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特許7362611非アルコール性脂肪肝疾患及び線維症の治療及び予防のためのペプチド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-06
(45)【発行日】2023-10-17
(54)【発明の名称】非アルコール性脂肪肝疾患及び線維症の治療及び予防のためのペプチド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/47 20060101AFI20231010BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20231010BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20231010BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20231010BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231010BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20231010BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20231010BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20231010BHJP
A61P 9/14 20060101ALI20231010BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231010BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20231010BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20231010BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20231010BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20231010BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20231010BHJP
C07K 7/08 20060101ALN20231010BHJP
A61K 38/04 20060101ALN20231010BHJP
【ＦＩ】
C07K14/47 ZNA
A61K38/17
A61P1/16
A61P3/06
A61P35/00
A61P13/12
A61P9/00
A61P11/00
A61P9/14
A61P25/28
A61P7/00
A61P19/02
A61P1/00
A61P17/00
C07K7/06
C07K7/08
A61K38/04
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2020531610
(86)(22)【出願日】2018-12-14
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-02-22
(86)【国際出願番号】 EP2018085071
(87)【国際公開番号】W WO2019115812
(87)【国際公開日】2019-06-20
【審査請求日】2021-12-01
(31)【優先権主張番号】17306772.9
(32)【優先日】2017-12-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】18305797.5
(32)【優先日】2018-06-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】509228260
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール
(73)【特許権者】
【識別番号】507002516
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ヴァンサン・マリオン
【審査官】野村 英雄
(56)【参考文献】
【文献】特表２００２－５２５３８２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭６４－００２５７２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０３６８５２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１１４０６２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０２０－５２５５０４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペプチド配列が、【化1】
【化2】
【請求項2】
２－（７－オクテニル）アルギニン及び２－（４－ペンテニル）セリンを含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項3】
請求項１又は２に記載のペプチドを含む医薬組成物。
【請求項4】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症からなる群から選択される疾患の治療又は予防において使用するための、請求項１若しくは２に記載のペプチド又は請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記線維症は、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症又は皮膚線維症である、請求項４に記載の使用のためのペプチド又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医療分野に関する。より詳細には、本発明は、肝疾患、特に、肝脂肪化、特に、非アルコール性脂肪性肝炎の治療及び線維症の治療に関する。
【背景技術】
【0002】
肝疾患の他のいかなる病因も不在下での肝細胞中のトリグリセリドの肝蓄積の存在により定義されるＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪肝疾患）は、西洋諸国において慢性肝疾患の最も一般的な原因である。この臨床組織学的表現型は、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）から非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に及び、肝炎及び進行性線維症により特徴付けられ、肝硬変及び末期肝疾患並びに肝細胞癌をもたらす。
【0003】
一般集団におけるＮＡＦＬＤの推定有病率が６～３３％に及ぶ一方、ＮＡＳＨの有病率は３～５％に及ぶにすぎないが、ＮＡＳＨ関連肝硬変は、米国において肝移植についての第２の主な適応症になりつつある。ＮＡＦＬＤのための入院は、２０００年以降９７％だけ増加している。
【0004】
ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを予防するか、又は治療するための現在承認されている薬物は存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
したがって、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び肝脂肪化（脂肪肝）を予防するか、又は治療するための新たな治療が必要である。
【0006】
線維症は、通常、炎症又は他の損傷の結果として線維結合組織が任意の器官に侵入する病理学的病態である。線維症を治療するためのいくつかの化合物が既知であるが、治療が不十分である。したがって、臨床的に有効な線維症を開発する試行は不成功であり、依然として線維症のための治療を見出すことが必要である。
【課題を解決するための手段】
【0007】
驚くべきことに、本発明者らは、脂肪組織中のＦＡＴＰ２（脂肪酸輸送タンパク質２）として一般に既知の溶質キャリアファミリー２７メンバー２（ＳＬＣ２７Ａ２）の発現を特異的に減少させるＰＫＣα及びその誘導体のキナーゼドメインからのペプチドを提供する。本ペプチドは、単一注射の３ヵ月後に肝臓上の脂肪化の現象を減少させ得、特に、肝臓中の脂肪滴のサイズ、肝損傷の２つのバイオマーカー（すなわち、ＡＳＴ及びＡＬＴ）のレベル及び肝重量と体重との比を減少させ得る。更に、本ペプチドは、デノボ脂質合成経路を下方調節し（例えば、ＡＣＣ（アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ）を減少させ）、且つＬＯＸＬ２肝タンパク質含有量及び循環レベルを減少させ、それにより線維症進行を停止させるそれらの能力により示されるとおり、線維症を減少させ得る。インビボでは、肝トリグリセリド含有量及び線維症面積の有意な減少が本ペプチドによる処置について観察され、そのことは抗脂肪化及び抗線維症効果を実証する。
【0008】
したがって、本発明は、ペプチドに関し、
－ ペプチドは、特に、哺乳動物における脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現を減少させ得、
－ ペプチドは、１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを同時に含まず、
－ ペプチドは、ヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用し、及び
－ ペプチドは、ＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）のキナーゼドメインの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２５個の連続残基の断片又はＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）のキナーゼドメインの５～４０個の連続残基からの断片からの配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し、
－ ペプチドは、５～８０個のアミノ酸又は５～６０個のアミノ酸又は５～４０個のアミノ酸の長さを有し、及び
－ ペプチド配列は、ＰＫＣのキナーゼドメインの断片の前記配列内に置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変を含み得る。
－ ペプチドは、特に、哺乳動物における脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現を減少させ得、
－ ペプチドは、１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを同時に含まず、
－ ペプチドは、ヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用し、及び
－ ペプチドは、ＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）のキナーゼドメインの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２５個の連続残基の断片又はＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）のキナーゼドメインの５～４０個の連続残基からの断片からの配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し、
－ ペプチドは、５～８０個のアミノ酸又は５～６０個のアミノ酸又は５～４０個のアミノ酸の長さを有し、及び
－ ペプチド配列は、ＰＫＣのキナーゼドメインの断片の前記配列内に置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変を含み得る。
【0009】
好ましくは、本ペプチドは、ステープリングなどの化学的架橋プロセスにより修飾されている。
【0010】
好ましくは、本ペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有する。
