特許7359695多発性硬化症に関連する自己抗原並びに治療及び診断でのその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-02
(45)【発行日】2023-10-11
(54)【発明の名称】多発性硬化症に関連する自己抗原並びに治療及び診断でのその使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20231003BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231003BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20231003BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20231003BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20231003BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
G01N33/53 K
G01N33/53 P
G01N33/50 T
C12Q1/02
C07K14/47
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2019552921
(86)(22)【出願日】2018-03-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-05-28
(86)【国際出願番号】 SE2018050341
(87)【国際公開番号】W WO2018182495
(87)【国際公開日】2018-10-04
【審査請求日】2021-03-26
(31)【優先権主張番号】1750372-3
(32)【優先日】2017-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(73)【特許権者】
【識別番号】518207959
【氏名又は名称】ネオギャップ・セラピューテックス・アーベー
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】グレンルンド、ハンス
(72)【発明者】
【氏名】ブロンゲ、マティアス
【審査官】春田 由香
(56)【参考文献】
【文献】D'Ambrosio, A. et al.，Peripheral blood biomarkers in multiple sclerosis，Autoimmunity Reviews，2015年，Vol.14, No.12，p.1097-1110，doi:10.1016/j.autrev.2015.07.014
【文献】Kipp, M. et al.，Brain lipid binding protein (FABP7) as modulator of astrocyte function，Physiological Research，2011年，Vol.60, Suppl.1，S49-S60，doi:10.33549/physiolres.932168
【文献】Chiurchiu, V. et al.，The role of reticulons in neurodegenerative diseases，Neuromolecular Medicine，2014年，Vol.16, No.1，p.3-15，doi:10.1007/s12017-013-8271-9
【文献】Gao, Y. F. et al.，COL3A1 and SNAP91: novel glioblastoma markers with diagnostic and prognostic value，Oncotarget，2016年，Vol.7, No.43，p.70494-70503，doi:10.18632/oncotarget.12038
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ｇ０１Ｎ ３３／００－３３／９８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－ １／７０
ＰｕｂＭｅｄ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者の多発性硬化症（ＭＳ）関連自己免疫の程度を決定することを補助する方法であって、該方法は、
ａ．Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原に対する、被験者の生存可能なＴ細胞および抗原提示細胞を含む試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化をインビトロで定量すること、
ここで、前記試験抗原は、
配列番号２、配列番号１、配列番号３若しくは配列番号４のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができる、並びに、
ｂ．工程ａにおいて定量された試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化と、関連する参照とを比較して、被験者のＭＳ関連自己免疫の程度を決定することを補助すること、
ここで、関連する参照は、
（ｉ）病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象から得られた参照試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化である、
（ｉｉ）病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象のセットから得られた参照試料のセットの比較可能に定量された抗原特異的活性化の平均値である、または
（ｉｉｉ）異なる時点に採取された、同じ対象からの試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化である、
を含み、
前記工程ａは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７若しくはＩＬ－２２の分泌を測定すること又はＴ細胞増殖を測定することにより、Ｔ細胞応答を決定することを含む、
上記方法。
【請求項2】
被験者の多発性硬化症（ＭＳ）関連自己免疫の程度を決定することを補助する方法であって、該方法は、
ａ．Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原に対する、被験者の生存可能なＴ細胞および抗原提示細胞を含む試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化をインビトロで定量すること、
ここで、Ｔ細胞エピトープは、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含み、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列が、
ｉ．配列番号２の残基４３～６７の部分配列と同一であるか、若しくは
ｉｉ．配列番号２の残基４３～６７の部分配列に由来し、該配列番号２の残基４３～６７の部分配列と比較してｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入を有し、
ｎが少なくとも８であり、ｍが１であり、前記試験抗原はＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができ、並びに、
ｂ．工程ａにおいて定量された試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化と、関連する参照とを比較して、被験者のＭＳ関連自己免疫の程度を決定することを補助すること、
ここで、関連する参照は、
（ｉ）病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象から得られた参照試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化である、
（ｉｉ）病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象のセットから得られた参照試料のセットの比較可能に定量された抗原特異的活性化の平均値である、または
（ｉｉｉ）異なる時点に採取された、同じ対象からの試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化である、
を含み、
前記工程ａは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７若しくはＩＬ－２２の分泌を測定すること又はＴ細胞増殖を測定することにより、Ｔ細胞応答を決定することを含む、
上記方法。
【請求項3】
ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列が、
ｉ．配列番号２の残基４３～６２の部分配列と同一であるか、若しくは
ｉｉ．配列番号２の残基４３～６２の部分配列に由来し、該配列番号２の残基４３～６２の部分配列と比較してｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入を有し、
ｎが少なくとも８であり、ｍが１である、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
被験者の多発性硬化症（ＭＳ）関連自己免疫の程度を決定することを補助する方法であって、該方法は、
ａ．Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原に対する、被験者の生存可能なＴ細胞および抗原提示細胞を含む試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化をインビトロで定量すること、
ここで、Ｔ細胞エピトープは、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含み、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列が、
ｉ．配列番号１の残基１１１～１４５の部分配列と同一であるか、若しくは
ｉｉ．配列番号１の残基１１１～１４５の部分配列に由来し、該配列番号１の残基１１１～１４５の部分配列と比較してｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入を有し、
ｎが少なくとも８であり、ｍが１であり、前記試験抗原はＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができ、並びに、
ｂ．工程ａにおいて定量された試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化と、関連する参照とを比較して、被験者のＭＳ関連自己免疫の程度を決定することを補助すること、
ここで、関連する参照は、
（ｉ）病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象から得られた参照試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化である、
（ｉｉ）病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象のセットから得られた参照試料のセットの比較可能に定量された抗原特異的活性化の平均値である、または
（ｉｉｉ）異なる時点に採取された、同じ対象からの試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化である、
を含み、
前記工程ａは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７若しくはＩＬ－２２の分泌を測定すること又はＴ細胞増殖を測定することにより、Ｔ細胞応答を決定することを含む、
上記方法。
【請求項5】
抗原特異的活性化が、配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができる試験抗原、配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができる試験抗原、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができる試験抗原、及び配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができる試験抗原からなる群から選択される２つ、３つ又は４つの試験抗原に対して定量される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
抗原特異的活性化が、各々が請求項２～４のいずれかに記載の基準を満たす２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の異なるＴ細胞エピトープに対して定量される、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ｎが少なくとも１１である、請求項２～４及び６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原が、配列番号２、配列番号１、配列番号３、又は配列番号４のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができるペプチド又はペプチド模倣体である、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原が、配列番号２、配列番号１、配列番号３、又は配列番号４のいずれかと同一のアミノ酸配列を含むペプチド又はペプチド模倣体である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原が、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができるペプチドまたはペプチド模倣体である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項11】
Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原が、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができるペプチドまたはペプチド模倣体である、請求項４に記載の方法。
【請求項12】
試験試料がＰＢＭＣ試料である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法であって、工程ａが、
ａ－Ｉ．試験抗原と試験試料中の抗原提示細胞とを接触させることと、
ａ－ＩＩ．抗原提示細胞によって提示された抗原に応答してＴ細胞の抗原特異的活性化が可能になる条件下で、試験試料中の生存可能なＴ細胞と、試験抗原と接触させた抗原提示細胞とをインビトロで接触させることとをさらに含む、上記方法。
【請求項14】
方法が、貪食可能な粒子に緊密に会合した試験抗原を提供することを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
工程ａが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７またはＩＬ－２２の分泌を測定することによりＴ細胞応答を決定することを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
請求項１～１２、１４及び１５のいずれか一項に記載の方法であって、工程ａが、
ａ－ＩＩＩ．緊密に会合した試験抗原を有する貪食可能な粒子を提供する工程と、ここで、会合した試験抗原を有する粒子を変性洗浄に供し、後続の工程を妨害しないほどエンドトキシンのレベルを十分に低くし、
ａ－ＩＶ．抗原提示細胞による粒子の貪食を可能にする条件下で、洗浄された粒子と試験試料中の抗原提示細胞とを接触させる工程と、
ａ－Ｖ．抗原提示細胞によって提示された抗原に応答してＴ細胞の抗原特異的活性化が可能になる条件下で、試験試料中の生存可能なＴ細胞と、粒子と接触させた抗原提示細胞とをインビトロで接触させる工程とを含む、上記方法。
【請求項17】
（ｉ）試験試料の定量された抗原特異的活性化が、参照の少なくとも２倍、３倍、５倍、若しくは１０倍である場合、（ｉｉ）試験試料の定量された抗原特異的活性化が、病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象のセットから得られた比較可能に定量された参照試料のセットの平均よりも、参照試料のセットの標準偏差の２倍だけ高い場合、
（ｉｉｉ）試験試料の定量された抗原特異的活性化が、スチューデントのＴ検定によって計算された０．０５未満のｐ値を伴って参照よりも統計的に有意に高い場合、又は
（ｉｖ）試験試料の定量された抗原特異的活性化が、マン・ホイットニーのＵ検定によって計算された０．０５未満のｐ値を伴って参照よりも統計的に有意に高い場合、
ＭＳ関連自己免疫の程度の増加が結論付けられる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
多発性硬化症（ＭＳ）の診断における非ｉｎ ｖｉｖｏ使用のための、ペプチド又はペプチド模倣体を含む医薬組成物であって、ペプチド又はペプチド模倣体が、配列番号２、配列番号１、配列番号３若しくは配列番号４のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができる、上記医薬組成物。
【請求項19】
多発性硬化症（ＭＳ）の診断における非ｉｎ ｖｉｖｏ使用のための、ペプチド又はペプチド模倣体を含む医薬組成物であって、ペプチド又はペプチド模倣体が、ＭＳ抗原に対応する特異的Ｔ細胞エピトープを含み、かつＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができ、Ｔ細胞エピトープは、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含み、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列が、ｉ．配列番号２の残基４３～６７の部分配列と同一であるか、若しくは
ｉｉ．配列番号２の残基４３～６７の部分配列に由来し、該配列番号２の残基４３～６７の部分配列と比較してｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入を有し、
ｎが少なくとも８であり、ｍが１である、上記医薬組成物。
【請求項20】
多発性硬化症（ＭＳ）の診断における非ｉｎ ｖｉｖｏ使用のための、ペプチド又はペプチド模倣体を含む医薬組成物であって、ペプチド又はペプチド模倣体が、ＭＳ抗原に対応する特異的Ｔ細胞エピトープを含み、かつＭＳ患者のＴ細胞を抗原特異的に活性化することができ、Ｔ細胞エピトープは、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含み、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列が、ｉ．配列番号１の残基１１１～１４５の部分配列と同一であるか、若しくは
ｉｉ．配列番号１の残基１１１～１４５の部分配列に由来し、該配列番号１の残基１１１～１４５の部分配列と比較してｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入を有し、
ｎが少なくとも８であり、ｍが１である、上記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多発性硬化症の治療及び診断に関する。
【背景技術】
【0002】
多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ、ＩＣＤ１０コードＧ３５）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の免疫介在性の慢性疾患である。現在の範例では、多発性硬化症は、脱髄及び軸索破壊をもたらす自己免疫性炎症性疾患であると提案されている。２０歳～４０歳の若年成人が主に罹患し、世界中で合計２５０万人が罹患しており、ＭＳは先進国の若者では障害の主要な原因の１つであり、集団内の相当な罹患率の原因であるとともに、その必要なケアのため社会に大きな負担をかける原因となっている。
多発性硬化症（ＭＳ、ＩＣＤ１０コードＧ３５）は、中枢神経系（ＣＮＳ）の免疫介在性の慢性疾患である。現在の範例では、多発性硬化症は、脱髄及び軸索破壊をもたらす自己免疫性炎症性疾患であると提案されている。２０歳～４０歳の若年成人が主に罹患し、世界中で合計２５０万人が罹患しており、ＭＳは先進国の若者では障害の主要な原因の１つであり、集団内の相当な罹患率の原因であるとともに、その必要なケアのため社会に大きな負担をかける原因となっている。
【0003】
ＭＳは、血液脳関門（ＢＢＢ）を介したＣＮＳへの自己反応性Ｔ細胞の浸潤を特徴とし、ＢＢＢでは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって自己反応性Ｔ細胞が活性化されると考えられている。その後、これらの自己反応性Ｔ細胞は、ＭＳの典型的な特徴である神経炎症、脱髄及び軸索破壊を引き起こし、特徴的な病理組織学的特徴であるプラークを形成する。局所破壊は、運動、感覚、視覚及び自律神経系を含む多種多様な病理学的臨床症状をもたらす。炎症は通常一過性であり、炎症性エピソードの間にいくらかの再ミエリン化が起こり、増加した神経機能障害の明確な発作（再燃と呼ばれる）を来たし、これに部分回復のエピソードが続く。しかし、時間が経つにつれて、回復が乏しくなり、持続する症状が度重なる。
【0004】
ＭＳのＴ細胞及び自己抗原
ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＭＳ
ＣＤ４＋Ｔ細胞の主な生理学的役割は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介してＡＰＣによって提示される外来抗原を認識し、その後サイトカインを活性化及び放出して免疫応答を調節することである。各ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは、特異的な抗原に感受性である特異的な細胞表面発現Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。Ｔヘルパー細胞と呼ばれることが多いＣＤ４＋Ｔ細胞は、機能とそれらが産生するサイトカインとに基づいて、さらにサブセットに分けることができる。簡単に言うと、タイプ１ヘルパー（Ｔｈ１）Ｔ細胞の主な機能は、細胞内病原体に対する免疫応答を調整することであり、Ｔｈ２細胞の主な機能は、寄生虫感染及び細胞外病原体に対する免疫応答を調整することであり、Ｔｈ１７の主な機能は、真菌及び細菌感染に対する免疫応答を調整することである。
ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＭＳ
ＣＤ４＋Ｔ細胞の主な生理学的役割は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介してＡＰＣによって提示される外来抗原を認識し、その後サイトカインを活性化及び放出して免疫応答を調節することである。各ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは、特異的な抗原に感受性である特異的な細胞表面発現Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。Ｔヘルパー細胞と呼ばれることが多いＣＤ４＋Ｔ細胞は、機能とそれらが産生するサイトカインとに基づいて、さらにサブセットに分けることができる。簡単に言うと、タイプ１ヘルパー（Ｔｈ１）Ｔ細胞の主な機能は、細胞内病原体に対する免疫応答を調整することであり、Ｔｈ２細胞の主な機能は、寄生虫感染及び細胞外病原体に対する免疫応答を調整することであり、Ｔｈ１７の主な機能は、真菌及び細菌感染に対する免疫応答を調整することである。
【0005】
