（１５ｍｇ／ｋｇ、週３回、５週間まで）、ドキソルビシン（３ｍｇ／ｋｇ、週１回）、又はＡＰＣ１及びドキソルビシン（ＡＰＣ１を１５ｍｇ／ｋｇ、週２回、及びドキソルビシンを３ｍｇ／ｋｇ、週１回）で処理したヌードマウスの相対腫瘍体積を示すものである。対照マウス群は生理食塩水で処理した。
【図16】ヒト卵巣癌腫瘍に対するＡＰＣ１及びドキソルビシンの効果である。グラフは、ヒト卵巣癌細胞（ＯＶ９０）を接種し、ＡＰＣ１（１５ｍｇ／ｋｇ、週３回、５週間まで）、ドキソルビシン（３ｍｇ／ｋｇ、週１回）、又はＡＰＣ１及びドキソルビシン（ＡＰＣ１を１５ｍｇ／ｋｇ、週２回、及びドキソルビシンを３ｍｇ／ｋｇ、週１回）で処理したヌードマウスの相対腫瘍体積を示すものである。対照マウス群は生理食塩水で処理した。
【図17】ヒト膵臓癌腫瘍に対するＡＰＣ１及びドキソルビシンの効果である。グラフは、ヒト膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ１）を接種し、ＡＰＣ１（１５ｍｇ／ｋｇ、週３回、５週間まで）、ドキソルビシン（３ｍｇ／ｋｇ、週１回）、又はＡＰＣ１及びドキソルビシン（ＡＰＣ１、１５ｍｇ／ｋｇ、週２回、及びドキソルビシン３ｍｇ／ｋｇ、週１回）で処理したヌードマウスの相対腫瘍体積を示すものである。対照マウス群は生理食塩水で処理した。
【図18A】ヒトがん細胞のグルタチオン量に対するＡＰＣ１の効果である。グラフは指示された濃度のＡＰＣ１で処理したヒト卵巣癌細胞（図１８Ａ）、ヒト膵臓癌細胞（図１８Ｂ）、及びヒトＴＮＢＣ細胞（図１８Ｃ）の相対グルタチオン量を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【0034】
実施形態の詳細な説明
本発明は、本明細書において「ＡＰＣ１」と称する、アミノ酸配列ＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫ（配列番号：１で表す）からなるポリペプチドを投与することにより、がん細胞の幅広い種類の抗がん剤に対する感受性を増大させ、したがって、抗がん剤（抗がん薬）の治療効果の増強剤として使用することができるという、驚くべき発見に基づく。
本発明は、本明細書において「ＡＰＣ１」と称する、アミノ酸配列ＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫ（配列番号：１で表す）からなるポリペプチドを投与することにより、がん細胞の幅広い種類の抗がん剤に対する感受性を増大させ、したがって、抗がん剤（抗がん薬）の治療効果の増強剤として使用することができるという、驚くべき発見に基づく。
【0035】
後に実施例で詳述するように、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）細胞にポリペプチドＡＰＣ１を投与することにより、ＴＮＢＣ細胞上のヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）受容体の発現のみならずエストロゲン受容体の発現も増加した。
【0036】
ＴＮＢＣは、特に、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、及びヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）を発現しない（又は少なくとも発現が低下している）ものと定義される。治療の明確な標的が存在しないため、ＴＮＢＣは治療の選択肢が限られた、悪性度の高いがんのサブタイプと見なされている。後に示すように、ＡＰＣ１を投与することにより、細胞表面のＨＥＲ２のみならずエストロゲン受容体の発現も増加した。したがって、特定の理論に束縛されることを望むものではないが、処理された細胞のＨＥＲ２に基づく抗がん療法に対する感受性（又は反応性）が増大した。
【0037】
ＡＰＣ１とＨＥＲ２に基づく抗がん療法とを併用した場合の、ＴＮＢＣ細胞（一般に、ＨＥＲ２に基づく標的抗がん療法に感受性を示さないと考えられている）に対する効果を調査するために、実施例に後述するように、ＴＮＢＣ細胞にまずＡＰＣ１を投与し、次いで、例えば特定の抗がん剤としてカドサイラを投与した。カドサイラは、ＨＥＲ２に対する抗体であるトラスツズマブ及び化学療法剤であるエムタンシン（ＤＭ１）の作用機序を１つの薬剤に併合した抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）である。
【0038】
図５Ａに示すように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞にカドサイラを投与した結果、アポトーシスレベルは予想通り比較的低かった。驚くべきことに、ＡＰＣ１及びカドサイラの両方で処理した細胞のアポトーシスレベルは、カドサイラ単独で処理した細胞よりも少なくとも２．５倍高くなった。加えて、後に実施例で示すように、ＨＥＲ２受容体が発現することも、ＡＰＣ１で処理したマウスのＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞において実証された。
【0039】
更に、例えば図１１Ｂに示すように、ＡＰＣ１で前処理し、続いて選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）であるタモキシフェンで処理されたＴＮＢＣ細胞の細胞生存率が、タモキシフェン単独で処理した細胞と比較して低下しており、処理された細胞上のエストロゲン受容体の発現が増加したことを示唆している。エストロゲン受容体の発現が増加したことは、図１３においても直接実証されている。
【0040】
驚くべきことに、ＴＮＢＣ細胞（図１４）及び様々な種類のがんの腫瘍を接種したマウス（図１５、１６、及び１７）にＡＰＣ１を投与し、これらの細胞にドキソルビシン又はシスプラチンも投与した場合、それぞれ細胞生存率が低下すると共に腫瘍体積が低下した。
【0041】
上の結果をまとめると（後に更に詳述する）、ＡＰＣ１はがん細胞の幅広い種類の抗がん剤に対する感受性を増大させ、したがって、抗がん剤の治療効果の増強剤として使用することができることが示された。
【0042】
したがって本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを投与することを含む方法を提供する。
【0043】
他の一態様により、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを提供する。
【0044】
公開特許出願である国際公開第２００９／０８３９６８号（３）には、「ＫＴＰＡＦ５０」と称されるポリペプチド及びその断片が、白血病及び前立腺癌細胞の生存率の低下に加えて、マウスの腫瘍成長の阻止にも関連することが既に示されている。
【0045】
国際公開第２００９／０８３９６８号（３）に示されているように、ＫＴＰＡＦ５０ポリペプチドの全長は７４アミノ酸残基であり、アミノ酸配列：
（本明細書において配列番号：２で表す）を有する。国際公開第２００９／０８３９６８号に記載されているＫＴＰＡＦ５０の断片の中でも、ＫＴＰＡＦ５０のＮ末端の２４個のアミノ酸残基（シグナル配列）を持たないポリペプチドであり、アミノ酸配列：ＬＲＲＲＥＱＡＥＲＧＳＲＲＣＡＩＡＧＥＥＲＡＭＬＳＰＳＰＬＰＥＴＰＦＳＰＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲを有するものが挙げられる（本明細書において配列番号：３で表す）。
【化1】
（本明細書において配列番号：２で表す）を有する。国際公開第２００９／０８３９６８号に記載されているＫＴＰＡＦ５０の断片の中でも、ＫＴＰＡＦ５０のＮ末端の２４個のアミノ酸残基（シグナル配列）を持たないポリペプチドであり、アミノ酸配列：ＬＲＲＲＥＱＡＥＲＧＳＲＲＣＡＩＡＧＥＥＲＡＭＬＳＰＳＰＬＰＥＴＰＦＳＰＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲを有するものが挙げられる（本明細書において配列番号：３で表す）。
【0046】
ここで本開示により、ペプチドＫＴＰＡＦ５０の１４個のＣ末端アミノ酸残基からなる、配列番号：１で表されるアミノ酸配列ＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫを有するＡＰＣ１ペプチドは、それ自体を様々なタイプの細胞に投与しても、細胞のアポトーシスは僅かである（例えあるとしても）、即ち細胞生存率に何ら効果がないことを示す（図５Ａ及び図５Ｂ）。ところが、ＡＰＣ１を追加の抗がん剤（例えば、カドサイラ又はハーセプチン）と一緒に投与することにより、ＴＮＢＣ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞がアポトーシスに至る。換言すれば、細胞のカドサイラに対する反応性はＡＰＣ１ペプチドの存在下に増大し、図６及び図７においてもその効果が実証された。更に、反応性の増大は、追加の薬剤としてＨＥＲ２受容体に対するハーセプチン（図９）を用いた場合のみならず、タモキシフェン（図１１及び図１２）、ドキソルビシン（例えば、図１４Ａ）、及びシスプラチン（例えば、図１４Ｂ）に関しても実証された。
【0047】
したがって幾つかの実施形態において、本明細書において定義する単離されたポリペプチドは、前記患者の前記少なくとも１種の抗がん剤に対する反応性を増大させる。
【0048】
特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と少なくとも１種の抗がん剤と投与することを含む方法を提供し、前記単離されたポリペプチドは、前記患者の前記少なくとも１種の抗がん剤に対する反応性を増大させる。
【0049】
他の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを提供し、前記単離されたポリペプチドは、前記患者の前記少なくとも１種の抗がん剤に対する反応性を増大させる。
【0050】
本開示に関連する「反応性を増大させる」又は「増大した反応性」という語は、本発明の分野の熟練の施術者に知られている任意の臨床パラメータを用いて評価することができる、治療の結果としての、患者全体のアウトカム（例えば、改善）を指す。反応性の増大は、本明細書において定義する単離されたポリペプチドの存在下及び非存在下における特定の抗がん療法が、患者から採取された細胞試料に与える効果を比較することによって評価することができる。
【0051】
より具体的には、反応性の増大は、対照である無処理の細胞又は器官の対応する比率と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、又は約１０００％とすることができる。
【0052】
反応性の評価は当該技術分野において知られている任意の方法、例えば、腫瘍マーカーの評価又はコンピューター体軸断層撮影（ＣＴ）若しくは核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）による腫瘍サイズの評価により実施することができる。
【0053】
例えば、後に図５に示すように、ＡＰＣ１の非存在下では、細胞のカドサイラによる治療に対する反応性はより低い。したがって幾つかの実施形態において、本明細書に定義する患者は、前記単離されたポリペプチドなしで投与した場合、前記抗がん剤に反応性を示さない。換言すれば、本明細書に定義する患者は、前記抗がん剤を単独で投与すると反応性を示さない場合がある。
【0054】
特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを投与することを含む方法を提供し、前記患者は、前記単離されたポリペプチドなしで投与した場合、前記抗がん剤に反応性を示さない。
【0055】
更なる特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と少なくとも１種の抗がん剤とを提供し、前記患者は、前記単離されたポリペプチドなしで投与した場合、前記抗がん剤に反応性を示さない。
【0056】
本明細書において用いられる「反応性を示さない」という語は、前記患者の、特定の抗がん治療による利益又は反応性が十分とは言えない（例えあるとしても）ことを意味する。上に述べたように、治療に対する反応性は、当該技術分野において知られている任意の方法により、例えば、腫瘍マーカーを評価するか又はコンピューター体軸断層撮影（ＣＴ）若しくは核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で腫瘍サイズを評価することによって評価することができる。
【0057】
本明細書に示すように、ＡＰＣ１を投与することにより、がん細胞の様々な抗がん剤（即ち、幾つかの例を挙げると、カドサイラ、ハーセプチン）に対する感受性が増大した。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＡＰＣ１を投与することにより、細胞標的（本明細書においては「細胞部位」と称する）の発現が調節された。
【0058】
したがって、幾つかの実施形態において、本発明による単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を調節する。特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法を包含し、前記方法は、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを投与することを含み、前記単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を調節する。
【0059】
更なる特定の実施形態において、本発明は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを提供し、前記単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を調節する。
【0060】
本明細書において用いられる「調節する」という語は、本明細書において定義する細胞部位の少なくとも１種の活性を変更、増大、又は低下させることを意味する。
【0061】
本開示に関連する「がん（癌）細胞」という語は、当該技術分野において知られている、任意のタイプの細胞及び任意のタイプのがん（癌）を包含することを意味する。
【0062】
後に詳述するように、ＡＰＣ１の投与は、細胞表面のＨＥＲ２発現及びエストロゲン受容体の発現を増加させ、したがって、特定の理論に束縛されることを望むものではないが、処理された細胞の、ＨＥＲ２を標的とする治療に対する感受性（又は脆弱性）を増大させる。更に、後に示すように、これらの細胞をＡＰＣ１で処理すると、卵巣癌、膵臓癌、及びＴＮＢＣ癌細胞のグルタチオン量が減少した。
【0063】
したがって、幾つかの実施形態において、本明細書において定義する単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を増加又は減少させる。
【0064】
他の特定の実施形態において、本明細書に定義する単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を増加させる。
【0065】
本明細書において定義する「細胞部位」という語は、抗がん剤の標的となり得る細胞分子又はその断片を包含する。
【0066】
本開示に関連する「発現を増加させる」という語は、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位又はその断片の、転写速度、翻訳速度、タンパク質及び／又はｍＲＮＡの安定性、遺伝子産物の量、並びにタンパク質及び／又はｍＲＮＡの成熟の、漸増（escalation）、上昇（rise）、又は増大（increment）を指す。より具体的には、発現の増加は、対照である無処理の細胞又は器官の対応する比率と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、又は約１０００％とすることができる。
【0067】
それとは逆に、本開示に関連する「発現を減少させる」という語は、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位又はその断片の、転写速度、翻訳速度、タンパク質及び／又はｍＲＮＡの安定性、遺伝子産物の量、並びにタンパク質及び／又はｍＲＮＡの成熟の、降下（decline）、低減（reduction）、又は抑制（constriction）を指す。より具体的には、発現の減少は、対照である無処理の細胞又は器官の対応する比率と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、又は約１０００％とすることができる。
【0068】
本明細書において定義する細胞部位の発現の増加又は減少は、当該技術分野において知られている任意の方法、例えば、これらに限定されるものではないが、後に例示する方法により監視することができる。
【0069】
添付の実施例に示すように、ＡＰＣ１を投与することによって、細胞受容体（即ち、ＨＥＲ２及びエストロゲン受容体）及びグルタチオンの発現が調節された。ＨＥＲ２はがん細胞の増殖（成長）及び転移（拡散）の制御に関与していることが知られている。当該技術分野において知られているように、腫瘍近傍の活性酸素種（ＲＯＳ）が発生するストレス条件下において、グルタチオンがその損傷を抑制するため、グルタチオンにより細胞の増殖能力が調節される。更にグルタチオンは、薬剤耐性メカニズムにも関係しており、したがって化学療法の作用を阻害する可能性がある。
【0070】
したがって、幾つかの実施形態において、本開示による細胞部位は、がん細胞の成長、制御、又は拡散の少なくとも１種に関与している。特に本開示による細胞部位は、がん細胞の成長の増加又は減少に関連している。
【0071】
幾つかの実施形態において、本明細書において定義する細胞部位は、細胞内分子部分（即ち、細胞内に存在する）であり、他の実施形態においては、前記がん細胞の細胞表面に存在する部分（即ち、細胞表面上で到達可能）である。更なる他の実施形態において、細胞部位又はその断片は、少なくともその断片が細胞内に存在し、少なくとも他の断片が細胞表面に存在するように、細胞膜に埋め込まれている。
【0072】
したがって、更なる実施形態において、本明細書において定義する細胞部位は、前記がん細胞の細胞表面に存在するか又は細胞内部位である。
【0073】
更なる特定の実施形態において、本開示による細胞部位は、受容体、ポリペプチド、酵素、転写因子、又はアダプター分子である。
【0074】
当該技術分野において知られている「受容体」という語は、細胞内又は細胞表面に埋め込まれている、特定の物質に選択的結合し、その結合の結果として特定の生理学的効果を生じることを特徴とする分子構造を指す。本開示に包含される受容体の非限定的な幾つかの例としては、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、アンドロゲン受容体、又はＳＴ２が挙げられる。
【0075】
特定の実施形態において、本開示による細胞部位は細胞表面受容体である。
【0076】
本明細書において言及する「細胞表面受容体」（「膜受容体」又は「膜貫通受容体」としても知られる）という語は、細胞外分子と結合（又は相互作用）することによって、特に細胞シグナル伝達に作用する、細胞膜に埋め込まれた受容体に関する。細胞外分子は、とりわけ、ホルモン、神経伝達物質、サイトカイン、成長因子、細胞接着分子、又は栄養素であり、受容体と反応して細胞の代謝及び活性の変化を誘導する。細胞表面受容体の非限定的な幾つかの例としては、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）が挙げられる。
【0077】
更なる特定の実施形態において、本明細書において定義する単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を増加させ、前記細胞部位は受容体（例えば、細胞表面受容体）である。
【0078】
更なる特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法を包含し、前記方法は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを前記患者に投与することを含み、前記単離されたポリペプチドは、前記の患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を増加させ、前記細胞部位は受容体である。
【0079】
更なる他の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを包含し、前記単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を増加させ、前記細胞部位は受容体である。
【0080】
様々な特定の実施形態において、本開示による単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を増加させ、前記細胞部位は、細胞表面受容体、好ましくは、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）である。
【0081】
上に述べたように、本明細書において定義する細胞部位は、受容体、ポリペプチド、酵素、転写因子、又はアダプター分子とすることができる。
【0082】
当該技術分野において知られている「ポリペプチド」という語は、アミノ酸残基の分子鎖を指し、当該技術分野において知られている「酵素」という語は、折り畳まれて特異的な三次元構造を形成し、分子に固有の特性を与える特徴的なアミノ酸配列を持つポリペプチド（又はタンパク質）分子を指す。本開示に包含されるポリペプチドの非限定的な例としては、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、プログラム細胞死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、並びにグルタチオンの合成に関与する酵素及び／又はポリペプチドが挙げられる。