【0011】
好ましくは、本ペプチドは、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの間の相互作用を減少させ得るか、又は予防し得る。
【0012】
任意選択的に、ペプチド配列は、以下の配列の少なくとも１つ：置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号９）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１０）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１１）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＬＭＹＨＩＱＱＶ（配列番号４）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＬＸＹＨＩＱＱＶ（配列番号１２）；ＬＤＮ；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＭＬＡ（配列番号６）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＸＬＡ（配列番号１３）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＭＥ（配列番号７）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＸＥ（配列番号１４）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＸＤＶＲＥ（配列番号１５）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＲＤＶＸＥ（配列番号１６）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＸＤＶＸＥ（配列番号１７）；ＬＤＮ；ＡＦＦ；ＰＤＹ；ＸＤＹ；ＰＥＩＩ（配列番号５）；ＸＥＩＩ（配列番号１８）；ＰＡＫ；ＸＡＫを含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し、Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸である。
【0013】
任意選択的に、ペプチド配列は、以下の配列の少なくとも１つ：置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号９）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１０）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１１）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＬＭＹＨＩＱＱＶ（配列番号４）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＬＸＹＨＩＱＱＶ（配列番号１２）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＭＬＡ（配列番号６）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＸＬＡ（配列番号１３）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＭＥ（配列番号７）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＸＥ（配列番号１４）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＸＤＶＲＥ（配列番号１５）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＲＤＶＸＥ（配列番号１６）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＸＤＶＸＥ（配列番号１７）を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し、Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸である。
【0014】
任意選択的に、ペプチド配列は、以下の配列の少なくとも１つ：
ａ）ＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡＬＬＤＫＸＸＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２０）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｂ）ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＸＸＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２１）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｃ）ＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２２）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｄ）ＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２３）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
及び任意の配列ａ）～ｄ）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２５個の連続残基の任意の断片の配列
を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在する。
ａ）ＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡＬＬＤＫＸＸＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２０）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｂ）ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＸＸＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２１）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｃ）ＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２２）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｄ）ＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２３）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
及び任意の配列ａ）～ｄ）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２５個の連続残基の任意の断片の配列
を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在する。
【0015】
任意選択的に、ペプチド配列は、以下の配列の少なくとも１つ：
を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し、太字であり且つ下線が施されている残基
は、ステープリングを担持し、ステープリングに好適な任意のアミノ酸誘導体であり、及び
Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、
配列は、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する。
【化1】
【化2】
Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、
配列は、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する。
【0016】
好ましくは、前記ＰＫＣは、アルファ－ＰＫＣ（αＰＫＣ）、βＩ及びβＩＩＰＫＣを含むベータ－ＰＫＣ（βＰＫＣ）、デルタ－ＰＫＣ、シータ－ＰＫＣ、エータ－ＰＫＣ及びイプシロン－ＰＫＣからなる群から選択される。より好ましくは、前記ＰＫＣは、配列番号１のαＰＫＣである。
【0017】
特定の実施形態では、ペプチド配列は、
を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し、
は、ステープリングを担持し、好ましくはそれぞれ２－（７－オクテニル）アルギニン及び２－（４－ペンテニル）セリンであり、
配列は、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する。
【化3】
【化4】
配列は、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する。
【0018】
本発明は、本開示によるペプチドを含む医薬組成物にも関する。本発明は、薬物として使用するための本開示によるペプチドにも関する。本発明は更に、薬物の製造のための本開示によるペプチドの使用に関する。
【0019】
本発明は更に、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症からなる群から選択される疾患の治療又は予防において使用するための本開示によるペプチド又はそれを含む医薬組成物に関する。
【0020】
任意選択的に、疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、及び肝脂肪化（脂肪肝）からなる群から選択される。好ましくは、疾患は、肝脂肪化（脂肪肝）又は非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。より好ましくは、疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である。
【0021】
任意選択的に、線維症は、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症又は皮膚線維症である。好ましくは、線維症は、肝線維症である。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1A】重要な脂肪酸輸送体及び受容体の発現レベルに対する脂肪組織標的化ＰＡＴＡＤ処置の効果である。１群当たりｎ＝４匹の動物、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用した。ＦＡＴＰの６つのアイソフォーム（ＦＡＴＰ１～６、ＳＬＣ２７Ａ１～ＳＬＣ２７Ａ６としても既知）が存在する。Ｆａｔｐ１（脂肪酸輸送タンパク質１）、Ｆａｔｐ２（脂肪酸輸送タンパク質２）、Ｆａｔｐ３（脂肪酸輸送タンパク質３）、Ｆａｔｐ４（脂肪酸輸送タンパク質４）、Ｆａｔｐ５（脂肪酸輸送タンパク質５）、Ｆａｔｐ６（脂肪酸輸送タンパク質６）、ＦＦＡＲ１（遊離脂肪酸受容体１）、ＦＦＡＲ２（遊離脂肪酸受容体２）、ＦＦＡＲ３（遊離脂肪酸受容体３）、ＦＦＡＲ４（遊離脂肪酸受容体４）。「低スクランブル」は、ステープル形態と同じアミノ酸残基を有するが、維持されたアルファヘリックス構造がランダムに再配置された２つのペプチドの組み合わせ：スクランブルペプチド配列Ａ及びスクランブルペプチド配列Ｂを指す。「ステープル」は、２つのステープルドペプチドの組み合わせ：ステープルドペプチド配列Ａ及びステープルドペプチド配列Ｂを指す。図１Ａは、ＰＡＴＡＤ注射脂肪組織中のＦＡＴＰ及びＦＦＡＲアイソフォームの発現レベルを示し、ＦＡＴＰ２発現レベルが有意に低減される。
