(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-04
(45)【発行日】2023-10-13
(54)【発明の名称】併用療法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20231005BHJP
A61K 31/454 20060101ALI20231005BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231005BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231005BHJP
C07D 417/14 20060101ALN20231005BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 N ZNA
A61K31/454 ZMD
A61P25/28
A61P43/00 121
C07D417/14 CSP
【請求項の数】
15
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2022164024
(22)【出願日】2022-10-12
(62)【分割の表示】P 2021503815の分割
【原出願日】2019-07-25
(65)【公開番号】P2022191382
(43)【公開日】2022-12-27
【審査請求日】2022-10-12
(31)【優先権主張番号】62/712,519
(32)【優先日】2018-07-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(72)【発明者】
【氏名】マンスオ・ルー・ハヤシ
(72)【発明者】
【氏名】マイケル・カール・イリザリー
(72)【発明者】
【氏名】ヒュー・ナットホール
【審査官】佐々木 大輔
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５０８２１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５１７４１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／１４０２９９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／２１７５５８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Molecular Neurodegeneration, 2014, Vol.9, Article number42, pp.1-15，http://www.molecularneurodegeneration.com/content/9/1/42
【文献】Alzheimer’s & Dementia, 2016, Vol.12, pp.1051-1065，http://dx.doi.org/10.1016/j.jalz.2016.06.006
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
Ａ６１Ｋ ３１／３３－３３／４４
Ｃ０７Ｄ ４１７／００－４１７／１４
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＯＧＡ阻害剤との併用による、異常なタウ凝集を特徴とする疾患の治療に用いるための、抗タウ抗体を含む医薬組成物であって、前記ＯＧＡ阻害剤が、以下の式の化合物、【化1】
【請求項2】
ＯＧＡ阻害剤との併用による、臨床又は前臨床のＡＤ、ＰＳＰ又はＣＢＳのいずれかの治療に用いるための、抗タウ抗体を含む医薬組成物であって、前記ＯＧＡ阻害剤が、以下の式の化合物、【化2】
【請求項3】
ＯＧＡ阻害剤との併用による、前駆期ＡＤ、軽度ＡＤ、中等度ＡＤ又は重度ＡＤのいずれかの治療に用いるための、抗タウ抗体を含む医薬組成物であって、前記ＯＧＡ阻害剤が、以下の式の化合物、【化3】
【請求項4】
前記ＯＧＡ阻害剤において、以下のピペリジン環上の４位の酸素に対して２位のメチルがシス配置にある、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。【化4】
【請求項5】
前記ＯＧＡ阻害剤が、Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドである、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記ＯＧＡ阻害剤が、結晶性である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記ＯＧＡ阻害剤が、Ｘ線粉末回折スペクトルにおいて１２．１°の回折角２－シータでのピークと、１５．３°、２１．６°、２２．２°、２２．７°、２３．５°、２４．３°、および２６．８°からなる群から選択される１つ以上のピークとの組合せにより特徴づけられており、前記回折角の許容誤差が、０．２度である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項8】
ＯＧＡ阻害剤との併用による、異常なタウ凝集を特徴とする疾患の治療に用いるための、抗タウ抗体を含む医薬組成物であって、前記ＯＧＡ阻害剤が、以下の式の化合物、【化5】
【請求項9】
ＯＧＡ阻害剤との併用による、臨床又は前臨床のＡＤ、ＰＳＰ又はＣＢＳのいずれかの治療に用いるための、抗タウ抗体を含む医薬組成物であって、前記ＯＧＡ阻害剤が、以下の式の化合物、【化6】
【請求項10】
ＯＧＡ阻害剤との併用による、前駆期ＡＤ、軽度ＡＤ、中等度ＡＤ又は重度ＡＤのいずれかの治療に用いるための、抗タウ抗体を含む医薬組成物であって、前記ＯＧＡ阻害剤が、以下の式の化合物、【化7】
【請求項11】
前記ＯＧＡ阻害剤において、以下のピペリジン環上の４位の酸素に対して２位のメチルがシス配置にある、請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。【化8】
【請求項12】
前記ＯＧＡ阻害剤において、以下のピペリジン環上の４位の酸素に対して２位のメチルがトランス配置にある、請求項８～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。【化9】
【請求項13】
前記ＯＧＡ阻害剤が、Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記ＯＧＡ阻害剤が、結晶性である、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記ＯＧＡ阻害剤が、Ｘ線粉末回折スペクトルにおいて１３．５°の回折角２－シータでのピークと、５．８°、１３．０°、１４．３°、１７．５°、２０．４°、２１．４°、および２２．２°からなる群から選択される１つ以上のピークとの組合せにより特徴づけられており、前記回折角の許容誤差が、０．２度である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本発明は、抗タウ抗体とＯ－ＧｌｃＮＡｃａｓｅ（「ＯＧＡ」）阻害剤との組み合わせ、ならびにアルツハイマー病（ＡＤ）、進行性核上性麻痺（「ＰＳＰ」）、および大脳皮質基底核症候群（「ＣＢＳ」）などのタウ媒介性神経変性を特徴とする生理学的障害（本明細書では「タウオパチー」とも称される）の治療のためにそれらを使用する方法に関する。
【0002】
ＡＤ、ＰＳＰ、およびＣＢＳは、異常なタウ凝集を病理学的特徴とする深刻な神経変性疾患であり、ＡＤだけで世界中で何百万もの人々が冒されている。ＡＤ、ＰＳＰ、およびＣＢＳなどの神経変性疾患におけるタウ凝集の神経解剖学的進行は、タウ原線維凝集が神経ネットワークに沿って増殖し、微小管の不安定化および最終的に局所的な神経機能障害をもたらすことを示唆している。患者に一過性の症候性の利益のみを与える現在市場で承認されている薬剤を考慮すると、ＡＤ、ＰＳＰ、およびＣＢＳなどのタウオパチーの治療には満たされていない著しいニーズがある。
【0003】
タウは、微小管の集合および安定性を促進する軸索微小管結合タンパク質である。タウ凝集の密度および神経解剖学的局在は、ＡＤ、ＰＳＰ、およびＣＢＳの神経学的症状および疾患の進行と強く相関している。例えば、ＡＤを有する個人の脳内のＮＦＴの数は、疾患の重症度と密接に相関していることがわかっており、タウが神経機能障害および神経変性に重要な役割を果たしていることを示唆している（Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．，７１（５），３６２－３８１（２０１２））。タウの病理は、ＰＳＰの疾患期間と相関することも示されており、より進行性の疾患経過を伴う症例は、進行が遅い症例よりも高いタウ負荷を有する。（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，１３０，１５６６－７６（２００７））。
【0004】
さらに、動物モデル研究は、タウ凝集体が神経シナプス接合部全体に広がり、単量体（天然または非凝集）タウを隔離し、タウ凝集体形成を誘発することを示した。ＡＤなどの神経変性疾患におけるタウ凝集および蓄積の神経解剖学的進行は、タウ原線維凝集が神経ネットワークに沿って増殖し、最終的に微小管の不安定化および局所的な神経機能障害をもたらすことを示唆している。これは、タウ凝集および蓄積のわずかな低減でさえ、神経内神経原線維変化（ＮＦＴ）の長期的な著しい低減をもたらし、したがって、特にＡＤの治療において治療上の利益を提供する可能性があることを示唆している。
【0005】
さらに、最近の研究（Ｙｕｚｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，４（８），４８３－４９０（２００８））は、ＡＤおよび関連するタウオパチーの治療に関して、タウの過剰リン酸化および神経内凝集をＮＦＴなどの病理学的タウに制限するＯＧＡ阻害剤の療法的可能性を支持している。具体的には、ＯＧＡ阻害剤であるチアメット－Ｇは、ＪＮＰＬ３タウマウスモデルにおける運動神経喪失の遅延（Ｙｕｚｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ，８，３９３－３９９（２０１２））、ならびにＴｇ４５１０タウマウスモデルにおけるタウの病状および変性神経突起の低減（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，７９，３０７－３１３（２０１４））に関連している。
【0006】
ＡＤおよびＰＳＰなどのタウオパチーのための治療を提供するために、タウ凝集体に特異的に結合し、タウ凝集体形成の増殖を低減する抗体（本明細書では「抗タウ抗体」と称される）とＯＧＡ阻害剤との組み合わせが所望される。そのような組み合わせはまた、好ましくは、いずれかの分子単独よりも効果的であろう。例えば、そのような組み合わせによる治療は、単独で使用される各分子と比較して、いずれかまたは両方の分子のより低い用量の使用を可能にし、効能を維持しながら、より低い副作用（または一方もしくは他方の療法のより短い期間）をもたらす可能性がある。本明細書で提供される新規の組み合わせは、タウオパチーの治療に関して、タウの過剰リン酸化を制限し、タウ凝集を病理学的タウに低減し、その増殖を低減すると考えられている。
【0007】
したがって、本発明は、認知または神経変性疾患を治療する方法を提供し、該方法は、そのような治療を必要とする患者に、有効量のＯＧＡ阻害剤と組み合わせて有効量の抗タウ抗体を投与することを含む。本発明は、臨床または前臨床ＡＤを治療する方法をさらに提供し、該方法は、そのような治療を必要とする患者に、有効量のＯＧＡ阻害剤と組み合わせて有効量の抗タウ抗体を投与することを含む。本発明はまた、前駆期ＡＤ（軽度認知障害、またはＭＣＩとも称される）、軽度ＡＤ、中等度ＡＤ、および／または重度ＡＤを治療する方法を提供し、該方法は、そのような治療を必要とする患者に、有効量のＯＧＡ阻害剤と組み合わせて有効量の抗タウ抗体を投与することを含む。
【0008】
本発明は、前臨床ＡＤまたは臨床ＡＤと診断された患者の認知機能低下を遅延させる方法をさらに提供し、該方法は、そのような治療を必要とする患者に、有効量のＯＧＡ阻害剤と組み合わせて有効量の抗タウ抗体を投与することを含む。本発明は、前臨床ＡＤまたは臨床ＡＤと診断された患者の機能低下を遅延させる方法をさらに提供し、該方法は、そのような治療を必要とする患者に、有効量のＯＧＡ阻害剤と組み合わせて有効量の抗タウ抗体を投与することを含む。本発明は、脳内の低レベルのＮＦＴを有する無症候性患者における記憶喪失または認知機能低下を予防する方法をさらに提供し、該方法は、有効量のＯＧＡ阻害剤と組み合わせて有効量の抗タウ抗体を投与することを含む。
【0009】
別の実施形態では、本発明は、アルツハイマー病を引き起こす遺伝子変異を有することがわかっている無症候性患者を治療する方法を提供し、該方法は、有効量のＯＧＡ阻害剤と組み合わせて有効量の抗タウ抗体を投与することを含む。本発明の別の実施形態は、軽度認知障害のＡＤへの進行を予防するための方法を提供し、該方法は、そのような治療を必要とする患者に、有効量のＯＧＡ阻害剤と組み合わせて有効量の抗タウ抗体を投与することを含む。
【0010】
本実施形態はまた、療法で使用するために、ＯＧＡ阻害剤との同時、別個、または連続的な組み合わせで使用するための抗タウ抗体を提供する。
【0011】
本発明は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を有するＯＧＡ阻害剤の医薬組成物と組み合わせて、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に抗タウ抗体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【0012】
さらに、本発明は、抗タウ抗体およびＯＧＡ阻害剤を含むキットを提供する。本発明は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共に抗タウ抗体を含む医薬組成物と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と共にＯＧＡ阻害剤を含む医薬組成物と、を含むキットをさらに提供する。本明細書で使用される場合、「キット」は、各成分の別個の容器を含み、単一のパッケージの中で、１つの成分は抗タウ抗体であり、別の成分はＯＧＡ阻害剤である。「キット」はまた、各成分の別個の容器を含み得、別個のパッケージの中で１つの成分は抗タウ抗体であり、別の成分はＯＧＡ阻害剤であり、各成分を組み合わせて投与するための指示書を有する。
【0013】
本発明は、ＡＤ、軽度ＡＤ、前駆期ＡＤの治療のための、または軽度認知障害のＡＤへの進行の防止のための医薬品の製造のための抗タウ抗体の使用をさらに提供し、医薬品は、ＯＧＡ阻害剤と同時に、別々に、または順次に投与される。
【0014】
本発明の一実施形態では、抗タウ抗体は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含み、ＨＣは、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含み、ＬＣは、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、該ＨＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、該ＬＣＶＲは、ＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む。本発明の抗タウ抗体の特定の実施形態によれば、ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号３で示され、ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号４で示され、ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号５で示され、ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号６で示され、ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列番号７で示され、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列番号８で示される。一実施形態では、本発明は、ＬＣＶＲおよびＨＣＶＲを含む、ヒトタウに結合するモノクローナル抗体を提供し、ＬＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号９で示され、ＨＣＶＲのアミノ酸配列は配列番号１０で示される。さらなる実施形態では、本発明は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含む、ヒトタウに結合するモノクローナル抗体を提供し、ＬＣのアミノ酸配列は配列番号１で示され、ＨＣのアミノ酸配列は配列番号２で示される。
【0015】
本発明の抗タウ抗体は、既知の方法を使用して調製および精製され得る。例えば、配列番号１１で示されるｃＤＮＡ配列などのＨＣ（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）および配列番号１２で示されるｃＤＮＡ配列などのＬＣ（例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡ配列は、ＧＳ（グルタミンシンテターゼ）発現ベクターにクローン化および操作され得る。次に、操作された免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞に安定的にトランスフェクトされ得る。当業者が理解するように、抗体の哺乳動物発現は、典型的にはＦｃ領域の高度に保存されたＮ－グリコシル化部位でグリコシル化をもたらすであろう。タウ凝集体に特異的に結合する抗体の発現について、安定したクローンが検証され得る。陽性クローンは、バイオリアクターでの抗体産生のために無血清培養培地に増やされることがある。抗体が分泌された培地は、従来の技術によって精製され得る。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水などの適合性のある緩衝液で平衡化されたタンパク質ＡまたはＧセファロースＦＦカラムに都合よく適用され得る。カラムを洗浄して、非特異的結合成分を除去する。結合した抗体は、例えば、ｐＨ勾配によって溶出され、抗体画分は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検出され、次にプールされる。抗体は、一般的な技術を使用して濃縮および／または滅菌濾過され得る。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去され得る。産生物は、例えば－７０℃で直ちに凍結され得るか、または凍結乾燥され得る。
【0016】
