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特許7360382改変されたホスホリパーゼドメインを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-03
(45)【発行日】2023-10-12
(54)【発明の名称】改変されたホスホリパーゼドメインを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
(51)【国際特許分類】
C12N 15/35 20060101AFI20231004BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20231004BHJP
C12N 15/866 20060101ALI20231004BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231004BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20231004BHJP
【ＦＩ】
C12N15/35
C12N15/864 100Z
C12N15/866 Z ZNA
C12N5/10
C12N7/01
【請求項の数】
34
(21)【出願番号】P 2020511907
(86)(22)【出願日】2018-08-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-11-26
(86)【国際出願番号】 IB2018056651
(87)【国際公開番号】W WO2019043630
(87)【国際公開日】2019-03-07
【審査請求日】2021-07-06
(31)【優先権主張番号】62/553,028
(32)【優先日】2017-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】521375829
【氏名又は名称】ベニテック アイピー ホールディングス インコーポレーテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ストリングス－ウフォムバー，ヴァネッサ
(72)【発明者】
【氏名】カオ，シー－チュー
(72)【発明者】
【氏名】ロエルヴィンク，ペトルス ダブリュ．
【審査官】市島 洋介
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００５／０７２３６４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】J. Virol.，2012年，Vol. 86, No. 17，pp.9163-9174
【文献】J. Virol.，2006年，Vol. 80, No. 4，pp.1874-1885
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ７／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ウイルスカプシドタンパク質は、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含む改変サブユニット１（ＶＰ１）配列を含み、前記アミノ酸位置は、配列番号１に記載される配列に関して規定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか１以上の前記アミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか１以上の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、前記対応する野生型配列に対して改変されていない、前記核酸分子。
【請求項2】
前記ウイルスカプシドタンパク質が、下記：（ｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含む、ＡＡＶ１由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含む、ＡＡＶ３由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含む、ＡＡＶ４由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含む、ＡＡＶ５由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含む、ＡＡＶ６由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含む、ＡＡＶ７由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含む、ＡＡＶ８由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含む、ＡＡＶ９由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含む、ＡＡＶ１０由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含む、ＡＡＶ１１由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含む、ＡＡＶ１２由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ１３由来のウイルスカプシドタンパク質
から成る群より選択される、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項3】
前記ウイルスカプシドタンパク質がＡＡＶ８に由来し、前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含む、請求項１または請求項２に記載の核酸分子。
【請求項4】
前記ウイルスカプシドタンパク質がＡＡＶ９に由来し、前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含む、請求項１または請求項２に記載の核酸分子。
【請求項5】
前記ウイルスカプシドタンパク質が、前記改変ＶＰ１と同じＡＡＶ血清型由来のサブユニット２（ＶＰ２）及びサブユニット３（ＶＰ３）配列を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項6】
前記ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項7】
昆虫細胞内での発現のための前記プロモーターが、多角体プロモーターまたはｐ１０プロモーターである、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項8】
Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項9】
Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載の核酸分子。
【請求項10】
前記Ｒｅｐタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での前記Ｒｅｐタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、請求項８または請求項９に記載の核酸分子。
【請求項11】
昆虫細胞内での発現のための前記プロモーターが、多角体プロモーターまたはｐ１０プロモーターである、請求項１０に記載の核酸分子。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含むバキュロウイルスベクター。
【請求項13】
下記：（ｉ）請求項１～１２のいずれか１項に記載の核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクター；及び
（ｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第２のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクター。
【請求項14】
下記：（ｉ）請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクター；
（ｉｉ）Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のバキュロウイルスベクター；及び
（ｉｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第３のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクター。
【請求項15】
前記第２のバキュロウイルスベクターが、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の複数のバキュロウイルスベクター。
【請求項16】
前記Ｒｅｐタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での前記Ｒｅｐタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１４または請求項１５に記載の複数のバキュロウイルスベクター。
【請求項17】
請求項１～１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含む昆虫細胞。
【請求項18】
請求項１２に記載のバキュロウイルスベクターまたは請求項１３～１６のいずれか１項に記載の複数のバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞。
【請求項19】
前記ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列及び前記Ｒｅｐタンパクをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、前記昆虫細胞内でエピソームとして複製する組換えバキュロウイルスゲノムから発現される、請求項８～１１及び１４～１６のいずれか１項に従属する請求項１７または１８に記載の昆虫細胞。
【請求項20】
ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが、前記昆虫細胞内でエピソームとして複製する組換えバキュロウイルスゲノムから発現される、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の昆虫細胞。
【請求項21】
昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：請求項１７～２０のいずれか１項に記載の昆虫細胞を、培地内で前記細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること
を含む、前記方法。
【請求項22】
昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：（ｉ）昆虫細胞を、請求項８～１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルス；及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第２のバキュロウイルスに同時感染させること；
（ｉｉ）（ｉ）で前記バキュロウイルスに感染した前記昆虫細胞を、培地内で前記細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること
を含む、前記方法。
【請求項23】
昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：昆虫細胞を、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルス；Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第２のバキュロウイルス；及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第３のバキュロウイルスに同時感染させること；
前記第１、第２及び第３のバキュロウイルスに感染した前記昆虫細胞を、培地内で前記細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること
を含む、前記方法。
【請求項24】
前記培地及び／または細胞から前記ＡＡＶを回収するさらなる工程を含む、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記ＡＡＶを精製することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
請求項２１～２５のいずれか１項に記載の方法で生成されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
【請求項27】
位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含む改変サブユニット１（ＶＰ１）配列を含むウイルスカプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、前記アミノ酸位置は、配列番号１に記載される配列に関して規定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか１以上の前記アミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか１以上の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、前記対応する野生型配列に対して改変されていない、前記ＡＡＶ。
【請求項28】
前記ＡＡＶが、下記：（ｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１；
（ｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型３；（ｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含むＡＡＶ血清型４；
（ｉｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含むＡＡＶ血清型５；（ｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含むＡＡＶ血清型６；
（ｖｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含むＡＡＶ血清型７；（ｖｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含むＡＡＶ血清型８；
（ｖｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含むＡＡＶ血清型９；
（ｉｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１０；
（ｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１１；（ｘｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１２；及び
（ｘｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１３
から成る群より選択される、請求項２７に記載のＡＡＶ。
【請求項29】
前記ＡＡＶが血清型８のものであり、かつ配列番号２１に記載される配列を含む改変ＶＰ１を含む、請求項２７または請求項２８に記載のＡＡＶ。
【請求項30】
前記ＡＡＶが血清型９のものであり、かつ配列番号２２に記載される配列を含む改変ＶＰ１を含む、請求項２７または請求項２８に記載のＡＡＶ。
【請求項31】
昆虫細胞内で産生される血清型２以外の血清型由来のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の機能性の改善方法であって、前記ＡＡＶのウイルスカプシドタンパク質を、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のみの１以上のアミノ酸を置換することによって、対応する野生型配列に対して改変することを含み、前記残基位置は、配列番号１に記載される配列に関して決定され、その結果、前記ウイルスカプシドタンパク質は、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含み、かつ前記ＡＡＶは、改変されなかった、昆虫細胞内で産生される対応する野生型ＡＡＶに比べて改善された機能性を有する、前記方法。
【請求項32】
前記ＡＡＶの前記ウイルスカプシドタンパク質を、下記：（ｉ）前記ＡＡＶが血清型１のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉ）前記ＡＡＶが血清型３のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉｉ）前記ＡＡＶが血清型４のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１７に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｖ）前記ＡＡＶが血清型５のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１８に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖ）前記ＡＡＶが血清型６のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１９に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉ）前記ＡＡＶが血清型７のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２０に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉ）前記ＡＡＶが血清型８のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉｉ）前記ＡＡＶが血清型９のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｘ）前記ＡＡＶが血清型１０のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２３に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘ）前記ＡＡＶが血清型１１のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２４に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘｉ）前記ＡＡＶが血清型１２のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；及び
（ｘｉｉ）前記ＡＡＶが血清型１３のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む
ように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
血清型８のＡＡＶの前記ウイルスカプシドタンパク質を、前記ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
血清型９のＡＡＶの前記ウイルスカプシドタンパク質を、前記ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、請求項３１または請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその内容全体を本明細書に援用する２０１７年８月３１日に提出された米国仮出願第６２／５５３，０２８号の利益を主張する。
本出願は、参照によりその内容全体を本明細書に援用する２０１７年８月３１日に提出された米国仮出願第６２／５５３，０２８号の利益を主張する。
【0002】
ＥＦＳ－ＷＥＢ経由で電子的に提出した配列表への言及
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子的に提出した配列表（名称：「４２２６．００６ＰＣ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」；サイズ：１００，４００バイト；２０１８年８月２２に作成した）を含み、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で電子的に提出した配列表（名称：「４２２６．００６ＰＣ０１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」；サイズ：１００，４００バイト；２０１８年８月２２に作成した）を含み、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
【0003】
技術分野
本開示は、一般的に、改変されたホスホリパーゼドメインを含むウイルスカプシドタンパク質を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及び昆虫細胞内でのバキュロウイルス発現系を用いたその生成方法に関する。
本開示は、一般的に、改変されたホスホリパーゼドメインを含むウイルスカプシドタンパク質を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及び昆虫細胞内でのバキュロウイルス発現系を用いたその生成方法に関する。
【背景技術】
【0004】
背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子治療のための最も有望なウイルスベクターの１つである。ＡＡＶは、２つのＯＲＦを発現する約４．７ｋｂのｓｓＤＮＡゲノムを含有し、１つのＯＲＦは、ウイルスコートタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３ならびにアセンブリ関連タンパク質またはアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードし、第２のＯＲＦは４つのウイルスレプリカーゼ成分をコードし；これらのＯＲＦは、２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接する。該ＩＴＲは、新生ウイルスカプシドにおけるゲノムの複製及び新たに合成されるゲノムのローディングで非常に重要な役割を果たすウイルスｒｅｐタンパク質によって認識される。組換えＡＡＶ粒子は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）が２つのＩＴＲ間でクローン化され、ウイルスのｃａｐ及びｒｅｐタンパク質がトランスにもたらされるベクターを用いて調製することができる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子治療のための最も有望なウイルスベクターの１つである。ＡＡＶは、２つのＯＲＦを発現する約４．７ｋｂのｓｓＤＮＡゲノムを含有し、１つのＯＲＦは、ウイルスコートタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３ならびにアセンブリ関連タンパク質またはアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードし、第２のＯＲＦは４つのウイルスレプリカーゼ成分をコードし；これらのＯＲＦは、２つの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接する。該ＩＴＲは、新生ウイルスカプシドにおけるゲノムの複製及び新たに合成されるゲノムのローディングで非常に重要な役割を果たすウイルスｒｅｐタンパク質によって認識される。組換えＡＡＶ粒子は、目的の遺伝子（ＧＯＩ）が２つのＩＴＲ間でクローン化され、ウイルスのｃａｐ及びｒｅｐタンパク質がトランスにもたらされるベクターを用いて調製することができる。
【0005】
組換えＡＡＶ粒子は、分裂ヒト細胞のみならず、非分裂ヒト細胞をも効率的に感染させる能力を保持する。ウイルス粒子は、核に入り、そこでゲノムはエピソームとして存続し、長期間、数か月から数年にわたって組換えベクター内に存在するいずれのトランスジーンをも発現し続けると考えられる。重要なことに、ＡＡＶ感染は普及しているにもかかわらず、該ウイルスはいずれの疾患にも関連しないと一般的に考えられる。さらに、典型的に血清型１～１２と呼ばれる多くのＡＡＶ血清型があり、これらはその組織親和性が異なる。これらの利点を考慮して、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、多くのヒト疾患のための遺伝子治療の臨床試験で評価されている。
【0006】
組換えＡＡＶのための２つの主なタイプの下記産生系がある：（１）哺乳動物の細胞株を用いる従来の生成系（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞）；及び（２）さらに最近では、昆虫細胞を用いる産生系。
【0007】
哺乳動物の産生系は、典型的にトリプルトランスフェクションを伴い、３種のプラスミドが哺乳動物の細胞株にトランスフェクトされ、これらのプラスミドは、ｉ）ＡＡＶ ｒｅｐ及びコートタンパク質、ｉｉ）アデノウイルス由来ヘルパー機能及びｉｉｉ）ＩＴＲと隣接する目的の遺伝子をコードする。ＡＡＶ ｒｅｐ及びＩＴＲ配列は、典型的にＡＡＶ２血清型、ならびにＣＡＰ配列に由来し、他の血清型由来の配列に置き換えて偽型ウイルス粒子を作り出すことができ、ウイルスカプシドタンパク質の選択は望ましい組織親和性を反映する。
【0008】
哺乳動物の産生系はいくつかの欠点に悩まされる。治療用途にとって最も重要な欠点は、付着性哺乳動物細胞の大規模トランスフェクションの困難さ及び結果としてのＡＡＶ産生系の不十分な拡張性である。さらに、哺乳動物細胞培養で産生される臨床用途のベクターは、哺乳動物宿主細胞内に存在する望ましくなく、おそらく病原性の物質で汚染されるリスクがある。
【0009】
哺乳動物産生系の代替物として、バキュロウイルスベクターを用いるＡＡＶの生成に昆虫細胞を使用することができる。バキュロウイルスが昆虫細胞に感染すると、バキュロウイルスはエピソームとして複製し、感染細胞においてバキュロウイルス由来プロモーターの使用を通じて極端に高いレベルのトランスジーン発現を誘導することができる。典型的に昆虫細胞を２種の組換えバキュロウイルスで同時感染させ、一方の組換えバキュロウイルスはＡＡＶ ｃａｐ及びｒｅｐタンパク質を発現し、第２のバキュロウイルスは、ＩＴＲと隣接するＧＯＩを含有し、ウイルスヘルパー機能を必要としない。
【0010】
ウシ胎仔血清等を補充しない懸濁培養液で成長するように昆虫細胞を適応させたので、ＡＡＶの生成に昆虫を使用することの主な利点は拡張性である。しかしながら、昆虫細胞産生系は、３種のＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）の正確な化学量論を達成することの困難さ、バキュロウイルス発現ベクターの継代不安定性、及び最も重大なことに、結果として生じるＡＡＶが、従来の哺乳動物細胞内で産生される対応ＡＡＶに比べて機能性が低いことを含めたいくつかの欠点もある。
【0011】
昆虫細胞内で産生されるＡＡＶの機能性は、ＡＡＶ血清型に応じて異なる。例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（４）：１８７４－１８８５は、昆虫細胞内で該バキュロウイルス系で産生されたＡＡＶ５粒子は、同じ系で産生されたＡＡＶ２に比べて乏しい活性を有すると報告した。従って、ＡＡＶ２は、昆虫細胞内でバキュロウイルス発現系から産生されると、そのウイルスカプシドタンパク質のサブユニット１（ＶＰ１）内のホスホリパーゼドメイン（ＰＬＡ）の活性を保持し、それによって、ウイルスがエンドソーム区画から脱出して細胞質に達することができるようにすると認識されている。Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌは、ビリオンの機能性を改善するためにＡＡＶ５ ＶＰ１の少なくとも４９個のアミノ酸のＮ末端部が、ＡＡＶ２ ＶＰ１の対応する部分と置き換えられている、キメラＡＡＶ２／５ ＶＰ１タンパク質を構築することによって、この問題に部分的に取り組んだ。しかしながら、ヒト遺伝子治療でＡＡＶを使用することへの興味を考慮すると、当技術分野には、ＡＡＶが細胞の内部移行後にエンドソームから脱出することができる昆虫細胞内で組換えＡＡＶ（ＡＡＶ２以外の血清型から）を生成する代替方法及び／または改善された方法の必要性が未だにある。
【0012】
公文書、条例、材料、装置、物品等のいずれの考察も、本発明に適した背景を与える目的でのみ本明細書に含まれることを理解されたい。これらの事項のいずれもまたは全ては、それが本出願の任意の請求項の優先日の前に存在したという理由で、本発明に関連する分野における共通の一般知識だったと承認するものと解釈すべきでない。
【発明の概要】
【0013】
概要
本開示は、昆虫細胞内でバキュロウイルス発現系から産生される血清型２以外の血清型からのＡＡＶのエンドソーム脱出能は、ホスホリパーゼドメイン及び隣接領域内の特異的部位でアミノ酸置換を行うことによって、修復または改善できるという発明者らによる予想外の発見に基づいている。詳細には、発明者らは、初めて２種の代表的なＡＡＶ血清型、すなわち血清型８及び９のエンドソーム脱出能を、６個までの残基位置でアミノ酸を対応位置のＡＡＶ血清型２由来のアミノ酸と置き換えることによって、修復または改善できることを示した。この関連で、本発明者らは、現在まで昆虫細胞内で産生されるＡＡＶの機能性を改善するためにこの戦略が利用されたように、キメラＡＡＶを生成するためにＰＬＡドメイン全体をＡＡＶ２のＰＬＡドメインと交換する必要はなく、野生型ＶＰ１／ＰＬＡ配列及びＡＡＶ２の野生型ＶＰ１／ＰＬＡ配列、例えば、ＡＡＶ２／ＷＴ ＶＰ１を含むモザイクカプシドを発現するＡＡＶを生成する必要もないことを示した。従って、発明者らは、それぞれのＡＡＶの野生型ウイルスカプシドタンパク質内の全ドメイン及び／またはサブユニット配列を置き換えなくても昆虫細胞内で産生される組換え非血清型２ＡＡＶのエンドソーム脱出能を修復または改善できる新規手法を提供した。
本開示は、昆虫細胞内でバキュロウイルス発現系から産生される血清型２以外の血清型からのＡＡＶのエンドソーム脱出能は、ホスホリパーゼドメイン及び隣接領域内の特異的部位でアミノ酸置換を行うことによって、修復または改善できるという発明者らによる予想外の発見に基づいている。詳細には、発明者らは、初めて２種の代表的なＡＡＶ血清型、すなわち血清型８及び９のエンドソーム脱出能を、６個までの残基位置でアミノ酸を対応位置のＡＡＶ血清型２由来のアミノ酸と置き換えることによって、修復または改善できることを示した。この関連で、本発明者らは、現在まで昆虫細胞内で産生されるＡＡＶの機能性を改善するためにこの戦略が利用されたように、キメラＡＡＶを生成するためにＰＬＡドメイン全体をＡＡＶ２のＰＬＡドメインと交換する必要はなく、野生型ＶＰ１／ＰＬＡ配列及びＡＡＶ２の野生型ＶＰ１／ＰＬＡ配列、例えば、ＡＡＶ２／ＷＴ ＶＰ１を含むモザイクカプシドを発現するＡＡＶを生成する必要もないことを示した。従って、発明者らは、それぞれのＡＡＶの野生型ウイルスカプシドタンパク質内の全ドメイン及び／またはサブユニット配列を置き換えなくても昆虫細胞内で産生される組換え非血清型２ＡＡＶのエンドソーム脱出能を修復または改善できる新規手法を提供した。