【図2】ＡＤＰＩＦペプチドは、脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現レベルの低減及びＧＬＰ－１循環レベルの増加においてＰＡＴＡＤペプチドよりも活性である。（Ａ）高脂肪／高糖食餌を給餌した４ヵ月齢の雄マウスをこの実験セットに使用した。Ｘ軸上の指示された条件の１１日後の異なるマウスからの脂肪組織中のＦＡＴＰ２の正規化発現レベルである。１群当たりｎ＝４匹の動物、ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用した。（Ｂ）注射１１日後の同じマウス中のＧＬＰ－１の循環濃度であり、ＰＡＴＡＤ及びＡＤＰＩＦはＧＬＰ１循環レベルを低脂肪対照まで再び回復し得、スクランブル注射マウスは減少したＧＬＰ－１濃度を提示したことを示す。
【図3AB】脂肪組織標的化ＰＡＴＡＤ及びＡＤＰＩＦ処置３ヵ月後の肝臓及び循環アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）に対する効果である。（Ａ）１回の単独ＰＡＴＡＤ注射３ヵ月後の対照（左側）及びＰＡＴＡＤ（右側）処置マウスからの固定肝からの冷凍切片の蛍光染色である。（Ｂ）時間（日齢）における肝臓と体重との比をＰＡＴＡＤペプチドについて１群当たりｎ＝１匹の動物についてプロットした。
【図3CD】（Ｃ）指示された処置のマウスの血漿中のＥＬＩＳＡアプローチにより測定されたＡＳＴ及びＡＬＴの両方の平均値である。１群当たりｎ＝４つの試料。ＰＡＴＡＤ及びＡＤＰＩＦは、ＡＳＴ及びＡＬＴの循環レベルの低減において両方とも有効である。ＡＤＰＩＦは、ＡＬＴの循環レベルの低減においてより活性であり、それは肝細胞損傷の改善を意味する。
【図4】ＡＤＰＩＦペプチドは、高血糖症の予防においてＰＡＴＡＤペプチドよりも活性である。（Ａ）０日目におけるＰＡＴＡＤ（ＰＡＴＡＤ ４１７）又はＡＤＰＩＦ（ＣＰＣペプチドＡ－ＭＲＰ）処置の単一注射後の食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）（対照ＨＦＤ）及び対照（対照通常食）の絶食雄における３０分間のグルコースボーラスにおける日数における時点系列である。グルコースボーラスを同時に注射し、それは肝臓を迂回し、血流中に直接向かう。（Ｂ）ＰＡＴＡＤ（ＰＡＴＡＤ ４１７）及びＡＤＰＩＦ（ＰＡＴＡＤ ４１７－ＭＲＰ）ペプチドによる処置前（－５日目）、処置時及び処置後（＋６日目）の曲線下面積の測定による食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）（対照ＨＦＤ）及び対照（対照通常食）の絶食雄における耐糖能に対する効果である。
【図5】ＡＤＰＩＦは、ＤＩＯ雄マウスにおけるリジルオキシダーゼ様２タンパク質（ＬＯＸＬ２）及び脂肪酸結合タンパク質４（ＦＡＢＰ４）の肝タンパク質含有量の減少においてＰＡＴＡＤよりも活性である。（Ａ）ＬＯＸＬ２は、線維症進行についての既知の重要な作用因子である。皮下脂肪組織中のビヒクル、ＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦ注射３ヵ月後の肝抽出物上のＬＯＸＬ２を測定したＥＬＩＳＡ結果。肝タンパク質含有量の有意な減少は、ＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦ処置後のいずれでも観察され、ＡＤＰＩＦが最も有効なペプチドである。１群当たりｎ＝４匹のマウス。（Ｂ）ＦＡＢＰ４は、細胞中の脂質媒介プロセスの重要な作用因子であり、ＮＡＦＬＤに伴って肝臓中で上昇する。本発明者らは、スクランブル又はＰＡＴＡＤ若しくはＡＤＰＩＦ単一注射３ヵ月後のＦＡＢＰ４タンパク質含有量を測定した。ＦＡＢＰ４は、ＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦ注射後のいずれでも有意に低減し、ＡＤＰＩＦはＰＡＴＡＤよりも活性である。
【図6】肝含有量及びプロファイルにおけるセラミドに対するＡＰＤＩＦの効果である。セラミドは、ＮＡＦＬＤに関与することが既知の生物活性脂質のグループである。本発明者らは、皮下脂肪組織中の週１回注射の頻度におけるＡＤＰＩＦの３回注射後のセラミドプロファイルに対するＡＤＰＩＦ注射の効果を測定し、決定した。ＡＤＰＩＦは、全体的に肝セラミド含有量の減少を誘発させ、異なるセラミド間で変動する。
【図7】脂肪組織標的化ＡＤＰＩＦ処置３ヵ月後の肝トリグリセリド含有量に対する効果である。１回の単独ＡＤＰＩＦ注射３ヵ月後の対照（左側）及びＡＤＰＩＦ（右側）処置マウスからの固定肝からの冷凍切片の蛍光染色であり、肝臓中の総トリグリセリドの全体的減少を示す脂肪滴の直径の減少を示す。マウスは、実験終了時において７ヵ月齢のＤＩＯ雄マウスであった。
【図8】ＡＤＰＩＦペプチド処置は、ＤＩＯ雄マウスにおいて１１日後にデノボ脂質合成経路遺伝子を下方調節する。脂肪組織中のＡＤＰＩＦペプチド注射１１日後、脂肪酸シンターゼ（Ｆａｓｎ）、アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｃ）及びステロール調節エレメント結合転写因子１（Ｓｒｅｂｆ１）の肝発現レベルは、対照と比べて有意に減少し、ＡＤＰＩＦ処置マウスの肝臓中のデノボ脂質合成が停止したことを示した。
【図9】ＡＤＰＩＦ処置は、肝臓中の線維症病変を低減させる。（Ａ）皮下脂肪組織中のＡＤＰＩＦ注射３ヵ月後の非処置ＤＩＯ－ＮＡＳＨ及びＡＤＰＩＦ処置ＤＩＯ－ＮＡＳＨの肝臓からの冷凍切片の免疫染色写真である。コラーゲンＩＶ及びＬＯＸＬ２が非処置ＤＩＯ－ＮＡＳＨにおいて高度に発現され、ＡＤＰＩＦ処置ＤＩＯ－ＮＡＳＨにおいて低減される。（Ｂ）ＬＯＸＬ２も分泌されるため、本発明者らは、ＬＯＸＬ２の循環レベルに対するＡＤＰＩＦの効果を測定し、ＡＤＰＩＦ処置（単独注射３ヵ月後）がＬＯＸＬ２レベルを半分だけ低減させることを見出した。（Ｃ）肝切片を透過型電子顕微鏡により分析して非処置ＤＩＯ－ＮＡＳＨの肝臓中の線維化貯留を同定した。このような線維化貯留は、皮下脂肪組織中のＡＤＰＩＦ注射３ヵ月後のＤＩＯ－ＮＡＳＨ処置肝臓中では見出されなかった。
【図10】ＡＤＰＩＦ処置は、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）脂質に影響を与える。リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）は、リゾホスファチジン酸の生成における重要な酵素である線維化促進酵素オートタキシンについての基質である。リゾホスファチジン酸は、肝臓に影響するが、腎臓及び他の軟部組織にも影響する線維症進行における役割を担うことが既知の生物活性脂質である。したがって、本発明者らは、膵臓（Ａ）、脂肪組織（Ｂ）、肝臓（Ｃ）及び血漿（Ｄ）中の異なる（ＬＰＣ）のレベルを測定した。ＡＤＰＩＦ処置（３週間の期間、マウス１匹当たり２５μｇの１回の皮下注射の頻度において与え、次いで、マウスを最後の注射から１週間後に安楽死させた）は、異なる分析組織中のあるＬＰＣの選択的減少を誘発させる。ＬＰＣ １８：２は、膵臓、脂肪組織及び肝臓中の全てでＡＤＰＩＦ処置後に大部分が低減される脂質である。
【図11】ＡＤＰＩＦペプチドは、線維症から腎臓を保護する。ビヒクル処置ＤＩＯ－ＮＡＳＨ及びＡＤＰＩＦ処置ＤＩＯ－ＮＡＳＨの腎臓からの冷凍切片を、コラーゲンＩＶ、ＺＯ－１及び核について免疫染色した。ビヒクル処置ＤＩＯ－ＮＡＳＨにおいて、ＡＤＰＩＦ処置よりも多くのコラーゲンＩＶの貯留が観察される。
【発明を実施するための形態】
【0023】
驚くべきことに、本発明者らは、脂肪組織中のＦＡＴＰ２（脂肪酸輸送タンパク質２）の発現を特異的に減少させるＰＫＣα及びその誘導体のキナーゼドメインからのペプチドを提供する（図１Ａ）。本ペプチドは、単一注射の３ヵ月後に肝臓上の脂肪化の現象を減少させ得、特に、肝臓中の脂肪滴のサイズ、肝損傷の２つのバイオマーカー（すなわち、ＡＳＴ及びＡＬＴ）のレベル及び肝重量と体重との比を減少させ得る（図３）。更に、本ペプチドは、デノボ脂質合成経路を下方調節し（例えば、ＡＣＣ（アセチル－ＣｏＡカルボキシラーゼ）を減少させ）（図８）、且つ肝臓中及び循環中のＬＯＸＬ２タンパク質レベルを減少させ（図５及び９Ａ）、それにより線維症進行を停止させるそれらの能力により示されるとおり、線維症を減少させ得る。本ペプチドは、腎臓中のコラーゲン沈着も減少させ得る。インビボでは、線維症面積の有意な減少が本ペプチドによる処置について観察され、そのことは抗線維症効果を実証する。
【0024】
したがって、本発明は、
－ 本明細書に定義のペプチド、
－ 本明細書に定義のペプチドを含む医薬組成物、
－ 薬物として使用するための本明細書に定義のペプチド又は薬物の製造のための本明細書に定義のペプチドの使用、
－ 非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される疾患の治療又は予防において使用するためのペプチド又はそのペプチドを含む医薬組成物、
－ 非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される疾患を治療又は予防するための医薬品の製造のためのペプチドの使用、
－ 治療有効量のペプチドを投与することを含む、対象における疾患の治療又は予防のための方法であって、疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症を含む血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される方法
に関する。
－ 本明細書に定義のペプチド、
－ 本明細書に定義のペプチドを含む医薬組成物、
－ 薬物として使用するための本明細書に定義のペプチド又は薬物の製造のための本明細書に定義のペプチドの使用、
－ 非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される疾患の治療又は予防において使用するためのペプチド又はそのペプチドを含む医薬組成物、
－ 非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される疾患を治療又は予防するための医薬品の製造のためのペプチドの使用、
－ 治療有効量のペプチドを投与することを含む、対象における疾患の治療又は予防のための方法であって、疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症を含む血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される方法
に関する。
【0025】
定義
ＡＬＭＳ１、アルシュトレーム症候群タンパク質１は、ＡＬＭＳ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＡＬＭＳ１遺伝子中の突然変異は、アルシュトレーム症候群を引き起こすことが判明している。これは、いくつかのデータベース、すなわちＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｎｏ Ｑ８ＴＣＵ４；Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ ７８４０、ＨＧＮＧ ＩＤ Ｎｏ ４２８に記載されている。参照配列は、ｍＲＮＡについてＮＭ＿０１５１２０．４で、タンパク質についてＮＰ＿０５５９３５．４でＧｅｎｂａｎｋに開示されている。
ＡＬＭＳ１、アルシュトレーム症候群タンパク質１は、ＡＬＭＳ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＡＬＭＳ１遺伝子中の突然変異は、アルシュトレーム症候群を引き起こすことが判明している。これは、いくつかのデータベース、すなわちＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｎｏ Ｑ８ＴＣＵ４；Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ ７８４０、ＨＧＮＧ ＩＤ Ｎｏ ４２８に記載されている。参照配列は、ｍＲＮＡについてＮＭ＿０１５１２０．４で、タンパク質についてＮＰ＿０５５９３５．４でＧｅｎｂａｎｋに開示されている。
【0026】
「タンパク質キナーゼＣ」及び「ＰＫＣ」（ＥＣ ２．７．１１．１３）という用語は、他のタンパク質の機能を、これらのタンパク質上のセリン及びスレオニンアミノ酸残基のヒドロキシル基のリン酸化により制御することに関与するタンパク質キナーゼ酵素のファミリーに相当し且つそれらを指す。ＰＫＣは、典型的には、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）又はカルシウムイオン（Ｃａ２＋）の濃度の増加などのシグナルによって活性化される。ＰＫＣは、いくつかのシグナル伝達カスケードで重要な役割を果たす。