本発明の抗タウ抗体は、ヒトタウに結合する。一実施形態では、本発明の抗タウ抗体は、ヒトタウの立体配座エピトープに結合する。特定の実施形態では、ヒトタウの立体配座エピトープは、ヒトタウのアミノ酸残基７～９および３１２～３２２を含み、ヒトタウのアミノ酸配列は、配列番号１３で示される。
【0017】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）を含む免疫グロブリン分子である。各ＬＣおよびＨＣのアミノ末端部分は、そこに含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を介した抗原認識に関与する可変領域を含む。ＣＤＲには、フレームワーク領域と呼ばれる、より保存された領域が点在している。本発明の抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、以下のような周知の番号付け規則に基づいている：Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２－９３（１９７１）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１）、および北の番号付け規則（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６：２２８－２５６（２０１１））。
【0018】
本発明の特定の実施形態では、抗体および抗体フラグメント、またはそれらをコードする核酸は、単離された形態で提供され得る。本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、自然界には見られず、細胞環境に見られる他の高分子種を含まないか、または実質的に含まないタンパク質、ペプチド、または核酸を指す。本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」は、目的のタンパク質、ペプチド、または核酸が、８０％超（モルベースで）、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超の存在する高分子種を含むことを意味する。
【0019】
本発明の抗体および抗体フラグメントの発現および分泌に続いて、培地は清澄化されて細胞が除去され、清澄化された培地は、多くの一般的に使用される技術のいずれかを使用して精製される。精製された抗体および抗体フラグメントは、非経口投与、特に皮下、髄腔内、または静脈内投与のためのタンパク質および抗体を処方するための周知の方法に従って医薬組成物に処方され得る。抗体および抗体フラグメントは、適切な薬学的に許容される賦形剤と共に凍結乾燥され、次に使用前に水ベースの希釈剤で再構成され得る。あるいは、抗体および抗体フラグメントは、水溶液中で処方され、使用前に保存され得る。いずれの場合も、抗体および抗体フラグメントの医薬組成物の保存形態および注射形態は、抗体および抗体フラグメント以外の成分である、薬学的に許容される賦形剤（複数可））を含有するであろう。成分が薬学的に許容可能であるかどうかは、医薬組成物の安全性および有効性、または安全性、純度、および効力に対するその効果に依存する。成分が安全性または有効性（または安全性、純度、もしくは効力）に十分に不利な効果を有し、ヒトへの投与用の組成物に使用されないことを是認すると判断された場合、それを抗体および抗体フラグメントの医薬組成物で使用することは薬学的に許容されない。
【0020】
本発明の新規の組み合わせおよび方法は、脳浸透性であるＯＧＡ阻害剤を含む。本発明の新規の組み合わせおよび方法のいくつかの実施形態では、ＯＧＡ阻害剤は、式Ｉの化合物、
またはその薬学的に許容される塩を含む。
【化1】
【0021】
いくつかの実施形態では、本発明の新規の組み合わせおよび方法のＯＧＡ阻害剤は、式Ｉａの化合物、
またはその薬学的に許容される塩である。
【化2】
【0022】
本発明の新規の組み合わせおよび方法のＯＧＡ阻害剤の実施形態を含む式Ｉの特定の構成は、
、およびその薬学的に許容される塩をさらに含む。
【化3】
【0023】
式Ｉの５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル化合物（式中、ピペリジン環上のメチルおよび酸素置換基がシスまたはトランス配置にある）、またはその薬学的に許容される塩は、本発明の新規の組み合わせのＯＧＡ阻害剤の範囲に含まれる。本発明の新規の組み合わせはまた、すべての個々のエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびにラセミ体を含む本発明の５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル化合物のエナンチオマーの混合物を企図する。本明細書で提供される新規の組み合わせおよび方法の５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル化合物の絶対配置は、
Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミド、およびその薬学的に許容される塩を含み、
Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドが特に好ましい。
Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミド、およびその薬学的に許容される塩を含み、
Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドが特に好ましい。
【0024】
本発明の５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イルＯＧＡ阻害剤化合物またはその塩は、当業者に既知の様々な手順によって調製され得る。当業者は、記載された経路の各々についての特定の合成ステップを異なる方法で組み合わせて、または異なるスキームからのステップと組み合わせて、本発明の化合物またはその塩を調製できることを認識する。以下の各ステップの産生物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、粉砕、および結晶化を含む、当技術分野で周知の従来の方法によって回収され得る。以下のスキームでは、特に明記しない限り、すべての置換基は以前に定義されたとおりである。試薬および出発物質は、当業者にとって容易に入手可能である。本発明の範囲を限定することなく、本発明をさらに例証するために、以下の調製および実施例が提供される。さらに、当業者は、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、およびＩｄの化合物が、当業者によって調製され得る対応する立体化学的構成を有する出発物質を使用することによって調製され得ることを理解する。例えば、以下の調製物は、最終的に式Ｉａに対応する構成を有する出発物質を利用する。
【0025】
調製１
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）カルバメートの合成。
フッ化セシウム（２２７ｇ、１４８０ｍｍｏｌ）を、室温でＤＭＳＯ（７７６ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－（４－クロロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）カルバメートの溶液に添加する（３８．８ｇ、１４８ｍｍｏｌ：ｔｅｒｔ－ブチルＮ－（４－クロロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）カルバメートの調製に関しては、例えば、Ｎ．Ｍａｓｕｄａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，１２，６１７１－６１８２（２００４）を参照されたい）。反応混合物を、１４５℃の加熱ブロック内で、１３３℃の内部温度で４８時間撹拌し、次に混合物を氷水浴で冷却する。混合物に、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）、ブライン（５００ｍＬ）、および酢酸エチル（５００ｍＬ）を添加する。混合物を室温で１０分間撹拌し、次に珪藻土を通して濾過し、酢酸エチル（５００ｍＬ）で洗浄する。濾液を分液漏斗に移し、層を分離し、次に水層を酢酸エチル（１Ｌ）で抽出する。合わせた有機物をブライン（１Ｌ）で洗浄し、次にブライン層を酢酸エチル（３００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、残基を得る。残基をシリカゲル（３３０ｇ）のパッドに通過させ、ジクロロメタン（１．５Ｌ）中の５％酢酸エチルで溶出し、濾液を濃縮して、残基を得る（２４．２ｇ）。
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）カルバメートの合成。
【化4】
【0026】
残基（３２．７ｇの組み合わせロット、１３３ｍｍｏｌ）をイソプロパノール（３０３ｍＬ）に溶解し、濾過して、次にＩＣカラムを使用してＳＦＣ（超臨界流体クロマトグラフィー）によって精製する（セルロース多糖誘導体：トリス（３，５－ジクロロフェニルカルバメート、３０ｘ２５０ｍｍ、５ｕ）、１０％ＩＰＡ（添加剤なし）、３ｍＬの注射で１８０ｍＬ／分。産生物含有画分を濃縮して、表題化合物を得る（１６．１ｇ。ＭＳ ｍ／ｚ ２４７．０（Ｍ＋Ｈ）。
【0027】
調製２
合成Ｎ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）アセトアミド（方法Ａ）
ジャケット付き容器内で、臭化亜鉛（９１．９ｇ、４０８ｍｍｏｌ）を室温でｔｅｒｔ－ブチルＮ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）カルバメート（３３．５ｇ、１３６ｍｍｏｌ）とジクロロメタン（５０３ｍＬ）との混合物に一度に添加する。反応混合物を３７℃の内部温度で一晩撹拌し、次にジャケット温度を－１０℃に設定し、内部温度を６℃未満に維持しながら、テトラヒドロフラン（１１１ｍＬ）を１５分かけて液滴添加する。次に、ジャケット温度を－３０℃に設定し、内部温度を５℃未満に維持しながら、ピリジン（１１０ｍＬ、１３６０ｍｍｏｌ）を５分かけて液滴添加する。ジャケット温度を０℃に設定し、無水酢酸（１１６ｍＬ、１２２０ｍｍｏｌ）を５分かけて液滴添加する。反応混合物を３７℃の内部温度で一晩撹拌し、次に室温に冷却し、珪藻土の短いパッドに通過させ、テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）で溶出する濾液をフラスコに移し、混合物を濃縮して、残基を得、これをトルエン（５０ｍＬ）から濃縮する。残基に、水（４００ｍＬ）および２－メチルテトラヒドロフラン（４００ｍＬ）中のクエン酸一水和物（５７．２ｇ、２７２ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、混合物を４０℃で５分間撹拌し、次に珪藻土の短いパッドに通過させ、２－メチルテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）で溶出する。濾液を分液漏斗に移し、層を分離する。水層を２－メチルテトラヒドロフラン（２×２５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物を水（５００ｍＬ）で希釈する。混合物に、ガスの発生が止まるまで撹拌しながら５分かけて固体重炭酸ナトリウムを少しずつ添加する。混合物を分液漏斗に移し、層を分離し、次に水層を２－メチルテトラヒドロフラン（２００ｍＬおよび１００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、残基を得、これを２－メチルテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）で希釈し、混合物をシリカゲル（２５０ｇ）の短いパッドを通過させ、２－メチルテトラヒドロフラン（２．５Ｌ）で溶出する。濾液を濃縮して、残基を得、これをジクロロメタンとヘプタンとの１：１混合物（２０２ｍＬ）中で懸濁する。混合物を室温で３０分間撹拌し、次に濾過する。濾過した固体を真空下、４０℃で２時間乾燥させて、表題化合物を得る（１８．０ｇ、７０％）。ＭＳ ｍ／ｚ １８９．０（Ｍ＋Ｈ）。
合成Ｎ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）アセトアミド（方法Ａ）
【化5】
【0028】
Ｎ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）アセトアミドの代替合成（方法Ｂ）。
ジクロロメタン（１３２５ｇ、１５．６ｍｏｌ）を２－アミノ－４－クロロチアゾール－５－カルバルデヒド（１００ｇ、０．６１ｍｏｌ）およびピリジン（１９４．６ｇ、２．４６ｍｏｌ）に添加し、０～５℃に冷却する。温度を０～５℃に維持しながら、無水酢酸（１８８．４ｇ、１．８５ｍｏｌ）を液滴添加する。添加が完了したら、温度を２０～２５℃に調整し、４１時間攪拌する。減圧下で濃縮した後、温度を４０℃未満に維持しながら、３５％ＨＣｌ水溶液（２００ｍＬ）および水（１．５Ｌ）を添加する。２０～２５℃に冷却し、１８時間攪拌する。混合物を濾過し、収集した固体を水で洗浄する。固体を６０～６５℃で２４時間乾燥させて、Ｎ－（４－クロロ－５－ホルミルチアゾール－２－イル）アセトアミド（７５ｇ、０．４ｍｏｌ）を提供する。
ジクロロメタン（１３２５ｇ、１５．６ｍｏｌ）を２－アミノ－４－クロロチアゾール－５－カルバルデヒド（１００ｇ、０．６１ｍｏｌ）およびピリジン（１９４．６ｇ、２．４６ｍｏｌ）に添加し、０～５℃に冷却する。温度を０～５℃に維持しながら、無水酢酸（１８８．４ｇ、１．８５ｍｏｌ）を液滴添加する。添加が完了したら、温度を２０～２５℃に調整し、４１時間攪拌する。減圧下で濃縮した後、温度を４０℃未満に維持しながら、３５％ＨＣｌ水溶液（２００ｍＬ）および水（１．５Ｌ）を添加する。２０～２５℃に冷却し、１８時間攪拌する。混合物を濾過し、収集した固体を水で洗浄する。固体を６０～６５℃で２４時間乾燥させて、Ｎ－（４－クロロ－５－ホルミルチアゾール－２－イル）アセトアミド（７５ｇ、０．４ｍｏｌ）を提供する。
【0029】
不活性雰囲気下で、スルホラン（１０００ｍｌ）をＮ－（４－クロロ－５－ホルミルチアゾール－２－イル）アセトアミド（５０ｇ、０．２４４ｍｏｌ、すぐ上で調製したもの）、塩化テトラメチルアンモニウム（１０７．１ｇ、０．９７７ｍｏｌ）、およびフッ化セシウム（３７０．６ｇ、２．４４ｍｍｏｌ）に添加する。１３０℃に加熱し、２３時間攪拌する。ＨＰＬＣ分析は７５％の変換を示し、その場での収率は４５％の表題化合物である。
【0030】
Ｎ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）アセトアミドの代替合成（方法Ｃ）。
２－プロパノール（１５０ｍＬ）をフッ化テトラメチルアンモニウム四水和物（１０．２ｇ、１０９．０ｍｍｏｌ）に添加し、内部温度を７０℃に維持しながら、真空下で混合物を２～３体積に濃縮して、水分を除去する。２－プロパノール（２００ｍＬ）を添加し、真空下で混合物を２～３体積に濃縮する。さらに２回繰り返す。ＤＭＦ（２００ｍＬ）を添加し、真空下で２～３体積に濃縮する。ＴＨＦ（２００ｍＬ）を添加し、２～３体積に濃縮する。さらに２回繰り返す。Ｎ－（４－クロロ－５－ホルミルチアゾール－２－イル）アセトアミド（１．２２ｇ、５．９６ｍｍｏｌ、上の方法Ｂで調製したもの）およびＤＭＦ（１２ｍｌ）を充填する。１１０℃に加熱し、１２時間攪拌する。反応混合物を２５℃に冷却する。２－メチルテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）および水（４０ｍＬ）を添加する。層を分離し、水層を２－メチルテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）で抽出した。層を分離し、合わせた有機層を水（２０ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、有機層を濃縮した。酢酸エチル（２０ｍＬ）および水（５ｍＬ）を添加する。層を分離し、有機層を濃縮して、溶媒を除去した。酢酸エチル（２ｍＬ）およびヘプタン（２ｍＬ）を添加し、濾過する。濾過した固体を真空下、５５℃で１８時間乾燥させて、Ｎ－（４－クロロ－５－ホルミルチアゾール－２－イル）アセトアミドとの９３％混合物として、表題化合物を得る。
２－プロパノール（１５０ｍＬ）をフッ化テトラメチルアンモニウム四水和物（１０．２ｇ、１０９．０ｍｍｏｌ）に添加し、内部温度を７０℃に維持しながら、真空下で混合物を２～３体積に濃縮して、水分を除去する。２－プロパノール（２００ｍＬ）を添加し、真空下で混合物を２～３体積に濃縮する。さらに２回繰り返す。ＤＭＦ（２００ｍＬ）を添加し、真空下で２～３体積に濃縮する。ＴＨＦ（２００ｍＬ）を添加し、２～３体積に濃縮する。さらに２回繰り返す。Ｎ－（４－クロロ－５－ホルミルチアゾール－２－イル）アセトアミド（１．２２ｇ、５．９６ｍｍｏｌ、上の方法Ｂで調製したもの）およびＤＭＦ（１２ｍｌ）を充填する。１１０℃に加熱し、１２時間攪拌する。反応混合物を２５℃に冷却する。２－メチルテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）および水（４０ｍＬ）を添加する。層を分離し、水層を２－メチルテトラヒドロフラン（４０ｍＬ）で抽出した。層を分離し、合わせた有機層を水（２０ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、有機層を濃縮した。酢酸エチル（２０ｍＬ）および水（５ｍＬ）を添加する。層を分離し、有機層を濃縮して、溶媒を除去した。酢酸エチル（２ｍＬ）およびヘプタン（２ｍＬ）を添加し、濾過する。濾過した固体を真空下、５５℃で１８時間乾燥させて、Ｎ－（４－クロロ－５－ホルミルチアゾール－２－イル）アセトアミドとの９３％混合物として、表題化合物を得る。
【0031】
調製３
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－メチル－ピペリジン－１－カルボキシレートの合成。
