特許 7358516 薬物の調製におけるグルカンの応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-09-29

(45)【発行日】2023-10-10

(54)【発明の名称】薬物の調製におけるグルカンの応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/716 20060101AFI20231002BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231002BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231002BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231002BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231002BHJP

   A61K 36/03 20060101ALN20231002BHJP

【ＦＩ】

A61K31/716

A61P7/00

A61P7/04

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K39/395 U

A61K45/00

A61K36/03

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2021574203

(86)(22)【出願日】2020-06-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-08-18

(86)【国際出願番号】 CN2020096223

(87)【国際公開番号】W WO2020249132

(87)【国際公開日】2020-12-17

【審査請求日】2022-02-09

(31)【優先権主張番号】201910512814.6

(32)【優先日】2019-06-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】521544883

【氏名又は名称】正大制▲薬▼（青▲島▼）有限公司

(73)【特許権者】

【識別番号】521544894

【氏名又は名称】青▲島▼▲海▼洋生物医▲薬▼研究院股▲フン▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】▲楊▼ 金波

(72)【発明者】

【氏名】于 ▲廣▼利

(72)【発明者】

【氏名】宋 巧玲

(72)【発明者】

【氏名】▲呉▼ ▲麗▼娟

(72)【発明者】

【氏名】▲趙▼ 俊

(72)【発明者】

【氏名】▲呂▼ 友晶

(72)【発明者】

【氏名】▲趙▼ 晨▲陽▼

(72)【発明者】

【氏名】管 ▲華▼▲詩▼

【審査官】鶴 剛史

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０５００１３５２（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５３５５４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平０８－５００６２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】KARACA, Halit et al.，Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2014年，Vol.15, No.8，pp.3641-3644

【文献】BOBADILLA, Francisca et al.，Carbohydrate Polymers，2013年，Vol.92, No.1，pp.241-248

【文献】GHAREEB, Doaa A. et al，Biotechnology & Biotechnological Equipment，2015年，Vol.29, No.5，pp.970-976

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００ ～ ３３／４４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

β－１，３／１，６－グルカンを含む、白血球減少症および／または血小板減少症の治療において、免疫チェックポイント薬物と併用して使用するための医薬組成物または製剤であって、
前記β－１，３／１，６－グルカンは、南極の褐藻に由来し、前記南極の褐藻はDurvillaea Antarcticaであり、前記免疫チェックポイント薬物が、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ－１）拮抗剤、またはＰＤ－Ｌ１拮抗剤から選択される、前記医薬組成物または製剤。

【請求項2】

前記白血球は、リンパ球であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物または製剤。

【請求項3】

前記β－１，３／１，６－グルカンは、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）のβ－グルカンであることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物または製剤。

【化1】

ここで、ｎは、１～２０から選択される整数であり、Ｒは、Ｈおよび／または４個以下のグルコース残基である。

【請求項4】

前記免疫チェックポイント薬物は、抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物または製剤。

【請求項5】

前記抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ＢＭＳ２０２、スパルタリズマブ（Ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ）、およびカムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物または製剤。

【請求項6】

少なくとも一つの化学治療剤と併用して使用することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物または製剤。

【請求項7】

前記化学治療剤は、細胞毒性化学治療剤から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の医薬組成物または製剤。

【請求項8】

放射線療法と併用して使用することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物または製剤。

【請求項9】

個体の癌の治療に起因する白血球減少症および／または血小板減少症を治療するために使用されることを特徴とする、請求項１～８に記載の医薬組成物または製剤。

【請求項10】

前記癌は、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、腎臓がん、肝臓がん、および乳がんのうちの一つまたは複数から選択されることを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物または製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、海洋医学の分野に関し、具体的には、β－１，３／１，６－グルカンの応用に関し、前記β－１，３／１，６－グルカンは、医薬組成物または製剤を調製するために使用され、免疫療法、放射線療法、または化学療法の抗腫瘍効果を増強し、白血球および／または血小板減少症を治療するために使用されることができる。

【背景技術】

【0002】

β－グルカンは、真菌、酵母、いくつかの細菌および植物の細胞壁から由来したグルコースで構成される長鎖多糖類である。これらのポリマーの主鎖は、線状β－Ｄ－（１，３）グルコシルユニットを含み、Ｏ－６でβ－Ｄ－（１，６）グルコシルユニットによって結合された側鎖で置換され、その分子量のサイズおよび分布は、変化されることができる。

