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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-02
(45)【発行日】2023-10-11
(54)【発明の名称】分子標的併用腫瘍治療・予防薬
(51)【国際特許分類】
A61K 38/15 20060101AFI20231003BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20231003BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231003BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231003BHJP
【ＦＩ】
A61K38/15
A61K31/704
A61P35/00
A61P43/00 111
A61P43/00 121
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2019040233
(22)【出願日】2019-03-06
(65)【公開番号】P2020143010
(43)【公開日】2020-09-10
【審査請求日】2022-03-01
(73)【特許権者】
【識別番号】599090202
【氏名又は名称】酒井 敏行
(73)【特許権者】
【識別番号】504366165
【氏名又は名称】オンコリスバイオファーマ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100185258
【弁理士】
【氏名又は名称】横井 宏理
(74)【代理人】
【識別番号】100101085
【弁理士】
【氏名又は名称】横井 健至
(74)【代理人】
【識別番号】100134131
【弁理士】
【氏名又は名称】横井 知理
(72)【発明者】
【氏名】酒井 敏行
【審査官】石井 裕美子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１３－０４９７０６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００９／０６７５４３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５１０３０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Cancer Biology & Therapy，2012年，Vol.13, No.8，p.614-622
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（ＩＩＩ）：
【化3】
（式中、Ｒ４はイソプロピル基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アムルビシンとを有効成分として含有することを特徴とする、肺癌治療用及び予防用医薬組成物。
【請求項2】
式（ＩＩＩ）：
【化3】
（式中、Ｒ４はイソプロピル基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、アムルビシンと併用するための肺癌治療用及び予防用医薬組成物。
【請求項3】
アムルビシンを有効成分として含有することを特徴とする、式（ＩＩＩ）：
【化3】
（式中、Ｒ４はイソプロピル基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と併用するための肺癌治療用及び予防用医薬組成物。
【請求項4】
式（ＩＩＩ）：
【化6】
（式中、Ｒ４はイソプロピル基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とアムルビシンとを、有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、肺癌治療用及び予防用医薬組成物の製造方法。
【請求項5】
式（ＩＩＩ）：
【化6】
（式中、Ｒ４はイソプロピル基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、アムルビシンと併用するための肺癌治療用及び予防用医薬組成物の製造方法。
【請求項6】
アムルビシンを有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、式（ＩＩＩ）：
【化6】
（式中、Ｒ４はイソプロピル基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と併用するための肺癌治療用及び予防用医薬組成物の製造方法。
【請求項7】
式（ＩＩＩ）：
【化9】
（式中、Ｒ４はイソプロピル基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物、及び、アムルビシンを有効成分として含有する医薬組成物からなる、肺癌治療用及び予防用医薬組成物のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、腫瘍治療及び予防における分子標的併用療法並びに予防法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
癌などの悪性腫瘍は、疾患を原因とする主要な死因の一つである。化学療法剤を用いた腫瘍の化学療法の有効性は上昇しているが、依然として満足のいく臨床治療成績は得られていない。たとえば、気管・気管支・肺癌は、世界中で毎年２００万人が新たに罹患し１７０万人が亡くなっており（非特許文献１参照。）、罹患数の著しい増加に伴い進行性の肺癌の症例数が増加しているため、有効な治療法の開発が課題となっている。
【0003】
近年、進行肺癌に対しては、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を始めとする、がんの発生や進展において直接的に重要な役割を果たすドライバー（ｄｒｉｖｅｒ）遺伝子におけるｄｒｉｖｅｒ変異を標的とした分子標的治療が試みられており、進行肺癌の罹患患者における生存期間は劇的に改善してきている。
【0004】
しかしながら、肺扁平上皮癌に対しては、有効な分子標的治療は未だ無く、免疫チェックポイント阻害剤が適応となったものの、肺扁平上皮癌に対する化学療法は、未だ細胞障害性抗がん剤が主力となっている。肺扁平上皮癌のｄｒｉｖｅｒ変異として最も頻度の高い線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）を標的としたＦＧＦＲ阻害剤を用いた臨床試験も行われているが、奏効率は僅か７～１９％に留まることが報告されており（非特許文献２参照。）、他の癌を対象とした分子標的薬で確認されているような高い有効性は得られていない現状である。そのため、肺扁平上皮癌に対する新規治療開発が早期に望まれている。
【0005】
悪性腫瘍に対処して克服するべく開発されている分子標的薬として、癌細胞の生長阻害、細胞分化及びアポトーシスを誘導する活性を有するものがあることが報告された分子標的薬であるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤がある。本発明者らは、ＨＤＡＣ阻害剤がｐ５３変異を有する悪性腫瘍に対する抗腫瘍効果を示すことを見出す（非特許文献３～９参照。）とともに、ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１－誘導物質をスクリーニングすることにより、新規なＨＤＡＣ阻害薬としてＯＢＰ－８０１／ＹＭ７５３（ｓｐｉｒｕｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ）も見出している（非特許文献１０、特許文献１及び特許文献２参照。）。
【0006】
しかし、ＳＡＨＡ／ボリノスタット、ロミデプシン／イストダックス、ベリノスタット／ベレオダックによる皮膚Ｔ細胞性リンパ腫治療、パノビノスタット／ファリーダックによる多発性骨髄腫治療が承認された例を除き、臨床において癌などの悪性腫瘍に対する治療において用いることが認められたＨＤＡＣ阻害剤の報告はない。
【0007】
ＨＤＡＣ阻害剤は様々な非小細胞肺癌細胞株において抗腫瘍効果を示した報告もあるが、非小細胞肺癌に対するＨＤＡＣ阻害剤単剤での臨床試験の成績は十分なものではなく、単剤投与試験による奏効率は、僅か０～６％に留まる（非特許文献１１～１３）。また、非小細胞肺癌に対する既存抗癌剤とＨＤＡＣ阻害剤の併用の試みにおいても、併用群においてGrade 3以上の有害事象が有意に多く発生し、さらにはＰＦＳの延長を認めないものがあるなど不十分であり（非特許文献１４～１５）、未だ肺癌を対象とした臨床試験で安全性と有効性とが確認された報告は見当たらない。小細胞肺癌細胞株でＨＤＡＣ阻害剤とアントラサイクリン系抗癌剤のアムルビシン（ａｍｒｕｂｉｃｉｎ）を含むいくつかのトポイソメラーゼ阻害剤との併用効果をみた報告はあるが（非特許文献１６）、扁平上皮癌を含む非小細胞肺癌を対象とした報告はない。
【0008】
このように様々な試みがなされているも十分な成果があがっているとまではいえず、依然として、癌などの悪性腫瘍治療及び予防における臨床成績を改善するための新たな治療戦略の開発と、該治療戦略に基づく新たな治療薬の開発が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】特許第３５５４７０７号公報
【文献】特開２００１－３４８３４０号公報
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ｇｌｏｂａｌ Ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ， ＪＡＭＡ Ｏｎｃｏｌ． ２０１８；４（１１）：１５５３－１５６８．
【文献】Ｒｅｂｅｃｃａ Ｓ． Ｈｅｉｓｔ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ． ２０１２； ７（１２）： １７７５－１７８０．
【文献】Ｈｉｒｏｓｅ Ｔ， Ｓｏｗａ Ｙ， Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ． ｐ５３－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇａｄｄ４５ ｂｙ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ： ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ Ｏｃｔ－１ ａｎｄ ＮＦ－Ｙ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００３；２２：７７６２－７３．