ＣＤ４＋Ｔ細胞及びそのＴＣＲの目的は、適応免疫応答の一部として、外来病原体に対して特異的であることである。しかし、受容体はコーディング遺伝子のランダムな再配列によって生成されるため、自己構造に特異的なＴＣＲを有するＴ細胞が発生し、自己反応性が生じる可能性がある。健康な個体では自己反応性Ｔ細胞がネガティブ選択を受けて除去されるが、中枢性及び末梢性免疫寛容に欠陥があると、持続性の自己反応性Ｔ細胞を生じさせる可能性がある。そのようなＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＳの病因に中心的な役割を果たすと考えられている。ＭＨＣクラスＩＩをコードする特定の遺伝子がこの疾患と強く関連しているという事実と、ＭＳ病変での多数のＣＤ４＋Ｔ細胞の検出とは、ＡＰＣによる抗原提示とそれに続くＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化が、この疾患に必須の役割を果たすことを示唆している。同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞もＭＳ病変に存在し、この疾患の病態生理に果たすＣＤ８＋Ｔ細胞の正確な役割は不明のままであるが、これらも何らかの役割を果たしている可能性がある。広く使用されているマウスモデル実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）は、ＭＳを模倣し、ミエリン由来ペプチドによりマウスの免疫を介して誘発され、さらに、自己反応性がＭＳに関与していることを示す。ＭＳなどの臓器特異的自己免疫疾患は、一般にＴｈ１介在性であると考えられてきたが、最近の試験では、Ｔｈ１７細胞が自己免疫応答を同様に促進することができることが示されている。
【0006】
Ｔ細胞及びＡＰＣはともに、一般に末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と呼ばれる細胞の画分に存在する。ＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球及び樹状細胞を含む末梢血由来の不均一な細胞群である。
【0007】
Ｔ細胞のサイトカイン
ＡＰＣによる活性化により、ＣＤ４＋Ｔ細胞の様々なサブセットが多種多様な異なるサイトカインを産生する。それらの機能は、他の細胞の増殖及び成熟を誘導すること、又は炎症の全体的な強度及び持続時間を調節することであり得る。
ＡＰＣによる活性化により、ＣＤ４＋Ｔ細胞の様々なサブセットが多種多様な異なるサイトカインを産生する。それらの機能は、他の細胞の増殖及び成熟を誘導すること、又は炎症の全体的な強度及び持続時間を調節することであり得る。
【0008】
インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）は、Ｔｈ１細胞によって高度に発現され、Ｔｈ１細胞の主要産物として作用する多能性の炎症誘発性サイトカインである。ＩＦＮγは、他の細胞の細胞傷害活性を促進し、マクロファージを活性化し、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの発現を調節し、ナイーブＴ細胞がＴｈ１細胞にさらに分化するのに寄与する。特定の状況下でＡＰＣが抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化すると、大量のＩＦＮγが放出されて、Ｔ細胞がＴｈ１に分化するように誘導される。インターロイキン１７Ａ（ＩＬ－１７Ａ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブグループＴｈ１７の主要なサイトカインであり、他の細胞の炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン及びメタロプロテアーゼの産生及び分泌を上方制御する。ＩＬ－１７ＡはＭＳに関与することが示されており、ＥＡＥのマウスモデル並びにＲＡ、乾癬及び炎症性腸疾患などの他の自己免疫疾患患者では上方制御されることがわかっている。インターロイキン２２（ＩＬ－２２）は、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｔｈ１７細胞及び最近特徴付けられたＴｈ２２細胞によって主に発現される活性化Ｔ細胞に見出される。ＩＬ－１７ＡとともにＢＢＢ破壊及びＣＮＳ炎症を促進することがわかっており、ＭＳの病因に重要なサイトカインであると考えられている。
【0009】
ＭＳの自己抗原
ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化されるためには、ＡＰＣによって提示されるその特異的な抗原を認識する必要がある。自己反応性Ｔ細胞の場合、抗原は自己タンパク質、いわゆる自己抗原である。ＭＳのいくつかの異なる自己抗原が提案され、検討されている（Ｅｌｏｎｇ Ｎｇｏｎｏ Ａ，Ｐｅｔｔｒｅ Ｓ，Ｓａｌｏｕ Ｍ，Ｂａｈｂｏｕｈｉ Ｂ，Ｓｏｕｌｉｌｌｏｕ ＪＰ，Ｂｒｏｕａｒｄ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ｍｙｅｌｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ－ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１４４（２）：１１７－２６）。最も検討されているものには、ミエリン、アストロサイト及びニューロン由来の抗原が挙げられるが、他にも示唆されている（Ｒｉｅｄｈａｍｍｅｒ Ｃ，Ｗｅｉｓｓｅｒｔ Ｒ．Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６：３２２）。検討された候補自己抗原の中には、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、ＣＮＰａｓｅ、Ｓ１００β及びトランスアルドラーゼがあり、ＭＢＰが最も徹底的に検討されている。これらの候補に対して、Ｔ細胞の自己反応性又は自己抗体が、いくつかのヒトを対象とした試験及び動物モデルで発見されている。ただし、結果は決定的なものではなく、データは整合性を欠いている。証拠を発見するのが困難であるにもかかわらず、自己抗原と、ＣＤ４＋Ｔ細胞のその活性化とが、ＭＳの病因に重要な役割を果たすとなお考えられている（Ｈｏｈｌｆｅｌｄ Ｒ，Ｄｏｒｎｍａｉｒ Ｋ，Ｍｅｉｎｌ Ｅ，Ｗｅｋｅｒｌｅ Ｈ．Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｐａｒｔ １：ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１５）。
ＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化されるためには、ＡＰＣによって提示されるその特異的な抗原を認識する必要がある。自己反応性Ｔ細胞の場合、抗原は自己タンパク質、いわゆる自己抗原である。ＭＳのいくつかの異なる自己抗原が提案され、検討されている（Ｅｌｏｎｇ Ｎｇｏｎｏ Ａ，Ｐｅｔｔｒｅ Ｓ，Ｓａｌｏｕ Ｍ，Ｂａｈｂｏｕｈｉ Ｂ，Ｓｏｕｌｉｌｌｏｕ ＪＰ，Ｂｒｏｕａｒｄ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ｍｙｅｌｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ－ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１４４（２）：１１７－２６）。最も検討されているものには、ミエリン、アストロサイト及びニューロン由来の抗原が挙げられるが、他にも示唆されている（Ｒｉｅｄｈａｍｍｅｒ Ｃ，Ｗｅｉｓｓｅｒｔ Ｒ．Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ，ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；６：３２２）。検討された候補自己抗原の中には、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリンオリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、ＣＮＰａｓｅ、Ｓ１００β及びトランスアルドラーゼがあり、ＭＢＰが最も徹底的に検討されている。これらの候補に対して、Ｔ細胞の自己反応性又は自己抗体が、いくつかのヒトを対象とした試験及び動物モデルで発見されている。ただし、結果は決定的なものではなく、データは整合性を欠いている。証拠を発見するのが困難であるにもかかわらず、自己抗原と、ＣＤ４＋Ｔ細胞のその活性化とが、ＭＳの病因に重要な役割を果たすとなお考えられている（Ｈｏｈｌｆｅｌｄ Ｒ，Ｄｏｒｎｍａｉｒ Ｋ，Ｍｅｉｎｌ Ｅ，Ｗｅｋｅｒｌｅ Ｈ．Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｐａｒｔ １：ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１５）。
【0010】
Ｔ細胞エピトープ
ある抗原に特異的なＴ細胞は、その抗原のアミノ酸（ａａ）配列全体を認識するのではなく、その抗原のどこかに含まれるはるかに短い特異的Ｔ細胞エピトープを認識する。エピトープは典型的には、ＭＨＣクラスＩ分子において提示される場合は８～１１アミノ酸長であり、ＭＣＨクラスＩＩ分子において提示される場合は１３～１７アミノ酸長である。ＡＰＣが抗原をインターナライズすると、抗原がさらに短いペプチド断片に分解され、これが次いで、ＡＰＣ表面のＭＨＣ分子を介してＴ細胞に提示される。抗原のこれらの消化された断片は、潜在的な特異的Ｔ細胞エピトープである。
ある抗原に特異的なＴ細胞は、その抗原のアミノ酸（ａａ）配列全体を認識するのではなく、その抗原のどこかに含まれるはるかに短い特異的Ｔ細胞エピトープを認識する。エピトープは典型的には、ＭＨＣクラスＩ分子において提示される場合は８～１１アミノ酸長であり、ＭＣＨクラスＩＩ分子において提示される場合は１３～１７アミノ酸長である。ＡＰＣが抗原をインターナライズすると、抗原がさらに短いペプチド断片に分解され、これが次いで、ＡＰＣ表面のＭＨＣ分子を介してＴ細胞に提示される。抗原のこれらの消化された断片は、潜在的な特異的Ｔ細胞エピトープである。
【0011】
抗原特異的免疫療法
抗原特異的免疫療法は、ＭＳの潜在的に効果的な将来の治療法であると考えられている。この治療の目標は、自己抗原特異的疾患を誘発するＴ細胞の枯渇又は好ましい免疫応答の誘導（制御）のいずれかによって、免疫寛容を誘導することである。これを達成する主な方法には、経口、経皮もしくは皮下注射経路を介して免疫優性ペプチドエピトープなどの自己抗原を寛容原性様式で適用すること、又は抗原特異的Ｔ細胞もしくはその受容体をワクチンとして使用して制御応答を誘導することのいずれかがある。様々な手法に共通するテーマは、使用される抗原標的である。この治療戦略は、様々な手法を介してＴ細胞寛容が誘導され得ることが十分に確立されているという点で、一般的には成功している。ＭＳのマウスモデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）では有望な結果が報告されているが、これまでのところ、ヒトを対象とした試験での成功は限られており、効果はないか、あまりない。これの主な理由の１つは、ＥＡＥとは異なり、ＭＳの標的自己抗原が未だ十分にわかっておらず、最適な標的又は十分な標的が使用されていなかった可能性があることである；「抗原特異的治療法を発見及び開発する際の主な障害の１つは、もちろん、多発性硬化症の標的抗原がわかっていないことである」（Ｈｏｈｌｆｅｌｄ Ｒ，Ｄｏｒｎｍａｉｒ Ｋ，Ｍｅｉｎｌ Ｅ，Ｗｅｋｅｒｌｅ Ｈ．Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｐａｒｔ １：ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１５）。
抗原特異的免疫療法は、ＭＳの潜在的に効果的な将来の治療法であると考えられている。この治療の目標は、自己抗原特異的疾患を誘発するＴ細胞の枯渇又は好ましい免疫応答の誘導（制御）のいずれかによって、免疫寛容を誘導することである。これを達成する主な方法には、経口、経皮もしくは皮下注射経路を介して免疫優性ペプチドエピトープなどの自己抗原を寛容原性様式で適用すること、又は抗原特異的Ｔ細胞もしくはその受容体をワクチンとして使用して制御応答を誘導することのいずれかがある。様々な手法に共通するテーマは、使用される抗原標的である。この治療戦略は、様々な手法を介してＴ細胞寛容が誘導され得ることが十分に確立されているという点で、一般的には成功している。ＭＳのマウスモデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）では有望な結果が報告されているが、これまでのところ、ヒトを対象とした試験での成功は限られており、効果はないか、あまりない。これの主な理由の１つは、ＥＡＥとは異なり、ＭＳの標的自己抗原が未だ十分にわかっておらず、最適な標的又は十分な標的が使用されていなかった可能性があることである；「抗原特異的治療法を発見及び開発する際の主な障害の１つは、もちろん、多発性硬化症の標的抗原がわかっていないことである」（Ｈｏｈｌｆｅｌｄ Ｒ，Ｄｏｒｎｍａｉｒ Ｋ，Ｍｅｉｎｌ Ｅ，Ｗｅｋｅｒｌｅ Ｈ．Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｐａｒｔ １：ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ４＋Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１５）。
【0012】
知識の欠落
要約すると、ＡＰＣによるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化と、それらが認識する自己抗原とが、ＭＳの病因に重要な役割を果たすと考えられている。ＭＨＣクラスＩＩとＭＳとの関連性、Ｔ細胞を標的とする免疫調節療法（例えば、ナタリズマブ）の有効性、ＭＳ病変でのＣＤ４＋Ｔ細胞の発見、及び以前の試験でのいくつかの自己反応性Ｔ細胞の発見はいずれも、この仮説を裏付けている。しかし、いくつかの試験が行われているにもかかわらず、どの自己抗原が自己反応性Ｔ細胞を誘発し、炎症を引き起こすかは正確にはわかっていない。抗原特異的免疫療法の展望を考慮すると、自己抗原の同定はますます重要になる。しかし、これまでの発見は決定的ではなく、当技術分野ではＭＳ病因に関与する新たな抗原を同定する必要がある。
要約すると、ＡＰＣによるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化と、それらが認識する自己抗原とが、ＭＳの病因に重要な役割を果たすと考えられている。ＭＨＣクラスＩＩとＭＳとの関連性、Ｔ細胞を標的とする免疫調節療法（例えば、ナタリズマブ）の有効性、ＭＳ病変でのＣＤ４＋Ｔ細胞の発見、及び以前の試験でのいくつかの自己反応性Ｔ細胞の発見はいずれも、この仮説を裏付けている。しかし、いくつかの試験が行われているにもかかわらず、どの自己抗原が自己反応性Ｔ細胞を誘発し、炎症を引き起こすかは正確にはわかっていない。抗原特異的免疫療法の展望を考慮すると、自己抗原の同定はますます重要になる。しかし、これまでの発見は決定的ではなく、当技術分野ではＭＳ病因に関与する新たな抗原を同定する必要がある。
【0013】
したがって、本発明の目的は、対象の多発性硬化症関連自己免疫を決定するための改善された又は代替の手段及び方法を提供し、ＭＳの治療に使用するための改善された手段、方法及び組成物を提供することである。
【0014】
定義
百分率で表される配列同一性は、比較ウィンドウ上で２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定される値として定義され、比較ウィンドウ内の配列の一部は、２つの配列を最適にアラインメントのために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。百分率は、両配列内で同一のアミノ酸残基が現れる位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出される。特に指定がない限り、比較ウィンドウは参照される配列の全長である。この文脈では、最適なアラインメントとは、以下の入力パラメータ、すなわち、Ｗｏｒｄ ｌｅｎｇｔｈ＝３、Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ ｃｏｓｔ＝１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｃｏｓｔ＝１を用いて、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ Ｈａｎｄｂｏｏｋ［インターネット］、第１６章を参照）による実装されたオンラインとしてのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって作成されるアラインメントである。
百分率で表される配列同一性は、比較ウィンドウ上で２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定される値として定義され、比較ウィンドウ内の配列の一部は、２つの配列を最適にアラインメントのために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。百分率は、両配列内で同一のアミノ酸残基が現れる位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出される。特に指定がない限り、比較ウィンドウは参照される配列の全長である。この文脈では、最適なアラインメントとは、以下の入力パラメータ、すなわち、Ｗｏｒｄ ｌｅｎｇｔｈ＝３、Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ ｃｏｓｔ＝１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｃｏｓｔ＝１を用いて、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ Ｈａｎｄｂｏｏｋ［インターネット］、第１６章を参照）による実装されたオンラインとしてのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムによって作成されるアラインメントである。
【0015】
本発明の文脈では、抗原という用語は、特異的Ｔ細胞エピトープを含む分子（典型的にはポリペプチド）を指す。
【0016】
特異的Ｔ細胞エピトープという用語は、Ｔ細胞によって認識される抗原の一部として定義される。典型的には、特異的Ｔ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子において提示される場合は８～１１アミノ酸長及びＭＣＨクラスＩＩ分子において提示される場合は１３～１７アミノ酸長のアミノ酸配列である。
【0017】
ＭＳ抗原という用語は、多発性硬化症（ＭＳ）の病理に関連する抗原を指す。
【0018】
エンドトキシン、例えばリポ多糖（ＬＰＳ）は、大腸菌などのグラム陰性菌の外側の細胞壁に見出される共有結合した脂質及び多糖サブユニットを含む。
【0019】
ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＴヘルパー細胞は、サイトカイン分泌を通じて免疫応答を調整する細胞である。Ｂ細胞の抗体クラススイッチングの刺激、細胞傷害性Ｔ細胞の増殖又は食細胞の増強など、他の免疫細胞を抑制又は増強することができる。これらは、ＡＰＣ上のＭＨＣクラスＩＩを介した抗原提示によって活性化され、特定の抗原内の約１３～１７アミノ酸のストレッチ（いわゆるＴ細胞エピトープ）に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。
【0020】
ＣＤ８＋Ｔ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍細胞、感染細胞又は損傷した細胞を死滅させる細胞である。ＣＤ４＋Ｔ細胞とは異なり、活性化のために特別なＡＰＣを必要としない。それらのＴ細胞受容体は、あらゆる有核細胞に発現するタンパク質であるＭＨＣクラスＩによって提示される抗原由来ペプチド（約８～１１アミノ酸長）を認識する。
【0021】
抗原特異的Ｔ細胞活性化とは、共刺激と組み合わせて、ＴＣＲとＭＨＣ（ＨＬＡ）分子上に提示された特定のペプチドとの相互作用を必要とするプロセスである。
【0022】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、典型的には、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞又はマクロファージ、細胞外の生物又はタンパク質、すなわち抗原を貪食又はインターナライズする細胞であり、処理後にＭＨＣクラスＩＩ上の抗原由来ペプチドをＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する。血液中では、単球が最も豊富な抗原提示細胞である。
【0023】
貪食可能な粒子とは、免疫系の細胞、特に単球が貪食することができる粒子として定義される。
【0024】
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、全血の密度勾配遠心分離によって調製されたヒト血液の画分である。ＰＢＭＣ画分は、主に、リンパ球（７０～９０％）及び単球（１０～３０％）からなり、赤血球、顆粒球及び血漿は除去されている。
【0025】
タンパク質エピトープシグネチャータグ（ＰｒＥＳＴ）、ヒトタンパク質の固有の部分を表す短い組換え１０～１２ｋＤａペプチド（Ｌｉｎｄｓｋｏｇ Ｍ，Ｒｏｃｋｂｅｒｇ Ｊ，Ｕｈｌｅｎ Ｍ，Ｓｔｅｒｋｙ Ｆ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００５；３８（５）：７２３－７）。
【0026】
本出願の文脈では、ペプチド模倣体という用語は、ペプチドを構造的に模倣するように設計されているが、いくつかの点で異なる又は改善された特性を有するペプチド様ポリマー鎖として定義される。
【0027】
本文脈では、治療という用語は、わずかな軽減、実質的な軽減、大幅な軽減並びに治癒を含むあらゆる程度の軽減を含め、治療すべき症状に苦しむ対象又は患者に有益な効果をもたらす治療を指す。好ましくは、軽減の程度は少なくともわずかな軽減である。ＭＳは一時的な再燃性の特徴を有する疾患であるため、本文脈での治療とは、再燃の予防又は再燃の可能性の低減も指す。
【0028】
本文脈では、予防という用語は、症状を発症又は再発症する可能性のわずかな、実質的な、又は大幅な低減並びに全体的な予防を含め、予防すべき症状を発症する可能性又は症状が再燃する可能性にあらゆる程度の低減をもたらす予防措置を指す。好ましくは、可能性の低減の程度は、少なくともわずかな低減である。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】１２５種類のタンパク質のライブラリーに対する多発性硬化症患者の自己抗原スクリーニング。１～２種類の異なるヒトタンパク質由来のＰｒＥＳＴを含む抗原プールを用いて刺激した場合の、ＭＳ患者のＰＢＭＣからのＴ細胞活性化と健常対照からのＰＢＭＣの活性化との比較。パネルＡ、ＩＦＮγ－ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔによる活性化決定。パネルＢ、ＩＬ１７－ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔによる活性化決定。パネルＣ、ＩＬ２２－ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔによる活性化決定。患者のＴ細胞は、ライブラリー内の特定のタンパク質に対して著しく反応する。白四角及び黒丸はそれぞれ、患者及び対照のＰＢＭＣの平均活性化を示し、ひげ線は平均のＣＩ９５％を示す。双方向ＡＮＯＶＡを使用して決定されたＰ値。アスタリスクはＰ値を示す。