【0003】

β－グルカンは、好中球、マクロファージおよび顆粒球等の自然免疫細胞を誘発することによって宿主の免疫応答を調節する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰｓ）であると考えられる。現在、市場に出回っているほとんどのβ－１，３－グルカンは、大麦、オーツ麦、食用キノコ（椎茸、舞茸（Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ）、担子菌（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ））、酵母等の陸生生物に由来し、原料の供給源が異なるため、得られたβ－１，３－グルカンの分子量、結合様式および分枝度等が大きく異なり、品質の管理が困難であり、例えば、注射用のβ－グルカンは、主に椎茸に由来し、β－１，６－分枝を有するβ－１，３－グルカンであり、その分子量が４００～８００ｋＤａに達するため、水溶性が低い。

【0004】

免疫系を外因的に刺激することによって癌を治療する癌免疫療法は、有望な癌治療戦略として浮上している。例えば、細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死受容体１（ＰＤ－１）およびそのリガンド（ＰＤ－Ｌ１）等の免疫チェックポイントの阻害剤は、免疫阻害シグナル伝達を遮断し、かつ自律的な抗腫瘍反応を増強することにより、様々な癌で大きな成功を収めている。

【0005】

ＰＤ－１を標的とする癌免疫療法は、免疫環境を調節して、より効果的な抗腫瘍反応を引き出すことで、大きな成功を収めているが、単剤ＰＤ－１の阻断の恩恵を受けるのは一部の患者だけである。放射線療法および化学療法は、最も一般的な癌治療法であるが、放射線療法および化学療法の毒性が大きいため、癌患者は、放射線療法および化学療法を受ける期間中に様々な副効果を経験し、ここで、最も一般的なのは、白血球の減少をもたらし、患者に生命を脅かす感染症を引き起こす可能性がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、β－１，３／１，６－グルカンの用途を提供することであり、前記用途は、抗腫瘍、白血球の上昇および血小板減少症への耐性を含み、前記β－１，３／１，６－グルカンは、水溶性が高く、安全性が高いという特徴を有する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明の第１の態様は、β－１，３／１，６－グルカンの応用を提供し、前記β－１，３／１，６－グルカンは、南極の褐藻に由来し、前記β－１，３／１，６－グルカンは、医薬組成物または製剤を調製するために使用され、前記医薬組成物または製剤は、白血球および／または血小板減少症を治療するために使用されることを特徴とする。

【0008】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンのＨ１シグナルは、１Ｈ－ＮＭＲでは４．４０～４．６４ｐｐｍ領域に位置し、Ｃ１シグナルは、１３Ｃ－ＮＭＲでは１０２．４～１０２．６７ｐｐｍ領域に位置する。

【0009】

別の好ましい例において、前記南極の褐藻は、海のキノコ、海の芽または雷鳴の藻、南極の雄牛の藻（Ｄｕｒｖｉｌｌａｅａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）である。

【0010】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンは、式（Ｉ）および／または式（ＩＩ）に示されるようなβ－グルカンであり、

【化1】

ここで、ｎは、１～２０から選択される整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０）であり、Ｒは、Ｈおよび／または４個以下のグルコース残基（例えば、１、２、３または４個のグルコース残基）である。

【0011】

別の好ましい例において、前記式（Ｉ）または式（ＩＩ）の構造中のＲは、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）または式（Ｖ）または式（ＶＩ）構造の一つまたは複数であり、ここで
式（ＩＩＩ）：Ｇｌｃβ１－、
式（ＩＶ）：Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－、
式（Ｖ）：Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－またはＧｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－；
式（ＶＩ）：
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－３Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－または
Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ１－６Ｇｌｃβ－。

【0012】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカン分子量は、１～５０ｋＤａ、好ましくは、２～３０ｋＤａ、より好ましくは、２～１０ｋＤａ、最も好ましくは、４～７ｋＤａである。

【0013】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの比旋光度は、－１５．０°より低くなく、好ましくは、－１５°～２５°、より好ましくは、－１５～－２１°である。

【0014】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの紫外線全波長走査スペクトルは、３００～９００ｎｍの波長範囲で明らかな吸収がなく、より好ましくは、２３０～９００ｎｍの波長範囲で明らかな吸収がない。

【0015】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの紫外線全波長走査スペクトルは、２６０～２８０ｎｍの波長範囲で吸収ピークを有さない。