【0014】
従って、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該ウイルスカプシドタンパク質は、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含む改変サブユニット１（ＶＰ１）配列を含み、アミノ酸位置は、配列番号１に記載される配列に関して規定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか１以上のアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか１以上の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されていない、核酸分子を提供する。
【0015】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型３に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型４に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型５に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型６に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型７に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型８に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型９に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１０に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１１に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１２に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１３に由来する。
【0016】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、下記：
（ｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含む、ＡＡＶ１由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含む、ＡＡＶ３由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含む、ＡＡＶ４由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｖ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含む、ＡＡＶ５由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含む、ＡＡＶ６由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含む、ＡＡＶ７由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含む、ＡＡＶ８由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含む、ＡＡＶ９由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｘ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含む、ＡＡＶ１０由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含む、ＡＡＶ１１由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含む、ＡＡＶ１２由来のウイルスカプシドタンパク質；及び
（ｘｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ１３由来のウイルスカプシドタンパク質
から成る群より選択される。
（ｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含む、ＡＡＶ１由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含む、ＡＡＶ３由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含む、ＡＡＶ４由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｖ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含む、ＡＡＶ５由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含む、ＡＡＶ６由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含む、ＡＡＶ７由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含む、ＡＡＶ８由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含む、ＡＡＶ９由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｘ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含む、ＡＡＶ１０由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含む、ＡＡＶ１１由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含む、ＡＡＶ１２由来のウイルスカプシドタンパク質；及び
（ｘｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ１３由来のウイルスカプシドタンパク質
から成る群より選択される。
【0017】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含むＡＡＶ１に由来する。
【0018】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含むＡＡＶ３に由来する。
【0019】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含むＡＡＶ４に由来する。
【0020】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含むＡＡＶ５に由来する。
【0021】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含むＡＡＶ６に由来する。
【0022】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含むＡＡＶ７に由来する。
【0023】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含むＡＡＶ８に由来する。
【0024】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含むＡＡＶ９に由来する。
【0025】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含むＡＡＶ１０に由来する。
【0026】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含むＡＡＶ１１に由来する。
【0027】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含むＡＡＶ１２に由来する。
【0028】
一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ１３に由来する。
【0029】
前述の各例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１と同じＡＡＶ血清型由来のサブユニット２（ＶＰ２）及びサブユニット３（ＶＰ３）配列を含んでよい。
【0030】
一例において、ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞内での発現のためのプロモーターに作動可能に連結される。一例において、プロモーターは多角体プロモーターである。別の例において、プロモーターはｐ１０プロモーターである。
【0031】
核酸分子は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでもよい。一例において、核酸分子は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、核酸分子は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、核酸分子は、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、核酸分子は、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、核酸分子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。前述の各例において、Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質と同じＡＡＶ血清型に由来し得る。代わりに、Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質のＡＡＶ血清型と異なるＡＡＶ血清型に由来してよく、例えば、Ｒｅｐタンパク質はＡＡＶ血清型２に由来し得る。
【0032】
Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、昆虫細胞内でのＲｅｐタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結され得る。一例において、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、多角体プロモーターに作動可能に連結される。一例において、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ｐ１０プロモーターに作動可能に連結される。
【0033】
前述の各例において、核酸分子は、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするポリヌクレオチドを含んでよい。例えば、ＡＡＰは、ウイルスカプシドタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと異なるオープンリーディングフレームによってコードされ得る。
【0034】
本開示は、本明細書に記載どおりに核酸分子を含むバキュロウイルスベクターをも提供する。
本開示は、下記：
（ｉ）本明細書に記載どおりに核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクターであって、核酸分子が、本明細書に記載どおりにＡＡＶウイルスカプシドタンパク質及びＲｅｐタンパク質をコードするベクター；及び
（ｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第２のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクターをも提供する。
本開示は、下記：
（ｉ）本明細書に記載どおりに核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクターであって、核酸分子が、本明細書に記載どおりにＡＡＶウイルスカプシドタンパク質及びＲｅｐタンパク質をコードするベクター；及び
（ｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第２のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクターをも提供する。
【0035】
一例において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ウイルスカプシドタンパク質と同じ血清型に由来する。別の例において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ウイルスカプシドタンパク質の血清型以外の血清型に由来する。ある特定例において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ血清型２に由来する。
【0036】
本開示は、下記：
（ｉ）本明細書に記載どおりに核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクターであって、核酸分子が、本明細書に記載どおりにＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードするベクター；
（ｉｉ）Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のバキュロウイルスベクター；及び
（ｉｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第３のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクターをも提供する。
（ｉ）本明細書に記載どおりに核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクターであって、核酸分子が、本明細書に記載どおりにＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードするベクター；
（ｉｉ）Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のバキュロウイルスベクター；及び
（ｉｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第３のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクターをも提供する。
【0037】
一例において、第２のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、第２のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、第２のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、第２のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、第２のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。前述の各例において、Ｒｅｐタンパク質は、第１のバキュロウイルスベクターにおいて核酸分子によりコードされているウイルスカプシドタンパク質と同じＡＡＶ血清型に由来し得る。代わりに、Ｒｅｐタンパク質は、第１のバキュロウイルスベクターにおいて核酸分子によりコードされているウイルスカプシドタンパク質のＡＡＶ血清型と異なるＡＡＶ血清型に由来してよく、例えば、Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ血清型２に由来し得る。
【0038】
前述の各例において、第２のバキュロウイルスベクター内でＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、昆虫細胞内でのＲｅｐタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結され得る。一例において、第２のバキュロウイルスベクター内でＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、多角体プロモーターに作動可能に連結される。一例において、第２のバキュロウイルスベクター内でＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ｐ１０プロモーターに作動可能に連結される。
【0039】
一例において、第３のバキュロウイルスベクターは、第１のバキュロウイルスベクター内で核酸分子によりコードされているウイルスカプシドタンパク質と同じ血清型由来のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。別の例において、第３のバキュロウイルスベクターは、第１のバキュロウイルスベクター内で核酸分子によりコードされているウイルスカプシドタンパク質の血清型以外の血清型由来のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。ある特定例において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ血清型２に由来する。
【0040】
バキュロウイルスベクターの少なくとも１つは、ＡＡＶのためのアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするポリヌクレオチドを含む。一例において、ＡＡＰは、第１のバキュロウイルスベクター内に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。一例において、ＡＡＰは、第２のバキュロウイルスベクター内に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。別の例において、ＡＡＰは、第３のバキュロウイルスベクター内に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【0041】
本開示は、本明細書に記載どおりに核酸を含む昆虫細胞をも提供する。
【0042】
本開示は、本明細書に記載どおりにバキュロウイルスベクターまたは複数のバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞をも提供する。
【0043】
一例において、ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列及び／またはＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、エピソームとして複製する組換えバキュロウイルスゲノムから発現される。
【0044】
代わりに、またはさらに、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、エピソームとして複製する組換えバキュロウイルスゲノムから発現される。
【0045】
本開示は、昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：
（ｉ）本明細書に記載どおりに昆虫細胞を、培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉ）培地及び／または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法をも提供する。
（ｉ）本明細書に記載どおりに昆虫細胞を、培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉ）培地及び／または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法をも提供する。
【0046】
本開示は、昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：
（ｉ）昆虫細胞を、本明細書に記載どおりにＡＡＶウイルスカプシドタンパク質及びＲｅｐタンパク質をコードする本明細書に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルス；及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、例えばＡＡＶ血清型２由来のＩＴＲ配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第２のバキュロウイルスに同時感染させること；
（ｉｉ）（ｉ）でバキュロウイルスに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉｉ）培地及び／または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法をも提供する。
（ｉ）昆虫細胞を、本明細書に記載どおりにＡＡＶウイルスカプシドタンパク質及びＲｅｐタンパク質をコードする本明細書に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルス；及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、例えばＡＡＶ血清型２由来のＩＴＲ配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第２のバキュロウイルスに同時感染させること；
（ｉｉ）（ｉ）でバキュロウイルスに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉｉ）培地及び／または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法をも提供する。
【0047】
一例において、ＡＡＶの生成方法は、培地及び／または細胞からＡＡＶを回収することを含む。別の例において、ＡＡＶの生成方法は、培地及び／または細胞からＡＡＶを回収してからＡＡＶを精製することを含む。一例において、ＡＡＶは、細胞から回収される。一例において、ＡＡＶは、培地から回収される。一例において、ＡＡＶは、細胞及び培地から回収される。
【0048】
第１及び第２のバキュロウイルスの少なくとも１つのゲノムは、ＡＡＶのためのアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするポリヌクレオチドを含むことになる。一例において、ＡＡＰは、第１のバキュロウイルスのゲノム内に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。一例において、ＡＡＰは、第２のバキュロウイルスのゲノム内に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【0049】
本開示は、昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：
（ｉ）昆虫細胞を、本明細書に記載どおりにＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする本明細書に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルス；Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第２のバキュロウイルス；及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第３のバキュロウイルスに同時感染させること；
（ｉｉ）（ｉ）でバキュロウイルスに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉｉ）培地及び／または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法をも提供する。
（ｉ）昆虫細胞を、本明細書に記載どおりにＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする本明細書に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルス；Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第２のバキュロウイルス；及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第３のバキュロウイルスに同時感染させること；
（ｉｉ）（ｉ）でバキュロウイルスに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉｉ）培地及び／または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法をも提供する。
【0050】
一例において、昆虫細胞を感染させる第２のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、昆虫細胞を感染させる第２のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、昆虫細胞を感染させる第２のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、昆虫細胞を感染させる第２のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、昆虫細胞を感染させる第２のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。前述の各例において、Ｒｅｐタンパク質は、第１のバキュロウイルスベクター内で核酸分子によりコードされているウイルスカプシドタンパク質と同じＡＡＶ血清型に由来し得る。代わりに、Ｒｅｐタンパク質は、第１のバキュロウイルスベクター内で核酸分子によりコードされているウイルスカプシドタンパク質のＡＡＶ血清型と異なるＡＡＶ血清型に由来してよく、例えば、Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ血清型２に由来し得る。
【0051】
前述の各例において、第２のバキュロウイルスベクター内でＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、昆虫細胞内でのＲｅｐタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結され得る。一例において、第２のバキュロウイルスベクター内でＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、多角体プロモーターに作動可能に連結される。一例において、第２のバキュロウイルスベクター内でＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ｐ１０プロモーターに作動可能に連結される。
【0052】
一例において、昆虫細胞を感染させる第３のバキュロウイルスベクターは、第１のバキュロウイルスベクター内で核酸分子によりコードされているウイルスカプシドタンパク質と同じ血清型由来のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。別の例において、昆虫細胞を感染させる第３のバキュロウイルスベクターは、第１のバキュロウイルスベクター内で核酸分子によりコードされているウイルスカプシドタンパク質の血清型以外の血清型由来のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。ある特定例において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列はＡＡＶ血清型２に由来する。
【0053】
一例において、第２のバキュロウイルスベクターのゲノムによりコードされているＲｅｐタンパク質及び第３のバキュロウイルスベクターのゲノムによりコードされているＩＴＲ配列は、ＡＡＶ血清型２に由来する。
【0054】
第１、第２及び第３のバキュロウイルスの少なくとも１つのゲノムは、ＡＡＶのためのアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするポリヌクレオチドを含むことになる。一例において、ＡＡＰは、第１のバキュロウイルスのゲノム内に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。一例において、ＡＡＰは、第２のバキュロウイルスのゲノム内に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。一例において、ＡＡＰは、第３のバキュロウイルスのゲノム内に含まれるポリヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【0055】
一例において、ＡＡＶの生成方法は、培地及び／または細胞からＡＡＶを回収することを含む。別の例において、ＡＡＶの生成方法は、培地及び／または細胞からＡＡＶを回収してからＡＡＶを精製することを含む。一例において、ＡＡＶは、細胞から回収される。一例において、ＡＡＶは、培地から回収される。一例において、ＡＡＶは、細胞及び培地から回収される。
【0056】
本開示は、本明細書に記載の方法によって生成されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をも提供する。
【0057】
位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含む改変サブユニット１（ＶＰ１）配列を含むウイルスカプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、アミノ酸位置は、配列番号１に記載される配列に関して規定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか１以上のアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか１以上の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されていない、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をも提供する。
【0058】