【文献】Ｎａｋａｔａ Ｓ， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ， Ｈｏｒｉｎａｋａ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ ｄｅａｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５／ＴＲＡＩＬ－Ｒ２ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＴＲＡＩＬ／ＡＰＯ２－Ｌ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００４；２３：６２６１－７１．
【文献】Ｙｏｋｏｔａ Ｔ， Ｍａｔｓｕｚａｋｉ Ｙ， Ｍｉｙａｚａｗａ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｃｔｉｖａｔｅ ＩＮＫ４ｄ ｇｅｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｐ１ ｓｉｔｅ ｉｎ ｉｔｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００４；２３：５３４０－９．
【文献】Ｈｉｔｏｍｉ Ｔ， Ｍａｔｓｕｚａｋｉ Ｙ， Ｙｏｋｏｔａ Ｔ， ｅｔ ａｌ． ｐ１５（ＩＮＫ４ｂ） ｉｎ ＨＤＡＣ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２００３；５５４：３４７－５０．
【文献】Ｙｏｋｏｔａ Ｔ， Ｍａｔｓｕｚａｋｉ Ｙ， Ｓａｋａｉ Ｔ． Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｐ１８ＩＮＫ４ｃ ｇｅｎｅ： ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐ１９ＩＮＫ４ｄ ｇｅｎｅ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２００４；５７４：１７１－５．
【文献】Ｎａｋａｎｏ Ｋ， Ｍｉｚｕｎｏ Ｔ， Ｓｏｗａ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｂｕｔｙｒａｔｅ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｓｐ１ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ａ ｐ５３－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７；２７２：２２１９９－２０６．
【文献】Ｓｏｗａ Ｙ， Ｏｒｉｔａ Ｔ， Ｍｉｎａｍｉｋａｗａ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｓｐ１ ｓｉｔｅｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９７；２４１：１４２－５０．
【文献】Ｓｈｉｎｄｏｈ Ｎ， Ｍｏｒｉ Ｍ， Ｔｅｒａｄａ Ｙ， ｅｔ ａｌ． ＹＭ７５３， ａ ｎｏｖｅｌ ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， ｅｘｈｉｂｉｔｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｔｈ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ， ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ｈｉｓｔｏｎｅｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ＷｉＤｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｏｎｃｏｌｏｇｙ． ２００８； ３２： ５４５－５５．
【文献】Ｗａｇｎｅｒ ＪＭ，ｅｔ ａｌ． Ｃｌｉｎ Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ． ２０１０ Ｄｅｃ；１（３－４）：１１７－１３６．
【文献】Ｔｒａｙｎｏｒ ＡＭ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｏｎｃｏｌ． ２００９ Ａｐｒ；４（４）：５２２－５２６．
【文献】Ｇｒｉｄｅｌｌｉ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔｏｌ． ２００８ Ｏｃｔ；６８（１）：２９－３６．
【文献】Ｔａｍｂｏ Ｙ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ． ２０１７ Ａｐｒ；３５（２）：２１７－２２６．
【文献】Ｒａｍａｌｉｎｇａｍ ＳＳ， ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． ２０１０ Ｊａｎ １；２８（１）：５６－６２．
【文献】Ｇｒａｙ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１２ Ｊｕｎ；１３（８）：６１４－６２２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明が解決しようとする課題は、悪性の腫瘍、特に肺癌を治療及び予防することができる、新たな治療薬並びに治療戦略を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者は、悪性の腫瘍、特に肺癌に対する、合理的かつ有効性の高い新たな治療戦略の確立を目指し、新規及び既存の分子標的医薬化合物を用いた評価を進めていた中で、分子標的薬であるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤のＯＢＰ－８０１と、アントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシンとを用いたところ、有意に高い相乗的な癌治療・予防効果が発揮されることを見出し、その分子機構の解明を通して、新たな治療戦略に基づく合理的で有効性の高い新規腫瘍治療用薬及び予防用医薬の発明を完成させた。
【0013】
本発明は、腫瘍に対する治療及び予防を可能とするため、特に肺癌に対する治療及び予防のためのものであって、分子標的薬であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とアントラサイクリン系抗癌剤とを医薬の有効成分として併用する点を、最も主要な特徴とする。
【0014】
上記の課題を解決するための本発明の手段は、第１の手段では、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アントラサイクリン系抗癌剤とを有効成分として含有することを特徴とする、腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。
【0015】
本発明の第２の手段は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分として含有することを特徴とする、アントラサイクリン系抗癌剤と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。
【0016】
本発明の第３の手段は、アントラサイクリン系抗癌剤を有効成分として含有することを特徴とする、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。
【0017】
本発明の第４の手段は、前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、
次式（Ｉ）：
又は、次式（ＩＩ）：
（式中、Ｒ１～Ｒ３は独立して水素原子、メチル基、エチル基、Ｒ４は水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基又はイソブチル基、Ｒ５～Ｒ８はそれぞれ独立して水素原子、メチル基、エチル基又はイソプロピル基、Ｒ８は水素原子、メチル基又は保護基、Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素原子、メチル基又は保護基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であることを特徴とする、本発明の第１の手段～第３の手段のいずれか１に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。
次式（Ｉ）：
【化1】
【化2】
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であることを特徴とする、本発明の第１の手段～第３の手段のいずれか１に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。
【0018】
本発明の第５の手段は、前記デプシペプチド化合物が、
次式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ４はイソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基又はイソブチル基を表す。）
で示される化合物であることを特徴とする、本発明の第４の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。
次式（ＩＩＩ）：
【化3】
で示される化合物であることを特徴とする、本発明の第４の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。
【0019】
本発明の第６の手段は、Ｒ４がイソプロピル基である本発明の第５の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。
【0020】
本発明の第７の手段は、前記アントラサイクリン系抗癌剤がアムルビシンであることを特徴とする、本発明の第１の手段～第６の手段のいずれか１に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。
【0021】
本発明の第８の手段は、前記腫瘍が、肺癌であることを特徴とする、本発明の第１の手段～第７の手段のいずれか１に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。
【0022】
本発明の第９の手段は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とアントラサイクリン系抗癌剤とを、有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。