【0016】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカン側鎖の長さは、≦５である。

【0017】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンは、次の段階によって調製されることができる。

【0018】

（１）脱脂段階：南極の褐藻を乾燥・粉砕し、有機溶媒に浸し、攪拌して、脱脂藻類粉末を得る。

【0019】

（２）水抽出段階：前記脱脂藻類粉末を室温下で水で攪拌・抽出して水抽出液を得る。

【0020】

（３）分級段階：段階（２）で得られた水抽出液を遠心分離し、遠心分離によって得られた上澄みに１～３ｍｏｌ／Ｌの塩化カルシウム水溶液を加え、攪拌した後遠心分離し、上澄みを取って、透析または限外ろ過脱塩を実行し、減圧下で濃縮・乾燥して、粗多糖類を得る。

【0021】

（４）精製段階：段階（３）の前記粗多糖類を蒸留水で溶解し、蒸留水および塩化ナトリウム水溶液を移動相として使用し、陰イオン交換樹脂で分離・精製し、水溶出成分を収集し、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して、前記β－１，３／１，６－グルカンを得る。

【0022】

別の好ましい例において、段階（４）は、次のように生成される：段階（３）の前記粗多糖類を蒸留水で溶解し、蒸留水および塩化ナトリウム水溶液を移動相として使用し、陰イオン交換樹脂で分離・精製し、硫酸フェノール法によって検出し、水溶出成分を収集し、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して、前記β－１，３／１，６－グルカンを得る。

【0023】

別の好ましい例において、前記陰イオン樹脂の分離および精製は、強陰イオン樹脂の分離および精製である。

【0024】

別の好ましい例において、前記陰イオン樹脂の分離および精製は、まず強陰イオン樹脂の分離および精製、次に弱陰イオン樹脂の分離および精製であるか、またはまず弱陰イオン子樹脂の分離および精製、次に強陰イオン子樹脂の分離および精製である。

【0025】

別の好ましい例において、前記強陰イオン樹脂は、第四級アンモニウム基を含む陰イオン樹脂である。

【0026】

別の好ましい例において、前記弱陰イオン樹脂は、ジエチルアミノエチル基を含む陰イオン樹脂である。

【0027】

別の好ましい例において、本発明は、β－１，３／１，６－グルカンの応用を提供し、前記白血球は、リンパ球であることを特徴とする。

【0028】

別の好ましい例において、前記リンパ球は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞である。

【0029】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、前記医薬組成物または製剤は、抗腫瘍効果を有することを特徴とする。

【0030】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、前記医薬組成物または製剤は、免疫チェックポイント薬物と併用して応用することもできることを特徴とする。

【0031】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、前記免疫チェックポイント薬物は、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ－１）拮抗剤、またはＰＤ－Ｌ１拮抗剤、または細胞毒性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ－４）拮抗剤、またはリンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）拮抗剤、またはＴ細胞免疫グロブリン－３（ＴＩＭ－３）拮抗剤、またはＴ細胞免疫グロブリンおよびＩＴＩＭドメインタンパク質（ＴＩＧＩＴ）拮抗剤から選択されることを特徴とする。

【0032】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、前記免疫チェックポイント薬物は、抗ＰＤ－１抗体および抗ＰＤ－Ｌ１抗体から選択されることを特徴とする。

【0033】

別の好ましい例において、白血球および血小板減少症を治療するための薬物の調製における前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、前記抗ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体は、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ＢＭＳ２０２、スパルタリズマブ（Ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）から選択されることを特徴とする。

【0034】

別の好ましい例において、プログラム細胞死１タンパク質（ＰＤ－１）またはＰＤ－Ｌ１の拮抗剤と併用応用された前記医薬組成物または製剤は、同時に、順次的にまたは別々に投与される。

【0035】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、前記医薬組成物または製剤は、少なくとも一つの化学治療剤と併用して応用することもできることを特徴とする。

【0036】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、前記化学治療剤は、細胞毒性化学治療剤から選択されることを特徴とする。

【0037】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、前記化学治療剤は、アントラサイクリン、５－Ｆｕ、アルカロイドのうちの一つから選択されることを特徴とする。

【0038】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、前記化学治療剤は、シスプラチン、カルボプラチンのうちの一つから選択されることを特徴とする。

【0039】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、化学治療剤と併用して応用された前記医薬組成物または製剤は、同時に、順次的にまたは別々に投与される。