【0083】
本明細書において定義する「転写因子」という語は、特定のＤＮＡ配列に結合することにより、ＤＮＡの遺伝情報をメッセンジャーＲＮＡに転写する速度を制御する分子を指す。
【0084】
本明細書において用いられる「アダプター分子」という語は、他の分子と物理的に相互作用することができ、その生物活性を変化させることができる分子を指す。アダプター分子の非限定的な例としては、構造（２Ｓ）－２－アミノ－４－｛［（１Ｒ）－１－［（カルボキシメチル）カルバモイル］－２－スルファニルエチル］カルバモイル｝ブタン酸を有するグルタチオン（ＧＳＨ）並びにＳＨ２及び／又はＳＨ３ドメインを含む分子が挙げられる。
【0085】
更なる他の実施形態において、本開示の細胞部位は、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、アンドロゲン受容体、Ｂ細胞分化抗原群ＣＤ２０（ＣＤ２０）、分化抗原群３３（ＣＤ３３）、プログラム細胞死リガンド（ＰＤ－Ｌ）、又はＳＴ２受容体の少なくとも１種である。
【0086】
本明細書において定義する「エストロゲン受容体」（ＥＲ）という語は、細胞の内部及び表面に見られるタンパク質群を指す。これらの受容体は、ホルモンであるエストロゲン（１７β－エストラジオールとも呼ばれる）によって活性化される。ＥＲには、細胞内受容体である核内受容体ファミリーのメンバーである核内エストロゲン受容体（ＥＲα及びＥＲβ）と、殆どがＧタンパク質共役受容体である細胞膜エストロゲン受容体（ｍＥＲ、即ち、ＧＰＥＲ（ＧＰＲ３０）、ＥＲ－Ｘ、及びＧｑ－ｍＥＲ）の２つの群が存在する。ＥＲは、エストロゲンによって活性化されると核内に移行し、ＤＮＡに結合して、様々な遺伝子の活性を制御することができる（即ち、ＤＮＡ結合性転写因子である）。ＥＲ受容体は、ＤＮＡとの結合とは独立した他の機能も有している。がん細胞（特に、乳癌細胞）をＥＲ陽性細胞に変えることの利益は当該技術分野において知られている。それは、ＥＲ陽性細胞はエストロゲン（並びにそのアンタゴニスト及び／又はアゴニスト）に感受性を示し、ホルモン療法に反応することができるためである。ＥＲ陽性である乳癌細胞を有すると診断された患者に施すことができる療法の非限定的な例としては、タモキシフェン、又は他の任意の選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）が挙げられる。
【0087】
当該技術分野において知られているように、「タモキシフェン」という語は、抗悪性腫瘍剤である選択的エストロゲン受容体修飾薬（ＳＥＲＭ）によるホルモン療法に関連する。タモキシフェン（２－［４－［（Ｚ）－１，２－ジフェニルブト－１－エニル］フェノキシ］－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン）は、乳房組織において抗エストロゲン剤（阻害剤）として作用するが、コレステロール代謝、骨密度、及び子宮内膜の細胞増殖においてはエストロゲン（刺激剤）として作用する。タモキシフェンは、エストラジオールのエストロゲン受容体への結合を競合的に阻害し、それにより、この受容体がＤＮＡ上のエストロゲン応答配列に結合することを阻止する。その結果としてＤＮＡ合成及びエストロゲンに対する細胞応答が低下する。タモキシフェンは、とりわけ、初期のホルモン受容体陽性乳癌の手術及び他の治療後の再発リスクの低下、術前の大きなホルモン受容体陽性乳癌の縮小、及び転移性乳癌を含む進行段階のホルモン受容体陽性乳癌の治療に使用される。
【0088】
「プロゲステロン受容体」という語（ＰＲ、特にＮＲ３Ｃ３としても知られる）は、細胞内に見られるタンパク質を指す。これはステロイドホルモンであるプロゲステロンにより活性化される。ヒトにおいて、ＰＲは、単一のＰＧＲ遺伝子によりコードされる。これは分子量が異なるＰＲＡ及びＰＲＢの２種の主要な形態を有している。さほど知られていない第３のアイソフォーム（ＰＲＣ）も存在する。プロゲステロン受容体を作用させるためにはプロゲステロンが必要である。結合するホルモンが存在しなければ、カルボキシル末端によって転写が阻害される。ホルモンが結合すると、構造変化が誘発され、阻害作用が解消される。プロゲステロンアンタゴニストは構造の再形成を阻害する。プロゲステロンが受容体に結合すると、続いて二量体化を伴う再形成が起こり、この複合体は核内に入り、ＤＮＡに結合する。こうして転写が開始され、その結果としてメッセンジャーＲＮＡが形成され、リボソームにより翻訳されて特定のタンパク質が産生される。
【0089】
がん細胞（特にトリプルネガティブ乳癌細胞）を調節してＰＲ陽性細胞にすることの利益は当該技術分野において知られている。それは、ＰＲ陽性細胞はプロゲステロン（並びにそのアンタゴニスト及び／又はアゴニスト）に感受性を示し、ホルモン療法に反応性を示すことができるためである。
【0090】
特に、プロゲステロン受容体の発現が増加すると、ＰＲ陽性細胞を、プロゲステロン受容体に作用する薬剤である選択的プロゲステロン受容体修飾薬（ＳＰＲＭ）の標的とすることが可能になる。ＳＰＲＭは、異なる組織で異なる作用を示す、即ち、ある組織においてはアゴニストとして作用する一方で、他の組織においてはアンタゴニストとして作用することから、受容体フルアゴニスト（プロゲステロン等）やフルアンタゴニスト（アグレプリストン等）とは区別されうる。このような混合作用プロファイル（mixed profile of action）により、組織特異的に刺激又は阻害が行われる。
【0091】
上に示したように、ＡＰＣ１の存在下において、ＴＮＢＣと見なされる細胞のＨＥＲ２の発現が増加することが実証されており、したがって、特に本開示は、トリプルネガティブ乳癌を治療するための、ＡＰＣ１（配列番号：１で表される）及びＨＥＲ２に対する抗がん剤（例えば、カドサイラ又はハーセプチン）の組合せの投与に関する。
【0092】
「ヒト上皮成長因子受容体２」（ＮＥＵ、ＮＧＬ、ＨＥＲ２、ＴＫＲ１、ＨＥＲ－２、ｃ－ｅｒｂＢ２、及びＨＥＲ－２／ｎｅｕとしても知られる）は、当該技術分野において知られているように、乳癌の約１８％～２０％で増幅が見られるヒト上皮成長因子受容体２遺伝子（ＥＲＢＢ２）によりコードされる。増幅はＨＥＲ２を過剰発現させる主要な機序であり、これらの腫瘍においては、チロシンキナーゼ活性を有する１８５ｋｄの糖タンパクが異常に多いことが見出されている。ＨＥＲ２の過剰発現は乳癌患者の臨床アウトカムに関連している。ＨＥＲ２の状態を幾つかの形で、特に、予後の推定及び幾つかの全身療法に対する反応性の予測に利用することができる。したがって、ＨＥＲ２の状態を、推奨される抗がん療法の種類に関する臨床判断（他の予後因子と共に）に組み込むことができる。重要なことは、幾つかの研究から、ＨＥＲ２を標的とする薬剤が、再発・転移癌の治療（metastatic settings）及びアジュバント療法（adjuvant settings）の両方において非常に有効であることが示されていることにある。例えば、ヒト化モノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン）は、ＨＥＲ２陽性患者の転移性乳癌に単独で使用するか又は化学療法と併用すると、奏効率、無増悪期間に加えて生存率さえも向上する。
【0093】
当該技術分野において知られているように、「グルタチオン」（ＧＳＨ、グルタチオン（γ－Ｌ－グルタミル－Ｌ－システイニルグリシン）という語は、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－システイン、及びグリシンを含む低分子量のアミノ酸含有分子（ペプチド）を指す。この分子は、食料供給源及びヒトの体内に見られ、そこで酸化防止剤として作用する。「グルタチオン系」には、細胞内でグルタチオンを合成する酵素及びグルタチオンを酸化防止作用を発揮させる手段として利用する酵素が含まれる。グルタチオンは多剤耐性にも関連している。アルキル化剤、放射線療法、及びシスプラチンに対する耐性及びそれらの間の交差耐性に、細胞内ＧＳＨ濃度の上昇が関係していることが既に示されている。
【0094】
「上皮成長因子受容体」（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１、又はＨＥＲ１）という語は、当該技術分野において知られており、本明細書において用いられるように、細胞増殖、生存、分化、及び遊走の制御に必須の役割を果たす受容体型チロシンキナーゼである上皮成長因子ファミリー（ＥｒｂＢ）のメンバーを指す。多くのヒト疾患、大部分は特にがんの根底に、ＥｒｂＢ受容体の制御不能がある。ＥＧＦＲは、細胞外のリガンドに結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、短い膜近傍部位、チロシンキナーゼドメイン、及びチロシンを含むＣ末端鎖から構成される単鎖の膜貫通糖タンパクである。受容体の細胞外ドメインに可溶性リガンドが結合すると受容体間のホモ二量体及びヘテロ二量体の形成が促進される。受容体の二量体化は細胞内チロシンキナーゼドメインの活性化及びＣ末端鎖のリン酸化に必須である。次いでホスホチロシン残基は、直接又はアダプタータンパク質を介して、シグナル伝達経路の下流の構成要素を活性化する。ＥＧＦＲは、標的抗がん剤の合理的デザインの標的となっている。ＥＧＦＲを標的とする抗がん剤は当該技術分野においてよく知られており、特に、とりわけ、エルロチニブ塩酸塩（Ｔａｒｃｅｖａ）、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ）、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ）、又はゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）が挙げられる。
【0095】
「アンドロゲン受容体」という語は、当該技術分野において知られているように、Ｎ末端ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、及びアンドロゲン結合ドメインの３つの主要な機能ドメインを有するタンパク質を指す。このタンパク質はステロイドホルモンで活性化される転写因子として機能する。ホルモンリガンドが結合すると、受容体はアクセサリータンパク質から解離し、核内に移行し、二量体化して、アンドロゲン応答遺伝子の転写を刺激する。アンドロゲン受容体は様々ながん、その中でも前立腺癌及び乳癌に関係している。アンドロゲン受容体を特異的薬剤の標的とすることは当該技術分野においてよく知られている。
【0096】
「Ｂ細胞分化抗原群ＣＤ２０」（ＣＤ２０）は、当該技術分野において知られており、本明細書において用いられるように、全てのＢ細胞表面に発現する活性化されたグリコシル化リンタンパク質を指す。Ｂ細胞表面分子はＢ細胞から形質細胞を発生及び分化させる役割を果たしている。ＣＤ２０は様々なモノクローナル抗体、特に、リツキシマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマチウキセタン（Ibritumoma tiuxetan）、及びトシツモマブの標的であり、これらはいずれも、全てのＢ細胞リンパ腫及び白血病の治療において活性を示す薬剤である。
【0097】
「分化抗原３３」（ＣＤ３３）という語は、当該技術分野において知られており、本明細書において使用されるように、骨髄球系細胞上に発現する膜貫通受容体を指す。通常これは、骨髄球に特異的であると考えられているが、一部のリンパ球上にも見られる。これはシアル酸に結合し、したがってレクチンのＳＩＧＬＥＣファミリーのメンバーである。
【0098】
「プログラム細胞死リガンド（ＰＤ－Ｌ）」は、当該技術分野において知られているように、プログラム細胞死受容体のリガンドである。プログラム細胞死リガンドの非限定的な例は、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２である。
【0099】
本明細書において定義する「ＳＴ２受容体」又はＴ１／ＳＴ２受容体（「Ｔ１／ＳＴ２」及び「ＳＴ２／Ｔ１」とも称される）という語は、３つの細胞外免疫グロブリンドメイン及び細胞内ＴＩＲドメインを有するＩＬ－ＩＲスーパーファミリーのメンバーを指す。
【0100】
本発明の単離されたポリペプチドを投与することにより、本明細書において定義する任意の細胞部位又はその断片の発現が調節され、細胞の様々な抗がん剤に対する反応性を変化させることによって、それを必要とする患者に対する抗がん治療の選択肢が広がることを理解すべきである。
【0101】
アメリカがん協会（American Cancer Society）によれば、１９９０年代後期までがん療法は、ホルモン治療を除けば、増殖細胞を死滅させることにより作用する細胞傷害性薬剤（化学療法薬）から構成されていた。この薬剤は、増殖細胞ほどではないにせよ、正常細胞にも影響を及ぼしていた。古典的な化学療法薬とは対照的に、標的療法は、がん細胞の成長、分裂、及び拡散を制御する過程に加えて、がん細胞を自然死させるシグナルにも影響を及ぼすことにより作用する。標的療法は様々な経路で働く。
【0102】
本明細書における「抗がん剤」という語は、その最も広義の意味で用いられ、当該技術分野において知られている、がんの治療及びがん性細胞の増殖を制御するために使用される任意の抗がん薬又は抗悪性腫瘍薬を指す。様々な実施形態において、抗がん剤は、細胞部位又はその断片を標的とする抗がん剤であり、がんの成長、進行、及び拡散に関与する少なくとも１種の特定の分子又は部位（「分子標的」とも称される）と相互作用することによりがんの成長及び／又は拡散をブロックする薬物（又は分子）を指す。標的がん療法は、「分子標的薬」、「分子標的療法」、又は「プレシジョンメディシン」と称されることもある。
【0103】
幾つかの実施形態において、本開示の抗がん剤は、標的療法、即ち、細胞内又はその表面に（少なくとも部分的に）存在する細胞分子、その部分又は断片を標的とする抗がん剤である。
【0104】
標的療法は、がんに関与する特定の分子標的（又は本明細書において定義する「細胞部位」）に作用し、一方、大部分の標準的な化学療法は、全ての急速に分裂する正常及びがん性細胞に作用するという点で、標準的な化学療法とは異なっている。
【0105】
本明細書における実施例に示すように、ＴＮＢＣ細胞にポリペプチドＡＰＣ１を投与することにより、ＴＮＢＣ細胞のヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）受容体及びエストロゲン受容体アルファの発現が増加し、これらの細胞のＨＥＲ２又はＥＲに基づく抗がん療法に対する感受性が増大する。
【0106】
したがって幾つかの実施形態において、本開示による前記少なくとも１種の抗がん剤は、前記少なくとも１種の細胞部位と直接的又は間接的に相互作用する。
【0107】
特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを投与することを含む方法を提供し、前記単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を増加又は減少させ、前記少なくとも１種の抗がん剤は、前記少なくとも１種の細胞部位と直接的又は間接的に相互作用する。
【0108】
他の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを提供し、前記単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を増加又は減少させ、前記少なくとも１種の抗がん剤は、前記少なくとも１種の細胞部位と直接的又は間接的に相互作用する。
【0109】
抗がん剤に関連して本明細書において用いられる「～と相互作用する」という語は、標的（細胞部位）の活性を変更するように、例えば、例示のみを目的として挙げると、標的の活性を上昇、標的の活性を阻害、標的の活性を制限、又は標的の活性を拡張（extend）するように、直接的又は間接的のいずれかで標的に結合又は接触することを意味する。
【0110】
標的がん療法にはさまざまな種類があり、幾つか例を挙げると、増殖シグナル阻害剤、血管新生阻害剤、及びアポトーシス誘導物質等がある。本開示の方法及び他の態様の幾つかの実施形態において、少なくとも１種の抗がん剤は、上記患者のがん細胞の増殖又は拡散の少なくとも１種を直接的又は間接的に阻害する。
【0111】
特定の実施形態において、本明細書において定義する少なくとも１種の抗がん剤は、上記患者のがん細胞の増殖又は拡散の少なくとも１種を直接的又は間接的に阻害する。
【0112】
本明細書において用いられる「成長（増殖）（growth）」という語は、細胞質の体積、細胞の発生、及び細胞の繁殖の増大、並びに細胞のサイズ又は個体数の増加を指す。がん細胞に関連する「拡散」という語は、がん細胞の転移と、転移を可能にするか、又は結果として転移を生じる様々な細胞過程とに関連する。本明細書において言及する「阻害する」又は「阻害」という語は、がん細胞の成長又は拡散の少なくとも１種を、約１％～５％、約５％～１０％、約１０％～１５％、約１５％～２０％、約２０％～２５％、約２５％～３０％、約３０％～３５％、約３５％～４０％、約４０％～４５％、約４５％～５０％、約５０％～５５％、約５５％～６０％、約６０％～６５％、約６５％～７０％、約７５％～８０％、約８０％～８５％、約８５％～９０％、約９０％～９５％、約９５％～９９％、又は約９９％～９９．９％遅延又は低減させることに関連する。
【0113】
更なる特定の実施形態において、本明細書において定義する少なくとも１種の抗がん剤は、前記少なくとも１種の細胞部位と直接的又は間接的に相互作用し、前記細胞部位は細胞表面受容体である。
【0114】
特に本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と少なくとも１種の抗がん剤とを投与することを含む、方法を包含し、前記単離されたポリペプチドは、前記患者の細胞の細胞表面受容体の少なくとも１種の発現を増加させ、前記少なくとも１種の抗がん剤は、前記少なくとも１種の細胞表面受容体と直接的又は間接的に相互作用する。
【0115】
更なる実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを包含し、前記単離されたポリペプチドは、前記患者の細胞の少なくとも１種の細胞表面受容体の発現を増加させ、前記少なくとも１種の抗がん剤は、前記少なくとも１種の細胞表面受容体と直接的又は間接的に相互作用する。
【0116】
様々な実施形態において、本開示による抗がん剤は、免疫療法剤、化学療法剤、シグナル伝達阻害剤、受容体阻害剤、遺伝子発現調節剤、アポトーシス誘導物質、血管新生阻害剤、ホルモン療法剤、代謝阻害剤、抗自食作用剤（例えば、ブレオマイシン又はドキソルビシン）、小胞体ストレス誘導剤、活性酸素種（ＲＯＳ）誘導剤、又はこれらの組合せである。
【0117】
後に例示するように、ペプチドＡＰＣ１を投与することにより、様々な免疫療法抗がん剤、例えば、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体）に対する抗体の効果が向上又は増強されることが示された。
【0118】
当該技術分野において知られているように、がん療法に関連する「免疫療法」（「生物学的療法」又は「バイオセラピー」とも称される）は、がん細胞を破壊する免疫系を発動させる治療を指す。現在、がんの治療に用いられている免疫療法の主要な種類としては、特に、モノクローナル抗体、がんワクチン、及び免疫チェックポイント阻害剤が挙げられる。こうしたタンパク質は、免疫応答を抑制した状態に維持することを助けると共に、Ｔ細胞にがん細胞を死滅させないようにすることができる。このタンパク質を阻害すると、免疫系のいわゆる「ブレーキ」が開放され、Ｔ細胞はがん細胞をより強力に死滅させることができるようになる。Ｔ細胞又はがん細胞上に見られるチェックポイントタンパク質の例としては、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及びＣＴＬＡ－４／Ｂ７－１／Ｂ７－２が挙げられる。
【0119】
他の免疫療法としては、がん細胞表面上の特定の分子を認識するモノクローナル抗体が挙げられ、モノクローナル抗体が標的分子に結合すると、その標的分子（本明細書においては「細胞部位」と称する、例えば、細胞表面受容体）を発現する細胞が免疫破壊される。
【0120】
したがって、様々な特定の実施形態において、本開示の抗がん剤は、免疫療法剤、例えば、抗体、モノクローナル抗体、又はその任意の断片若しくは複合体である。
【0121】
他の実施形態において、本開示による抗がん剤は、免疫療法、好ましくは、モノクローナル抗体又は複合体化抗体である。様々な更なる実施形態において、本明細書に定義するモノクローナル抗体又は複合体化抗体は、上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）の少なくとも１種に対する抗体である。特定の実施形態において、本開示による少なくとも１種の抗がん剤は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体を対象とする。更なる他の実施形態において、モノクローナル抗体は、ＰＤ－Ｌ１に対する抗体である。
【0122】
本明細書における「抗体」という語は、その最も広義の意味で用いられ、免疫グロブリン遺伝子又はその機能性断片によりコードされる、抗原に特異的に結合及び認識するポリペプチドを指し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、１価抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）が含まれ、抗原結合性抗体断片も含まれる。このような抗原結合性断片は、例えば、抗原に結合することができるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２とすることができる。この種の断片は、当該技術分野において知られている任意の方法、例えば、パパイン（Ｆａｂ断片を産生する）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生する）等の酵素を使用するタンパク質分解により産生することができる。抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び／又は親和性成熟化抗体とすることができる。