【0023】
本発明の第１０の手段は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、アントラサイクリン系抗癌剤と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。
【0024】
本発明の第１１の手段は、アントラサイクリン系抗癌剤を有効成分として含有させる工程を有することを特徴とする、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。
【0025】
本発明の第１２の手段は、前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、
次式（Ｉ）：
又は、次式（ＩＩ）：
（式中、Ｒ１～Ｒ３は独立して水素原子、メチル基、エチル基、Ｒ４は水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基又はイソブチル基、Ｒ５～Ｒ８はそれぞれ独立して水素原子、メチル基、エチル基又はイソプロピル基、Ｒ８は水素原子、メチル基又は保護基、Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素原子、メチル基又は保護基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であることを特徴とする、本発明の第９の手段～第１１の手段のいずれか１に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。
次式（Ｉ）：
【化4】
【化5】
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であることを特徴とする、本発明の第９の手段～第１１の手段のいずれか１に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。
【0026】
本発明の第１３の手段は、前記デプシペプチド化合物が、
次式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ４はイソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基又はイソブチル基を表す。）
で示される化合物であることを特徴とする、本発明の第１２の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。
次式（ＩＩＩ）：
【化6】
で示される化合物であることを特徴とする、本発明の第１２の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。
【0027】
本発明の第１４の手段は、Ｒ４がイソプロピル基である本発明の第１３の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物である。
【0028】
本発明の第１５の手段は、前記アントラサイクリン系抗癌剤がアムルビシンであることを特徴とする、本発明の第９の手段～第１４の手段のいずれか１に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。
【0029】
本発明の第１６の手段は、前記腫瘍が、肺癌であることを特徴とする、本発明の第９の手段～第１５の手段のいずれか１に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物の製造方法である。
【0030】
本発明の第１７の手段は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分として含有する医薬組成物、及び、アントラサイクリン系抗癌剤を有効成分として含有する医薬組成物からなる、腫瘍治療用及び予防用医薬組成物のキットである。
【0031】
本発明の第１８の手段は、前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、
次式（Ｉ）：
又は、次式（ＩＩ）：
（式中、Ｒ１～Ｒ３は独立して水素原子、メチル基、エチル基、Ｒ４は水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基又はイソブチル基、Ｒ５～Ｒ８はそれぞれ独立して水素原子、メチル基、エチル基又はイソプロピル基、Ｒ８は水素原子、メチル基又は保護基、Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素原子、メチル基又は保護基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であることを特徴とする、本発明の第１７の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物のキットである。
次式（Ｉ）：
【化7】
【化8】
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であることを特徴とする、本発明の第１７の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物のキットである。
【0032】
本発明の第１９の手段は、前記デプシペプチド化合物が、
次式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ４はイソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基又はイソブチル基を表す。）
で示される化合物であることを特徴とする、本発明の第１８の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物のキットである。
次式（ＩＩＩ）：
【化9】
で示される化合物であることを特徴とする、本発明の第１８の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物のキットである。
【0033】
本発明の第２０の手段は、Ｒ４がイソプロピル基である本発明の第１９の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物のキットである。
【0034】
本発明の第２１の手段は、前記アントラサイクリン系抗癌剤がアムルビシンであることを特徴とする、本発明の第１７の手段～第２０の手段のいずれか１に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物のキットである。
【0035】
本発明の第２２の手段は、前記腫瘍が、肺癌であることを特徴とする、本発明の第１７の手段～第２１の手段に記載の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物のキットである。
【発明の効果】
【0036】
本発明の、ＯＢＰ－８０１などのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アントラサイクリン系抗癌剤とを有効成分として併用する医薬組成物を用いることで、相乗的な腫瘍細胞及び腫瘍組織に対するアポトーシス誘導並びに腫瘍増殖阻害効果が得られ、有効成分に起因した副作用を回避した、腫瘍治療及び予防が可能となる。更に、ＯＢＰ－８０１などのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とアントラサイクリン系抗癌剤という薬剤標的分子がそれぞれ異なるものを組み合わせたことで、単剤では得ることができない相乗的な、カスパーゼ経路の活性化とＴＸＮＩＰ及びチオレドキシン２の発現及び活性制御によるミトコンドリア・アポトーシス経路の活性化という顕著な薬理効果を得ることが可能となり、従来療法の有効性が低い肺癌のような腫瘍を含む幅広い腫瘍に適用できる有効な治療薬及び予防薬として、臨床的に有効な、腫瘍に対する新たな治療・予防戦略を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1-1】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤及び／またはアントラサイクリン系抗癌剤のヒト肺扁平上皮癌細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用を示す。 図１Ａは、ＯＢＰ－８０１のＣａｌｕ－１細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用を示す。図１Ｂは、アムルビシンのＣａｌｕ－１細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用を示す。データは平均値±ＳＤを示す。
【図1-2】図１Ｃは、ＯＢＰ－８０１及びアムルビシン併用時のＣａｌｕ－１細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用を示す。図１Ｄは、ＯＢＰ－８０１及びアムルビシン併用時のＨ５２０細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用を示す。図１Ｅは、ＯＢＰ－８０１及びアムルビシン併用時のＡ５４９細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用を示す。データは平均値±ＳＤを示す。＊＊はＰ＜０．０１（ｖｓ．ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。
【図2-1】Ｃａｌｕ－１細胞におけるＳｕｂ－Ｇ１期細胞の割合の解析結果を示す。 図２Ａは、Ｃａｌｕ－１細胞に対するＯＢＰ－８０１及び／またはアムルビシンの７２時間処理によるＳｕｂ－Ｇ１期細胞の割合の解析結果を示す。データは平均値±ＳＤを示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図2-2】図２Ｂは、Ｃａｌｕ－１細胞に対するＯＢＰ－８０１、アムルビシン、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）、及び／またはパンカスパーゼ阻害剤ｚＶＡＤ－ｆｍｋ（Ｚ－ＶＡＤ）の７２時間処理によるＳｕｂ－Ｇ１期細胞の割合の解析結果を示す。図２Ｃは、Ｈ５２０細胞に対するＯＢＰ－８０１、アムルビシン、ＮＡＣ、及び／またはＺ－ＶＡＤの７２時間処理によるＳｕｂ－Ｇ１期細胞の割合の解析結果を示す。図２Ｄは、Ａ５４９細胞に対するＯＢＰ－８０１、アムルビシン、ＮＡＣ、及び／またはＺ－ＶＡＤの７２時間処理によるＳｕｂ－Ｇ１期細胞の割合の解析結果を示す。データは平均値±ＳＤを示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図2-3】図２Ｅは、Ｃａｌｕ－１細胞に対するＯＢＰ－８０１及び／またはアムルビシンの７２時間処理時におけるウエスタンブロット解析結果である。併用時のＣｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ(切断型ＰＡＲＰ（ポリ［ＡＤＰ－リボース］ポリメラーゼ））発現を示す。