【0027】
ＰＫＣファミリーは、ヒトにおいて少なくとも１５個のアイソザイムを含み、これらは、３つの主なサブファミリー、従来型（又は古典型）ＰＫＣ、新型ＰＫＣ及び非典型ＰＫＣに分割される。
【0028】
従来型（ｃ）ＰＫＣは、アイソフォームα、βＩ、βＩＩ及びγを含む。これらのＰＫＣは、活性化のためにＣａ２＋、ＤＡＧ及びホスファチジルセリンなどのリン脂質を必要とする。
【0029】
新型（ｎ）ＰＫＣは、δ、ε、η及びθアイソフォームを含む。これらのＰＫＣは、活性化のためにＤＡＧを必要とするが、Ｃａ２＋を必要としない。
【0030】
非典型（ａ）ＰＫＣは、ζ、ι及びλアイソフォームを含む。これらのＰＫＣは、活性化のためにＣａ２＋もジアシルグリセロールも必要としない。
【0031】
αＰＫＣ、ＰＫＣ－Ａ又はＰＫＣ－アルファとも呼ばれるタンパク質キナーゼＣアルファ型は、カルシウム及び二次メッセンジャーのジアシルグリセロールによって活性化され得るセリン特異的及びスレオニン特異的タンパク質キナーゼのファミリーに属する。これは、いくつかのデータベース、すなわちＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｎｏ Ｐ１７２５２、Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ ９３９３、ＨＧＮＧ ＩＤ Ｎｏ ５５７８に記載されている。参照配列は、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、ｍＲＮＡについてＮＭ＿０２７３７．２で、タンパク質についてＮＰ＿００２７２８．１で開示されている。ヒトαＰＫＣのタンパク質配列は、配列番号１で開示されている。
【0032】
αＰＫＣのキナーゼドメインは、配列番号１に開示され、配列番号２に示される３３９位～５９５位である。
【0033】
「からなる」、「から本質的になる」又は「実質的に含む」：１つ又は複数の要素への言及などの用語を用いる本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書での記述は、特に明記しない限り又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、特定の１つ又は複数の要素「からなる」、「から本質的になる」又はそれを「実質的に含む」本発明の類似の態様又は実施形態に対して支援を与えることを意図している。例えば、特定の配列を含むとされる本明細書に記載のペプチド又はタンパク質は、特に明記しない限り又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、その配列からなるペプチド又はタンパク質も記述しているものとして理解されるべきである。「から本質的になる」とは、ペプチド又はタンパク質がその配列からなるが、それが、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、付加、欠失又はこれらの混合、好ましくは１、２、３、４又は５個の置換、付加、欠失又はこれらの混合も含み得ることを意図している。特に、「～において本質的に存在する」とは、ペプチドが１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の追加のアミノ酸をＮ及び／又はＣ末端で含み得、好ましくは１、２、３、４又は５個の追加のアミノ酸及び／又は１、２又は３個の置換、欠失、付加又はこれらの混合を含み得ることを意図することができる。好ましくは置換、付加、欠失又はこれらの混合の数は、配列の長さに依存する。例えば、置換、欠失、付加又はこれらの混合の割合は、３０％以下、好ましくは２５％以下であり得る。
【0034】
本明細書で使用される場合、「置換」とは、ペプチド配列における単一のアミノ酸の別のアミノ酸による交換を指す。
【0035】
本明細書で使用される場合、「欠失」とは、ペプチド配列における単一のアミノ酸の除去を指す。
【0036】
本明細書で使用される場合、「挿入」又は「付加」とは、ペプチド配列における単一のアミノ酸の付加に相当し且つそれを指す。
【0037】
「置換、付加、欠失」とは、１つのアミノ酸の置換、付加、欠失を意図している。次に、「１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、付加、欠失又はこれらの混合」、「１、２、３、４又は５個の置換、付加、欠失又はこれらの混合」又は「１、２又は３個の置換、欠失、付加又はこれらの混合」を指す場合、それはそれぞれ、「置換、付加、欠失又はこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の改変」、「置換、付加、欠失又はこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変」又は「置換、欠失、付加又はこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変」を意味する。「１、２、３、４又は５個の置換、付加、欠失又はこれらの混合」は、「１～５個の置換、付加、欠失又はこれらの混合」も意味する。「１、２又は３個の置換、付加、欠失又はこれらの混合」は、「１～３個の置換、付加、欠失又はこれらの混合」も意味する。
【0038】
本明細書に開示されるペプチド配列において、アミノ酸は、以下の命名法に従い、それらの１つの文字コードで表される：Ａ：アラニン；Ｃ：システイン；Ｄ：アスパラギン酸；Ｅ：グルタミン酸；Ｆ：フェニルアラニン；Ｇ：グリシン；Ｈ：ヒスチジン；Ｉ：イソロイシン；Ｋ：リジン；Ｌ：ロイシン；Ｍ：メチオニン；Ｎ：アスパラギン；Ｐ：プロリン；Ｑ：グルタミン；Ｒ：アルギニン；Ｓ：セリン；Ｔ：スレオニン；Ｖ：バリン；Ｗ：トリプトファン及びＹ：チロシン。
【0039】
本明細書で使用される場合、「配列同一性」又は「同一性」は、２つのペプチドのアミノ酸とアミノ酸との正確な対応を指す。同一性のパーセントは、配列を整列させ、２つの整列させた配列間の正確な一致数を計数し、より短い配列の長さで割って、結果に１００を乗じることによって２つの分子間の配列情報の直接的な比較によって決定することができる。
【0040】
配列同一性は、２つの配列の長さに応じて、グローバル又はローカルアライメントアルゴリズムを用いる２つのペプチド配列のアライメントによって決定することができる。同様な長さの配列は、長さ全体にわたって配列を最適に整列させるグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を用いて整列させることが好ましい一方、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を用いて整列させることが好ましい。次いで、配列は、これらが少なくとも特定の最小割合の配列同一性を共有するとき（例えば、デフォルトパラメータを用いてプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列されるとき）、「実質的に同一」又は「本質的に同様」と称され得る。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを用いて、２つの配列をそれらの長さ全体（完全長）にわたって整列させ、一致数を最大化し、且つギャップ数を極小化する。グローバルアライメントは、２つの配列が同様な長さを有する場合、配列同一性を決定するために適切に使用される。
【0041】
「増加した」、「増加させる」又は「増強させる」とは、同じ条件下で試験される分子の不在下で測定された測定値と比べるとき、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％だけ増加した測定値を指すことを意図している。「減少した」又は「減少させる」とは、同じ条件下で試験される分子の不在下で測定された測定値と比べるとき、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％だけ減少した測定値を指すことを意図している。
【0042】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」又は「治療すること」という用語は、疾患の治癒、軽減又は遅延など、患者の健康状態を改善することを意図する任意の行為を指す。これは、予防的処置及び治療的処置を含む。例えば、これは、ＮＡＦＬＤからＮＡＳＨへの、ＮＡＳＨから線維症を伴うＮＡＳＨへの、ＮＡＳＨから肝硬変への、ＮＡＳＨ又は肝硬変から肝細胞癌への進化の遅延又は遮断を指し得る。治療という用語は、特に、肝脂肪化の修正、遅延又は低減を明示している。「治療」という用語は、肝脂肪化、肝炎、肝線維症、肝酵素（ＡＳＴ及びＡＬＴなどのアミノトランスフェラーゼ）及び／又は脂肪肝指数（Ｂｅｄｇｎｉ ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００６ Ｎｏｖ ２；６：３３）の改善も明示している。特に、治療は、肝脂肪化、肝炎、肝線維症、肝酵素（ＡＳＴ及びＡＬＴなどのアミノトランスフェラーゼ）及び／又は脂肪肝指数を低下させるか、又は減少させるか、又は遅延させる。線維症に関して、これは、線維症の進化の遅延又は遮断を指し得る。特に、治療という用語は、線維症の修正、遅延又は低減を明示している。
【0043】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝線維症、肝炎、肝硬変又は肝細胞癌を治療するか又はその進行若しくは発症を遅延させる、本開示のペプチドの量又は本開示の医薬組成物の量を指す。これは、線維症を治療するか又は遅延させる、本開示のペプチドの量又は本開示の医薬組成物の量も指し得る。
【0044】
本明細書で使用される場合、「有効成分（ａｃｔｉｖｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」、「活性成分（ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）」及び「医薬品有効成分」という用語は、治療効果を有する医薬組成物の構成成分に相当し且つそれを指す。
【0045】
本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝線維症、肝炎、肝硬変、肝細胞癌又は線維症などの疾患を治療するか又はその進行若しくは発症を遅延させ得る、本開示のペプチドなどの活性成分又は本開示による医薬組成物によって誘発された効果を指す。
【0046】
本明細書で使用される場合、「賦形剤又は薬学的に許容される担体」という用語は、医薬組成物中に存在する有効成分以外の任意の成分を指す。その添加は、特定の一貫性又は他の物理的若しくは味覚的特性を最終生成物に付与することを目的とし得る。賦形剤又は薬学的に許容される担体は、有効成分とのいかなる相互作用、特に化学的相互作用も欠いている必要がある。
【0047】
本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」又は「患者」は、置き換え可能であり、動物、好ましくは哺乳動物、更により好ましくは成人、児童、新生児及び出生前のヒトを含むヒトを指す。
【0048】
本明細書では、「約」という用語は、所定値の±１０％の値の範囲を指す。例えば、「約５０」は、５０の±１０％の値、すなわち４５～５５の範囲にある値を含む。好ましくは、「約」という用語は、所定値の±５％の値の範囲を指す。
【0049】
本明細書で使用される場合、「非アルコール性脂肪肝疾患」及び「ＮＡＦＬＤ」は、１日当たり２０ｇ未満のアルコール摂取の存在下での大血管脂肪化の存在により定義される疾患を指す。ＮＡＦＬＤは、米国において最も一般的な肝疾患であり、一般にインスリン耐性／２型真性糖尿病及び肥満症に関連する。ＮＡＦＬＤは、脂肪化、脂肪性肝炎、肝硬変及び場合により肝細胞癌により顕在化される。ＮＡＦＬＤの概要については、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＴｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｄａｌｐｉａｚ（２００７）Ｔｈｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｒｉｓｋ．Ｍａｎａｇ．，３（６）：１１５３－１１６３参照。