フラスコに、ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ）－２－メチル－４－オキソ－ピペリジン－１－カルボキシレート（５０ｇ、２３４．４４ｍｍｏｌ）およびテトラヒドロフラン（５００ｍＬ）を添加する。混合物を窒素雰囲気下で－６５℃に冷却し、リチウムトリ（ｓｅｃ－ブチル）ボロヒドリド（３０４．７７ｍＬ、３０４．７７ｍｍｏｌ、テトラヒドロフラン中１Ｍ）を、内部温度を－６０℃未満に維持しながら、４５分かけて液滴添加する。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次に－３０℃に冷却する。内部温度を－２０℃未満に維持しながら、反応混合物に、水（２５．３４ｍＬ）とテトラヒドロフラン（１００．１６ｍＬ）との混合物を添加する。水（１２６．７０ｍＬ）中の過酸化水素（１１８．８８ｍＬ、１．１７ｍｏｌ、３０重量／重量％）の水溶液を、内部温度を１０℃未満に維持しながら、１時間かけて液滴添加する。混合物に、塩化水素水溶液（４６．８９ｍＬ、２３４．４４ｍｍｏｌ、５Ｍ）およびメチルｔ－ブチルエーテル（１．００Ｌ）を添加し、混合物を室温まで温める。層を分離し、水（５００ｍＬ）中で有機相をメタ重亜硫酸ナトリウム（２２２．８４ｇ、１．１７ｍｏｌ）の溶液と室温で１０分間撹拌する。層を分離し、有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濃縮する。残基をフラッシュクロマトグラフィー（０～５０％メチルｔ－ブチルエーテル／イソヘキサン、シリカゲル）によって精製し、産生物含有画分を組み合わせ、濃縮して、表題化合物を得る（４０．４ｇ、７８％）。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）２３８（Ｍ＋Ｎａ）。
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－メチル－ピペリジン－１－カルボキシレートの合成。
【化6】
【0032】
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－メチル－ピペリジン－１－カルボキシレートの代替合成。
脱イオン水（４６０Ｌ）とリン酸二水素カリウム（６．５ｋｇ、０．４１当量）とを含有するガラスライニング反応器に、２０℃でＤＭＳＯ（２７．４ｋｇ、１．０体積）およびＤ－（＋）－グルコース一水和物（２８．９ｋｇ、１．２５当量）を充填する。内部温度を３０℃に調整し、水性水酸化ナトリウム（８％、１５Ｌ、０．２８当量）を添加することによって反応のｐＨを６．９に調整する。反応器をｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ）－２－メチル－４－オキソ－ピペリジン－１－カルボキシレート（２４．９ｋｇ、１．０当量（９９．１％ｅｅ））で充填し、混合物を３０℃で１５分間撹拌する。ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ－１３０、２５０ｇ、１％ｗ／ｗ）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ－１０１、２５０ｇ、１％ｗ／ｗ）、およびＮＡＤＰナトリウム塩（６３ｇ、０．２５％ｗ／ｗ）をオープンポートを介して反応混合物に直接充填する。混合物を３０℃の温度および８％の水性ＮａＨＣＯ３を添加することによって、ｐＨ７．０±０．２に維持する。１６．５時間撹拌した後（９９．５％の転化率）、反応にＣｅｌｉｔｅ（商標）（１２．５ｋｇ、５０ｗ／ｗ％）およびトルエン（１２５Ｌ、５体積）を充填する。３０℃で３０分間撹拌した後、混合物をインラインＧＡＦフィルター（４ソック）を介して１時間かけて別の２０００Ｌ反応器に移す。混合物を攪拌せずに３０分間放置し、層を分離し、水層をトルエン（２×１２５Ｌ）で逆抽出する。合わせた有機層を濾過し（インラインＧＡＦフィルター）、トルエン混合物を２５℃で塩化ナトリウム水溶液（２５％、１２５Ｌ、５体積）で洗浄する。得られたトルエン溶液を共沸乾燥（部分真空、内部温度＜６０℃）させて、０．１０ｗ／ｗ％水にし、２０℃に冷却する。混合物を、カートリッジフィルターを介して反応器から濾過し、正の窒素圧下で清浄なドラムに入れる。次に、反応混合物をドラムから５００Ｌのガラスライニング容器に移し、真空下（＜６０℃）で５６Ｌ（２．２５体積）の目標残留体積まで濃縮する。ｎ－ヘプタン（１６９ｋｇ、１０体積）を４０℃で充填し、混合物に２５ｇのｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－メチル－ピペリジン－１－カルボキシレートを播種する。得られた濃厚なスラリーを追加のｎ－ヘプタン（２５Ｌ、１体積）で希釈し、４時間かけて１６℃に冷却する。産生物を遠心分離によって単離し、ｎ－ヘプタンで洗浄し（１スピンあたり２５Ｌ、４スピンが必要）、３０℃のトレイ乾燥機で１１時間乾燥させた後、２０．３ｋｇ（８１％、＞９９．９％ｅｅ）を生成する。ＥＳ／ＭＳ（ｍ／ｅ）２３８（Ｍ＋Ｎａ）。
【化7】
【0033】
調製４
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレートの合成。
３－（クロロメチル）－５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール（４３．５ｇ、３０１ｍｍｏｌ）を、室温でアセトニトリル（５９０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－メチル－ピペリジン－１－カルボキシレート（２９．５ｇ、１３７ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。反応混合物を氷水浴中で撹拌し、内部温度を１０℃未満に維持しながら、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（５４．３ｇ、５４８ｍｍｏｌ）を１０分かけて少しずつ添加する。反応混合物を氷水浴中で、５℃の内部温度で９時間撹拌し、次にゆっくりと室温に温め、一晩撹拌する。反応混合物を氷水浴で冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液（２００ｍＬ）を５分かけて添加し、添加中、内部温度を１０℃未満に維持する。次に、混合物を水（１００ｍＬ）で希釈し、室温に温める。混合物をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物をブライン（３００ｍＬ）で洗浄する。合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、残基を得る。残基をシリカゲル（３００ｇ）のパッドに素早く通過させ、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（１Ｌ）で溶出し、濾液を濃縮して、表題化合物を得る（４６．５ｇ、１０９％）。ＭＳ ｍ／ｚ ３３４．０（Ｍ＋Ｎａ）．
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレートの合成。
【化8】
【0034】
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレートの代替合成。
窒素下のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－メチル－ピペリジン－１－カルボキシレート（０．２５ｇ、１．１６ｍｍｏｌ）および３－（クロロメチル）－５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール（０．３０８ｇ、２．３２ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（０．３５ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を５分かけて少しずつ添加する。反応混合物を室温で１０分間、次に４０℃で１２時間撹拌する。反応混合物を室温に冷却し、次に水（１０ｍＬ）でクエンチする。層を分離し、水相をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２×１０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機抽出物を塩化リチウムの水溶液（５％）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、茶色の油として表題化合物を得る（０．４９ｇ、０．７ｍｍｏｌ、８１％収率、６０％純度）。ＭＳ ｍ／ｚ ３３４．０（Ｍ＋Ｎａ）。
【化9】
【0035】
調製５
５－メチル－３－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，２，４－オキサジアゾール塩酸塩の合成。
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレート（４．０３ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）を含むフラスコを氷水浴に沈める。このフラスコに、１，４－ジオキサン（２５．９ｍＬ、１０４ｍｍｏｌ）中の塩酸の４Ｍの溶液を、攪拌しながら５分かけて液滴添加し、添加中、内部温度を２０℃未満に維持する。反応混合物を室温で１時間撹拌し、次に濃縮して、表題化合物を得る（１Ｈ ＮＭＲによって測定した８３％の純度に基づいて、３．５６ｇ、９２％収率。ＭＳ ｍ／ｚ ２１２．０（Ｍ＋Ｈ）。
５－メチル－３－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，２，４－オキサジアゾール塩酸塩の合成。
【化10】
【0036】
５－メチル－３－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，２，４－オキサジアゾール塩酸塩の代替合成。
メタノール（５０ｍＬ）をｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレート（１２．９ｇ、０．０４１ｍｏｌ）に添加する。混合物を０℃に冷却する。内部温度を２０℃未満に維持しながら、メタノール中の塩酸の４Ｍ溶液（８０ｍＬ）を冷却した混合物に液滴添加する。次に、反応混合物を室温で１８時間撹拌する。次に、混合物を濃縮して、溶媒を除去する。アセトン（１０ｍＬ）を添加し、混合物を２０分間撹拌する。テトラヒドロフラン（４０ｍＬ）を添加し、混合物を３時間撹拌する。固体を窒素下で濾過することによって収集し、濾過した固体ケーキをテトラヒドロフランですすぐ。次に、濾過した固体を真空下、４５℃で２時間乾燥させて、９０％の純度として表題化合物を得る。アセトンを使用した再結晶によって、表題化合物の純度を９５％に増加することができる。
メタノール（５０ｍＬ）をｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレート（１２．９ｇ、０．０４１ｍｏｌ）に添加する。混合物を０℃に冷却する。内部温度を２０℃未満に維持しながら、メタノール中の塩酸の４Ｍ溶液（８０ｍＬ）を冷却した混合物に液滴添加する。次に、反応混合物を室温で１８時間撹拌する。次に、混合物を濃縮して、溶媒を除去する。アセトン（１０ｍＬ）を添加し、混合物を２０分間撹拌する。テトラヒドロフラン（４０ｍＬ）を添加し、混合物を３時間撹拌する。固体を窒素下で濾過することによって収集し、濾過した固体ケーキをテトラヒドロフランですすぐ。次に、濾過した固体を真空下、４５℃で２時間乾燥させて、９０％の純度として表題化合物を得る。アセトンを使用した再結晶によって、表題化合物の純度を９５％に増加することができる。
【0037】
調製６
５－メチル－３－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，２，４－オキサジアゾールの合成。
窒素下のジクロロメタン（１０ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレート（０．４９ｇ、１．６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１．８ｍＬ、２３ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で３時間撹拌する。混合物を減圧下で濃縮して、黄色の油を得る。残基をメタノール（５ｍＬ）に溶解し、陽イオン交換カートリッジに注ぎ、メタノール（２×１０ｍＬ）で溶出し、次にメタノール中の２Ｍのアンモニア溶液（１０ｍＬ）で溶出する。濾液を減圧下で濃縮して、表題化合物を得る（０．３ｇ、１．４ｍｍｏｌ、９１％）。ＭＳ ｍ／ｚ ２１２．０（Ｍ＋Ｈ）。
５－メチル－３－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，２，４－オキサジアゾールの合成。
【化11】
【0038】
本発明の新規の組み合わせおよび方法の他の実施形態では、ＯＧＡ阻害剤、式Ｘの化合物、
またはその薬学的に許容される塩。
【化12】
【0039】
さらに、本発明は、式Ｘａの化合物、
またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【化13】
【0040】
本発明の新規の組み合わせおよび方法のＯＧＡ阻害剤の実施形態を含む式Ｘの特定の構成は、
、およびその薬学的に許容される塩をさらに含む。
【化14】
【0041】
式Ｘの５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル化合物（式中、ピペリジン環上のメチルおよび酸素置換基がシスまたはトランス配置である）、またはその薬学的に許容される塩は、本発明の新規の組み合わせのＯＧＡ阻害剤の範囲に含まれる。本発明の新規の組み合わせはまた、すべての個々のエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびにラセミ体を含む本発明の５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル化合物のエナンチオマーの混合物を企図する。本明細書で提供される新規の組み合わせおよび方法の５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル化合物の絶対配置は、
Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミド、および遊離塩基を含み、結晶形態を含む、その薬学的に許容される塩を含む。
Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミド、および遊離塩基を含み、結晶形態を含む、その薬学的に許容される塩を含む。
【0042】
本発明の新規の組み合わせおよび方法の５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル化合物、またはその塩は、当業者に既知の様々な手順によって調製され得、そのうちのいくつかは、以下のスキーム、調製、および実施例で例証される。当業者は、記載された経路の各々についての特定の合成ステップを異なる方法で組み合わせて、または異なるスキームからのステップと組み合わせて、本発明の化合物またはその塩を調製できることを認識する。以下の各ステップの産生物は、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、粉砕、および結晶化を含む、当技術分野で周知の従来の方法によって回収され得る。以下のスキームでは、特に明記しない限り、すべての置換基は以前に定義されたとおりである。試薬および出発物質は、当業者にとって容易に入手可能である。本発明の範囲を限定することなく、本発明をさらに例証するために、以下のスキーム、調製、および実施例が提供される。さらに、当業者は、式Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ、およびＸｄの化合物が、当業者によって調製され得る対応する立体化学的構成を有する出発物質を使用することによって調製され得ることを理解する。例えば、以下の調製物は、最終的に式Ｘａに対応する構成を有する出発物質を利用する。
【0043】
調製７
２－［［（２Ｓ，４Ｓ）－１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－２－メチル－４－ピペリジル］オキシ］酢酸の合成。
２－クロロ－１－モルホリノ－エタノン（５９．４ｇ、３６３ｍｍｏｌ）を、室温でアセトニトリル（５２１ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－メチル－ピペリジン－１－カルボキシレート（５２．１ｇ、２４２ｍｍｏｌ）の溶液に添加する。反応混合物を氷水浴中で撹拌し、内部温度を１５℃未満に維持しながら、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（４８．０ｇ、４８４ｍｍｏｌ）を１０分かけて少しずつ添加する。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次に氷水浴冷却で飽和塩化アンモニウム水溶液（２５０ｍＬ）および水（２５０ｍＬ）を含む別のフラスコに５分かけて添加し、添加中、内部温度を１５度未満に維持する。混合物を室温に温め、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２×５００ｍＬ）で抽出し、次に合わせた有機物をブライン（３００ｍＬ）で洗浄する。次に、合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、残基を得、これを室温で２－プロパノール（４１４ｍＬ）および２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（３０３ｍＬ、６０５ｍｍｏｌ）と組み合わせる。反応混合物を４７℃の加熱ブロック内で、４５℃の内部温度で一晩撹拌する。反応混合物を室温に冷却し、濃縮して、２－プロパノールを除去し、次に混合物を水（５０ｍＬ）で希釈する。混合物をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２５０ｍＬ）で抽出し、次に水層を氷水浴で冷却し、酢酸（５５．６ｍＬ、９６８ｍｍｏｌ）で酸性化する。水性混合物を酢酸エチル（４×２５０ｍＬ）で抽出し、次に合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、残基を得、これをトルエン（３×１００ｍＬ）から濃縮して、表題化合物を得る（７９．８ｇ）。ＭＳ ｍ／ｚ ２７２．０（Ｍ－Ｈ）。
２－［［（２Ｓ，４Ｓ）－１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－２－メチル－４－ピペリジル］オキシ］酢酸の合成。
【化15】
【0044】
調製８
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－［２－（２－アセチルヒドラジノ）－２－オキソ－エトキシ］－２－メチル－ピペリジン－１－カルボキシレートの合成。