【図3】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、アントラサイクリン系抗癌剤、及び／またはキナーゼ阻害薬のＣａｌｕ－１細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用を示す。 図３Ａは、ＯＢＰ－８０１、アムルビシン、及び／またはＡＳＫ１（アポトーシス・シグナル調節キナーゼ１）阻害薬であるＳｅｌｏｎｓｅｒｔｉｂのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用を示す。図３Ｂは、ＯＢＰ－８０１、アムルビシン、及び／またはｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤であるＳＢ２０３５８０のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用を示す。図３Ｃは、ＯＢＰ－８０１、アムルビシン、及び／またはＪＮＫ阻害剤であるＳＰ２６００１２５のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用を示す。データは平均値±ＳＤを示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図4-1】Ｃａｌｕ－１細胞におけるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤及び／またはアントラサイクリン系抗癌剤の７２時間処理時におけるウエスタンブロット解析結果である。 図４Ａは、ＯＢＰ－８０１及び／またはアムルビシンの７２時間処理時におけるウエスタンブロット解析結果である。ＴＸＮＩＰ（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（チオレドキシン相互作用タンパク質））発現を示す。
【図5-1】Ｃａｌｕ－１細胞におけるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤及び／またはアントラサイクリン系抗癌剤の４８時間処理時におけるウエスタンブロット解析結果及びＳｕｂ－Ｇ１期細胞の割合の解析結果である。 図５Ａは、ＯＢＰ－８０１及び／またはアムルビシンと、チオレドキシン２に対するｓｉＲＮＡのｓｉＴｒｘ２との４８時間処理時におけるウエスタンブロット解析結果である。チオレドキシン２（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ２）発現を示す。
【図5-2】図５Ｂは、ＯＢＰ－８０１及び／またはアムルビシンと、チオレドキシン２に対するｓｉＲＮＡのｓｉＴｒｘ２との４８時間処理時におけるＳｕｂ－Ｇ１期細胞の割合の解析結果を示す。データは平均値±ＳＤを示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図6-1】ヒト肺扁平上皮癌細胞株Ｈ５２０を皮下移植したヌードマウスを用いた評価系によるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤及び／またはアントラサイクリン系抗癌剤のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す。 図６Ａは、ＯＢＰ－８０１及び／またはアムルビシンの非処理または処理時における腫瘍体積の変動を示す。データは平均値±ＳＤを示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
【図7】ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤のＯＢＰ－８０１又はＳＡＨＡと、アントラサイクリン系抗癌剤のアムルビシンとの７２時間併用処理時のＣａｌｕ－１細胞に対する腫瘍細胞増殖抑制作用を示す。 図７Ａ及び図７Ｂは、Ｃａｌｕ－１細胞に対するＯＢＰ－８０１又はＳＡＨＡと、アムルビシンとの７２時間併用処理による腫瘍細胞増殖抑制効果を確認した結果である。
【図8】ＯＢＰ－８０１及びアムルビシン併用時の作用機序のモデルを示す。
【発明を実施するための形態】
【0038】
本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるＯＢＰ－８０１と、アントラサイクリン系抗癌剤とを有効成分として含有することを特徴とする、腫瘍治療用及び予防用医薬組成物を提供する。
【0039】
本明細書において「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣ阻害剤）」とは、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）を分子標的とし、阻害する分子標的剤を指す。
【0040】
本発明の組成物に含まれるＨＤＡＣ阻害剤のＯＢＰ－８０１は、オンコリスバイオファーマ株式会社（東京、日本）から入手、使用することができる。
【0041】
ＨＤＡＣ阻害剤のＳＡＨＡ／ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット／ＬＢＨ５８９、ベリノスタット／ＰＸＤ１０１、モセチノスタット／ＭＧＣＤ０１０３、アベキシノスタット／ＰＣＩ－２４７８１、エンチノスタット／ＳＮＤＸ－２７５／ＭＳ－２７５、ＳＢ９３９、ＣＳ０５５／ＨＢＩ－８０００、レスミノスタット／４ＳＣ－２０１／ＢＹＫ４０８７４０、ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ／ＩＴＦ２３５７、ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ／ＪＮＪ－２６４８１５８５、ＣＨＲ－２８４５、ＣＨＲ－３９９６、ＣＵＤＣ－１０１、ＡＲ－４２、ＤＡＣ－０６０、ＥＶＰ－０３３４、ＭＧＣＤ－２９０、ＣＸＤ－１０１／ＡＺＤ－９４６８、ＣＧ２００７４５、ａｒｇｉｎｉｎｅ ｂｕｔｙｒａｔｅ、４ＳＣ－２０２、ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ／ＡＣＹ－１２１５又はＳＨＰ－１４１は、本発明の組成物に含まれるＯＢＰ-８０１と同様にして用いてもよい。
【0042】
また、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤として、
次式（Ｉ）：
または、次式（ＩＩ）：
（式中、Ｒ１～Ｒ３は独立して水素原子、メチル基、エチル基、Ｒ４は水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基又はイソブチル基、Ｒ５～Ｒ８はそれぞれ独立して水素原子、メチル基、エチル基又はイソプロピル基、Ｒ８は水素原子、メチル基又は保護基、Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素原子、メチル基又は保護基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩を使用してもよい。
中でも、次式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ４はイソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基又はイソブチル基を表す。）
で示される化合物であることがより好ましく、Ｒ４がイソプロピル基である化合物（ＯＢＰ－８０１）が特に好ましい。
次式（Ｉ）：
【化10】
【化11】
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩を使用してもよい。
中でも、次式（ＩＩＩ）：
【化12】
で示される化合物であることがより好ましく、Ｒ４がイソプロピル基である化合物（ＯＢＰ－８０１）が特に好ましい。
【0043】
また、本明細書において「アントラサイクリン系抗癌剤」とは、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩを阻害し、ＤＮＡ鎖の塩基対間にインターカレートしてＤＮＡの合成・複製・転写を阻害し、腫瘍細胞の増殖を抑える抗癌剤としての活性を有する化合物を指す。
【0044】
本発明の組成物に含まれるアントラサイクリン系抗癌剤としては、アムルビシン、アムルビシン塩酸塩、ドキソルビシン、ドキソルビシン塩酸塩、ダウノルビシン、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノルビシンクエン酸塩、エピルビシン、エピルビシン塩酸塩、アクラルビシン、アクラルビシン塩酸塩、ゾルビシン塩酸塩、イダルビシン、イダルビシン塩酸塩、ピラルビシン、ピラルビシン塩酸塩、バルルビシン、ピクサントロン、ピクサントロンマレイン酸塩、アルドキソルビシン、アルドキソルビシン塩酸塩、カルビシン塩酸塩、エソルビシン塩酸塩、ベルビシン塩酸塩などを用いることができる。本発明の組成物に含まれるアントラサイクリン系抗癌剤としては、好ましくは、アムルビシン、またはアムルビシン塩酸塩などのアムルビシンの各種塩を用いることができる。
【0045】
本発明の組成物に含まれるアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン、アムルビシン塩酸塩は、ＡｐｅｘＢｉｏ（台湾）などから入手し、使用することができる。
【0046】
本発明において、「腫瘍」とは、癌などの上皮性悪性腫瘍や肉腫などの非上皮性悪性腫瘍である悪性腫瘍並びに良性腫瘍を包含する。悪性腫瘍としては、好ましくは、肺癌、気管支癌、咽頭癌、甲状腺癌、黒色腫、乳癌、骨腫瘍、骨軟部腫瘍、骨肉腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、腎細胞癌、子宮体癌、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、皮膚癌、中皮腫、リンパ腫、神経系腫瘍、又は、神経組織腫瘍腫が包含され、さらに好ましくは、肺癌が包含される。肺癌としては、非小細胞肺癌（Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ； ＮＳＣＬＣ）、又は、小細胞肺癌（Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ； ＳＣＬＣ）が包含され、より好ましくは非小細胞肺癌が包含され、さらにより好ましくは、非小細胞肺癌としては、扁平上皮非小細胞肺がん（Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ； Ｓｑ ＮＳＣＬＣ）、又は、非扁平上皮非小細胞肺がん（Ｎｏｎ－Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ； Ｎｏｎ－Ｓｑ ＮＳＣＬＣ）が包含され、よりさらに好ましくは、扁平上皮非小細胞肺がん（Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｎｏｎ－Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ； Ｓｑ ＮＳＣＬＣ）が包含される。