一例において、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか２以上のアミノ酸は、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変されている。一例において、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか３以上のアミノ酸は、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変されている。一例において、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか４以上のアミノ酸は、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変されている。一例において、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか５以上のアミノ酸は、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変されている。一例において、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のそれぞれのアミノ酸は、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変されている。
【0059】
改変ＶＰ１配列を含むウイルスカプシドタンパク質について本明細書に記載した。これらのいずれの例も、特に別段の定めをした場合を除き、変更すべきところは変更して本開示のＡＡＶに当てはまるものと解釈すべきである。
【0060】
一例において、ＡＡＶは、下記：
（ｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１；
（ｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型３；
（ｉｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含むＡＡＶ血清型４；
（ｉｖ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含むＡＡＶ血清型５；
（ｖ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含むＡＡＶ血清型６；
（ｖｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含むＡＡＶ血清型７；
（ｖｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含むＡＡＶ血清型８；
（ｖｉｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含むＡＡＶ血清型９；
（ｉｘ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１０；
（ｘ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１１；
（ｘｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１２；及び
（ｘｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１３
から成る群より選択される。
（ｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１；
（ｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型３；
（ｉｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含むＡＡＶ血清型４；
（ｉｖ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含むＡＡＶ血清型５；
（ｖ）改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含むＡＡＶ血清型６；
（ｖｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含むＡＡＶ血清型７；
（ｖｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含むＡＡＶ血清型８；
（ｖｉｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含むＡＡＶ血清型９；
（ｉｘ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１０；
（ｘ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１１；
（ｘｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１２；及び
（ｘｉｉ）改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１３
から成る群より選択される。
【0061】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１である。
【0062】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型３である。
【0063】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含むＡＡＶ血清型４である。
【0064】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含むＡＡＶ血清型５である。
【0065】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含むＡＡＶ血清型６である。
【0066】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含むＡＡＶ血清型７である。
【0067】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含むＡＡＶ血清型８である。
【0068】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含むＡＡＶ血清型９である。
【0069】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１０である。
【0070】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１１である。
【0071】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１２である。
【0072】
一例において、ＡＡＶは、改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１３である。
【0073】
本開示は、昆虫細胞内で産生される血清型２以外の血清型由来のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の機能性の改善方法であって、ＡＡＶのウイルスカプシドタンパク質内のＶＰ１配列を、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のみの１以上のアミノ酸を置換することによって、対応する野生型配列に対して改変することを含み、残基位置は、配列番号１に記載される配列に関して決定され、その結果、ウイルスカプシドタンパク質は、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含み、ＡＡＶは、改変されなかった、昆虫細胞内で産生される対応する野生型ＡＡＶに比べて改善された機能性を有する、方法をも提供する。ＡＡＶの改善された機能性は、内部移行後にＡＡＶが細胞のエンドソーム区画から脱出する能力の改善、すなわち、改善されたエンドソーム脱出能に起因するのが好ましい。改変ＶＰ１配列を含むＡＡＶウイルスカプシドタンパク質について本明細書に記載した。これらのいずれの例も、特に別段の定めをした場合を除き、変更すべきところは変更して、本明細書に記載どおりにそれを生成する方法に当てはまるものと解釈すべきである。
【0074】
一例において、本方法は、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか２以上のアミノ酸を、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか３以上のアミノ酸を、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか４以上のアミノ酸を、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか５以上のアミノ酸を、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸を、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0075】
一例において、本方法は、ＡＡＶのウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を下記：
（ｉ）ＡＡＶが血清型１のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉ）ＡＡＶが血清型３のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉｉ）ＡＡＶが血清型４のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１７に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｖ）ＡＡＶが血清型５のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１８に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖ）ＡＡＶが血清型６のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１９に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉ）ＡＡＶが血清型７のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２０に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉ）ＡＡＶが血清型８のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉｉ）ＡＡＶが血清型９のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｘ）ＡＡＶが血清型１０のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２３に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘ）ＡＡＶが血清型１１のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２４に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘｉ）ＡＡＶが血清型１２のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；及び
（ｘｉｉ）ＡＡＶが血清型１３のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む
ように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
（ｉ）ＡＡＶが血清型１のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉ）ＡＡＶが血清型３のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉｉ）ＡＡＶが血清型４のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１７に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｖ）ＡＡＶが血清型５のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１８に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖ）ＡＡＶが血清型６のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１９に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉ）ＡＡＶが血清型７のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２０に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉ）ＡＡＶが血清型８のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉｉ）ＡＡＶが血清型９のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｘ）ＡＡＶが血清型１０のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２３に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘ）ＡＡＶが血清型１１のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２４に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘｉ）ＡＡＶが血清型１２のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；及び
（ｘｉｉ）ＡＡＶが血清型１３のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む
ように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0076】
一例において、本方法は、ＡＡＶ１のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0077】
一例において、本方法は、ＡＡＶ３のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0078】
一例において、本方法は、ＡＡＶ４のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１７に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0079】
一例において、本方法は、ＡＡＶ５のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１８に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0080】
一例において、本方法は、ＡＡＶ６のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１９に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0081】
一例において、本方法は、ＡＡＶ７のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２０に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0082】
一例において、本方法は、ＡＡＶ８のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0083】
一例において、本方法は、ＡＡＶ９のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0084】
一例において、本方法は、ＡＡＶ１０のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２３に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0085】
一例において、本方法は、ＡＡＶ１１のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２４に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0086】
一例において、本方法は、ＡＡＶ１２のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0087】
一例において、本方法は、ＡＡＶ１３のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0088】
【図1】ＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄと名付けられたＤＮＡ構築物のベクターマップである。このＤＮＡ構築物は、昆虫細胞内でＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及び改変ＡＡＶ８カプシドを両方発現するように設計された。ベクター骨格はバキュロウイルスベクターｐＯＥＴ１骨格（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり、昆虫細胞内で改変ＡＡＶ８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶを調製するために使用した。
【図2】ＡＡＶ８－ＶＰｍｏｄと名付けられたＤＮＡ構築物のベクターマップである。このＤＮＡ構築物はＡＡＶ８カプシド遺伝子の改変型を含有し、ＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ（図４）及びＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ（図１）を調製するために使用した。
【図3】ｗｔＡＡＶ８-Ｒｅｐ／Ｃａｐと名付けられたＤＮＡ構築物のベクターマップである。このＤＮＡ構築物は、昆虫細胞内でＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及びｗｔＡＡＶ８カプシドを発現するように設計され、ｗｔＡＡＶ８カプシドタンパク質を含有するＡＡＶを調製するために使用した。
【図4】ＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄと名付けられたＤＮＡ構築物のベクターマップである。このＤＮＡ構築物は、昆虫細胞内でＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及び改変ＡＡＶ８カプシドを発現するように設計され、ＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ（図１）を調製するために使用した。
【図5】ＢａｃＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄと名付けられたＤＮＡ構築物のベクターマップである。このＤＮＡ構築物は、昆虫細胞内でＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及び改変ＡＡＶ９カプシドを発現するように設計された。ベクター骨格はバキュロウイルスベクターｐＯＥＴ１骨格（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であり、改変ＡＡＶ９カプシドタンパク質を含有するＡＡＶを調製するために使用した。
【図6】ＡＡＶ９－ＶＰｍｏｄと名付けられたＤＮＡ構築物のベクターマップである。このＤＮＡ構築物はＡＡＶ９カプシド遺伝子の改変型を含有し、ＢａｃＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ（図５）を調製するために使用した。
【図7】ＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄと名付けられたＤＮＡ構築物のベクターマップである。このＤＮＡ構築物は、昆虫細胞内でＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質及び改変ＡＡＶ９カプシドを発現するように設計された。
【図8】ＡＡＶ２－ＧＯＩと名付けられたＤＮＡ構築物のベクターマップである。このＤＮＡ構築物は、ＡＡＶ ＩＴＲと隣接する２つのｓｈｍｉＲを発現するように設計され、ＢａｃＡＡＶ２－ＧＯＩ（図９）を調製するために使用した。
【図9】ＢａｃＡＡＶ２－ＧＯＩと名付けられたＤＮＡ構築物のベクターマップである。このＤＮＡ構築物は、バキュロウイルスベクターｐＯＥＴ１骨格（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内でＡＡＶ ＩＴＲと隣接する２つのｓｈｍｉＲを発現するように設計された（ＡＡＶ２－ＧＯＩ）。この構築物を用いて、２つのｓｈｍｉＲをコードするＧＯＩを発現する改変ＡＡＶ９カプシドタンパク質を含有するＡＡＶを調製した。
【図10】図１０Ａ～図１０Ｃは、（ｉ）哺乳動物細胞内で産生された非改変ＶＰ１を有するＡＡＶ８（ＶｅｃＢｉｏ）、（ｉｉ）昆虫細胞内でバキュロウイルスによって産生された改変ＶＰ１を有するＡＡＶ８（ＢａｃＶＰｍｏｄ）、及び（ｉｉｉ）昆虫細胞内でバキュロウイルスによって産生された非改変ＶＰ１を有するＡＡＶ８（Ｂｅｎ１０）の４ｘ１０ｅ９、８ｘ１０ｅ９及び１．６ｘ１０ｅ１０のＡＡＶベクターゲノムに感染したＪＨＵ６７細胞から発現した１細胞当たりのｓｈｍｉＲコピーの総数を示す。哺乳動物細胞内で産生された野生型カプシドを有するＡＡＶは、昆虫細胞内で産生された野生型カプシドを有するＡＡＶに比べて高レベルのｓｈｍｉＲを発現し、この発現はほとんど検出できない。昆虫細胞内で産生された改変ＶＰ１を含むカプシドを有するＡＡＶは、非改変野生型カプシドを用いて昆虫内で産生されたＡＡＶに比べて、発現、ひいては機能性の顕著な増大を示す。
【図11】ＡＡＶ内部移行受容体（ＡＡＶ－Ｒ）を発現し、かつ（ｉ）哺乳動物細胞内で産生された非改変ＶＰ１を有するＡＡＶ９、及び（ｉｉ）昆虫細胞内でバキュロウイルスによって産生された改変ＶＰ１を有するＡＡＶ９の４ｘ１０ｅ９、８ｘ１０ｅ９及び１．６ｘ１０ｅ１０のＡＡＶベクターゲノムに感染したＣ２Ｃ１２細胞から発現したｓｈｍｉＲコピーの総数を示す。両組換えウイルスは、同等レベルのｓｈｍｉＲを発現した。これは同等の機能性を実証している。
【発明を実施するための形態】
【0089】
配列表のキー
配列番号１：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型の改変コンセンサスＶＰ１部分配列。
配列番号１：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型の改変コンセンサスＶＰ１部分配列。
【0090】
配列番号２：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型１のＶＰ１部分配列。
【0091】
配列番号３：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型２のＶＰ１部分配列。
【0092】
配列番号４：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型３のＶＰ１部分配列。
【0093】
配列番号５：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型４のＶＰ１部分配列。
【0094】
配列番号６：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型５のＶＰ１部分配列。
【0095】
配列番号７：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型６のＶＰ１部分配列。
【0096】
配列番号８：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型７のＶＰ１部分配列。
【0097】
配列番号９：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型８のＶＰ１部分配列。
【0098】
配列番号１０：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型９のＶＰ１部分配列。
【0099】
配列番号１１：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型１０のＶＰ１部分配列。
【0100】
配列番号１２：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型１１のＶＰ１部分配列。
【0101】
配列番号１３：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型１２のＶＰ１部分配列。
【0102】
配列番号１４：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型１３のＶＰ１部分配列。
【0103】
配列番号１５：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型１の改変ＶＰ１部分配列
【0104】
配列番号１６：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型３の改変ＶＰ１部分配列。
【0105】
配列番号１７：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型４の改変ＶＰ１部分配列
【0106】
配列番号１８：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型５の改変ＶＰ１部分配列。
【0107】
配列番号１９：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型６の改変ＶＰ１部分配列
【0108】
配列番号２０：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型７の改変ＶＰ１部分配列
【0109】
配列番号２１：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型８の改変ＶＰ１部分配列
【0110】
配列番号２２：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型９の改変ＶＰ１部分配列。
【0111】
配列番号２３：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型１０の改変ＶＰ１部分配列。
【0112】
配列番号２４：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型１１の改変ＶＰ１部分配列
【0113】
配列番号２５：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型１２の改変ＶＰ１部分配列
【0114】
配列番号２６：ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含む、ＡＡＶ血清型１３の改変ＶＰ１部分配列
【0115】
配列番号２７：ＡＡＶ血清型１のＶＰ１アミノ酸配列。
【0116】
配列番号２８：ＡＡＶ血清型２のＶＰ１アミノ酸配列。
【0117】
配列番号２９：ＡＡＶ血清型３のＶＰ１アミノ酸配列。
【0118】
配列番号３０：ＡＡＶ血清型４のＶＰ１アミノ酸配列。
【0119】
配列番号３１：ＡＡＶ血清型５のＶＰ１アミノ酸配列。
【0120】
配列番号３２：ＡＡＶ血清型６のＶＰ１アミノ酸配列。
【0121】
配列番号３３：ＡＡＶ血清型７のＶＰ１アミノ酸配列。
【0122】
配列番号３４：ＡＡＶ血清型８のＶＰ１アミノ酸配列。
【0123】
配列番号３５：ＡＡＶ血清型９のＶＰ１アミノ酸配列。
【0124】
配列番号３６：ＡＡＶ血清型１０のＶＰ１アミノ酸配列。
【0125】
配列番号３７：ＡＡＶ血清型１１のＶＰ１アミノ酸配列。
【0126】
配列番号３８：ＡＡＶ血清型１２のＶＰ１アミノ酸配列。
【0127】
配列番号３９：ＡＡＶ血清型１３のＶＰ１アミノ酸配列。
【0128】
詳細な説明
通則
本明細書全体を通じて、特に別段の定めをした場合を除き、または文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、単一の工程、特徴、組成物、工程の群または特徴もしくは組成物の群への言及は、１つ及び複数の（すなわち１つ以上の）当該工程、特徴、組成物、工程の群または特徴もしくは組成物の群を包含するものと解釈すべきである。
通則
本明細書全体を通じて、特に別段の定めをした場合を除き、または文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、単一の工程、特徴、組成物、工程の群または特徴もしくは組成物の群への言及は、１つ及び複数の（すなわち１つ以上の）当該工程、特徴、組成物、工程の群または特徴もしくは組成物の群を包含するものと解釈すべきである。
【0129】
当業者は、本開示が、具体的に記載したもの以外の変形形態及び変更形態を受け入れる余地があることを理解している。本開示は、全てのそのような変形形態及び変更形態を包含するものと理解すべきである。本開示は、本明細書に個々にまたはまとめて言及または指摘した全ての工程、特徴、組成物及び化合物、ならびに前記工程または特徴のありとあらゆる組み合わせまたはいずれか２つ以上をも包含する。
【0130】
本開示は、例示の目的だけを意図する本明細書に記載の具体例による範囲に限定されるべきでない。機能的に等価な生成物、組成物及び方法は、明白に本開示の範囲内である。
【0131】
本明細書の本開示のいずれの例も、特に別段の定めをした場合を除き、変更すべきところは変更して、本開示のいずれの他の例にも当てはまるものと解釈すべきである。
【0132】
別段の具体的な定義がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝子学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学の）が一般的に理解するのと同じ意味を有するものと解釈すべきである。
【0133】
特に別段の定めをした場合を除き、本開示で利用する組換えＤＮＡ、組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技術は、当技術分野で周知の標準的手順である。該技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４）、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての改訂を含めて）、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全ての改訂を含めて）等の情報源の文献全体を通じて記載及び説明されている。