【0040】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、前記医薬組成物または製剤は、放射線療法と併用して応用することもできることを特徴とする。

【0041】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、放射線療法と併用応用された前記医薬組成物または製剤は、同時に、順次的にまたは別々に投与される。

【0042】

別の好ましい例において、前記β－１，３／１，６－グルカンの応用であって、前記医薬組成物または製剤は、個体の癌を治療するために使用されることを特徴とする。

【0043】

別の好ましい例において、前記癌は、黒色腫、結腸直腸がん、肺がん、腎臓がん、肝臓がん、乳がんのうちの一つまたは複数である。

【0044】

別の好ましい例において、前記医薬組成物または製剤は、安全かつ有効な量のβ－１，３／１，６－グルカン、および薬学的に許容されるベクターまたは賦形剤を含む。

【発明の効果】

【0045】

本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】Ｂ１６同系腫瘍モデルに対する抗ＰＤ－１抗体と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図2】Ｂ１６同系腫瘍モデルのＴリンパ球に対する抗ＰＤ－１抗体と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図3】Ｂ１６同系腫瘍モデルの血小板に対する抗ＰＤ－１抗体と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図4】Ｂ１６同系腫瘍モデルのリンパ球に対する抗ＰＤ－１抗体と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図5】Ｂ１６同系腫瘍モデルに対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍効果を示す。

【図6】Ｂ１６同系腫瘍モデルに対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍効果を示す。

【図7】Ｂ１６同系腫瘍モデルに対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍効果を示す。

【図8】Ｂ１６同系腫瘍モデルの白血球に対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図9】Ｂ１６同系腫瘍モデルの白血球に対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図10】Ｂ１６同系腫瘍モデルの白血球に対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図11】Ｂ１６同系腫瘍モデルの白血球に対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図12】Ｂ１６同系腫瘍モデルの白血球に対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図13】Ｂ１６同系腫瘍モデルの白血球に対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図14】Ｂ１６同系腫瘍モデルの白血球に対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図15】Ｂ１６同系腫瘍モデルの白血球に対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図16】Ｂ１６同系腫瘍モデルの末梢血に対する放射線療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図17】Ｂ１６同系腫瘍モデルに対する化学療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図18】Ｂ１６同系腫瘍モデルに対する化学療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図19】Ｂ１６同系腫瘍モデルに対する化学療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図20】Ｂ１６同系腫瘍モデルに対する化学療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【図21】Ｂ１６同系腫瘍モデルに対する化学療法と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0047】

用語
特に定義しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される以下の用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。特に明記しない限り、本明細書の全体で引用されるすべての特許、特許出願、出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明において、ＰＬＴは、血小板の計数であり、ＮＥＵＴは、好中球であり、ＬＹＭＰＨは、リンパ球であり、ＭＯＮＯは、単球であり、ＷＢＣは、白血球である。

【0048】

本明細書において、「強陰イオン樹脂」および「強陰イオン交換樹脂」という用語は、交換可能に使用され、第四級アミン基等のより強い反応性基を含む陰イオン樹脂を指す。

【0049】

本明細書において、「弱陰イオン樹脂」および「弱陰イオン交換樹脂」という用語は、交換可能に使用され、ジエチルアミノエチル基等のより弱い反応性基を含む陰イオン樹脂を指す。

【0050】

本発明の主な利点は、次のとおりである。

【0051】

（１）本発明に記載のβ－１，３／１，６－グルカンは、海洋の南極の褐藻に由来し、低分子量、良好な水溶性、および高い安全性等の特徴を有し、白血球減少症および血小板減少症に強い効果を有し、特に、腫瘍治療によるＴリンパ球およびＢリンパ球の減少に良好な効果を有する。

【0052】

以下、具体的な実施例に併せて、本発明をさらに詳しく説明し、添付の図面と併せて本発明の具体的な実施例を読んだ後、本発明の他の利点および特徴はさらに明らかになるであろう。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常従来の条件または製造業者によって提案された条件に従う。