【0050】
本明細書で使用される場合、「脂肪化」、「肝脂肪化」、及び「脂肪肝」という用語は、肝細胞中のトリグリセリド及び他の脂肪の蓄積を指す。
【0051】
本明細書で使用される場合、「非アルコール性脂肪性肝炎」又は「ＮＡＳＨ」という用語は、肝臓中の脂肪の蓄積により引き起こされる肝炎及び損傷を指す。ＮＡＳＨは、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と呼ばれる病態のグループの一部である。ＮＡＳＨは、アルコール性肝疾患と似ているが、アルコールをほとんど飲まないか、又は全く飲まない人々において生じる。ＮＡＳＨの主な特徴は肝臓中の脂肪であり、炎症及び損傷を伴う。ＮＡＳＨを有するほとんどの人々は体調が良く、肝臓の問題を抱えていることに気付かない。これにもかかわらず、ＮＡＳＨは重度であり得、肝臓が永久的に損傷され、瘢痕化され、もはや適切に機能し得ない肝硬変をもたらし得る。ＮＡＳＨは、通常、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）又はアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）などの定型的な血液検査パネルに含まれる肝臓検査における上昇を有することが見出された人々において最初に疑われる。更なる評価が肝疾患についての明らかな理由（例えば、医薬品、ウイルス性肝炎又はアルコールの過剰摂取）を示さない場合、及び肝臓のｘ線又は撮像試験が脂肪を示す場合、ＮＡＳＨが疑われる。ＮＡＳＨの診断を証明し、それを単なる脂肪肝から区別する唯一の手段は、肝生検である。
【0052】
本明細書で使用される場合、組織学的に定義される「肝硬変」という用語は、線維症及び正常の肝臓構造の構造的に異常な結節への変換により特徴付けられるびまん性肝臓プロセスである。
【0053】
ＮＡＦＬＤは、ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）によりＮＡＳＨと区別することができ、それは、脂肪化（０～３）、小葉炎症（０～２）、及び肝細胞バルーニング（０～２）についての肝生検の組織病理学的スコアの合計である。＜３のＮＡＳはＮＡＦＬＤに対応し、３～４は境界型ＮＡＳＨに対応し、＞５はＮＡＳＨに対応する。生検は、線維症（０～４）についてもスコアリングされる。
【0054】
ペプチド
本開示によるペプチドは、以下の特徴を提示する：
－ これが１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを同時に含まないこと、
－ 好ましくは、これがヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用すること、
－ これがＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）のキナーゼドメインの断片、好ましくはＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）のキナーゼドメインの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２５個の連続残基の断片からの配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在すること、及び
－ ペプチド配列がＰＫＣのキナーゼドメインの断片の前記配列内に置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択される１、２、３、４又は５個のアミノ酸改変を含み得ること。
本開示によるペプチドは、以下の特徴を提示する：
－ これが１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを同時に含まないこと、
－ 好ましくは、これがヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用すること、
－ これがＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）のキナーゼドメインの断片、好ましくはＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）のキナーゼドメインの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２５個の連続残基の断片からの配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在すること、及び
－ ペプチド配列がＰＫＣのキナーゼドメインの断片の前記配列内に置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択される１、２、３、４又は５個のアミノ酸改変を含み得ること。
【0055】
本ペプチドは、以下の特徴の１つ又はいくつかを更に提示し得る：
－ これが８０個未満のアミノ酸、より好ましくは６０個未満のアミノ酸、いっそう好ましくは４０個未満のアミノ酸、いっそうより好ましくは３０個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これが少なくとも５個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これが架橋により修飾されていること、
－ これがＡＬＭＳ１－ＰＫＣ相互作用を妨害し得、特に、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの間の相互作用を減少させ得るか、若しくは防止し得；又はこれがＡＬＭＳ１－ＰＫＣ相互作用を妨害し得ず、特に、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの間の相互作用を減少させ得ないか、若しくは防止し得ないこと、
－ これが脂肪組織中のＦＡＴＰ発現の発現レベルを改変し、好ましくはこれが脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現を減少させること、
－ これが肝脂肪化、肝臓中の脂肪の量、肝臓中の脂肪滴のサイズ、及び／又は脂肪肝指数を減少させること、
－ これが脂肪細胞中のヘムオキシゲナーゼ１の発現レベルを誘発させること。
－ これが８０個未満のアミノ酸、より好ましくは６０個未満のアミノ酸、いっそう好ましくは４０個未満のアミノ酸、いっそうより好ましくは３０個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これが少なくとも５個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これが架橋により修飾されていること、
－ これがＡＬＭＳ１－ＰＫＣ相互作用を妨害し得、特に、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの間の相互作用を減少させ得るか、若しくは防止し得；又はこれがＡＬＭＳ１－ＰＫＣ相互作用を妨害し得ず、特に、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの間の相互作用を減少させ得ないか、若しくは防止し得ないこと、
－ これが脂肪組織中のＦＡＴＰ発現の発現レベルを改変し、好ましくはこれが脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現を減少させること、
－ これが肝脂肪化、肝臓中の脂肪の量、肝臓中の脂肪滴のサイズ、及び／又は脂肪肝指数を減少させること、
－ これが脂肪細胞中のヘムオキシゲナーゼ１の発現レベルを誘発させること。
【0056】
本ペプチドは、以下の特徴の１つ又はいくつかを更に提示し得る：
－ これが８０個未満のアミノ酸、より好ましくは６０個未満のアミノ酸、いっそう好ましくは４０個未満のアミノ酸、いっそうより好ましくは３０個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これが少なくとも５個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これが架橋により修飾されていること、
－ これがＡＬＭＳ１－ＰＫＣ相互作用を妨害し得ず、特に、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの間の相互作用を減少させ得ないか、又は防止し得ないこと、
－ これがコラーゲンＩＶ及びＬＯＸＬ２（リジルオキシダーゼホモログ２）の発現の発現レベルを改変し、優先的には、これがコラーゲンＩＶ及びＬＯＸＬ２の発現、特に、肝臓及び／又は血漿中のＬＯＸＬ２発現を減少させること、
－ これが線維症を減少させること、
－ これが組織中及び循環中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の脂質含有量、優先的には、１８：２ ＬＰＣを減少させ得ること。
－ これが８０個未満のアミノ酸、より好ましくは６０個未満のアミノ酸、いっそう好ましくは４０個未満のアミノ酸、いっそうより好ましくは３０個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これが少なくとも５個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも５個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これが架橋により修飾されていること、
－ これがＡＬＭＳ１－ＰＫＣ相互作用を妨害し得ず、特に、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの間の相互作用を減少させ得ないか、又は防止し得ないこと、
－ これがコラーゲンＩＶ及びＬＯＸＬ２（リジルオキシダーゼホモログ２）の発現の発現レベルを改変し、優先的には、これがコラーゲンＩＶ及びＬＯＸＬ２の発現、特に、肝臓及び／又は血漿中のＬＯＸＬ２発現を減少させること、
－ これが線維症を減少させること、
－ これが組織中及び循環中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の脂質含有量、優先的には、１８：２ ＬＰＣを減少させ得ること。
【0057】
一態様では、本開示のペプチドは、ＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）のキナーゼドメインの断片からの配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在する。ＰＫＣは、従来型ＰＫＣ、新型ＰＫＣ及び非典型ＰＫＣから選択することができる。特に、ＰＫＣは、従来型ＰＫＣから選択することができる。好ましくは、ＰＫＣは、α、βＩ、βＩＩ及びγＰＫＣからなる群から選択することができる。より好ましくは、ＰＫＣは、α、βＩ及びβＩＩＰＫＣからなる群から選択することができる。いっそうより好ましくは、ＰＫＣは、αＰＫＣ、好ましくはヒトαＰＫＣ、より好ましくは配列番号１のヒトαＰＫＣである。ヒトαＰＫＣのキナーゼドメインは、配列番号２に開示されている。
【0058】
ＰＫＣのキナーゼドメインの断片は、ＰＫＣのキナーゼドメインの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２５個の連続残基を有する。一態様では、ＰＫＣのキナーゼドメインの断片は、ＰＫＣのキナーゼドメインの５～４０個の連続残基（任意選択的に、５～３０個又は５～２５個又は７～２５個又は８～２５個又は９～２５個又は１０～２５個又は１１～２５個又は１２～２５個）を有する。
【0059】
断片が選択されるＰＫＣのキナーゼドメインは、好ましくは配列番号２の配列と少なくとも４０％の同一性、より好ましくは配列番号２の配列と少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０又は９５％の同一性を有する。
【0060】
好ましくは、ＰＫＣのキナーゼドメインの断片の前記配列は、本ペプチドの配列の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％に対応する。特定の実施形態では、本開示によるペプチド配列は、配列番号１の断片の配列において存在する。
【0061】