【0123】
本明細書に定義する「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という語は、実質的に均一な抗体の集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在し得る自然発生する変異体の可能性を除いて、同一であるものを指す。モノクローナル抗体は、単一種の抗原部位（抗原決定基）に対する抗体である。
【0124】
モノクローナル抗体は当該技術分野において知られている任意の方法により作製及び精製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、免疫した動物（例えば、ラット、マウス、又はサル）の脾臓又はリンパ節から取り出したＢ細胞から、雑種細胞の増殖に好ましい条件下で不死化Ｂ細胞と融合させることにより、作製することができる。
【0125】
本明細書に定義する「複合体化抗体」（「免疫複合体」としても知られる）という語は、更なる試剤と複合体化（結合又は接合）した、本発明による抗体又はその任意の抗原結合性断片を指す。免疫複合体は当業者に知られている任意の方法、例えば、本発明による抗体に更なる試剤を架橋させることによるか又は組換えＤＮＡ法により作製することができる。
【0126】
抗体の作製は当該技術分野においてよく知られている。様々な特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、がん細胞を死滅させる毒性分子、具体的には、複合体化抗体であるカドサイラを送達する。トラスツズマブエムタンシン又はａｄｏ－トラスツズマブエムタンシンとしても知られるカドサイラは、細胞傷害性薬剤であるエムタンシン（ＤＭ１）に結合させたモノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチンとしても知られる）から構成される抗体－薬物複合体である。トラスツズマブ単独では、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体に結合することによりがん細胞の成長を停止させ、一方、ＤＭ１は細胞内に侵入し、チューブリンに結合することにより細胞を破壊する。Ｈｅｒ２に結合したトラスツズマブは、受容体のホモ二量体化又はヘテロ二量体化（Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ３）を阻止し、最終的にＭＡＰＫ及びＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ細胞シグナル伝達経路の活性化を阻害する。ＨＥＲ２は特定のがん細胞においてのみ過剰発現しており、モノクローナル抗体はＨＥＲ２を標的とするので、この複合体は腫瘍細胞に特異的に毒性物質を送達する。
【0127】
したがって、更なる特定の実施形態において、本明細書に定義する抗がん剤は、ＨＥＲ２に対するモノクローナル抗体又は複合体化抗体である。更なる実施形態において、本明細書に定義する少なくとも１種の抗がん剤は、カドサイラ又はハーセプチンである。
【0128】
「シグナル伝達阻害剤」という語は、ある分子から他の分子へと伝えられるシグナルを遮断する物質を指す。このようなシグナルを遮断すると、細胞分裂及び細胞死を含む多くの細胞機能に影響を与えることができ、それにより、がん細胞が死滅し得る。換言すれば、シグナル伝達阻害剤は、シグナル伝達に参加する分子の活性、即ち、細胞がその環境からのシグナルに応答する過程を遮断する。一部のがんにおいて、悪性細胞は、外部の成長因子によってそのように促されることがなくても、分裂を続けるように刺激されている。シグナル伝達阻害剤はこの不適切なシグナル伝達を妨げる。
【0129】
「受容体阻害剤」という語は、当該技術分野において知られているように、受容体の活性を遮断するか又は少なくとも調節する任意の物質を意味する。幾つかの非限定的な実施形態において、受容体阻害剤は、上皮成長因子受容体ファミリーメンバーの阻害剤、即ち、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーメンバーの活性を遮断する物質を指す。上皮成長因子受容体は、一部の正常細胞の表面に見られ、細胞成長に関与している。ＥＧＦＲは、一部種類のがん細胞上でも多量に存在する場合があり、それによって、このような細胞を成長及び分裂させるので、ＥＧＦＲを遮断するとがん細胞の成長を阻害することができる。
【0130】
本開示による幾つかの非限定的な受容体の例には、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、アンドロゲン受容体、ＣＤ２０、及びＳＴ２が包含される。
【0131】
様々な更なる実施形態において、本明細書に定義する抗がん剤は、エストロゲン受容体を遮断することにより作用する（例えば、タモキシフェン、フルベストラント）。
【0132】
特定の実施形態において、本開示による少なくとも１種の抗がん剤は、前記少なくとも１種の細胞部位と直接的又は間接的に相互作用し、前記少なくとも１種の細胞部位は、細胞表面受容体、例えばＨＥＲ２、ＥＲ、及び／又はＰＲである。他の実施形態において、本開示による抗がん剤は、ＨＥＲ２、ＥＲ及び／又はＰＲを対象とする。更なる具体的な実施形態において、本開示による抗がん剤は、受容体阻害剤、好ましくは上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害剤である。
【0133】
本明細書に定義する「遺伝子発現調節剤」という語は、遺伝子発現の制御に直接的又は間接的に関係する薬剤を指す。
【0134】
本明細書において用いられる「アポトーシス誘導物質」という語は、がん細胞に、制御された細胞死、即ちアポトーシスの過程を辿らせる薬剤を意味する。幾つかの非限定的なアポトーシス誘導物質の例として、ドキソルビシン、ブレオマイシン、シスプラチン、フルオロウラシル（５ＦＵ）が挙げられる。
【0135】
構造（７Ｓ，９Ｓ）－７－［（２Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｓ）－４－アミノ－５－ヒドロキシ－６－メチルオキサン－２－イル］オキシ－６，９，１１－トリヒドロキシ－９－（２－ヒドロキシアセチル）－４－メトキシ－８，１０－ジヒドロ－７Ｈ－テトラセン－５，１２－ジオンを有するドキソルビシン（例えば、アドリアマイシン又はドキシルとも称される）は、ストレプトマイセス・ペウセティウス（Streptomyces peucetius）から得られる抗悪性腫瘍薬である抗生物質である。ドキソルビシンはＤＮＡ螺旋の塩基対の間に挿入され、それによってＤＮＡの複製を阻止し、最終的にタンパク質合成を阻害する、アントラサイクリン系トポイソメラーゼ阻害剤である。加えて、ドキソルビシンはトポイソメラーゼＩＩを阻害し、その結果として、ＤＮＡ複製時に安定した切断可能な酵素－ＤＮＡ結合複合体の生成を増大させ、続いて二重鎖切断後のヌクレオチド鎖の連結を阻止する。ドキソルビシンは、酸素フリーラジカル（ＲＯＳ）も発生させ、その結果として細胞膜脂質の脂質過酸化に伴う細胞傷害をもたらす。ドキソルビシンの任意の誘導体も本開示に包含される。
【0136】
シスプラチン、シス白金、又はｃｉｓ－ジアンミンジクロロ白金（ＩＩ）（Ｃｌ２Ｈ６Ｎ２Ｐｔ）は様々な種類のがんの治療に使用される白金系化学療法薬であり、その種類に分類された最初のメンバーであるが、現在はカルボプラチン及びオキサリプラチンもこれに含まれる。
【0137】
特定の実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを投与することを含む方法を提供し、前記少なくとも１種の抗がん剤は、アポトーシス誘導物質、好ましくはドキソルビシン、ドキソルビシン誘導体、又はシスプラチンである。
【0138】
更なる実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを提供し、前記少なくとも１種の抗がん剤は、アポトーシス誘導物質、好ましくは、ドキソルビシン、ドキソルビシン誘導体又はシスプラチンである。
【0139】
本明細書において用いられる「血管新生阻害剤」という語は、腫瘍への新しい血管の成長（腫瘍血管新生）をブロックする薬剤を指す。血管新生を阻害する幾つかの標的療法は、新しい血管の形成を刺激する物質である血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の作用を妨げる。
【0140】
当該技術分野において知られており、本明細書において使用される「ホルモン療法」という語は、成長のために特定のホルモンを必要とするホルモン感受性腫瘍の成長を停止させるか又は少なくとも遅らせる薬剤を指す。ホルモン療法は身体のホルモン産生を阻止することによるか又はホルモンの作用を妨げることにより作用する。ホルモン療法剤の例としては、これらに限定されるものではないが、乳癌の治療及び予防に用いられるタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤、及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）遮断薬、並びに前立腺癌の治療に使用される黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニストが挙げられる。
【0141】
本明細書において用いられる「代謝阻害剤」は、がん細胞の代謝を妨げる薬剤を指し、幾つかの例として、解糖を阻害する薬剤（例えば、ダウノルビシン（ダウノマイシンとしても知られる）又はパクリタキセル）、ミトコンドリア代謝を阻害する薬剤（例えば、パクリタキセル又はオメプラゾール）が挙げられる。
【0142】
後の実施例で詳述するように、ＡＰＣ１を前投与することにより、がん細胞のドキソルビシン又はシスプラチンに対する感受性が増大した。ドキソルビシン及びシスプラチンは、特に化学療法剤として分類することができる。
【0143】
当該技術分野においてよく知られているが、「化学療法剤」は、がんの治療に使用され、場合によっては、数日間から数週間に亘り他の薬剤と組み合わせて使用される。この種の薬剤は、増殖速度が速い細胞に毒性を示す。
【0144】
したがって、更なる実施形態により、本明細書において定義する少なくとも１種の抗がん剤は、化学療法剤、好ましくは、ドキソルビシン若しくはドキソルビシン誘導体、シスプラチン、タキソール、又は活性酸素種（ＲＯＳ）誘導剤である。
【0145】
本明細書において定義する「抗自食作用剤」という語は、オートファジーに関与する過程のいずれかを少なくとも部分的に阻害する任意の薬剤を含むことを意味する。当該技術分野において知られているように、オートファジーは、損傷した細胞小器官及びタンパク質を分解することにより栄養の再利用を促進する過程であり、少なくとも神経変性疾患に対し細胞を保護する機序として認められている。一方、オートファジーを阻害することは、様々ながんの治療において望ましい（例えば、クロロキン又はヒドロキシクロロキンを、多発性新生物（multiple neoplasm）を治療するための他の薬物と組み合わせて用いる）。
【0146】
本明細書において定義する「小胞体ストレス誘導剤」という語は、小胞体（ＥＲ）のストレスを増大するか又は刺激する任意の薬剤を含むことを意味している。当該技術分野において知られているように、小胞体（ＥＲ）は、分泌タンパク質及び膜貫通タンパク質を正しく折り畳み、処理するように機能する。ＥＲの機能を乱す薬剤は、正しく折り畳まれなかった、又は折り畳まれなかったタンパク質をＥＲ内腔に蓄積させ、「ＥＲストレス」として知られる状態にする。ＥＲストレス状態が解除されなければ、様々な種類のがんの治療に所望されるアポトーシスが促進される。
【0147】
イオン及び分子の一群である活性酸素種（ＲＯＳ）は、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）、アルコキシルラジカル、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２・－）、一重項酸素、及び過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を含み、これらは全て非常に反応性が高い化学種である。内在性ＲＯＳは大部分が呼吸時にミトコンドリア内で形成される。低濃度のＲＯＳは哺乳動物の細胞の生物学的機能の制御において重要な役割を果たすが、ＲＯＳが過剰に産生されると、細胞内生体高分子に与える酸化損傷作用により細胞死が誘導される可能性がある。細胞死を誘導することは様々な種類のがんの治療において望ましく、したがってＲＯＳは、抗腫瘍療法として重要な役割を果たす。
【0148】
実際、分子標的薬及び化学療法剤等の一部の抗がん薬は、ＲＯＳの産生を誘導することによりがん細胞を効果的に死滅させる。加えて、光線力学的療法（ＰＤＴ）は、主として、がん細胞を死滅させるためにＲＯＳバーストを誘発することに基づいている。電離放射線を利用する放射線療法により細胞死が誘導される機序は、ＲＯＳ産生とも称される。したがって、本明細書において用いられる「活性酸素種（ＲＯＳ）誘導剤」は、ＲＯＳの産生を誘導する任意の薬剤を指す。
【0149】
上に述べたように、本明細書において定義する単離されたポリペプチドは、少なくとも１種の抗がん剤と一緒に投与される。「少なくとも１種の」という語は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれを超える種類の本明細書において定義する抗がん剤を含むことを意味する。
【0150】
上に述べたように、本発明は、細胞に本開示の単離されたポリペプチドを投与することにより、ＴＮＢＣ細胞の細胞表面上のヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）受容体の発現が増加し、これらの細胞が、ＨＥＲ２受容体に対する標的療法を受けやすくなることを見出したことに基づく。実際、ペプチドＡＰＣ１及びカドサイラの両方で処理された細胞のアポトーシスレベルが、カドサイラ単独で処理された細胞よりも少なくとも２．５倍高くなった。添付の実施例においても、本開示のペプチドによってエストロゲン受容体の発現が増加し、タモキシフェン（例えば、図１１、図１２、及び図１３）及び他の抗がん剤、即ち、ドキソルビシン及びシスプラチン（図１４、図１５、図１６、及び図１７）の効果が実証された。
【0151】
したがって本開示は、本発明の単離されたポリペプチドを、少なくとも１種の抗がん剤と一緒に投与する併用療法を提供する。換言すれば、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法であって、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体を、少なくとも１種の抗がん剤と組み合わせて前記患者に投与することを含む、方法を提供する。
【0152】
更に本発明は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤との組合せを提供する。
【0153】
「併用（組合せ）（combination）」又は「併用療法」という語は、２種以上の薬剤（即ち、本明細書において定義する単離されたポリペプチド及び少なくとも１種の抗がん剤）の同時又は連続投与を意味することができる。例えば、並行（concurrent）（同時）投与は、２種以上の薬剤が並行して（同時に）投与されることを意味し、連続投与は、２種以上の薬剤が異なる時点で、任意選択で異なる投与経路により患者に投与されることを意味する。
【0154】
特定の実施形態において、本明細書に定義する組合せは、前記患者の前記少なくとも１種の抗がん剤に対する反応性を、前記少なくとも１種の抗がん剤単独で処理した細胞又は器官の対応する比率と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、又は約１０００％増大させる。
【0155】
様々な実施形態において、本開示による単離されたポリペプチドは、前記少なくとも１種の抗がん剤を投与する前、同時、又は後に投与される。単離されたポリペプチド及び本明細書に定義した少なくとも１種の抗がん剤の投与は、当該技術分野において知られている任意の経路により実施することができる。
【0156】
本発明による投与は次に示す経路のいずれかにより実施することができる：経口投与、静脈内、筋肉内、腹腔内、イントラテカル（intratechal）、若しくは皮下注射、直腸内投与、鼻腔内投与、眼内投与、又は局所投与。
【0157】
特定の実施形態において、本明細書において定義する単離されたポリペプチドは、前記少なくとも１種の抗がん剤を投与する前に投与される。更なる特定の実施形態において、本明細書において定義する単離されたポリペプチドは、前記少なくとも１種の抗がん剤を投与する約１～７日前に投与される。
【0158】
上に詳述したように、本発明は、がんの治療に用いるための方法及び単離されたポリペプチドを提供する。
【0159】
本明細書において用いられる「がん」及び「腫瘍」という語はその最も広義の意味で使用され、組織又は器官の過形成にも同様に関連する。組織がリンパ系又は免疫系の一部である場合、悪性細胞には循環細胞の非固形腫瘍も含むことができる。他の組織又は器官の悪性腫瘍は、固形腫瘍を生成させる可能性がある。一般に、本発明の方法及び更なる態様は、非固形腫瘍及び固形腫瘍の治療に使用することができる。がん及びがんの種類の診断は、当該技術分野において知られているように、熟練の内科医により行われる。
【0160】
がんの種類の非限定的な例としては、副腎皮質癌、黒色腫、悪性黒色腫、非黒色腫皮膚癌、カポジ肉腫、膀胱癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、神経外胚葉及び松果体癌、小児脳幹グリオーマ、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、小児髄芽腫、小児視経路グリオーマ、髄膜種、混合膠腫、乏突起神経膠腫、星状細胞腫、上衣腫、下垂体腺腫、メタスタシックアデノカルシノーマ（Metastasic Adenocarcinoma）、聴神経腫瘍、傍脊柱部奇形腫（Paravertebral teratoma）、乳癌、腺管癌、乳腺腫瘍、卵巣癌、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、妊娠性絨毛性癌（Gestational Trophoblastic cancer）、ファロペイン（Fallopain）、子宮肉腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、網膜芽細胞腫、軟部肉腫、ウィルムス腫瘍、ファンコニ貧血、ランゲルハンス細胞組織球症、腎臓の悪性ラブドイド腫瘍、肝臓癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、絨毛癌、内分泌癌、食道癌、ユーイング肉腫、眼癌、胃癌（gastric cancer）、消化器癌、尿生殖器癌、神経膠腫、婦人科癌、頭頸部癌、肝細胞癌、下咽頭癌、アイスレットコール（Islet call）癌、腎臓がん、喉頭癌、肺癌、男性乳癌、中皮腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非黒色腫皮膚癌、食道がん、骨肉腫、膵臓癌、下垂体癌、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌（stomach cancer）、精巣癌胸腺癌、甲状腺癌、移行上皮癌、絨毛性癌、急性リンパ性白血病、白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌、肛門癌、骨癌、腸癌、脂肪肉腫、腎芽細胞腫及び骨肉腫が挙げられる。
【0161】
本開示に包含される具体的ながんの種類は、前記少なくとも１種の抗がん剤に対する反応性を増大させることにより利益が得られるであろう、例えば、本明細書において定義する単離されたポリペプチドを投与することにより、少なくとも１種の細胞部位（例えば、幾つかを挙げると、受容体、細胞表面受容体）の発現量が増加することによりそのことが示される、種類のがんに包含される。
【0162】
更なる特定の実施形態において、本開示によるがんは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は膵臓癌の少なくとも１種である。
【0163】
後に示すように、ＭＤＡ２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、及びＢＴＳ４９（全てトリプルネガティブ乳癌細胞株）に単離されたペプチドＡＰＣ１を投与すると、これらの細胞の分子部分、即ち受容体ＨＥＲ２を標的とする抗がん剤を用いた治療に対する感受性が増大した。したがって、特定の実施形態において、本明細書において定義するがんは乳癌である。更なる特定の実施形態において、本明細書において定義するがんはトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）である。
【0164】
「トリプルネガティブ乳癌」（ＴＮＢＣ）という語は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、又はＨｅｒ２／ｎｅｕの遺伝子を発現しない任意の乳癌を指す。ほとんどの化学療法は上の３種の受容体のうちの１つを標的としているため、この受容体を発現しないＴＮＢＣは治療がより困難である。
【0165】