【図2】ＭＳの被疑自己抗原を用いて刺激した場合の多発性硬化症（ＭＳ）患者及び健常対照のＴ細胞活性化を比較するＩＦＮγ／ＩＬ－２２／ＩＬ－１７ Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイ。この適用に含まれる新たなＭＳマーカーのそれぞれを表す、図１と同じデータに基づく結果。患者１６例と対照９例とを含めた。パネルＡ、ＦＡＢＰ７（配列番号１及び６）及びＣＹＢ５６１Ｄ２を含む抗原プール１８を用いて刺激した場合の活性化。パネルＢ、ＰＲＯＫ２（配列番号：２）及びＮＯＶＡ２を含む抗原プール２３を用いて刺激した場合の活性化。パネルＣ、ＲＴＮ３（配列番号３）及びＳＤＫ２を含む抗原プール２６を用いて刺激した場合の活性化。パネルＤ、ＳＮＡＰ９１（配列番号４）及びＳＮＡＰ２５を含む抗原プール２９を用いて刺激した場合の活性化。Ｐ値はマン・ホイットニーのＵ検定を用いて決定し、見出された際に記載されている。ひげ線は平均のＣＩ９５％を示す。
【図3】抗原スクリーニングからの抗原プールの分割。患者と対照との間で活性化に有意差が検出されたスクリーニング実験からの抗原プールをさらに分割した。これらのプールのそれぞれには、図中の番号１及び番号２と名付けられた２つの異なるヒトタンパク質由来のＰｒＥＳＴを含めた。ＩＦＮγ／ＩＬ－２２／ＩＬ－１７ Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔでは、別個の抗原を用いて、スクリーニングで高度の活性化を示して反応した４例の患者を再度試験した。試験はいずれも３連で行った。各ウェル内の活性化された細胞の数を比較する、スチューデントのｔ検定によって決定されたＰ値（１抗原当たりｎ＝１２）。ひげ線はＳＤを示す。陽性抗原は、以下の通りであった。１８の番号２－ＦＡＢＰ７。２３の番号２－ＰＲＯＫ２。２６の番号１－ＲＴＮ３。２９の番号２－ＳＮＡＰ９１。
【図4】患者間の反応性プロファイル。患者間に観察された活性化のパターン。各線は、１例の患者のデータ点を接続する。プロファイル１ａ、１ｂ及び３では、点線は対照平均＋２ＳＤを示す。プロファイル２では、点線は３例の患者の平均ＩＬ－２２プロファイルを示す。抗原２６（ＲＴＮ３）に顕著に応答したのは３例の患者のみであり、ＩＦＮγ産生細胞のみが活性化したことから、抗原２６に関する前述の図の結果は、これらの特定の患者を示すのに最適ではない。しかし、図は、本明細書中でプロファイル２と名付けられた、この抗原に応答する別個の患者群を明確に示している。このようなパターンは、健常対照では確認されなかった。
【図5】診断マーカーとして使用した場合の個々の抗原のＲＯＣ曲線、感度及び特異性。個々に、ＦＡＢＰ７（プール１８から）は疾患のマーカーとして機能する最大の有望性を示し、それぞれ７５及び８５％の感度及び特異性に達する。Ａ～Ｄは、単独で使用される各抗原のＲＯＣ曲線を示す。図５Ｅでは、ＰＲＯＫ２又はＳＮＡＰ９１のいずれかに対して活性化された細胞の数（特定の個体ごとに高い方の数（患者及び対照について同じ））を用いた。最も高い応答のみを選択し分析するこの方法では、それらを個別に分析するよりもさらに優れたＲＯＣ曲線が得られた。（ＰＲＯＫ２及びＳＮＡＰ９１の）平均値を使用すると、同様の改善されたＲＯＣ曲線が得られたが、最高値のみを使用するほど良くはなかった。図５Ｆは、抗原１８の全長組換えバージョン、ＦＡＢＰ７アイソフォーム２（配列番号１）に基づく。
【図6】全長組換えＦＡＢＰ７アイソフォーム２を用いて刺激した場合の多発性硬化症（ＭＳ）患者及び健常対照のＴ細胞活性化を比較するＩＦＮγ／ＩＬ－２２／ＩＬ－１７ Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイ。１３例の患者（このうち７例は以前に試験登録した患者の初回サンプリングから１年後の新たなサンプリングからなり、６例は以前に試験していない（白四角））及び７例の対照（以前の試験に含めていない）を、ＦＡＢＰ７アイソフォーム２タンパク質（配列番号１）の社内で生産した組換えバージョンを用いてさらに試験した。マン・ホイットニー検定を使用して計算されたＰ値。ひげ線は平均及びＣＩ９５％を示す。
【図7】自己抗原由来の重複ペプチドを用いて患者の細胞を刺激するＩＦＮγ／ＩＬ－２２／ＩＬ－１７ Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイ。ＦＡＢＰ７アイソフォーム２及びＰＲＯＫ２全体に及ぶ重複ペプチド（１５アミノ酸長、１０アミノ酸重複）を、それぞれ５～７個のペプチドを含むプールにプールした。ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで、これらに対して６例のＭＳ患者の細胞を試験した。パネルＡ、ＦＡＢＰ７（配列番号１）由来の重複ペプチドの６つの異なるプールを用いて刺激した場合の活性化。パネルＢ、ＰＲＯＫ２（配列番号２）由来の重複ペプチドの３つの異なるプールを用いて刺激した場合の活性化。詳細なペプチド情報を表４に示す。ひげ線はＣＩ９５％を示す。グラフ内の負の数の活性化Ｔ細胞は、平均応答が陰性対照よりも低いことに起因する。
【図8】全長組換え抗原（ＦＡＢＰ７、ＰＲＯＫ２、ＲＴＮ３、ＳＮＡＰ９１）を用いて刺激した場合の多発性硬化症（ＭＳ）患者及び健常対照のＴ細胞活性化を比較するＩＦＮγ／ＩＬ－２２／ＩＬ－１７ Ｆｌｕｏｒｏｓｐｏｔアッセイ。ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで、組換え全長バージョンの自己抗原に対するＴ細胞活性化について、５２例の多発性硬化症患者と２４例の健常対照とを試験した。Ａ：ＦＡＢＰ７アイソフォーム２（配列番号１）。Ｂ：ＰＲＯＫ２（配列番号２）。Ｃ：ＲＴＮ３（配列番号３）。Ｄ：ＳＮＡＰ９１（配列番号４）。マン・ホイットニー検定を使用して計算されたＰ値。ひげ線は平均及びＣＩ９５％を示す。
【図9】診断マーカーとして使用した場合の全長抗原のＲＯＣ曲線、感度及び特異性。個々に、４つの抗原は疾患の診断マーカーとして同様に機能し、いずれも９５％の特異性で約５０％の感度に達する。Ａ：ＦＡＢＰ７アイソフォーム２。Ｂ：ＰＲＯＫ２。Ｃ：ＲＴＮ３。Ｄ：ＳＮＡＰ９１。Ｅ：４つの抗原すべての組合せを診断試験として使用すると、さらに高い感度及び特異性が得られる。具体的には、４つの抗原に対する平均応答に対するＩＦＮγ応答の平方根で割ったＩＬ－１７の比率を利用すると、＞９５％の特異性で７０％の感度が得られる。
【図10】ＨＬＡ ＤＲＢ５ ０１：０１に対するＦＡＢＰ７及びＰＲＯＫ２ペプチドの結合親和性の程度の例。競合結合アッセイで、ＨＬＡ ＤＲＢ５ ０１：０１に関連する多発性硬化症に対する親和性について、ＦＡＢＰ７（配列番号１及び６）及びＰＲＯＫ２（配列番号２）全体に及ぶ重複ペプチドを試験した。親和性の程度を４つのカテゴリーに分け、代表的な結合曲線を示す：Ａ：－結合なし、Ｂ：＋弱い結合、Ｃ：＋＋中程度の結合、Ｄ：＋＋＋強い結合。黒丸は参照Ｈ１Ｎ１インフルエンザペプチド結合を示し、三角は試験された自己抗原ペプチドを示す。表４に全結果を示す。
【発明の概要】
【0030】
本発明は、本発明者らによって、ＰＣＴ／欧州特許第２０１６／０８１１４１号明細書に以前に開示されたＴ細胞反応性プラットフォーム上で行われたスクリーニングからの発見に基づいている。
【0031】
４５プールの１２５の候補抗原のライブラリーに対して、多発性硬化症（ＭＳ）患者及び対照から得られたＴ細胞の試料をスクリーニングした（例１）。陽性抗原プール１８、２３、２６及び２９を個々のタンパク質に分けて再試験し、ＭＳの新規自己抗原としてのＦＡＢＰ７（配列番号１）、ＰＲＯＫ２（配列番号２）、ＲＴＮ３（配列番号３）及びＳＮＡＰ９１（配列番号４）の同定を可能にした（例２）。また、個々の患者が、新規自己抗原に対するいくつかの異なるタイプの反応性プロファイルを示したことが発見された（例３）。
【0032】
新規自己抗原の診断的有用性は、レシーバーオペレーター特性（ＲＯＣ）分析によって実証された（例４）。個々の抗原のうち、感度及び特異性（常にトレードオフ）は、７５％の感度及び８５％の特異性を示すＦＡＢＰ７が最も有望であった。感度及び特異性は、４つの抗原すべての組合せが最も有望であり、感度は７０％、特異性は＞９５％であった。
【0033】
各抗原の全長組換えバージョンを試験することによって自己抗原をさらに検証し（例７）、ＦＡＢＰ７及びＰＲＯＫ２の配列全体を網羅する重複ペプチド（１５アミノ酸、１０アミノ酸重複）を使用して、特異的Ｔ細胞エピトープの同定の原理を実証した（例６）。さらに、異なるペプチド－エピトープのＨＬＡ結合特性を実証した（例６）。
【0034】
先行技術では、疾患関連Ｔ細胞エピトープを含む寛容原性組成物（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を用いてＭＳを首尾よく治療することが可能であることが実証されたことを考えると、本発明者らは、自己抗原の発見がＭＳの新たな治療をさらに提供することを認識した（例８を参照）。
【0035】
背景の節で述べたように、Ｔ細胞寛容を誘導する方法は知られているが、ＭＳの治療は、Ｔ細胞寛容が誘導され得る好適な抗原の欠如によって妨げられてきた。本発明のＭＳの治療の生物学的メカニズムは、抗原特異的Ｔ細胞寛容の誘導に基づいており、これはこの分野で広く受け入れられている。
【0036】
当初の学術研究は、別個の実体（それらの天然の生物学的背景から）としての４つの新規自己抗原の概念に基づいていたが、その後、診断及び治療の両方に用いられるＴ細胞エピトープの性質が短いこと、並びに４つすべての自己抗原を組み合わせることによって診断結果が改善されるという事実（ＲＯＣ解析）を考慮すると、本発明で用いるための特異的Ｔ細胞エピトープ（配列番号５）の単一の供給源として、４つすべての新規自己抗原のプールされた配列を考慮することが可能かつ有利であることが認識された。配列番号５の配列は、ＦＡＢＰ７アイソフォーム２（配列番号１）、ＰＲＯＫ２（配列番号２）、ＲＴＮ３（配列番号３）、ＳＮＡＰ９１（配列番号４）及びＦＡＢＰ７アイソフォーム１の固有の部分（配列番号６）の組合せである。
【0037】
本発明は、具体的には以下の項目に関する。以下の項目に開示された主題は、この主題が特許請求の範囲に開示された場合と同じ方法で開示されているものとみなされるべきである。
【0038】
１．配列番号５のアミノ酸配列に含まれる特異的Ｔ細胞エピトープに対応する内因性エピトープに対してＴ細胞自己反応性を示すＭＳ患者の多発性硬化症（ＭＳ）の治療方法に使用するための寛容原性組成物であって、
組成物が、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列を含む治療用Ｔ細胞エピトープを含み、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列が、
ａ．配列番号５の部分配列（ｓｕｂ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるか、
ｂ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎが少なくとも８であり、ｍが０、１又は２である寛容原性組成物。
組成物が、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列を含む治療用Ｔ細胞エピトープを含み、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列が、
ａ．配列番号５の部分配列（ｓｕｂ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であるか、
ｂ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎが少なくとも８であり、ｍが０、１又は２である寛容原性組成物。
【0039】
２．配列番号５のアミノ酸配列に含まれる特異的Ｔ細胞エピトープに対応する内因性エピトープに対してＴ細胞自己反応性を示すＭＳ患者の多発性硬化症（ＭＳ）の治療方法に使用するための寛容原性組成物であって、
組成物が、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列を含む治療用Ｔ細胞エピトープをコードする核酸を含み、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列が、
ａ．配列番号５の部分配列と同一であるか、
ｂ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎが少なくとも８であり、ｍが０、１又は２である寛容原性組成物。
組成物が、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列を含む治療用Ｔ細胞エピトープをコードする核酸を含み、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列が、
ａ．配列番号５の部分配列と同一であるか、
ｂ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎが少なくとも８であり、ｍが０、１又は２である寛容原性組成物。
【0040】
３．配列番号５のアミノ酸配列に含まれる特異的Ｔ細胞エピトープに対応する内因性エピトープに対してＴ細胞自己反応性を示すＭＳ患者の多発性硬化症（ＭＳ）の治療方法に使用するための寛容原性組成物であって、
組成物が、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列を含む治療用Ｔ細胞エピトープにエクスビボで曝露された抗原提示細胞を含み、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列が、
ａ．配列番号５の部分配列と同一であるか、
ｂ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎが少なくとも８であり、ｍが０、１又は２である寛容原性組成物。
組成物が、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列を含む治療用Ｔ細胞エピトープにエクスビボで曝露された抗原提示細胞を含み、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列が、
ａ．配列番号５の部分配列と同一であるか、
ｂ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎが少なくとも８であり、ｍが０、１又は２である寛容原性組成物。
【0041】
４．治療方法が、配列番号５のアミノ酸配列に含まれるＴ細胞エピトープに対する患者のＴ細胞自己反応性を決定することを含む、項目１～３のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0042】
５．決定が、項目４３～１１０のいずれか一項目に記載の方法を用いて実行される、項目４に記載の使用のための組成物。
【0043】
６．部分配列が配列番号５の残基１～１６６に含まれる、項目１～５のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0044】
７．部分配列が配列番号５の残基１６７～２９５に含まれる、項目１～５のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0045】
８．部分配列が配列番号５の残基２９６～１３２７に含まれる、項目１～５のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0046】
９．部分配列が配列番号５の残基１３２８～２２３４に含まれる、項目１～５のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0047】
１０．部分配列が配列番号５の残基２２３５～２２５０に含まれる、項目１～５のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0048】
１１．部分配列が配列番号５の残基１～２２３４に含まれる、項目１～５のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0049】
１２．部分配列が表４のペプチドの配列のいずれか１つに含まれる、項目１～５のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0050】
１３．ｎが少なくとも１１である、項目１～１２のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0051】
１４．ｎが少なくとも１３である、項目１～１３のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0052】
１５．ｎが少なくとも１５である、項目１～１４のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0053】
１６．ｎが少なくとも１７である、項目１～１５のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0054】
１７．ｎが少なくとも１９である、項目１～１６のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0055】
１８．ｎが少なくとも５０、少なくとも７５、最も好ましくは少なくとも１００である、項目１～１７のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0056】
１９．ｍが２である、項目１～１８のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0057】
２０．ｍが１である、項目１～１８のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0058】
２１．ｍが０である、項目１～１８のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0059】
２２．上記Ｔ細胞エピトープが、ｍ個以下の残基の置換により部分配列とは異なり、部分配列と比較して置換又は欠失を含まない、項目１～２１のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0060】
２３．治療用Ｔ細胞エピトープがペプチド又はペプチド模倣体である、項目１もしくは３又はそれに従属する任意の項目に記載の使用のための組成物。
【0061】
２４．治療用Ｔ細胞エピトープが、配列番号５の部分配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するペプチド又はペプチド模倣体である、項目２３に記載の使用のための組成物。
【0062】
２５．組成物が、各々が項目１に記載の基準を満たす２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の異なる治療用Ｔ細胞エピトープを含む、項目１又はそれに従属する任意の項目に記載の使用のための組成物。
【0063】
２６．組成物が、各々が項目２に記載の基準を満たす２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の異なる治療用Ｔ細胞エピトープをコードする核酸を含む、項目２又はそれに従属する任意の項目に記載の使用のための組成物。
【0064】
２７．抗原提示細胞が、各々が項目３に記載の基準を満たす２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の異なる治療用Ｔ細胞エピトープに曝露されている、項目３又はそれに従属する任意の項目に記載の使用のための組成物。
【0065】
２８．異なる治療用Ｔ細胞エピトープが、項目６～１１で指定された配列区間（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ）のうちの１個、２個、３個、４個、５個又は６個から選択される、項目２５～２７のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0066】
２９．組成物が、生体適合性ポリマー、粒子又は細胞などの固体担体に結合した治療用Ｔ細胞エピトープを含む、項目１又はそれに従属する任意の項目に記載の使用のための組成物。
【0067】
３０．結合が共有結合によるものである、項目２９に記載の使用のための組成物。
【0068】
３１．組成物が、患者に上記治療用Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞寛容を誘導するために製剤化される、項目１～３０のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0069】
３２．組成物が、上記内因性エピトープと同じＴ細胞受容体に特異的に結合することができる治療用Ｔ細胞エピトープを含む、項目１又はそれに従属する任意の項目に記載の使用のための組成物。
【0070】
３３．組成物が、上記内因性エピトープと同じＴ細胞受容体に特異的に結合することができる治療用Ｔ細胞エピトープをコードする核酸を含む、項目２又はそれに従属する任意の項目に記載の使用のための組成物。
【0071】
３４．組成物が、上記内因性エピトープと同じＴ細胞受容体に特異的に結合することができる治療用Ｔ細胞エピトープに曝露された抗原提示細胞を含む、項目３又はそれに従属する任意の項目に記載の使用のための組成物。
【0072】
３５．方法が、患者がＴ細胞自己反応性を示すエピトープに治療用Ｔ細胞エピトープが対応するように、治療用Ｔ細胞エピトープを選択することを含む、項目１～３４のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0073】
３６．治療用Ｔ細胞エピトープが、上記内因性エピトープと同じＴＣＲに治療用Ｔ細胞エピトープが特異的に結合することができることに基づいて選択される、項目３５に記載の使用のための組成物。
【0074】
３７．治療方法が、対象に組成物を寛容原性様式で投与し、それにより患者の上記Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞寛容を誘導することを含む、項目１～３６のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0075】
３８．治療方法が、組成物を経口投与、経粘膜投与、皮内投与、経皮投与又は皮下投与することを含む、項目１～３７のいずれか一項目に記載の使用のための組成物。
【0076】
３９．治療方法が、抗原提示細胞に組成物をインビトロで投与し、続いて上記抗原提示細胞を患者に投与することを含む、項目１もしくは２又はそれに従属する任意の項目に記載の使用のための組成物。
【0077】
４０．上記核酸が、細胞、好ましくは抗原提示細胞での発現を可能にするプロモーターに作動可能に結合したベクターに含まれる、項目２又はそれに従属する任意の項目に記載の使用のための組成物。
【0078】
４１．上記ベクターが遺伝子治療ベクター又はウイルスベクターである、項目４０に記載の使用のための組成物。
【0079】
４２．抗原提示細胞が、樹状細胞、単球、マクロファージ、Ｂ細胞（好ましくはＰＢＭＣに由来する）又はミクログリアである、項目３又はそれに従属する任意の項目に記載の使用のための組成物。
【0080】
４３．被験者の多発性硬化症（ＭＳ）関連自己免疫の程度を決定する方法であって、
ａ．生存可能なＴ細胞を含む、被験者に由来する試験試料を提供することと、
ｂ．Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原に応答した試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化をインビトロで定量することと、ここで、上記Ｔ細胞エピトープは、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含み、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列が、
ｉ．配列番号５の部分配列と同一であるか、
ｉｉ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎが少なくとも８であり、ｍが０、１又は２であり、
ｃ．定量された抗原特異的活性化と、関連する参照とを比較して、被験者のＭＳ関連自己免疫の程度を決定することとを含む方法。
ａ．生存可能なＴ細胞を含む、被験者に由来する試験試料を提供することと、
ｂ．Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原に応答した試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化をインビトロで定量することと、ここで、上記Ｔ細胞エピトープは、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含み、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列が、