ＰＫＣのキナーゼドメインの断片が１つのメチオニン及び／又は１つのプロリン及び／又は１つのアルギニンを含む場合、配列は、全てのプロリン残基及び／又は全てのメチオニン残基及び／又は全てのアルギニン残基を除去するように改変することができる（すなわち、置換を導入することによる）。例えば、配列は、全てのプロリン残基を除去するように改変することができる（すなわち、置換を導入することによる）。或いは、配列は、全てのメチオニン残基を除去するように改変することができる（すなわち、置換を導入することによる）。そうでなければ、配列は、全てのアルギニン残基を除去するように改変することができる（すなわち、置換を導入することによる）。一態様では、配列は、全てのプロリン及びメチオニン残基を除去するように改変することができる（すなわち、置換を導入することによる）。別の態様では、配列は、全てのプロリン及びアルギニン残基を除去するように改変することができる（すなわち、置換を導入することによる）。追加の態様では、配列は、全てのメチオニン及びアルギニン残基を除去するように改変することができる（すなわち、置換を導入することによる）。より好ましくは、配列は、全てのプロリン残基、全てのメチオニン残基及び全てのアルギニン残基を除去するように改変することができる（すなわち、置換を導入することによる）。
【0062】
好ましくは、本ペプチドは、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択される２０個以下、好ましくは１５個以下、より好ましくは１０個以下のアミノ酸改変を含む。特に好ましい実施形態では、本ペプチドは、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個、好ましくは１、２、３、４又は５個、より好ましくは１、２又は３個のアミノ酸改変を含み得る。
【0063】
例えば、本ペプチドは、キナーゼドメインＰＫＣの断片の配列、好ましくは配列番号２の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の同一性を有する。一実施形態では、配列番号２に対応するペプチドの配列の一部は、配列番号２の断片の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の同一性を有する。
【0064】
例えば、ＰＫＣのキナーゼドメインの断片の配列は、配列番号１の３３９～４３２位、配列番号１の４３４～５４４位、配列番号１の５４６～５６１位、配列番号１の５６３～５６５位又は配列番号１の５６８～５９５位の配列に属し得る。
【0065】
一実施形態では、ＰＫＣのキナーゼドメインの断片の配列は、以下の残基：配列番号１のＧ４３３、Ｅ５４５、Ｓ５６２、Ｓ５６６を含み得ない。
【0066】
一態様では、本開示のペプチドは、アルファヘリックス構造を有する。本明細書で使用される場合、「アルファヘリックス」、「α－ヘリックス」、「古典型ポーリング－コリー－ブランソンα－ヘリックス」及び「３．６１３－ヘリックス」は、互いに同等であり且つ互いを指す。「アルファヘリックス」という用語は、全ての骨格Ｎ－Ｈ基が、水素結合を、タンパク質配列に沿って３～４個の残基前に位置するアミノ酸の骨格Ｃ＝Ｏ基に提供する、右巻き又はらせん構造（ヘリックス）である、タンパク質の二次構造における共通モチーフを指す。アルファヘリックスは、約３．６個の残基の１ヘリックスターン当たりの残基の平均数を有し、１３個の原子が水素結合によって形成された環に含まれる。
【0067】
特定の実施形態では、本開示のペプチドは、アルファヘリックス構造を有し、且つ／又はアルファヘリックス構造と予測される配列を有する。ペプチドの構造を決定するための方法、例えば円二色性又はＮＭＲは、当業者に周知である。同様に、ペプチドのアルファヘリックス構造を予測するための方法も当業者に周知であり、例えばＳＴＲＩＤＥ（Ｆｒｉｓｈｍａｎ Ｄ．，Ａｒｇｏｓ Ｐ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｖｏｌ．２３，ｎｏ ４、１９９５，ｐ．５６６－５７９）；ＤＥＦＩＮＥ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｆ．Ｍ．，Ｋｕｎｄｒｏｔ Ｃ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｖｏｌ．３，ｎｏ ２，１９８８，ｐ．７１－８４）；ＤＳＳＰ（Ｔｏｕｗ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１５；４３：Ｄ３６４－Ｄ３６８；Ｋａｂｓｃｈ＆Ｓａｎｄｅｒ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．１９８３，２２，２５７７－２６３７）である。
【0068】
アルファヘリックスは、以下の位置においてキナーゼドメイン中に位置する：配列番号１の３７２～３７７；３８１～３９２；４２５～４３２；４３７～４５６；４６６～４６８；５０２～５０４；５０７～５１０；５１８～５３３；５４３～５５２；５６３～５７２；５７７～５７９；５８７～５９３及び５９５～５９７。
【0069】
したがって、本ペプチドは、以下の配列：
－ ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）、
－ ＬＭＹＨＩＱＱＶ（配列番号４）、
－ ＬＤＮ、
－ ＰＤＹ、
－ ＰＥＩＩ（配列番号５）、
－ ＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＭＬＡ（配列番号６）、
－ ＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＭＥ（配列番号７）、
－ ＰＡＫ、
－ ＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）、
－ ＡＦＦ
の少なくとも１つを含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得る。
－ ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）、
－ ＬＭＹＨＩＱＱＶ（配列番号４）、
－ ＬＤＮ、
－ ＰＤＹ、
－ ＰＥＩＩ（配列番号５）、
－ ＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＭＬＡ（配列番号６）、
－ ＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＭＥ（配列番号７）、
－ ＰＡＫ、
－ ＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）、
－ ＡＦＦ
の少なくとも１つを含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得る。
【0070】
特定の実施形態では、本ペプチドは、以下の配列：
－ ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）、及び
－ ＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）
の少なくとも１つを含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得る。
－ ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）、及び
－ ＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）
の少なくとも１つを含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得る。
【0071】
任意選択的に、本ペプチドは、以下の配列の少なくとも１つ：ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）；ＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号９）；ＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１０）；ＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１１）；ＬＭＹＨＩＱＱＶ（配列番号４）；ＬＸＹＨＩＱＱＶ（配列番号１２）；ＬＤＮ；ＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＭＬＡ（配列番号６）；ＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＸＬＡ（配列番号１３）；ＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＭＥ（配列番号７）；ＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＸＥ（配列番号１４）；ＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）；ＧＥＸＤＶＲＥ（配列番号１５）；ＧＥＲＤＶＸＥ（配列番号１６）；ＧＥＸＤＶＸＥ（配列番号１７）；ＬＤＮ；ＡＦＦ；ＰＤＹ；ＸＤＹ；ＰＥＩＩ（配列番号５）；ＸＥＩＩ（配列番号１８）；ＰＡＫ；ＸＡＫを含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得、Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸である。好ましくは、Ｘは、α－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸である。例えば、Ｘは、Ｘは、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択することができる。一態様では、本ペプチドは、以下の配列の少なくとも１つ：ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）；ＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号９）；ＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１０）；ＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１１）；ＬＭＹＨＩＱＱＶ（配列番号４）；ＬＸＹＨＩＱＱＶ（配列番号１２）；ＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＭＬＡ（配列番号６）；ＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＸＬＡ（配列番号１３）；ＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＭＥ（配列番号７）；ＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＸＥ（配列番号１４）；ＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）；ＧＥＸＤＶＲＥ（配列番号１５）；ＧＥＲＤＶＸＥ（配列番号１６）；ＧＥＸＤＶＸＥ（配列番号１７）を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得、Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸である。特に、本ペプチドは、以下の配列の少なくとも１つ：ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）；ＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号９）；ＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１０）；ＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１１）；ＬＸＹＨＩＱＱＶ（配列番号１２）；ＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＸＬＡ（配列番号１３）；ＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＸＥ（配列番号１４）；ＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）；ＧＥＸＤＶＲＥ（配列番号１５）；ＧＥＲＤＶＸＥ（配列番号１６）；ＧＥＸＤＶＸＥ（配列番号１７）を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得、Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸である。例えば、本ペプチドは、以下の配列の少なくとも１つ：ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ又はＶＥＣＴＴＶＥＫＥＶＬＡ（配列番号１９）を含み得る。