【0047】
本発明において、「ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アントラサイクリン系抗癌剤とを有効成分として含有することを特徴とする、腫瘍治療用及び予防用医薬組成物」とは、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とアントラサイクリン系抗癌剤とを、腫瘍の治療または予防において同時に、別々に、または、順次に投与するために組み合わせた医薬組成物を意味する。
【0048】
本発明の医薬組成物は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アントラサイクリン系抗癌剤とが、共に含有される配合剤の形で提供することができる。また、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含有する医薬組成物とアントラサイクリン系抗癌剤を含有する医薬組成物とが別々に提供され、これらの医薬組成物が、同時に、別々に、または順次に使用されてもよい。さらに、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含有する医薬組成物とアントラサイクリン系抗癌剤を含有する医薬組成物から構成されるキットとして提供してもよい。
【0049】
さらに、本発明にしたがって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とアントラサイクリン系抗癌剤とが腫瘍治療及び予防において併用される場合には、 いずれか一方が単独で用いられる投与量よりも各々が少ない投与量で投与され得る。
【0050】
本発明の、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アントラサイクリン系抗癌剤とを含有する組成物は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アントラサイクリン系抗癌剤とを必須の成分として含有し、所望により、製剤化のための添加物を含有していてもよい。
好適には、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤及び、アントラサイクリン系抗癌剤のみを有効成分として含有し、更に製剤化のための添加物を含有する医薬組成物である。
より好適には、次式（Ｉ）：
又は、次式（ＩＩ）：
（式中、Ｒ１～Ｒ３は独立して水素原子、メチル基、エチル基、Ｒ４は水素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基又はイソブチル基、Ｒ５～Ｒ８はそれぞれ独立して水素原子、メチル基、エチル基又はイソプロピル基、Ｒ８は水素原子、メチル基又は保護基、Ｒ１０及びＲ１１は、独立して水素原子、メチル基又は保護基を表す。）
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、及び、アントラサイクリン系抗癌剤のみを有効成分として含有し、更に製剤化のための添加物を含有する医薬組成物である。
さらに好適には、次式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ４はイソプロピル基、ｓｅｃ－ブチル基又はイソブチル基を表す。）
で示される化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、及び、アントラサイクリン系抗癌剤のみを有効成分として含有し、更に製剤化のための添加物を含有する医薬組成物である。
特に好適には、前記式（ＩＩＩ）で示され、式中のＲ４がイソプロピル基である化合物（ＯＢＰ－８０１）又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、及び、アントラサイクリン系抗癌剤のみを有効成分として含有し、更に製剤化のための添加物を含有する医薬組成物である。
好適には、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤及び、アントラサイクリン系抗癌剤のみを有効成分として含有し、更に製剤化のための添加物を含有する医薬組成物である。
より好適には、次式（Ｉ）：
【化13】
【化14】
で示されるデプシペプチド化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、及び、アントラサイクリン系抗癌剤のみを有効成分として含有し、更に製剤化のための添加物を含有する医薬組成物である。
さらに好適には、次式（ＩＩＩ）：
【化15】
で示される化合物又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、及び、アントラサイクリン系抗癌剤のみを有効成分として含有し、更に製剤化のための添加物を含有する医薬組成物である。
特に好適には、前記式（ＩＩＩ）で示され、式中のＲ４がイソプロピル基である化合物（ＯＢＰ－８０１）又はその製薬学的に許容可能な塩であるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、及び、アントラサイクリン系抗癌剤のみを有効成分として含有し、更に製剤化のための添加物を含有する医薬組成物である。
【0051】
本発明において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アントラサイクリン系抗癌剤とを有効成分として含有するとは、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アントラサイクリン系抗癌剤とを主要な活性成分として含むという意味であって、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アントラサイクリン系抗癌剤の含有率を制限するものではない。
【0052】
本発明において、「治療」という用語は、本発明に係る医薬組成物が被験者に投与されることにより、腫瘍が死滅またはその細胞数が減少すること、腫瘍の増殖が抑制されること 、腫瘍に起因する様々な症状が改善されることを意味するものである。また、本発明において「予防」という語は、減少した腫瘍が再度増殖することによりその数が増加することの防止、増殖が抑制された腫瘍の再増殖の防止を意味する。
【0053】
本発明の腫瘍治療用及び予防用医薬組成物は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とアントラサイクリン系抗癌剤とを有効成分として含有させる工程を経ることにより製造することができる。また、本発明のアントラサイクリン系抗癌剤と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を有効成分として含有させる工程を経ることにより、また、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と併用するための腫瘍治療用及び予防用医薬組成物は、アントラサイクリン系抗癌剤を有効成分として含有させる工程を経ることにより、製造することができる。さらに、上記各工程にくわえ、所望により、製剤化のための添加物を含有させる工程を加えたものとしてもよい。
【0054】
本発明の医薬組成物において、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とアントラサイクリン系抗癌剤とが別々の医薬組成物に含有され提供される場合には、これらの医薬組成物の剤型は、同じ剤型であっても異なる剤型であってもよい。例えば、双方が経口製剤、非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって互いに異なる剤型であってもよく、双方が経口製剤、非経口製剤、注射剤、点滴剤、静脈内点滴剤のうちの一つであって同種の剤型であってもよい。また、上記の医薬組成物には、 さらに異なる一種以上の製剤を組み合わせてもよい。
【0055】
本発明の医薬組成物は、バルク液体溶液若しくは懸濁液などの液体組成物、又は、バルク粉末、錠剤などの固形組成物の形態をとることができる。例えば、液体組成物の予め充填・測定したアンプル又は注射器、或いは固体組成物の場合には丸薬、錠剤、カプセルなどとする。これら製剤における有効成分量は腫瘍の治療及び／又は予防効果が得られるように設定される。
【0056】
上記液体組成物としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムが例示され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０と適宜併用され得る。油性液としてはゴマ油、大豆油が例示され、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と好適に配合され得る。
【0057】
また、上記固形組成物としては、結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガカント・ガム又はゼラチン；賦形剤、例えばデンプン又はラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、又はトウモロコシデンプン；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；流動促進剤、例えばコロイド二酸化シリコン；甘味剤、例えばショ糖又はサッカリン；又は、香料、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香味料などの、任意の成分、又は類似の性質の化合物を含むことができる。
【0058】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内及び鼻腔内を含む様々な経路により、経口投与もしくは非経口投与することができる。非経口投与の場合には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが例示される。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の治療用抗体が全身または局部的に投与され得る。また、投与方法及び投与用量は、患者の年齢、症状により適宜選択され得る。