当該技術分野において知られているように、ホルモン療法（例えば、抗エストロゲン）又は標的療法（例えば、トラスツズマブ）等の特定の乳癌治療戦略は、腫瘍細胞が対応する受容体及び標的を発現する場合にのみ有効である。乳癌では、ホルモン療法にはエストロゲン（ＥＲ）及び／又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）が有効に発現していることが必要であり、一方、トラスツズマブ療法は、それをコードするがん遺伝子であるＥＲＢＢ２の増幅に起因してＨＥＲ２が過剰発現している腫瘍にのみ適用される。上に示したように、標的療法（例えば、ホルモン療法及びトラスツズマブ）は、化学療法よりも有害な副作用が少なく、化学療法よりも更なる利点がある（例えば、患者の無病生存率及び全生存期間の延長）。ところが、一部のがん腫瘍はＥＲもＰＲも発現せず、ＨＥＲ２も過剰発現していない（例えば、ＴＮＢＣ）。
【0166】
トリプルネガティブ乳癌は、異種の癌の群を含む。あらゆる種類のＴＮＢＣが本開示に包含される。上記及び他の実施形態において、ＴＮＢＣは、進行ＴＮＢＣ、局所進行ＴＮＢＣ、又は転移性ＴＮＢＣである。
【0167】
他の一態様により、本開示は、それを必要とする患者のトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を治療するための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを投与することを含む、方法を提供する。
【0168】
更に本開示は、それを必要とする患者のトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を治療するための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを提供する。
【0169】
更なる特定の実施形態において、本明細書に定義する前記少なくとも１種の抗がん剤は、ＨＥＲ２、ＥＲ、及び／又はＰＲを対象とする。
【0170】
様々な特定の実施形態において、本明細書に定義する単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞のヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）の少なくとも１種の発現を増加させる。
【0171】
更なる特定の実施形態において、本開示による抗がん剤は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体（例えば、本明細書に定義する抗がん剤は、カドサイラやハーセプチン等のＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体に対する抗体である）、ＥＲ（例えば、本明細書に定義する抗がん剤は、タモキシフェン又はラロキシフェンである）、又はＰＲと相互作用する。
【0172】
更なる実施形態において、本開示による少なくとも１種の抗がん剤は、化学療法剤、好ましくは、ドキソルビシン又はドキソルビシン誘導体、シスプラチン、タキソール、又は活性酸素種（ＲＯＳ）誘発剤である。
【0173】
本明細書において用いられる「治療する（treat）」「治療すること（treating）」「治療（treatment）」という語は、本明細書において定義する患者の疾患の活動性の１種又は複数種の臨床的兆候を改善することを意味する。「治療」とは、療法的治療を指す。治療を必要とするのは、がんに罹患している哺乳動物の被験体である。したがって、「患者」又は「それを必要とする患者」という語は、本明細書において定義する単離されたポリペプチド及び少なくとも１種の抗がん剤又はその任意の医薬組成物を、がん、特にヒトの患者のがんを克服するか又は少なくとも進行を遅らせるために投与することが所望される任意の哺乳動物、例えばヒトを意味する。がんの診断は熟練の内科医に知られている方法により実施することができる。
【0174】
幾つかの実施形態において、本発明によるそれを必要とする患者は、乳癌と診断されているか又は罹患している被験体であり、特定の実施形態において、それを必要とする患者は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）と診断されているか又は罹患している被験体を指す。
【0175】
様々な実施形態において、本明細書において定義するそれを必要とする患者は、事前に化学療法を施されており、がんが進行又は再発している。
【0176】
更に本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するため又はトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）を治療するための医薬の調製における、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤との使用を提供する。
【0177】
上に示したように、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを投与することを含む、方法を提供する。
【0178】
後に詳述するように、本開示により、がん細胞（又は場合により動物）に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列ＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫを有するペプチドＡＰＣ１を投与することにより、抗がん剤を用いた治療に対するがん細胞の反応性が増大したことを例示する。
【0179】
本明細書において定義する「単離されたポリペプチド」という語は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（本明細書において「ＡＰＣ１」と称する）、又は配列番号：１で表されるアミノ酸配列の機能性断片若しくは誘導体、又は前記単離されたペプチドの医薬上許容される塩を包含する。「単離された」という語は、それらの本来の環境から取り出され、単離又は分離された、本明細書に記載するアミノ酸配列、ペプチド、又はポリペプチド等の分子を指す。
【0180】
特定の実施形態において、本開示による単離されたポリペプチドは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる。他の実施形態において、本開示による単離されたポリペプチドは、配列番号：２又は配列番号：３で表されるアミノ酸配列からなる。
【0181】
上に示したように、「ポリペプチド」は、任意選択的に、そのアミノ酸残基の１つ又は複数が修飾、例えば、マノシレーション（manosylation）、グリコシル化、アミド化（例えば、Ｃ末端アミド）、カルボキシル化、又はリン酸化されていてもよい、アミノ酸残基の分子鎖を指す。本開示のポリペプチドは、合成により、遺伝子工学的方法により、宿主細胞内で発現させることにより、又は当該技術分野において知られている他の任意の好適な手段により得ることができる。ペプチド又はポリペプチドを作製するための方法は当該技術分野においてよく知られている。
【0182】
本明細書において用いられる「アミノ酸」という語は、天然又は合成のアミノ酸残基に加えて、天然のアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸擬似体を指す。天然のアミノ酸とは、遺伝暗号によりコードされるものに加えて、後段で修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸、及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸という語は、Ｌ－アミノ酸、及びＬ－アミノ酸の鏡像体である、α炭素に対する鏡像異性を反転させた、Ｄ－アミノ酸を包含する。
【0183】
「アミノ酸配列」又は「ポリペプチド配列」という語は、ペプチド及びタンパク質の鎖中に存在するペプチド結合で連結しているアミノ酸残基の順序にも関係している。この配列は、一般に、遊離アミノ基を含むＮ末端から遊離カルボキシル基を含むＣ末端までが報告される。
【0184】
「含む（comprising）」という語は、本開示による単離されたポリペプチドが、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含むが、このペプチドのＮ末端又はＣ末端又はその両方の末端に、更なるアミノ酸残基も含むことができる（例えば、単離されたポリペプチドは、配列番号：２又は配列番号：３で表されるアミノ酸配列（両方共、そのＣ末端に配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む）からなるように、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含むことができる）ことを意味する。単離されたポリペプチドは、本開示により、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含み、配列番号：１で表されるペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に保護基も有するポリペプチドも包含する。保護基は、当該技術分野において知られており、とりわけ、アルコール保護基、アミン保護基、カルボニル保護基等が含まれる。
【0185】
上に示したように、本開示は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能性断片又は誘導体を含む単離されたポリペプチドも包含する。
【0186】
本明細書において定義する「断片」という語は、本発明によるポリペプチドから少なくとも１個のアミノ酸残基を欠失させることにより得られる、本開示による単離されたポリペプチドよりも少なくとも１個のアミノ酸が短い任意のペプチド又はポリペプチドを指す。
【0187】
具体的には、本発明による単離されたポリペプチドの断片は、配列番号：１で表される配列よりも１、２、３、４、５個、又はそれを超える個数のアミノ酸残基が短い、配列番号：１の連続したアミノ酸の一部を含むポリペプチドである。換言すれば、本明細書において定義する断片は、配列番号：１で表される配列の９、１０、１１、１２、１３、又は１４個のアミノ酸残基を含むことができる。
【0188】
「誘導体」という語は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含むが、その全配列中、１個又は複数個のアミノ酸残基が異なる、即ち、配列番号：１の配列全体の中に欠失、置換（例えば、少なくとも１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置き換わっている）、逆位、又は挿入を有するポリペプチドを含むことを意味する。この語はまた、全配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基が、それぞれのＤアミノ酸残基に置き換わっているものも包含する。誘導体は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の少なくとも１個のアミノ酸残基が合成アミノ酸残基、アミノ酸類似体、又はアミノ酸擬似体に置き換わっているものも包含する。
【0189】
アミノ酸の「置換」は、１個のアミノ酸が他のアミノ酸に、例えば、構造及び／又は化学的性質が類似している他のアミノ酸に置き換わった結果である（保存的アミノ酸置換）。アミノ酸の置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性の類似性に基づき行うことができる。例えば、次に示す８つの群は、互いに保存的置換となるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）。
【0190】
アミノ酸置換はまた、配列番号：１で表される配列の少なくとも１個のアミノ酸残基を、上に定義し、当該技術分野において知られている、少なくとも１種の合成アミノ酸残基により行うことも、少なくとも１種のアミノ酸類似体又はアミノ酸擬似体により行うこともできる。
【0191】
これらの改変されたポリペプチド断片又は誘導体は、元のペプチドの生物活性を変化させてはならないことが理解される。「機能性」という語は、未改変ポリペプチド（配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有する）の生物活性と定性的に類似した生物活性を保持している、配列番号：１で表されるアミノ酸配列の任意の断片又は誘導体を包含する。本明細書において定義する断片又は誘導体の生物活性は、当該技術分野において知られている任意の方法により、例えば、本明細書に記載するもの、即ち、前記断片又は誘導体が、がん細胞の本明細書において定義する少なくとも１種の細胞部位の発現を増加することを監視することにより決定することができる。
【0192】
特定の実施形態において、本開示は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドの機能性断片又は誘導体に関し、前記機能性断片又は誘導体は、本発明の未改変の単離されたポリペプチド、即ち、配列番号：１、配列番号：２、又は配列番号：３で表されるアミノ酸配列のうちの１つのアミノ酸配列との同一性が、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、より好ましくは９５％、特に９９％である、アミノ酸配列を有する。
【0193】
したがって、様々な実施形態において、本開示は、それを必要とする患者のがんを治療するための方法であって、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、少なくとも１種の抗がん剤とを前記患者に投与することを含み、機能性断片又は誘導体は、配列番号：１で表されるアミノ酸配列との同一性が、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【0194】
本開示の単離されたペプチド及び／又は抗がん剤は、当該技術分野において知られている任意の方法によって、それ自体を、又は当該技術分野において知られている医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は生理食塩水）と一緒に、投与することができる。更に、本明細書において定義する単離されたペプチドの任意の医薬上許容される塩又は溶媒和物が本開示に包含される。
【0195】
換言すれば、本明細書において定義する単離されたポリペプチド及び／又は前記少なくとも１種の抗がん剤は、任意選択で、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を更に含む医薬組成物中に含まれる。単離されたポリペプチド及び抗がん剤は、別々の医薬組成物に含まれていても、同一の医薬組成物に含まれていてもよい。
【0196】
本開示の医薬組成物は、一般に、当該技術分野において知られている緩衝剤、その浸透圧を調整する薬剤、並びに任意選択で、１種又は複数種の医薬上許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む。補助的な有効成分も組成物に組み込むことができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの好適な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒とすることができる。
【0197】
様々な実施形態において、本開示による単離されたポリペプチド及び／又は前記抗がん剤は、治療有効量で投与される。
【0198】
当該技術分野において知られているように、「治療有効量」という語は、研究者、獣医師、医師（medical doctor）、又は他の臨床家が求めている、組織、系、動物、又はヒトの生物学的又は医学的応答を誘発しうる薬物又は医薬品（即ち、本明細書において定義する単離されたポリペプチド及び抗がん剤）の量を意味することを意図している。治療有効量の決定は、当該技術分野においてよく知られている臨床パラメータに基づき熟練の内科医により行うことができる。
【0199】
ヒトに対する治療的に有効なＡＰＣ１の用量は、当業者により、当該技術分野において知られている方法により、例えば、本明細書において後に例示する試験により評価することができる。
【0200】
後の実施例において示すように、ペプチドＡＰＣ１は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体に対する抗体、エストロゲン受容体に対するタモキシフェンに加えて、他の作用機序により作用するドキソルビシン及びシスプラチンを含む様々な抗がん剤に対するがん細胞の反応性を増大させた。したがって本発明は、それを必要とする患者のがん細胞の少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させるための方法であって、前記患者に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体を投与することを含む方法を更に提供し、前記単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を調節し、それによって前記がん細胞の前記少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させる。
【0201】
本発明の更なる他の態様により、それを必要とする患者のがん細胞の少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させるための方法に使用するための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体が提供され、前記単離されたポリペプチドは、前記患者のがん細胞の少なくとも１種の細胞部位の発現を調節し、それによって前記がん細胞の前記少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させる。
【0202】
特定の実施形態において、本発明によるがん細胞の感受性を増大させるための方法は、前記患者に前記少なくとも１種の抗がん剤を投与することを更に含む。
【0203】
更なる特定の実施形態における、本発明によるがん細胞の感受性を増大させるための方法において、前記がんは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、又は大腸癌、Ｂ細胞リンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、又は膵臓癌の少なくとも１種である。
【0204】
それを必要とする患者のがん細胞の少なくとも１種の抗がん剤に対する感受性を増大させる方法の更なる他の特定の実施形態においては、本明細書に定義する前記単離されたポリペプチドを、結腸直腸癌細胞及び肺癌細胞に投与してこれらの細胞をＥＧＦＲ陽性細胞に形質転換し、それにより、これらの細胞に、古典的なＥＧＦＲ阻害剤、例えばＥＧＦＲに結合して細胞死を誘導するモノクローナル抗体を用いた治療に対する感受性を付与する。
【0205】
幾つかの実施形態において、本明細書において定義するがん細胞の分化を誘発する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで実施され、他の実施形態においては、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。
【0206】
本開示に関連する「感受性の増大」という語は、本明細書において定義する単離されたペプチドで処理していない細胞と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、又は約１０００％、特定の刺激、この場合は、本明細書に定義した細胞部位を標的とする抗がん剤の効果を受けやすい、反応しやすい、影響を受けやすい、又は応答しやすくなったがん細胞の状態を指す。
【0207】
特に本開示の単離されたポリペプチドの投与を行っていないがん細胞は、無処理（naive）であり、本明細書において定義する細胞部位を標的とする抗がん剤の効果に対し非感受性又は非反応性であると称する。様々な実施形態において、本明細書において定義する単離されたポリペプチドは、ホルモン療法にもはや応答せず、その効力が弱まった前立腺癌細胞を、ホルモン療法に応答する細胞に形質転換することができる。
【0208】
更なる実施形態において、本開示による単離されたポリペプチドは、ＥＧＦＲ阻害剤に応答しない肺癌細胞がレスポンダー細胞になるように形質転換する（それにより、ＥＧＦＲ阻害剤に反応しない肺癌細胞のＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性が増大される）。
【0209】
更なる他の実施形態において、本開示による単離されたポリペプチドは、ＥＧＦＲ阻害剤に応答しない結腸直腸がん（ＣＲＣ）細胞を形質転換してレスポンダーにする（それにより、ＥＧＦＲ阻害剤に応答しないＣＲＣ細胞のＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性が増大される）。
【0210】
本明細書において定義する本発明の単離されたペプチドと併用することができる抗がん剤の、具体的な、但し非限定的な例としては、これらに限定されるものではないが、カドサイラ、ハーセプチン、タモキシフェン、シスプラチン、及びドキソルビシンが挙げられる。
【0211】
本明細書において用いられる「がん細胞」という語は、任意の種類のがん及びそれに由来する任意の種類のがん細胞を包含することを意味する。
【0212】
更に本議論は：
（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、任意選択で、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と；
（ｉｉ）抗がん剤と、任意選択で、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と；
を含む、キットを提供する。