【0134】
本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）もしくは含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）等の異形は、規定された工程もしくは要素もしくは整数または工程もしくは要素もしくは整数の群を含めるが、いずれの他の工程もしくは要素もしくは整数または要素もしくは整数の群をも排除しないことを意味すると理解される。
【0135】
用語「及び／または」、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味するものと理解すべきであり、両方の意味またはどちらかの意味を明示的にサポートするものと解釈すべきでる。
【0136】
選ばれた定義
本明細書で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、短い（約４．７ｋｂ）一本鎖ＤＮＡゲノムを含有し、それらの複製のためにはアデノウイルス等のヘルパーウイルスの存在に依存するパルボウイルス科内の１群のウイルスに関する。本開示は、ＡＡＶに由来するベクター、すなわち遺伝子トランスファービヒクルをも企図する。
本明細書で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、短い（約４．７ｋｂ）一本鎖ＤＮＡゲノムを含有し、それらの複製のためにはアデノウイルス等のヘルパーウイルスの存在に依存するパルボウイルス科内の１群のウイルスに関する。本開示は、ＡＡＶに由来するベクター、すなわち遺伝子トランスファービヒクルをも企図する。
【0137】
本明細書で使用する場合、ＡＡＶの文脈で使用する用語「血清型」は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に区別されるカプシドを有するＡＡＶを指すために用いる区別である。血清学的独自性は、あるＡＡＶに対する抗体間の交差反応性が別のＡＡＶに比べて欠如することに基づいて決定される。該交差反応性の相違は、通常はカプシドタンパク質配列／抗原決定基の相違に起因（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３配列の相違に起因）する。
【0138】
本明細書においてＡＡＶの文脈で使用する場合、用語「ウイルスカプシドタンパク質」、「カプシドタンパク質」、「カプシドポリペプチド」または同様の語は、コートタンパク質またはＶＰタンパク質とも呼ばれるＡＡＶ粒子のタンパク質性殻を生成するためのセルフアセンブリの活性を有するＡＡＶのポリペプチドに関する。それは３つのサブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３で構成され、これらは典型的に単一の核酸分子から発現され、相互に作用して正二十面体対称性のカプシドを形成する。ＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。
【0139】
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結される」または「作動可能な連結」（または同様の用語）は、機能的な関係にあるポリヌクレオチド要素の連結を指す。核酸またはポリヌクレオチド配列は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれると、「作動可能に連結される」。例えば、転写調節配列、例えば、当技術分野において承認されているプロモーター、エンハンサーまたは他の発現制御要素は、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合に当該コード配列に作動可能に連結されることになる。
【0140】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、一般的に、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ及びその他のタンパク質（トランス作用性転写因子）の認識及び結合に関与して、１つ以上のコード配列の転写を開始及び制御するＤＮＡ配列に関し、一般的に転写の方向に対してコード配列の上流に位置する。
【0141】
本明細書で使用する場合、複数もしくは単数の用語「逆方向末端反復配列」または「ＩＴＲ」は、ベクターの一端に位置し、ベクターの反対端に位置する相補的配列と併用されるとヘアピン構造を形成できる配列を指す。この逆方向末端反復配列の対は、宿主ゲノム内においてＡＡＶ ＤＮＡのレスキュー、複製及びパッケージングに関与する。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＤＮＡの効率的なカプシド形成及び完全にアセンブルされたＡＡＶ粒子の生成にも必要とされる。
【0142】
改変カプシドタンパク質またはＶＰ１配列を含む本開示のＡＡＶの文脈で使用する用語「改善された機能性」または同様の用語は、改変カプシドタンパク質またはＶＰ１配列を含むＡＡＶが、改変されなかった、昆虫細胞内で生成される同じ血清型の野生型ＡＡＶに比べて改善されたエンドソーム脱出能を有することを意味すると理解すべきである。本明細書で使用する場合、用語「エンドソーム脱出能（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、エンドソーム脱出能（ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｅｓｃａｐｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、または同様の用語は、細胞の内部移行後にエンドソーム区画から脱出するＡＡＶの能力を意味すると理解すべきである。ＡＡＶ機能性の文脈においては、細胞の内部移行後にエンドソームから脱出できないＡＶＶは、特に遺伝子治療の文脈では機能的でないと認められる。
【0143】
改変ＡＡＶ生成のためのＤＮＡ構築物
本開示は、一般的に、特に改変ＶＰ１配列及び関連ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）ドメインを含む改変ウイルスカプシドタンパク質を有するＡＡＶに関し、昆虫細胞内で産生されるとき（対応する野生型ＡＡＶに比べて）改善または修復された機能性を有する。本開示は、該改変ＡＡＶの生成ならびに遺伝子治療の場合のような哺乳動物細胞における外因性核酸の導入及び／または発現のためのベクターとしてのその使用にも関する。
本開示は、一般的に、特に改変ＶＰ１配列及び関連ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）ドメインを含む改変ウイルスカプシドタンパク質を有するＡＡＶに関し、昆虫細胞内で産生されるとき（対応する野生型ＡＡＶに比べて）改善または修復された機能性を有する。本開示は、該改変ＡＡＶの生成ならびに遺伝子治療の場合のような哺乳動物細胞における外因性核酸の導入及び／または発現のためのベクターとしてのその使用にも関する。
【0144】
ＡＡＶは、一般的にヒト（例えば、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３）または霊長類（例えば、血清型１及び４）に感染する。全ての既知ＡＡＶ血清型のゲノム構成は非常に類似している。ＡＡＶのゲノムは直鎖状の一本鎖ＤＮＡ分子であり、一般的に約５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長未満である。逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）は、非構造性複製（Ｒｅｐ）タンパク質及び構造性（ＶＰ）タンパク質に特有のコードヌクレオチド配列と隣接する。ＶＰタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）はカプシドを形成する。ＡＡＶカプシドアセンブリは、ＶＰ２及びＶＰ３ ＯＲＦのコード配列内にあるカプシド遺伝子のインフレームのオープンリーディングフレームによってコードされるアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）の発現を必要とする（Ｓｏｎｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）ＰＮＡＳ，１０７（２２）：１０２２０－１０２２５）。末端の１４５ｎｔは自己相補的であり、Ｔ字形ヘアピンを形成するエネルギー的に安定した分子内二本鎖、すなわち逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が形成されるように構築される。これらのヘアピン構造は、ウイルスＤＮＡ複製の起点として機能し、細胞のＤＮＡポリメラーゼ複合体のプライマーとして役立つ。哺乳動物細胞内での野生型ＡＡＶ（ｗｔＡＡＶ）の感染後に、Ｒｅｐ遺伝子（すなわちＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２）がそれぞれＰ５プロモーター及びＰ１９プロモーターから発現される。Ｒｅｐ７８タンパク質は、ウイルスゲノムの複製において機能を有し、一方でＲｅｐ５２タンパク質は、ウイルス粒子中に新生ゲノムを動員する。ＲｅｐのＯＲＦにおけるスプライシング現象が４つのＲｅｐタンパク質（すなわちＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかしながら、哺乳動物細胞内では、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングされていないｍＲＮＡでＡＡＶベクター産生に十分であることが示されている。昆虫細胞内でも、ＡＡＶベクター産生にはＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質で十分である。３つのカプシドタンパク質、すなわちＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、ｐ４０プロモーターからの単一のＶＰリーディングフレームから発現される。
【0145】
ＡＡＶ（特に昆虫細胞内で産生されるもの）の機能性に特に重要なのは、保存ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）モチーフを含有するＶＰ１サブユニットであり、ＰＬＡ２の活性は、エンドソーム脱出に必要であり、脱出後に宿主細胞の核内にウイルスゲノムを移行させることが示されている。血清型２のＡＡＶは、昆虫細胞内で発現されるとＰＬＡ２活性を保持し、それによってその機能性を保持することが示されているが、他の血清型のＡＡＶは、パルボウイルス科全体のこのドメインの一般的保存にもかかわらず、欠陥のあるＰＬＡ２活性を有する。この欠陥のあるＰＬＡ２活性は、昆虫細胞において、血清型２以外の機能的ＡＡＶを産生する能力を制限している。ＰＬＡ２モチーフを含有するＡＡＶ ＶＰ１配列、またはそのＮ末端部をＡＡＶ２ ＶＰ１の対応する配列と置き換える（ドメイン交換）キメラＡＡＶ２／５ ＶＰ１タンパク質の構築を含め、多くの手法を利用してさまざまな効果に対してこの問題に取り組んでいる。野生型と血清型２の両方のＶＰ１配列を発現するＡＡＶをもたらすＡＡＶ２ ＶＰ１をベースとするモザイクの産生も報告されている。これらの手法は、昆虫細胞内で発現されるときにさまざまな程度まで機能性を改善すると報告されているが、昆虫細胞内でＡＡＶベクターを生成するためのバキュロウイルス系は臨床環境での使用がまだ制限されている。本開示においては、昆虫細胞内でバキュロウイルス系から発現されるときにＡＡＶ２以外の血清型からのＡＡＶのその後の機能性を改善することが示されている、ＡＡＶ ＶＰ１配列への部位特異的改変を含む新規手法について記載する。この改善された機能性は、エンドソーム区画から脱出するビリオンの能力によって与えられる。
【0146】
従って、本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、ウイルスカプシドタンパク質が、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含む改変サブユニット１（ＶＰ１）配列を含み、アミノ酸位置は、配列番号１に記載される配列に関して規定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか１以上のアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか１以上の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されていない、核酸分子を提供する。
【0147】
一例において、配列番号１に記載される配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか２、３、４、５または６つのアミノ酸は、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変される。
【0148】
ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、血清型２以外の、一般的にヒトに感染するＡＡＶのいずれか１つ（例えば、血清型１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３）に由来し得る。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型３に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型４に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型５に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型６に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型７に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型８に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型９に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１０に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１１に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１２に由来する。一例において、ウイルスカプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型１３に由来する。
【0149】
ＡＡＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１５～２６のいずれか１つに記載される配列を含む改変ＶＰ１をコードし得る。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ１に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号１５に記載される配列を含む。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ３に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号１６に記載される配列を含む。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ４に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号１７に記載される配列を含む。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ５に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号１８に記載される配列を含む。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ６に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号１９に記載される配列を含む。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ７に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号２０に記載される配列を含む。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ８に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号２１に記載される配列を含む。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ９に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号２２に記載される配列を含む。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ１０に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号２３に記載される配列を含む。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ１１に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号２４に記載される配列を含む。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ１２に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号２５に記載される配列を含む。一例において、ウイルスカプシドタンパク質はＡＡＶ１３に由来し、改変ＶＰ１配列は、配列番号２６に記載される配列を含む。
【0150】
前述の各例において、ウイルスカプシドタンパク質は、改変ＶＰ１と同じＡＡＶ血清型由来のサブユニット２（ＶＰ２）及びサブユニット３（ＶＰ３）配列を含み得る。好ましくはＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、同じＯＲＦから発現される。
【0151】
本明細書に記載どおりにＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、昆虫細胞内でのカプシドタンパク質の発現に適したプロモーターに作動可能に連結され得る。昆虫細胞内での発現に適したプロモーターは技術上周知であり、本明細書で使用するために企図される。この関連で、昆虫細胞内におけるポリペプチドの分子操作及び発現に関する方法論は、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５，Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘ．（１９８６）；Ｌｕｃｋｏｗ．，Ｉｎ Ｐｒｏｋｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ'ｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，９７－１５２（１９９１）；Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（１９９２）；Ｏ'Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ Ｌｕｃｋｏｗ，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３９（１９９２）；ＵＳ Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７４５，０５１；ＵＳ２００３１４８５０６；ＷＯ２００３／０７４７１４；Ｋｏｔｉｎ ＲＭ（２０１１）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０（Ｒ１）：Ｒ２－Ｒ６；Ａｕｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５（６）；１０８１－１０９２；及びｖａｎ Ｏｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９６：６－２３に記載されている。技術上周知のプロモーター及び他の該調節要素は、本開示の核酸に使用するために明白に企図される。ある特定の例においては、プロモーターは多角体プロモーターまたはｐ１０プロモーターである。
【0152】
本明細書に記載のように、ＡＡＶカプシドアセンブリは、非構造性タンパク質、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）の発現を必要とする。従って、前述の各例において、本明細書に記載される核酸分子は、ＡＡＰをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
【0153】
本明細書に記載のように、ＡＡＶゲノムは、Ｒｅｐ遺伝子（すなわちＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２）を含み、これらがコードするタンパク質がウイルスゲノムの複製で機能する。Ｒｅｐ ＯＲＦにおけるスプライシング現象が４つのＲｅｐタンパク質（すなわちＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０）の発現をもたらす。しかしながら、昆虫細胞内ではＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質をコードするスプライシングされていないｍＲＮＡでＡＡＶベクター産生に十分であることが示されている。従って、一例において、本開示の核酸分子は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製Ｒｅｐタンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をも含む。一例において、本明細書に記載の核酸分子は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、本明細書に記載の核酸分子は、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、本明細書に記載の核酸分子は、ウイルスカプシドタンパク質と同じＡＡＶ血清型由来のＲｅｐ６８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、本明細書に記載の核酸分子は、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、本明細書に記載の核酸分子は、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含む。前述の各例において、それぞれの小型及び大型Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質と同じＡＡＶ血清型に由来し得る。代わりに、それぞれの小型及び大型Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質のＡＡＶ血清型以外のＡＡＶ血清型に由来し得る。例えば、Ｒｅｐタンパク質はＡＡＶ血清型２に由来し得る。
【0154】
Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、昆虫細胞内でのＲｅｐタンパク質の発現に適したプロモーターに作動可能に連結され得る。昆虫細胞内での発現に適したプロモーターは技術上周知であり、本明細書で使用するために企図される。ある特定例においては、プロモーターは、多角体プロモーターまたはｐ１０プロモーターであり得る。それぞれのＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、同一プロモーターに作動可能に連結され得る。代わりに、Ｒｅｐタンパク質をコードする各配列が、それ自体のプロモーターに作動可能に連結され得る。
【0155】
改変ＶＰ１配列をコードする核酸は、インシリコで、例えば、野生型ＡＡＶ配列または野生型ＡＡＶ配列由来の天然起源のバリアントＡＡＶ配列に基づいて設計可能であり、該核酸配列を含むＤＮＡ構築物は、技術上周知の方法を用いて合成可能である。代わりに、または加えて、本明細書に記載される対応する野生型ＶＰ１配列（または当該野生型ＡＡＶ配列由来の天然起源のバリアントＡＡＶ配列）に対するＶＰ１配列への改変は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されているような周知の遺伝子操作技術の適用によって達成可能である。ＶＰコード配列の種々のさらなる改変は当業者に知られており、ＶＰ及びビリオンの収率を高めるかまたは他の望ましい効果、例えば向性変化を有するかまたはビリオンの抗原性を低減させることができる。これらの改変は本開示の範囲内である。
【0156】
例えば、本明細書に記載のように昆虫細胞内における改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶの生成のために本開示で使用し得るＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノムに由来することができる。一般的に、ＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで顕著な相同性のゲノム配列を有し、同一セットの遺伝的機能をもたらし、物理的及び機能的に類似するビリオンを生成し、かつ実際に同一の機構（本明細書に記載のＰＬＡ２ドメインの活性の特異的除外を伴う）によって複製及びアセンブルする。本開示の改変ＡＡＶの設計及び生成に用いるＡＡＶに適した核酸及びタンパク質配列は、公に入手可能である。ヒトに感染することが分かっている（及び本明細書で企図される）野生型ＡＡＶに関するＶＰ１配列は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｊ．Ｖｉｒ．８７（１１）：６３９１－６４０５に記載されている。ヒトまたはサルのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型は、本開示の文脈で用いるＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい起源であり、一般的にヒトに感染するＡＡＶ血清型（例えば、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３）がさらに好ましい。ＡＡＶ血清型１～１３に関するカプシドポリペプチド配列は技術上周知であり、例えば、ＡＡＶ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＤ２７７５７．１，ＧＩ：４６８９０９７）、ＡＡＶ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＣ０３７８０．１，ＧＰ．２９０６０２３）、ＡＡＶ３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＣ５５０４９．１，ＧＩ：１４０８４６９）、ＡＡＶ４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＣ５８０４５．１，ＧＬ２３３７９４０）、ＡＡＶ５（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＤ１３７５６．１，ＧＩ－４２４９６５８）、ＡＡＶ１０（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＴ４６３３７．１，ＧＬ４８７２８３４３）、ＡＡＶ１１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＴ４６３３９．１，ＧＩ：４８７２８３４６）、ＡＡＶ１２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢＩ１６６３９．１，ＧＩ：１１２３７９６５６）、またはＡＡＶ１３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢＺ１０８１２．１，ＧＩ：１６７０４７０８７）である。血清型１～１３に関するＡＡＶカプシドタンパク質のポリペプチド配列は、本明細書の配列番号２７～３９にも記載されている。さらに、血清型1～１３由来のＡＡＶに関する全ゲノムは技術上周知であり、例えば、ＡＡＶ１（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００２０７７．１）、ＡＡＶ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｊ０１９０１．１）、ＡＡＶ３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ０２８７０５．１）、ＡＡＶ４（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００１８２９．１）、ＡＡＶ５（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００６１５２．１）、ＡＡＶ６（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＦ０２８７０４．１）、ＡＡＶ７（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００６２６０．１）、ＡＡＶ８（ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００６２６１．１）、ＡＡＶ９（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ５３０５７９．１）、ＡＡＶ１０（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ６３１９６５．１）、ＡＡＶ１１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＹ６３１９６６．１）またはＡＡＶ１２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＤＱ８１３６４７．１）である。
【0157】
本開示は、本開示の核酸によってコードされる改変ＶＰ１配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質をも提供する。
【0158】
改変ＡＡＶの生成のためのバキュロウイルスベクター
本開示は、昆虫細胞適合ベクター、すなわち、バキュロウイルスベクター内の本開示の核酸分子をも提供する。特に、本開示は、本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸分子を含むバキュロウイルスベクターを提供する。