【0059】
以下、本発明を実施例の記載によって具体的に説明するが、本発明は当該記載によって限定して解釈されるものではない。
【実施例】
【0060】
腫瘍治療及び予防における、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とアントラサイクリン系抗癌剤との併用による顕著な治療・予防効果を明らかにした。本実施例においては、本発明が治療対象とする腫瘍の例として、ヒト肺扁平上皮癌細胞を用い、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の例としてＯＢＰ－８０１、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と併用するアントラサイクリン系抗癌剤の例として、アムルビシン塩酸塩を用いた。
【0061】
＜材料と方法＞
〔１．細胞培養〕
ヒト肺扁平上皮癌細胞株のＣａｌｕ－１細胞とヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞は、１０％ＦＢＳと４ｍＭグルタミンを添加したＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。ヒト肺扁平上皮癌細胞株のＨ５２０細胞は、１０％ＦＢＳと２ｍＭグルタミンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
〔１．細胞培養〕
ヒト肺扁平上皮癌細胞株のＣａｌｕ－１細胞とヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９細胞は、１０％ＦＢＳと４ｍＭグルタミンを添加したＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。ヒト肺扁平上皮癌細胞株のＨ５２０細胞は、１０％ＦＢＳと２ｍＭグルタミンを添加したＲＰＭＩ １６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
【0062】
〔２．試薬〕
ＯＢＰ－８０１は、オンコリスバイオファーマ株式会社（東京、日本）から供給された。アムルビシン塩酸塩は、ＡｐｅｘＢｉｏ（台湾）より購入した。Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）は、ナカライテスク（日本）から購入した。パンカスパーゼインヒビター ｚＶＡＤ－ｆｍｋは、Ｒ＆Ｄ システムズ（ミネアポリス，ミネソタ州，米国）から購入した。ｓｅｌｏｎｓｅｒｔｉｂ、ＳＢ２０３５８０、ＳＰ２６００１２５は、セレック ケミカルズ（ヒューストン，テキサス州，米国）より購入した。ｓｉＴｒｘ２は、サーモンフィッシャーサイエンティフィック（ウォルサム，マサチューセッツ州，米国）より購入した。
ＯＢＰ－８０１は、オンコリスバイオファーマ株式会社（東京、日本）から供給された。アムルビシン塩酸塩は、ＡｐｅｘＢｉｏ（台湾）より購入した。Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）は、ナカライテスク（日本）から購入した。パンカスパーゼインヒビター ｚＶＡＤ－ｆｍｋは、Ｒ＆Ｄ システムズ（ミネアポリス，ミネソタ州，米国）から購入した。ｓｅｌｏｎｓｅｒｔｉｂ、ＳＢ２０３５８０、ＳＰ２６００１２５は、セレック ケミカルズ（ヒューストン，テキサス州，米国）より購入した。ｓｉＴｒｘ２は、サーモンフィッシャーサイエンティフィック（ウォルサム，マサチューセッツ州，米国）より購入した。
【0063】
〔３．細胞生存率試験〕
細胞生存率は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（株式会社同仁化学研究所、日本）を用い、マルチウェルスペクトロフォトメーター Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ（サーモンフィッシャーサイエンティフィック（ウォルサム，マサチューセッツ州，米国）で波長４５０ｎｍにて測定し、決定した。
細胞生存率は、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（株式会社同仁化学研究所、日本）を用い、マルチウェルスペクトロフォトメーター Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＦＣ（サーモンフィッシャーサイエンティフィック（ウォルサム，マサチューセッツ州，米国）で波長４５０ｎｍにて測定し、決定した。
【0064】
〔４．アポトーシスの解析〕
細胞を、各濃度で、ＯＢＰ－８０１を添加又は非添加、及び／又はアムルビシン塩酸塩を添加し、７２時間処理したのち、細胞を回収した。細胞は、０．１％トライトン－Ｘ１００で透過処理された後、核をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）にて染色した。ＤＮＡ量はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメーター（ベクトン－ディッキンソン，フランクリン レイクス，ニュージャージー州，米国）にて測定され、Ｃｅｌｌ ＱｕｅｓｔＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（ベクトン－ディッキンソン）により解析された。
細胞を、各濃度で、ＯＢＰ－８０１を添加又は非添加、及び／又はアムルビシン塩酸塩を添加し、７２時間処理したのち、細胞を回収した。細胞は、０．１％トライトン－Ｘ１００で透過処理された後、核をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）にて染色した。ＤＮＡ量はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭフローサイトメーター（ベクトン－ディッキンソン，フランクリン レイクス，ニュージャージー州，米国）にて測定され、Ｃｅｌｌ ＱｕｅｓｔＴＭ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（ベクトン－ディッキンソン）により解析された。
【0065】
〔５．併用係数〕
併用係数（ＣＩ）は、ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙによる方法に基づき、ＣａｌｃｕＳｙｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｓｏｆｔ，英国）を用いて算出した。ＣＩ＜１の場合は相乗効果、すなわち、予想される相加効果よりも大きいと判断される。ＣＩ＝１の場合は相加効果、また、ＣＩ＞１の場合は拮抗効果と判断される。
併用係数（ＣＩ）は、ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙによる方法に基づき、ＣａｌｃｕＳｙｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏｓｏｆｔ，英国）を用いて算出した。ＣＩ＜１の場合は相乗効果、すなわち、予想される相加効果よりも大きいと判断される。ＣＩ＝１の場合は相加効果、また、ＣＩ＞１の場合は拮抗効果と判断される。
【0066】
〔６．異種移植モデルにおける抗腫瘍活性評価 〕
メスＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（５週齢）をチャールス・リバー・ラボラトリー（ウィルミントン，マサチューセッツ州，米国）より購入した。Ｈ５２０細胞（４ｘ１０６個）は、マウス背部に皮下注射により移植した。腫瘍体積は、１／２ｘ（長さ）ｘ（幅）２の計算式により算出した。平均腫瘍体積が４０ｍｍ３に到達した時（第１３日目に）、マウスを無作為に４つの群（５匹／群）に分け、処置を続けた。マウスには、週１回（第１５，２２，２９及び３６日目に）、希釈液のみ（コントロールグループ）又はＯＢＰ－８０１（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。また、希釈液のみ（コントロールグループ）又はアムルビシン塩酸塩（ＡＭＲ）（２５ｍｇ／ｋｇ）を、一回のみ（第１４日目に）投与した。ＯＢＰ－８０１は、２０％ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン／生理食塩水に溶解し、尾静脈に注射した。アムルビシン塩酸塩は生理食塩水に溶解し、尾静脈に注射した。マウス体重及び腫瘍体積は、第１３，１８，２２，２６，３０，３３，３７及び４０日目に計測した。全ての実験及び術式は、研究施設内委員会が定めた指針に基づき実施された。
メスＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（５週齢）をチャールス・リバー・ラボラトリー（ウィルミントン，マサチューセッツ州，米国）より購入した。Ｈ５２０細胞（４ｘ１０６個）は、マウス背部に皮下注射により移植した。腫瘍体積は、１／２ｘ（長さ）ｘ（幅）２の計算式により算出した。平均腫瘍体積が４０ｍｍ３に到達した時（第１３日目に）、マウスを無作為に４つの群（５匹／群）に分け、処置を続けた。マウスには、週１回（第１５，２２，２９及び３６日目に）、希釈液のみ（コントロールグループ）又はＯＢＰ－８０１（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。また、希釈液のみ（コントロールグループ）又はアムルビシン塩酸塩（ＡＭＲ）（２５ｍｇ／ｋｇ）を、一回のみ（第１４日目に）投与した。ＯＢＰ－８０１は、２０％ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン／生理食塩水に溶解し、尾静脈に注射した。アムルビシン塩酸塩は生理食塩水に溶解し、尾静脈に注射した。マウス体重及び腫瘍体積は、第１３，１８，２２，２６，３０，３３，３７及び４０日目に計測した。全ての実験及び術式は、研究施設内委員会が定めた指針に基づき実施された。
【0067】
〔７．ウェスタンブロット解析〕
細胞を溶解液（５０ｍＭ トリス－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ＮＰ－４０，０．５％ デオキシコール酸，０．１％ ＳＤＳ，１ｍＭ ジチオスレイトール，及び０．５ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオライド）にて溶解した。タンパク抽出液をポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動処理し、ニトロセルロース膜に転写した。ブロットは、ブロッキング液（５％スキムミルク／ＴＢＳ―Ｔ）にて室温１時間ブロッキング処理し、適切な一次抗体で室温１時間インキュベートする。シグナルは、Ｃｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ Ｌ（ナカライテスク、日本）又はＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ミリポア，ビレリカ，マサチューセッツ州，米国）を用いて検出した。