（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体と、任意選択で、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と；
（ｉｉ）抗がん剤と、任意選択で、医薬上許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と；
を含む、キットを提供する。
【0213】
様々な特定の実施形態において、本発明によるキットは、前記少なくとも１種の細胞部位と直接的又は間接的に相互作用する抗がん剤に関する。更なる実施形態において、本発明によるキットは、細胞部位を標的とする抗がん剤に関する。
【0214】
幾つかの実施形態において、本発明によるキットは使用説明書を更に含む。
【0215】
他の実施形態において、本発明によるキットは、免疫療法剤、化学療法剤、シグナル伝達阻害剤、受容体阻害剤、遺伝子発現調節剤、アポトーシス誘導物質、血管新生阻害剤、ホルモン療法剤、代謝阻害剤、抗自食作用剤、小胞体ストレス誘導剤、活性酸素種（ＲＯＳ）誘導剤、又はこれらの組合せである、抗がん剤に関する。
【0216】
更なる実施形態において、本発明によるキットは、配列番号：１で表されるアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドに関する。
【0217】
更に本開示は、それを必要とする患者のがんを治療する方法に使用するための、本明細書において定義するキットを提供する。
【0218】
様々な特定の実施形態において、本明細書において定義する単離されたポリペプチドは、単回投与することができる。更なる実施形態において、本明細書において定義する単離されたポリペプチドは、反復投与することができる。
【0219】
本明細書において用いられる「約」という語は、言及した値から１％、より具体的には５％、より具体的には１０％、より具体的には１５％、場合によっては２０％、高い又は低い方向に逸れていてもよい値を示唆し、この逸脱範囲には、整数値が包含され、適切であれば、連続する範囲を構成する非整数値も包含される。
【0220】
開示及び説明を行ってきたが、本発明は、本明細書に開示された具体的な例、方法ステップ、及び組成物は、幾分変化し得るため、このような方法ステップ及び組成物に限定されないことを理解すべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ限定されるので、本明細書において用いる専門用語も、具体的な実施形態を説明する目的にのみ使用され、限定を意図するものではないことを理解すべきである。
【0221】
「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（includes）」、「含む（including）」、「有する（having）」、及びそれらの活用形は、「含むが、それらに限定されない」ことを意味する。この語は「からなる（consisting of）」及び「から基本的になる（consisting essentially of）」という語を包含する。「から基本的になる」という句は、組成物又は方法が、追加の構成要素及び／又はステップを含み得るが、この追加の構成要素及び／又はステップが、特許請求する組成物又は方法の基本的及び新規な特徴を実質的に変えない場合に限られることを意味する。本明細書及び実施例及び後述の特許請求の範囲全体を通して、文脈によりそうでないことが必要でない限り、「含む（comprise）」、並びにその変化形である「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等は、明言された整数又はステップ又は整数若しくはステップの群を含むが、他の任意の整数又はステップ又は整数若しくはステップの群を除外しないことを示唆していると理解される。
【0222】
本明細書において用いられる「方法」という語は、所与の課題を達成するための様式、手段、技法、及び手順を指し、これらに限定されるものではないが、化学、薬理学、生物学、生化学、及び医学分野の専門家に知られている様式、手段、技法、及び手順、又は当該専門家によって、公知の様式、手段、技法、及び手順から容易に開発される、様式、手段、技法、及び手順が含まれる。
【0223】
本開示は、がん細胞の分化を誘導する方法であって、前記細胞に、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド又はその機能性断片若しくは誘導体を投与することを含む、方法を更に提供する。
【0224】
「分化を誘導する」又は「分化の誘導」という語は、細胞生化学の変化、成長の阻害、及び細胞タイプの分化の促進を、引き起こす、発生させる、促進する、又は影響を与えることを指す。
【0225】
幾つかの実施形態において、本明細書において定義する単離されたポリペプチドは、肺、大腸、前立腺、又は乳房のがん幹細胞の分化を誘導し、これらの細胞がこれらの疾患の古典的な標的抗がん療法に応答するようにする。
【0226】
上の実施形態は、本発明の様々な態様、即ち、本発明に使用するための、治療方法、がん細胞の感受性を増大させる方法、単離されたペプチド、及び追加の抗がん剤、並びにキットに等しく言及していることに留意されたい。
【0227】
本明細書及び特許請求の範囲に用いる単数形「１の（a、an）」及び「その（the）」は、文脈が明らかにそれ以外を指示していない限り、複数形も含むことに留意しなければならない。
【0228】
本明細書及び実施例及びそれに続く特許請求の範囲全体を通して、文脈がそうでないことを必要としていない限り、「含む（comprise）」という語及びその変化形である「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等は、明記した整数又はステップ又は整数若しくはステップの群を包含するが、他の整数又はステップ又は整数若しくはステップの群を除外しないことを示唆していることが理解される。
【0229】
以下に示す実施例は、本発明者らが本発明の態様を実施する際に用いる技法の代表的なものである。これらの技法は、本発明を実施するための好ましい実施形態の例示であって、当業者は、本開示に照らし、本発明の主旨及び意図された範囲から逸脱することなく多くの修正を行うことができることを認識するであろう。
【実施例】
【0230】
実施例
実験手順
材料
本明細書において以下に特に指定しない限り、細胞用培地（５００ｍｌ当たり）は、５０ｍｌ ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０４－１２１－１Ａ）、５ｍｌ ピルビン酸ナトリウム１１ｍｇ／ｍｌ（１００ｍＭ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０３－０４２－１Ｂ）、０．５ｍｌ アンホテリシンＢ ２５００μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０３－０２９－１）、及び５ｍｌ ゲンタマイシン硫酸塩 ５０ｍｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０３－０３５－１）を含む、高グルコースＬ－グルタミン含有ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、４１９６５－０３９）又はＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１８７５）とした。
Ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０３－０５２－１Ｂ）。
培養フラスコ：７５ｃｍ２（Ｎｕｎｃ、カタログ番号１７８９０５）、２５ｃｍ２（Ｎｕｎｃ、カタログ番号１３６１９６）。
チェンバースライド（８ウェル、Ｎｕｎｃ、カタログ番号１５４５３４）。
ＡＰＣ１（リン酸緩衝生理食塩水中、５０ｍｇ／ｍｌ）。ＡＰＣ－１ペプチド（Ｎｏｖｅｔｉｄｅ、Ｉｓｒａｅｌ）は、アミノ酸配列ＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫ（配列番号：１で表す）を有する。ＡＰＣ１をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で可溶化した。
カドサイラ、１００ｍｇ（トラスツズマブエムタンシン、Ｒｏｃｈｅ）、０．４５％生理食塩水で２０ｍｇ／ｍｌ溶液を用時調製する。
キシレン（Ｓｉｇｍａ ＃５３４０５６）。
エタノール、無水、未変性、組織学用（１００％ Ｓｏｌｕｆｉｘ ＃Ｅ００３及び９５％ Ｓｉｇｍａ ＃３２２９４）。
脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）。
ヘマトキシリン Ｇｉｌｌ２（Ｓｉｇｍａ、＃ＧＨＳ２１６）。
実験手順
材料
本明細書において以下に特に指定しない限り、細胞用培地（５００ｍｌ当たり）は、５０ｍｌ ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０４－１２１－１Ａ）、５ｍｌ ピルビン酸ナトリウム１１ｍｇ／ｍｌ（１００ｍＭ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０３－０４２－１Ｂ）、０．５ｍｌ アンホテリシンＢ ２５００μｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０３－０２９－１）、及び５ｍｌ ゲンタマイシン硫酸塩 ５０ｍｇ／ｍｌ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０３－０３５－１）を含む、高グルコースＬ－グルタミン含有ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、４１９６５－０３９）又はＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２１８７５）とした。
Ｔｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０３－０５２－１Ｂ）。
培養フラスコ：７５ｃｍ２（Ｎｕｎｃ、カタログ番号１７８９０５）、２５ｃｍ２（Ｎｕｎｃ、カタログ番号１３６１９６）。
チェンバースライド（８ウェル、Ｎｕｎｃ、カタログ番号１５４５３４）。
ＡＰＣ１（リン酸緩衝生理食塩水中、５０ｍｇ／ｍｌ）。ＡＰＣ－１ペプチド（Ｎｏｖｅｔｉｄｅ、Ｉｓｒａｅｌ）は、アミノ酸配列ＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫ（配列番号：１で表す）を有する。ＡＰＣ１をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で可溶化した。
カドサイラ、１００ｍｇ（トラスツズマブエムタンシン、Ｒｏｃｈｅ）、０．４５％生理食塩水で２０ｍｇ／ｍｌ溶液を用時調製する。
キシレン（Ｓｉｇｍａ ＃５３４０５６）。
エタノール、無水、未変性、組織学用（１００％ Ｓｏｌｕｆｉｘ ＃Ｅ００３及び９５％ Ｓｉｇｍａ ＃３２２９４）。
脱イオン水（ｄＨ２Ｏ）。
ヘマトキシリン Ｇｉｌｌ２（Ｓｉｇｍａ、＃ＧＨＳ２１６）。
【0231】
細胞
トリプルネガティブ乳房腫瘍細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＤＭＥＭ中で培養）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＲＰＭＩ中で培養）、及びＢＴＳ－１４９（ＲＰＭＩ中で培養）をＡＴＣＣから入手した。本明細書においては、細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８を、それぞれ「ＭＤＡ２３１」及び「ＭＤＡ４６８」とも称する。
トリプルネガティブ乳房腫瘍細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＤＭＥＭ中で培養）、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＲＰＭＩ中で培養）、及びＢＴＳ－１４９（ＲＰＭＩ中で培養）をＡＴＣＣから入手した。本明細書においては、細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８を、それぞれ「ＭＤＡ２３１」及び「ＭＤＡ４６８」とも称する。
【0232】
細胞用培地の維持
トリプルネガティブ乳房腫瘍細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、及びＢＴＳ－１４９）を、３７℃、５％ＣＯ２を含むインキュベーターで密度が７０～８０％（この密度を超えるべきではない）に達するまで増殖させた。次いで増殖培地を捨て、細胞用フラスコをＴｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ ５ｍｌで洗浄した。次いで追加のＴｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ ５ｍｌを細胞用フラスコに加え、細胞用フラスコをインキュベーターに移し、大部分の細胞がもはやフラスコに付着しなくなるまで待った（細胞の剥離量を増やそうとしてフラスコを叩くべきではない；この手続きには数分を要する）。次いでトリプシン処理した細胞に培地（１０ｍｌ）を加えた。最後に培地及びトリプシンに懸濁させた細胞を２個のフラスコに分割して、各フラスコに新鮮な培地１５ｍｌを加えた。細胞を上述の条件のインキュベーターに移し、約７０～８０％の密度に達するまで２～３日間待ち、必要に応じて上の手順を繰り返した。本明細書で使用した他の細胞株は当該技術分野において知られているように増殖させた。
トリプルネガティブ乳房腫瘍細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、及びＢＴＳ－１４９）を、３７℃、５％ＣＯ２を含むインキュベーターで密度が７０～８０％（この密度を超えるべきではない）に達するまで増殖させた。次いで増殖培地を捨て、細胞用フラスコをＴｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ ５ｍｌで洗浄した。次いで追加のＴｒｙｐｓｉｎ ＥＤＴＡ ５ｍｌを細胞用フラスコに加え、細胞用フラスコをインキュベーターに移し、大部分の細胞がもはやフラスコに付着しなくなるまで待った（細胞の剥離量を増やそうとしてフラスコを叩くべきではない；この手続きには数分を要する）。次いでトリプシン処理した細胞に培地（１０ｍｌ）を加えた。最後に培地及びトリプシンに懸濁させた細胞を２個のフラスコに分割して、各フラスコに新鮮な培地１５ｍｌを加えた。細胞を上述の条件のインキュベーターに移し、約７０～８０％の密度に達するまで２～３日間待ち、必要に応じて上の手順を繰り返した。本明細書で使用した他の細胞株は当該技術分野において知られているように増殖させた。
【0233】
ＡＰＣ１の存在下における細胞増殖
細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、及びＢＴＳ－１４９）を密度が７０～８０％に達するまで増殖させた。次いで増殖培地を捨て、細胞を上に述べたようにトリプシン及び培地で処理した。細胞を表面から剥離させ、細胞懸濁液（即ち、培地及びトリプシン中の細胞）２０ｍｌを５０ｍｌのコニカルチューブに移して、３００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。次いで上清を捨て、新鮮な培地２ｍｌを細胞ペレットに加えた。次いで細胞を流動化し、培地１３ｍｌをチューブに加え、それにより細胞を合計１５ｍｌの培地中に懸濁させた。細胞を計数し、増殖培地１ｍｌ中に１０，０００～１５，０００個／ｗｅｌｌでチェンバースライドに播種した。細胞を播種したチェンバースライドをフードに移し、１時間後にインキュベーターに移し、上述の条件下に一晩インキュベートした。翌日、細胞用チェンバースライドから培地を吸引して捨て、ＡＰＣ１を添加した細胞処理培地１ｍｌ（終濃度１００又は２５０μｇ／ｍｌ）又は対照培地（培地のみ）。培地を各ウェルに添加した（凍結融解サイクルを繰り返すことを避けるため、ＡＰＣ１をアリコートとして利用した）。次いで細胞を２４～１４４時間インキュベートした。任意選択で、処理された細胞にＡＰＣ１の追加投与量を投与し、この細胞を２回目の投与量の存在下に更に９６時間までインキュベートし、３回目の投与量の存在下に１４４時間までインキュベートした。細胞を回収し、以下に詳述するように更に分析した。
細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、及びＢＴＳ－１４９）を密度が７０～８０％に達するまで増殖させた。次いで増殖培地を捨て、細胞を上に述べたようにトリプシン及び培地で処理した。細胞を表面から剥離させ、細胞懸濁液（即ち、培地及びトリプシン中の細胞）２０ｍｌを５０ｍｌのコニカルチューブに移して、３００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。次いで上清を捨て、新鮮な培地２ｍｌを細胞ペレットに加えた。次いで細胞を流動化し、培地１３ｍｌをチューブに加え、それにより細胞を合計１５ｍｌの培地中に懸濁させた。細胞を計数し、増殖培地１ｍｌ中に１０，０００～１５，０００個／ｗｅｌｌでチェンバースライドに播種した。細胞を播種したチェンバースライドをフードに移し、１時間後にインキュベーターに移し、上述の条件下に一晩インキュベートした。翌日、細胞用チェンバースライドから培地を吸引して捨て、ＡＰＣ１を添加した細胞処理培地１ｍｌ（終濃度１００又は２５０μｇ／ｍｌ）又は対照培地（培地のみ）。培地を各ウェルに添加した（凍結融解サイクルを繰り返すことを避けるため、ＡＰＣ１をアリコートとして利用した）。次いで細胞を２４～１４４時間インキュベートした。任意選択で、処理された細胞にＡＰＣ１の追加投与量を投与し、この細胞を２回目の投与量の存在下に更に９６時間までインキュベートし、３回目の投与量の存在下に１４４時間までインキュベートした。細胞を回収し、以下に詳述するように更に分析した。
【0234】
ＡＰＣ１及びカドサイラの存在下における細胞増殖
細胞を７０～８０％の密度に達するまで増殖させた。次いで増殖培地を捨て、上に述べたように細胞をトリプシン及び培地で処理した。次いでトリプシン及び培地中に懸濁した細胞を５０ｍｌコニカルチューブに移し、３００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。次いで上清を捨て、新鮮な培地２ｍｌを細胞ペレットに加えた。細胞を流動化させ、追加の培地１３ｍｌを細胞に加え、細胞が合計１５ｍｌの培地中に懸濁するようにした。細胞を計数し、それぞれ約４０，０００個の細胞を１０ｍｌの培地（各フラスコ中）を含む９本の２５ｃｍ２フラスコに入れた。細胞をインキュベーターに一晩放置した。翌日、上清を捨て、１０ｍｌの２．５％ＦＢＳ（１０％ＦＢＳに替えて）を含むＤＭＥＭ又はＲＰＭＩに交換した。実施例として細胞用フラスコを次に示すように更に処理した：
フラスコ１＋９：無処理
フラスコ２：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１
フラスコ３：無処理
フラスコ４：無処理
フラスコ５：無処理
フラスコ６：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１
フラスコ７：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１
フラスコ８：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１
細胞を７０～８０％の密度に達するまで増殖させた。次いで増殖培地を捨て、上に述べたように細胞をトリプシン及び培地で処理した。次いでトリプシン及び培地中に懸濁した細胞を５０ｍｌコニカルチューブに移し、３００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。次いで上清を捨て、新鮮な培地２ｍｌを細胞ペレットに加えた。細胞を流動化させ、追加の培地１３ｍｌを細胞に加え、細胞が合計１５ｍｌの培地中に懸濁するようにした。細胞を計数し、それぞれ約４０，０００個の細胞を１０ｍｌの培地（各フラスコ中）を含む９本の２５ｃｍ２フラスコに入れた。細胞をインキュベーターに一晩放置した。翌日、上清を捨て、１０ｍｌの２．５％ＦＢＳ（１０％ＦＢＳに替えて）を含むＤＭＥＭ又はＲＰＭＩに交換した。実施例として細胞用フラスコを次に示すように更に処理した：
フラスコ１＋９：無処理
フラスコ２：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１
フラスコ３：無処理
フラスコ４：無処理
フラスコ５：無処理
フラスコ６：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１
フラスコ７：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１
フラスコ８：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１
【0235】
上に示したように処理した細胞をインキュベーターで４８時間インキュベートした。次いでＡＰＣ１の２回目投与量（終濃度を同一とする）を細胞用フラスコ２、６、７、及び８に加え、細胞を更に２４時間インキュベートした。細胞が８５％コンフルエントに達したら、細胞の５０％をフラスコから掻き取った。培地を捨て、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ １０ｍｌを各フラスコに加えた。細胞用フラスコを、例えば、更に次に示すように処理した（ＡＰＣ１の３回目投与及び／又はカドサイラ）：
フラスコ１＋９：無処理
フラスコ２：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１
フラスコ３：５μｇ／ｍｌカドサイラ
フラスコ４：１０μｇ／ｍｌカドサイラ
フラスコ５：２５μｇ／ｍｌカドサイラ