テトラヒドロフラン（７９８ｍＬ）を、２－［［（２Ｓ，４Ｓ）－１－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル－２－メチル－４－ピペリジル］オキシ］酢酸（７９．８ｇ、２２４ｍｍｏｌ、７６．６質量％）を含むフラスコに添加し、混合物を氷水浴中で、５℃の内部温度で撹拌する。混合物に、１，１’－カルボニルジイミダゾール（４３．５ｇ、２６８ｍｍｏｌ）を一度に添加し、反応混合物を室温で２時間撹拌する。１，１’－カルボニルジイミダゾールの追加分（７．２５ｇ、４４．７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で３０分間撹拌する。反応混合物を氷水浴に沈め、アセトヒドラジド（２１．５ｇ、２９１ｍｍｏｌ）を一度に添加し、次に反応混合物を室温で一晩撹拌する。反応混合物を氷水浴中で撹拌し、内部温度を１５℃未満に維持しながら、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）を２分かけて添加する。混合物を水（３００ｍＬ）で希釈し、次に濃縮して、テトラヒドロフランを除去する。水性混合物を２－メチルテトラヒドロフラン（４×５００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、残基を得、これを、酢酸エチル（２００ｍＬ）およびヘプタン（２００ｍＬ）と組み合わせる。混合物を室温で３０分間撹拌し、次にヘプタン（２００ｍＬ）で希釈し、混合物を室温でさらに３０分間激しく撹拌し、次に濾過する。濾過した固体を真空下、４０℃で２時間乾燥させて、表題化合物の第１の収穫物を得る（７１．５ｇ）。濾液を再濾過し、濾過した固体を窒素ガス流下、室温で１５分間乾燥させて、表題化合物の第２の収穫物を得る（１．９８ｇ）。産生物の第１の収穫物（７１．１ｇ、２１６ｍｍｏｌ、純度不明）および産生物の第２の収穫物（１．９７ｇ、５．９８ｍｍｏｌ、純度不明）の大部分を、ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル（７３１ｍＬ）と組み合わせ、混合物を４５℃の加熱ブロック内で３０分間、内部温度４０℃で撹拌し、次に撹拌しながら１時間かけて室温に冷却し、混合物を濾過する。濾過した固体を、窒素ガス流下、室温で３０分間真空乾燥させて、表題化合物を得る（５３．７ｇ）。ＭＳ ｍ／ｚ ３５２．０（Ｍ＋Ｎａ）。
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－［２－（２－アセチルヒドラジノ）－２－オキソ－エトキシ］－２－メチル－ピペリジン－１－カルボキシレートの合成。
【化16】
【0045】
調製９
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレートの合成。
窒素下のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－メチル－ピペリジン－１－カルボキシレート（０．５ｇ、２ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（０．９２ｇ、９．２８ｍｍｏｌ）を少しずつ添加する。得られた反応混合物を室温で４０分間撹拌する。反応混合物を０℃に冷却し、２－（クロロメチル）－５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール（０．４１６ｇ、３．１４ｍｍｏｌ）を添加する。得られた溶液を室温で一晩撹拌する。反応混合物を真空で濃縮し、残基を水で希釈する。混合物を酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗油を得る。
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレートの合成。
【化17】
【0046】
残基をジメチルスルホキシド中に（総体積２ｍＬまで）取り、プレップＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １０ Ｍｉｃｒｏｎ ３０＊１００ｍｍ Ｃ－１８）（水酸化アンモニウムでｐＨ９まで調整した１０ｍＭの重炭酸アンモニウムを有するＣＨ３ＣＮ＆Ｗａｔｅｒ、５０ｍｌ／分で７分間にわたって１５％～１００％のＣＨ３ＣＮ）（１回の注射）（２０４ｎｍ）によって精製して、表題の化合物を得る（０．０２８ｇ、０．０８９ｍｍｏｌ、４％）。ＭＳ ｍ／ｚ ３１２．０（Ｍ＋Ｈ）。
【0047】
ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレートの代替合成。
フラスコに、ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－４－［２－（２－アセチルヒドラジノ）－２－オキソ－エトキシ］－２－メチル－ピペリジン－１－カルボキシレート（５３．７ｇ、１６３ｍｍｏｌ）およびアセトニトリル（５３７ｍＬ）を添加し、スラリーを室温で撹拌する。混合物に、水浴冷却下で５分間にわたって、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１１４ｍＬ、６５２ｍｍｏｌ）を１回で添加し、ｐ－トルエンスルホニルクロリド（７７．７ｇ、４０８ｍｍｏｌ）を３回に分けて添加する。反応混合物を室温で一晩撹拌し、次に氷水浴で冷却し、内部温度を１５℃未満に維持しながら、Ｎ’，Ｎ’－ジメチルエタン－１，２－ジアミン（２１．８ｇ、２４５ｍｍｏｌ）を１０分かけて液滴添加する。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次に室温で飽和クエン酸水溶液（５０ｍＬ）、酢酸エチル（５００ｍＬ）、および水（４５０ｍＬ）で希釈する。層を分離し、有機層を飽和クエン酸水溶液（５０ｍＬ）と水（４５０ｍＬ）との混合物で洗浄する。有機層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５００ｍＬ）で洗浄し、次に水層を酢酸エチル（５００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮して、残基を得、これをシリカゲル（４００ｇ）の短いパッドに通過させ、ヘプタン中の２５％酢酸エチル（２×５００ｍＬ画分）で溶出し、次に酢酸エチル（５×５００ｍＬ画分）で溶出する。産生物含有画分を濃縮して、表題化合物を得る（５３．３ｇ）。ＭＳ ｍ／ｚ ３１２．２（Ｍ＋Ｈ）。
【化18】
【0048】
調製１０
５－メチル－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，３，４－オキサジアゾール２，２，２－トリフルオロ酢酸の合成。
窒素下のジクロロメタン（３ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレート（０．０２７５ｇ、０．０８８３ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（０．０３５ｍＬ、０．４５ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で一晩撹拌する。混合物を減圧下で濃縮して、表題化合物を得る（０．０４ｇ、８４％）。ＭＳ ｍ／ｚ ２１２．０（Ｍ＋Ｈ）。
５－メチル－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，３，４－オキサジアゾール２，２，２－トリフルオロ酢酸の合成。
【化19】
【0049】
調製１１
２－メチル－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，３，４－オキサジアゾールの合成。
フラスコに、ｔｅｒｔ－ブチル（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］ピペリジン－１－カルボキシレート（５２．９ｇ、１７０ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（２６５ｍＬ）を室温で添加する。反応混合物を氷水浴中で、５℃の内部温度で撹拌し、内部温度を１０℃未満に維持しながら、トリフルオロ酢酸（３５００ｍｍｏｌ、２６５ｍＬ）を５分かけて液滴添加する。反応混合物を室温で１５分間撹拌し、次に濃縮して、残基を得、これを水（３００ｍＬ）およびメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（３００ｍＬ）で希釈する。層を分離し、水層を氷水浴中で撹拌し、５０％水酸化ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で塩基性化し、添加中、内部温度を１０℃未満に維持する。混合物をジクロロメタン（４×３００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、表題化合物を得る（３０．５ｇ）。ＭＳ ｍ／ｚ ２１２．２（Ｍ＋Ｈ）。
２－メチル－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，３，４－オキサジアゾールの合成。
【化20】
【0050】
本発明の新規の組み合わせおよび方法の一部として本明細書で提供されるＯＧＡ阻害剤化合物の個々の異性体、エナンチオマー、およびジアステレオマーは、選択的結晶化技術またはキラルクロマトグラフィーなどの方法による本発明の化合物の合成において、任意の都合のよい時点で当業者によって分離または分解され得ることを理解されたい（例えば、Ｊ．Ｊａｃｑｕｅｓ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９８１およびＥ．Ｌ．Ｅｌｉｅｌ ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ，”Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４を参照されたい）。
【0051】
本発明のＯＧＡ阻害剤化合物の薬学的に許容される塩は、例えば、当技術分野で周知の標準的な条件下での好適な溶媒中で、本発明の化合物の適切な遊離塩基と適切な薬学的に許容される酸との反応によって形成され得る。そのような塩の形成は、当技術分野で周知されており、高く評価されている。例えば、Ｇｏｕｌｄ，Ｐ．Ｌ．，”Ｓａｌｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂａｓｉｃ ｄｒｕｇｓ，”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３３：２０１－２１７（１９８６）、Ｂａｓｔｉｎ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．“Ｓａｌｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎｅｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｔｉｔｉｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４：４２７－４３５（２０００）、およびＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９，（１９７７）を参照されたい。
【実施例】
【0052】
以下の実施例は、本発明を例証することを意図しているが、限定することを意図していない。
【0053】
遺伝子操作された抗タウ抗体の発現
本発明の操作された抗タウ抗体は、本質的に以下のように発現および精製することができる。配列番号１２のＤＮＡ配列（配列番号１のＬＣアミノ酸配列をコードする）および配列番号１１のＤＮＡ配列（配列番号２のＨＣアミノ酸配列をコードする）を含むグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現ベクターを使用して、エレクトロポレーションによってチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）をトランスフェクトする。発現ベクターは、ＳＶ Ｅａｒｌｙ（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳの遺伝子をコードする。ＧＳの発現によって、ＣＨＯ細胞に必要なアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成が可能になる。トランスフェクション後、細胞を５０μＭのＬ－メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）でバルク選択する。選択の厳密さを高めるために、ＭＳＸによるＧＳの阻害を利用する。発現ベクターｃＤＮＡが宿主細胞ゲノムの転写活性領域に組み込まれている細胞は、内因性レベルのＧＳを発現するＣＨＯ野生型細胞に対して選択され得る。トランスフェクトされたプールを、安定した発現細胞のクローンに近い成長を可能にするために低密度でプレーティングする。マスターウェルを抗体発現についてスクリーニングし、次に産生に使用される無血清の浮遊培養でスケールアップする。
本発明の操作された抗タウ抗体は、本質的に以下のように発現および精製することができる。配列番号１２のＤＮＡ配列（配列番号１のＬＣアミノ酸配列をコードする）および配列番号１１のＤＮＡ配列（配列番号２のＨＣアミノ酸配列をコードする）を含むグルタミンシンテターゼ（ＧＳ）発現ベクターを使用して、エレクトロポレーションによってチャイニーズハムスター卵巣細胞株（ＣＨＯ）をトランスフェクトする。発現ベクターは、ＳＶ Ｅａｒｌｙ（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳの遺伝子をコードする。ＧＳの発現によって、ＣＨＯ細胞に必要なアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成が可能になる。トランスフェクション後、細胞を５０μＭのＬ－メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）でバルク選択する。選択の厳密さを高めるために、ＭＳＸによるＧＳの阻害を利用する。発現ベクターｃＤＮＡが宿主細胞ゲノムの転写活性領域に組み込まれている細胞は、内因性レベルのＧＳを発現するＣＨＯ野生型細胞に対して選択され得る。トランスフェクトされたプールを、安定した発現細胞のクローンに近い成長を可能にするために低密度でプレーティングする。マスターウェルを抗体発現についてスクリーニングし、次に産生に使用される無血清の浮遊培養でスケールアップする。
【0054】
抗体が分泌された清澄化培地を、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合性緩衝液で平衡化したタンパク質Ａ親和性カラムに適用する。カラムを１ＭのＮａＣｌで洗浄して、非特異的結合成分を除去する。結合した抗タウ抗体を、例えば、ｐＨ（約）３．５のクエン酸ナトリウムで溶出し、画分を、１Ｍのトリス緩衝液で中和する。抗タウ抗体画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥまたは分析サイズ排除などによって検出し、次にプールする。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去され得る。本発明の抗タウ抗体を、一般的な技術を使用して濃縮および／または滅菌濾過する。これらのクロマトグラフィーステップ後の抗タウ抗体の純度は、９５％を超えている。本発明の抗タウ抗体は、－７０℃で直ちに凍結され得るか、または４℃で数ヶ月間保存され得る。
【0055】
抗タウ抗体の結合速度論および親和性
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００機器で測定される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ（ＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．４＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋３ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０５％界面活性剤Ｐ２０）により２５°でプライミング）を使用して、例示的な抗タウ抗体（配列番号２の両方のＨＣおよび配列番号１の両方のＬＣを有する）の、ヒト単量体（例えば、天然または非凝集体）タウおよびヒトタウ凝集体（両方とも配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する）の両方への結合を測定する。
ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００機器で測定される表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ（ＨＢＳ－ＥＰ＋ランニング緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．４＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋３ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０５％界面活性剤Ｐ２０）により２５°でプライミング）を使用して、例示的な抗タウ抗体（配列番号２の両方のＨＣおよび配列番号１の両方のＬＣを有する）の、ヒト単量体（例えば、天然または非凝集体）タウおよびヒトタウ凝集体（両方とも配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する）の両方への結合を測定する。
【0056】
特に記載のない限り、すべての試薬および材料はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）ＡＢ（Ｕｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）からのものである。４つすべてのフローセル（ＦＣ）に固定化タンパク質Ａ（標準のＮＨＳ－ＥＤＣアミンカップリングを使用して生成）を含有するＣＭ５チップを使用して、捕捉する方法を用いる。抗体サンプルをランニング緩衝液に希釈することによって０．５μｇ／ｍＬで調製する。単量体タウおよび原線維タウを、ランニング緩衝液に希釈することによって、２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３、７．８２、３．９１、１．９５、および０（ブランク）ｎＭの濃度に調製する。各分析サイクルは、（１）別個のフローセル（ＦＣ２、ＦＣ３、およびＦＣ４）で抗体サンプルを捕捉することと、（２）２５０μＬ（３００秒）の単量体タウまたはタウ原線維凝集体をそれぞれのＦＣに５０μＬ／分の流量で注射することと、（３）２０分間緩衝液流に戻して、解離段階を監視することと、（４）グリシン、ｐＨ１．５の２５μＬ（３０秒）注射によりチップ表面を再生することと、（５）ＨＢＳ－ＥＰ＋の５０μＬ（６０秒）注射によりチップ表面を平衡化することと、で構成される。
【0057】
タウ凝集体への結合のデータは標準の二重参照を使用して処理され、Ｂｉａｃｏｒｅ ２０００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア、バージョン４．１を使用して１：１結合モデルに適合し、会合率（ｋｏｎ、Ｍ－１ｓ－１単位）、解離率（ｋｏｆｆ、ｓ－１単位）、およびＲｍａｘ（ＲＵ単位）が決定される。平衡解離定数（ＫＤ）を、