抗体は、ウサギポリクローナル抗体である、抗Ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ抗体（＃５６２５，セルシグナリングテクノロジー，ダンバース，マサチューセッツ州，米国）、抗ＴＸＮＩＰ抗体（ａｂ１８８８６５，アブカム，ケンブリッジ，英国）、抗ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ２抗体（ｓｃ－１３３２０１，サンタクルーズ バイオテクノロジー，ダラス，テキサス州，米国）、及び抗β－アクチン抗体（シグマ，セントルイス，ミズーリ州，米国）を用いた。
細胞を溶解液（５０ｍＭ トリス－ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１％ ＮＰ－４０，０．５％ デオキシコール酸，０．１％ ＳＤＳ，１ｍＭ ジチオスレイトール，及び０．５ｍＭ フェニルメチルスルフォニルフルオライド）にて溶解した。タンパク抽出液をポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動処理し、ニトロセルロース膜に転写した。ブロットは、ブロッキング液（５％スキムミルク／ＴＢＳ―Ｔ）にて室温１時間ブロッキング処理し、適切な一次抗体で室温１時間インキュベートする。シグナルは、Ｃｈｅｍｉ－Ｌｕｍｉ Ｏｎｅ Ｌ（ナカライテスク、日本）又はＩｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｗｅｓｔｅｒｎ（ミリポア，ビレリカ，マサチューセッツ州，米国）を用いて検出した。
抗体は、ウサギポリクローナル抗体である、抗Ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ抗体（＃５６２５，セルシグナリングテクノロジー，ダンバース，マサチューセッツ州，米国）、抗ＴＸＮＩＰ抗体（ａｂ１８８８６５，アブカム，ケンブリッジ，英国）、抗ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ２抗体（ｓｃ－１３３２０１，サンタクルーズ バイオテクノロジー，ダラス，テキサス州，米国）、及び抗β－アクチン抗体（シグマ，セントルイス，ミズーリ州，米国）を用いた。
【0068】
〔８．低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡトランスフェクション〕
Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ２のノックダウンは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン）を用いた低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の遺伝子導入により行った。
Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ２のノックダウンは、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭＲＮＡｉＭＡＸ（インビトロジェン）を用いた低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の遺伝子導入により行った。
【0069】
＜結果＞
〔試験例１：ＯＢＰ－８０１及び／またはアムルビシンのヒト肺扁平上皮癌細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用〕
〔試験例１：ＯＢＰ－８０１及び／またはアムルビシンのヒト肺扁平上皮癌細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用〕
【0070】
ＯＢＰ－８０１又はアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩が腫瘍細胞の増殖に与える影響を、ヒト肺扁平上皮癌細胞株であるＣａｌｕ－１細胞を用いて検討した。
【0071】
ＯＢＰ－８０１は、ヒト肺扁平上皮癌細胞に対する濃度依存的な細胞増殖抑制作用を示し、５０％阻害効果を示す濃度は約２．７５ｎＭであった（図１Ａ）。また、アムルビシン塩酸塩は、ヒト肺扁平上皮癌細胞に対する濃度依存的な細胞増殖抑制作用を示し、６０％阻害効果を示す濃度は約２μＭであった（図１Ｂ）。
【0072】
〔実施例２：アントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩をＯＢＰ－８０１と併用処理することによる、ヒト肺扁平上皮癌細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制作用の相乗的増強〕
【0073】
ＯＢＰ－８０１及びアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩との併用処理が腫瘍組織中の腫瘍細胞に与える増殖阻害効果を、ヒト肺扁平上皮癌細胞株のＣａｌｕ－１細胞、Ｈ５２０細胞、並びに、ヒト肺腺癌細胞株のＡ５４９細胞を用いて検討した。
【0074】
Ｃａｌｕ－１細胞に対しては、ＯＢＰ－８０１を２．７５ｎＭの濃度で単剤処理またはアムルビシン塩酸塩を２．５μＭの濃度で単剤処理しても、約５０～６０％ほどの阻害効果しか示さないが、ＯＢＰ－８０１を２．７５ｎＭ、アムルビシン塩酸塩を２．５μＭの濃度で併用処理すると、約９５％程度の顕著な細胞増殖抑制作用を示すことが確認された（図１Ｃ）。この併用処理における併用係数は、相乗的な細胞増殖抑制作用であることを示す１．０未満であることが判明した（図１Ｆ）。
【0075】
Ｈ５２０細胞に対しては、ＯＢＰ－８０１を４．５ｎＭの濃度で単剤処理またはアムルビシン塩酸塩を４μＭの濃度で単剤処理しても５０％ほどの阻害効果しか示さないが、ＯＢＰ－８０１を４．５ｎＭ、アムルビシン塩酸塩を４μＭの濃度で併用処理すると、約８５％程度の顕著な細胞増殖抑制作用を示すことが確認された（図１Ｄ）。
【0076】
Ａ５４９細胞に対しては、ＯＢＰ－８０１を２．５ｎＭの濃度で単剤処理またはアムルビシン塩酸塩を４００ｎＭの濃度で単剤処理しても約５０～７０％ほどの阻害効果しか示さないが、ＯＢＰ－８０１を２．５ｎＭ、アムルビシン塩酸塩を４００ｎＭの濃度で併用処理すると、約９０％程度の顕著な細胞増殖抑制作用を示すことが確認された（図１Ｄ）。
【0077】
これらの結果から、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩とを癌細胞に対して併用処理することで、癌細胞の増殖が相乗的に抑制されることが明らかとなった。
【0078】
〔実施例３：ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩との併用処理による、腫瘍細胞の相乗的アポトーシス誘導効果〕
【0079】
ＯＢＰ－８０１及びアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩が、腫瘍細胞に如何なる影響を与えるものであるのか、Ｃａｌｕ－１細胞を用いて検討した。その結果、興味深いことに、Ｃａｌｕ－１細胞に対してＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩を７２時間併用処理すると、Ｃａｌｕ－１細胞に顕著なアポトーシス誘導が生じることを見出した（図２Ａ）。
【0080】
これらの結果から、癌細胞の増殖が相乗的に抑制されるＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩との併用処理では、顕著なアポトーシス誘導効果が得られるものであることが、明らかとなった。
〔実施例４：ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩との併用による、カスパーゼ及び細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）依存性アポトーシスの誘導〕
〔実施例４：ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩との併用による、カスパーゼ及び細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）依存性アポトーシスの誘導〕
【0081】
ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩との併用による腫瘍細胞に生じるアポトーシスが、カスパーゼ依存性であるか検討するため、Ｃａｌｕ－１細胞、Ｈ５２０細胞、Ａ５４９細胞を用い、カスパーゼ阻害剤を利用して解析した。
【0082】
その結果、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩の併用により誘導されたアポトーシスは、汎カスパーゼ阻害剤であるｚＶＡＤ－ｆｍｋによって抑制された（図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ）。
【0083】
これらの結果から、腫瘍に対するＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩との併用においては、カスパーゼ依存アポトーシスが誘発されていることが示唆される。
【0084】
さらに、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩の併用により誘導されたアポトーシス誘導効果は、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）によっても抑制された（図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ）。
【0085】
これらの結果から、腫瘍に対するＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩との併用においてＲＯＳ依存性のアポトーシスが生じていることが理解される。
【0086】
〔実施例５：ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩の併用による、Ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰの増加〕
【0087】