フラスコ６：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１＋５μｇ／ｍｌカドサイラ
フラスコ７：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１＋１０μｇ／ｍｌカドサイラ
フラスコ８：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１＋２５μｇ／ｍｌカドサイラ（任意選択）
フラスコ１＋９：無処理
フラスコ２：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１
フラスコ３：５μｇ／ｍｌカドサイラ
フラスコ４：１０μｇ／ｍｌカドサイラ
フラスコ５：２５μｇ／ｍｌカドサイラ
フラスコ６：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１＋５μｇ／ｍｌカドサイラ
フラスコ７：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１＋１０μｇ／ｍｌカドサイラ
フラスコ８：２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１＋２５μｇ／ｍｌカドサイラ（任意選択）
【0236】
細胞を更に７２～９６時間インキュベートした。最後に細胞を回収し、次に示すように分析した（アポトーシスマーカーによるＦＡＣＳ解析又はＨＥＲ２発現の評価）。カドサイラ（トラスツズマブエムタンシン、Ｒｏｃｈｅ）は、秤量して０．４５％生理食塩水で希釈して濃度を２０ｍｇ／ｍｌとし、即座に使用した（残った溶液は廃棄）。
【0237】
換言すれば、細胞をＡＰＣ１の１回目投与量と共に４８時間、次いでＡＰＣ１の２回目投与量と共に２４時間インキュベートした後、培地を除去し、新鮮なＦＢＳ培地をＡＰＣ１の３回目投与量（最初の投与量と同一）と共に、指示がある場合はカドサイラと一緒に又はカドサイラなしで添加した。７２時間後、細胞をＦＡＣＳ解析に供した。
【0238】
ＡＰＣ１及びタモキシフェンで処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のレサズリン細胞生存率試験
材料
クリアボトム９６ウェル細胞培養プレート；
細胞培養培地：１０％ＦＢＳを添加した、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢ含有ＤＭＥＭ；
細胞毒性試験キット（比色検出）ａｂ１１２１１８；
タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ Ｔ５６４８）、２．５ｍｇ／ｍｌに希釈（６．６５ｍＭ）；
５０ｍｇ／ｍｌ ＡＰＣ１ストック溶液（ＰＢＳで希釈）；
細胞株：２５０μｇ／ｍｌのＡＰＣ１で週２回、１週間処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（特に指定がない場合）。
材料
クリアボトム９６ウェル細胞培養プレート；
細胞培養培地：１０％ＦＢＳを添加した、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢ含有ＤＭＥＭ；
細胞毒性試験キット（比色検出）ａｂ１１２１１８；
タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ Ｔ５６４８）、２．５ｍｇ／ｍｌに希釈（６．６５ｍＭ）；
５０ｍｇ／ｍｌ ＡＰＣ１ストック溶液（ＰＢＳで希釈）；
細胞株：２５０μｇ／ｍｌのＡＰＣ１で週２回、１週間処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（特に指定がない場合）。
【0239】
手順
ＡＰＣ１で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１を細胞培養培地（１００μｌ）を含む９６ウェルプレートに１０３個／ウェルで播種した。ＡＰＣ１で処理した細胞をＡＰＣ１ ２５０μｇ／ｍｌと一緒に播種し、一晩インキュベートした。次いで、次に示す処理液を培養培地中で２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１と一緒に又はＡＰＣ１を使用せずに調製した：対照、１０ｎＭタモキシフェン、５０ｎＭタモキシフェン、及び１００ｎＭタモキシフェン。次いで培地をプレートから吸引し、処理液（１００μｌ）を適切なウェルに加えた。各処理を３連で行い、細胞を４８時間インキュベートした。次いで細胞毒性試験キット（比色検出、ａｂ１１２１１８）２０μｌを各ウェルに加え、細胞を１時間インキュベートした。プレートを分光光度計にて５７０及び６０５のＯＤを読み取った。
ＡＰＣ１で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＭＤＡ－ＭＢ－２３１を細胞培養培地（１００μｌ）を含む９６ウェルプレートに１０３個／ウェルで播種した。ＡＰＣ１で処理した細胞をＡＰＣ１ ２５０μｇ／ｍｌと一緒に播種し、一晩インキュベートした。次いで、次に示す処理液を培養培地中で２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１と一緒に又はＡＰＣ１を使用せずに調製した：対照、１０ｎＭタモキシフェン、５０ｎＭタモキシフェン、及び１００ｎＭタモキシフェン。次いで培地をプレートから吸引し、処理液（１００μｌ）を適切なウェルに加えた。各処理を３連で行い、細胞を４８時間インキュベートした。次いで細胞毒性試験キット（比色検出、ａｂ１１２１１８）２０μｌを各ウェルに加え、細胞を１時間インキュベートした。プレートを分光光度計にて５７０及び６０５のＯＤを読み取った。
【0240】
次いで試験試料及び対照試料の細胞生存率を次式に基づき算出した：細胞生存率（％）＝１００×（Ｒｓａｍｐｌｅ－Ｒｏ）／（Ｒｃｔｒｌ－Ｒｏ）。
「Ｒｓａｍｐｌｅ」は試験化合物（ＡＰＣ１）の存在下における吸光度比ＯＤ５７０／ＯＤ６０５である。「Ｒｃｔｒｌ」は試験化合物の非存在下における吸光度比ＯＤ５７０／ＯＤ６０５であり（対照試料）、「Ｒｏ」はバックグラウンド（細胞を含まない対照）の吸光度比ＯＤ５７０／ＯＤ６０５の平均値である。
「Ｒｓａｍｐｌｅ」は試験化合物（ＡＰＣ１）の存在下における吸光度比ＯＤ５７０／ＯＤ６０５である。「Ｒｃｔｒｌ」は試験化合物の非存在下における吸光度比ＯＤ５７０／ＯＤ６０５であり（対照試料）、「Ｒｏ」はバックグラウンド（細胞を含まない対照）の吸光度比ＯＤ５７０／ＯＤ６０５の平均値である。
【0241】
ＡＰＣ１及びシスプラチン又はドキソルビシンで処理したＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞の細胞生存率試験（レサズリン）
材料
クリアボトム９６ウェル細胞培養プレート；
細胞培養培地は、１０％ＦＢＳを添加した、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢ含有ＤＭＥＭとした；
細胞毒性試験キット（比色検定）ａｂ１１２１１８；
シスプラチン（Ｓｉｇｍａ ＥＰＣＣ２２１０００）、使用直前にＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍｌに希釈（１３３．３ｍＭ）；
ドキソルビシン（Ｄ１５１５ Ｓｉｇｍａ）、ＤＷで５０ｍｇ／ｍｌに希釈（８６．６ｍＭ）（４℃で３週間まで保存可能）；
ＡＰＣ１、ＰＢＳで５０ｍｇ／ｍｌに希釈；
細胞株は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＡＰＣ１で処理（２５０μｇ／ｍｌ、週２回、１週間）したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞、及びＡＰＣ１で処理（２５０μｇ／ｍｌ、週２回、１週間）したＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞とした。
材料
クリアボトム９６ウェル細胞培養プレート；
細胞培養培地は、１０％ＦＢＳを添加した、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢ含有ＤＭＥＭとした；
細胞毒性試験キット（比色検定）ａｂ１１２１１８；
シスプラチン（Ｓｉｇｍａ ＥＰＣＣ２２１０００）、使用直前にＤＭＳＯで４０ｍｇ／ｍｌに希釈（１３３．３ｍＭ）；
ドキソルビシン（Ｄ１５１５ Ｓｉｇｍａ）、ＤＷで５０ｍｇ／ｍｌに希釈（８６．６ｍＭ）（４℃で３週間まで保存可能）；
ＡＰＣ１、ＰＢＳで５０ｍｇ／ｍｌに希釈；
細胞株は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＡＰＣ１で処理（２５０μｇ／ｍｌ、週２回、１週間）したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞、及びＡＰＣ１で処理（２５０μｇ／ｍｌ、週２回、１週間）したＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞とした。
【0242】
手順
細胞（１０３個）を、細胞培養培地（１００μｌ）を入れた９６ウェルプレートに播種した。ＡＰＣ１で処理した細胞をＡＰＣ１ ２５０μｇ／ｍｌと一緒に播種した。細胞を一晩インキュベートした。次いで、次に示す処理液を、培地中、ＡＰＣ１ ２５０μｇと一緒に又はＡＰＣ１を使用せずに調製した：対照、５００μＭシスプラチン、７５０μＭシスプラチン、１０００μＭシスプラチン、０．３μＭドキソルビシン、０．５μＭドキソルビシン、及び１μＭドキソルビシン。
細胞（１０３個）を、細胞培養培地（１００μｌ）を入れた９６ウェルプレートに播種した。ＡＰＣ１で処理した細胞をＡＰＣ１ ２５０μｇ／ｍｌと一緒に播種した。細胞を一晩インキュベートした。次いで、次に示す処理液を、培地中、ＡＰＣ１ ２５０μｇと一緒に又はＡＰＣ１を使用せずに調製した：対照、５００μＭシスプラチン、７５０μＭシスプラチン、１０００μＭシスプラチン、０．３μＭドキソルビシン、０．５μＭドキソルビシン、及び１μＭドキソルビシン。
【0243】
次いで培地をプレートから吸引し、処理液１００μｌを適切なウェルに加えた。各処理を３連で実施した。細胞を４８時間インキュベートした。次いで細胞毒性試験キット（比色検出、ａｂ１１２１１８）２０μｌを各ウェルに加え、細胞を１時間インキュベートし、５７０及び６０５のＯＤを、分光光度計を用いて測定した。試験試料及び対照試料の細胞生存率を次式に基づき上に詳述したように算出した：細胞生存率（％）＝１００×（Ｒｓａｍｐｌｅ－Ｒｏ）／（Ｒｃｔｒｌ－Ｒｏ）。
【0244】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析
ＦＡＣＳ解析を用いてアポトーシス又はＨＥＲ２発現に関し細胞を試験した。ＨＥＲ２抗体としてａｂｃａｍａｂ １６９０１を使用した。アポトーシスを評価するマーカーとしてＡｎｎｅｘｉｎ（Ｅｎｃｏ）を使用した。
ＦＡＣＳ解析を用いてアポトーシス又はＨＥＲ２発現に関し細胞を試験した。ＨＥＲ２抗体としてａｂｃａｍａｂ １６９０１を使用した。アポトーシスを評価するマーカーとしてＡｎｎｅｘｉｎ（Ｅｎｃｏ）を使用した。
【0245】
ＡＰＣ１で処理したヒト腫瘍細胞の免疫蛍光
ＡＰＣ１で処理したヒト腫瘍細胞の免疫蛍光に使用した材料を次に示す。スライド：Ｎｕｎｃ（商標） Ｌａｂ－Ｔｅｋ（商標）ＩＩ ＣＣ２（商標）チェンバースライドシステム（１５４９１７ Ｎｕｎｃ）、洗浄バッファー：ＰＢＳ（０２－０２３－５Ａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、固定液：ＰＢＳ中３％ホルムアルデヒド（２５２５４９ Ｓｉｇｍａ）、透過処理液：ＰＢＳ中０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０６９４ Ａｍｒｅｓｃｏ）、ブロッキング／抗体バッファー：１％ＢＳＡ（Ａ７９０６ Ｓｉｇｍａ）を添加したＰＢＳ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（０７７７ Ａｍｒｅｓｃｏ）含有）、一次抗体：抗ＥｒｂＢ ２抗体（３Ｂ５）（ａｂ１６９０１）ａｂｃａｍ、二次抗体：ロバ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８）血清吸着処理済み（ａｂ１５０１０９）、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）含有封入剤：Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ Ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（ａｂｃａｍ ａｂ１０４１３９）。
ＡＰＣ１で処理したヒト腫瘍細胞の免疫蛍光に使用した材料を次に示す。スライド：Ｎｕｎｃ（商標） Ｌａｂ－Ｔｅｋ（商標）ＩＩ ＣＣ２（商標）チェンバースライドシステム（１５４９１７ Ｎｕｎｃ）、洗浄バッファー：ＰＢＳ（０２－０２３－５Ａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、固定液：ＰＢＳ中３％ホルムアルデヒド（２５２５４９ Ｓｉｇｍａ）、透過処理液：ＰＢＳ中０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０６９４ Ａｍｒｅｓｃｏ）、ブロッキング／抗体バッファー：１％ＢＳＡ（Ａ７９０６ Ｓｉｇｍａ）を添加したＰＢＳ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（０７７７ Ａｍｒｅｓｃｏ）含有）、一次抗体：抗ＥｒｂＢ ２抗体（３Ｂ５）（ａｂ１６９０１）ａｂｃａｍ、二次抗体：ロバ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８）血清吸着処理済み（ａｂ１５０１０９）、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）含有封入剤：Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ Ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（ａｂｃａｍ ａｂ１０４１３９）。
【0246】
上に述べたように細胞をＡＰＣ１と一緒にインキュベートした後、培地を吸引し、各ウェルを洗浄バッファーで満たして細胞を洗浄した。バッファーを捨て、固定液３００μｌを各ウェルに加え、細胞を室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。次いで固定液を捨て、ウェルを洗浄バッファーで簡単に２回洗浄し、透過処理液３００μｌを各ウェルに加えた。次いで細胞をＲＴで１０分間インキュベートした。次いで透過処理液を捨て、各ウェルに洗浄バッファーを加え、５分間処理した後、洗浄バッファーを捨てた。洗浄が完了したら、ブロッキングバッファー（１ｍｌ）を各ウェルに加え、細胞をＲＴで１時間インキュベートした。インキュベート時間が終了する前に、最初の（一次）抗体を希釈、即ちＡｎｔｉ－ＥｒｂＢ ２抗体（３Ｂ５）（ａｂ１６９０１）ａｂｃａｍを抗体希釈バッファーで１：４００に希釈した。次いでブロッキングバッファーをウェルから捨て、一次抗体１２０μｌを各ウェルに加えた。細胞を覆い（パラフィルム又はダクトテープで）、４℃で一晩インキュベートした。翌日、一次抗体を捨て、細胞を洗浄バッファーで３回洗浄した（上に述べた洗浄をそれぞれ５分間）。次いで二次抗体を希釈、即ちロバ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）血清吸着処理済み（ａｂ１５０１０９）を抗体希釈バッファーで１：１０００に希釈し、二次抗体１５０μｌを各ウェルに加えた。細胞をＲＴの暗所で１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄バッファーで３回洗浄した（上に述べたように、暗所でそれぞれ５分間）。次いでウェルをスライドから取り外し、スライドを暗所の空気中で乾燥させた。ＤＡＰＩ含有封入剤を加え、チェンバーをスライドから取り外した後、封入剤をスライドに添加し、カバースリップを被せてマニキュア液でシールし、４℃の暗所で保存した。細胞を蛍光顕微鏡並びにＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８（緑色発光）及びＤＡＰＩ（青色発光）用フィルタを用いて可視化した。
【0247】
Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウス注射用がん細胞培養液の調製
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１７５ｃｍ２フラスコ（Ｎｕｎｃ １７８８８３）内で、１０％非働化処理済みウシ胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、＃０４－１２１－１Ａ）及び１％抗生物質Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３－０３１－１Ｂ）を添加したＨｅｐｅｓ含有ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ４１９６５－０３９）中で増殖させた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％でインキュベートした。マウスに注射した他のがん細胞（即ち、ＯＶ９０及びＰａｎｃ１）も同様にして調製した。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、１７５ｃｍ２フラスコ（Ｎｕｎｃ １７８８８３）内で、１０％非働化処理済みウシ胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、＃０４－１２１－１Ａ）及び１％抗生物質Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０３－０３１－１Ｂ）を添加したＨｅｐｅｓ含有ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ ４１９６５－０３９）中で増殖させた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、湿度９５％でインキュベートした。マウスに注射した他のがん細胞（即ち、ＯＶ９０及びＰａｎｃ１）も同様にして調製した。
【0248】
十分な数の細胞が存在する場合、細胞を３００ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、残っている培地を洗い流すために５～１０ｍｌのＰＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、＃０２－０２３－５Ａ）を細胞ペレットに加えた。細胞を再び遠心分離し（同一の速度及び時間）、上清を捨て、５～１０ｍｌの生理食塩水を細胞に加えた。この段階で、光学顕微鏡で血球計数板を用いて細胞を計数し、それに従い、８×１０６個／２００μｌの濃度に達するように生理食塩水を加えた。
【0249】
実験動物
雌性Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＯｌａＨｓｄ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ、５～６週齢）をＨａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。購入前にマウスを病原微生物がいない環境に維持した。ケージ（４２５×２６６×１８５ｍｍ、床面積８００ｃｍ２（１２９１Ｈ Ｅｕｒｏｓｔａｎｄａｒｄ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｈ、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ、マウス６～９匹／ケージ）を清掃し、木材チップ（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｌｋａｄ Ｓａｎｉ－Ｃｈｉｐｓ、２．２立方フィート、実験室用）及び水（水道水、１Ｌボトル中）は週１回交換した。マウスは滅菌済イヤーパンチを用いて識別した。
雌性Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＯｌａＨｓｄ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ、５～６週齢）をＨａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。購入前にマウスを病原微生物がいない環境に維持した。ケージ（４２５×２６６×１８５ｍｍ、床面積８００ｃｍ２（１２９１Ｈ Ｅｕｒｏｓｔａｎｄａｒｄ Ｔｙｐｅ ＩＩＩ Ｈ、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ、マウス６～９匹／ケージ）を清掃し、木材チップ（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｌｋａｄ Ｓａｎｉ－Ｃｈｉｐｓ、２．２立方フィート、実験室用）及び水（水道水、１Ｌボトル中）は週１回交換した。マウスは滅菌済イヤーパンチを用いて識別した。
【0250】
Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスのがん細胞注射
雌性Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウス（上述の通り）を本発明者の動物施設で少なくとも２４時間維持した。次いで全てのマウスに２７Ｇ注射針を使用して８×１０６個の細胞（生理食塩水２００μｌ中）を腹腔内注射した。