本開示は、昆虫細胞適合ベクター、すなわち、バキュロウイルスベクター内の本開示の核酸分子をも提供する。特に、本開示は、本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸分子を含むバキュロウイルスベクターを提供する。
【0159】
本開示は、下記：
（ｉ）本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクター；及び
（ｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第２のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクターをも提供する。
（ｉ）本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクター；及び
（ｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第２のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクターをも提供する。
【0160】
一例において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、第１のバキュロウイルスベクター内の核酸分子によってコードされるウイルスカプシドタンパク質と同じ血清型に由来する。別の例において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、別のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ２に由来する。
【0161】
典型的に、目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、隣接ＩＴＲを含めて、５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長以下である。しかしながら、特大、すなわち５，０００ｎｔ長より大きいＤＮＡをコードするポリヌクレオチドも企図される。本明細書では特大ＤＮＡは、５ｋｂｐという最大ＡＡＶパッケージング制限を超えるＤＮＡと理解される。従って、通常は５．０ｋｂより大きいゲノムによってコードされる組換えタンパク質またはＲＮＡを産生可能なＡＡＶベクターの生成も実現可能であり得る。
【0162】
哺乳動物細胞内での発現のための目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、昆虫細胞内で複製され、かつ複製されたＡＡＶゲノム中に組み込まれるように、バキュロウイルスベクター内に配置されることになる。本開示に従って生成されたＡＡＶでトランスフェクトされた哺乳動物細胞内での後の発現のために、構築物がＡＡＶビリオンのパッケージング容量以内にとどまる限り、任意のヌクレオチド配列を組み込むことができる。ポリヌクレオチド配列は、例えば、目的のタンパク質をコードし得るかまたはＲＮＡｉ作用物質、すなわち、例えば、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）もしくは低分子ヘアピン型マイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲ）のようなＲＮＡ干渉可能なＲＮＡ分子を発現し得る。一例において、目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、複数の目的のタンパク質、複数のＲＮＡｉ作用物質、または目的の１以上のタンパク質及び１以上のＲＮＡｉ作用物質をコードする。哺乳動物細胞内での発現のための目的のタンパク質は、治療用遺伝子産物であり得る。治療用遺伝子産物は、標的細胞内で発現されると、例えば、望ましくない活性の除去、例えば、感染細胞の除去、もしくは例えば、酵素活性の欠乏を引き起こす遺伝子欠陥の補完のような望ましい治療効果をもたらすポリペプチド、またはＲＮＡ分子（例えば本明細書に記載されるｓｈＲＮＡまたはｓｈｍｉＲ）、または他の遺伝子産物であり得る。代わりに、または加えて、ポリヌクレオチドによってコードされる目的のタンパク質は、細胞の形質転換及び発現を評価するためのマーカータンパク質として役立ち得る。この目的に適したマーカータンパク質は、例えば、蛍光タンパク質ＧＦＰまたはホタルルシフェラーゼである。これらのマーカー遺伝子を得るための原料及びそれらの使用方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに提供されている。
【0163】
第１のバキュロウイルスベクターがＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードしない例によれば、複数のバキュロウイルスベクターは、さらに下記：
（ｉｉｉ）Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む第３のバキュロウイルスベクター
を含む。
（ｉｉｉ）Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む第３のバキュロウイルスベクター
を含む。
【0164】
例えば、第３のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。例えば、第３のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。例えば、第３のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。例えば、第３のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。例えば、第３のバキュロウイルスベクターは、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。第３のバキュロウイルスベクターについて記載する前述の各例において、それぞれの小型及び大型Ｒｅｐタンパク質は、第１のバキュロウイルスベクターによってコードされるウイルスカプシドタンパク質と同じＡＡＶ血清型に由来し得る。代わりに、それぞれの小型及び大型Ｒｅｐタンパク質は、第１のバキュロウイルスベクターによってコードされるウイルスカプシドタンパク質のＡＡＶ血清型以外のＡＡＶ血清型に由来し得る。例えば、Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ血清型２に由来し得る。この関連で、Ｒｅｐ配列は、ほとんどの血清型の間で特に保存され、Ｒｅｐ配列は昆虫細胞内で効率的に交差補完すると報告されている。
【0165】
複数のバキュロウイルスベクターについて記載する前述の各例において、第３のバキュロウイルスベクター内でＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、昆虫細胞内でのＲｅｐタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結され得る。昆虫細胞内でのタンパク質の発現に適したプロモーターは記載されており、特に別段の定めをした場合を除き、変更すべきところは変更して、バキュロウイルスベクターについて記載する本開示の例に当てはまると解釈すべきである。
【0166】
複数のバキュロウイルスベクターの少なくとも１つは、ＡＡＶカプシドアセンブリに必要とされるアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするポリヌクレオチドを含むことになる。一例において、カプシドタンパク質をコードするバキュロウイルスベクターは、ＡＡＰをコードするポリヌクレオチドを含む。代替例においては、Ｒｅｐタンパク質をコードするバキュロウイルス及び／または目的のタンパク質もしくはＲＮＡをコードするバキュロウイルスは、ＡＡＰをコードするポリヌクレオチドを含む。
【0167】
バキュロウイルスベクターならびにそれらの生成方法及び使用方法は技術上周知であり、昆虫細胞の遺伝子操作に関する上記引用文献に記載されている。
【0168】
昆虫細胞
本明細書では、本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする本開示の核酸分子を含む昆虫細胞をも提供する。
本明細書では、本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする本開示の核酸分子を含む昆虫細胞をも提供する。
【0169】
昆虫細胞は、好ましくは（ｉ）Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質と、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質とをコードするポリヌクレオチド配列、ならびに（ｉｉ）ＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをも含むことになる。大型及び小型Ｒｅｐタンパク質の特定の組み合わせ、ならびに適切なＩＴＲについては、本明細書に、例えば、本開示のバキュロウイルスベクターの文脈に記載してあり、特に別段の定めをした場合を除き、変更すべきところは変更して、昆虫細胞について記載する本開示の例に当てはまると解釈すべきである。同様に、昆虫細胞により産生されたＡＡＶのゲノムへの組み込みのために目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に、例えば、本開示のバキュロウイルスベクターの文脈に記載してあり、特に別段の定めをした場合を除き、変更すべきところは変更して、昆虫細胞について記載する本開示の例に当てはまると解釈すべきである。
【0170】
好ましくは、（ｉ）本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする本開示の核酸分子、（ｉｉ）Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）ＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドをそれぞれバキュロウイルスベクターに導入し、昆虫細胞を感染させるために使用する。好ましくは、（ｉ）～（ｉｉｉ）の少なくとも１つは、アセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）ＡＡＶカプシドアセンブリをコードするポリヌクレオチドをも含むことになる。従って、本明細書に記載の昆虫細胞は、感染性かつ安定したＡＡＶビリオンの発現及びアセンブリを可能にするのに必要な成分を含むべきである。一例において、昆虫細胞は、エピソームとして複製する組換えバキュロウイルスを含み得る。
【0171】
本開示は、感染性かつ安定したＡＡＶビリオンを生成することができる、本明細書に記載どおりに１つのバキュロウイルスベクターまたは複数のバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞をも提供する。一例において、昆虫細胞は、本明細書に記載どおりにバキュロウイルスベクターまたは複数のバキュロウイルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされている。昆虫細胞が本開示のバキュロウイルスベクターまたは複数のバキュロウイルスベクターで形質転換またはトランスフェクトされている例によれば、（ｉ）本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする本開示の核酸分子、（ｉｉ）Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）ＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドはそれぞれ、エピソームとして複製する組換えバキュロウイルスゲノムから発現されることになる。
【0172】
本開示によれば、バキュロウイルスの複製を可能にし、かつ培養下で維持できるいずれの昆虫細胞をも使用することができる。例えば、使用する細胞株は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、ショウジョウバエ細胞株、または蚊細胞株、例えば、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来細胞株からのものであり得る。好ましい昆虫細胞または細胞株は、バキュロウイルス感染しやすい昆虫種由来の細胞であり、例えば、ｅｘｐｒｅｓＳＦ＋(登録商標)、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２（Ｓ２）細胞、Ｓｅ３０１、ＳｅＩＺＤ２１０９、ＳｅＵＣＲｌ、Ｓｆ９、Ｓｆ９００＋、Ｓｆ２１、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂｌ－４、ＭＧ－Ｉ、５Ｔｎ３６８、ＨｚＡｍｌ、Ｈａ２３０２、及びＨｚ２Ｅ５が挙げられる。
【0173】
改変ＡＡＶの生成方法
本開示は、改変ＶＰ１配列を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶの生成方法であって、本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列をコードする核酸が、昆虫細胞内で発現され、その中でＡＡＶがアセンブルされる、方法をも提供する。一例において、本開示は、昆虫細胞内でのＡＡＶの生成方法であって、下記：
（ｉ）本明細書に記載どおりに昆虫細胞を培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉ）培地及び／または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法をも提供する。
本開示は、改変ＶＰ１配列を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶの生成方法であって、本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列をコードする核酸が、昆虫細胞内で発現され、その中でＡＡＶがアセンブルされる、方法をも提供する。一例において、本開示は、昆虫細胞内でのＡＡＶの生成方法であって、下記：
（ｉ）本明細書に記載どおりに昆虫細胞を培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉ）培地及び／または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法をも提供する。
【0174】
別の例において、本開示は、昆虫細胞内でのＡＡＶの生成方法であって、下記：
（ｉ）昆虫細胞を、本明細書に記載の改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする本開示の核酸分子を含み、かつＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルスベクターと、本明細書に記載どおりにＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第２のバキュロウイルスベクターとに同時感染させること；
（ｉｉ）（ｉ）でバキュロウイルスベクターに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉｉ）培地及び／または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法を提供する。
（ｉ）昆虫細胞を、本明細書に記載の改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする本開示の核酸分子を含み、かつＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルスベクターと、本明細書に記載どおりにＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第２のバキュロウイルスベクターとに同時感染させること；
（ｉｉ）（ｉ）でバキュロウイルスベクターに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉｉ）培地及び／または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法を提供する。
【0175】
別の例において、本開示は、昆虫細胞内でのＡＡＶの生成方法であって、下記：
（ｉ）昆虫細胞を、本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする本開示の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルスベクターと、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第２のバキュロウイルスベクターと、ＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第３のバキュロウイルスベクターとに同時感染させること；
（ｉｉ）（ｉ）でバキュロウイルスベクターに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉｉ）培地または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法を提供する。
（ｉ）昆虫細胞を、本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列を有するＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする本開示の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルスベクターと、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第２のバキュロウイルスベクターと、ＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第３のバキュロウイルスベクターとに同時感染させること；
（ｉｉ）（ｉ）でバキュロウイルスベクターに感染した昆虫細胞を、培地内で細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉｉ）培地または細胞からＡＡＶを回収すること
を含む方法を提供する。
【0176】
前述の各例において、Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質と同じＡＡＶ血清型に由来し得る。代わりに、Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質のＡＡＶ血清型と異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。例えば、Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ血清型２に由来し得る。
【0177】
同様に、前述の各例において、ＩＴＲ配列は、ウイルスカプシドタンパク質と同じＡＡＶ血清型に由来し得る。代わりに、ＩＴＲ配列は、ウイルスカプシドタンパク質のＡＡＶ血清型と異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ血清型２に由来し得る。
【0178】
複数のバキュロウイルスベクターの少なくとも１つは、ＡＡＶカプシドアセンブリのためのアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするポリヌクレオチドをも含むことになる。一例において、カプシドタンパク質をコードするバキュロウイルスベクターは、ＡＡＰをコードするポリヌクレオチドを含む。代替例において、Ｒｅｐタンパク質をコードするバキュロウイルス及び／または目的のタンパク質もしくはＲＮＡをコードするバキュロウイルスは、ＡＡＰをコードするポリヌクレオチドを含む。
【0179】
方法が本明細書に記載のバキュロウイルスベクターに昆虫細胞を感染させることを含む例によれば、当技術分野で知られているいずれの通常の方法をも利用し得る。昆虫細胞内でのＡＡＶ等のウイルスの生成に適した培地及び条件は技術上周知であり、本明細書で企図される。例えば、昆虫細胞内でのＡＡＶ及びポリペプチドの分子操作及び発現に関する方法論は、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌ．Ｎｏ．７５５５，Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｔｅｘ．（１９８６）；Ｌｕｃｋｏｗ．，Ｉｎ Ｐｒｏｋｏｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ’Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，９７－１５２（１９９１）；Ｋｉｎｇ，Ｌ．Ａ ａｎｄ Ｒ．Ｄ．Ｐｏｓｓｅｅ，Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ（１９９２）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｌ．Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ａ Ｌｕｃｋｏｗ，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ ３９（１９９２）；ＵＳ Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７４５，０５１；ＵＳ２００３１４８５０６；ＷＯ２００３／０７４７１４；Ｋｏｔｉｎ ＲＭ（２０１１） Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２０（Ｒ１）：Ｒ２－Ｒ６；Ａｕｃｏｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９５（６）：１０８１－１０９２；及びｖａｎ Ｏｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１５） Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９６：６－２３に記載されている。
【0180】
適切な大型及び小型Ｒｅｐタンパク質、ＩＴＲ配列、ならびに目的のタンパク質またはＲＮＡは、本明細書に、例えば、本開示のバキュロウイルスベクターの文脈に記載してあり、特に別段の定めをした場合を除き、変更すべきところは変更して、ＡＡＶの生成方法について記載する本開示の例に当てはまると解釈すべきである。一例において、本明細書に記載の方法は、昆虫細胞を本開示の複数のバキュロウイルスベクターで同時トランスフェクトさせることを含む。
【0181】
ＡＡＶの生成方法を記載する前述の各例において、バキュロウイルスベクター内でＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、昆虫細胞内でのＲｅｐタンパク質の発現のためのプロモーター（及び場合により他の調節要素）に作動可能に連結され得る。同様に、ＡＡＶ ＩＴＲ配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列は、昆虫細胞内での発現のためのプロモーター（及び場合により他の調節要素）に作動可能に連結され得る。昆虫細胞内での発現に適したプロモーターは技術上周知であり、本明細書に記載されており、特に別段の定めをした場合を除き、変更すべきところは変更して、ＡＡＶの生成方法について記載する本開示の例に当てはまると解釈すべきである。一例において、プロモーターは多角体プロモーターまたはｐ１０プロモーターである。
【0182】
一例において、ＡＡＶの生成方法は、培地及び／または細胞からＡＡＶを回収する工程を含む。別の例において、ＡＡＶの生成方法は、培地及び／または細胞からＡＡＶを回収してからＡＡＶを精製する工程を含む。一例において、ＡＡＶは細胞から回収される。一例において、ＡＡＶは培地から回収される。一例において、ＡＡＶは細胞及び培地から回収される。培地及び／または細胞からのＡＡＶの回収及び精製に適した方法は技術上周知であり、本明細書で使用するために企図される。例えば、該方法は、イオジキサノールに基づく密度勾配精製後の塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配遠心分離を含み得る。例えば、該方法は、抗ＡＡＶ抗体、好ましくは固定化抗体を用いるＡＡＶの親和性精製を含み得る。抗ＡＡＶ抗体はモノクローナル抗体であり得る。特に適切な抗体は、ラクダまたはラマから得られるように一本鎖ラクダ抗体またはその断片である（例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２００１） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：２７７－３０２参照）。ＡＡＶの親和性精製用の抗体は、好ましくはＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープ、例えば複数のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質上に存在するエピトープに特異的に結合する抗体である（異なる血清型由来のＡＶＶの精製を可能にするため）
【0183】
組換えＡＡＶの構築及び精製については以前に記載されている。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号、第５，１３９，９４１号、第５，８６３，５４１号、及び第５，８６９，３０５号、第６，０５７，１５２号、第６，３７６，２３７号；Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１－８０１；及びＢｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４２３－４３２を参照されたい。該方法は、記載されたとおりに本明細書で使用するために企図される。
【0184】
本開示は、本明細書に記載の方法によって生成される改変ＶＰ１配列を有するウイルスカプシドタンパク質を含むＡＡＶをも提供する。
【0185】
本開示は、昆虫細胞内で産生される血清型２以外の血清型由来のＡＡＶの機能性の改善方法であって、ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、該ウイルスカプシドタンパク質が、位置１のセリン、位置２６のグルタミン酸、位置４０のアルギニン、位置４３のアスパラギン酸、位置４４のセリン及び／または位置６４のリジンの１つ以上を含むように、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４の１以上のアミノ酸を置換することによって、対応する野生型配列に対して改変することを含み、残基位置は、配列番号１に記載される配列に関して決定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び／または６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されず、かつＡＡＶは、昆虫細胞内で産生されるときに改変されなかった対応する野生型ＡＡＶに比べて、昆虫細胞内で産生されるときに改善された機能性を有する、方法をも提供する。ＡＡＶの機能性の改善は、細胞の内部移行後にＡＡＶがエンドソーム区画から脱出するＡＡＶの能力の改善に起因することになる。改変ＶＰ１配列を含むＡＡＶウイルスカプシドタンパク質については本明細書に記載してあり、これらのいずれの例も、特に別段の定めをした場合を除き、変更すべきところは変更して、本明細書に記載どおりにＡＡＶの機能性を改善する方法に当てはまるものと解釈すべきである。
【0186】
一例において、ＡＡＶの機能性の改善方法は、ウイルスカプシドタンパク質が、位置１のセリン、位置２６のグルタミン酸、位置４０のアルギニン、位置４３のアスパラギン酸、位置４４のセリン及び／または位置６４のリジンの２つ以上を含むように、ＶＰ１配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸のいずれか２つ以上を、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変することを含み、残基位置は、配列番号１に記載される配列に関して決定される。一例において、ＡＡＶの機能性の改善方法は、ウイルスカプシドタンパク質が、位置１のセリン、位置２６のグルタミン酸、位置４０のアルギニン、位置４３のアスパラギン酸、位置４４のセリン及び／または位置６４のリジンの３つ以上を含むように、ＶＰ１配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸のいずれか３つ以上を、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変することを含み、残基位置は、配列番号１に記載される配列に関して決定される。一例において、ＡＡＶの機能性の改善方法は、ウイルスカプシドタンパク質が、位置１のセリン、位置２６のグルタミン酸、位置４０のアルギニン、位置４３のアスパラギン酸、位置４４のセリン及び／または位置６４のリジンの４つ以上を含むように、ＶＰ１配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸のいずれか４つ以上を、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変することを含み、残基位置は、配列番号１に記載される配列に関して決定される。一例において、ＡＡＶの機能性の改善方法は、ウイルスカプシドタンパク質が、位置１のセリン、位置２６のグルタミン酸、位置４０のアルギニン、位置４３のアスパラギン酸、位置４４のセリン及び／または位置６４のリジンの５つ以上を含むように、ＶＰ１配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸のいずれか５つ以上を、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変することを含み、残基位置は、配列番号１に記載される配列に関して決定される。一例において、ＡＡＶの機能性の改善方法は、ウイルスカプシドタンパク質が、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含むように、ＶＰ１配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４の各アミノ酸を、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変することを含み、残基位置は、配列番号１に記載される配列に関して決定される。
【0187】
本開示の方法は、配列番号１５～２６のいずれか１つに記載される配列を含むＶＰ１配列を有するウイルスカプシドタンパク質を含むＡＡＶを提供することができる。ＡＡＶは、一般的にヒトに感染するいずれの血清型に由来してもよい（例えば、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３）。
【0188】