ＰＡＲＰはアポトーシスの初期にカスパーゼによって切断されることから、アポトーシス誘導後にＣｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰが増加する。そこで、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩の併用によりＣｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰが増加するか確認し、アポトーシスの誘導が生じているか検討した。
【0088】
その結果、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩の併用により、Ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰが増加していることが確認された（図２Ｅ）。
【0089】
〔実施例６：ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩の併用による腫瘍細胞の相乗的アポトーシス誘導へのアポトーシス・シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）、ｐ３８ＭＡＰＫ、ＪＮＫの寄与〕
【0090】
ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩へアポトーシス誘導効果に対するアポトーシス・シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）、ｐ３８ＭＡＰＫ及びＪＮＫの寄与の程度を、Ｃａｌｕ－１細胞を用いて検討した。
【0091】
アポトーシス・シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）の寄与の程度の検討には、アポトーシス・シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）阻害薬のＳｅｌｏｎｓｅｒｔｉｂ（ＧＳ－４９９７）を用いた。ｐ３８ＭＡＰＫの寄与の程度の検討には、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤のＳＢ２０３５８０を用いた。ＪＮＫの寄与の程度の検討には、ＪＮＫ阻害剤のＳＰ２６００１２５を用いた。
【0092】
Ｃａｌｕ－１細胞に対してＯＢＰ－８０１を２．７５ｎＭとアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩を２μＭとで７２時間併用処理すると、Ｃａｌｕ－１細胞に顕著なアポトーシス誘導が生じるが、ＡＳＫ１阻害薬のＳｅｌｏｎｓｅｒｔｉｂを同時に処理すると、誘導されるアポトーシスの程度が部分的に減少した（図３Ａ）。他方、ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤のＳＢ２０３５８０またはＪＮＫの寄与の程度の検討には、ＪＮＫ阻害剤のＳＰ２６００１２５を同時に処理しても、誘導されるアポトーシスの程度には変化が生じなかった（図３Ｂ及び図３Ｃ）。
【0093】
これらの結果から、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩の併用による腫瘍細胞の相乗的アポトーシス誘導には、アポトーシス・シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）の経路が関与していることが明らかとなった。
【0094】
〔実施例７：ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩の併用による腫瘍細胞のアポトーシス誘導へのＴＸＮＩＰ（ＴｈｉｏｒｅｄｏＸｉＮ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）と活性酸素種（ＲＯＳ）の寄与〕
【0095】
チオレドキシン2(Ｔｒｘ2)は、アポトーシス・シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）に結合し阻害していることが知られている。Ｔｒｘ２は、活性酸素種（ＲＯＳ）やＴＸＮＩＰ（ＴｈｉｏｒｅｄｏＸｉＮ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）によって酸化されると、ＡＳＫ１から解離し、その結果ＡＳＫ１が活性化されアポトーシスが誘導される。そこで、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩の併用の、腫瘍細胞に対するアポトーシス誘導に関与することが明らかとなったアポトーシス・シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）の活性化機序を解析した。
【0096】
Ｃａｌｕ－１細胞に対してＯＢＰ－８０１を２．７５ｎＭとアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩を２μＭとで７２時間併用処理した。すると、ＯＢＰ－８０１単剤と併用処理において、顕著にＴＸＮＩＰの発現が上昇することが明らかになった（図４Ａ）。また、Ｃａｌｕ－１細胞に対してＯＢＰ－８０１を２．７５ｎＭとアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩を２μＭとで４８時間併用処理したところ、アムルビシン塩酸塩単独と併用処理において、ＲＯＳが上昇することが明らかになった（図４Ｂ）。
【0097】
〔実施例８：ヒト肺扁平上皮癌細胞におけるチオレドキシン２（Ｔｒｘ２）とアポトーシスの関係〕
【0098】
アポトーシス・シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）に結合し阻害しているチオレドキシン２（Ｔｒｘ２）の、ヒト肺扁平上皮癌細胞における役割をｓｉＲＮＡを用いた発現抑制を行うことで解析した。
【0099】
Ｃａｌｕ－１細胞にチオレドキシン２（Ｔｒｘ２）特異的に設計されたｓｉＲＮＡ（ｓｉＴｒｘ２ ＃１，＃２，＃３）を導入することで、導入後４８時間後のウエスタンブロット解析により、Ｔｒｘ２の発現抑制が確認された（図５Ａ）。さらに、これらのｓｉＲＮＡを導入後１２０時間において、アポトーシスが誘導されることを見出した（図５Ｂ）。よって、Ｃａｌｕ－１細胞において、Ｔｒｘ２が機能阻害されると、アポトーシスが誘導されることが明らかになった。
【0100】
〔実施例９：ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩の併用投与による、マウスにおける腫瘍増殖抑制効果並びに腫瘍体積の縮小効果〕
【0101】
分子標的薬であるＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩とをｉｎ ｖｉｖｏにおいて併用投与することで、宿主動物体内の腫瘍細胞及び腫瘍組織の増殖を妨げることが可能となるか否か検討した。腫瘍細胞としてヒト肺扁平上皮癌細胞株のＨ５２０細胞を用い、それをヌードマウスの皮下に移植して腫瘍を担持させ、異種移植モデルを得た。そして、それらをコントロール群、ＯＢＰ－８０１単剤投与群、アントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩単剤投与群、及び、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩との併用群に分け、各試薬を投与した。
【0102】
その結果、腫瘍体積は、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩との併用投与処理群において、顕著に抑制された（図６Ａ）。また、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤であるアムルビシン塩酸塩とを長期併用投与しても、動物の体重に影響は出ないものであることが確認された（図６Ｂ）。
【0103】
これらの結果から、腫瘍の治療・予防においては、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤とを併用投与することが、腫瘍増殖を顕著に減少に転じさせることができる点において、大変有効であるとともに、長期投与時にも体重減少などの副作用が生じない効果を奏するものであり、腫瘍治療に適することを示している。
【0104】
〔実施例１０：アムルビシンとの併用により、ＯＢＰ－８０１は、ＳＡＨＡと比べ、より強い細胞増殖抑制効果を示した。〕
【0105】
ＳＡＨＡは、臨床的に最も用いられているＨＤＡＣ阻害剤である。アムルビシンとの併用における、ＯＢＰ－８０１とＳＡＨＡの腫瘍細胞の増殖に与える影響を検討した。腫瘍細胞としては、Ｃａｌｕ－１細胞を用いた。ＨＤＡＣ阻害剤としては、ＯＢＰ－８０１又はＳＡＨＡを用いた。図７Ａ及び図７Ｂに示すように、Ｃａｌｕ－１細胞へのＯＢＰ－８０１又はＳＡＨＡ単剤処理では、ほぼ同程度に腫瘍細胞の増殖抑制効果を示したが、ＯＢＰ－８０１とアムルビシンとの併用処理では、ＳＡＨＡとアムルビシンとの併用処理に比べ、より効果的に腫瘍細胞の増殖抑制効果を示した。これらの結果は、ＯＢＰ－８０１がアムルビシンとの併用において、ＳＡＨＡよりも強い作用を示し、より腫瘍治療に適していることを示している。
【0106】
以上の試験例、実施例の結果から、ＯＢＰ－８０１やアムルビシンの各単剤では治療し得ない肺扁平上皮癌などを含む肺癌のような難治性の癌に対しても、ＯＢＰ－８０１とアントラサイクリン系抗癌剤、好適には、ＯＢＰ－８０１とアムルビシンという薬剤標的分子が異なる医薬を併用することで、相乗的な、カスパーゼ経路の活性化、ＴＸＮＩＰ及びチオレドキシン２の発現及び活性制御によるミトコンドリア・アポトーシス経路活性化による強いアポトーシス誘導効果が期待できるものとなることが明らかとなった（図８）。
【産業上の利用可能性】
【0107】
本発明の、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アントラサイクリン系抗癌剤とを有効成分として併用する医薬組成物を用いることで、相乗的な腫瘍細胞及び腫瘍組織に対するアポトーシス誘導並びに腫瘍増殖阻害効果が得られ、有効成分に起因した副作用を回避した、腫瘍治療及び予防が可能になった。更に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と、アントラサイクリン系抗癌剤という異なる作用機序の医薬を組み合わせたことで、単剤の処方では得ることができない、相乗的な、カスパーゼ経路の活性化とＴＸＮＩＰ及びチオレドキシン２の発現及び活性制御によるミトコンドリア・アポトーシス経路の活性化という顕著な薬理効果を得ることが可能となり、従来療法の有効性が低い腫瘍を含む幅広い腫瘍に適用できる有効な治療薬及び予防薬として、臨床的に有効な新たな腫瘍の治療・予防戦略を提供することが可能になった。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】