雌性Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウス（上述の通り）を本発明者の動物施設で少なくとも２４時間維持した。次いで全てのマウスに２７Ｇ注射針を使用して８×１０６個の細胞（生理食塩水２００μｌ中）を腹腔内注射した。
【0251】
マウスのＡＰＣ１処理
ＡＰＣ１ペプチドを３５０μｇ／匹の投与量で注射するために生理食塩水で適切な濃度に希釈した。腫瘍サイズが０．５ｃｍ×０．５ｃｍに達したら（通常５日間）マウスの処理を開始した。対照群にはアーリン（ａａｌｉｎｅ）を注射した。処理群にはＡＰＣ１を注射した（３５０μｇ／匹）。マウスの注射は２週間に亘り、日曜、火曜、及び木曜に行った（計６回注射）。
ＡＰＣ１ペプチドを３５０μｇ／匹の投与量で注射するために生理食塩水で適切な濃度に希釈した。腫瘍サイズが０．５ｃｍ×０．５ｃｍに達したら（通常５日間）マウスの処理を開始した。対照群にはアーリン（ａａｌｉｎｅ）を注射した。処理群にはＡＰＣ１を注射した（３５０μｇ／匹）。マウスの注射は２週間に亘り、日曜、火曜、及び木曜に行った（計６回注射）。
【0252】
腫瘍サイズ及びマウスの体重の監視
治療期間中、各マウスの体重を計測し、腫瘍サイズをデジタルノギスで測定した。
治療期間中、各マウスの体重を計測し、腫瘍サイズをデジタルノギスで測定した。
【0253】
腫瘍切片のＨＥＲ２免疫組織染色
溶液及び試薬
次に示す溶液及び試薬を使用した：洗浄バッファー：１×ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（１×ＴＢＳＴ）。１Ｌを調製する場合、５０ｍｌの２０×ＴＢＳ（Ａｍｒｅｓｃｏ、＃Ｊ６４０）を蒸留水（ｄＨ２Ｏ）９５０ｍｌに加えた。次いでこの溶液にＴｗｅｅｎ－２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、＃Ｊ６４０）１ｍｌを加え、溶液を混合した。抗体希釈液：Ｓｉｇｎａｌ Ｓｔａｉｎ（登録商標）抗体希釈液＃８１１２。抗原賦活化剤：クエン酸塩：１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー。１Ｌを調製する場合、２．９４ｇのクエン酸三ナトリウム塩二水和物（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７・２Ｈ２Ｏ）を１ＬのｄＨ２Ｏに加え、ｐＨを６．０に調整した。過酸化水素（３％）：３０％ Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ、＃２１６７６３）１０ｍｌをｄＨ２Ｏ ９０ｍｌに加えた。ブロッキング液：Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｂｕｓｔｅｒ（Ｉｎｎｏｖｅｘ、＃ＮＢ３０６）。一次（１ｓｔ）抗体：抗ＥｒｂＢ ２抗体［３Ｂ５］（ａｂ１６９０１）（ａｂｃａｍ）。蛍光標識二次抗体：ロバ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８）血清吸着処理済み（ａｂ１５０１０９）。ＤＡＰＩ含有封入剤：Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ ＤＡＰＩ含有封入剤（ａｂｃａｍ ａｂ１０４１３９）。
溶液及び試薬
次に示す溶液及び試薬を使用した：洗浄バッファー：１×ＴＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０（１×ＴＢＳＴ）。１Ｌを調製する場合、５０ｍｌの２０×ＴＢＳ（Ａｍｒｅｓｃｏ、＃Ｊ６４０）を蒸留水（ｄＨ２Ｏ）９５０ｍｌに加えた。次いでこの溶液にＴｗｅｅｎ－２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、＃Ｊ６４０）１ｍｌを加え、溶液を混合した。抗体希釈液：Ｓｉｇｎａｌ Ｓｔａｉｎ（登録商標）抗体希釈液＃８１１２。抗原賦活化剤：クエン酸塩：１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー。１Ｌを調製する場合、２．９４ｇのクエン酸三ナトリウム塩二水和物（Ｃ６Ｈ５Ｎａ３Ｏ７・２Ｈ２Ｏ）を１ＬのｄＨ２Ｏに加え、ｐＨを６．０に調整した。過酸化水素（３％）：３０％ Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ、＃２１６７６３）１０ｍｌをｄＨ２Ｏ ９０ｍｌに加えた。ブロッキング液：Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｂｕｓｔｅｒ（Ｉｎｎｏｖｅｘ、＃ＮＢ３０６）。一次（１ｓｔ）抗体：抗ＥｒｂＢ ２抗体［３Ｂ５］（ａｂ１６９０１）（ａｂｃａｍ）。蛍光標識二次抗体：ロバ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８）血清吸着処理済み（ａｂ１５０１０９）。ＤＡＰＩ含有封入剤：Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ ＤＡＰＩ含有封入剤（ａｂｃａｍ ａｂ１０４１３９）。
【0254】
脱パラフィン及び水和
この手順を行う間は常にスライドが乾かないようにした。切片はＨａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにて作製した。固定した切片をパラフィン包埋し、４ミクロンの切片に切り出し、スライドガラスに貼り付けた。切片を脱パラフィン化／水和するために、切片をキシレンの洗浄液中で３回（各５分間）、１００％エタノールの洗浄液中で２回（各１０分間）、９５％エタノールの洗浄液中で２回（各１０分間）、最後にｄＨ２Ｏの洗浄液中で２回（各５分間）インキュベートした。
この手順を行う間は常にスライドが乾かないようにした。切片はＨａｒｌａｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにて作製した。固定した切片をパラフィン包埋し、４ミクロンの切片に切り出し、スライドガラスに貼り付けた。切片を脱パラフィン化／水和するために、切片をキシレンの洗浄液中で３回（各５分間）、１００％エタノールの洗浄液中で２回（各１０分間）、９５％エタノールの洗浄液中で２回（各１０分間）、最後にｄＨ２Ｏの洗浄液中で２回（各５分間）インキュベートした。
【0255】
抗原賦活化
スライドをｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファーと一緒に沸騰させた後、沸点直前の温度で１０分間維持した。スライドを実験台で３０分間放冷した。
スライドをｐＨ６．０の１０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファーと一緒に沸騰させた後、沸点直前の温度で１０分間維持した。スライドを実験台で３０分間放冷した。
【0256】
染色
切片をｄＨ２Ｏ中で３回、各５分間洗浄した。切片を３％過酸化水素中で１０分間インキュベートした後、ｄＨ２Ｏ中で２回（各５分間）及び洗浄バッファー中で５分間洗浄した。各切片を１００～４００μｌのブロッキング液を用いて室温で３０分間ブロッキングした。次いでブロッキング液を除去し、抗体希釈剤で１：４００に希釈した一次抗体１００～４００μｌを各切片に加え、４℃で一晩インキュベートした。次いで抗体溶液を除去し、切片を洗浄バッファー中で３回、各５分間洗浄した。二次抗体を抗体希釈剤で１：１，０００に希釈し、二次抗体を各切片に１００～４００μｌずつ加えた。次いで切片を室温の暗所で１時間インキュベートした。最後に二次抗体溶液を除去し、切片を洗浄バッファーで３回、各５分間暗所で洗浄し、次いでｄＨ２Ｏ中で、５分間暗所で洗浄した。
切片をｄＨ２Ｏ中で３回、各５分間洗浄した。切片を３％過酸化水素中で１０分間インキュベートした後、ｄＨ２Ｏ中で２回（各５分間）及び洗浄バッファー中で５分間洗浄した。各切片を１００～４００μｌのブロッキング液を用いて室温で３０分間ブロッキングした。次いでブロッキング液を除去し、抗体希釈剤で１：４００に希釈した一次抗体１００～４００μｌを各切片に加え、４℃で一晩インキュベートした。次いで抗体溶液を除去し、切片を洗浄バッファー中で３回、各５分間洗浄した。二次抗体を抗体希釈剤で１：１，０００に希釈し、二次抗体を各切片に１００～４００μｌずつ加えた。次いで切片を室温の暗所で１時間インキュベートした。最後に二次抗体溶液を除去し、切片を洗浄バッファーで３回、各５分間暗所で洗浄し、次いでｄＨ２Ｏ中で、５分間暗所で洗浄した。
【0257】
切片の脱水
切片を載せたスライドを暗所の空気中で乾燥させた。カバーガラスを載せ、封入剤を使用して封入した。
切片を載せたスライドを暗所の空気中で乾燥させた。カバーガラスを載せ、封入剤を使用して封入した。
【0258】
Ｎｏｔｃｈタンパク質受容体のウェスタンブロット解析
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ゲンタマイシン硫酸塩（０３－０３５－１Ｃ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、及びアンホテリシンＢ（０３－０２９－１Ｃ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を添加したＤＭＥＭ（４１９６５０３９ Ｇｉｂｃｏ）培地２５ｍｌを入れた５本の７５ｃｍ２フラスコにＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（０．８×１０６）を播種した。細胞をインキュベーターで一晩インキュベートした。次いでＰＢＳストック液中５０ｍｇ／ｍｌのペプチドＡＰＣ１を室温（Ｒ．Ｔ．）で解凍し、フラスコに終濃度が２５０μｇ／ｍｌとなるように加え、細胞を０、１、３、５、又は２１時間インキュベートした。
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ゲンタマイシン硫酸塩（０３－０３５－１Ｃ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、及びアンホテリシンＢ（０３－０２９－１Ｃ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を添加したＤＭＥＭ（４１９６５０３９ Ｇｉｂｃｏ）培地２５ｍｌを入れた５本の７５ｃｍ２フラスコにＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（０．８×１０６）を播種した。細胞をインキュベーターで一晩インキュベートした。次いでＰＢＳストック液中５０ｍｇ／ｍｌのペプチドＡＰＣ１を室温（Ｒ．Ｔ．）で解凍し、フラスコに終濃度が２５０μｇ／ｍｌとなるように加え、細胞を０、１、３、５、又は２１時間インキュベートした。
【0259】
次いで培地を除去し、セルスクレイパーでフラスコの細胞を掻き取り、新鮮なＤＭＥＭ培地１．８ｍｌに入れた。細胞の２種類の画分：膜タンパク質抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃８９８４２）を用いて抽出した細胞質タンパク質及び膜タンパク質を２ｍｌのエッペンドルフチューブに回収した。製造業者の推奨に従いプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａｐ ２７１４）及びホスファターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ Ｐ５７２６）を透過処理バッファー及び可溶化バッファーに加えた。
【0260】
ウェスタンブロッティング用試料を次に示すように調製した：サンプルバッファー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＮＰ０００７、４倍濃度）及びサンプル還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃ＮＰ０００９、１０倍濃度）を各試料に加え、試料を５分間沸騰させた。
【0261】
次いで４～２０％トリス－グリシンゲル（ＮｕＳｅｐ、カタログ＃ＮＧ２１－４２０）上の各ウェルに試料を５０μｌずつを添加した。ゲルを１時間１５０Ｖ（最初の１０分間は８０Ｖ）で泳動させた後、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ トランスファーメンブレン、カタログ＃：ＩＰＶ０００１０、孔径：０．４５）に１時間転写した。膜を５％乳含有ＴＢＳＴを用いてＲ．Ｔで１時間攪拌しながらブロッキングを行った。５％乳含有ＴＢＳＴ中で１：１０００に希釈したＮｏｔｃｈ３抗体（ａｂｃａｍａｂ ２３４２６）を加え、攪拌しながら４℃で一晩インキュベートした。
【0262】
膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、次いで二次抗体であるαラビット－ＨＲＰ（５％乳含有ＴＢＳＴで１：５０００に希釈）を加えて、攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。最後に、膜をＴＢＳＴで３回洗浄し（各洗浄の間に４～５分間放置する）、ＥＣＬ基質（Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ １７０５０６１ ＢＩＯ－ＲＡＤ）を加えた。膜をＬｉ－ＣＯＲＣ－Ｄｉｇｉｔ装置でスキャンした。Ｎｏｔｃｈ３抗体を膜にアプライし、タンパク質の定量化を行い、βアクチンタンパク質を用いて較正した。
【0263】
ＡＰＣ１で処理した細胞のグルタチオンレダクターゼ測定
材料
７５ｃｍ２細胞培養フラスコ；
細胞培養培地は、１０％ＦＢＳを加えたピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢ含有ＤＭＥＭとした；
グルタチオン測定キット（Ｓｉｇｍａ ＣＳ０２６０）；
ＡＰＣ１溶液、５０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中；
細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）を７５ｃｍ２細胞培養フラスコで８０～９０％コンフルエントに達するまで増殖させた。細胞をＡＰＣ１（２５０μｇ／ｍｌ、週２回、１週間）で処理した。
材料
７５ｃｍ２細胞培養フラスコ；
細胞培養培地は、１０％ＦＢＳを加えたピルビン酸ナトリウム、ペニシリン／ストレプトマイシン、及びアンホテリシンＢ含有ＤＭＥＭとした；
グルタチオン測定キット（Ｓｉｇｍａ ＣＳ０２６０）；
ＡＰＣ１溶液、５０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ中；
細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８）を７５ｃｍ２細胞培養フラスコで８０～９０％コンフルエントに達するまで増殖させた。細胞をＡＰＣ１（２５０μｇ／ｍｌ、週２回、１週間）で処理した。
【0264】
手順
細胞をＰＢＳ１０ｍｌで２回洗浄し、ＰＢＳ（５ｍｌ）を加え、細胞をスクラッピングにより回収し、３００Ｇ、４℃で５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞を上に示したようにＡＰＣ１で処理した。グルタチオン標準溶液の値を用いて検量線を求め、還元型グルタチオン１ナノモルに対応するΔＡ４１２／ｍｉｎを製造業者の指示に従いウェル毎に算出した。
細胞をＰＢＳ１０ｍｌで２回洗浄し、ＰＢＳ（５ｍｌ）を加え、細胞をスクラッピングにより回収し、３００Ｇ、４℃で５分間遠心分離した後、上清を捨て、細胞を上に示したようにＡＰＣ１で処理した。グルタチオン標準溶液の値を用いて検量線を求め、還元型グルタチオン１ナノモルに対応するΔＡ４１２／ｍｉｎを製造業者の指示に従いウェル毎に算出した。
【0265】
実施例１
トリプルネガティブ乳癌細胞をＡＰＣ１で処理することにより細胞表面のＨＥＲ２受容体の発現が増加する
上に示したように、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、とりわけ、エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）が発現せず、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）が発現も増幅もしないものと定義されている。
トリプルネガティブ乳癌細胞をＡＰＣ１で処理することにより細胞表面のＨＥＲ２受容体の発現が増加する
上に示したように、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、とりわけ、エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）が発現せず、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）が発現も増幅もしないものと定義されている。
【0266】
本明細書においてアミノ酸配列ＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫ（配列番号：１で表される）を有する「ＡＰＣ１」と称するペプチドは、ペプチドＫＴＰＡＦ５０の１４個のＣ末端アミノ酸残基からなり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びマウスのがん細胞の生存率及び増殖に影響を与えることが既に見出されている（３、４）。ＡＰＣ１をトリプルネガティブ乳癌細胞（且つＨＥＲ２を発現しない）として知られているＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に投与した場合の効果を、まずＦＡＣＳ解析により、上に述べたように調査した。これを図１に示す。
【0267】
簡潔には、ＡＰＣ１を上に詳述したようにＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に反復投与した。ＡＰＣ１の１回目投与量（終濃度１００又は２５０μｇ／ｍｌ）を細胞に加え、細胞を４８時間インキュベートした。次いで処理された細胞にＡＰＣ１の追加投与を行い、更に２４時間インキュベートした。
【0268】
図１Ａに示すように、ＡＰＣ１処理を行わなかったＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（対照細胞）の細胞膜上にＨＥＲ２はほとんど発現していない。驚くべきことに、ＡＰＣ１で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞では、図１Ｂ及び図１Ｃに示すように、ＨＥＲ２発現が上昇した。図１Ｂ（１００μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１）を図１Ｃ（２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１）と比較すると、ＨＥＲ２発現量が変化していることから、この効果は濃度依存性があると推定される。ＡＰＣ１ ２５０μｇ／ｍｌにおけるＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞表面上のＨＥＲ２発現が、ＨＥＲ２陽性であることが知られているＮ８７細胞上の発現（図１Ｄ）と類似していることが明らかである。
【0269】
ＡＰＣ１投与がＴＮＢＣ細胞上のＨＥＲ２発現に与える効果を、上に詳述したように、更に様々な濃度のＡＰＣ１で処理し、様々な時間でインキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞上のＨＥＲ２の発現の免疫蛍光により調査した。
【0270】
まず図２Ｂに示すように、２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１の存在下に４８時間インキュベートしたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、ＨＥＲ２発現の免疫蛍光による解析から、対照細胞と比較して明らかなＨＥＲ２発現が示された（図２Ａ）。
【0271】
更に、図３Ｂに示すように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を２５０μｇ／ｍｌ ＡＰＣ１の存在下に長時間インキュベート、即ち、１回目投与後に１４４時間インキュベートし、更に２回目及び３回目投与後にそれぞれ９６及び７２時間インキュベートすることにより上述の効果が増強された。上に示したＡＰＣ１の投与量を２５０μｇ／ｍｌとする条件が、本細胞腫のＨＥＲ２発現を増加させるのに最適であることが見出された。
【0272】
他の公知のＴＮＢＣ細胞、即ちＭＤＡ－ＭＢ－４６８でも、図４Ｂに示すように、同様の結果が得られた。この場合、細胞にはＡＰＣ１を２回投与し（各１００μｇ／ｍｌ）、１回目及び２回目投与の後、それぞれ２４及び７２時間インキュベートした。
【0273】
【0274】
上の結果は、ＡＰＣ１を投与することにより細胞表面のＨＥＲ２発現が増加し、したがって、特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＨＥＲ２を標的とする治療に対する処理された細胞の感受性（又は脆弱性）が増大することを示唆している。
【0275】
実施例２
ＡＰＣ１で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するカドサイラの効果
上の結果は、ＡＰＣ１をＴＮＢＣ細胞に投与することにより、少なくとも細胞表面上のＨＥＲ２発現が向上又は増加することと、したがってＡＰＣ１を、この細胞のＨＥＲ２を標的とする任意の治療、例えばＨＥＲ２を標的とする抗体に対する感受性を増大させる薬剤として使用することができることとを示唆している。
ＡＰＣ１で処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対するカドサイラの効果