【0072】
任意選択的に、本ペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の置換、欠失、付加又はこれらの混合、好ましくは１、２、３、４又は５個の置換、欠失、付加又はこれらの混合、より好ましくは１、２又は３個の置換を含む。
【0073】
任意選択的に、本ペプチドは、以下の配列の少なくとも１つ：置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変から選択されるアミノ酸の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号９）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１０）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１１）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＬＭＹＨＩＱＱＶ（配列番号４）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＬＸＹＨＩＱＱＶ（配列番号１２）；ＬＤＮ；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＭＬＡ（配列番号６）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＸＬＡ（配列番号１３）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＭＥ（配列番号７）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＸＥ（配列番号１４）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＸＤＶＲＥ（配列番号１５）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＲＤＶＸＥ（配列番号１６）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＸＤＶＸＥ（配列番号１７）；ＬＤＮ；ＡＦＦ；ＰＤＹ；ＸＤＹ；ＰＥＩＩ（配列番号５）；ＸＥＩＩ（配列番号１８）；ＰＡＫ；ＸＡＫを含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得、Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸である。好ましくは、Ｘは、α－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸である。例えば、Ｘは、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択することができる。
【0074】
一態様では、本ペプチドは、以下の配列の少なくとも１つ：置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変から選択されるアミノ酸の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号９）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１０）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１１）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＬＭＹＨＩＱＱＶ（配列番号４）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＬＸＹＨＩＱＱＶ（配列番号１２）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＭＬＡ（配列番号６）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＳＶＤＷＷＡＹＧＶＬＬＹＥＸＬＡ（配列番号１３）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＭＥ（配列番号７）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＥＤＥＤＥＬＦＱＳＩＸＥ（配列番号１４）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＸＤＶＲＥ（配列番号１５）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＲＤＶＸＥ（配列番号１６）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＸＤＶＸＥ（配列番号１７）を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得、Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸である。好ましくは、Ｘは、α－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸である。例えば、Ｘは、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択することができる。
【0075】
特に、本ペプチドは、以下の配列の少なくとも１つ：置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号３）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変から選択されるアミノ酸の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡ（配列番号９）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１０）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡ（配列番号１１）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＲＤＶＲＥ（配列番号８）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＸＤＶＲＥ（配列番号１５）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＲＤＶＸＥ（配列番号１６）；置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有するＧＥＸＤＶＸＥ（配列番号１７）を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得、Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸である。好ましくは、Ｘは、α－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸である。例えば、Ｘは、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択することができる。
【0076】
例えば、本ペプチドは、以下の配列の少なくとも１つ：ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡ又はＶＥＣＴＴＶＥＫＥＶＬＡ（配列番号１９）を含み得る。
【0077】
一態様では、本ペプチドは、以下の配列の少なくとも１つ：
ａ）ＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡＬＬＤＫＸＸＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２０）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｂ）ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＸＸＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２１）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｃ）ＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２２）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｄ）ＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２３）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
及び任意の配列ａ）～ｄ）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２５個の連続残基の任意の断片の配列
を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得る。
ａ）ＶＥＣＴＸＶＥＫＸＶＬＡＬＬＤＫＸＸＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２０）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｂ）ＶＥＣＴＭＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＸＸＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２１）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｃ）ＶＥＣＴＸＶＥＫＲＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２２）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
ｄ）ＶＥＣＴＭＶＥＫＸＶＬＡＬＬＤＫＰＰＦＬＴＱＬＨＳ（配列番号２３）（Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する）、
及び任意の配列ａ）～ｄ）の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２５個の連続残基の任意の断片の配列
を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得る。
【0078】
別の特定の実施形態では、本開示によるペプチドは、それをアルファヘリックス構造で維持するために設計又は修飾される。当該技術分野において既知であるように、これは、生物学的効果に重要ではないアミノ酸の置換によるアミノ酸の修飾、非天然アミノ酸の使用、ペプチド環化及びペプチド骨格への修飾若しくはペプチド鎖のアミノ酸間の化学結合の付加を含む様々な方法を介して達成することができる。このような修飾は、例えば、それらの熱安定性及びプロテアーゼ安定性を増大させるために行うことができる。
【0079】