【0053】

実施例１．Ｂ１６同系腫瘍モデルに対する抗ＰＤ－１抗体と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果
３ｘ１０^５個のマウス黒色腫細胞株Ｂ１６（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからの贈り物）の細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌、６～８週齢、済南朋悦実験動物会社から購入）に皮下注射する。腫瘍移植の約４日後、Ｂ１６腫瘍が触知可能に成長した後に投与実験を行う。マウスを四つのグループに分け、それぞれ溶媒またはβ－１，３／１，６－グルカン（４ｍｇ／ｋｇ、静脈内注射、週２回）のみ、または抗ＰＤ－１抗体（抗マウスＰＤ－１抗体はＢｉｏｘＣｅｌｌから購入し、マウスあたり２００μｇ、週１回、静脈内注射）と組み合わせてマウスを処理する。腫瘍体積を強化し、かつ腫瘍重量を記録する。マウスを犠牲にした後、フローサイトメトリー分析のために血液および腫瘍のサンプルを収集する。

【0054】

心臓穿刺により血液サンプルを採集し、ＥＤＴＡ－抗凝固チューブに収集し、５０μｌの全血を採集して血液を分析し、５０μｌの全血を採集して赤血球を溶解し（赤血球溶解緩衝液、Ｍｅｌｔｅｎｙｉ）、残りの全血を３５００ｒｐｍで７分間遠心分離し、血漿－８０℃下で保存する。脾臓および胸腺を採集して重さを量り、記録する。マウス皮下腫瘍を採集し、約０．２～０．５ｇの腫瘍組織を採集し、マウス腫瘍解離キット（Ｍｅｌｔｅｎｙｉ）によって腫瘍サンプルからの単細胞懸濁液を得る。赤血球を溶解した後の血球および解離した腫瘍細胞懸濁液を後続の処理を実行し、フローサイトメトリー用のブロッキング緩衝液（２０％ＦＢＳ、１：１００ ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体および１：１００ラットＩｇＧ）で単細胞懸濁液を２０分間ブロックし、４℃下で対応する免疫細胞表面タンパク質抗体（ＣＤ１１ｂ－ＰＥ、ＣＤ４－ＢＶ５１０、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ１９－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＦＩＴＣ、ＣＤ２０６－ＰＥ－Ｃｙ７、Ｌｙ６Ｃ－ＡＰＣ）で３０分間インキュベート・染色する。ＦＡＣＳ Ａｒｉａｌ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって免疫細胞集団の比率の分析を実行する。具体的なプロセスは、ＦＳＣ／ＳＳＣ象限で細胞集団を描写し、ＦＳＣ－ＨおよびＦＳＣ－Ａによって単細胞集団を描写し、免疫細胞表面マーカーによって対応する免疫細胞を描写し、細胞比率または相対濃度を計算する。

【0055】

図１Ａおよび１Ｂに示されるように、溶媒、β－１，３／１，６－グルカン（４ｍｇ／ｋｇ、静脈内注射、週２回）、抗ＰＤ－１抗体（２００μｇ／マウス、静脈内注射、週１回）、またはβ－１，３／１，６－グルカンおよび抗ＰＤ－１抗体の組み合わせでＢ１６同系腫瘍マウス（４日目から投与開始し、４日目に溶媒グループ、β－１，３／１，６－グルカンとＰＤ－１併用投与グループおよび単一の投与グループに尾静脈内注射し、７日目に溶媒グループおよびＰＤ－１グループに溶媒を投与し、β－１，３／１，６－グルカンおよびβ－１，３／１，６－グルカンおよびＰＤ－１併用投与グループにβ－１，３／１，６－グルカンを投与し、１０日目の投与は、４日目と同じであり、１３日目の投与は、７日目と同じである）を処理し、投与期間中に腫瘍体積を評価し、１４日目にマウスを犠牲にし、腫瘍重量等の指標を評価する。結果は、β－１，３／１，６－グルカンがＢ１６同系腫瘍モデルにおいて抗ＰＤ－１抗体誘発腫瘍退縮を増強し、抗ＰＤ－１抗体の組み合わせが単一の治療よりも効果的に腫瘍増殖阻害することを示す。治療期間中、マウス体重および死亡に有意な変化はなく、当該併用療法が重度の毒性を引き起こさなかったことを示す（図１Ｃ）。フローサイトメトリーによる血液および腫瘍の免疫細胞サブ集団の分析は、併用治療がマウスの血液中のＣＤ１９＋細胞の割合を層化させ、かつＣＤ１１ｂ＋細胞の割合を減少させることを示す（図１Ｄ）。併用治療は、また末梢血中の炎症誘発単球由来のマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ、図１Ｅ）をアップレギュレーションする。腫瘍浸潤免疫細胞の検出は、腫瘍内部にはより多くの骨髄性細胞（ＣＤ１１ｂ＋）、特に炎症誘発性マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃｈｉ）（図１Ｆ）が浸潤されていることを発見し、単独の抗ＰＤ－１抗体処理と比較して、併用治療後、免疫阻害性腫瘍関連マクロファージＴＡＭ（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２０６＋）の割合も減少する（図１Ｇ）。さらに、β－１，３／１，６－グルカンとＰＤ－１抗体との併用応用は血液および腫瘍におけるＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の比率を向上させることが検出される（図２）。β－１，３／１，６－グルカンおよび抗ＰＤ－１抗体は、炎症誘発性マクロファージによる腫瘍浸潤を相乗的に増加させ、免疫阻害性ＴＡＭの割合を減少し、適応免疫細胞のＴ細胞
およびＢ細胞の比率を増加させルことにより、より炎症誘発性で抗腫瘍性の腫瘍微小環境を構築する。