ｉ．配列番号５の部分配列と同一であるか、
ｉｉ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎが少なくとも８であり、ｍが０、１又は２であり、
ｃ．定量された抗原特異的活性化と、関連する参照とを比較して、被験者のＭＳ関連自己免疫の程度を決定することとを含む方法。
【0081】
４４．部分配列が、配列番号５の残基１～１６６に含まれる、項目４３に記載の方法。
【0082】
４５．部分配列が、配列番号５の残基１６７～２９５に含まれる、項目４３に記載の方法。
【0083】
４６．部分配列が、配列番号５の残基２９６～１３２７に含まれる、項目４３に記載の方法。
【0084】
４７．部分配列が、配列番号５の残基１３２８～２２３４に含まれる、項目４３に記載の方法。
【0085】
４８．部分配列が、配列番号５の残基２２３５～２２５０に含まれる、項目４３に記載の方法。
【0086】
４９．部分配列が、配列番号５の残基１～２２３４に含まれる、項目４３に記載の方法。
【0087】
５０．部分配列が、表４のペプチドの配列のいずれか１つに含まれる、項目４３に記載の方法。
【0088】
５１．抗原特異的活性化が、各々が項目４３に記載の基準を満たす２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の異なるＴ細胞エピトープに対して定量される、項目４３～５０の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0089】
５２．異なるＴ細胞エピトープが、項目４４～４９で指定された配列区間のうちの１個、２個、３個、４個、５個又は６個から選択される、項目５１に記載の方法。
【0090】
５３．抗原特異的活性化が、ＦＡＢＰ７（配列番号１）、ＰＲＯＫ２（配列番号２）、ＲＴＮ３（配列番号３）及びＳＮＡＰ９１（配列番号４）からなる群から選択される異なるＭＳ抗原に対応する特異的Ｔ細胞エピトープをそれぞれ含む少なくとも２つ、３つ又は４つの試験抗原に対して定量される、項目４３～５２の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0091】
５４．上記部分配列が、ＦＡＢＰ７（配列番号１）残基１～８２の配列に含まれる、項目４３～５３の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0092】
５５．上記部分配列が、ＦＡＢＰ７（配列番号１）残基８３～１６６の配列に含まれる、項目４３～５４の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0093】
５６．上記部分配列が、ＦＡＢＰ７（配列番号１）残基１０５～１６６の配列に含まれる、項目４３～５５の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0094】
５７．上記部分配列が、ＰＲＯＫ２（配列番号２）残基３４～７４の配列に含まれる、項目４３～５６の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0095】
５８．上記部分配列が、ＰＲＯＫ２（配列番号２）残基１０６～１２８の配列に含まれる、項目４３～５７の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0096】
５９．上記部分配列が、ＲＴＮ３（配列番号３）残基８１～２１７の配列に含まれる、項目４３～５８の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0097】
６０．上記部分配列が、ＲＴＮ３（配列番号３）残基３４５～４８３の配列に含まれる、項目４３～５９の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0098】
６１．上記部分配列が、ＳＮＡＰ９１（配列番号４）残基３７８～４８０の配列に含まれる、項目４３～６０の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0099】
６２．上記部分配列が、ＳＮＡＰ９１（配列番号４）残基４８１～５７２の配列に含まれる、項目４３～６１の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0100】
６３．上記部分配列が、ＳＮＡＰ９１（配列番号４）残基５８４～６９１の配列に含まれる、項目４３～６２の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0101】
６４．ｎが少なくとも１１である、項目４３～６３の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0102】
６５．ｎが少なくとも１３である、項目４３～６４の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0103】
６６．ｎが少なくとも１５である、項目４３～６５の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0104】
６７．ｎが少なくとも１７である、項目４３～６６の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0105】
６８．ｎが少なくとも１９である、項目４３～６７の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0106】
６９．ｎが少なくとも５０、少なくとも７５、最も好ましくは少なくとも１００である、項目４３～６８の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0107】
７０．ｍが２である、項目４３～６９の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0108】
７１．ｍが１である、項目４３～６９のいずれか一項目に記載の方法。
【0109】
７２．ｍが０である、項目４３～６９のいずれか一項目に記載の方法。
【0110】
７３．上記Ｔ細胞エピトープが、ｍ個以下の残基の置換により、選択されたＭＳ抗原の部分配列とは異なり、部分配列と比較して置換又は欠失を含まない、項目４３～７２の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0111】
７４．上記Ｔ細胞エピトープがペプチド又はペプチド模倣体である、項目４３～７３の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0112】
７５．特異的Ｔ細胞エピトープを含む抗原が、配列番号１～４、配列番号５又は配列番号６のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するペプチド又はペプチド模倣体である、項目４３～７４の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0113】
７６．対象が診断されたＭＳ患者である、項目４３～７５の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0114】
７７．対象がＭＳを有する疑いのある個体である、項目４３～７５のいずれか一項目に記載の方法。
【0115】
７８．対象がヒトである、項目４３～７７の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0116】
７９．試験試料が血液試料に由来する、項目４３～７８の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0117】
８０．試験試料がＰＢＭＣ試料である、項目４３～７９の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0118】
８１．試験試料が抗原提示細胞をさらに含む、項目４３～８０の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0119】
８２． 項目４３～８１の方法項目のいずれか一項目に記載の方法であって、
ａ．生存可能な抗原提示細胞を提供することと、
ｂ．試験抗原と抗原提示細胞とを接触させることと、
ｃ．抗原提示細胞によって提示された抗原に応答してＴ細胞の抗原特異的活性化が可能になる条件下で、試験試料と、試験抗原と接触させた抗原提示細胞とをインビトロで接触させることと、
ｄ．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化を定量することとをさらに含む方法。
ａ．生存可能な抗原提示細胞を提供することと、
ｂ．試験抗原と抗原提示細胞とを接触させることと、
ｃ．抗原提示細胞によって提示された抗原に応答してＴ細胞の抗原特異的活性化が可能になる条件下で、試験試料と、試験抗原と接触させた抗原提示細胞とをインビトロで接触させることと、
ｄ．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化を定量することとをさらに含む方法。
【0120】
８３．方法が、貪食可能な粒子に緊密に会合した試験抗原を提供することを含む、項目４３～８２の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0121】
８４．方法が、（ａ’）貪食可能な粒子に試験抗原を緊密に会合させる工程、及び／又は（ａ’’）粒子に会合した試験抗原を変性洗浄に供し、後続の工程を妨害しないほどエンドトキシンのレベルを十分に低くする工程をさらに含む、項目８３に記載の方法。
【0122】
８５．粒子が、５．６μｍ未満、好ましくは４μｍ未満、さらに好ましくは３μｍ未満、さらに一層好ましくは０．５～２μｍの区間又は最も好ましくは約１μｍの最大寸法を有する、項目８３～８４のいずれか一項目に記載の方法。
【0123】
８６．粒子が実質的に球形である、項目８５に記載の方法。
【0124】
８７．変性洗浄が、会合した試験抗原を有する粒子を、少なくともｐＨ１３、さらに好ましくは少なくともｐＨ１４、最も好ましくは少なくともｐＨ１４．３などの高ｐＨにさらすことを含む、項目８４～８６のいずれか一項目に記載の方法。
【0125】
８８．変性洗浄が、会合した試験抗原を有する粒子を低ｐＨにさらすことを含む、項目８４～８７のいずれか一項目に記載の方法。
【0126】
８９．変性洗浄が、会合した試験抗原を有する粒子を少なくとも９０℃、さらに好ましくは少なくとも９２℃、最も好ましくは少なくとも９５°Ｃなどの高温にさらすことを含む、項目８４～８８のいずれか一項目に記載の方法。
【0127】
９０．変性洗浄が、会合した試験抗原を有する粒子を、少なくとも５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ又は８Ｍなどの十分な濃度で尿素又は塩酸グアニジンなどの変性剤にさらすことを含む、項目８４～８９のいずれか一項目に記載の方法。
【0128】
９１．変性洗浄により、試験抗原中のエンドトキシン量が、該方法ではエンドトキシンの最終濃度が１００ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは５０ｐｇ／ｍｌ未満、さらに好ましくは２５ｐｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ未満になるような量になる、項目８４～９０のいずれか一項目に記載の方法。
【0129】
９２．粒子が常磁性特性を有する、項目８３～９１のいずれか一項目に記載の方法。
【0130】
９３．試験抗原が粒子に共有結合しているか、金属キレートを介して粒子に結合している、項目８３～９２のいずれか一項目に記載の方法。
【0131】
９４．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化の定量が、ＥＬＩＳｐｏｔもしくはＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ技術を使用して、又はＴ細胞増殖を測定することにより行われる、項目４３～９３の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0132】
９５．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化の定量が、ＩＦＮ－γの分泌を測定することによりＴ細胞応答を決定することを含む、項目４３～９４の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0133】
９６．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化の定量が、ＩＬ－１７の分泌を測定することによりＴ細胞応答を決定することを含む、項目４３～９５の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0134】
９７．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化の定量が、ＩＬ－２２の分泌を測定することによりＴ細胞応答を決定することを含む、項目４３～９６の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0135】
９８．試験細胞試料のＴ細胞活性化の定量が、試料中の活性化Ｔ細胞の割合を決定することを含む、項目４３～９７の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0136】
９９．抗原特異的Ｔ細胞活性化の定量が、
ａ．緊密に会合した試験抗原を有する貪食可能な粒子を提供する工程と、ここで、会合した試験抗原を有する粒子を変性洗浄に供し、後続の工程を妨害しないほどエンドトキシンのレベルを十分に低くし、
ｂ．生存可能な抗原提示細胞を提供する工程と、
ｃ．抗原提示細胞による粒子の貪食を可能にする条件下で、洗浄された粒子と抗原提示細胞とを接触させる工程と、
ｄ．生存可能なＴ細胞を含むアッセイ対象の試験試料を提供する工程と、
ｅ．抗原提示細胞によって提示された抗原に応答してＴ細胞の抗原特異的活性化が可能になる条件下で、試験試料と、粒子と接触させた抗原提示細胞とをインビトロで接触させる工程と、
ｆ．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化を定量する工程とを含む、項目４３～９８の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
ａ．緊密に会合した試験抗原を有する貪食可能な粒子を提供する工程と、ここで、会合した試験抗原を有する粒子を変性洗浄に供し、後続の工程を妨害しないほどエンドトキシンのレベルを十分に低くし、
ｂ．生存可能な抗原提示細胞を提供する工程と、
ｃ．抗原提示細胞による粒子の貪食を可能にする条件下で、洗浄された粒子と抗原提示細胞とを接触させる工程と、
ｄ．生存可能なＴ細胞を含むアッセイ対象の試験試料を提供する工程と、
ｅ．抗原提示細胞によって提示された抗原に応答してＴ細胞の抗原特異的活性化が可能になる条件下で、試験試料と、粒子と接触させた抗原提示細胞とをインビトロで接触させる工程と、
ｆ．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化を定量する工程とを含む、項目４３～９８の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0137】
１００．参照が、病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象から得られた参照試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化である、項目４３～９９の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0138】
１０１．参照が、病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象のセットから得られた参照試料のセットの比較可能に定量された抗原特異的活性化の平均値である、項目４３～９９のいずれか一項目に記載の方法。
【0139】
１０２．セットが、少なくとも１０例の参照対象を含む、項目１０１に記載の方法。
【0140】
１０３．参照が、異なる時点に採取された、同じ対象から得られた試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化である、項目４３～９９のいずれか一項目に記載の方法。
【0141】
１０４．試験試料の定量された抗原特異的活性化が、参照の少なくとも２倍、好ましくは３倍、さらに好ましくは５倍、最も好ましくは１０倍である場合、ＭＳ関連自己免疫の程度の増加が結論付けられる、項目４３～１０３の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0142】
１０５．試験試料の定量された抗原特異的活性化が、病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象のセットから得られた比較可能に定量された参照試料のセットの平均よりも、参照試料のセットの標準偏差の２倍だけ高い場合、ＭＳ関連自己免疫の程度の増加が結論付けられる、項目４３～１０４の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0143】
１０６．試験試料の定量された抗原特異的活性化が、スチューデントのＴ検定によって計算された０．０５未満のｐ値を伴って参照よりも統計的に有意に高い場合、ＭＳ関連自己免疫の程度の増加が結論付けられる、項目４３～１０５の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0144】
１０７．試験試料の定量された抗原特異的活性化が、マン・ホイットニーのＵ検定によって計算された０．０５未満のｐ値を伴って参照よりも統計的に有意に高い場合、ＭＳ関連自己免疫の程度の増加が結論付けられる、項目４３～１０６の方法項目のいずれか一項目に記載の方法。
【0145】
１０８． 項目４３～１０７の方法項目のいずれか一項目に記載の方法であって、
ａ．方法が、対象のＭＳを診断するためのものであり、
ｂ．参照が、病理学的多発性硬化症関連自己免疫のない参照対象の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者が多発性硬化症であることを示す方法。
ａ．方法が、対象のＭＳを診断するためのものであり、
ｂ．参照が、病理学的多発性硬化症関連自己免疫のない参照対象の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者が多発性硬化症であることを示す方法。
【0146】
１０９．項目４３～１０８の方法項目のいずれか一項目に記載の方法であって、
ａ．方法が、対象のＭＳの経過を追跡するためのものであり、
ｂ．参照が、同じ対象から異なる時点に採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性が高いことを示し、逆もまた同様である方法。
ａ．方法が、対象のＭＳの経過を追跡するためのものであり、
ｂ．参照が、同じ対象から異なる時点に採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性が高いことを示し、逆もまた同様である方法。
【0147】
１１０． 項目４３～１０９の方法項目のいずれか一項目に記載の方法であって、
ａ．方法が、対象のＭＳ経過の予後を確認するためのものであり、
ｂ．参照が、同じ対象から異なる時点に採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性が増大していることを示し、逆もまた同様である方法。
ａ．方法が、対象のＭＳ経過の予後を確認するためのものであり、
ｂ．参照が、同じ対象から異なる時点に採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性が増大していることを示し、逆もまた同様である方法。
【0148】
１１１． 項目４３～１１０の方法項目のいずれか一項目に記載の方法であって、
ａ．方法が、治療的処置に対する対象の応答を評価するためのものであり、
ｂ．参照が、評価対象の治療的処置の実施前に同じ対象から採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．試験試料が、治療的処置の開始後、同じ対象から得られたものであり、
ｄ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が低ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性に対する治療効果を示し、定量された抗原特異的活性化の程度が変わらないか高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性に対する治療効果の欠如を示す方法。
ａ．方法が、治療的処置に対する対象の応答を評価するためのものであり、
ｂ．参照が、評価対象の治療的処置の実施前に同じ対象から採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．試験試料が、治療的処置の開始後、同じ対象から得られたものであり、
ｄ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が低ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性に対する治療効果を示し、定量された抗原特異的活性化の程度が変わらないか高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性に対する治療効果の欠如を示す方法。
【0149】
１１２．ＭＳの診断又は治療でのペプチド又はペプチド模倣体の使用であって、ペプチド又はペプチド模倣体がＭＳ抗原に対応する特異的Ｔ細胞エピトープを含み、上記Ｔ細胞エピトープが、ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なる、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含み、ｍが０、１又は２である使用。
【0150】
１１３．部分配列が、配列番号５の残基１～１６６、配列番号５の残基１６７～２９５、配列番号５の残基２９６～１３２７、配列番号５の残基１３２８～２２３４、配列番号５の残基２２３５～２２５０及び／又は配列番号５の残基１～２２３４から選択される、項目１１２に記載の使用。
【0151】
１１４．ｎが少なくとも１１である、項目１１２又は１１３に記載の使用。
【0152】
１１５．ｎが少なくとも１３である、項目１１２又は１１３に記載の使用。
【0153】
１１６．ｎが少なくとも１５である、項目１１２又は１１３に記載の使用。
【0154】
１１７．ｎが少なくとも１７である、項目１１２又は１１３に記載の使用。
【0155】
１１８．ｎが少なくとも１９である、項目１１２又は１１３に記載の使用。
【0156】
１１９．ｍが１である、項目１１２～１１８のいずれか一項目に記載の使用。
【0157】
１２０．ｍが０である、項目１１２～１１８のいずれか一項目に記載の使用。
【0158】
詳細な説明
多発性硬化症の治療に使用するための寛容原性組成物
第１の態様では、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列に含まれる特異的Ｔ細胞エピトープに対応する内因性エピトープに対してＴ細胞自己反応性を示すＭＳ患者の多発性硬化症（ＭＳ）の治療方法に使用するための寛容原性組成物を提供し、
組成物は、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列を含む治療用Ｔ細胞エピトープを含み、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列は、
ａ．配列番号５の部分配列と同一であるか、