の関係から計算し、モル単位で表す。単量体タウへの結合のデータは、迅速なオンレートおよびオフレートのため、上記のようにＳＰＲによっては正確に決定できない。したがって、単量体タウに結合するためのＫＤは、応答単位に対する抗原の濃度をプロットすることから、定常状態の結合適合モデルを使用することによって得る。結果の結合データを表１に提供する。
【数1】
【表1】
【0058】
表１に提供される結果は、例示された抗タウ抗体がタウ凝集体に対して著しい結合親和性を有し、親和性値がＢｉａｃｏｒｅ分析によって正確に決定され得るように単量体タウへの測定可能な結合を有さないことを示す（迅速なオンレートおよびオフレートのため）。
【0059】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＡＤ脳ホモジネートからタウ原線維を凝集させるための例示的な抗タウ抗体（配列番号２の両方のＨＣおよび配列番号１の両方のＬＣを有する）の相対的結合親和性を決定する。ＡＤ脳ホモジネートをＡＤ患者の脳からの約８０ｇの皮質から調製する。簡単に説明すると、緩衝液（ＴＢＳ／１ｍＭ ＰＭＳＦ／１Ｘ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（登録商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ、ｐ／ｎ．１１ ６９７ ４９８ ００１）およびホスファターゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ、ｐ／ｎ．７８４２８））を約１０ｍｌ／１ｇ（組織）でＡＤ脳組織に添加する。手持ち型キネマティカポリトロンを使用して、速度６～７で組織を均質化する。次に、Ｐａｒｒ Ｂｏｍｂ（Ｐａｒｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ｐ／ｎ．４６５３）を使用して、１５００ｐｓｉの窒素で３０分間組織をさらに均質化する。ホモジネートを２８，０００ｇ（Ｊ１４ベックマンローター）で、４℃で３０分間回転させる。上清を収集し、プールして、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４００Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗの高さ４ｃｍのガードカラムに流して、大きな破片を除去し、次に１時間あたり５０～６０ｍｌの流量で、２５ｍｌのＭＣ１－Ａｆｆｉｇｅｌの１０カラムに流して、ＭＣ１結合タウ原線維を精製する。精製の回収率を最大化するために、上清をＭＣ－１カラムに通して、４℃で１８～２０時間リサイクルする。ガードカラムを除去し、ＭＣ１カラムを少なくとも４０カラム容量のＴＢＳで洗浄する。次に、結合したタウ凝集体を２カラム容量の３ＭのＫＳＣＮで溶出し、約１ｍｌの画分で収集する。各溶出画分のタンパク質濃度を、マイクロタイタープレートブラッドフォードアッセイによって確認する。陽性タンパク質レベルを含有する画分をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｃｅｌ－３０Ｋ）を使用して４℃で約２ｍｌに濃縮し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（１０Ｋ ＭＷＣＯ ３～１２ｍｌ、Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して１リットルのＴＢＳに対して一晩透析する。ＡＤ脳ホモジネートから精製されたタウ原線維内のタウの濃度を、ＤＡ－９捕捉抗体およびＣＰ２７検出抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定する。
【0060】
ＰＢＳ中の精製したタウ原線維（５０μｌ）を９６ウェルプレート（Ｃｏａｓｔａｒ、ｐ／ｎ．３６９０）のウェルに、総タウの０．７μｇ／ｍｌに相当する濃度でコーティングする。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次に１５０μｌのＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、１００μｌのＢＢ３（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｐ／ｎ．６４３）中、室温で少なくとも１時間ブロッキングする（通常２時間）。ブロッキングに続いて、ブロッキング緩衝液をウェルから除去する。例示された抗タウ抗体（配列番号２の両方のＨＣおよび配列番号１の両方のＬＣを有する）を０．２５％カゼイン緩衝液で１０００ｎＭストックに希釈し、次に２倍希釈で２３倍段階希釈する。５０μｌのストックおよび段階希釈した抗体を別個のウェルに添加し、室温で２時間インキュベートした後、プレートをウェルあたり２００μｌのＰＢＳＴで４回洗浄する。５０μｌの抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ抗体（１：４０００で０．２５％カゼイン緩衝液に希釈）を添加し、室温で１時間インキュベートした後、プレートをウェルあたり２００μｌのＰＢＳＴで４回洗浄する。５０μｌのＴＭＢ／Ｈ２Ｏ２を添加し、室温で約１０分間インキュベートする。５０μｌの停止溶液（２Ｎ Ｈ２ＳＯ４）を添加することによって反応を停止し、４５０ｎｍで比色シグナルを測定する。データをＰｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ）プログラムにニュウリョクし、非線形回帰曲線適合およびシグモイド線量応答を使用してＥＣ５０値を生成する。結果を表２に提示する。
【表2】
【0061】
表２に反映されるように、本発明の例示されたタウモノクローナル抗体は、精製されたタウ原線維に対して著しい親和性（ＥＣ５０によって測定される）を示す。
【0062】
エクスビボターゲットエンゲージメント研究
例示された抗タウ抗体（配列番号２の両方のＨＣおよび配列番号１の両方のＬＣを有する）のヒトの脳由来の凝集タウへの結合を、「正常な」個体（最小限のタウ凝集を示す）、ＡＤ患者（重度のタウ凝集およびＮＦＴ形成病理を示す）、ＰＤ患者（重度のタウ凝集を示す）から得られたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）脳切片の免疫組織化学染色によって決定する。バックグラウンドの非特異的染色レベルを決定するために、ヒトタウを有さない「対照」野生型マウスに由来する脳切片に対しても染色を行う。
例示された抗タウ抗体（配列番号２の両方のＨＣおよび配列番号１の両方のＬＣを有する）のヒトの脳由来の凝集タウへの結合を、「正常な」個体（最小限のタウ凝集を示す）、ＡＤ患者（重度のタウ凝集およびＮＦＴ形成病理を示す）、ＰＤ患者（重度のタウ凝集を示す）から得られたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）脳切片の免疫組織化学染色によって決定する。バックグラウンドの非特異的染色レベルを決定するために、ヒトタウを有さない「対照」野生型マウスに由来する脳切片に対しても染色を行う。
【0063】
ＦＦＰＥ切片を脱パラフィンおよび再水和する。その後、抗原回復（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ ＰＴモジュールシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを使用）を切片に対して行い、これは、クエン酸緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｐ／ｎ．ＴＡ－２５０－ＰＭ１Ｘ）中で切片を１００℃で２０分間加熱し、次にｄＨ２０中で切片を冷却することを含む。次に、切片を次の７つのインキュベーションステップ（室温）に晒す：（１）０．０３％のＨ２Ｏ２中で１０分、（２）ＰＢＳＴ中で希釈した正常なヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．，ｐ／ｎ．Ｓ－１０００）の１：２０希釈液中で３０分、（３）例示された抗タウ抗体中で６０分（１ｍｇ／ｍｌに正規化され、次に切片とのインキュベーションの前に１：４０００の希釈にＰＢＳＴ中で希釈）、（４）ＰＢＳＴ中１．１μｇ／ｍｌの濃度のウサギ抗ヒトＩｇＧ４（例示された抗体のＦｃ領域に対して産生）中で３０分、（５）ＰＢＳＴ中で希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．，ｐ／ｎ．ＢＡ－１０００）の１：２００希釈液中で３０分、（６）アビジン－ビオチン複合体溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．，ｐ／ｎ．ＰＫ－７１００）中で３０分、（７）３，３’－ジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．，ｐ／ｎ．ＳＫ－４１０５）中で５分。ＰＢＳＴを使用して、上記の７つのステップの各々の間で切片を洗浄する。上の７つのインキュベーションステップに続いて、切片をヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバースリップをかける。マウスの「対照」組織切片の場合、上のプロトコルを、インキュベーションステップ（３）において、例示された抗タウ抗体の１：８０００希釈液（１：４０００希釈液とは対照的に）を使用すること、ならびにインキュベーションステップ（４）および（５）をＰＢＳＴ中のビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ．ｐ／ｎ．ＢＡ－３０００）の１：２００希釈の１回３０分に置き換えることによって変更する。
【0064】
実質的に上記の手順に従って、例示された抗タウ抗体の、ヒトの脳由来のタウへの結合の分析が行われる。結果を表３に提供する。
【表3】
【0065】
表３に提供された結果は、例示された抗タウ抗体が、対照サンプルと比較して、海馬脳切片において、ＡＤおよびＰＤ患者の両方からの凝集タウに対して著しくより高いレベルの染色を示すことを反映している。さらに、ＡＤおよびＰＤはタウをコードする遺伝子の異なるスプライシング変異体を特徴とするため、これらの結果は、例示された抗タウ抗体が、ＡＤおよびＰＤの両方のタウ凝集体に共通のヒトタウ（配列番号１３の例示されたヒトタウに基づく残基番号付け）のアミノ酸残基７～９および３１２～３２２を含む立体配座エピトープに特異的に結合するという結論を支持する。
【0066】
タウ凝集体増殖のインビボ中和
約５ヶ月齢のＰ３０１Ｓマウスからの均質な脳幹プレップは、正常な１０週齢の雌Ｐ３０１Ｓマウスの海馬に注射すると、天然の非凝集タウの凝集を誘発することが知られており、タウ凝集の増殖のような効果を示す。４．５～５ヶ月齢のＰ３０１Ｓマウスからの脳幹組織の均質なプレップを上記と実質的に同じように調製する。
約５ヶ月齢のＰ３０１Ｓマウスからの均質な脳幹プレップは、正常な１０週齢の雌Ｐ３０１Ｓマウスの海馬に注射すると、天然の非凝集タウの凝集を誘発することが知られており、タウ凝集の増殖のような効果を示す。４．５～５ヶ月齢のＰ３０１Ｓマウスからの脳幹組織の均質なプレップを上記と実質的に同じように調製する。
【0067】
正常な１０週齢の雌Ｐ３０１Ｓマウスの海馬の左半球に５μｌの均質な脳プレップおよび７．５μｇの例示的な抗タウ抗体（配列番号２の両方のＨＣおよび配列番号１の両方のＬＣを有する）（Ｎ＝１２）または７．５μｇの対照ヒトＩｇＧ４抗体（Ｎ＝１１）を注射する。注射の４週間後、マウスを犠牲にし、左右の半球を収集し、パラフィン包埋し、６μｍの連続切片をスライドガラスに載せる。ブレグマ（ＡＰ＝－２．３０）を含むスライドを脱パラフィンし、包埋組織を再水和し、スライドをクエン酸緩衝液中１００℃で２０分間加熱することによって、抗原回復を行う。スライドをｄＨ２Ｏ中で冷却し、以下のステップに従って室温でインキュベートする：（ａ）（０．０３％）Ｈ２Ｏ２中で１０分、（ｂ）正常なヤギ血清の１：２０希釈液中で３０分、（ｃ）ＰＧ－５抗体の１：８０００希釈液（ＰＢＳＴ中で希釈）中で６０分（Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｄａｖｉｅｓ，Ａｌｂｅｒｔ Ｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｏｆ Ｙｅｓｈｉｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの研究室から得たＰＧ－５抗体、ＰＧ－５抗体は、リン酸化されたときのタウの残基４０９でセリンに特異的に結合し、残基番号付けは、配列番号１３の例示されたヒトタウに基づく）、（ｄ）ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の１：２００希釈液（ＰＢＳＴ中で希釈）で３０分、（ｅ）アビジン－ビオチン複合体溶液中で３０分、および（ｆ）３，３’－ジアミノベンジジン中で５分。ＰＢＳＴは、それぞれのステップ間の洗浄に使用される。５分後、３，３’－ジアミノベンジジン中のインキュベーションでは、切片をヘマトキシリンで対比染色し、次に再水和し、カバースリップをかける染色信号をＳｃａｎｓｃｏｐｅ ＡＴ Ｓｌｉｄｅ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｐｅｒｉｏ）によって２０倍の倍率で測定する。ＰＧ－５免疫反応性を、Ｉｍａｇｅｓｃｏｐｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ．１１．１．２．７８０、Ａｐｅｒｉｏ）のポジティブピクセルアルゴリズムを使用して定量化し、パーセンテージで表す。結果を表４に提供する。
【表4】
【0068】
表４に提供される結果は、例示された抗タウ抗体が、対照ＩｇＧ４抗体と比較して、左右の海馬の両方においてタウ凝集のレベルを低減することを示す。示されるように、例示された抗タウ抗体は、対照ＩｇＧ４抗体と比較して、左海馬におけるタウ凝集の６０．５％大きい低減、および右海馬におけるタウ凝集の６６．５％大きい低減をそれぞれもたらす。これらの結果は、例示された抗タウ抗体がタウ凝集の増殖に対して中和活性を有することを示す。
【0069】
５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イルＯＧＡ阻害剤
実施例１
Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドの合成。
Ｎ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）アセトアミド（２８．３ｇ、１５０ｍｍｏｌ）を、室温で酢酸エチル（７０７ｍＬ）中の５－メチル－３－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，２，４－オキサジアゾール塩酸塩（４８．７ｇ、１８５ｍｍｏｌ、純度９４％）に添加する。反応混合物を室温で撹拌し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３４．１ｍＬ、１９５ｍｍｏｌ）を１分かけて液滴添加し、次にトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（９８．５ｇ、４５１ｍｍｏｌ）を一度に添加する。反応混合物を、３１℃の加熱ブロック内で、３０℃の内部温度で一晩撹拌し、次に氷水浴中で５℃の内部温度に冷却する。内部温度を１０℃未満に維持しながら、混合物に２Ｍの塩酸水溶液（２２６ｍＬ）を１５分かけて添加する。混合物に水（２５０ｍＬ）を添加し、混合物を室温で５分間撹拌する。層を分離し、有機層を水（５０ｍＬ）中の２Ｍの塩酸水溶液（２８ｍＬ）の混合物で抽出する。第１の水層を氷水浴中で撹拌し、内部温度を１０℃未満に維持しながら、５０％水酸化ナトリウム水溶液（２５．７ｍＬ）を１０分かけて液滴添加する。混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）で希釈し、次に室温で１０分間撹拌し、次に酢酸エチル（３×４００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、残基を得る。水性塩酸で抽出した第２の水層を２－メチルテトラヒドロフラン（２００ｍＬ）で希釈し、混合物を珪藻土の短いパッドに通過させる。濾液を分液漏斗に移し、層を分離する。水層を氷水浴中で撹拌し、内部温度を１０℃未満に維持しながら、５０％水酸化ナトリウム水溶液（３．１５ｍＬ）を５分かけて液滴添加する。混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で希釈し、次に室温で５分間撹拌し、次に酢酸エチル（３×４０ｍＬ）および酢酸エチル（１００ｍＬ）中の１０％イソプロパノールで抽出する。合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、残基を得、これを処理した第１の部分からの残基と組み合わせる。組み合わせた残基をシリカゲル（３５０ｇ）のパッドに通過させ、酢酸エチル（３．５Ｌ）で溶出し、濾液を濃縮して、残基を得る（４５．８ｇ）。
実施例１
Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドの合成。
【化21】
【0070】
残基（合わせたロットの４７．５ｇ、１２３．９ｍｍｏｌ）をフラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ヘプタン中の５０～１００％酢酸エチルで溶出する。産生物含有画分を残基に濃縮し、これを、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルとヘプタンとの１：１混合物（４４８ｍＬ）に懸濁する。混合物を４６℃の加熱ブロック内で、４５℃の内部温度で３０分間撹拌し、次に撹拌しながら２時間かけて室温に冷却する。混合物を濾過し、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテルとヘプタンとの１：１混合物（３０ｍＬ）で固体を洗浄する。濾過した固体を真空下、４０℃で一晩乾燥させて、表題化合物を得る（２８．５ｇ）。ＭＳ ｍ／ｚ ３８４．０（Ｍ＋Ｈ）；
【数2】
【0071】
Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドの代替合成。
窒素下のジクロロメタン（１０ｍＬ）中のＮ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）アセトアミド（０．０５ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）および５－メチル－３－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，２，４－オキサジアゾール（０．０４ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ、０．５７ｍｍｏｌ）およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．１２ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を室温で１２時間撹拌する。反応混合物を重炭酸ナトリウムの飽和水溶液（１０ｍＬ）に注ぐ。層を分離し、水相をジクロロメタン（２×１０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、オレンジ色の油を得る。