一例において、本方法は、ＡＡＶのウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、下記：
（ｉ）ＡＡＶが血清型１のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉ）ＡＡＶが血清型３のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉｉ）ＡＡＶが血清型４のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１７に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｖ）ＡＡＶが血清型５のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１８に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖ）ＡＡＶが血清型６のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１９に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉ）ＡＡＶが血清型７のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２０に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉ）ＡＡＶが血清型８のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉｉ）ＡＡＶが血清型９のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｘ）ＡＡＶが血清型１０のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２３に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘ）ＡＡＶが血清型１１のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２４に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘｉ）ＡＡＶが血清型１２のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；及び
（ｘｉｉ）ＡＡＶが血清型１３のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む
ように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
（ｉ）ＡＡＶが血清型１のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉ）ＡＡＶが血清型３のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉｉ）ＡＡＶが血清型４のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１７に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｖ）ＡＡＶが血清型５のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１８に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖ）ＡＡＶが血清型６のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１９に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉ）ＡＡＶが血清型７のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２０に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉ）ＡＡＶが血清型８のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉｉ）ＡＡＶが血清型９のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｘ）ＡＡＶが血清型１０のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２３に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘ）ＡＡＶが血清型１１のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２４に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘｉ）ＡＡＶが血清型１２のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；及び
（ｘｉｉ）ＡＡＶが血清型１３のものであるとき、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む
ように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0189】
一例において、本方法は、ＡＡＶ１のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、ＡＡＶ３のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、ＡＡＶ４のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１７に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、ＡＡＶ５のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１８に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、ＡＡＶ６のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号１９に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、ＡＡＶ７のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２０に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、ＡＡＶ８のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、ＡＡＶ９のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、ＡＡＶ１０のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２３に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、ＡＡＶ１１のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２４に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、ＡＡＶ１２のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。一例において、本方法は、ＡＡＶ１３のウイルスカプシドタンパク質のＶＰ１配列を、ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、対応する野生型配列に対して改変することを含む。
【0190】
本明細書に記載どおりにＡＡＶの機能性の改善する方法は、改変ＡＡＶの機能性を、対応する野生型ＡＡＶに関して解析する工程をさらに含み得る。すなわち、本方法は、本明細書に記載され及び／または本明細書に記載の方法によって生成された改変もしくは野生型ＡＡＶに哺乳動物細胞を感染させ、機能性のレベルを判定することをさらに含み得る。例えば、ＡＡＶの機能性は、ＡＡＶに感染後に哺乳動物細胞内での目的のタンパク質またはＲＮＡの発現レベルを決定することによって判定可能である。ビリオンの機能性を判定するための機能性アッセイは、例えば、Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８３：９７３-９７８；Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１（１０）：１２７３－１２８５に記載されているように、技術上周知であり、本明細書で使用するために企図さる。ウイルスの感染性及び／または機能性を検定するのに適したアッセイとしては、限定するものではないが、（１）Ａ２０酵素結合免疫吸着検定法によるカプシド力価；（２）定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によるベクターゲノム力価；ならびに（３）５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）とｑＰＣＲ解読による感染力価及び（４）レポーター遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質［ＧＦＰ］による形質導入を検定することによる感染力価が挙げられる。
【0191】
本明細書に記載どおりにＡＡＶの機能性を改善する方法は、本明細書に記載どおりに改変ＡＡＶ ＶＰ１配列をコードする核酸または本明細書に記載どおりに該核酸を含むバキュロウイルスベクターを準備することを含み得る。代わりに、または加えて、本明細書に記載どおりにＡＡＶの機能性を改善する方法は、本明細書に記載どおりに改変ＶＰ１配列を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶを生成することを含み得る。
【0192】
改変ＶＰ１を有するＡＡＶ
本開示は、改変ＶＰ１配列を有するウイルスカプシドタンパク質を含むＡＡＶであって、前記改変ＶＰ１配列が、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含み、アミノ酸位置は、配列番号１に記載される配列に関して規定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか１以上のアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか１以上の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されていない、ＡＡＶをも提供する。
本開示は、改変ＶＰ１配列を有するウイルスカプシドタンパク質を含むＡＡＶであって、前記改変ＶＰ１配列が、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含み、アミノ酸位置は、配列番号１に記載される配列に関して規定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか１以上のアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか１以上の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されていない、ＡＡＶをも提供する。
【0193】
一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、配列番号１に記載される配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか２、３、４、５または６つのアミノ酸が、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変されている改変ＶＰ１配列を有するウイルスカプシドタンパク質を含む。
【0194】
一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、配列番号１に記載される配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか２以上のアミノ酸が、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変されている改変ＶＰ１配列を有するウイルスカプシドタンパク質を含む。
【0195】
一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、配列番号１に記載される配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか３以上のアミノ酸が、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変されている改変ＶＰ１配列を有するウイルスカプシドタンパク質を含む。
【0196】
一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、配列番号１に記載される配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか４以上のアミノ酸が、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変されている改変ＶＰ１配列を有するウイルスカプシドタンパク質を含む。
【0197】
一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、配列番号１に記載される配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか５以上のアミノ酸が、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変されている改変ＶＰ１配列を有するウイルスカプシドタンパク質を含む。
【0198】
一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、配列番号１に記載される配列の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のそれぞれのアミノ酸が、本明細書に記載どおりに対応する野生型配列に対して改変されている改変ＶＰ１配列を有するウイルスカプシドタンパク質を含む。
【0199】
改変ＶＰ１配列を含むウイルスカプシドタンパク質については本明細書に記載してあり、そのいずれの例も、特に別段の定めをした場合を除き、変更すべきところは変更して、前記改変ＶＰ１配列を含む本開示のＡＡＶに当てはまるものと解釈すべきである。
【0200】
本明細書に記載のＡＡＶは、血清型２以外の、一般的にヒトに感染するＡＡＶのいずれか１つ（例えば、血清型１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３）であってもよい。一例において、ＡＡＶは血清型１のものである。一例において、ＡＡＶは、血清型３のものである。一例において、ＡＡＶは血清型４のものである。一例において、ＡＡＶは血清型５のものである。一例において、ＡＡＶは血清型６のものである。一例において、ＡＡＶは血清型７のものである。一例において、ＡＡＶは血清型８のものである。一例において、ＡＡＶは血清型９のものである。一例において、ＡＡＶは血清型１０のものである。一例において、ＡＡＶは血清型１１のものである。一例において、ＡＡＶは血清型１２のものである。一例において、ＡＡＶは血清型１３のものである。
【0201】
本明細書に記載のＡＡＶは、配列番号１５～２６のいずれか１つに記載される配列を含む改変ＶＰ１を有するカプシドタンパク質を含み得る。一例において、ＡＡＶは血清型１のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号１５に記載される配列を含む。一例において、ＡＡＶは血清型３のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号１６に記載される配列を含む。一例において、ＡＡＶは血清型４のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号１７に記載される配列を含む。一例において、ＡＡＶは血清型５のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号１８に記載される配列を含む。一例において、ＡＡＶは血清型６のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号１９に記載される配列を含む。一例において、ＡＡＶは血清型７のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号２０に記載される配列を含む。一例において、ＡＡＶは血清型８のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号２１に記載される配列を含む。一例において、ＡＡＶは血清型９のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号２２に記載される配列を含む。一例において、ＡＡＶは血清型１０のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号２３に記載される配列を含む。一例において、ＡＡＶは血清型１１のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号２４に記載される配列を含む。一例において、ＡＡＶは血清型１２のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号２５に記載される配列を含む。一例において、ＡＡＶは血清型１３のものであり、改変ＶＰ１配列は、配列番号２６に記載される配列を含む。
【0202】
前述の各例において、本明細書に記載のＡＡＶは、改変ＶＰ１と同じＡＡＶ血清型由来のサブユニット２（ＶＰ２）及びサブユニット３（ＶＰ３）配列を含むウイルスカプシドタンパク質を含む。好ましくはＶＰ１、ＶＰ１及びＶＰ３は、同じＯＲＦから発現される。
【0203】
本明細書に記載されるように、ＡＡＶゲノムは、該ウイルスによってコードされるタンパク質である複製（Ｒｅｐ）遺伝子を含み、これらが該ウイルスゲノムの複製において機能を果たす。従って、一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を含む。一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２を含む。一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ４０を含む。一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ５２を含む。一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ４０を含む。一例において、本明細書に記載のＡＡＶは、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０を含む。前述の各例において、それぞれの小型及び大型Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質と同じＡＡＶ血清型に由来し得る。代わりに、それぞれの小型及び大型Ｒｅｐタンパク質は、ウイルスカプシドタンパク質のＡＡＶ血清型以外のＡＡＶ血清型に由来し得る。例えば、Ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ２に由来し得る。
【0204】
本開示のＡＡＶは、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。
【0205】
一例において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ウイルスカプシドタンパク質と同じ血清型に由来する。別の例において、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ウイルスカプシドタンパク質の血清型以外の血清型に由来する。ある特定例において、ＩＴＲ配列はＡＡＶ血清型２に由来する。
【0206】
本明細書に記載されるように、目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、隣接ＩＴＲを含めて、典型的に５，０００ヌクレオチド（ｎｔ）長以下である。しかしながら、特大ＤＮＡ、すなわち５，０００ｎｔ長より大きいＤＮＡをコードするポリヌクレオチドも企図される。本明細書では特大ＤＮＡは、５ｋｂｐという最大ＡＡＶパッケージング制限を超えるＤＮＡと理解される。従って、本開示のＡＡＶは、通常は５．０ｋｂより大きいゲノムによってコードされるタンパク質またはＲＮＡを発現することができる本開示のＡＡＶも実現可能であり得る。
【0207】
本開示のＡＡＶは、好ましくは、そのゲノムに組み込まれる、哺乳動物細胞内での発現のための、目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むことになる。本開示に従って生成されたＡＡＶでトランスフェクトされた哺乳動物細胞内での後の発現のために、構築物がＡＡＶビリオンのパッケージング容量以内にとどまる限り、任意のヌクレオチド配列を組み込むことができる。目的のタンパク質またはＲＮＡをコードする適切なポリヌクレオチドについては本明細書に既に記載してあり、特に別段の定めをした場合を除き、変更すべきところは変更して、本開示のＡＡＶに当てはまると解釈すべきである。一例において、ＡＡＶゲノムは、本明細書に記載どおりに目的の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、ＡＡＶゲノムは、本明細書に記載どおりにＲＮＡｉ作用物質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、ＡＡＶゲノムは、例えば、本明細書に記載どおりに細胞の形質転換及び発現を評価するためのマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。一例において、ＡＡＶゲノムは、複数のポリヌクレオチド配列を含み、前記複数は、本明細書に記載どおりに、目的のタンパク質、ＲＮＡｉ作用物質、及び／またはマーカータンパク質の２つ以上をコードする。
【0208】
改変ＶＰ１配列を含む本明細書に記載のＡＡＶは、昆虫細胞内で生成されるとき、対応する野生型ＶＰ１配列を含むＡＶＶに比べて改善された機能性を有することになる。
【0209】
一例において、改変ＶＰ１配列を有するカプシドタンパク質を含むＡＡＶは、本開示の方法を用いて生成される。
【0210】
キット
本開示は、本開示の核酸分子、バキュロウイルスベクター、複数のバキュロウイルスベクター及び／または昆虫細胞をキットの形態でも提供する。キットは、本開示の核酸分子を含む容器を含み得る。一例において、核酸は、バキュロウイルスベクター内に含まれる。一例において、キットは、本開示の核酸分子を含む第１の容器と、ＡＡＶを生成するための１種以上のさらなる試薬を含む第２の容器とを含む。一例において、核酸は、バキュロウイルスベクター内に含まれる。一例において、キットは、本開示の複数のバキュロウイルスベクターを含み、それぞれ別々の容器に含まれる。キットは、場合により、例えば、本開示に従うＡＡＶの生成に適した昆虫細胞をさらに含み得る。キットは、本明細書に記載される方法を用いたＡＡＶの生成のために本開示の核酸分子、バキュロウイルスベクター、複数のバキュロウイルスベクター及び／または昆虫細胞を使用するための説明書をさらに含んでもよい。
本開示は、本開示の核酸分子、バキュロウイルスベクター、複数のバキュロウイルスベクター及び／または昆虫細胞をキットの形態でも提供する。キットは、本開示の核酸分子を含む容器を含み得る。一例において、核酸は、バキュロウイルスベクター内に含まれる。一例において、キットは、本開示の核酸分子を含む第１の容器と、ＡＡＶを生成するための１種以上のさらなる試薬を含む第２の容器とを含む。一例において、核酸は、バキュロウイルスベクター内に含まれる。一例において、キットは、本開示の複数のバキュロウイルスベクターを含み、それぞれ別々の容器に含まれる。キットは、場合により、例えば、本開示に従うＡＡＶの生成に適した昆虫細胞をさらに含み得る。キットは、本明細書に記載される方法を用いたＡＡＶの生成のために本開示の核酸分子、バキュロウイルスベクター、複数のバキュロウイルスベクター及び／または昆虫細胞を使用するための説明書をさらに含んでもよい。
【実施例】
【0211】
実験例
実施例１－改変ＡＡＶ ＶＰ１配列の設計、生成及び試験
この実施例において、発明者らは、昆虫細胞内での生成時にＡＡＶのホスホリパーゼ活性及びウイルス機能性を修復するため、中に特異的配列改変、すなわち、アミノ酸置換をホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）ドメイン及び隣接配列に導入したウイルスカプシドタンパク質サブユニット１（ＶＰ１）を有するＡＡＶを設計及び調製した。さらに、種々の代表的なＡＡＶ血清型についてＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含むＶＰ１部分配列に関して行なった多重配列アラインメントに基づいて、ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含むコンセンサスＶＰ１部分配列を、ホスホリパーゼ活性を修復するように設計した配列改変を含めて調製した。このコンセンサスＶＰ１部分配列は配列番号１に記載されている。
実施例１－改変ＡＡＶ ＶＰ１配列の設計、生成及び試験
この実施例において、発明者らは、昆虫細胞内での生成時にＡＡＶのホスホリパーゼ活性及びウイルス機能性を修復するため、中に特異的配列改変、すなわち、アミノ酸置換をホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）ドメイン及び隣接配列に導入したウイルスカプシドタンパク質サブユニット１（ＶＰ１）を有するＡＡＶを設計及び調製した。さらに、種々の代表的なＡＡＶ血清型についてＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含むＶＰ１部分配列に関して行なった多重配列アラインメントに基づいて、ＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含むコンセンサスＶＰ１部分配列を、ホスホリパーゼ活性を修復するように設計した配列改変を含めて調製した。このコンセンサスＶＰ１部分配列は配列番号１に記載されている。
【0212】
１．１ 改変ＡＡＶ８ ＶＰ１及びＡＡＶ９ ＶＰ１配列の設計
ＡＡＶ８（配列番号３４）及びＡＡＶ２（配列番号２８）のウイルスカプシドタンパク質１（ＶＰ１）タンパク質由来のＮ末端１８０アミノ酸、ならびにＡＡＶ９（配列番号３５）及びＡＡＶ２（配列番号２６）のＶＰ１タンパク質由来のＮ末端１８０アミノ酸についてＢＬＡＳＴｐアラインメントツールを用いてペアワイズ配列アラインメントを行なった。これらのアラインメントに基づいて、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９由来のＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列が、ＡＡＶ２の対応する配列に高度に保存されていることを示した。
ＡＡＶ８（配列番号３４）及びＡＡＶ２（配列番号２８）のウイルスカプシドタンパク質１（ＶＰ１）タンパク質由来のＮ末端１８０アミノ酸、ならびにＡＡＶ９（配列番号３５）及びＡＡＶ２（配列番号２６）のＶＰ１タンパク質由来のＮ末端１８０アミノ酸についてＢＬＡＳＴｐアラインメントツールを用いてペアワイズ配列アラインメントを行なった。これらのアラインメントに基づいて、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９由来のＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列が、ＡＡＶ２の対応する配列に高度に保存されていることを示した。
【0213】
これらの配列アラインメントに基づいて、配列番号３４に記載される配列の位置４２、６７、８１、８４、８５及び１０５のアミノ酸を、配列番号２８に記載されるＡＡＶ２ ＶＰ１配列の対応する位置に存在するアミノ酸、すなわち、配列番号３４の配列内のＧ４２Ｓ、Ａ６７Ｅ、Ｑ８１Ｒ、Ｑ８４Ｄ、Ａ８５Ｓ及びＱ１０５Ｋと置き換えることによって、改変ＡＡＶ８ ＶＰ１配列をインシリコで設計した。改変ＡＡＶ８ ＶＰ１配列において置換された残基位置の２つは、ＰＬＡ２ドメインと隣接する領域内にあり（しかしＰＬＡ２ドメインの折りたたみ及び／または活性に関与する可能性があると考えられる）、改変された残基位置の４つは、ＰＬＡ２ドメイン自体の内部に存在した。
【0214】
同様に、配列番号３５に記載される配列の位置４２、６７、８１、８４及び８５のアミノ酸を、配列番号２８に記載されるＡＡＶ２ ＶＰ１配列の対応する位置に存在するアミノ酸、すなわち、配列番号３５の配列内のＡ４２Ｓ、Ａ６７Ｅ、Ｑ８１Ｒ、Ｋ８４Ｄ及びＡ８５Ｓと置き換えることによって、改変ＡＡＶ９ ＶＰ１配列をインシリコで設計した。改変ＡＡＶ９ ＶＰ１配列において置換された位置の１つは、ＰＬＡ２ドメインと隣接する領域内にあり（しかしＰＬＡ２ドメインの折りたたみ及び／または活性に関与する可能性があると考えられる）、改変された残基位置の４つは、ＰＬＡ２ドメイン自体の内部に存在した。
【0215】
１．２ 改変残基を含むコンセンサスＡＡＶ ＶＰ１部分配列の設計
ＡＡＶ２、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９の全ＶＰ１配列について行なった配列アラインメントン基づいて、ＡＡＶ血清型１～１３（配列番号１５～２６）のＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含むＶＰ１部分配列について多重配列アラインメントを行なった。上記ペアワイズアラインメントから明らかにされた差異に加えて、いくつかのさらなる非同一残基が部分配列内で明らかにされた。しかしながら、これらの差異は保存的差異であると思われたので及び／または残基位置はＰＬＡ２ドメインの外部であり、ホスホリパーゼ活性に影響を与える可能性はないと考えられたので、対応するＡＡＶ２配列に関する同一性についてこれらの位置を変化させないと決断した。多重配列アラインメントに基づいて、上記アミノ酸置換を有するＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含むコンセンサスＶＰ１部分配列をインシリコで調製した（配列番号１）。