ｂ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎは少なくとも８であり、ｍは０、１又は２である。
多発性硬化症の治療に使用するための寛容原性組成物
第１の態様では、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列に含まれる特異的Ｔ細胞エピトープに対応する内因性エピトープに対してＴ細胞自己反応性を示すＭＳ患者の多発性硬化症（ＭＳ）の治療方法に使用するための寛容原性組成物を提供し、
組成物は、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列を含む治療用Ｔ細胞エピトープを含み、ｎ個の連続するアミノ酸残基の配列は、
ａ．配列番号５の部分配列と同一であるか、
ｂ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎは少なくとも８であり、ｍは０、１又は２である。
【0159】
第２の態様では、配列番号５のアミノ酸配列に含まれる特異的Ｔ細胞エピトープに対応する内因性エピトープに対してＴ細胞自己反応性を示すＭＳ患者の多発性硬化症（ＭＳ）の治療方法に使用するための寛容原性組成物が提供され、組成物は、第１の態様に関して定義された治療用Ｔ細胞エピトープをコードする核酸を含む。
【0160】
第３の態様では、配列番号５のアミノ酸配列に含まれる特異的Ｔ細胞エピトープに対応する内因性エピトープに対してＴ細胞自己反応性を示すＭＳ患者の多発性硬化症（ＭＳ）の治療方法に使用するための寛容原性組成物が提供され、組成物は、第１の態様に関して定義された治療用Ｔ細胞エピトープにエクスビボで曝露された抗原提示細胞を含む。
【0161】
治療方法が患者に組成物を投与することを含むことを意味すると理解されるべきである。
【0162】
治療方法は、好ましくは、本発明の第４の態様として以下に開示される方法により、組成物を投与する前に、配列番号５のアミノ酸配列に含まれる特異的Ｔ細胞エピトープに対する患者のＴ細胞自己反応性を決定する工程を含んでもよい。
【0163】
患者の抗原提示細胞（ＡＰＣ）が比較的大きなを消化し、断片をＴ細胞に提示することを考慮すれば、実質的にあらゆる比較的大きなポリペプチドの一部として（例えば、遺伝子工学又は化学ペプチド合成によって）、治療用Ｔ細胞エピトープを含めることができることに留意すべきである。言い換えれば、ＡＰＣによる消化のために、治療用Ｔ細胞エピトープが見出される配列状況は、ほとんど又は全く変化することはない。
【0164】
第１の態様の組成物が、各々が上記の基準を満たす２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、１００又はそれ以上などの複数の治療用Ｔ細胞エピトープを含むことが好ましい。上記及び背景の節で述べたように、抗原提示細胞は、抗原提示のための任意のタンパク質を小さな断片に消化するため、同じ治療の枠組み内で使用される比較的大きなポリペプチド又はペプチド模倣体に１つ以上の治療用Ｔ細胞エピトープを含めることが可能であるか、さらに好ましい。不確実性を避けるために、治療用Ｔ細胞エピトープが別個の化学物質であってもよいことは明らかである。
【0165】
組成物が、各エピトープが上記の基準を満たす２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、１００又はそれ以上などの複数の治療用Ｔ細胞エピトープをコードする１つ以上の核酸を含むという改変を伴う第２の態様の組成物にも、同じことが当てはまる。上記のように、細胞は抗原提示のための任意の発現タンパク質を小さな断片に消化するため、核酸は複数の治療用Ｔ細胞エピトープをコードしてもよい。或いは、又はさらに、前述の理由のために、特異的Ｔ細胞エピトープではない配列を含む比較的長い配列の一部として治療用Ｔ細胞エピトープを含めることが可能である。
【0166】
第３の組成物の抗原提示細胞は、各々が上記の基準を満たす２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、１００又はそれ以上などの複数の治療用Ｔ細胞エピトープに曝露されていてもよい。前述のように、この場合でも、Ｔ細胞エピトープが比較的大きな単数又は複数のポリペプチドに含まれてもよい。
【0167】
第３の態様の文脈の「曝露」とは、抗原提示細胞と、治療用Ｔ細胞エピトープを含むペプチド又はペプチド模倣体とを接触させることだけでなく、治療用Ｔ細胞エピトープをコードする核酸を抗原提示細胞にトランスフェクトし、細胞に治療用Ｔ細胞エピトープを発現させて細胞を曝露することも指し得ることが理解されるべきである。
【0168】
部分配列
第１、第２又は第３の態様の部分配列は、ｉ）配列番号５の残基１～１６６、ｉｉ）配列番号５の残基１６７～２９５、ｉｉｉ）配列番号５の残基２９６～１３２７、ｉｖ）配列番号５の残基１３２８～２２３４又はｖ）配列番号５の残基２２３５～２２５０に含まれ得る。好ましくは、部分配列は、ｖｉ）配列番号５の残基１～２２３４に含まれる。
第１、第２又は第３の態様の部分配列は、ｉ）配列番号５の残基１～１６６、ｉｉ）配列番号５の残基１６７～２９５、ｉｉｉ）配列番号５の残基２９６～１３２７、ｉｖ）配列番号５の残基１３２８～２２３４又はｖ）配列番号５の残基２２３５～２２５０に含まれ得る。好ましくは、部分配列は、ｖｉ）配列番号５の残基１～２２３４に含まれる。
【0169】
第１の態様の組成物は、上記で定義された複数の異なる治療用Ｔ細胞エピトープを含んでもよい。好ましくは、複数の異なる治療用Ｔ細胞エピトープは、ｉ）～ｖｉ）として上記で提示された異なる区間のうちの２つ、３つ、４つ、５つ又は６つから選択される。
【0170】
同じ原則が、必要な変更を加えて、第２の態様の核酸に適用される。好ましくは、核酸は、上記で定義された複数の異なる治療用Ｔ細胞エピトープをコードする。好ましくは、複数の異なるコードされたＴ細胞エピトープは、ｉ）～ｖｉ）として上記で提示された異なる区間のうちの２つ、３つ、４つ、５つ又は６つから選択される。
【0171】
同様に、第３の態様の細胞は、上記で定義された複数の異なる治療用Ｔ細胞エピトープに曝露されていてもよい。好ましくは、複数の異なる治療用Ｔ細胞エピトープは、ｉ）～ｖｉ）として上記で提示された異なる区間のうちの２つ、３つ、４つ、５つ又は６つから選択される。
【0172】
部分配列は、表４のペプチドの配列のいずれか１つに含まれてもよい。好ましくは、部分配列は、ＨＬＡ結合が「＋＋」又は「＋＋＋」、最も好ましくは「＋＋＋」として示される表４のペプチドの配列のいずれか１つに含まれる。
【0173】
好ましくは、ｎは少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２である。ｎは、少なくとも５０、少なくとも７５、さらに一層好ましくは少なくとも１００であってよい。ｎは、前述の数値から形成される任意の区間、例えば８～２２、９～２１、８～１７、８～１５、８～１２又は８～１００であってよい。最も好ましくは、ｎは、８～１９、又はｍ＝０の場合、８～１７である。好ましくは、ｍは２であり、さらに好ましくはｍは１であり、最も好ましくはｍは０である。
【0174】
好ましくは、治療用Ｔ細胞エピトープは部分配列と同一である（ｍ＝０）。ただし、ほとんどの場合、配列をわずかに変化させ、配列番号５の部分配列を同定する配列を有するものと比較して機能的に完全又は実質的に同等の治療用Ｔ細胞エピトープを依然として有することが可能であると考えられる。例えば、あるアミノ酸を、極性、電荷又は疎水性に関して同様の特性を有する別のアミノ酸に置換することが許容され得る。治療的Ｔ細胞エピトープ内の小さな挿入又は欠失も、それらが、配列番号５の部分配列を同定する配列を有するものと比較して機能的に完全又は実質的に同等の治療用Ｔ細胞エピトープをもたらすことを条件に許容され得る。好ましくは、ｍは２であり、さらに好ましくはｍは１であり、最も好ましくはｍは０である。
【0175】
好ましくは、上記治療用Ｔ細胞エピトープは、ｍ個以下の残基の置換により部分配列とは異なり、部分配列と比較して置換又は欠失を含まなくてもよい。
【0176】
第１又は第３の態様の治療用Ｔ細胞エピトープは、ペプチド又はペプチド模倣体であり得る。第１又は第３の態様の治療用Ｔ細胞エピトープは、配列番号５の部分配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するペプチド又はペプチド模倣体であり得る。
【0177】
第２の態様の核酸は、ＤＮＡ、ＰＮＡ、又は哺乳動物細胞での発現のためのタンパク質をコードすることができる他の任意の核酸であり得る。
【0178】
組成物の製剤化
組成物は、ヒト又は非ヒト哺乳動物、好ましくはヒトであり得る患者に上記治療用Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞寛容を誘導するために製剤化される。
組成物は、ヒト又は非ヒト哺乳動物、好ましくはヒトであり得る患者に上記治療用Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞寛容を誘導するために製剤化される。
【0179】
第１の態様の組成物は、生体適合性ポリマー（ＰＬＧＡなど）、リポソーム、固体粒子又は細胞などの固体担体に結合した治療用Ｔ細胞エピトープを含んでもよい。
【0180】
結合は共有結合を介することが好ましいが、金属キレート結合、疎水性相互作用又はイオン相互作用を含む他の結合も可能である。抗原ペプチドを細胞に結合するための好適な結合プロトコルが、欧州特許第２２０５２７３号明細書に開示されている。抗原ペプチドをＰＬＧＡ微粒子に結合するための好適な結合プロトコルが、Ｇｈｏｌａｍｚａｄらによって開示されている（Ｉｒａｎｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１７． １６（３）：２７１－２８１）。抗原ペプチドを高分子担体に結合するための好適なプロトコルが、Ｐｅａｒｓｏｎらによって開示されている（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１７ Ｊｕｌ ５；２５（７）：１６５５－１６６４． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０４．０１５）。
【0181】
第１の態様による組成物は、上記内因性エピトープと同じＴ細胞受容体に特異的に結合することができる治療用Ｔ細胞エピトープを含んでもよい。本発明の文脈では、特異的結合とは、インビトロ又はインビボでの生物学的状況でＴ細胞活性化をもたらすのに十分に高い結合を意味する。
【0182】
第２の態様による組成物は、上記内因性エピトープと同じＴ細胞受容体に特異的に結合することができる治療用Ｔ細胞エピトープをコードする核酸を含んでもよい。
【0183】
第３の態様の抗原提示細胞は、上記内因性エピトープと同じＴ細胞受容体に特異的に結合することができる治療用Ｔ細胞エピトープに曝露されていてもよい。
【0184】
治療用Ｔ細胞エピトープの選択
第１、第２又は第３の態様の治療方法は、患者がＴ細胞自己反応性を示す内因性Ｔ細胞エピトープに治療用Ｔ細胞エピトープが対応するように治療用Ｔ細胞エピトープを選択することを含んでもよい。
第１、第２又は第３の態様の治療方法は、患者がＴ細胞自己反応性を示す内因性Ｔ細胞エピトープに治療用Ｔ細胞エピトープが対応するように治療用Ｔ細胞エピトープを選択することを含んでもよい。
【0185】
治療用Ｔ細胞エピトープは、上記内因性エピトープと同じＴＣＲに特異的に治療用Ｔ細胞エピトープが結合することができることに基づいて選択され得る。
【0186】
第１、第２又は第３の組成物の治療用Ｔ細胞エピトープは、治療対象の個々の患者又は対象の自己反応性に合うように個別に調整又は選択され得る。しかし、多くの場合、組成物を調整することは時間がかかり、費用がかかり、多くの区域では規制上の課題を提示する可能性があるため、最も一般的な内因性Ｔ細胞エピトープに対応するいくつかの治療用Ｔ細胞エピトープを含む組成物を投与する方が実用的であり得る。
【0187】
組成物の投与
第１から第３の態様の治療方法は、好ましくは、対象に組成物を寛容原性様式で投与し、それにより患者の治療用Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞寛容を誘導することを含む。
第１から第３の態様の治療方法は、好ましくは、対象に組成物を寛容原性様式で投与し、それにより患者の治療用Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞寛容を誘導することを含む。
【0188】
治療方法は、組成物を経口投与、経粘膜投与、皮内投与、経皮投与又は皮下投与することを含んでもよい。投与は注射によるものであってよい。
【0189】
第１又は第２の態様の治療方法は、抗原提示細胞に組成物をエクスビボで投与し、続いて上記抗原提示細胞を対象に投与することを含んでもよい。
【0190】
治療用量は、好ましくは、数週間／月の期間で、低用量から高用量まで漸増される。治療は、最初の低用量で開始し、その後の投与ごとに用量を増やす（例えば、倍増する）ことが好ましい。数週間／月のこの漸増期間の後、開始用量の１０～１００倍であり得る維持レベルに到達し、これを一定期間維持することができる。
【0191】
文献には、ＭＳ及び他の症状に対してＴ細胞寛容を誘導するためのいくつかのプロトコルが記載されており、寛容が誘導されるＴ細胞抗原を本明細書に記載されている治療用Ｔ細胞エピトープに置き換えるだけで、このプロトコルを本発明との使用に適合させることができる。
【0192】
Ｃａｔｈａｗａｙら（Ｃａｔｈａｗａｙ Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ Ｋ，Ｂａｒｒｅｌｌ Ｋ，Ｓｈａｒｒａｃｋ Ｂ，Ｓｔｏｌｔ Ｐ，Ｗｒａｉｔｈ ＤＣ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＴＸ－ＭＳ－１４６７ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｖｅｒ １６ ｗｅｅｋｓ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１８）は、多発性硬化症が再燃している患者に対する抗原特異的免疫療法の安全性、忍容性及び有効性を評価するために、抗原に対する寛容を誘導するための様々な治療プロトコルを用いてオープンラベル試験を実施している。
【0193】
Ｗａｌｃｚａｋら（Ｗａｌｃｚａｋ Ａ，Ｓｉｇｅｒ Ｍ，Ｓｚｃｚｅｐａｎｉｋ Ｍ，Ｓｅｌｍａｊ Ｋ．Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３）は、二重盲検プラセボ対照コホート試験で、ヒト患者に対するミエリンペプチドの経皮投与を用いて、多発性硬化症に対する効果的な抗原特異的療法を実証している。
【0194】
Ｌｕｔｔｅｒｏｔｔｉらは、７つのミエリンペプチドと化学的に結合した自己末梢血単核球の単回注入を用いるＭＳ患者における寛容化レジメンを発表している（Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１３ Ｊｕｎ ５；５（１８８）：１８８ｒａ７５）。同チームはまた、ペプチドが赤血球に結合した同様のレジメンを特許公開に開示している（欧州特許第２２０５２７３号明細書）。
【0195】
Ｇｈｏｌａｍｚａｄら（Ｉｒａｎｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１７．１６（３）：２７１－２８１）は、ＭＳの疾患モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎に対して寛容原性効果を有するミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）被覆ＰＬＧＡ微粒子の静脈内注射を含むレジメンを開示している。
【0196】
Ｐｕｊｏｌ－Ａｕｔｏｎｅｌｌら（Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ）．２０１７ Ｊｕｎ；１２（１１）：１２３１－１２４２．Ｄｏｉ：１０．２２１７／ｎｎｍ－２０１６－０４１０）は、ＭＯＧペプチドを抗原として用いて、多発性硬化症疾患モデルに対して治療効果を有するホスファチジルセリン－リポソームに基づく免疫療法を用いるレジメンを開示している。
【0197】
Ｐｅａｒｓｏｎら（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ｊｕｌ ５；２５（７）：１６５５－１６６４．Ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０４．０１５）は、多発性硬化症のマウスモデルである再発寛解型実験的自己免疫性脳脊髄炎（Ｒ－ＥＡＥ）に対してポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）にコンジュゲートした抗原性ＭＯＧペプチドを用いた実験プロトコルを報告した。ポリマーにコンジュゲートしたペプチドは、疾患の抑制に有効であった。
【0198】
上記のレジメン及びプロトコルのいずれも、第１の態様に従うように抗原ペプチドを改変することにより、第１の態様の組成物とともに使用することができる。
【0199】
遺伝子治療
一般的に言えば、第２の態様の核酸は、患者の細胞、好ましくは抗原提示細胞での発現を可能にするプロモーターに作動可能に結合したベクターに含まれることが好ましい。ベクターは、遺伝子導入ベクター、又は当技術分野で知られているウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターもしくはアデノウイルスベクターであってよい。エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション又は流体力学的送達など、当技術分野で知られている任意の方法によって、裸のＤＮＡ遺伝子導入ベクターを投与してもよい。使用され得るベクター送達を強化する化学的方法には、リポソーム、リポフレックス（ｌｉｐｏｆｌｅｘ）、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、無機もしくは有機ナノ粒子、又は細胞透過性ペプチドが挙げられる。
一般的に言えば、第２の態様の核酸は、患者の細胞、好ましくは抗原提示細胞での発現を可能にするプロモーターに作動可能に結合したベクターに含まれることが好ましい。ベクターは、遺伝子導入ベクター、又は当技術分野で知られているウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクターもしくはアデノウイルスベクターであってよい。エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション又は流体力学的送達など、当技術分野で知られている任意の方法によって、裸のＤＮＡ遺伝子導入ベクターを投与してもよい。使用され得るベクター送達を強化する化学的方法には、リポソーム、リポフレックス（ｌｉｐｏｆｌｅｘ）、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、無機もしくは有機ナノ粒子、又は細胞透過性ペプチドが挙げられる。
【0200】
治療用Ｔ細胞エピトープをコードする配列の発現が望まれる組織に応じて、好適なプロモーターが当技術分野で知られている。
【0201】
Ｋｅｅｌｅｒら（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１８ Ｊａｎ ３；２６（１）：１７３－１８３）は、肝細胞で完全長ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）を発現する肝標的遺伝子導入ベクターを用いて、遺伝子治療誘導抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）がＭＳの神経炎症を阻害し、疾患を逆転させることができることを実証している。使用される材料及び方法は、第２の態様による治療方法に適用してもよく、発現される核酸配列の改変は、第２の態様に関して本明細書に定義される治療用Ｔ細胞エピトープに置き換えられる。
【0202】
抗原提示細胞を用いた治療
第３の態様の抗原提示細胞は、樹状細胞、単球、マクロファージ又はＢ細胞であり得、好ましくは末梢血単核球に由来し得る。或いは、抗原提示細胞は、ＣＮＳ由来であり得るミクログリアであってよい。好ましくは、細胞は患者にとって自己由来であるが、ＭＨＣ受容体に関してドナーに適合した異なる個体に由来するものであってもよい。
第３の態様の抗原提示細胞は、樹状細胞、単球、マクロファージ又はＢ細胞であり得、好ましくは末梢血単核球に由来し得る。或いは、抗原提示細胞は、ＣＮＳ由来であり得るミクログリアであってよい。好ましくは、細胞は患者にとって自己由来であるが、ＭＨＣ受容体に関してドナーに適合した異なる個体に由来するものであってもよい。
【0203】
さらに、異なる個体又は異なる種由来の遺伝子操作されたＡＰＣ細胞株の使用も想定され、ここでＭＨＣ受容体は、患者に適合するように遺伝子操作される。
【0204】
細胞がエピトープを取り込み、患者に投与された後に患者の免疫系にエピトープを提示するように、細胞が第３の態様の組成物（治療用Ｔ細胞エピトープ）にエクスビボで曝露される。細胞は表面にポリペプチドを提示する前にポリペプチドを処理及び消化するため、比較的大きなタンパク質又はいくつかの異なるタンパク質の一部としてエピトープが細胞に与えられ得る。エピトープが細胞で発現されるように、治療用Ｔ細胞エピトープをコードする核酸構築物を細胞にトランスフェクトすることも同様に適用可能であろう。
【0205】
Ｐｈｉｌｌｉｐｓら（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７； ８：１２７９）は、ＭＳ及び他の自己免疫疾患について、寛容原性樹状細胞を用いて計画され、進行中の臨床試験についてレビュー論文で考察している。
【0206】
Ｊｏｎｅｓ及びＨａｗｉｇｅｒ（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７ Ｍａｙ ９；８：５３２．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１７．００５３２）は、関連する神経抗原に対する寛容原性応答の際に末梢免疫系で胸腺外に形成された抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞（ｐＴｒｅｇ細胞）によって、神経炎症を改善したり、さらには完全に予防したりすることができることを示す実験、及びＭＳ治療に対するこれらの知見の関連性について考察している。
【0207】
Ｉｂｅｒｇら（Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７ Ｎｏｖ；３８（１１）：７９３－８０４．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｔ．２０１７．０７．００７）は、臨床現場での寛容誘導に、Ｔ細胞抗原の特異的な送達によって強化される樹状細胞の機能をどのように生かすことができるかについて考察している。
【0208】
Ｈｕａｎｇらは、Ｌｅｗｉｓラットでは自己抗原パルス樹状細胞が実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）に対する寛容を誘導することを報告している（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ （２０００） １２２（３）：４３７－４４．ｄｏｉ：１０．１０４６／ｊ．１３６５－２２４９．２０００．０１３９８．ｘ）。
【0209】
Ｍｅｎｇｅｓらは、腫瘍壊死因子αによって成熟した樹状細胞の反復注射が、自己免疫からのマウスの抗原特異的保護を誘導することを報告している（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ （２００２） １９５（１）：１５－２１．Ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２００１１３４１）。
【0210】
上記の元の試験及びレビュー（そこで引用された元の試験を含む）で考察された手段及び方法は、本発明の治療用Ｔ細胞エピトープの組成物とともに使用するように適合させることができる。
【0211】
多発性硬化症（ＭＳ）関連自己免疫の程度を決定する方法