窒素下のジクロロメタン（１０ｍＬ）中のＮ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）アセトアミド（０．０５ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）および５－メチル－３－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，２，４－オキサジアゾール（０．０４ｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１ｍＬ、０．５７ｍｍｏｌ）およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．１２ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）を添加する。反応混合物を室温で１２時間撹拌する。反応混合物を重炭酸ナトリウムの飽和水溶液（１０ｍＬ）に注ぐ。層を分離し、水相をジクロロメタン（２×１０ｍＬ）で抽出する。合わせた有機抽出物を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、オレンジ色の油を得る。
【0072】
残基をメタノール中に（総体積９．８ｍＬまで）取り、濾過し、プレップＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １０ Ｍｉｃｒｏｎ ５０＊１５０ｍｍ Ｃ－１８）（水酸化アンモニウムでｐＨ９まで調整した１０ｍＭの重炭酸アンモニウムを有するＣＨ３ＣＮ＆Ｗａｔｅｒ、１１０ｍｌ／分で１０分間にわたって１５％～１００％のＣＨ３ＣＮ）（１回の注射）（２７１／２０４ｎｍ）によって精製して、表題化合物を得る（０．０２ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、２８％）。ＭＳ ｍ／ｚ ３８４．２（Ｍ＋Ｈ）。
【0073】
実施例１Ａ
結晶性Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミド。
ヘプタン中の４４８ｍＬの５０％メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル中の粗Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミド（２９．９ｇ）を４６℃で３０分間懸濁する。混合物を撹拌し、２時間かけて１９℃に冷却してから濾過し、続いてヘプタン中の３０ｍＬの５０％メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄して、表題化合物を提供する（２８．５ｇ、９５％収率）。
結晶性Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミド。
ヘプタン中の４４８ｍＬの５０％メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル中の粗Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミド（２９．９ｇ）を４６℃で３０分間懸濁する。混合物を撹拌し、２時間かけて１９℃に冷却してから濾過し、続いてヘプタン中の３０ｍＬの５０％メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで洗浄して、表題化合物を提供する（２８．５ｇ、９５％収率）。
【0074】
実施例１ＡのＸ線粉末回折（ＸＲＰＤ）
結晶性固体のＸＲＰＤパターンは、３５ｋＶおよび５０ｍＡで動作するＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）およびＶａｎｔｅｃ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ Ｘ線粉末回折計で得られる。サンプルを、２θで４～４０°、２θで０．００８７°のステップサイズ、０．５秒／ステップのスキャン速度、０．６ｍｍの発散、５．２８ｍｍの固定散乱防止、および９．５ｍｍの検出器スリットでスキャンする。乾燥粉末を石英サンプルホルダーに詰め、スライドガラスを使用して滑らかな表面を得る。結晶学の分野では、所与の任意の結晶形態について、結晶形態および癖などの要因に起因する好ましい配向のために、回折ピークの相対強度が変化し得ることは周知されている。好ましい配向の影響が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形の特徴的なピーク位置は変化しない、（例えば、米国薬局方３８－Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ３５ Ｃｈａｐｔｅｒ ９４１、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）公式２０１５年５月１日による結晶性および部分的に結晶性の固体の特性評価を参照されたい）。さらに、結晶学の分野では、所与の任意の結晶形態について、角度のピーク位置がわずかに変化し得ることも周知されている。例えば、ピーク位置は、サンプルが分析される温度もしくは湿度の変動、サンプルの変位、または内部標準の有無によってシフトし得る。この場合、２θで±０．２のピーク位置変動は、示された結晶形態の明確な識別を妨げることなく、これらの潜在的な変動を考慮に入れることになる。結晶形態の確認は、区別可能なピーク（°２θの単位）、典型的にはより顕著なピークの任意の個別の組み合わせに基づいて行われ得る。周囲温度および相対湿度で収集された結晶形態の回折パターンは、８．８５度および２６．７７度の２－シータでのＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調整される。
結晶性固体のＸＲＰＤパターンは、３５ｋＶおよび５０ｍＡで動作するＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）およびＶａｎｔｅｃ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ Ｘ線粉末回折計で得られる。サンプルを、２θで４～４０°、２θで０．００８７°のステップサイズ、０．５秒／ステップのスキャン速度、０．６ｍｍの発散、５．２８ｍｍの固定散乱防止、および９．５ｍｍの検出器スリットでスキャンする。乾燥粉末を石英サンプルホルダーに詰め、スライドガラスを使用して滑らかな表面を得る。結晶学の分野では、所与の任意の結晶形態について、結晶形態および癖などの要因に起因する好ましい配向のために、回折ピークの相対強度が変化し得ることは周知されている。好ましい配向の影響が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形の特徴的なピーク位置は変化しない、（例えば、米国薬局方３８－Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ３５ Ｃｈａｐｔｅｒ ９４１、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）公式２０１５年５月１日による結晶性および部分的に結晶性の固体の特性評価を参照されたい）。さらに、結晶学の分野では、所与の任意の結晶形態について、角度のピーク位置がわずかに変化し得ることも周知されている。例えば、ピーク位置は、サンプルが分析される温度もしくは湿度の変動、サンプルの変位、または内部標準の有無によってシフトし得る。この場合、２θで±０．２のピーク位置変動は、示された結晶形態の明確な識別を妨げることなく、これらの潜在的な変動を考慮に入れることになる。結晶形態の確認は、区別可能なピーク（°２θの単位）、典型的にはより顕著なピークの任意の個別の組み合わせに基づいて行われ得る。周囲温度および相対湿度で収集された結晶形態の回折パターンは、８．８５度および２６．７７度の２－シータでのＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調整される。
【0075】
結晶性Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，２，４－オキサジアゾール－３－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドの調製サンプルは、以下の表１に記載されるように、回折ピーク（２－シータ値）を有するときにＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＰＤパターンを特徴とする。具体的には、パターンは、１５．３°、２１．６°、２２．２°、２２．７°、２３．５°、２４．３°、および２６．８°からなる群から選択される１つ以上のピークとともに、１２．１°でピークを含み、回折角の許容誤差は０．２度である。
【表5】
【0076】
５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル化合物ＯＧＡ阻害剤
実施例２
Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドの合成。
窒素下の酢酸エチル（１ｍＬ）中の２－メチル－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，３，４－オキサジアゾール・２，２，２－トリフルオロ酢酸（０．１６ｇ、０．７ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．０２１ｍＬ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を５分間撹拌する。Ｎ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）アセトアミド（０．０４ｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）を添加し、５分間撹拌し、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．０５５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を４０℃に温め、一晩撹拌する。混合物を減圧下で濃縮して、褐色の固体を得る。
実施例２
Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドの合成。
【化22】
【0077】
残基をジメチルスルホキシド中に（総体積１ｍＬまで）取り、プレップＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ－ＮＸ １０ Ｍｉｃｒｏｎ ３０＊１００ｍｍ Ｃ－１８）（水酸化アンモニウムでｐＨ９まで調整した１０ｍＭの重炭酸アンモニウムを有するＣＨ３ＣＮ＆Ｗａｔｅｒ、１００ｍｌ／分で１２分間にわたって１５％～１００％のＣＨ３ＣＮ）（１回の注射）（（２７１／２０４ｎｍ）によって精製して、表題化合物を得る（０．００７ｇ、１４％）。ＭＳ ｍ／ｚ ３８４．２（Ｍ＋Ｈ）。
【0078】
結晶性Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドの代替合成。
トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（５９．１ｇ、２７９ｍｍｏｌ）を２－メチル－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－ピペリジル］オキシメチル］－１，３，４－オキサジアゾール（２３．３ｇ、９３．０ｍｍｏｌ）、酢酸エチル（４３８ｍＬ）、およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３２．４ｍＬ、１８６ｍｍｏｌ）の混合物に室温で添加する。反応混合物を３１℃の加熱ブロック内で、３０℃の内部温度で１５分間撹拌し、次にＮ－（４－フルオロ－５－ホルミル－チアゾール－２－イル）アセトアミド（１７．５ｇ、９３．０ｍｍｏｌ）を５分かけて少しずつ添加する。反応混合物を３１℃の加熱ブロック内で、３０℃の内部温度で一晩撹拌し、次に氷水浴中で５℃の内部温度に冷却する。内部温度を１０℃未満に維持しながら、混合物に２Ｍの塩酸水溶液（１４０ｍＬ）を１５分かけて添加する。混合物を室温で１５分間撹拌し、次に水（５０ｍＬ）および酢酸エチル（２０ｍＬ）で希釈し、層を分離する。有機層を水（１００ｍＬ）中の２Ｍの塩酸水溶液（３５ｍＬ）の混合物で抽出する。組み合わせた水層を氷水浴中で撹拌し、内部温度を１０℃未満に維持しながら、５０％水酸化ナトリウム水溶液（１９．５ｍＬ）を１０分かけて液滴添加する。混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で希釈し、２－メチルテトラヒドロフラン（３ｘ２００ｍＬ）で抽出する。合わせた有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮して、残基を得、これを、フラッシュクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中の０～１５％の２－プロパノールで溶出する。産生物含有画分を濃縮して、残基を得、これをヘプタン（１００ｍＬ）から濃縮する。濃縮した材料をヘプタン（４５７ｍＬ）中の４０％酢酸エチルと組み合わせ、混合物を５０℃の加熱ブロック内で１時間撹拌し、次に室温に冷却し、濾過する。濾過した固体を真空下、４０℃で１時間乾燥させて、産生物の第１の収穫物を得る（２２．９ｇ）。濾液を濃縮して、残基を得、これをヘプタン（５０ｍＬ）中の４０％酢酸エチルと組み合わせ、混合物を５０℃の加熱ブロック内で３０分間撹拌し、次に室温に冷却し、濾過する。濾過した固体をヘプタン（３３ｍＬ）中の５０％酢酸エチルと組み合わせ、混合物を５０℃の加熱ブロック内で１時間撹拌し、次に室温に冷却し、濾過する。濾過した固体を真空下、４０℃で１時間乾燥させて、産生物の第２の収穫物を得る（２．５０ｇ）。
【化23】
【0079】
産生物の第１および第２の収穫物（２９．３ｇ、７６．４ｍｍｏｌ）を含むロットの組み合わせを、室温で酢酸エチル（１１７ｍＬ）およびヘプタン（１１７ｍＬ）と組み合わせる。混合物を５１℃の加熱ブロック内で、５０℃の内部温度で３０分間撹拌し、次に室温に冷却し、濾過する。濾過した固体を真空下、４０℃で一晩乾燥させて、結晶性固体として表題化合物を得る（２６．７ｇ）。ＭＳ ｍ／ｚ ３８４．０（Ｍ＋Ｈ）、
【数3】
【0080】
結晶性Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドのＸ粉末線回折（ＸＲＰＤ）。
結晶性Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミド（２１８ｍｇ）を１．２５ｍＬのメタノールに６０℃で５分間溶解する。溶液を２０分間撹拌しながら周囲温度に冷却する。得られた固体を真空濾過によって単離する。最終的な固体産生物は、１６３ｍｇまたは７５％の収率である。
結晶性Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミド（２１８ｍｇ）を１．２５ｍＬのメタノールに６０℃で５分間溶解する。溶液を２０分間撹拌しながら周囲温度に冷却する。得られた固体を真空濾過によって単離する。最終的な固体産生物は、１６３ｍｇまたは７５％の収率である。
【0081】
結晶性固体のＸＲＤパターンは、３５ｋＶおよび５０ｍＡで動作するＣｕＫａ源（λ＝１．５４０６０Å）およびＶａｎｔｅｃ検出器を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ４ Ｅｎｄｅａｖｏｕｒ Ｘ線粉末回折計で得られる。サンプルを、２θで４～４０°、２θで０．００８７°のステップサイズ、０．５秒／ステップのスキャン速度、０．６ｍｍの発散、５．２８ｍｍの固定散乱防止、および９．５ｍｍの検出器スリットでスキャンする。乾燥粉末を石英サンプルホルダーに詰め、スライドガラスを使用して滑らかな表面を得る。結晶学の分野では、所与の任意の結晶形態について、結晶形態および癖などの要因に起因する好ましい配向のために、回折ピークの相対強度が変化し得ることは周知されている。好ましい配向の影響が存在する場合、ピーク強度は変化するが、多形の特徴的なピーク位置は変化しない。例えば、米国薬局方３８－Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ ３５ Ｃｈａｐｔｅｒ＜９４１＞、Ｘ線粉末回折（ＸＲＰＤ）公式２０１５年５月１日による結晶性および部分的に結晶性の固体の特性評価を参照されたい。さらに、結晶学の分野では、所与の任意の結晶形態について、角度のピーク位置がわずかに変化し得ることも周知されている。例えば、ピーク位置は、サンプルが分析される温度もしくは湿度の変動、サンプルの変位、または内部標準の有無によってシフトし得る。この場合、２θで±０．２のピーク位置変動は、示された結晶形態の明確な識別を妨げることなく、これらの潜在的な変動を考慮に入れることになる。結晶形態の確認は、区別可能なピーク（°２θの単位）、典型的にはより顕著なピークの任意の個別の組み合わせに基づいて行われ得る。周囲温度および相対湿度で収集された結晶形態の回折パターンは、８．８５度および２６．７７度の２－シータでのＮＩＳＴ６７５標準ピークに基づいて調整された。
【0082】
したがって、結晶性Ｎ－［４－フルオロ－５－［［（２Ｓ，４Ｓ）－２－メチル－４－［（５－メチル－１，３，４－オキサジアゾール－２－イル）メトキシ］－１－ピペリジル］メチル］チアゾール－２－イル］アセトアミドは、表１に記載されるように、回折ピーク（２－シータ値）を有するときにＣｕＫａ放射線を使用したＸＲＤパターンを特徴とする。より具体的には、パターンは、好ましくは、５．８°、１３．０°、１４．３°、１７．５°、２０．４°、２１．４°、および２２．２°からなる群から選択される１つ以上のピークとともに、１３．５°でピークを含み、回折角の許容誤差は０．２度である。
【表6】
【0083】
インビトロヒトＯＧＡ酵素アッセイ
ＯＧＡタンパク質の生成
完全長のヒトＯ－ＧｌｃＮＡｃ－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＭ＿０１２２１５）をコードするヌクレオチド配列を、Ｎ末端ポリヒスチジン（ＨＩＳ）タグ付きのｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロゲン）ベクターに挿入する。バキュロウイルスの生成を、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（インビトロゲン）プロトコルに従って実行する。Ｓｆ９細胞を、培養物１リットルあたり１０ｍＬのＰ１のウイルスを使用して１．５×１０６細胞／ｍＬで感染させ、２８℃で４８時間インキュベートする。細胞をスピンダウンし、ＰＢＳですすぎ、ペレットを－８０℃で保存する。