ＡＡＶ２、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９の全ＶＰ１配列について行なった配列アラインメントン基づいて、ＡＡＶ血清型１～１３（配列番号１５～２６）のＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含むＶＰ１部分配列について多重配列アラインメントを行なった。上記ペアワイズアラインメントから明らかにされた差異に加えて、いくつかのさらなる非同一残基が部分配列内で明らかにされた。しかしながら、これらの差異は保存的差異であると思われたので及び／または残基位置はＰＬＡ２ドメインの外部であり、ホスホリパーゼ活性に影響を与える可能性はないと考えられたので、対応するＡＡＶ２配列に関する同一性についてこれらの位置を変化させないと決断した。多重配列アラインメントに基づいて、上記アミノ酸置換を有するＰＬＡ２ドメイン及び隣接配列を含むコンセンサスＶＰ１部分配列をインシリコで調製した（配列番号１）。
【0216】
１．３ 構造性及び非構造性ＡＡＶ８タンパク質を発現するバキュロウイルスベクターの生成
サブユニットＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む改変ＡＡＶ８カプシドタンパク質ならびにＡＡＶ８非構造性タンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするバキュロウイルスベクターを調製した（ＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ、図１）。
サブユニットＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む改変ＡＡＶ８カプシドタンパク質ならびにＡＡＶ８非構造性タンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするバキュロウイルスベクターを調製した（ＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ、図１）。
【0217】
簡潔には、配列番号２１に記載される配列を含む改変ＶＰ１サブユニットを有するＡＡＶ８カプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶｐ３）をコードし、かつ隣接ＮｏｔＩ及びＡｐａＩ制限部位を有するＤＮＡ構築物をＧｅｎＳｃｒｉｐｔで合成した（ＡＡＶ８－ＶＰｍｏｄ、図２）。非構造性タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０のみならず、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３ならびにアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をもコードするｗｔＡＡＶ８－Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミド（Ｖｉｒｏｖｅｋ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を骨格として用いてＡＡＶ８－ＶＰｍｏｄ ＤＮＡ構築物を受け入れた。ＡＡＶ８－ＶＰｍｏｄ ＤＮＡ構築物とｗｔＡＡＶ８－Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミドを両方ともＮｏｔＩ及びＡｐａＩで消化させてからＡＡＶ８－ＶＰｍｏｄ ＤＮＡ構築物を、ｗｔカプシドタンパク質コード配列の代わりにｗｔＡＡＶ８－Ｒｅｐ／Ｃａｐプラスミド骨格（図３）に連結してＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ（図４）を得た。
【0218】
次にＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ中間体をｐＯＥＴ１バキュロウイルストランスファーベクター（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化した。これを容易にするため、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ技術を用いてＥｃｏＲＶ部位をＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ中間体に挿入してＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ-ＥｃｏＲＶ中間体を得た。次にＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ-ＥｃｏＲＶ中間体及びｐＯＥＴ１をＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＶで消化させてから挿入物をｐＯＥＴ１骨格（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結して最終ＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄクローンを生成した（ＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ、図１）。
【0219】
１．４ 構造性及び非構造性ＡＡＶ９タンパク質を発現するバキュロウイルスベクターの生成
サブユニットＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３ならびにＡＡＶ９非構造性タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０を含むＡＡＶ９カプシドタンパク質をコードするバキュロウイルスベクターを調製した（ＢａｃＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ、図５）。
サブユニットＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３ならびにＡＡＶ９非構造性タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０を含むＡＡＶ９カプシドタンパク質をコードするバキュロウイルスベクターを調製した（ＢａｃＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ、図５）。
【0220】
簡潔には、配列番号２２に記載される配列によってコードされた改変ＡＡＶ９ ＶＰ１サブユニットを有するＡＡＶ９カプシドタンパク質をコードし、かつ隣接ＮｏｔＩ及びＡｐａＩ制限部位を有するＤＮＡ構築物をＧｅｎＳｃｒｉｐｔで合成した（ＡＡＶ９－ＶＰｍｏｄ、図６）。非構造性タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０のみならず、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３ならびにアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をもコードするｗｔＡＡＶ９－Ｒｅｐプラスミド（Ｖｉｒｏｖｅｋ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を骨格として用いてＡＡＶ９－ＶＰｍｏｄ ＤＮＡ構築物を受け入れた。ＡＡＶ９－ＶＰｍｏｄ ＤＮＡ構築物とｗｔＡＡＶ９－Ｒｅｐプラスミドを両方ともＮｏｔＩ及びＡｐａＩで消化させ、その後にＡＡＶ９－ＶＰｍｏｄ ＤＮＡ構築物を、ｗｔカプシドタンパク質コード配列の代わりにｗｔＡＡＶ９－Ｒｅｐプラスミド骨格（図３）に連結してＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄを得た（図７）。
【0221】
次にＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ中間体をｐＯＥＴ１バキュロウイルストランスファーベクター（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化した。これを容易にするため、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ技術を用いてＥｃｏＲＶ部位をＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ中間体に挿入してＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ-ＥｃｏＲＶ中間体を得た。次にＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄ-ＥｃｏＲＶ中間体及びｐＯＥＴ１（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＶで消化させ、次に挿入物をｐＯＥＴ１骨格に連結して最終ＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄクローンを得た（ＢａｃＡＡＶ９－Ｒｅｐ-ＣａｐＰＬ、図５）。
【0222】
１．５ 目的の遺伝子（ＧＯＩ）を発現するバキュロウイルスベクターの生成
ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするバキュロウイルスベクターを調製した。簡潔には、一例ではＡＡＶ２ ＩＴＲと隣接するヒトＰＡＢＰＮ１の転写物を標的にする２つのｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ構築物を、ＡＡＶ２－ＧＯＩ構築物（図８）及びｐＯＥＴ１（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＮｏｔＩで消化させ、ＡＡＶ２－ＧＯＩ構築物をｐＯＥＴ１骨格に連結することによってｐＯＥＴ１バキュロウイルストランスファーベクター（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化して最終クローンを生成した（ＢａｃＡＡＶ２－ＧＯＩ、図９）。ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子転写物の種々の領域を標的にする３つのｓｈｍｉＲをコードするものではあるが、上記と同様に、第２のＧＯＩをも調製した。
ＡＡＶ２逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接する目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードするバキュロウイルスベクターを調製した。簡潔には、一例ではＡＡＶ２ ＩＴＲと隣接するヒトＰＡＢＰＮ１の転写物を標的にする２つのｓｈｍｉＲをコードするＤＮＡ構築物を、ＡＡＶ２－ＧＯＩ構築物（図８）及びｐＯＥＴ１（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＮｏｔＩで消化させ、ＡＡＶ２－ＧＯＩ構築物をｐＯＥＴ１骨格に連結することによってｐＯＥＴ１バキュロウイルストランスファーベクター（Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にクローン化して最終クローンを生成した（ＢａｃＡＡＶ２－ＧＯＩ、図９）。ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子転写物の種々の領域を標的にする３つのｓｈｍｉＲをコードするものではあるが、上記と同様に、第２のＧＯＩをも調製した。
【0223】
１．６ Ｐ０バキュロウイルスストックの生成
Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのｂａｃｕｌｏＣＯＭＰＬＥＴＥシステムを用いてバキュロウイルスＰ０ストックを生成した（製造業者の説明書に従って）。簡潔には、トランスフェクションの１時間前に百万個のＳｆ９細胞を６ウェルプレートに播種し、プレートに付着させた。１ｍｌのＴＣ１００培地、５００ｎｇのＢａｃ－ＡＡＶ２－ＧＯＩプラスミド、ＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＣａｐＰＬまたはＢａｃＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＣａｐＰＬを５００ｎｇのフラッシュＢＡＣ ＤＮＡ及びｂａｃｕｌｏＦＥＣＴＩＮトランスフェクション試薬と混合した（製造業者のプロトコルに従って）。室温での３０分のインキュベーション後、播種したＳｆ９細胞にトランスフェクション混合物を加えた。６ウェルプレートを２８℃でインキュベートした。トランスフェクション２４時間後に、１ｍｌのＳｆ９培地を細胞に添加した。トランスフェクションの５日後に、Ｐ０バキュロウイルスストックを含有する培地を収集し、４℃で貯蔵した。このようにしてＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ-ＣａｐＰＬ、ＢａｃＡＡＶ９－Ｒｅｐ-ＣａｐＰＬ及びＢａｃ－ＡＡＶ２－ＧＯＩのためのＰ０バキュロウイルスを生成した。
Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのｂａｃｕｌｏＣＯＭＰＬＥＴＥシステムを用いてバキュロウイルスＰ０ストックを生成した（製造業者の説明書に従って）。簡潔には、トランスフェクションの１時間前に百万個のＳｆ９細胞を６ウェルプレートに播種し、プレートに付着させた。１ｍｌのＴＣ１００培地、５００ｎｇのＢａｃ－ＡＡＶ２－ＧＯＩプラスミド、ＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＣａｐＰＬまたはＢａｃＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＣａｐＰＬを５００ｎｇのフラッシュＢＡＣ ＤＮＡ及びｂａｃｕｌｏＦＥＣＴＩＮトランスフェクション試薬と混合した（製造業者のプロトコルに従って）。室温での３０分のインキュベーション後、播種したＳｆ９細胞にトランスフェクション混合物を加えた。６ウェルプレートを２８℃でインキュベートした。トランスフェクション２４時間後に、１ｍｌのＳｆ９培地を細胞に添加した。トランスフェクションの５日後に、Ｐ０バキュロウイルスストックを含有する培地を収集し、４℃で貯蔵した。このようにしてＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ-ＣａｐＰＬ、ＢａｃＡＡＶ９－Ｒｅｐ-ＣａｐＰＬ及びＢａｃ－ＡＡＶ２－ＧＯＩのためのＰ０バキュロウイルスを生成した。
【0224】
１．７ Ｐ１バキュロウイルスストックの生成
５００ｕｌのＰ０バキュロウイルスストックを用いて１００ｍｌのＳｆ９細胞培養物を２ｘ１０ｅ６細胞／ｍｌの濃度で感染させた。バキュロウイルス培養物を１４０ｒｐｍで５日間振盪させながら２８℃でインキュベートした。感染５日後、Ｐ１を含有する培地を回収して４℃で貯蔵した。
５００ｕｌのＰ０バキュロウイルスストックを用いて１００ｍｌのＳｆ９細胞培養物を２ｘ１０ｅ６細胞／ｍｌの濃度で感染させた。バキュロウイルス培養物を１４０ｒｐｍで５日間振盪させながら２８℃でインキュベートした。感染５日後、Ｐ１を含有する培地を回収して４℃で貯蔵した。
【0225】
１．８ Ｐ２バキュロウイルスストックの生成
５００ｕｌのＰ１バキュロウイルスストックを用いて１００ｍｌのＳｆ９細胞培養物を２ｘ１０ｅ６細胞／ｍｌの濃度で感染させた。バキュロウイルス培養物を１４０ｒｐｍで５日間振盪させながら２８℃でインキュベートした。感染５日後、Ｐ２を含有する培地を回収して４℃で貯蔵した。
５００ｕｌのＰ１バキュロウイルスストックを用いて１００ｍｌのＳｆ９細胞培養物を２ｘ１０ｅ６細胞／ｍｌの濃度で感染させた。バキュロウイルス培養物を１４０ｒｐｍで５日間振盪させながら２８℃でインキュベートした。感染５日後、Ｐ２を含有する培地を回収して４℃で貯蔵した。
【0226】
１．９ Ｐ２バキュロウイルスストックの力価決定
バキュロウイルスＰ２ストックの力価をＯｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのｂａｃｕｌｏＱＵＡＮＴキットを用いて測定した。製造業者の説明書に従ってバキュロウイルスストックを段階希釈し、提供された溶解バッファーで溶解させた。バキュロウイルスエンベロープ融合タンパク質、ｇｐ６４のｑＰＣＲを利用してＤＮＡを増幅させた。検量線を用いてＰ２ストックを定量化し、外挿してウイルスのｐｆｕ／ｍｌを決定した。
バキュロウイルスＰ２ストックの力価をＯｘｆｏｒｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのｂａｃｕｌｏＱＵＡＮＴキットを用いて測定した。製造業者の説明書に従ってバキュロウイルスストックを段階希釈し、提供された溶解バッファーで溶解させた。バキュロウイルスエンベロープ融合タンパク質、ｇｐ６４のｑＰＣＲを利用してＤＮＡを増幅させた。検量線を用いてＰ２ストックを定量化し、外挿してウイルスのｐｆｕ／ｍｌを決定した。
【0227】
１．１０ ＡＡＶを生成するための同時感染
２ｘ１０ｅ６細胞／ｍｌの細胞密度の６００ｍｌのＳｆ９細胞を、０．１のＭＯＩでＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ-ＣａｐＰＬ及びＢａｃＡＡＶ２－ＧＯＩ（ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子転写物を標的にする３つのｓｈｍｉＲをコードする）または０．１のＭＯＩでＢａｃＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＣａｐＰＬ及びＢａｃＡＡＶ２－ＧＯＩ（ヒトＰＡＢＰＮ１遺伝子転写物を標的にする２つのｓｈｍｉＲをコードする）に同時感染させた。次に細胞培養物を１１５ｒｐｍで６日間振盪させながら２８℃でインキュベートした。
２ｘ１０ｅ６細胞／ｍｌの細胞密度の６００ｍｌのＳｆ９細胞を、０．１のＭＯＩでＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ-ＣａｐＰＬ及びＢａｃＡＡＶ２－ＧＯＩ（ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子転写物を標的にする３つのｓｈｍｉＲをコードする）または０．１のＭＯＩでＢａｃＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＣａｐＰＬ及びＢａｃＡＡＶ２－ＧＯＩ（ヒトＰＡＢＰＮ１遺伝子転写物を標的にする２つのｓｈｍｉＲをコードする）に同時感染させた。次に細胞培養物を１１５ｒｐｍで６日間振盪させながら２８℃でインキュベートした。
【0228】
１．１１ ＡＡＶの精製
感染６日後に、感染培養物から清澄培地を収集した。０．２ミクロンフィルタリング後に０．１ミクロンフィルタリングを利用してバキュロウイルスをＡＡＶから濾別した。次にバキュロウイルスフリー培地にＰＥＧを添加してＡＡＶを沈殿させた。ＰＥＧ添加２４時間後に培地を２５００ｇで４５分間回転させてＡＡＶをペレット化した。上清を捨て、ペレット化ウイルスを溶解バッファーに懸濁させた。イオジキサノール勾配によってＡＡＶの初期精製を行ない、それにより４０～６０％のフラクション間の５ｍｌの層が収集された。このウイルス含有層をバッファー交換して残存イオジキサノールを除去し、バッファー交換したウイルスをセシウム勾配上に層化した。次に一晩の遠心分離をセシウム勾配上で行なった。セシウム勾配からＡＡＶ含有バンドをシリンジで収集し、バッファー交換して精製ＡＡＶウイルスストックから塩化セシウムを除去した。
感染６日後に、感染培養物から清澄培地を収集した。０．２ミクロンフィルタリング後に０．１ミクロンフィルタリングを利用してバキュロウイルスをＡＡＶから濾別した。次にバキュロウイルスフリー培地にＰＥＧを添加してＡＡＶを沈殿させた。ＰＥＧ添加２４時間後に培地を２５００ｇで４５分間回転させてＡＡＶをペレット化した。上清を捨て、ペレット化ウイルスを溶解バッファーに懸濁させた。イオジキサノール勾配によってＡＡＶの初期精製を行ない、それにより４０～６０％のフラクション間の５ｍｌの層が収集された。このウイルス含有層をバッファー交換して残存イオジキサノールを除去し、バッファー交換したウイルスをセシウム勾配上に層化した。次に一晩の遠心分離をセシウム勾配上で行なった。セシウム勾配からＡＡＶ含有バンドをシリンジで収集し、バッファー交換して精製ＡＡＶウイルスストックから塩化セシウムを除去した。
【0229】
１．１２ ＡＡＶの力価決定
全てのＡＡＶ調製物についての最終ＡＡＶ力価をｑＰＣＲで定量化した。簡潔には、１０マイクロリットルの精製ＡＡＶウイルスを１５分間室温でＤＮＡｓｅ処理（ＤＮＡｓｅＩ、増幅グレード、１Ｕ／ｕｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）した。次に６５℃での１０分間のインキュベーションによりＤＮＡｓｅ酵素を失活させた。ウイルスを以下のように希釈した：１：１０；１：３０；１：１００；１：１，０００；１：３，０００；１：１０，０００。各希釈物をｑＰＣＲで解析して１ｍｌ当たりのウイルスゲノムの総数を決定した。
全てのＡＡＶ調製物についての最終ＡＡＶ力価をｑＰＣＲで定量化した。簡潔には、１０マイクロリットルの精製ＡＡＶウイルスを１５分間室温でＤＮＡｓｅ処理（ＤＮＡｓｅＩ、増幅グレード、１Ｕ／ｕｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）した。次に６５℃での１０分間のインキュベーションによりＤＮＡｓｅ酵素を失活させた。ウイルスを以下のように希釈した：１：１０；１：３０；１：１００；１：１，０００；１：３，０００；１：１０，０００。各希釈物をｑＰＣＲで解析して１ｍｌ当たりのウイルスゲノムの総数を決定した。
【0230】
１．１３ 哺乳動物細胞内で調製したＡＡＶ
哺乳動物細胞内で調製したＡＡＶの機能性を、上述したように昆虫細胞内で調製したＡＡＶと比較した。哺乳動物及び昆虫細胞内で調製した組換えＡＡＶの生物活性（機能性）を比較するため、種々の力価のウイルスで哺乳動物細胞をインビトロで感染させ、プロセシングされたｓｈｍｉＲの発現をｑＲＴ ＰＣＲアッセイで定量化した。
哺乳動物細胞内で調製したＡＡＶの機能性を、上述したように昆虫細胞内で調製したＡＡＶと比較した。哺乳動物及び昆虫細胞内で調製した組換えＡＡＶの生物活性（機能性）を比較するため、種々の力価のウイルスで哺乳動物細胞をインビトロで感染させ、プロセシングされたｓｈｍｉＲの発現をｑＲＴ ＰＣＲアッセイで定量化した。
【0231】
これらの実験のため、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子転写物を標的にする３つのｓｈｍｉＲを発現する組換えＡＡＶ８粒子が哺乳動物細胞内で商用供給業者により調製された（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ；https：//www.vectorbiolabs.com）。さらに、ヒトＰＡＢＰＮ１を標的にする２つのｓｈｍｉＲを発現する組換えＡＡＶ９粒子が第２の供給業者、すなわちＮａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ ｈｏｓｐｉｔａｌベクターコアにより哺乳動物細胞内で調製された（https://ccts.osu.edu/research-support-services/clinical-research-support/nationwide-childrens-viral-vector-gmop-facility）。
【0232】
（ｉ）哺乳動物細胞内で生成された非改変ＶＰ１を有するＡＡＶ８（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ）、（ｉｉ）昆虫細胞内でバキュロウイルスにより（ＢａｃＡＡＶ８－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄを用いて本明細書に記載どおりに）生成された改変ＶＰ１を有するＡＡＶ８、及び（ｉｉｉ）ｗｔＡＡＶ８－Ｒｅｐ／Ｃａｐ（Ｂｅｎ１０，Ｖｉｒｏｖｅｋ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）を用いて昆虫細胞内でバキュロウイルスにより生成された非改変ｗｔＶＰ１を有するＡＡＶ８について生物活性を評価した（それぞれＨＢＶポリメラーゼ遺伝子を標的にする３つのｓｈｍｉＲ（ｓｈｍｉＲ１、ｓｈｍｉＲ２及びｓｈｍｉＲ３）をコードする）。簡潔には、ＪＨＵ６７細胞を４ｘ１０ｅ９、８ｘ１０ｅ９及び１．６ｘ１０ｅ１０のＭＯＩで上記改変または非改変組換えウイルス調製物に感染させ、感染７２時間後に３つのｓｈｍｉＲのそれぞれについてｓｈｍｉＲ発現を定量化した。ｓｈｍｉＲの発現を定量化するため、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて感染細胞からＲＮＡを抽出した。Ｑｉａｇｅｎ ｍｉＳｃｒｉｐｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを逆転写させた。次にｓｈｍｉＲ標的を増幅するように設計された特異的プライマーとのｑＰＣＲ反応にｃＤＮＡを用いてサンプル中に存在するコピーの総数を決定した。
【0233】
図１０Ａ～１０Ｃに示すように、哺乳動物細胞内で調製された非改変ｗｔＶＰ１を有するＡＡＶ８に感染した細胞は直ちに検出可能レベルのｓｈｍｉＲを産生したが、昆虫細胞内でバキュロウイルスにより生成された非改変ｗｔＶＰ１を有するＡＡＶ８は、たとえあったにしても、少ししかｓｈｍｉＲを産生しなかった。対照的に昆虫細胞内でバキュロウイルスにより生成された改変ＶＰ１を有するＡＡＶ８は、相対的に高レベルのｓｈｍｉＲを産生した。これは、昆虫細胞内でバキュロウイルスにより生成された非改変ｗｔＶＰ１を有するＡＡＶ８に比べてこれらのＡＡＶの機能性の向上を示唆している。
【0234】
（ｉ）哺乳動物細胞内で生成された非改変カプシドタンパク質を有するＡＡＶ９（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ）、及び（ｉｉ）昆虫細胞内でバキュロウイルスにより生成されたＢＡＣＡＡＶ９－Ｒｅｐ－ＶＰｍｏｄを用いて改変されたプシドタンパク質を有するＡＡＶ９（本明細書に記載どおり）についても生物活性を評価した（それぞれヒトＰＡＢＰＮ１の転写物を標的にする２つのｓｈｍｉＲ（ｓｈ１３及びｓｈ１７と名付けられている）をコードする）。簡潔には、ＡＡＶ内部移行受容体を発現するＣ２Ｃ１２細胞を４ｘ１０ｅ９、８ｘ１０ｅ９及び１．６ｘ１０ｅ１０のベクターゲノムに感染させた。７２時間のインキュベーション後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出し、上記ｑＰＣＲ法に従って２つのｓｈｍｉＲについてｓｈｍｉＲの発現を定量化した。
【0235】
図１１に示すように、２つの調製物は非常に類似するレベルのｓｈｍｉＲ発現を示した。これは、非常に類似するウイルス機能性を示唆している。
【0236】
血清型８及び９由来のＡＡＶという観点から実証したが、本明細書に記載の手法に従って他のＡＡＶ血清型（血清型２以外）のＶＰ１サブユニット配列を改変すると、昆虫細胞内でバキュロウイルス発現系から生成されるときにＡＡＶの機能性を修復することになると想定される。
【0237】
当業者は、本開示の広い一般的範囲を逸脱することなく、多くの変更及び／または修正を上記実施形態に加えることができると認識している。従って、本実施形態は、全ての点で例示的であり、限定的でないとみなすべきである。
（付記）
（付記１）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ウイルスカプシドタンパク質は、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含む改変サブユニット１（ＶＰ１）配列を含み、前記アミノ酸位置は、配列番号１に記載される配列に関して規定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか１以上の前記アミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか１以上の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、前記対応する野生型配列に対して改変されていない、前記核酸分子。
（付記２）
前記ウイルスカプシドタンパク質が、下記：
（ｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含む、ＡＡＶ１由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含む、ＡＡＶ３由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含む、ＡＡＶ４由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含む、ＡＡＶ５由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含む、ＡＡＶ６由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含む、ＡＡＶ７由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含む、ＡＡＶ８由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含む、ＡＡＶ９由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含む、ＡＡＶ１０由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含む、ＡＡＶ１１由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含む、ＡＡＶ１２由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ１３由来のウイルスカプシドタンパク質
から成る群より選択される、付記１に記載の核酸分子。
（付記３）
前記ウイルスカプシドタンパク質がＡＡＶ８に由来し、前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含む、付記１または付記２に記載の核酸分子。
（付記４）
前記ウイルスカプシドタンパク質がＡＡＶ９に由来し、前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含む、付記１または付記２に記載の核酸分子。
（付記５）
前記ウイルスカプシドタンパク質が、前記改変ＶＰ１と同じＡＡＶ血清型由来のサブユニット２（ＶＰ２）及びサブユニット３（ＶＰ３）配列を含む、付記１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。
（付記６）
前記ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、付記１～５のいずれか１項に記載の核酸分子。
（付記７）
昆虫細胞内での発現のための前記プロモーターが、多角体プロモーターまたはｐ１０プロモーターである、付記６に記載の核酸分子。
（付記８）
Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、付記１～７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（付記９）
Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む、付記８に記載の核酸分子。