第４の態様では、本発明は、被験者の多発性硬化症（ＭＳ）関連自己免疫の程度を決定する方法であって、
ａ．生存可能なＴ細胞を含む、被験者に由来する試験試料を提供することと、
ｂ．ＭＳ抗原に対応する特異的Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原に応答した試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化をインビトロで定量することと、ここで、上記Ｔ細胞エピトープは、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含み、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列が、
ｉ．配列番号５の部分配列と同一であるか、
ｉｉ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎが少なくとも８であり、ｍが０、１又は２であり、
ｃ．定量された抗原特異的活性化と、関連する参照とを比較して、被験者のＭＳ関連自己免疫の程度を決定することとを含む方法を提供する。
第４の態様では、本発明は、被験者の多発性硬化症（ＭＳ）関連自己免疫の程度を決定する方法であって、
ａ．生存可能なＴ細胞を含む、被験者に由来する試験試料を提供することと、
ｂ．ＭＳ抗原に対応する特異的Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原に応答した試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化をインビトロで定量することと、ここで、上記Ｔ細胞エピトープは、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含み、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列が、
ｉ．配列番号５の部分配列と同一であるか、
ｉｉ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により配列番号５の部分配列とは異なり、
ｎが少なくとも８であり、ｍが０、１又は２であり、
ｃ．定量された抗原特異的活性化と、関連する参照とを比較して、被験者のＭＳ関連自己免疫の程度を決定することとを含む方法を提供する。
【0212】
第４の態様の被験者の多発性硬化症（ＭＳ）関連自己免疫の程度を決定する方法は、
ａ．生存可能なＴ細胞を含む、被験者から得られた試験試料を提供することと、
ｂ．ＭＳ抗原に対応する特異的Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原に応答した試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化をインビトロで定量することと、
ｃ．定量された抗原特異的活性化と、関連する参照とを比較して、被験者のＭＳ関連自己免疫の程度を決定することとを含んでもよく、
ＭＳ抗原は、ＦＡＢＰ７（配列番号１）、ＰＲＯＫ２（配列番号２）、ＲＴＮ３（配列番号３）及びＳＮＡＰ９１（配列番号４）からなる群から選択され、
上記Ｔ細胞エピトープは、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含み、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列は、
ｉ．選択されたＭＳ抗原の部分配列と同一であるか、
ｉｉ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により、選択されたＭＳ抗原の部分配列とは異なり、
ｎは少なくとも８であり、ｍは０、１又は２である。
ａ．生存可能なＴ細胞を含む、被験者から得られた試験試料を提供することと、
ｂ．ＭＳ抗原に対応する特異的Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原に応答した試験試料のＴ細胞の抗原特異的活性化をインビトロで定量することと、
ｃ．定量された抗原特異的活性化と、関連する参照とを比較して、被験者のＭＳ関連自己免疫の程度を決定することとを含んでもよく、
ＭＳ抗原は、ＦＡＢＰ７（配列番号１）、ＰＲＯＫ２（配列番号２）、ＲＴＮ３（配列番号３）及びＳＮＡＰ９１（配列番号４）からなる群から選択され、
上記Ｔ細胞エピトープは、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含み、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列は、
ｉ．選択されたＭＳ抗原の部分配列と同一であるか、
ｉｉ．ｍ個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により、選択されたＭＳ抗原の部分配列とは異なり、
ｎは少なくとも８であり、ｍは０、１又は２である。
【0213】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）が試験抗原を消化することを考慮すれば、実質的に任意の比較的大きなポリペプチド試験抗原（例えば、遺伝子工学による）にＴ細胞エピトープを含めることができることに留意すべきである。試験抗原は消化されるため、特異的Ｔ細胞エピトープが試験抗原に見出される状況が変化することはない。したがって、試験抗原がその配列の一部として新規ＭＳ抗原ＦＡＢＰ７、ＰＲＯＫ２、ＲＴＮ３及びＳＮＡＰ９１（いずれも配列番号５に含まれる）のうちの１つに対応する特異的Ｔ細胞エピトープを含む限り、任意の試験抗原を使用することができる。
【0214】
背景の節で述べたように、最短のエピトープは典型的には８アミノ酸長であるが、個々の場合に応じて長くすることができる。したがって、本発明は、Ｔ細胞エピトープが、ｎ個のアミノ酸の連続するストレッチについて少なくとも類似性を共有する配列番号５（すなわち、新規ＭＳ抗原の１つ）に対して配列同一性又は類似性を有することを必要とする。
【0215】
ｎの値は、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であり得る。好ましくは、ｎは少なくとも１１であり、さらに好ましくはｎは少なくとも１３であり、なお一層好ましくはｎは少なくとも１５であり、さらになお好ましくはｎは少なくとも１７であり、さらに一層好ましくはｎは少なくとも１９である。或いは、ｎは、少なくとも５０、好ましくは少なくとも７５、又は最も好ましくは少なくとも１００であり得る。ｎは、前述の数値から形成される任意の区間、例えば８～２２、９～２１、８～１７、８～１５、８～１２又は８～１００であり得る。最も好ましくは、ｎは、８～１９、又はｍ＝０の場合、８～１７である。
【0216】
好ましくは、Ｔ細胞エピトープは部分配列と同一である（ｍ＝０）。ただし、ほとんどの場合、配列をわずかに変化させ、機能的に完全に又は実質的に同等の、ＭＳ抗原に対応する特異的Ｔ細胞エピトープを依然として有することが可能である。例えば、あるアミノ酸を、極性、電荷又は疎水性に関して同様の特性を有する別のアミノ酸に置換することが許容され得る。特異的Ｔ細胞エピトープ内の小さな挿入又は欠失も、それらが、選択されたＭＳ抗原に対応する機能的に完全又は実質的に同等の特異的Ｔ細胞エピトープをもたらすことを条件に許容され得る。
【0217】
好ましくは、差は置換のみであり、すなわち、欠失又は挿入はない。さらに好ましくは、差は、あるアミノ酸を、極性、電荷及び／又は疎水性に関して同様の特徴を有する別のアミノ酸に置換することを含む置換のみである。好ましくは、ｍは２であり、さらに好ましくはｍは１であり、最も好ましくはｍは０である。
【0218】
好ましくは、抗原特異的活性化は、ＦＡＢＰ７（配列番号１）、ＰＲＯＫ２（配列番号２）、ＲＴＮ３（配列番号３）及びＳＮＡＰ９１（配列番号４）からなる群から選択される異なるＭＳ抗原に対応する特異的Ｔ細胞エピトープをそれぞれ含む少なくとも２つ、３つ又は４つの試験抗原に対して定量される。例２に示すように、あらゆるＭＳ患者がいずれの新規ＭＳ抗原に対してもＴ細胞関連自己免疫を示すわけではない。したがって、特にスクリーニング設定では、異なるＭＳ抗原から同時に得られる複数の特異的Ｔ細胞エピトープに対して、被験者のＭＳ関連自己免疫を試験することが有利である。また、新規ＭＳマーカーに対する自己免疫の決定は、他の既知のＭＳマーカーの決定と有利に組み合わせることができると考えられる。
【0219】
特異的Ｔ細胞エピトープを含む試験抗原は、配列番号１～４、配列番号５又は配列番号６のいずれかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するペプチド又はペプチド模倣体であってよい。
【0220】
診断方法における部分配列
第４の態様の部分配列は、ｉ）配列番号５の残基１～１６６、ｉｉ）配列番号５の残基１６７～２９５、ｉｉｉ）配列番号５の残基２９６～１３２７、ｉｖ）配列番号５の残基１３２８～２２３４又はｖ）配列番号５の残基２２３５～２２５０に含まれ得る。好ましくは、部分配列は、ｖｉ）配列番号５の残基１～２２３４に含まれる。
第４の態様の部分配列は、ｉ）配列番号５の残基１～１６６、ｉｉ）配列番号５の残基１６７～２９５、ｉｉｉ）配列番号５の残基２９６～１３２７、ｉｖ）配列番号５の残基１３２８～２２３４又はｖ）配列番号５の残基２２３５～２２５０に含まれ得る。好ましくは、部分配列は、ｖｉ）配列番号５の残基１～２２３４に含まれる。
【0221】
第４の態様の方法は、上記で定義された複数の異なるＴ細胞エピトープに応答する抗原特異的活性化を定量することを含んでもよい。好ましくは、複数の異なるＴ細胞エピトープは、ｉ）～ｖｉ）として上記で提示された異なる区間のうちの２つ、３つ、４つ、５つ又は６つから選択される。
【0222】
第４の態様の方法は、各々が上記の基準を満たす２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、１００又はそれ以上などの複数の治療用Ｔ細胞エピトープに応答する抗原特異的活性化を定量することを含み得ることが好ましい。
【0223】
部分配列は、表４のペプチドの配列のいずれか１つに含まれてもよい。好ましくは、部分配列は、ＨＬＡ結合が「＋＋」又は「＋＋＋」、最も好ましくは「＋＋＋」として示される表４のペプチドの配列のいずれか１つに含まれる。
【0224】
部分配列は、例で使用される特異的抗原タンパク質に対応する、本明細書に記載のＭＳ抗原の特異的部分に由来することが好ましい場合がある。
【0225】
上記部分配列は、ＦＡＢＰ７（配列番号１）の残基１～８２、残基８３～１６６又は残基１０５～１６６の配列に含まれてもよい。
【0226】
上記部分配列は、ＰＲＯＫ２（配列番号２）の残基３４～７４又は残基１０６～１２８の配列に含まれてもよい。
【0227】
上記部分配列は、ＲＴＮ３（配列番号３）の残基８１～２１７又は残基３４５～４８３の配列に含まれてもよい。
【0228】
上記部分配列は、ＳＮＡＰ９１（配列番号４）の残基３７８～４８０、残基４８１～５７２又は残基５８４～６９１の配列に含まれてもよい。
【0229】
被験者
対象は、診断されたＭＳ患者、又はＭＳを有する疑いのある個体であり得る。好ましくは、対象はヒトである。
対象は、診断されたＭＳ患者、又はＭＳを有する疑いのある個体であり得る。好ましくは、対象はヒトである。
【0230】
試験試料
試験試料は、好ましくは血液試料に由来し、さらに好ましくはＰＢＭＣ試料である。
試験試料は、好ましくは血液試料に由来し、さらに好ましくはＰＢＭＣ試料である。
【0231】
最も好ましくは、試験試料は、試料のＴ細胞に試験抗原を提示するために使用することができる抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含む。定量に同一個体由来のＡＰＣを利用することによって（詳細は以下）、ＡＰＣ上のＭＣＨ受容体の個々の遺伝的変異から生じる不確実性が排除される。
【0232】
特異的Ｔ細胞活性化を決定する好ましい方法の詳細
本発明者によって、ＭＳ関連自己免疫を決定するのに有用なＴ細胞反応性プラットフォームが、ＰＣＴ／欧州特許第２０１６／０８１１４１号明細書に以前に開示されている。
本発明者によって、ＭＳ関連自己免疫を決定するのに有用なＴ細胞反応性プラットフォームが、ＰＣＴ／欧州特許第２０１６／０８１１４１号明細書に以前に開示されている。
【0233】
本発明の方法は、
ａ．生存可能な抗原提示細胞を提供することと、
ｂ．試験抗原と抗原提示細胞とを接触させることと、
ｃ．抗原提示細胞によって提示された抗原に応答してＴ細胞の抗原特異的活性化が可能になる条件下で、試験試料と、試験抗原と接触させた抗原提示細胞とをインビトロで接触させることと、
ｄ．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化を定量することとをさらに含んでもよい。
ａ．生存可能な抗原提示細胞を提供することと、
ｂ．試験抗原と抗原提示細胞とを接触させることと、
ｃ．抗原提示細胞によって提示された抗原に応答してＴ細胞の抗原特異的活性化が可能になる条件下で、試験試料と、試験抗原と接触させた抗原提示細胞とをインビトロで接触させることと、
ｄ．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化を定量することとをさらに含んでもよい。
【0234】
抗原提示細胞は、被験者に由来することが好ましい。
【0235】
該方法は、貪食可能な粒子に緊密に会合した試験抗原を提供することを含んでもよい。粒子は、試験抗原とともに抗原提示細胞によって貪食される。試験抗原はＡＰＣによって酵素的に消化され、消化された抗原エピトープはＴ細胞に提示される。
【0236】
試験抗原を貪食可能な粒子に緊密に会合させることの特別な利点は、変性洗浄によって、あらゆる汚染エンドトキシンを除去することができることである。残念ながら、Ｔ細胞活性化を決定するアッセイに共通する問題は、Ｔ細胞と接触するエンドトキシンが低レベルであっても、通常非常に低いレベルの抗原特異的活性化をマスクする活性化を生じることである。試験されているＴ細胞集団のうち、特定の抗原に抗原特異的に応答するのはごく一部であるが（最近その抗原に遭遇した対象の血中では約１／１００００である）、細胞の大部分がエンドトキシンに応答して高レベルのバックグラウンドを生じる。どこにでも存在するエンドトキシン汚染を考えると、これは実用面で大きな問題となる可能性がある。
【0237】
したがって、該方法は、（ａ’）貪食可能な粒子に試験抗原を緊密に会合させる工程、及び／又は（ａ’’）粒子に会合した試験抗原を変性洗浄に供し、後続の工程を妨害しないほどエンドトキシンのレベルを十分に低くする工程をさらに含んでもよい。
【0238】
粒子は、５．６μｍ未満、好ましくは４μｍ未満、さらに好ましくは３μｍ未満、さらに一層好ましくは０．５～２μｍの区間又は最も好ましくは約１μｍの最大寸法を有することが好ましい。粒子は好ましくは実質的に球形である。
【0239】
変性洗浄は、会合した試験抗原を有する粒子を、少なくともｐＨ１３、さらに好ましくは少なくともｐＨ１４、最も好ましくは少なくともｐＨ１４．３などの高ｐＨにさらすことを含んでもよい。変性洗浄は、会合した試験抗原を有する粒子を低ｐＨにさらすことを含んでもよい。変性洗浄は、会合した試験抗原を有する粒子を、少なくとも９０℃、さらに好ましくは少なくとも９２℃、最も好ましくは少なくとも９５°Ｃなどの高温にさらすことを含んでもよい。変性洗浄は、会合した試験抗原を有する粒子を、少なくとも５Ｍ、６Ｍ、７Ｍ又は８Ｍなどの十分な濃度で尿素又は塩酸グアニジンなどの変性剤にさらすことを含んでもよい。
【0240】
好ましくは、変性洗浄により、試験抗原中のエンドトキシン量が、該方法ではエンドトキシンの最終濃度が１００ｐｇ／ｍｌ未満、好ましくは５０ｐｇ／ｍｌ未満、さらに好ましくは２５ｐｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは１０ｐｇ／ｍｌ未満になるような量になる。
【0241】
粒子が常磁性特性を有すると有利であり、磁気保持により取り扱いが容易になる。
【0242】
好ましくは、試験抗原は粒子に共有結合しているか、金属キレートを介して粒子に結合している。
【0243】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）及びＴ細胞試料
本発明の文脈では、ＡＰＣは、単球／マクロファージ又は樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞である。ＡＰＣは、初代細胞又は不死化細胞であり得る。
本発明の文脈では、ＡＰＣは、単球／マクロファージ又は樹状細胞などの専門的な抗原提示細胞である。ＡＰＣは、初代細胞又は不死化細胞であり得る。
【0244】
ＡＰＣはＴ細胞試料のＴ細胞と適合していなければならず、その結果、Ｔ細胞が反応することができる抗原特異的な状況（ＭＨＣ拘束性）で、ＡＰＣがＴ細胞に抗原を提示することができる。ＡＰＣ及びＴ細胞試料は、好ましくは同じ種から得られ、ＭＨＣ受容体に関してドナーに適合している。ただし、異なる種から得られた遺伝子組換えＡＰＣの使用も想定されている。
【0245】
抗原提示細胞とＴ細胞試料とが同じ個体に由来する場合、ＡＰＣとＴ細胞との間のミスマッチの可能性は回避される。
【0246】
抗原提示細胞及びＴ細胞試料は同じ血液試料に由来してもよく、これは実際的な観点から有利である。抗原提示細胞及びＴ細胞試料は、同じ個体から得られたＰＢＭＣ試料に由来してもよい。末梢血試料からＰＢＭＣを得ることは、通常のプロトコルであり、同時に、かつ同じ個体からのＡＰＣ及びＴ細胞の両方の便利な供給源を提供する。
【0247】
ＰＢＭＣ試料は、新鮮なものを使用してもよく、凍結されてもよい。凍結細胞を使用するという可能性は、物流の観点から大きな実用的な利点である。
【0248】
Ｔ細胞試料は、腫瘍、好ましくは腫瘍のリンパ管に由来し得る。
【0249】
Ｔ細胞試料はまた、腹水に由来し得る。
【0250】
Ｔ細胞試料は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞をともに含む全ＰＢＭＣ、精製されたＴ細胞集団、又は特定のＴ細胞集団を欠いたＰＢＭＣを含み得る。
【0251】
抗原特異的Ｔ細胞活性化の定量
抗原特異的Ｔ細胞活性化の定量は、
ａ．緊密に会合した試験抗原を有する貪食可能な粒子を提供する工程と、ここで、会合した試験抗原を有する粒子を変性洗浄に供し、後続の工程を妨害しないほどエンドトキシンのレベルを十分に低くし、
ｂ．生存可能な抗原提示細胞を提供する工程と、
ｃ．抗原提示細胞による粒子の貪食を可能にする条件下で、洗浄された粒子と抗原提示細胞とを接触させる工程と、
ｄ．生存可能なＴ細胞を含むアッセイ対象の試験試料を提供する工程と、
ｅ．抗原提示細胞によって提示された抗原に応答してＴ細胞の抗原特異的活性化が可能になる条件下で、試験試料と、粒子と接触させた抗原提示細胞とをインビトロで接触させる工程と、
ｆ．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化を定量する工程とを含んでもよい。
抗原特異的Ｔ細胞活性化の定量は、
ａ．緊密に会合した試験抗原を有する貪食可能な粒子を提供する工程と、ここで、会合した試験抗原を有する粒子を変性洗浄に供し、後続の工程を妨害しないほどエンドトキシンのレベルを十分に低くし、
ｂ．生存可能な抗原提示細胞を提供する工程と、
ｃ．抗原提示細胞による粒子の貪食を可能にする条件下で、洗浄された粒子と抗原提示細胞とを接触させる工程と、
ｄ．生存可能なＴ細胞を含むアッセイ対象の試験試料を提供する工程と、
ｅ．抗原提示細胞によって提示された抗原に応答してＴ細胞の抗原特異的活性化が可能になる条件下で、試験試料と、粒子と接触させた抗原提示細胞とをインビトロで接触させる工程と、
ｆ．試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化を定量する工程とを含んでもよい。
【0252】
試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化の定量は、ＥＬＩＳｐｏｔもしくはＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ技術を使用して、又はＴ細胞増殖を測定することにより行われてもよい。本例はリードアウトとして特定のサイトカインの発現を使用するが、抗原特異的Ｔ細胞活性化を決定するために使用することができる多くの追加の方法があることに留意することが重要である。例えば、Ｔ細胞増殖をリードアウトとして使用することが（有用性はＰＣＴ／欧州特許第２０１６／０８１１４１号明細書で以前に実証されている）、任意の特異的なサイトカインを測定する必要性を排除するために使用され得る。
【0253】
試験試料の抗原特異的Ｔ細胞活性化の定量は、好ましくは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１７及び／又はＩＬ－２２の分泌を測定することによりＴ細胞応答を決定することを含んでもよい。これらの中では、最も堅牢な結果が得られるため、ＩＬ－１７及びＩＬ－２２が特に好ましい（表３を参照）。
【0254】
好ましくは、試験細胞試料のＴ細胞活性化の定量は、試料中の活性化Ｔ細胞の割合を決定することを含む。試験細胞試料のＴ細胞活性化の定量は、２つの異なる測定を使用して検出された、試料の活性化Ｔ細胞の比率を決定することを含んでもよい。数値は、対数又は平方根をとるなどの数値演算によって正規化されてもよい。１つの特に好ましい定量は、ＩＦＮ－γ陽性細胞数の平方根からＩＬ－１７陽性細胞数を分割することによって得られる測定値を決定することを含む。
【0255】
関連する参照
好ましくは、定量された抗原特異的活性化と比較される関連する参照は、病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象から得られた参照試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化である。
好ましくは、定量された抗原特異的活性化と比較される関連する参照は、病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象から得られた参照試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化である。
【0256】
参照は、病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象のセットから得られた参照試料のセットの比較可能に定量された抗原特異的活性化の平均値であり得る。上記セットは、少なくとも１０例の参照対象を含み得る。
【0257】
参照は、異なる時点に採取された、同じ対象から得られた試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化であり得る。
【0258】
診断用途
該方法の診断的有用性を例３～７に示した。レシーバーオペレーター特性（ＲＯＣ）分析によって実証されるように、感度と選択性との間には常にトレードオフがある。病態の存在を結論付ける閾値を低く設定すると、感度は向上するが（すなわち、偽陰性の数が減少する）、選択性が低下するという代償を支払う（すなわち、偽陽性の数が増加する）。代わりに閾値を上げると、感度が低下し、選択性が向上する。設定に応じて、偽陰性及び偽陽性の許容値は異なる。例えば、何百万人もの人々が試験される集団全体のスクリーニングでは、偽陽性の数は非常に少なくなければならず、そうでなければ追跡を必要とする患者の数は圧倒的ものになる。一方、診断試験が患者１例の専門家による評価の一部として用いられ、診断に至る前に他のいくつかの因子が考慮される場合には、はるかに大きな割合の偽陽性が許容可能であると考えられる場合がある。したがって、結論を下すための閾値は、ほとんどの場合、分析が行われる設定を考慮して設定する必要があり、一般的に適用可能な閾値を決定することは適切でも必要でもない。