上のＯＧＡタンパク質（Ｈｉｓ－ＯＧＡ）を次のように精製する：４Ｌの細胞を５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００、４錠のプロテアーゼ阻害剤（完全にＥＤＴＡを含まない、Ｒｏｃｈｅ）を含有する２００ｍＬの緩衝液中、４℃で４５分間溶解する。次に、この細胞溶解物を１６５００ｒｐｍ、４℃で４０分間スピンし、上清を６ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂（ニッケル－ニトリロ三酢酸）を用いて４℃で２時間インキュベートする。
ＯＧＡタンパク質の生成
完全長のヒトＯ－ＧｌｃＮＡｃ－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＭ＿０１２２１５）をコードするヌクレオチド配列を、Ｎ末端ポリヒスチジン（ＨＩＳ）タグ付きのｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロゲン）ベクターに挿入する。バキュロウイルスの生成を、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（インビトロゲン）プロトコルに従って実行する。Ｓｆ９細胞を、培養物１リットルあたり１０ｍＬのＰ１のウイルスを使用して１．５×１０６細胞／ｍＬで感染させ、２８℃で４８時間インキュベートする。細胞をスピンダウンし、ＰＢＳですすぎ、ペレットを－８０℃で保存する。
上のＯＧＡタンパク質（Ｈｉｓ－ＯＧＡ）を次のように精製する：４Ｌの細胞を５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００、４錠のプロテアーゼ阻害剤（完全にＥＤＴＡを含まない、Ｒｏｃｈｅ）を含有する２００ｍＬの緩衝液中、４℃で４５分間溶解する。次に、この細胞溶解物を１６５００ｒｐｍ、４℃で４０分間スピンし、上清を６ｍＬのＮｉ－ＮＴＡ樹脂（ニッケル－ニトリロ三酢酸）を用いて４℃で２時間インキュベートする。
【0084】
次に、樹脂をカラムに詰め、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭのイミダゾール、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００、１ｍＭのＤＴＴを用いて、続いて５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴを用いて洗浄する。タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾール、１０％グリセロール、１ｍＭのＤＴＴで溶出する。プールしたＨｉｓ－ＯＧＡ含有画分を６ｍｌに濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（１６／６０）にロードする。タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭのＤＴＴで溶出する。Ｈｉｓ－ＯＧＡを含有する画分をプールし、タンパク質濃度をＢＣＡ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ）で測定する。
【0085】
ＯＧＡ酵素アッセイ
ＯＧＡ酵素は、核細胞質タンパク質からのＯ－ＧｌｃＮＡｃの除去を触媒する。この活性を測定するために、フルオレセインジ－Ｎ－アセチル－β－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミニド（ＦＤ－ＧｌｃＮＡｃ，Ｋｉｍ，Ｅｕｎ Ｊｕ；Ｋａｎｇ，Ｄａｅ Ｏｏｋ；Ｌｏｖｅ，Ｄｏｎａ Ｃ．；Ｈａｎｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ａ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００６），３４１（８），９７１－９８２）を、１０μＭ（９６ウェルアッセイ形式）または６．７μＭ（３８４ウェルアッセイ形式）の最終濃度で基質として使用する。この蛍光発生基質は、ＯＧＡによる切断時に蛍光を発するため、５３５ｎｍで検出された蛍光の増加（４８５ｎｍでの励起）によって酵素活性を測定できる。
ＯＧＡ酵素は、核細胞質タンパク質からのＯ－ＧｌｃＮＡｃの除去を触媒する。この活性を測定するために、フルオレセインジ－Ｎ－アセチル－β－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミニド（ＦＤ－ＧｌｃＮＡｃ，Ｋｉｍ，Ｅｕｎ Ｊｕ；Ｋａｎｇ，Ｄａｅ Ｏｏｋ；Ｌｏｖｅ，Ｄｏｎａ Ｃ．；Ｈａｎｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ａ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００６），３４１（８），９７１－９８２）を、１０μＭ（９６ウェルアッセイ形式）または６．７μＭ（３８４ウェルアッセイ形式）の最終濃度で基質として使用する。この蛍光発生基質は、ＯＧＡによる切断時に蛍光を発するため、５３５ｎｍで検出された蛍光の増加（４８５ｎｍでの励起）によって酵素活性を測定できる。
【0086】
アッセイ緩衝液を、ｐＨ７で、水中での最終濃度５０ｍＭのＨ２ＮａＰＯ３－ＨＮａ２ＰＯ３、０．０１％のウシ血清アルブミンおよび０．０１％トリトン（商標）Ｘ－１００を得るように調製する。最終的な酵素濃度は、３ｎＭ（９６ウェルアッセイ形式）または３．２４ｎＭ（３８４ウェルアッセイ形式）である。両方のアッセイ形式から本質的に同等の結果が得られる。
【0087】
試験する化合物を、１０ポイントの濃度応答曲線を使用して純粋なジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈する。反応混合物中の最大化合物濃度は、３０μＭである。適切な濃度の化合物をＯＧＡ酵素と３０分間プレインキュベートした後、基質を添加することによって反応を開始する。反応を室温で６０分間進行させる。次に、反応を停止せずに、蛍光を読み取る。化合物の正規化されたデータと対数とをプロットし、４つのパラメーターのロジスティック方程式を使用してデータを適合することによって、ＩＣ５０値を計算する。
【0088】
実施例１の化合物を本質的に上記のように試験すると、２．３６ｎＭ±０．７８６（ｎ＝８）のＩＣ５０を示した。このデータは、実施例１の化合物がインビトロでＯＧＡ酵素活性を阻害することを示す。
【0089】
実施例２の化合物もまた本質的に上記のように試験すると、２．１３ｎＭ±０．８９（ｎ＝５）のＩＣ５０を示した。この結果は、実施例２の化合物がインビトロでＯＧＡ酵素活性を阻害することを示す。
【0090】
ＯＧＡ酵素活性の阻害を測定するための全細胞アッセイ
細胞プレーティング：
当技術分野で既知の標準条件を利用して、微小管関連タンパク質タウのＰ３０１Ｓ－１Ｎ４Ｒ形態の誘発性発現のために改変されたＴＲｅｘ－２９３細胞を生成し、１０％テトラサイクリン不含ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ Ｆ２４４２）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５μｇ／ｍＬのブラスチシジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ａ１１１３９－０３）、および２００μｇ／ｍＬのゼオシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ｒ２５０－０１）で補足したＤＭＥＭ高グルコース（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ５７９６）からなる成長培地で維持する。実験のために、細胞をポリ－Ｄ－リジンでコーティングされたＣｏｒｎｉｎｇ Ｂｉｏｃｏａｔ（３５６６６３）３８４ウェルプレートのウェルあたり１０，０００～１４，０００細胞で成長培地にプレーティングし、３７℃／５％ＣＯ２の細胞インキュベーターで２０～２４時間インキュベートする。タウ発現を誘発せずに実験を行う。
細胞プレーティング：
当技術分野で既知の標準条件を利用して、微小管関連タンパク質タウのＰ３０１Ｓ－１Ｎ４Ｒ形態の誘発性発現のために改変されたＴＲｅｘ－２９３細胞を生成し、１０％テトラサイクリン不含ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ Ｆ２４４２）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５μｇ／ｍＬのブラスチシジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ａ１１１３９－０３）、および２００μｇ／ｍＬのゼオシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ｒ２５０－０１）で補足したＤＭＥＭ高グルコース（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ５７９６）からなる成長培地で維持する。実験のために、細胞をポリ－Ｄ－リジンでコーティングされたＣｏｒｎｉｎｇ Ｂｉｏｃｏａｔ（３５６６６３）３８４ウェルプレートのウェルあたり１０，０００～１４，０００細胞で成長培地にプレーティングし、３７℃／５％ＣＯ２の細胞インキュベーターで２０～２４時間インキュベートする。タウ発現を誘発せずに実験を行う。
【0091】
化合物処理：
試験する化合物を、１０ポイントの濃度応答曲線を使用して純粋なＤＭＳＯ中で１／３に段階希釈し、成長培地でさらに希釈する。プレーティングの２０～２４時間後、細胞を成長培地中の試験化合物で処理し、最大化合物濃度は、１５μＭ（０．１５％ＤＭＳＯ）である。最大阻害は１５ｕＭのチアメットＧの反復測定によって定義され、最小阻害は０．１５％ＤＭＳＯ処理の反復測定によって定義される。細胞を３７℃／５％ＣＯ２のインキュベーターに２０～２４時間戻す。化合物を各プレート内で２回ずつ試験する。
試験する化合物を、１０ポイントの濃度応答曲線を使用して純粋なＤＭＳＯ中で１／３に段階希釈し、成長培地でさらに希釈する。プレーティングの２０～２４時間後、細胞を成長培地中の試験化合物で処理し、最大化合物濃度は、１５μＭ（０．１５％ＤＭＳＯ）である。最大阻害は１５ｕＭのチアメットＧの反復測定によって定義され、最小阻害は０．１５％ＤＭＳＯ処理の反復測定によって定義される。細胞を３７℃／５％ＣＯ２のインキュベーターに２０～２４時間戻す。化合物を各プレート内で２回ずつ試験する。
【0092】
免疫染色：
化合物処理の２０～２４時間後、培地をアッセイプレートから除去し、ＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ８５３７、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）中の２５μＬの３．７％ホルムアルデヒド溶液（Ｓｉｇｍａ＃Ｆ１６３５）を各ウェルに添加し、３０分間インキュベートする。次に、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄してから、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ＃Ｔ９２８４）で透過処理する。３０分後、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄してから、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００）を各ウェルに添加し、６０分間インキュベートする。ブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液中のＯ－ＧｌｃＮＡｃタンパク質抗体（ＲＬ２クローン、Ｔｈｅｒｍｏ、ＭＡ１０７２）の０．４０～０．３３μｇ／ｍＬの溶液を細胞に添加し、２～８℃で一晩静置する。翌日、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、ＤＰＢＳ中の２ｕｇ／ｍＬの二次抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ａ１１００１）を各ウェルに添加し、室温で９０分間静置する。二次抗体を除去し、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、ＤＰＢＳ中のＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ９５６４、４’，６－ジアミジノ－２－フェニインドール（ｐｈｅｎｙｉｎｄｏｌｅ）、ジラクテート）およびＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｒ６５１３）のそれぞれ１および５０ｕｇ／ｍＬの濃度の溶液を、各ウェルに添加する。プレートを密封し、１時間インキュベートし、Ａｃｕｍｅｎ ｅＸ３ ｈｃｉ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）で分析する。上記のすべてのインキュベーションおよび洗浄ステップは、一次抗体を除いて、室温で行う。
化合物処理の２０～２４時間後、培地をアッセイプレートから除去し、ＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ８５３７、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）中の２５μＬの３．７％ホルムアルデヒド溶液（Ｓｉｇｍａ＃Ｆ１６３５）を各ウェルに添加し、３０分間インキュベートする。次に、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄してから、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ＃Ｔ９２８４）で透過処理する。３０分後、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄してから、ブロッキング溶液（１％ＢＳＡ／ＤＰＢＳ／０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００）を各ウェルに添加し、６０分間インキュベートする。ブロッキング溶液を除去し、ブロッキング溶液中のＯ－ＧｌｃＮＡｃタンパク質抗体（ＲＬ２クローン、Ｔｈｅｒｍｏ、ＭＡ１０７２）の０．４０～０．３３μｇ／ｍＬの溶液を細胞に添加し、２～８℃で一晩静置する。翌日、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、ＤＰＢＳ中の２ｕｇ／ｍＬの二次抗体であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃Ａ１１００１）を各ウェルに添加し、室温で９０分間静置する。二次抗体を除去し、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、ＤＰＢＳ中のＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ＃Ｄ９５６４、４’，６－ジアミジノ－２－フェニインドール（ｐｈｅｎｙｉｎｄｏｌｅ）、ジラクテート）およびＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｒ６５１３）のそれぞれ１および５０ｕｇ／ｍＬの濃度の溶液を、各ウェルに添加する。プレートを密封し、１時間インキュベートし、Ａｃｕｍｅｎ ｅＸ３ ｈｃｉ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）で分析する。上記のすべてのインキュベーションおよび洗浄ステップは、一次抗体を除いて、室温で行う。
【0093】
分析および結果：
プレートをＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３機器で４８８および４０５ｎｍ励起レーザー、ならびに２つの発光フィルターＦＬ２（５００～５３０ｎｍ）およびＦＬ１（４２０～４９０ｎｍ）を使用して分析する。ＦＬ２フィルターはＯ－ＧｌｃＮＡｃタンパク質抗体（ＲＬ２クローン）に対応するシグナルであり、ＦＬ１フィルターは細胞核（ＤＡＰＩ）に対応するシグナルである。総ＦＬ２／総ＦＬ１（オブジェクトまたは集団を選択しない各ウェルの総蛍光）の比率をデータ分析に使用する。データをチアメットＧの１５μＭ処理によって参照される最大阻害および０．１５％ＤＭＳＯ処理によって達成される最小阻害に正規化する。データを非線形曲線適合アプリケーション（４パラメーターロジスティック方程式）で適合し、ＩＣ５０値を計算および報告する。
プレートをＡｃｕｍｅｎ ｅＸ３機器で４８８および４０５ｎｍ励起レーザー、ならびに２つの発光フィルターＦＬ２（５００～５３０ｎｍ）およびＦＬ１（４２０～４９０ｎｍ）を使用して分析する。ＦＬ２フィルターはＯ－ＧｌｃＮＡｃタンパク質抗体（ＲＬ２クローン）に対応するシグナルであり、ＦＬ１フィルターは細胞核（ＤＡＰＩ）に対応するシグナルである。総ＦＬ２／総ＦＬ１（オブジェクトまたは集団を選択しない各ウェルの総蛍光）の比率をデータ分析に使用する。データをチアメットＧの１５μＭ処理によって参照される最大阻害および０．１５％ＤＭＳＯ処理によって達成される最小阻害に正規化する。データを非線形曲線適合アプリケーション（４パラメーターロジスティック方程式）で適合し、ＩＣ５０値を計算および報告する。
【0094】
実施例１の化合物を本質的に上記のように試験すると、２１．９ｎＭ±７．３（ｎ＝５）のＩＣ５０を示した。このデータは、実施例１の化合物が細胞アッセイにおいてＯＧＡ酵素活性を阻害することを示す。
【0095】
実施例２の化合物もまた本質的に上記のように試験すると、２２．６ｎＭ±７．３（ｎ＝３）のＩＣ５０を示した。この結果は、実施例２の化合物が細胞アッセイにおいてＯＧＡ酵素活性を阻害することを示す。
【0096】
インビボマウス併用試験
以下の実施例は、本発明のＯＧＡ阻害剤と組み合わせた本発明の抗タウ抗体の組み合わせが、ＡＤ、ＰＳＰ、およびＣＢＳなどの異常なタウ凝集を特徴とする疾患を治療するために有用であり得ることを（動物モデルにおいて）検証するための研究をどのように設計できるかを示す。しかしながら、以下の説明は、限定ではなく例証として記載されており、当業者によって様々な修正が行われ得ることを理解されたい。
以下の実施例は、本発明のＯＧＡ阻害剤と組み合わせた本発明の抗タウ抗体の組み合わせが、ＡＤ、ＰＳＰ、およびＣＢＳなどの異常なタウ凝集を特徴とする疾患を治療するために有用であり得ることを（動物モデルにおいて）検証するための研究をどのように設計できるかを示す。しかしながら、以下の説明は、限定ではなく例証として記載されており、当業者によって様々な修正が行われ得ることを理解されたい。
【0097】