（付記１０）
前記Ｒｅｐタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での前記Ｒｅｐタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、付記８または付記９に記載の核酸分子。
（付記１１）
昆虫細胞内での発現のための前記プロモーターが、多角体プロモーターまたはｐ１０プロモーターである、付記１０に記載の核酸分子。
（付記１２）
付記１～１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含むバキュロウイルスベクター。
（付記１３）
下記：
（ｉ）付記１～１２のいずれか１項に記載の核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクター；及び
（ｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第２のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクター。
（付記１４）
下記：
（ｉ）付記１～７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクター；
（ｉｉ）Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のバキュロウイルスベクター；及び
（ｉｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第３のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクター。
（付記１５）
前記第２のバキュロウイルスベクターが、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む、付記１４に記載の複数のバキュロウイルスベクター。
（付記１６）
前記Ｒｅｐタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での前記Ｒｅｐタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、付記１４または付記１５に記載の複数のバキュロウイルスベクター。
（付記１７）
付記１～１１のいずれか１項に記載の核酸を含む昆虫細胞。
（付記１８）
付記１２に記載のバキュロウイルスベクターまたは付記１３～１６のいずれか１項に記載の複数のバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞。
（付記１９）
前記ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列及び前記Ｒｅｐタンパクをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、前記昆虫細胞内でエピソームとして複製する組換えバキュロウイルスゲノムから発現される、付記１７または１８に記載の昆虫細胞。
（付記２０）
ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが、前記昆虫細胞内でエピソームとして複製する組換えバキュロウイルスゲノムから発現される、付記１７～１９のいずれか１項に記載の昆虫細胞。
（付記２１）
昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：
付記１７～２０のいずれか１項に記載の昆虫細胞を、培地内で前記細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
前記培地及び／または細胞から前記ＡＡＶを回収すること
を含む、前記方法。
（付記２２）
昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：
（ｉ）昆虫細胞を、付記８～１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルス；及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第２のバキュロウイルスに同時感染させること；
（ｉｉ）（ｉ）で前記バキュロウイルに感染した前記昆虫細胞を、培地内で前記細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉｉ）前記培地及び／または細胞から前記ＡＡＶを回収すること
を含む、前記方法。
（付記２３）
昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：
昆虫細胞を、付記１～７のいずれか１項に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルス；Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第２のバキュロウイルス；及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第３のバキュロウイルスに同時感染させること；
（ｉ）で前記バキュロウイルに感染した前記昆虫細胞を、培地内で前記細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
前記培地及び／または細胞から前記ＡＡＶを回収すること
を含む、前記方法。
（付記２４）
前記ＡＡＶを精製することを含む、付記２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
（付記２５）
付記２１～２４のいずれか１項に記載の方法で生成されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
（付記２６）
位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含む改変サブユニット１（ＶＰ１）配列を含むウイルスカプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、前記アミノ酸位置は、配列番号１に記載される配列に関して規定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか１以上の前記アミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか１以上の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、前記対応する野生型配列に対して改変されていない、前記ＡＡＶ。
（付記２７）
前記ＡＡＶが、下記：
（ｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１；
（ｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型３；（ｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含むＡＡＶ血清型４；
（ｉｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含むＡＡＶ血清型５；（ｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含むＡＡＶ血清型６；
（ｖｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含むＡＡＶ血清型７；（ｖｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含むＡＡＶ血清型８；
（ｖｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含むＡＡＶ血清型９；
（ｉｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１０；
（ｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１１；（ｘｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１２；及び
（ｘｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１３
から成る群より選択される、付記２６に記載のＡＡＶ。
（付記２８）
前記ＡＡＶが血清型８のものであり、かつ配列番号２１に記載される配列を含む改変ＶＰ１を含む、付記２６または付記２７に記載のＡＡＶ。
（付記２９）
前記ＡＡＶが血清型９のものであり、かつ配列番号２２に記載される配列を含む改変ＶＰ１を含む、付記２６または付記２７に記載のＡＡＶ。
（付記３０）
昆虫細胞内で産生される血清型２以外の血清型由来のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の機能性の改善方法であって、前記ＡＡＶのウイルスカプシドタンパク質を、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のみの１以上のアミノ酸を置換することによって、対応する野生型配列に対して改変することを含み、前記残基位置は、配列番号１に記載される配列に関して決定され、その結果、前記ウイルスカプシドタンパク質は、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含み、かつ前記ＡＡＶは、改変されなかった、昆虫細胞内で産生される対応する野生型ＡＡＶに比べて改善された機能性を有する、前記方法。
（付記３１）
前記ＡＡＶの前記ウイルスカプシドタンパク質を、下記：
（ｉ）前記ＡＡＶが血清型１のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉ）前記ＡＡＶが血清型３のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉｉ）前記ＡＡＶが血清型４のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１７に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｖ）前記ＡＡＶが血清型５のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１８に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖ）前記ＡＡＶが血清型６のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１９に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉ）前記ＡＡＶが血清型７のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２０に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉ）前記ＡＡＶが血清型８のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉｉ）前記ＡＡＶが血清型９のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｘ）前記ＡＡＶが血清型１０のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２３に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘ）前記ＡＡＶが血清型１１のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２４に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘｉ）前記ＡＡＶが血清型１２のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；及び
（ｘｉｉ）前記ＡＡＶが血清型１３のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む
ように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、付記３０に記載の方法。
（付記３２）
血清型８のＡＡＶの前記ウイルスカプシドタンパク質を、前記ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、付記３０または３１に記載の方法。
（付記３３）
血清型９のＡＡＶの前記ウイルスカプシドタンパク質を、前記ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、付記３０または３１に記載の方法。
（付記）
（付記１）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ウイルスカプシドタンパク質は、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含む改変サブユニット１（ＶＰ１）配列を含み、前記アミノ酸位置は、配列番号１に記載される配列に関して規定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか１以上の前記アミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか１以上の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、前記対応する野生型配列に対して改変されていない、前記核酸分子。
（付記２）
前記ウイルスカプシドタンパク質が、下記：
（ｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含む、ＡＡＶ１由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含む、ＡＡＶ３由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含む、ＡＡＶ４由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含む、ＡＡＶ５由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含む、ＡＡＶ６由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含む、ＡＡＶ７由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含む、ＡＡＶ８由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｖｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含む、ＡＡＶ９由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｉｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含む、ＡＡＶ１０由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含む、ＡＡＶ１１由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含む、ＡＡＶ１２由来のウイルスカプシドタンパク質；
（ｘｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ１３由来のウイルスカプシドタンパク質
から成る群より選択される、付記１に記載の核酸分子。
（付記３）
前記ウイルスカプシドタンパク質がＡＡＶ８に由来し、前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含む、付記１または付記２に記載の核酸分子。
（付記４）
前記ウイルスカプシドタンパク質がＡＡＶ９に由来し、前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含む、付記１または付記２に記載の核酸分子。
（付記５）
前記ウイルスカプシドタンパク質が、前記改変ＶＰ１と同じＡＡＶ血清型由来のサブユニット２（ＶＰ２）及びサブユニット３（ＶＰ３）配列を含む、付記１～４のいずれか１項に記載の核酸分子。
（付記６）
前記ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、付記１～５のいずれか１項に記載の核酸分子。
（付記７）
昆虫細胞内での発現のための前記プロモーターが、多角体プロモーターまたはｐ１０プロモーターである、付記６に記載の核酸分子。
（付記８）
Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、付記１～７のいずれか１項に記載の核酸分子。
（付記９）
Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む、付記８に記載の核酸分子。
（付記１０）
前記Ｒｅｐタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での前記Ｒｅｐタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、付記８または付記９に記載の核酸分子。
（付記１１）
昆虫細胞内での発現のための前記プロモーターが、多角体プロモーターまたはｐ１０プロモーターである、付記１０に記載の核酸分子。
（付記１２）
付記１～１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含むバキュロウイルスベクター。
（付記１３）
下記：
（ｉ）付記１～１２のいずれか１項に記載の核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクター；及び
（ｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第２のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクター。
（付記１４）
下記：
（ｉ）付記１～７のいずれか１項に記載の核酸分子を含む第１のバキュロウイルスベクター；
（ｉｉ）Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２のバキュロウイルスベクター；及び
（ｉｉｉ）ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む第３のバキュロウイルスベクター
を含む複数のバキュロウイルスベクター。
（付記１５）
前記第２のバキュロウイルスベクターが、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２をコードするポリヌクレオチド配列を含む、付記１４に記載の複数のバキュロウイルスベクター。
（付記１６）
前記Ｒｅｐタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、昆虫細胞内での前記Ｒｅｐタンパク質の発現のためのプロモーターに作動可能に連結されている、付記１４または付記１５に記載の複数のバキュロウイルスベクター。
（付記１７）
付記１～１１のいずれか１項に記載の核酸を含む昆虫細胞。
（付記１８）
付記１２に記載のバキュロウイルスベクターまたは付記１３～１６のいずれか１項に記載の複数のバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞。
（付記１９）
前記ＡＡＶウイルスカプシドタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列及び前記Ｒｅｐタンパクをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、前記昆虫細胞内でエピソームとして複製する組換えバキュロウイルスゲノムから発現される、付記１７または１８に記載の昆虫細胞。
（付記２０）
ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドが、前記昆虫細胞内でエピソームとして複製する組換えバキュロウイルスゲノムから発現される、付記１７～１９のいずれか１項に記載の昆虫細胞。
（付記２１）
昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：
付記１７～２０のいずれか１項に記載の昆虫細胞を、培地内で前記細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
前記培地及び／または細胞から前記ＡＡＶを回収すること
を含む、前記方法。
（付記２２）
昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：
（ｉ）昆虫細胞を、付記８～１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルス；及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第２のバキュロウイルスに同時感染させること；
（ｉｉ）（ｉ）で前記バキュロウイルに感染した前記昆虫細胞を、培地内で前記細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
（ｉｉｉ）前記培地及び／または細胞から前記ＡＡＶを回収すること
を含む、前記方法。
（付記２３）
昆虫細胞内でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の生成方法であって、下記：
昆虫細胞を、付記１～７のいずれか１項に記載の核酸分子を含むゲノムを有する第１のバキュロウイルス；Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８から選択される少なくとも１つの大型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質ならびにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０から選択される少なくとも１つの小型ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むゲノムを有する第２のバキュロウイルス；及びＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と隣接する目的のタンパク質またはＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むゲノムを有する第３のバキュロウイルスに同時感染させること；
（ｉ）で前記バキュロウイルに感染した前記昆虫細胞を、培地内で前記細胞がＡＡＶを産生するのに十分な条件下で培養すること；及び場合により
前記培地及び／または細胞から前記ＡＡＶを回収すること
を含む、前記方法。
（付記２４）
前記ＡＡＶを精製することを含む、付記２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
（付記２５）
付記２１～２４のいずれか１項に記載の方法で生成されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）。
（付記２６）
位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含む改変サブユニット１（ＶＰ１）配列を含むウイルスカプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、前記アミノ酸位置は、配列番号１に記載される配列に関して規定され、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のいずれか１以上の前記アミノ酸は、対応する野生型配列に対して改変されており、かつ前記いずれか１以上の位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のアミノ酸以外のさらなるアミノ酸は、前記対応する野生型配列に対して改変されていない、前記ＡＡＶ。
（付記２７）
前記ＡＡＶが、下記：
（ｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１；
（ｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型３；（ｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１７に記載される配列を含むＡＡＶ血清型４；
（ｉｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１８に記載される配列を含むＡＡＶ血清型５；（ｖ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号１９に記載される配列を含むＡＡＶ血清型６；
（ｖｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２０に記載される配列を含むＡＡＶ血清型７；（ｖｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２１に記載される配列を含むＡＡＶ血清型８；
（ｖｉｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２２に記載される配列を含むＡＡＶ血清型９；
（ｉｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２３に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１０；
（ｘ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２４に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１１；（ｘｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２５に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１２；及び
（ｘｉｉ）前記改変ＶＰ１配列が、配列番号２６に記載される配列を含むＡＡＶ血清型１３
から成る群より選択される、付記２６に記載のＡＡＶ。
（付記２８）
前記ＡＡＶが血清型８のものであり、かつ配列番号２１に記載される配列を含む改変ＶＰ１を含む、付記２６または付記２７に記載のＡＡＶ。
（付記２９）
前記ＡＡＶが血清型９のものであり、かつ配列番号２２に記載される配列を含む改変ＶＰ１を含む、付記２６または付記２７に記載のＡＡＶ。
（付記３０）
昆虫細胞内で産生される血清型２以外の血清型由来のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の機能性の改善方法であって、前記ＡＡＶのウイルスカプシドタンパク質を、位置１、２６、４０、４３、４４及び６４のみの１以上のアミノ酸を置換することによって、対応する野生型配列に対して改変することを含み、前記残基位置は、配列番号１に記載される配列に関して決定され、その結果、前記ウイルスカプシドタンパク質は、位置１にセリン、位置２６にグルタミン酸、位置４０にアルギニン、位置４３にアスパラギン酸、位置４４にセリン及び位置６４にリジンを含み、かつ前記ＡＡＶは、改変されなかった、昆虫細胞内で産生される対応する野生型ＡＡＶに比べて改善された機能性を有する、前記方法。
（付記３１）
前記ＡＡＶの前記ウイルスカプシドタンパク質を、下記：
（ｉ）前記ＡＡＶが血清型１のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉ）前記ＡＡＶが血清型３のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｉｉ）前記ＡＡＶが血清型４のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１７に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｖ）前記ＡＡＶが血清型５のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１８に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖ）前記ＡＡＶが血清型６のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号１９に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉ）前記ＡＡＶが血清型７のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２０に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉ）前記ＡＡＶが血清型８のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｖｉｉｉ）前記ＡＡＶが血清型９のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｉｘ）前記ＡＡＶが血清型１０のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２３に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘ）前記ＡＡＶが血清型１１のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２４に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；
（ｘｉ）前記ＡＡＶが血清型１２のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２５に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む；及び
（ｘｉｉ）前記ＡＡＶが血清型１３のものであるとき、前記ウイルスカプシドタンパク質は、配列番号２６に記載される配列を含むＶＰ１配列を含む
ように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、付記３０に記載の方法。
（付記３２）
血清型８のＡＡＶの前記ウイルスカプシドタンパク質を、前記ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２１に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、付記３０または３１に記載の方法。
（付記３３）
血清型９のＡＡＶの前記ウイルスカプシドタンパク質を、前記ウイルスカプシドタンパク質が、配列番号２２に記載される配列を含むＶＰ１配列を含むように、前記対応する野生型配列に対して改変することを含む、付記３０または３１に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】