上の結果は、ＡＰＣ１をＴＮＢＣ細胞に投与することにより、少なくとも細胞表面上のＨＥＲ２発現が向上又は増加することと、したがってＡＰＣ１を、この細胞のＨＥＲ２を標的とする任意の治療、例えばＨＥＲ２を標的とする抗体に対する感受性を増大させる薬剤として使用することができることとを示唆している。
【0276】
ＡＰＣ１が実際にＴＮＢＣ細胞のＨＥＲ２を標的とする治療に対する感受性を増大させることを検証するため、上に述べたように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞にまずＡＰＣ１を投与し、次いでカドサイラを投与した。カドサイラは、トラスツズマブ（ハーセプチンとしても知られる、ＨＥＲ２に対する抗体）及び化学療法薬分子であるエムタンシン（ＤＭ１）の作用機序を１つの薬剤に併合した抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）である。
【0277】
簡潔には、細胞にまずＡＰＣ１を２回投与し（各２５０μｇ／ｍｌ、１回目及び２回目の投与後にそれぞれ４８及び２４時間インキュベート）、更にカドサイラを５又は１０μｇ／ｍｌの投与量で投与（更に７２時間インキュベート）した。次いで処理された細胞を、アポトーシスマーカーであるＡｎｎｅｘｉｎのＦＡＣＳ解析に供した。
【0278】
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は上に詳述したようにトリプルネガティブ細胞として知られており、したがって、カドサイラ治療に感受性を示さない。実際、図５Ａに示すように、ＡＰＣ１で前処理していないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞にカドサイラを単独投与した場合のアポトーシスレベルは比較的低かった（５μｇ／ｍｌカドサイラ投与では実質的にゼロであり、１０μｇ／ｍｌカドサイラ投与で１０％であった）。
【0279】
驚くべきことに、ＡＰＣ１及びカドサイラの両方で処理した細胞は、カドサイラ単独で処理した細胞と比較して、アポトーシスレベルがカドサイラの各投与量に対し少なくとも２．５倍高くなった。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＡＰＣ１により、カドサイラが細胞内に侵入して、細胞死因子として作用する薬物部分を放出することが可能になった。
【0280】
上に述べたように、まずＡＰＣ１を投与し、次いでカドサイラを投与したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞でも、カドサイラを５、１０、又は２５μｇ／ｍｌ投与した場合に、図５Ｂに示すように類似の結果が得られた。但しこの場合は、ＡＰＣ１及びカドサイラの両方で処理した細胞のアポトーシスレベルはＡＰＣ１のみで処理した対応する細胞よりも３～１０倍高かった。
【0281】
ＡＰＣ１をＴＮＢＣ細胞に投与することにより、抗ＨＥＲ２剤を用いた更なる処理に対する感受性が高まるという効果を更に裏付けるために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に加えて他のＴＮＢＣ細胞、即ち、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８及びＢＴＳ４９について追加実験を行った。
【0282】
これらの実験において、ＡＰＣ１を２回投与（各２５０μｇ／ｍｌ）し、上に詳述した時間インキュベートした。次いでカドサイラを５、１０、又は２５μｇ／ｍｌ投与し、細胞を更に上に詳述したようにインキュベートした。
【0283】
図６は、カドサイラで処理する前にＡＰＣ１で前処理することによりＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のアポトーシスレベルが２～６倍高くなったことを示している。対照及びＡＰＣ１のみ／カドサイラのみで処理した細胞においてはアポトーシスレベルが低かったが、ＡＰＣ１及びカドサイラの両方で処理した細胞においては、細胞のアポトーシスレベルが大幅に増加した。
【0284】
更に図７は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に関し示された結果と同様に、カドサイラで処理する前にＡＰＣ１で前処理することによりＢＴＳ４９細胞のアポトーシスレベルが２．５～５倍高くなったことを示している。しかしながら、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の場合、ＡＰＣ１で前処理しなかった細胞のアポトーシスの基礎レベルは幾分高かった。
【0285】
実施例３
ＡＰＣ１処理したマウスＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞上のＨＥＲ２受容体発現
ＡＰＣ１はまた、後に詳述するように、腫瘍細胞を注射したマウスのＴＮＢＣ細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）上のＨＥＲ２発現を増加させることも示された。
ＡＰＣ１処理したマウスＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞上のＨＥＲ２受容体発現
ＡＰＣ１はまた、後に詳述するように、腫瘍細胞を注射したマウスのＴＮＢＣ細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）上のＨＥＲ２発現を増加させることも示された。
【0286】
雌性Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウス（５～６週齢）に８×１０６個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を腹腔内注射した。腫瘍サイズが０．５ｃｍ×０．５ｃｍに達したら（通常５日後）、マウスにＡＰＣ１（３５０μｇ／匹）を週３回、２週間注射した（即ち、２週間に亘り、日曜、火曜、及び木曜、計６回注射）。
【0287】
ＡＰＣ１がマウス体内で増殖するＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞に与える効果を監視するために、腫瘍切片のＨＥＲ２免疫組織染色を行った。図８に示すように、対照細胞（図８Ａ、生理食塩水で処理したマウスから採取）においては、細胞表面にＨＥＲ２の発現は観測されず、ＡＰＣ１で処理したマウスから採取した細胞（図８Ｂ）には、ＨＥＲ２の明確な発現が認められた。
【0288】
上記のことを鑑み、特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＡＰＣ１は細胞表面にＨＥＲ２を発現させ、これらの細胞に、ＨＥＲ２を対象とするＨＥＲ２に基づく抗がん療法に対する脆弱性又は感受性を付与する。
【0289】
実施例４
ＡＰＣ１で処理したＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するハーセプチンの効果
上に示したように、ＡＰＣ１は細胞上のＨＥＲ２の発現を増加させ、それにより、ＨＥＲ２に基づくがんの抗体治療により細胞を特異的に標的化することが可能になった。ＨＥＲ２に基づく抗がん剤がＡＰＣ１で前処理されたＴＮＢＣ細胞を標的とする能力を示すために、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を阻害するモノクローナル抗体であるハーセプチンを使用した。
ＡＰＣ１で処理したＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞に対するハーセプチンの効果
上に示したように、ＡＰＣ１は細胞上のＨＥＲ２の発現を増加させ、それにより、ＨＥＲ２に基づくがんの抗体治療により細胞を特異的に標的化することが可能になった。ＨＥＲ２に基づく抗がん剤がＡＰＣ１で前処理されたＴＮＢＣ細胞を標的とする能力を示すために、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を阻害するモノクローナル抗体であるハーセプチンを使用した。
【0290】
図９は、ＡＰＣ１及びハーセプチンの両方で処理したＴＮＢＣ細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－４６８のアポトーシス（２５％）が、ハーセプチンのみ（１０％）又はＡＰＣ１のみ（１５％）で処理した細胞のアポトーシスレベルよりも高かったことを示している。更に、ＡＰＣ１及びハーセプチンの両方を併用して処理したＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のアポトーシスレベルは、ハーセプチン単独で処理したＮ８７細胞のアポトーシスレベルと同等であった。
【0291】
実施例５
ＡＰＣ１で処理したＴＮＢＣ細胞がＮｏｔｃｈ３タンパク質発現を増加させた
当該技術分野において知られているように、神経原性遺伝子座ノッチホモログタンパク質（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃｌｏｃｕｓ ｎｏｔｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）３（Ｎｏｔｃｈ３）は幾つかの種類のがんで過剰発現しており、現在、抗がん薬の標的として研究されている。ＡＰＣ１の投与がＮｏｔｃｈ３の量に与える効果を、上に詳述したように、ＴＮＢＣ細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１で評価した。
ＡＰＣ１で処理したＴＮＢＣ細胞がＮｏｔｃｈ３タンパク質発現を増加させた
当該技術分野において知られているように、神経原性遺伝子座ノッチホモログタンパク質（Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃｌｏｃｕｓ ｎｏｔｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）３（Ｎｏｔｃｈ３）は幾つかの種類のがんで過剰発現しており、現在、抗がん薬の標的として研究されている。ＡＰＣ１の投与がＮｏｔｃｈ３の量に与える効果を、上に詳述したように、ＴＮＢＣ細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１で評価した。
【0292】
図１０に示すように、ＡＰＣ１をＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に投与すると、３及び５時間インキュベートした後に最大となったことが膜タンパク質画分のウェスタンブロット解析から示されるように、細胞膜上の活性Ｎｏｔｃｈ３受容体の発現が増加した。
【0293】
この結果は、上に示した場合において、ペプチドＡＰＣ１が細胞タンパク質である膜タンパク質の発現を誘導する能力も示している。
【0294】
実施例６
ＴＮＢＣ細胞をＡＰＣ１で処理するとタモキシフェンに対する感受性が細胞に付与される
ＡＰＣ１がエストロゲン受容体の発現も調節するか否かを調査するために、ＴＮＢＣ細胞をＡＰＣ１の存在下にインキュベートした。この目的のために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＡＰＣ１で前処理した後、タモキシフェンの存在下に２４～４８時間インキュベートした。次いでこれらの細胞の生存率を、上で詳述したようにレサズリン細胞生存率試験により調査した。
ＴＮＢＣ細胞をＡＰＣ１で処理するとタモキシフェンに対する感受性が細胞に付与される
ＡＰＣ１がエストロゲン受容体の発現も調節するか否かを調査するために、ＴＮＢＣ細胞をＡＰＣ１の存在下にインキュベートした。この目的のために、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＡＰＣ１で前処理した後、タモキシフェンの存在下に２４～４８時間インキュベートした。次いでこれらの細胞の生存率を、上で詳述したようにレサズリン細胞生存率試験により調査した。
【0295】
図１１Ｂに示すように、ＡＰＣ１（２５０μｇ／ｍｌを３回投与）及びタモキシフェンで処理した（２４時間）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、図１１Ａに示す、ＡＰＣ１で前処理せずにタモキシフェンのみの存在下に成長させた対照細胞と比較して、生存率が低下した。
【0296】
【0297】
ＡＰＣ１及びタモキシフェンの組合せで処理したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞で観測された生存率が、ＡＰＣ１で処理しなかったＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と比較して低下したことは、特定の理論に束縛されることを望むものではないが、ＡＰＣ１がタモキシフェンの標的、即ちエストロゲン受容体に対し明らかに効果を示すことを例証している。換言すれば、これらの結果は、ＡＰＣ１ががん細胞のエストロゲン受容体の発現を増加させ、これらの細胞のタモキシフェンに対する感受性を増大させることを示している。
【0298】
実施例７
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＡＰＣ１で処理することによりエストロゲンα受容体の発現が増加した
上に示した結果を鑑み、エストロゲン受容体αの発現量を直接測定した。図１３に示すように、抗エストロゲン受容体α（ＥＲα）抗体を用いてウェスタンブロット解析を実施したところ、ＡＰＣ１（２５０μｇ／ｍｌ）で週１回１週間処理（図１３の左からレーン３～７）又は週２回３若しくは４週間処理（図１３の左からレーン９、１０）したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、エストロゲン受容体αの発現量が明らかに増加したことが分かった。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞をＡＰＣ１で処理することによりエストロゲンα受容体の発現が増加した
上に示した結果を鑑み、エストロゲン受容体αの発現量を直接測定した。図１３に示すように、抗エストロゲン受容体α（ＥＲα）抗体を用いてウェスタンブロット解析を実施したところ、ＡＰＣ１（２５０μｇ／ｍｌ）で週１回１週間処理（図１３の左からレーン３～７）又は週２回３若しくは４週間処理（図１３の左からレーン９、１０）したＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、エストロゲン受容体αの発現量が明らかに増加したことが分かった。
【0299】
これらの結果は、ＡＰＣ１ががん細胞の細胞部位、今回はエストロゲン受容体の発現を増加させることを例証している。
【0300】
実施例８
ＡＰＣ１がＴＮＢＣ細胞の化学療法に対する感受性を増大させた
ＡＰＣ１が、特定の細胞標的を対象とする薬剤を用いた治療に対するＴＮＢＣ細胞の感受性を増大させるという上の結果に加えて、次に示す結果は、ＡＰＣ１が、異なる作用機序によって作用する他の抗がん剤に対するＴＮＢＣ細胞の感受性を増大させたことを示している。
ＡＰＣ１がＴＮＢＣ細胞の化学療法に対する感受性を増大させた
ＡＰＣ１が、特定の細胞標的を対象とする薬剤を用いた治療に対するＴＮＢＣ細胞の感受性を増大させるという上の結果に加えて、次に示す結果は、ＡＰＣ１が、異なる作用機序によって作用する他の抗がん剤に対するＴＮＢＣ細胞の感受性を増大させたことを示している。
【0301】
この目的のために、上に詳述したように、ＴＮＢＣ細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８をＡＰＣ１で前処理した後、ドキソルビシン又はシスプラチンの存在下にインキュベートした。図１４Ａに示すように、ＡＰＣ１により上のＴＮＢＣ細胞のドキソルビシンに対する感受性が濃度依存的に増大した。
【0302】
ＡＰＣ１及びシスプラチンの組合せに関しても、図１４Ｂに示すように、同様の効果が示された。
【0303】
実施例９
ＡＰＣ１がＴＮＢＣ腫瘍のドキソルビシンに対する感受性を増大させた
ＡＰＣ１の投与によりＴＮＢＣ細胞のドキソルビシン又はシスプラチンに対する感受性が増大することを示している上の結果に加えて、ＡＰＣ１及びドキソルビシンを併用する効果をヒトＴＮＢＣ細胞（腫瘍）を接種したマウスでも試験した。
ＡＰＣ１がＴＮＢＣ腫瘍のドキソルビシンに対する感受性を増大させた
ＡＰＣ１の投与によりＴＮＢＣ細胞のドキソルビシン又はシスプラチンに対する感受性が増大することを示している上の結果に加えて、ＡＰＣ１及びドキソルビシンを併用する効果をヒトＴＮＢＣ細胞（腫瘍）を接種したマウスでも試験した。
【0304】
この目的のために、上に詳述したようにＴＮＢＣ細胞をマウスに接種した。簡潔には、３２匹のヌードマウスにＴＮＢＣ細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、８×１０６個／匹）の皮下に接種した。腫瘍体積が５０ｍｍ３を超えたら、次に示すようにマウスを無作為に４群（８匹／群）に割り付けた。対照群は生理食塩水のみで処理し、ＡＰＣ１処理群は、ＡＰＣ１を１５ｍｇ／ｋｇの投与量で週３回処理し、ドキソルビシン及びＡＰＣ１処理群は、ＡＰＣ１の週２回投与（１５ｍｇ／ｋｇ）及びドキソルビシンの週１回投与（３ｍｇ／ｋｇ）によって処理し、ドキソルビシン処理群は、ドキソルビシンのみを、週１回３ｍｇ／ｋｇを投与することにより処理した。これらの投与プロトコルを、実験期間を通して、即ち５週間繰り返した。
【0305】
図１５から明らかなように、対照群においては相対腫瘍体積が直線的に増加したのに対し、ドキソルビシン処理群及びＡＰＣ１処理群においては、腫瘍体積の増加が緩やかになった（この効果はＡＰＣ１処理群でより顕著であった）。
【0306】
顕著なことには、ＡＰＣ１及びドキソルビシンの両方で処理したマウスでは、腫瘍体積に対し明らかな相乗効果が見られ、腫瘍成長が阻害され、それどころか腫瘍サイズが低下した（元のサイズと比較して）。
【0307】
これらの例から、ＡＰＣ１がＴＮＢＣ細胞の化学療法対する感受性を、細胞自体でも、動物の腫瘍として存在した場合も増大させることが明らかである。
【0308】
実施例１０
卵巣及び膵臓腫瘍を治療するためのＡＰＣ１及びドキソルビシンの併用
ＡＰＣ１及びドキソルビシンの組合せがＴＮＢＣ腫瘍に与える効果を鑑み、本発明者らは、他のがん、即ち、ヒト卵巣癌及びヒト膵臓癌から採取した腫瘍に対する上の組合せの効果も調査した。
卵巣及び膵臓腫瘍を治療するためのＡＰＣ１及びドキソルビシンの併用
ＡＰＣ１及びドキソルビシンの組合せがＴＮＢＣ腫瘍に与える効果を鑑み、本発明者らは、他のがん、即ち、ヒト卵巣癌及びヒト膵臓癌から採取した腫瘍に対する上の組合せの効果も調査した。
【0309】
この目的のために、ヒト卵巣細胞（ＯＶ９０、９×１０６個／匹）又はヒト膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ１、７×１０６個／匹）をヌードマウスの皮下に接種した。腫瘍体積が４０ｍｍ３又は５０ｍｍ３（それぞれ、ＯＶ９０及びＰａｎｃ１の場合）を超えたら、マウスを次に示すように無作為に４群（８匹／群）に割り付けた。対照群は生理食塩水のみで処理し、ＡＰＣ１処理群は、ＡＰＣ１を各１５ｍｇ／ｋｇの投与量で週３回処理し、ドキソルビシン及びＡＰＣ１処理群は、ＡＰＣ１を週２回投与（各１５ｍｇ／ｋｇ）及びドキソルビシンを週１回（３ｍｇ／ｋｇ）投与することにより処理し、ドキソルビシン処理群は、ドキソルビシンのみを３ｍｇ／ｋｇ投与することにより処理した。これらの投与プロトコルを実験期間を通して、即ち５週間繰り返した。
【0310】
図１６に示すように、対照群においては相対腫瘍体積が直線的に増加し、ドキソルビシン処理群及びＡＰＣ１処理群においては、腫瘍体積の増加が緩やかになり、ＡＰＣ１処理群の効果がより顕著であった。
【0311】
驚くべきことに、ＡＰＣ１及びドキソルビシンの両方で処理したマウスにおいては、腫瘍体積に明らかな相乗効果が見られ、その結果として腫瘍の成長が阻害され（２０日目まで）、２０日目から実験終了までは腫瘍サイズが元の腫瘍サイズよりも低下した。
【0312】
図１７に示すように、同様の相乗効果が、マウスに接種したヒト膵臓癌腫瘍細胞においても示された。
【0313】
実施例１１
ＡＰＣ１によりヒトがん細胞のグルタチオン量が低下した
当該技術分野においてよく知られているように、グルタチオンが複合体化し、抗がん薬のグルタチオン複合体が細胞から輸送されることが、抗がん薬の解毒のための機序の１つとして提案された。
ＡＰＣ１によりヒトがん細胞のグルタチオン量が低下した
当該技術分野においてよく知られているように、グルタチオンが複合体化し、抗がん薬のグルタチオン複合体が細胞から輸送されることが、抗がん薬の解毒のための機序の１つとして提案された。
【0314】
一般に、グルタチオンは、抗がん薬と一体化して、より毒性が低く、より水溶性が高い複合体を形成することができる。実際、多くの薬剤耐性細胞においてグルタチオンが関連する酵素の発現が増加しているか又は過剰発現しており、結果として薬剤耐性となることが見出されている。
【0315】
本実施例において、本発明者らは、ＡＰＣ１が卵巣、膵臓、及びＴＮＢＣがん細胞のグルタチオン量に与える影響を調査した。
【0316】
上に詳述したように、卵巣癌細胞ＯＶ９０及びＯＶ３、膵臓癌細胞ＢｘＰＣ３及びＰａｎｃ１、並びにＴＮＢＣがん細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８をＡＰＣ１で処理し、次いでこれらの細胞の相対的なグルタチオン量を上に詳述したように測定した。
【0317】
【0318】
特定の理論に束縛されることを望むものではないが、これらの結果から、ＡＰＣ１が、様々な薬剤を用いた治療に対するがん細胞の感受性を増大させるように作用する少なくとも１種の経路を説明することができる。即ち、ＡＰＣ１は、細胞内のグルタチオン量を低下させ、それによって、細胞の薬剤耐性度を低下させるように作用するようである。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【配列表】