特許7360142IP Force 特許公報全文掲載

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アミロイドーシス治療薬の新規なスクリーニング方法に関する。本発明はまた、アミロイドーシスの治療のための医薬組成物

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明は、アミロイドーシスの治療薬の探索に用いることができる新規なスクリーニング方法を提供することを目的とする。より具体的には、従来のスクリーニング系に比べ、生体内における病態により近いスクリーニング系を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明者らは、全長トランスサイレチン（TTR） 凝集体が培養神経細胞及びグリア細胞においてＣ末端断片に切断されること、そして、TTR の5-kDa のＣ末端断片である TTR81-127（p.101-147)が試験管中及び培養細胞表面で、中性ｐＨでも高度にアミロイド形成性であることを見いだし、本発明を完成した。本発明の一つの態様は、アミロイド原性の高い TTR81-127（p.101-147・・・　続きを知財ポータルサイト IP Force にログインして見る

発明の効果[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明により、アミロイドーシスの治療薬の探索に用いることができる新規なスクリーニング方法が提供された。

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 全長 TTR1-127（p.21-147)と TTR81-127（p.101-147)を連結した融合タンパク質のアミノ酸配列を示す。下線のENLYFQは、TEVプロテアーゼの認識配列を示す。
【図2】 全長 TTR1-127（p.21-147)と TTR81-127（p.101-147)を連結した融合タンパク質のDNA配列を示す。下線のGAAAACCTGTATTTCCAGは、TEVプロテアーゼの認識配列を示す。
【図3】 図３Ａは、未処理及び酸誘導凝集体の全長 TTR Val30Met（p.Val50Met）でSH-SY 5Y神経細胞を処理した結果である。図３Ｂは、酸誘導凝集体の全長 TTR Val30Met（p.Val50Met）でU87MG細胞を処理した結果である。
【図4】 酸誘導凝集体の全長 TTR Val30Met（p.Val50Met）でト血管平滑筋様グロモテル細胞、ヒト肝癌HepG2細胞、及びヒト網膜色素上皮ARPE-19細胞を処理した結果である。
【図5】 5-kDa及び10-kDaフラグメントが由来するTTRの配列の位置を示した図である。
【図6】 試験管内で組換え全長 TTR Val30Met（p.Val50Met）の酸誘導凝集体をトリプシンで切断した後に、SDS-PAGEを行った結果である。
【図7】 図７Aは、ATTRmアミロイドーシス患者からの硝子体 TTRアミロイド線維の成分をSDS-PAGE－免疫ブロティングで分析した結果である。図７Bは、ATTRmアミロイドーシス患者（Pt1）からの硝子体 TTRアミロイド線維をトリプシンで切断したのちSDS-PAGE－免疫ブロティングで分析した結果である。
【図8】 中性ｐＨ、37℃にて、PBS中で、TTR及び TTRフラグメントを用い、インビトロでの凝集体又はアミロイド形成能を調べた結果である。図Ａは TTR81-127（p.101-147)フラグメント、図Ｂは TTR49-127（p.69-147）フラグメント、図Ｃは全長野生型 TTR、図Ｄは全長 TTR Val30Met（p.Val50Met）の結果である。なお、TTR1-80（p.21-100）フラグメントは凝集体もアミロイド線維も形成しなかったので、図示していない。バーは、200 nｍを示す。
【図9】 グロモテル細胞中に形成されたアミロイド沈着物をCongo Red染色で検出した結果である。右図は、偏光顕微鏡で確認した結果である。バーは、200 μｍを示す。
【図10】 中性ｐＨ、37℃にて、PBS中で、TTR及び TTRフラグメントを用い、インビトロで、凝集体又はアミロイドを形成させ、オフラビンT（ThT）蛍光アッセイを行った結果である。
【図11】 Ａは、中性ｐＨ、37℃にて、PBS中で、TTR81-127（p.101-147)が四量体を形成しているかを確認した結果である。Ｂは、経時的変化を確認した結果である。
【図12】 細胞ベースのFSB分析及び細胞ベースのELISA分析の概略である。
【図13】 グロメテル細胞を用いた細胞ベースのFSB分析及び細胞ベースのELISA分析により、TTR81-127（p.101-147)沈着物を測定した結果である。
【図14】 Ａは、TTR81-127（p.101-147)に対する抗血清を用いた細胞ベースELISAにより、培養細胞中の TTR81-127（p.101-147)沈着物の量を定量的に分析した結果である。Ｂは、本発明のスクリーニング法の質を評価した結果である。
【図15】 本発明のスクリーニング法を用い、酸性ｐＨにて全長 TTRを用いる従来の評価方法で TTR凝集を阻害する又は TTRの四量体構造を安定化させると報告されている化合物を検討した結果である。
【図16】 本発明のスクリーニング法を用いて選択された28種類の化合物について、中性ｐＨで、TTR81-127（p.101-147)のアミロイド形成を阻害するか否かを検討した結果である。
【図17】 本発明のスクリーニング法を用いて選択された２つの化合物、ピルビニウムパモ酸塩及び塩酸アポモルヒネについて、アミロイド形成抑制を確認した結果である。Ａは、細胞ベースFSBアッセイの概略を示している。Ｂは、細胞FSBアッセイにおけるピルビニウムパモ酸塩のアミロイド形成抑制効果を、Ｃは、細胞FSBアッセイにおける塩酸アポモルヒネのアミロイド抑制効果を確認した結果であり、Ｄ～Ｅは、培養細胞をFSBで染色した結果を示している。
【図18】 予め形成された TTR81-127（p.101-147)のアミロイド線維を用いてアミロイド線維の破壊活性を測定した結果である。上段は、予め形成した TTR81-127（p.101-147)のアミロイド線維を用いた結果であり、後段は患者からの心臓アミロイド線維を用いた結果である。バーは、200 μｍである。
【図19】 尿素変性に対する TTR四量体の安定性に対する化合物の効果を評価した結果である。SDS-PAGEで分析した後、四量体の定量を行いグラフとして示した結果である。上段は、全長 TTR Val30Met（p.Val50Met）を用いた結果、下段は、患者血漿中の TTRを用いた結果である。
【図20】 Ａは、全長 TTRの自然の四量体構造からの TTRアミロイド線維形成の仮説モデルを、Ｂは、TTR81-127（p.101-147)フラグメントを用いた本発明の方法を示す実験モデル及び標的を示している。
【図21】 ピルビニウムパモ酸塩及び塩酸アポモルヒネについて、Ａβ42 及びＡβ40 のアミロイド線維形成阻害効果を確認した結果である。*P < 0.05, **P < 0.005, ***P < 0.001。

代表図 図1本件の代表的な図

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