【0056】

実施例２．Ｂ１６同系腫瘍モデルの血小板に対する抗ＰＤ－１抗体と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの効果
実験方法は、実施例１と同じであり、１４日目に、動物を犠牲にした後心臓から採血して、ＥＤＴＡ－抗凝固チューブに入れ、混合後に５０μｌを採集して、血液分析器で血小板濃度を検出する。図３に示されるように、ＰＤ－１抗体の単独使用は血小板濃度を低下させ、β－１，３／１，６－グルカンの単独使用は血小板濃度に影響を与えないが、ＰＤ－１抗体との併用使用は、ＰＤ－１抗体の血小板減少症の副作用を逆転させることができる。

【0057】

実施例３．末梢血中のリンパ球数に対する抗ＰＤ－１抗体と併用使用されたβ－１，３／１，６－グルカンの影響
実験方法は、実施例１と同じであり、１４日目に、動物を犠牲にした後心臓から採血して、ＥＤＴＡ－抗凝固チューブに入れ、混合後に５０μｌの全血を採集し、各サンプルに５μｌのＧＦＰミクロスフェアを加えて、赤血球溶解を実行する。

【0058】

ブロッキング緩衝液（２０％ＦＢＳ、１：１００ ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体および１：１００ラットＩｇＧ）で単細胞懸濁液を２０分間ブロックし、４℃下で対応する免疫細胞表面タンパク質抗体（ＣＤ４－ＢＶ５１０、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ１９－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＦＩＴＣ）で３０分間インキュベート・染色する。ＦＡＣＳ Ａｒｉａｌ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって免疫細胞集団の比率の分析を実行する。具体的なプロセスは、ＦＳＣ／ＳＳＣ象限で細胞集団を描写し、ＦＳＣ－ＨおよびＦＳＣ－Ａによって単細胞集団を描写し、免疫細胞表面マーカーによって対応する免疫細胞を描写し、相対的な免疫細胞の濃度を計算する。

【0059】

図４の実験結果は、ＰＤ－１抗体の単独投与で血液中のＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８の相対濃度を増加させることができ、８ｍｇ／ｋｇのβ－１，３／１，６－グルカンとＰＤ－１抗体との併用投与が血液中のＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９の相対濃度をさらに増加させることができ、β－１，３／１，６－グルカンがＰＤ－１抗体の免疫活性化効果をさらに増強させることができることを示す。

【0060】

実施例４．放射線療法後のマウスモデルにおけるβ－１，３／１，６－グルカンの応用
３ｘ１０^５個のマウス黒色腫細胞株Ｂ１６（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからの贈り物）の細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌、６～８週齢、済南朋悦実験動物会社から購入）に皮下注射する（Ｏｖｅｒｗｉｊｋ ＆ Ｒｅｓｔｉｆｏ、２００１）。腫瘍移植の約５日後、局所放射線療法（腫瘍注射領域、１０Ｇｙ）を使用する。６日目および１４日目に、溶媒またはβ－１，３／１，６－グルカン（尾静脈内注射、週１回）を投与し、期間中の腫瘍体積およびマウス体重を検出し、１７日目に動物を犠牲にした後、腫瘍質量を検出する。