該方法の診断的有用性を例３～７に示した。レシーバーオペレーター特性（ＲＯＣ）分析によって実証されるように、感度と選択性との間には常にトレードオフがある。病態の存在を結論付ける閾値を低く設定すると、感度は向上するが（すなわち、偽陰性の数が減少する）、選択性が低下するという代償を支払う（すなわち、偽陽性の数が増加する）。代わりに閾値を上げると、感度が低下し、選択性が向上する。設定に応じて、偽陰性及び偽陽性の許容値は異なる。例えば、何百万人もの人々が試験される集団全体のスクリーニングでは、偽陽性の数は非常に少なくなければならず、そうでなければ追跡を必要とする患者の数は圧倒的ものになる。一方、診断試験が患者１例の専門家による評価の一部として用いられ、診断に至る前に他のいくつかの因子が考慮される場合には、はるかに大きな割合の偽陽性が許容可能であると考えられる場合がある。したがって、結論を下すための閾値は、ほとんどの場合、分析が行われる設定を考慮して設定する必要があり、一般的に適用可能な閾値を決定することは適切でも必要でもない。
【0259】
試験試料の定量された抗原特異的活性化が、参照の少なくとも２倍、好ましくは３倍、さらに好ましくは５倍、最も好ましくは１０倍である場合、ＭＳ関連自己免疫の程度の増加が結論付けられ得る。
【0260】
試験試料の定量された抗原特異的活性化が、病理学的ＭＳ関連自己免疫のない参照対象のセットから得られた比較可能に定量された参照試料のセットの平均よりも、参照試料のセットの標準偏差の２倍だけ高い場合、ＭＳ関連自己免疫の程度の増加が結論付けられ得る。
【0261】
試験試料の定量された抗原特異的活性化が、スチューデントのＴ検定によって計算された０．０５未満のｐ値を伴って参照よりも統計的に有意に高い場合、ＭＳ関連自己免疫の程度の増加が結論付けられ得る。
【0262】
試験試料の定量された抗原特異的活性化が、マン・ホイットニーのＵ検定によって計算された０．０５未満のｐ値を伴って参照よりも統計的に有意に高い場合、ＭＳ関連自己免疫の程度の増加が結論付けられ得る。
【0263】
特定の設定での適用
第４の態様による方法が提供され、
ａ．方法は、対象のＭＳを診断するためのものであり、
ｂ．参照は、病理学的多発性硬化症関連自己免疫のない参照対象の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者が多発性硬化症であることを示す。
第４の態様による方法が提供され、
ａ．方法は、対象のＭＳを診断するためのものであり、
ｂ．参照は、病理学的多発性硬化症関連自己免疫のない参照対象の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者が多発性硬化症であることを示す。
【0264】
上記方法は、患者のＭＳの存在を検出するために特に適合されている。
【0265】
第４の態様による方法が提供され、
ａ．方法は、対象のＭＳの経過を追跡するためのものであり、
ｂ．参照は、同じ対象から異なる時点（好ましくは早期）に採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性が高いことを示し、逆もまた同様である。
ａ．方法は、対象のＭＳの経過を追跡するためのものであり、
ｂ．参照は、同じ対象から異なる時点（好ましくは早期）に採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性が高いことを示し、逆もまた同様である。
【0266】
上記方法は、ＭＳに罹患していることが既にわかっている対象のＭＳの経過を追跡するために特に適合されている。
【0267】
第４の態様による方法が提供され、
ａ．方法は、対象のＭＳ経過の予後を確認するためのものであり、
ｂ．参照は、同じ対象から早い時点に採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性が増大していることを示し、逆もまた同様である。
ａ．方法は、対象のＭＳ経過の予後を確認するためのものであり、
ｂ．参照は、同じ対象から早い時点に採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性が増大していることを示し、逆もまた同様である。
【0268】
上記方法は、ＭＳに罹患していることが既にわかっている対象のＭＳ経過の予後を確認するために特に適合されている。ＭＳは間欠的な回復を伴う再燃を特徴とすることから、起こりつつある再燃を事前に検出し、治療を事前に実施することができるようにすることは価値がある。
【0269】
第４の態様による方法が提供され、
ａ．方法は、治療的処置に対する対象の応答を評価するためのものであり、
ｂ．参照は、評価対象の治療的処置の実施前に同じ対象から採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．試験試料は、治療的処置の開始後、同じ対象から得られたものであり、
ｄ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が低ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性に対する治療効果を示し、定量された抗原特異的活性化の程度が変わらないか高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性に対する治療効果の欠如を示す。
ａ．方法は、治療的処置に対する対象の応答を評価するためのものであり、
ｂ．参照は、評価対象の治療的処置の実施前に同じ対象から採取された試料の比較可能に定量された抗原特異的活性化の代表であり、
ｃ．試験試料は、治療的処置の開始後、同じ対象から得られたものであり、
ｄ．参照と比較して、試験試料の定量された抗原特異的活性化の程度が低ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性に対する治療効果を示し、定量された抗原特異的活性化の程度が変わらないか高ければ、被験者の多発性硬化症疾患活動性に対する治療効果の欠如を示す。
【0270】
上記方法は、治療的処置に対する対象の応答を評価するために特に適合されている。特に、該方法は、個々の患者に適切な薬物を選択し、個々の患者のための用量を把握するための臨床試験を実施する際に価値がある。
【0271】
ペプチド又はペプチド模倣体の使用
第５の態様では、ＭＳの診断又は治療でのペプチド又はペプチド模倣体の使用が提供され、ペプチド又はペプチド模倣体は配列番号５に含まれる特異的Ｔ細胞エピトープを含み、上記Ｔ細胞エピトープは、０、１又は２個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により、選択されたＭＳ抗原の部分配列とは異なる、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含む。この使用は、特に診断用途のために、インビトロであり得る。
第５の態様では、ＭＳの診断又は治療でのペプチド又はペプチド模倣体の使用が提供され、ペプチド又はペプチド模倣体は配列番号５に含まれる特異的Ｔ細胞エピトープを含み、上記Ｔ細胞エピトープは、０、１又は２個以下の残基の置換、欠失及び／又は挿入により、選択されたＭＳ抗原の部分配列とは異なる、ｎ個の連続する残基のアミノ酸配列を含む。この使用は、特に診断用途のために、インビトロであり得る。
【0272】
部分配列は、配列番号５の残基１～１６６、配列番号５の残基１６７～２９５、配列番号５の残基２９６～１３２７、配列番号５の残基１３２８～２２３４、配列番号５の残基２２３５～２２５０又は配列番号５の残基１～２２３４から選択され得る。
【0273】
好ましくは、Ｔ細胞エピトープは、ＦＡＢＰ７アイソフォーム２（配列番号１）、ＰＲＯＫ２（配列番号２）、ＲＴＮ３（配列番号３）、ＳＮＡＰ９１（配列番号４）及びＦＡＢＰ７アイソフォーム１（配列番号６）からなる群から選択されるＭＳ抗原に対応し得る。
【0274】
ｎの値は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０であり得る。好ましくは、ｎは少なくとも１１であり、さらに好ましくはｎは少なくとも１３であり、なお一層好ましくはｎは少なくとも１５であり、さらになお好ましくはｎは少なくとも１７であり、さらに一層好ましくはｎは少なくとも１９である。好ましくは、ｍは１であり、さらに好ましくはｍは０である。
【0275】
第５の態様のＴ細胞エピトープは、第１の態様の治療用Ｔ細胞エピトープについて定義された通りであり得る。
【0276】
本開示に関する一般的な態様
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、限定するものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）ものとして解釈されるべきである。見出し及び小見出しを有する節に本開示を配置しているのは、単に見やすさを改善するためのものであり、いかなる様式にも限定するものと解釈すべきではなく、その分割は、異なる見出し及び小見出しでの特徴を互いに組み合わせることを除外又は限定しない。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、限定するものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）ものとして解釈されるべきである。見出し及び小見出しを有する節に本開示を配置しているのは、単に見やすさを改善するためのものであり、いかなる様式にも限定するものと解釈すべきではなく、その分割は、異なる見出し及び小見出しでの特徴を互いに組み合わせることを除外又は限定しない。
【0277】
すべての参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【0278】
例
以下の例は、限定とみなされるべきではない。実験の詳細に関する追加の情報については、当業者は、材料及び方法と題された別の節を参照されたい。
以下の例は、限定とみなされるべきではない。実験の詳細に関する追加の情報については、当業者は、材料及び方法と題された別の節を参照されたい。
【0279】
例１：ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ自己抗原スクリーニングによる多発性硬化症の自己抗原の同定
本発明者らは、Ｔ細胞活性化のアッセイとしてＩＦＮγ／ＩＬ－２２／ＩＬ－１７Ａ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを使用して、４５プールに分割されビーズに結合した１２５のＰｒＥＳＴのライブラリーに応答したＴ細胞活性化を測定した。スクリーニングでは、健常対照よりもＭＳ患者から得られたＰＢＭＣで高いＴ細胞応答を刺激する抗原プールを検出することにより、有力な自己抗原を同定した。図１に見られるように、患者１６例及び健常対照９例のこのスクリーニングでは、双方向ＡＮＯＶＡを使用して分析した際に、活性化された細胞の平均患者数と平均対照数との間に統計的有意差を認めることができた。ＩＬ－２２分泌活性化Ｔ細胞については、５つの抗原プール、抗原番号６（Ｐ＜０．０００１）、抗原番号１８（Ｐ＜０．０００１）、抗原番号２３（Ｐ＜０．０００１）、抗原番号２９（Ｐ＜０．０００１）及び抗原番号３３（Ｐ＜０．０５）に差が認められた（パネルａ）。ＩＬ－１７分泌Ｔ細胞については、同じ５つの抗原、抗原番号６（Ｐ＜０．０５）、抗原番号１８（Ｐ＜０．０００１）、抗原番号２３（Ｐ＜０．０１）、抗原番号２９（Ｐ＜０．０００１）及び抗原番号３３（Ｐ＜０．０５）に、患者と対照との間の差を認めることができた（パネルｂ）。ＩＦＮγについては、抗原番号１８（ｐ＜０．０００１）にのみ差を認めることができた（パネルｃ）。
本発明者らは、Ｔ細胞活性化のアッセイとしてＩＦＮγ／ＩＬ－２２／ＩＬ－１７Ａ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔを使用して、４５プールに分割されビーズに結合した１２５のＰｒＥＳＴのライブラリーに応答したＴ細胞活性化を測定した。スクリーニングでは、健常対照よりもＭＳ患者から得られたＰＢＭＣで高いＴ細胞応答を刺激する抗原プールを検出することにより、有力な自己抗原を同定した。図１に見られるように、患者１６例及び健常対照９例のこのスクリーニングでは、双方向ＡＮＯＶＡを使用して分析した際に、活性化された細胞の平均患者数と平均対照数との間に統計的有意差を認めることができた。ＩＬ－２２分泌活性化Ｔ細胞については、５つの抗原プール、抗原番号６（Ｐ＜０．０００１）、抗原番号１８（Ｐ＜０．０００１）、抗原番号２３（Ｐ＜０．０００１）、抗原番号２９（Ｐ＜０．０００１）及び抗原番号３３（Ｐ＜０．０５）に差が認められた（パネルａ）。ＩＬ－１７分泌Ｔ細胞については、同じ５つの抗原、抗原番号６（Ｐ＜０．０５）、抗原番号１８（Ｐ＜０．０００１）、抗原番号２３（Ｐ＜０．０１）、抗原番号２９（Ｐ＜０．０００１）及び抗原番号３３（Ｐ＜０．０５）に、患者と対照との間の差を認めることができた（パネルｂ）。ＩＦＮγについては、抗原番号１８（ｐ＜０．０００１）にのみ差を認めることができた（パネルｃ）。
【0280】
図２は、上記の抗原プールに対する個々の患者及び対照の活性化と同じ提示されたデータを示す。
【0281】
例２：抗原プールに含まれる免疫原性抗原の決定。
例１に記載の抗原プール１８、２３、２６及び２９を、それらに含まれる個々のタンパク質に分割した。この個々のタンパク質に対する活性化について、例１でこれらの特異的な抗原プールに対して高度のＴ細胞活性化を示した４例の患者由来のＰＢＭＣを再度試験した。使用した方法及びプロトコルは、例１と同じであった。各プールで、１つの特異的なタンパク質が、明らかな大部分のＴ細胞活性化を誘導した。試験したタンパク質は、以下の通りであった。抗原プール１８、番号１ ＣＹＢ５６１Ｄ２及び番号２ ＦＡＢＰ７（配列番号１）。番号１ ＮＯＶＡ２及び番号２ ＰＲＯＫ２（配列番号２）を含む抗原プール２３。番号１ ＲＴＮ３（配列番号３）及び番号２ ＳＤＫ２を含む抗原プール２６。番号１ ＳＮＡＰ２５及び番号２ ＳＮＡＰ９１（配列番号４）を含む抗原プール２９。結果を図３に示す。
例１に記載の抗原プール１８、２３、２６及び２９を、それらに含まれる個々のタンパク質に分割した。この個々のタンパク質に対する活性化について、例１でこれらの特異的な抗原プールに対して高度のＴ細胞活性化を示した４例の患者由来のＰＢＭＣを再度試験した。使用した方法及びプロトコルは、例１と同じであった。各プールで、１つの特異的なタンパク質が、明らかな大部分のＴ細胞活性化を誘導した。試験したタンパク質は、以下の通りであった。抗原プール１８、番号１ ＣＹＢ５６１Ｄ２及び番号２ ＦＡＢＰ７（配列番号１）。番号１ ＮＯＶＡ２及び番号２ ＰＲＯＫ２（配列番号２）を含む抗原プール２３。番号１ ＲＴＮ３（配列番号３）及び番号２ ＳＤＫ２を含む抗原プール２６。番号１ ＳＮＡＰ２５及び番号２ ＳＮＡＰ９１（配列番号４）を含む抗原プール２９。結果を図３に示す。
【0282】
例３：反応性プロファイルに基づく患者のグループ化。
個々の対象のレベルで４つの候補自己抗原に対するＴ細胞活性化を分析した際に、患者間に４つの異なる反応性プロファイルが観察された。候補抗原全種を用いて刺激すると、番号２６を除いて、４例の患者が応答し、全サイトカインを産生する細胞の顕著な活性化を示し、これを「プロファイル１ａ」と名付けた。５例の患者が、番号１８及び１つ又は２つ以上の抗原に対して応答し、全サイトカインを産生する細胞の顕著な活性化を示し、これを「プロファイル１ｂ」と名付けた。３例の患者が番号２６に対して応答し、ＩＦＮγ産生細胞のみの活性化を示し、これを「プロファイル２」と名付けた。４例の患者には応答が認められず、これを「プロファイル３」と名付けた。プロファイルを図４に示す。
個々の対象のレベルで４つの候補自己抗原に対するＴ細胞活性化を分析した際に、患者間に４つの異なる反応性プロファイルが観察された。候補抗原全種を用いて刺激すると、番号２６を除いて、４例の患者が応答し、全サイトカインを産生する細胞の顕著な活性化を示し、これを「プロファイル１ａ」と名付けた。５例の患者が、番号１８及び１つ又は２つ以上の抗原に対して応答し、全サイトカインを産生する細胞の顕著な活性化を示し、これを「プロファイル１ｂ」と名付けた。３例の患者が番号２６に対して応答し、ＩＦＮγ産生細胞のみの活性化を示し、これを「プロファイル２」と名付けた。４例の患者には応答が認められず、これを「プロファイル３」と名付けた。プロファイルを図４に示す。
【0283】
【0284】
例４：診断用途のデモンストレーション
これらの抗原に対するＴ細胞活性化は、多発性硬化症のための診断ツール及びバイオマーカーとして使用することができる。例１から得られたデータに基づいて、レシーバーオペレーター特性（ＲＯＣ）曲線を作成して、Ｔ細胞活性化を診断ツールとして使用した場合の感度及び特異性を推定した。これらのグラフを図５Ａ～Ｆに、データを表１及び表３に示す。抗原番号１８（ＦＡＢＰ７ ＰｒＥＳＴを含む）又は完全長のＦＡＢＰ７アイソフォーム２（配列番号１）を用いて刺激した場合のＩＬ２２及びＩＬ１７産生Ｔ細胞の活性化は特に有望であり、それぞれ約８０％の感度及び特異性に達する。これらの抗原全種の混合物に対して患者及び対照のＰＢＭＣを試験すると、これらの数値がさらに向上する可能性が非常に高くなる。表２に見られるように、抗原２３及び２９の組合せは、それ自体で各抗原よりも感度の高い試験を提供する。
これらの抗原に対するＴ細胞活性化は、多発性硬化症のための診断ツール及びバイオマーカーとして使用することができる。例１から得られたデータに基づいて、レシーバーオペレーター特性（ＲＯＣ）曲線を作成して、Ｔ細胞活性化を診断ツールとして使用した場合の感度及び特異性を推定した。これらのグラフを図５Ａ～Ｆに、データを表１及び表３に示す。抗原番号１８（ＦＡＢＰ７ ＰｒＥＳＴを含む）又は完全長のＦＡＢＰ７アイソフォーム２（配列番号１）を用いて刺激した場合のＩＬ２２及びＩＬ１７産生Ｔ細胞の活性化は特に有望であり、それぞれ約８０％の感度及び特異性に達する。これらの抗原全種の混合物に対して患者及び対照のＰＢＭＣを試験すると、これらの数値がさらに向上する可能性が非常に高くなる。表２に見られるように、抗原２３及び２９の組合せは、それ自体で各抗原よりも感度の高い試験を提供する。
【0285】
全長タンパク質も同様に使用することができる。図９Ａ～Ｄを参照されたい。４つの全長抗原をいずれも利用し、４種に対する各個体の平均応答を使用すると、感度及び特異性がさらに向上する（図９Ｅ）。ＩＬ－１７とＩＦＮγとの比率を分析するなど、異なるリードアウトを組み合わせると、試験の感度をさらに向上させることができる（図９Ｅ、表２）。
【0286】
【表1】
【0287】
【表2】
【0288】
【表3】
【0289】
例５：全長組換えバージョンを使用したＭＳ抗原としてのＦＡＢＰ７の検証
組換え型のヒトＦＡＢＰ７アイソフォーム２（配列番号１）を大腸菌で生産した。このタンパク質は、標準的な大腸菌組換えタンパク質プロトコルに従って社内で生産した。これをｈｉｓタグ精製により精製し、常磁性ビーズに結合させ、前述のプロトコルに従って洗浄した。前述のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで、Ｔ細胞活性化について、１３例の患者（このうち７例は以前に試験登録した患者の新たなサンプリングからなり、６例は以前に試験していない）及び７例の対照（以前の試験に含めていない）を試験した。
組換え型のヒトＦＡＢＰ７アイソフォーム２（配列番号１）を大腸菌で生産した。このタンパク質は、標準的な大腸菌組換えタンパク質プロトコルに従って社内で生産した。これをｈｉｓタグ精製により精製し、常磁性ビーズに結合させ、前述のプロトコルに従って洗浄した。前述のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで、Ｔ細胞活性化について、１３例の患者（このうち７例は以前に試験登録した患者の新たなサンプリングからなり、６例は以前に試験していない）及び７例の対照（以前の試験に含めていない）を試験した。
【0290】
結果を図６に示す。例１及び３のＦＡＢＰ７ ＰｒＥＳＴの結果と、この例で使用した全長組換えバージョンとは、互いによく似ている。
【0291】
例６：特異的Ｔ細胞エピトープの同定
ＦＡＢＰ７大部分重複アイソフォーム２及び１（それぞれ、配列番号１及び配列番号６）並びにＰＲＯＫ２（配列番号２）の全長を網羅する重複ペプチド（１５アミノ酸長、１０アミノ酸重複）を、ＦＡＢＰ７については６つの画分、ＰＲＯＫ２については３つの画分にプールし、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ分析でＰＢＭＣを刺激するために使用した。これらのプールに対して、６例の患者由来のＰＢＭＣを試験した。図７Ａ及び図７Ｂが示すように、患者は各抗原の単一プール（ＦＡＢＰ７についてはプール５、ＰＲＯＫ２についてはプール１）に対して比較的高い応答を示した。この例は、さらに長いタンパク質を使用した以前の例と比較して、特異的Ｔ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を有する短いペプチドもＭＳ患者の自己反応性Ｔ細胞を同定するために使用することができることを示している。
ＦＡＢＰ７大部分重複アイソフォーム２及び１（それぞれ、配列番号１及び配列番号６）並びにＰＲＯＫ２（配列番号２）の全長を網羅する重複ペプチド（１５アミノ酸長、１０アミノ酸重複）を、ＦＡＢＰ７については６つの画分、ＰＲＯＫ２については３つの画分にプールし、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ分析でＰＢＭＣを刺激するために使用した。これらのプールに対して、６例の患者由来のＰＢＭＣを試験した。図７Ａ及び図７Ｂが示すように、患者は各抗原の単一プール（ＦＡＢＰ７についてはプール５、ＰＲＯＫ２についてはプール１）に対して比較的高い応答を示した。この例は、さらに長いタンパク質を使用した以前の例と比較して、特異的Ｔ細胞エピトープを含むアミノ酸配列を有する短いペプチドもＭＳ患者の自己反応性Ｔ細胞を同定するために使用することができることを示している。
【0292】
陽性ペプチドプールをさらに分割し、実験を反復して繰り返すことにより、各ＭＳ抗原内の特異的Ｔ細胞エピトープのさらに詳細な同定が可能になる。１５アミノ酸よりも短いペプチドを設計及び試験して、特異的Ｔ細胞エピトープを完全に解明することができる。
【0293】
有力なＴ細胞エピトープを発見するもう１つの相補的な方法が、ＨＬＡ結合実験を実施することである。競合結合アッセイで、多発性硬化症関連ＨＬＡ ＤＲＢ５ ０１：０１分子に対する結合親和性について、同じ重複ペプチドを試験した。次いで、結合親和性を、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスに由来する既知の強力なバインダーペプチドの結合親和性と比較した。ＦＡＢＰ７及びＰＲＯＫ２の両方について、患者も応答した同じペプチドプールで最も強い結合ペプチドが発見され、これがＴ細胞エピトープ候補であることが示された。結果を表４に示す。様々な結合親和性の代表的な例を図１０Ａ～Ｅに示す。
【0294】
【表4-1】
【表4-2】
【0295】
例７：組換え全長抗原を使用した自己抗原スクリーニングの検証
標準的な組換えタンパク質生産プロトコルに従って、大腸菌で抗原ＦＡＢＰ７（配列番号１）、ＰＲＯＫ２（配列番号２）、ＲＴＮ３（配列番号３）、ＳＮＡＰ９１（配列番号４）の組換え全長バージョンを社内で生産し、ｈｉｓタグ精製により精製した。前述のように、ＩＦＮγ／ＩＬ１７／ＩＬ２２ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで、抗原に対する反応性について、５２例の患者及び２４例の対照を試験した。以前に試験したＰｒＥＳＴと同様に、ＳＮＡＰ９１に対するＩＦＮγを除き、分析した全サイトカインについて全４種の抗原に対する多発性硬化症患者のＰＢＭＣの反応性が有意に高かった（図８Ａ～Ｄを参照）。
標準的な組換えタンパク質生産プロトコルに従って、大腸菌で抗原ＦＡＢＰ７（配列番号１）、ＰＲＯＫ２（配列番号２）、ＲＴＮ３（配列番号３）、ＳＮＡＰ９１（配列番号４）の組換え全長バージョンを社内で生産し、ｈｉｓタグ精製により精製した。前述のように、ＩＦＮγ／ＩＬ１７／ＩＬ２２ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで、抗原に対する反応性について、５２例の患者及び２４例の対照を試験した。以前に試験したＰｒＥＳＴと同様に、ＳＮＡＰ９１に対するＩＦＮγを除き、分析した全サイトカインについて全４種の抗原に対する多発性硬化症患者のＰＢＭＣの反応性が有意に高かった（図８Ａ～Ｄを参照）。
【0296】
例８：抗原特異的免疫療法