本明細書に記載されるような併用療法において、例示的なＯＧＡ阻害剤によるタウの過剰リン酸化および凝集の低減、ならびに例示的な抗タウ抗体のタウ凝集増殖中和の影響を評価するために、タウトランスジェニックマウス（例えば、ＪＮＰＬ３またはＴｇ４５１０）を使用する（あるいは、タウトランスジェニック系統とＡＰＰトランスジェニックマウス系統（例えば、Ｔｇ２５７６、またはＰＤＡＰＰもしくはＡＰＰノックイン）との交配に由来する、タウ／ＡＰＰトランスジェニックマウス系統からの子孫を使用することができる）。本分野で知られているように、本発明のタウ抗体は、Ｔｇ４５１０マウスにおいて免疫原性応答を誘発し、したがって、好ましくは同じ立体配座エピトープを標的とし、実施例１の例示されたタウモノクローナル抗体と比較して同様のレベルの改善された親和性を反映する代理マウスタウ抗体を使用すべきである。マウスは、（ａ）対照抗体（例えば、１５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル、（ｂ）ＯＧＡ阻害剤および対照、（ｃ）抗タウ抗体（例えば、１５ｍｇ／ｋｇ）および対照、ならびに（ｄ）ＯＧＡ阻害剤および抗タウ抗体（例えば、１５ｍｇ／ｋｇ）からなる治療群に分けることができる。抗体は、例えば、週に２回、腹腔内に投与され得る。
【0098】
治療期間に続いて、マウスを犠牲にし、脳および脊髄の組織が収集され得る。タウ骨材の病理は、上記のように、または容積ＭＲＩで評価することができる。この研究は、ＯＧＡ阻害剤と抗タウ抗体の併用療法が、タウの病態（例えば、マウスの海馬）、過剰リン酸化、および凝集の低減、ならびにタウ凝集体の増殖の低減、好ましくは相乗的相互作用をもたらすことを示し得る。
【0099】
インビボ併用試験
以下の実施例は、本発明の抗タウ抗体と組み合わせた本発明のＯＧＡ阻害剤の組み合わせが、ＡＤ、ＰＳＰ、およびＣＢＳなどの異常なタウ凝集を特徴とする疾患を治療するために有用であり得ることを検証するための研究をどのように設計できるかを示す。しかしながら、以下の説明は、限定ではなく例証として記載されており、当業者によって様々な修正が行われ得ることを理解されたい。
以下の実施例は、本発明の抗タウ抗体と組み合わせた本発明のＯＧＡ阻害剤の組み合わせが、ＡＤ、ＰＳＰ、およびＣＢＳなどの異常なタウ凝集を特徴とする疾患を治療するために有用であり得ることを検証するための研究をどのように設計できるかを示す。しかしながら、以下の説明は、限定ではなく例証として記載されており、当業者によって様々な修正が行われ得ることを理解されたい。
【0100】
本明細書に記載されるような併用療法において、例示的なＯＧＡ阻害剤によるタウの過剰リン酸化および凝集の低減、ならびに例示的な抗タウ抗体のタウ凝集増殖中和の影響を評価するために、疾患進行の遅延は、バイオマーカー、ならびに／または検証済みの評価尺度を使用した認知および機能低下評価によって評価することができる。
【0101】
患者は、二重盲検プラセボ群および併用療法群からなる治療群に分けることができる。併用療法群には、有効量の抗タウ抗体と組み合わせて有効量のＯＧＡ阻害剤が投与される。単剤療法群（併用群のＯＧＡ阻害剤と同じ用量のＯＧＡ阻害剤の単剤療法群、および併用療法群の抗タウ抗体と同じ用量の抗タウ抗体の単剤療法群）を、病気の修正に対する各個々の分子の寄与をさらに解明するために含めることができる。さらに、治療群は、前臨床もしくは臨床ＡＤの診断に基づいて、または患者（ＡＤの無症候性ではあるが）がＡＤ疾患を引き起こす遺伝子変異を有するという診断に基づいて特徴付けることができる。例えば、群には、（ａ）無症候性であるがＡＤを引き起こす遺伝子変異陽性、（ｂ）前駆期ＡＤ、（ｃ）軽度ＡＤ、（ｄ）中等度ＡＤ、および（ｅ）重度ＡＤのうちの１つ以上を含めることができる。各治療群は、９ヶ月～１８ヶ月の治療期間の間、それぞれの治療（例えば、抗タウ抗体については月に１回、ＯＧＡ阻害剤については毎日）を受けることができる。
【0102】
治療期間に続いて、ＡＤ神経変性は以下のバイオマーカー評価のうちの１つ以上を通じて評価することができる：（ａ）タウＰＥＴ撮像（ＮＦＴ蓄積の評価）、（ｂ）容積ＭＲＩ（神経解剖学的萎縮の評価）、（ｃ）ＦＤＧ－ＰＥＧ ＰＥＴ撮像（代謝低下の評価）、（ｄ）フロルベタピル灌流ＰＥＴ撮像（代謝低下の評価）、（ｅ）ＣＳＦタウ濃度（神経変性の評価）、および／または（ｆ）ＣＳＦリン酸化タウ濃度（神経変性の評価）。さらに、各治療群の認知および機能低下を評価する１つ以上の検証済みの評価尺度、例えば、ＡＤＡＳ－ｃｏｇ、ＭＭＳＥ、ＣＤＲ－ＳＢ、ＡＤＣＳ－ＡＤＬ、および機能的活動アンケート（ＦＡＱ）が適用され得る。
【0103】
いくつかの実施形態では、ＰＳＰまたはＣＢＳと診断された患者における臨床試験のために、患者は、６ヶ月～１８ヶ月の期間の間治療を受けることができる。神経変性は、以下のバイオマーカー評価のうちの１つ以上を通じて評価することができる：（ａ）ＤＡＴもしくはＡＶ－１３３撮像（ドーパミン作動性システム変性）、（ｂ）容積ＭＲＩ（神経解剖学的萎縮の評価）、（ｃ）ＦＤＧ－ＰＥＧ ＰＥＴ撮像（代謝低下の評価）、および／または（ｄ）ＣＳＦ神経フィラメント軽鎖、神経グラニン、タウ、ｐ－タウ（神経変性の評価）。さらに、各治療群の認知および機能低下を評価する１つ以上の検証済みの評価尺度、例えば、ＰＳＰ－ＲＳ、ＭＭＳＥ、ＳＥＡＤＬ、ＣＧＩ－Ｃ、ＭｏＣＡが適用され得る。
【0104】
この研究は、本発明のＯＧＡ阻害剤と本発明の抗タウ抗体との併用療法が、タウの過剰リン酸化および凝集の低減、ならびにタウ凝集体の増殖の低減をもたらす可能性があることを示し得る。
配列
配列番号１－例示された抗タウ抗体のＬＣ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＶＤＮＲＦＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＳＱＳＴＬＶＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２－例示された抗タウ抗体のＨＣ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＲＧＮＹＶＤＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号３－例示された抗タウ抗体のＬＣＤＲ１
ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨ
配列番号４－例示された抗タウ抗体のＬＣＤＲ２
ＹＫＶＤＮＲＦＳ
配列番号５－例示された抗タウ抗体のＬＣＤＲ３
ＳＱＳＴＬＶＰＬＴ
配列番号６－例示された抗タウ抗体のＨＣＤＲ１
ＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥ
配列番号７－例示された抗タウ抗体のＨＣＤＲ２
ＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧ
配列番号８－例示された抗タウ抗体のＨＣＤＲ３
ＡＲＲＧＮＹＶＤＤ
配列番号９－例示された抗タウ抗体のＬＣＶＲ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＶＤＮＲＦＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＳＱＳＴＬＶＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１０－例示された抗タウ抗体のＨＣＶＲ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＲＧＮＹＶＤＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１１－例示されたＨＣをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）
ｇａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇｔｃｔｇｇａｇｃａｇａｇｇｔｇａａａａａｇｃｃｃｇｇｇｇａｇｔｃｔｃｔｇａａｇａｔｃｔｃｃｔｇｔａａｇｇｇｔｔｃｔｇｇｃｔａｃａｃａｔｔｃａｇｔａａｃｔａｃｔｇｇａｔａｇａｇｔｇｇｇｔｇｃｇｃｃａｇａｔｇｃｃｃｇｇｇａａａｇｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｇｇｇｇｇａｇａｔｔｔｔａｃｃｔｇｇａａｇｔｇａｔａｇｔａｔｔａａｇｔａｃｇａａａａｇａａｔｔｔｃａａｇｇｇｃｃａｇｇｔｃａｃｃａｔｃｔｃａｇｃｃｇａｃａａｇｔｃｃａｔｃａｇｃａｃｃｇｃｃｔａｃｃｔｇｃａｇｔｇｇａｇｃａｇｃｃｔｇａａｇｇｃｃｔｃｇｇａｃａｃｃｇｃｃａｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃｇａｇａａｇｇｇｇｇａａｃｔａｃｇｔｇｇａｃｇａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃｃｔｃａｇｃｔｔｃｔａｃｃａａｇｇｇｃｃｃａｔｃｇｇｔｃｔｔｃｃｃｇｃｔａｇｃｇｃｃｃｔｇｃｔｃｃａｇｇａｇｃａｃｃｔｃｃｇａｇａｇｃａｃａｇｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａｇｇａｃｔａｃｔｔｃｃｃｃｇａａｃｃｇｇｔｇａｃｇｇｔｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃａｇｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃａｃａｃｃｔｔｃｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔａｃａｇｔｃｃｔｃａｇｇａｃｔｃｔａｃｔｃｃｃｔｃａｇｃａｇｃｇｔｇｇｔｇａｃｃｇｔｇｃｃｃｔｃｃａｇｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｃｇａａｇａｃｃｔａｃａｃｃｔｇｃａａｃｇｔａｇａｔｃａｃａａｇｃｃｃａｇｃａａｃａｃｃａａｇｇｔｇｇａｃａａｇａｇａｇｔｔｇａｇｔｃｃａａａｔａｔｇｇｔｃｃｃｃｃａｔｇｃｃｃａｃｃｃｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｇｇｇｇａｃｃａｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｔｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｇｇａａｇａｃｃｃｃｇａｇｇｔｃｃａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｔｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔｔｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｃｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｇｃｃｔｃｃｃｇｔｃｃｔｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａｇｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃａｇｇａｇｇａｇａｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｃｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａａａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａｇｇｃｔａａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｇａｇｇｇｇａａｔｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃａｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇｔ
配列番号１２－例示されたＬＣをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）
ｇａａａｔｔｇｔｇｔｔｇａｃｇｃａｇｔｃｔｃｃａｇｇｃａｃｃｃｔｇｔｃｔｔｔｇｔｃｔｃｃａｇｇｇｇａａａｇａｇｃｃａｃｃｃｔｃｔｃｃｔｇｃａｇａｔｃｔａｇｔｃａｇａｇｃｃｔｔｇｔａｃａｃａｇｔａａｔｃａｇａａｃａｃｃｔａｔｔｔａｃａｔｔｇｇｔａｃｃａｇｃａｇａａａｃｃｔｇｇｃｃａｇｇｃｔｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｔｃａｔｃｔａｔａａａｇｔｔｇａｃａａｃｃｇａｔｔｔｔｃｔｇｇｃａｔｃｃｃａｇａｃａｇｇｔｔｃａｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｃｔｔｃａｃｔｃｔｃａｃｃａｔｃａｇｃａｇａｃｔｇｇａｇｃｃｔｇａａｇａｔｔｔｔｇｃａｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｔｃｔｃａａａｇｔａｃａｃｔｇｇｔｔｃｃｇｃｔｃａｃｇｔｔｃｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃｃａａｇｇｔｇｇａｇａｔｃａａａｃｇｇａｃｃｇｔｇｇｃｔｇｃａｃｃａｔｃｔｇｔｃｔｔｃａｔｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｔｔｇａａａｔｃｔｇｇａａｃｔｇｃｃｔｃｔｇｔｔｇｔｇｔｇｃｃｔｇｃｔｇａａｔａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇａｇａｇｇｃｃａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇａｔａａｃｇｃｃｃｔｃｃａａｔｃｇｇｇｔａａｃｔｃｃｃａｇｇａｇａｇｔｇｔｃａｃａｇａｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｃａｇｃａｃｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｃａｇｃａｃｃｃｔｇａｃｇｃｔｇａｇｃａａａｇｃａｇａｃｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａａｇｔｃｔａｃｇｃｃｔｇｃｇａａｇｔｃａｃｃｃａｔｃａｇｇｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇｃｃｃｇｔｃａｃａａａｇａｇｃｔｔｃａａｃａｇｇｇｇａｇａｇｔｇｃ
配列番号１３－ヒトの完全長タウのアミノ酸配列
ＭＡＥＰＲＱＥＦＥＶＭＥＤＨＡＧＴＹＧＬＧＤＲＫＤＱＧＧＹＴＭＨＱＤＱＥＧＤＴＤＡＧＬＫＥＳＰＬＱＴＰＴＥＤＧＳＥＥＰＧＳＥＴＳＤＡＫＳＴＰＴＡＥＤＶＴＡＰＬＶＤＥＧＡＰＧＫＱＡＡＡＱＰＨＴＥＩＰＥＧＴＴＡＥＥＡＧＩＧＤＴＰＳＬＥＤＥＡＡＧＨＶＴＱＡＲＭＶＳＫＳＫＤＧＴＧＳＤＤＫＫＡＫＧＡＤＧＫＴＫＩＡＴＰＲＧＡＡＰＰＧＱＫＧＱＡＮＡＴＲＩＰＡＫＴＰＰＡＰＫＴＰＰＳＳＧＥＰＰＫＳＧＤＲＳＧＹＳＳＰＧＳＰＧＴＰＧＳＲＳＲＴＰＳＬＰＴＰＰＴＲＥＰＫＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳＳＡＫＳＲＬＱＴＡＰＶＰＭＰＤＬＫＮＶＫＳＫＩＧＳＴＥＮＬＫＨＱＰＧＧＧＫＶＱＩＩＮＫＫＬＤＬＳＮＶＱＳＫＣＧＳＫＤＮＩＫＨＶＰＧＧＧＳＶＱＩＶＹＫＰＶＤＬＳＫＶＴＳＫＣＧＳＬＧＮＩＨＨＫＰＧＧＧＱＶＥＶＫＳＥＫＬＤＦＫＤＲＶＱＳＫＩＧＳＬＤＮＩＴＨＶＰＧＧＧＮＫＫＩＥＴＨＫＬＴＦＲＥＮＡＫＡＫＴＤＨＧＡＥＩＶＹＫＳＰＶＶＳＧＤＴＳＰＲＨＬＳＮＶＳＳＴＧＳＩＤＭＶＤＳＰＱＬＡＴＬＡＤＥＶＳＡＳＬＡＫＱＧＬ
配列
配列番号１－例示された抗タウ抗体のＬＣ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＶＤＮＲＦＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＳＱＳＴＬＶＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２－例示された抗タウ抗体のＨＣ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＲＧＮＹＶＤＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
配列番号３－例示された抗タウ抗体のＬＣＤＲ１
ＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨ
配列番号４－例示された抗タウ抗体のＬＣＤＲ２
ＹＫＶＤＮＲＦＳ
配列番号５－例示された抗タウ抗体のＬＣＤＲ３
ＳＱＳＴＬＶＰＬＴ
配列番号６－例示された抗タウ抗体のＨＣＤＲ１
ＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥ
配列番号７－例示された抗タウ抗体のＨＣＤＲ２
ＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧ
配列番号８－例示された抗タウ抗体のＨＣＤＲ３
ＡＲＲＧＮＹＶＤＤ
配列番号９－例示された抗タウ抗体のＬＣＶＲ
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＮＱＮＴＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＫＶＤＮＲＦＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＳＱＳＴＬＶＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１０－例示された抗タウ抗体のＨＣＶＲ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＳＮＹＷＩＥＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＥＩＬＰＧＳＤＳＩＫＹＥＫＮＦＫＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＲＧＮＹＶＤＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
配列番号１１－例示されたＨＣをコードするヌクレオチド配列（配列番号２）
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配列番号１２－例示されたＬＣをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）
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配列番号１３－ヒトの完全長タウのアミノ酸配列
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【配列表】