【0061】

図５～７に示されるように、放射線療法は、腫瘍細胞の増殖を大幅に阻害できるが、β－１，３／１，６－グルカンは、放射線療法の抗腫瘍効果を増強させることができる。

【0062】

３ｘ１０^５個のマウス黒色腫細胞株Ｂ１６（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからの贈り物）の細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌、６～８週齢、済南朋悦実験動物会社から購入）に皮下注射する（Ｏｖｅｒｗｉｊｋ ＆ Ｒｅｓｔｉｆｏ、２００１）。腫瘍移植の約５日後、局部放射線療法（腫瘍注射領域、１０Ｇｙ）を使用する。６日目および１４日目に、溶媒またはβ－１，３／１，６－グルカン（尾静脈内注射、週１回）を投与し、１７日目に、動物を犠牲にした後、腫瘍質量を検出する。動物を犠牲にした後心臓から採血して、ＥＤＴＡ－抗凝固チューブに入れ、混合後に５０μｌの全血を採集し、血液分析器で免疫細胞の濃度を検出する。

【0063】

図８～１５に示されるように、放射線療法は、抗腫瘍の同時に動物の体内の免疫細胞の濃度低下させ、マウスの生存状態に不利するが、β－１，３／１，６－グルカンは、免疫刺激剤として、免疫細胞を刺激し、免疫細胞の濃度を向上させ、放射線療法の副効果を効果的に減少させる。

【0064】

１４日目に、動物を犠牲にした後心臓から採血し、ＥＤＴＡ－抗凝固チューブに入れ、混合後に５０μｌの全血を採集し、各サンプルに５μｌのＧＦＰ ミクロスフェアを加えて、赤血球溶解を実行する。

【0065】

ブロッキング緩衝液（２０％ＦＢＳ、１：１００ ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体および１：１００ラットＩｇＧ）で単細胞懸濁液を２０分間ブロックし、４℃下で対応する免疫細胞表面タンパク質抗体（ＣＤ４－ＢＶ５１０、ＣＤ８－ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＣＤ１９－ＡＰＣ）で３０分間インキュベート・染色する。ＦＡＣＳ Ａｒｉａｌ ＩＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって免疫細胞集団の比率の分析を実行する。具体的なプロセスは、ＦＳＣ／ＳＳＣ象限で細胞集団を描写し、ＦＳＣ－ＨおよびＦＳＣ－Ａによって単細胞集団を描写し、免疫細胞表面マーカーによって対応する免疫細胞を描写し、相対的な免疫細胞の濃度を計算する。

【0066】

図１６の結果は、放射線療法がＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９の細胞濃度を低下させ、８ｍｇ／ｋｇのβ－１，３／１，６－グルカンが対応する細胞濃度を上昇させることにより、免疫系を刺激することを示す。

【0067】

実施例５．マウス腫瘍モデルのための化学療法と組み合わせたβ－１，３／１，６－グルカン
白血球および血小板に対する化学療法と組み合わせたβ－１，３／１，６－グルカンの効果
３ｘ１０^５個のマウス黒色腫細胞株Ｂ１６（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからの贈り物）の細胞懸濁液をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雌、６～８週齢、済南朋悦実験動物会社から購入）に皮下注射する（Ｏｖｅｒｗｉｊｋ ＆ Ｒｅｓｔｉｆｏ、２００１）。腫瘍移植の約２日後、カルボプラチンの腹腔内注射（３０ｍｇ／ｋｇ、週２回）およびＢＧ１３６（４ｍｇ／ｋｇ）またはレンチナンＬＮＴ（２ｍｇ／ｋｇ）の尾静脈内注射を使用して、投与期間中の腫瘍体積を検出し、１５日目に、動物を犠牲にした後、腫瘍質量を検出する。動物を犠牲にした後心臓から採血し、ＥＤＴＡ－抗凝固チューブに入れ、混合後に５０μｌの全血を採集し、血液分析器で免疫細胞の濃度を検出する。

【0068】

図１７～２１に示されるように、ＢＧ１３６は、カルボプラチンの腫瘍阻害効果を増強させ、免疫応答を刺激し、カルボプラチン投与後の免疫阻害を逆転させ、血小板を減少させることができる。

【0069】

実施例６．
免疫細胞が様々な種類の腫瘍細胞で重要な役割を果たすため、β－１，３／１，６－グルカンの抗腫瘍、美白および血小板増加の効果は、様々な腫瘍細胞で役割を果たす（例えば、肺がん、腎臓がん、肝臓がん、乳がん等）。

【0070】

また、免疫細胞が腫瘍の転移および発生を調節する役割も果たすため、β－１，３／１，６－グルカンは、腫瘍細胞の転移および発生阻害することができる。

【0071】

本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】