抗原特異的免疫療法では、以前に知られている多発性硬化症自己抗原ペプチドエピトープの皮下、皮内又は経皮投与を使用した先行試験が十分に説明されている。例えば、Ｗａｌｃｚａｋら（Ｗａｌｃｚａｋ Ａ，Ｓｉｇｅｒ Ｍ，Ｓｚｃｚｅｐａｎｉｋ Ｍ，Ｓｅｌｍａｊ Ｋ．Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３）は、既知の自己抗原であるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）由来の既知のエピトープの混合物を使用し、１年間にわたって経皮的に適用し、疾患活動性の顕著であるが中等度の低下をもたらした。Ｃｈａｔａｗａｙら（Ｃａｔｈａｗａｙ Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ Ｋ，Ｂａｒｒｅｌｌ Ｋ，Ｓｈａｒｒａｃｋ Ｂ，Ｓｔｏｌｔ Ｐ，Ｗｒａｉｔｈ ＤＣ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＴＸ－ＭＳ－１４６７ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｖｅｒ １６ ｗｅｅｋｓ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１８）は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）由来の４つのペプチドエピトープの混合物を用量を漸増して４週間かけて皮下注射し、続いて１６週間かけて最高用量を隔週投与した。同様に、顕著に良好であるが軽微な効果が認められた。これは、自己抗原に対するＴ細胞寛容の誘導を介した抗原特異的免疫療法の方法が有効な手法であることを示している。
抗原特異的免疫療法では、以前に知られている多発性硬化症自己抗原ペプチドエピトープの皮下、皮内又は経皮投与を使用した先行試験が十分に説明されている。例えば、Ｗａｌｃｚａｋら（Ｗａｌｃｚａｋ Ａ，Ｓｉｇｅｒ Ｍ，Ｓｚｃｚｅｐａｎｉｋ Ｍ，Ｓｅｌｍａｊ Ｋ．Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３）は、既知の自己抗原であるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）及びミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）由来の既知のエピトープの混合物を使用し、１年間にわたって経皮的に適用し、疾患活動性の顕著であるが中等度の低下をもたらした。Ｃｈａｔａｗａｙら（Ｃａｔｈａｗａｙ Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ Ｋ，Ｂａｒｒｅｌｌ Ｋ，Ｓｈａｒｒａｃｋ Ｂ，Ｓｔｏｌｔ Ｐ，Ｗｒａｉｔｈ ＤＣ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＴＸ－ＭＳ－１４６７ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｖｅｒ １６ ｗｅｅｋｓ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１８）は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）由来の４つのペプチドエピトープの混合物を用量を漸増して４週間かけて皮下注射し、続いて１６週間かけて最高用量を隔週投与した。同様に、顕著に良好であるが軽微な効果が認められた。これは、自己抗原に対するＴ細胞寛容の誘導を介した抗原特異的免疫療法の方法が有効な手法であることを示している。
【0297】
この文献で以前に記述された例、及びエピトープ－マッピングの既知の方法に基づいて、まず、ＦＡＢＰ７、ＰＲＯＫ２、ＲＴＮ３及びＳＮＡＰ９１の特異的ペプチドエピトープを同定する。次いで、前述のように、これらの自己抗原に対するＴ細胞反応性について患者をスクリーニングする。スクリーニングに基づいて、ペプチドエピトープの患者ベースの混合物を選択し、次いで、抗原特異的免疫療法について確立されたプロトコルに従って治療に用いる。以前に使用されたものよりも多くの自己抗原から得られたペプチドエピトープを用いて治療すると、個別化された手法（患者に関係のないペプチドエピトープは含まない）は同じままであるため、忍容性に対して、有効性が大きくなると予測することができる。
【0298】
材料及び方法
遊離カルボン酸基を含む常磁性ビーズに対するタンパク質の共有結合。
直径１μｍのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、製造業者のプロトコル（ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）及びＥＤＣ（エチルカルボジイミド）を使用した２段階の手順）に従って結合手順を実施した。
遊離カルボン酸基を含む常磁性ビーズに対するタンパク質の共有結合。
直径１μｍのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、製造業者のプロトコル（ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）及びＥＤＣ（エチルカルボジイミド）を使用した２段階の手順）に従って結合手順を実施した。
【0299】
ＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭ ＭＥＳ（２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸）、ｐＨ６）を用いて、ビーズを２回洗浄した。次いで、ＭＥＳ緩衝液中５０ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド）及び５０ｍｇ／ｍｌのＥＤＣ（Ｎ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド）をビーズに加えることによってカルボン酸基を活性化し、室温で３０分間インキュベートした。磁石を用いてビーズを回収し、上清を除去し、ＭＥＳ緩衝液を用いてビーズを２回洗浄した。タンパク質をＭＥＳ緩衝液で１ｍｇ／ｍｌの濃度、合計１００ｕｇになるまで希釈し、これをビーズに加え、室温で１時間インキュベートした。磁石を用いてビーズを回収し、上清を除去し、タンパク質濃度測定のために保存した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を用いて、未反応の活性化カルボン酸基を１５分間クエンチした。次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いてビーズを洗浄し、－８０℃で保存した。
【0300】
ビーズに結合したタンパク質の量を測定するために、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、結合前のタンパク質及び結合後の上清中のタンパク質濃度を測定した。製造業者のプロトコルに従って、ＢＣＡアッセイを使用した。
【0301】
変性洗浄によるエンドトキシンの除去。
ビーズを、大腸菌で生産された組換えタンパク質と結合させた。タンパク質結合ビーズをいくつかの異なる変性条件で洗浄して、エンドトキシンを確実に除去した。エンドトキシン除去のために、３種類の洗浄バッファー、２Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ１４．３）、０．５Ｍ Ｌ－アルギニン及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（いずれも室温で滅菌水中）を用いてビーズを洗浄した。ビーズを緩衝液に懸濁し、４分間振盪し、磁石を用いて回収し、上清を除去した。これを５回繰り返した。次いで、滅菌ＰＢＳを用いてビーズを５回洗浄して、残りの洗浄緩衝液を除去した。単球反応性アッセイ（ＩＬ１Ｂ／ＩＬ６ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイ、ＭＡＢＴＥＣＨ、スウェーデン）を使用して、残りのエンドトキシンを測定した。
ビーズを、大腸菌で生産された組換えタンパク質と結合させた。タンパク質結合ビーズをいくつかの異なる変性条件で洗浄して、エンドトキシンを確実に除去した。エンドトキシン除去のために、３種類の洗浄バッファー、２Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ１４．３）、０．５Ｍ Ｌ－アルギニン及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（いずれも室温で滅菌水中）を用いてビーズを洗浄した。ビーズを緩衝液に懸濁し、４分間振盪し、磁石を用いて回収し、上清を除去した。これを５回繰り返した。次いで、滅菌ＰＢＳを用いてビーズを５回洗浄して、残りの洗浄緩衝液を除去した。単球反応性アッセイ（ＩＬ１Ｂ／ＩＬ６ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイ、ＭＡＢＴＥＣＨ、スウェーデン）を使用して、残りのエンドトキシンを測定した。
【0302】
患者
ソールナ及びフーディンゲのカロリンスカ大学病院神経クリニックでナタリズマブ治療を受けた合計２４例のＭＳ患者に、通常の治療来院と同時に８０ｍｌの静脈血を提供するよう依頼した。その後の実験に使用するために、最初の採血から６～１２カ月後に、これらの患者のうち６例を再度採血した（例５）。
ソールナ及びフーディンゲのカロリンスカ大学病院神経クリニックでナタリズマブ治療を受けた合計２４例のＭＳ患者に、通常の治療来院と同時に８０ｍｌの静脈血を提供するよう依頼した。その後の実験に使用するために、最初の採血から６～１２カ月後に、これらの患者のうち６例を再度採血した（例５）。
【表5】
【0303】
施設及びクリニックのスタッフの間で、年齢及び性別がマッチした健常対照を採用した。対照に対して、患者と同じ採血手順を行った。
【0304】
標準プロトコルに従って、Ｆｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）勾配遠心分離によって、静脈血試料（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ＥＤＴＡ管に採取）からＰＢＭＣを分離した。細胞を凍結培地中（４５％ＦＣＳ、４５％ＲＰＭＩ、１０％ＤＭＳＯ）で凍結し、－１５０℃で保存した。
【0305】
全長抗原を試験するために、第２のさらに大規模のコホートを収集した。このコホートには、５２例の患者及び２４例の健常対照を含めた。包含／除外基準（表５）並びに採血及びＰＢＭＣ分離は同じであった。
【0306】
候補抗原ライブラリー
使用した抗原は、王立工科大学（ＫＴＨ、スウェーデン）及びＳｗｅｄｉｓｈ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓプロジェクトから入手した（Ｕｈｌｅｎ Ｍ，Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ Ｌ，Ｈａｌｌｓｔｒｏｍ ＢＭ，Ｌｉｎｄｓｋｏｇ Ｃ，Ｏｋｓｖｏｌｄ Ｐ，Ｍａｒｄｉｎｏｇｌｕ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｔｉｓｓｕｅ－ｂａｓｅｄ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４７（６２２０）：１２６０４１９）。それらは、ヒトタンパク質の固有の部分を表す短い組換え１０～１２ｋＤａペプチドであるタンパク質エピトープシグネチャータグ（ＰｒＥＳＴ）からなる。ＰｒＥＳＴを大腸菌で生産し、タグを介して精製した。以下の基準によって、このプロジェクトのＰｒＥＳＴを選択した。１）公開されたデータによると、ＭＳに関与すると想定されるタンパク質。２）ミエリンシートの主要な構造タンパク質。３）当該分野の専門家との情報交換により選択された目的のタンパク質。４）以前は疾患に関連していなかった高発現ＣＮＳ特異的タンパク質。この試験では、７０種類のタンパク質から得られた合計１２５のＰｒＥＳＴを使用した。
使用した抗原は、王立工科大学（ＫＴＨ、スウェーデン）及びＳｗｅｄｉｓｈ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｔｌａｓプロジェクトから入手した（Ｕｈｌｅｎ Ｍ，Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ Ｌ，Ｈａｌｌｓｔｒｏｍ ＢＭ，Ｌｉｎｄｓｋｏｇ Ｃ，Ｏｋｓｖｏｌｄ Ｐ，Ｍａｒｄｉｎｏｇｌｕ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｔｉｓｓｕｅ－ｂａｓｅｄ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１５；３４７（６２２０）：１２６０４１９）。それらは、ヒトタンパク質の固有の部分を表す短い組換え１０～１２ｋＤａペプチドであるタンパク質エピトープシグネチャータグ（ＰｒＥＳＴ）からなる。ＰｒＥＳＴを大腸菌で生産し、タグを介して精製した。以下の基準によって、このプロジェクトのＰｒＥＳＴを選択した。１）公開されたデータによると、ＭＳに関与すると想定されるタンパク質。２）ミエリンシートの主要な構造タンパク質。３）当該分野の専門家との情報交換により選択された目的のタンパク質。４）以前は疾患に関連していなかった高発現ＣＮＳ特異的タンパク質。この試験では、７０種類のタンパク質から得られた合計１２５のＰｒＥＳＴを使用した。
【0307】
全長抗原の生産
タンパク質の全長バージョンを用いたその後の試験のために、例１及び２に記載のＰｒＥＳＴのスクリーニングから取り出した抗原（ＦＡＢＰ７、ＰＲＯＫ２、ＲＴＮ３及びＳＮＡＰ９１）を選択した。抗原及びヒスタミンタグをコードするプラスミドを大腸菌に形質転換することにより、全長抗原を生産した。増殖後、細菌を溶解し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムでの６ｘヒスチジンタグ精製により細菌溶解の上清からタンパク質を精製した。その後、抗原をビーズに結合させ、前述のようにエンドトキシンを洗浄した。
タンパク質の全長バージョンを用いたその後の試験のために、例１及び２に記載のＰｒＥＳＴのスクリーニングから取り出した抗原（ＦＡＢＰ７、ＰＲＯＫ２、ＲＴＮ３及びＳＮＡＰ９１）を選択した。抗原及びヒスタミンタグをコードするプラスミドを大腸菌に形質転換することにより、全長抗原を生産した。増殖後、細菌を溶解し、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーカラムでの６ｘヒスチジンタグ精製により細菌溶解の上清からタンパク質を精製した。その後、抗原をビーズに結合させ、前述のようにエンドトキシンを洗浄した。
【0308】
ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ Ｔ細胞活性化アッセイ
細胞培養フード内の無菌条件下でＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイを実施した。細胞を３７°Ｃの水浴中で解凍し、ｃＲＰＭＩ（１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ－グルタミン（２００ｍＭ）、１％ペニシリン（１０，０００Ｕ／ｍｌ）－ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて洗浄した。光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＭＳ－Ｆ、Ｎｉｋｏｎ、日本）を用いて細胞を手動で計数し、続いてｃＲＰＭＩで２．５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度に希釈した。ＰＢＳを用いてＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレート（ヒトＩＦＮγ／ＩＬ－２２／ＩＬ－１７Ａ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔキット、プレコート、Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）を洗浄した後、室温で３０分間ｃＲＰＭＩを用いてブロックした。次いで、ブロッキングｃＲＰＭＩを廃棄し、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレートの各ウェルに１００μｌの新鮮なｃＲＰＭＩを加えた。特定のレイアウトに従って、抗原（３ｘ１０６ビーズ）を各ウェルに２連で加えた。製造業者のプロトコルに従って、抗ＣＤ３を陽性対照として使用した。結合していないビーズ及び刺激のない培地の両方を陰性対照として使用した。１００μｌのｃＲＰＭＩ中のＰＢＭＣ（２５０，０００個の細胞）を各ウェルに加えた（抗ＣＤ３に対して１２５，０００個の細胞）。プレートをインキュベーター（３７°Ｃ加湿環境下、５％ＣＯ２）に４４時間置いた。メーカーのプロトコルに従って、スポットを発色させた。
細胞培養フード内の無菌条件下でＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイを実施した。細胞を３７°Ｃの水浴中で解凍し、ｃＲＰＭＩ（１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ－グルタミン（２００ｍＭ）、１％ペニシリン（１０，０００Ｕ／ｍｌ）－ストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて洗浄した。光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＴＭＳ－Ｆ、Ｎｉｋｏｎ、日本）を用いて細胞を手動で計数し、続いてｃＲＰＭＩで２．５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度に希釈した。ＰＢＳを用いてＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレート（ヒトＩＦＮγ／ＩＬ－２２／ＩＬ－１７Ａ ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔキット、プレコート、Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）を洗浄した後、室温で３０分間ｃＲＰＭＩを用いてブロックした。次いで、ブロッキングｃＲＰＭＩを廃棄し、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔプレートの各ウェルに１００μｌの新鮮なｃＲＰＭＩを加えた。特定のレイアウトに従って、抗原（３ｘ１０６ビーズ）を各ウェルに２連で加えた。製造業者のプロトコルに従って、抗ＣＤ３を陽性対照として使用した。結合していないビーズ及び刺激のない培地の両方を陰性対照として使用した。１００μｌのｃＲＰＭＩ中のＰＢＭＣ（２５０，０００個の細胞）を各ウェルに加えた（抗ＣＤ３に対して１２５，０００個の細胞）。プレートをインキュベーター（３７°Ｃ加湿環境下、５％ＣＯ２）に４４時間置いた。メーカーのプロトコルに従って、スポットを発色させた。
【0309】
重複ペプチド
ＦＡＢＰ７アイソフォーム１及び２並びにＰＲＯＫ２全体に及ぶ連続重複ペプチド（１５アミノ酸長、１０アミノ酸重複）を、市販業者から凍結乾燥された形態で購入し、続いて、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に５０～１００ｍｇ／ｍｌの濃度まで懸濁させた。次いで、それらを滅菌ＰＢＳで５ｍｇ／ｍｌの濃度にさらに希釈した。それらを、それぞれ５～７個のペプチドを含む、ＦＡＢＰ７については６つの画分及びＰＲＯＫ２については３つの画分にプールした。含まれた各プールは、全長タンパク質上に互いに隣り合って位置していた。前述のプロトコルに従って、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで、これらに対して６例のＭＳ患者の細胞を試験した。細胞培養ウェル内の各ペプチドの最終濃度は５μｇ／ｍｌであった。
ＦＡＢＰ７アイソフォーム１及び２並びにＰＲＯＫ２全体に及ぶ連続重複ペプチド（１５アミノ酸長、１０アミノ酸重複）を、市販業者から凍結乾燥された形態で購入し、続いて、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に５０～１００ｍｇ／ｍｌの濃度まで懸濁させた。次いで、それらを滅菌ＰＢＳで５ｍｇ／ｍｌの濃度にさらに希釈した。それらを、それぞれ５～７個のペプチドを含む、ＦＡＢＰ７については６つの画分及びＰＲＯＫ２については３つの画分にプールした。含まれた各プールは、全長タンパク質上に互いに隣り合って位置していた。前述のプロトコルに従って、ＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで、これらに対して６例のＭＳ患者の細胞を試験した。細胞培養ウェル内の各ペプチドの最終濃度は５μｇ／ｍｌであった。
【0310】
抗原特異的免疫療法
同定された自己抗原ＦＡＢＰ７、ＰＲＯＫ２、ＲＴＮ３及びＳＮＡＰ９１を標的とする抗原特異的免疫療法の安全性、忍容性及び有効性を評価するために、臨床試験が行われるであろう。第一に、例６で先に説明されたように、各抗原由来の免疫優性エピトープが同定される。第二に、例７に記載の方法を使用して、自己抗原に対するＴ細胞活性について試験参加者（多発性硬化症患者）がスクリーニングされる。自己抗原に対する反応性を有する患者が試験の適格対象になる。治療は、各自己抗原からの１つもしくは複数の免疫優性ペプチドエピトープの混合物、又は患者が包含前のスクリーニングで応答した自己抗原のみに由来する１つもしくは複数の免疫優性ペプチドエピトープの混合物のいずれかからなり得る。
同定された自己抗原ＦＡＢＰ７、ＰＲＯＫ２、ＲＴＮ３及びＳＮＡＰ９１を標的とする抗原特異的免疫療法の安全性、忍容性及び有効性を評価するために、臨床試験が行われるであろう。第一に、例６で先に説明されたように、各抗原由来の免疫優性エピトープが同定される。第二に、例７に記載の方法を使用して、自己抗原に対するＴ細胞活性について試験参加者（多発性硬化症患者）がスクリーニングされる。自己抗原に対する反応性を有する患者が試験の適格対象になる。治療は、各自己抗原からの１つもしくは複数の免疫優性ペプチドエピトープの混合物、又は患者が包含前のスクリーニングで応答した自己抗原のみに由来する１つもしくは複数の免疫優性ペプチドエピトープの混合物のいずれかからなり得る。
【0311】
治療プロトコルは、以前に公開された成功した抗原特異的免疫療法プロトコルに基づくことになる（Ｃａｔｈａｗａｙ Ｊ，Ｍａｒｔｉｎ Ｋ，Ｂａｒｒｅｌｌ Ｋ，Ｓｈａｒｒａｃｋ Ｂ，Ｓｔｏｌｔ Ｐ，Ｗｒａｉｔｈ ＤＣ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＡＴＸ－ＭＳ－１４６７ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｖｅｒ １６ ｗｅｅｋｓ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１８）（Ｗａｌｃｚａｋ Ａ，Ｓｉｇｅｒ Ｍ，Ｓｚｃｚｅｐａｎｉｋ Ｍ，Ｓｅｌｍａｊ Ｋ．Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ＪＡＭＡ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１３）。１つの代替プロトコルでは、治療は、週１回／隔週のペプチドエピトープ混合物の皮下注射又は皮内注射からなり、これは低用量で開始され、その後、所望のさらに高い用量に達するまで増量期間が続く。その後、限られた期間にわたり、高用量の週１回／隔週の注射の期間が続く。或いは、ペプチドエピトープは、同様のスキームの下で、経皮投与、舌下投与又は経口投与される。安全性及び忍容性は継続的に評価され、有効性は完全な治療後に評価される。エンドポイントは、病変の数及び体積の磁気共鳴画像法に基づく評価と、総合障害度（ＥＤＳＳ）及び初回再燃までの期間又は再燃の頻度を含む臨床的変数との組合せなどの有効性パラメータからなる。
【配列表フリーテキスト】
【0312】
配列表５ ＜２２３＞ヒトタンパク質ＦＡＢＰ７、ＰＲＯＫ２、ＲＴＮ３及びＳＮＡＰ９１の組合せ配列。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【配列表】