特に、本開示のペプチドは、化学的架橋によって修飾される。例えば、本ペプチドは、ステープルドペプチドである。一実施形態では、本開示のペプチドは、ステープル化されている。「ステープルドペプチド」又は「ステッチドペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド二次構造が、ペプチド中の隣接するα－ヘリックスのターンを接続する１つ以上の人工的な分子架橋（ブリッジ）で安定化されている、人工的に修飾されたペプチドを指す。ステープルドペプチドを調製するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えばその開示が参照により本明細書に組み込まれるＶｅｒｄｉｎｅ＆Ｈｉｌｉｎｓｋｉ（２０１２，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，５０３，３－３３）、国際公開第１００３３６１７号パンフレット及び国際公開第１００１１３１３号パンフレットに記載されている。
【0080】
一実施形態では、本開示のステープルドペプチドの架橋は、ｉ＋３、及び／又はｉ＋４、及び／又はｉ＋７架橋である。ペプチドにおいて、「ｉ＋３架橋」は、アミノ酸、「ｉ」アミノ酸と、ｉアミノ酸から３個のアミノ酸残基の距離で存在する別のアミノ酸との間の架橋である。ペプチドにおいて、「ｉ＋４架橋」は、アミノ酸、「ｉ」アミノ酸と、ｉアミノ酸から４個のアミノ酸残基の距離で存在する別のアミノ酸との間の架橋である。ペプチドにおいて、「ｉ＋７架橋」は、アミノ酸、「ｉ」アミノ酸と、ｉアミノ酸から７個のアミノ酸残基の距離で存在する別のアミノ酸との間の架橋である。
【0081】
最短配列、特に、３～４個の残基を含むものについて、架橋は、ｉ＋３及びｉ＋４であり、それは、この配列の外側の残基間に導入される。配列が十分長い場合、ｉ＋７の架橋が好ましい。
【0082】
ある特定のペプチドに関するこの態様を説明するため、本ペプチドは、以下の配列の少なくとも１つ：
を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在し得、太字であり且つ下線が施されている残基
は、ステープリングを担持し、ステープリングに好適な任意のアミノ酸誘導体であり、及び
Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、及び
配列は、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する。
【化5】
【化6】
Ｘは、Ｍ、Ｐ及びＲを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはα－ヘリックス二次構造に好ましいアミノ酸であり、より好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹ、いっそうより好ましくはＡ、Ｄ、Ｎ、Ｇ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｌ、Ｋ、Ｆ、Ｓ、Ｗ及びＹからなる群から選択され、及び
配列は、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する。
【0083】
例えば、ｉ＋７ステープリングに関して、第１の
は、２－（７－オクテニル）アミノ酸（例えば、２－（７－オクテニル）アラニン又は２－（７－オクテニル）アルギニン）であり、且つ第２の
は、２－（４－ペンテニル）アミノ酸（例えば、２－（４－ペンテニル）アラニン又は２－（４－ペンテニル）セリン）である。具体的な組み合わせは、２－（７－オクテニル）アラニン及び２－（４－ペンテニル）アラニン；２－（７－オクテニル）アラニン及び２－（４－ペンテニル）セリン；２－（７－オクテニル）アルギニン及び２－（４－ペンテニル）アラニン；又は２－（７－オクテニル）アルギニン及び２－（４－ペンテニル）セリンであり得る。
【化7】
【化8】
【0084】
特定の実施形態では、本ペプチドは、
であり得、
は、ステープリングを担持し、好ましくはそれぞれ２－（７－オクテニル）アルギニン及び２－（４－ペンテニル）セリンであり、
配列は、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する。
【化9】
【化10】
配列は、置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２、３、４又は５個の改変、より好ましくは置換、欠失、付加及びこれらの混合から選択されるアミノ酸の１、２又は３個の改変を任意選択的に有する。
【0085】
特定の実施形態では、本開示によるペプチドは、環式ペプチドである。本明細書で使用される場合、「環式ペプチド」又は「環状ペプチド」は、Ｎ末端及びＣ末端、又はＮ末端及び別のアミノ酸の側鎖、好ましくはＣ末端アミノ酸、又はＣ末端及び別のアミノ酸の側鎖、好ましくはＮ末端アミノ酸、あるアミノ酸の側鎖及び別のアミノ酸の側鎖、好ましくはＮ末端アミノ酸及びＣ末端アミノ酸が共有結合で連結され、環構造を生成するペプチドに相当し且つそれを指す。本明細書で使用される場合、「Ｎ末端」、「アミノ末端」、「ＮＨ２末端」、「Ｎ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ）」及び「アミン末端」という用語は、ペプチドの最初のアミノ酸に存在する遊離アミノ基（－ＮＨ２）に相当し且つそれを指す。本明細書で使用される場合、「Ｃ末端」、「カルボキシル末端」、「カルボキシ末端」、「Ｃ末端（Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ）」及び「ＣＯＯＨ末端」という用語は、ペプチドの最後のアミノ酸に存在する遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）に相当し且つそれを指す。
【0086】
一実施形態では、本開示によるペプチドは、８０個未満のアミノ酸、より好ましくは６０個未満のアミノ酸、なお好ましくは４０個未満のアミノ酸及び更により好ましくは３０個未満のアミノ酸の長さを有する。特定の実施形態では、本開示によるペプチドは、２５個未満のアミノ酸の長さを有する。別の特定の実施形態では、２０個未満のアミノ酸、より好ましくは１５個未満のアミノ酸の長さを有する。好ましくは、本ペプチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個を超えるアミノ酸の最小長さを有する。例えば、本ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも６個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有する。
【0087】
一実施形態では、本開示によるペプチドは、ＡＬＭＳ１－ＰＫＣ相互作用を妨害し得、特に、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの間の相互作用を減少させ得るか、又は防止し得る。換言すると、本開示によるペプチドは、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの間の相互作用を遮断し得る。或いは、本開示によるペプチドは、ＡＬＭＳ１－ＰＫＣ相互作用を妨害し得ず、特に、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの間の相互作用を減少させ得ないか、又は防止し得ない。換言すると、本開示によるペプチドは、ＡＬＭＳ１とαＰＫＣとの間の相互作用を遮断し得ない。
【0088】
αＰＫＣのＡＬＭＳ１への結合に対するペプチドの効果を決定するため、当業者により既知の任意の技術、特にタンパク質相互作用を決定するのに好適な任意の方法を実行することができる。例えば、組換え又は精製されたネイティブＡＬＭＳ１又はαＰＫＣを、表面プラズモン共鳴チップ及びチップの上を流れる他の分子に結合させて、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ，ＵＳＡ）機において結合親和性を評価することができる。
【0089】
αＰＫＣのＡＬＭＳ１への結合に対するペプチドの効果は、試験ペプチドの不在下及び存在下でのαＰＫＣのＡＬＭＳ１への結合を測定することにより、且つαＰＫＣのＡＬＭＳ１への結合を比較することにより決定される。
【0090】
特に、ＡＬＭＳ１を釣り餌（ｂａｉｔ）として使用する免疫沈降アッセイを実行することができる。このアッセイは、インスリンの不在下で及び／又は存在下、好ましくはインスリンの不在下で培養した細胞、特に脂肪細胞を用いて実行することができる。試験されるペプチドを培養基中に添加する。次いで、αＰＫＣを免疫検出する。
【0091】
「減少した」、「減少させる」又は「防止する」とは、同じ条件下で試験される分子の不在下で測定された結合値と比べるとき、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％だけ減少した結合値を指すことを意図している。
【0092】
一実施形態では、本開示によるペプチドは、脂肪細胞中のＦＡＴＰ２の発現を減少させ得る。
【0093】
ＦＡＴＰ２は、溶質キャリアファミリー２７メンバー２（ＳＬＣ２７Ａ２）とも呼ばれる。このタンパク質は、データベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢにＯ１４９７５のもと開示されている。遺伝子は、ＵｎｉＧｅｎｅデータベースにＨｓ．１１７２９のもと記載されている。参照の配列は、ＮＣＢＩにおいてアイソフォーム１についてはＮＰ＿００３６３６．２及びＮＭ＿００３６４５．３のもと並びにアイソフォーム２についてはＮＰ＿００１１５３１０１．１及びＮＭ＿００１１５９６２９．１のもと見出すことができる。
【0094】
「減少した」又は「減少させる」とは、同じ条件下でペプチドの不在下で測定された発現値と比べるとき、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％だけ減少した発現値を指すことを意図している。発現は、タンパク質レベル（例えば、抗体を用いて）又はｍＲＮＡレベルのいずれかにおいて測定することができる。
【0095】
発現は、免疫組織化学、半定量的ウエスタンブロットなどの任意の利用可能な方法により、又はタンパク質若しくは抗体アレイによりタンパク質レベルにおいて測定することができる。ＦＡＴＰ２に指向される抗体は、例えば、Ｏｒｉｇｅｎｅから参照番号ＴＡ３５０４２４若しくはＴＡ３３３９９０；又はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから参照番号ｓｃ－３９３９０６で市販されている。
【0096】
発現は、任意の利用可能な方法によりｍＲＮＡレベルにおいても測定することもできる。好ましくはＦＡＴＰ２の発現レベルは、定量的ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイム定量的ＲＴ－ＰＣＲ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ技術ＰＣＲにより、又はＲＮＡ－Ｓｅｑなどのハイスループットシーケンシング技術若しくはマイクロ流体系を使用するシーケンシング技術によりｍＲＮＡ転写産物の量を測定することにより決定される。より具体的には、発現は、実施例のセクションに規定される方法により測定される。
【0097】
特定の実施形態では、脂肪組織中の本ペプチドにより引き起こされるＦＡＴＰ２発現に対する効果は、好ましくはＦＡＴＰ２に特異的である。この実施形態では、本ペプチドは、特に哺乳動物における脂肪組織中の他のＦＡＴＰ、すなわち、ＦＡＴＰ１、ＦＡＴＰ３、ＦＡＴＰ４、ＦＡＴＰ５及びＦＡＴＰ６の発現に対する効果を有し得ないか、又はあまり有し得ない。
【0098】
一実施形態では、本開示によるペプチドは、肝脂肪化、肝臓中の脂肪の量、肝臓中の脂肪滴のサイズ及び／又は脂肪肝指数を減少させ得る。
【0099】
特定の実施形態では、本開示によるペプチドは、以下の特徴
－ これが１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを同時に含まないこと、
－ これがヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用すること、及び
－ これがＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）のキナーゼドメインの断片からの配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在すること
を提示し、並びに、１つ、２つ、３つ、４つ又は全ての以下の特徴を更に提示する：
－ これが脂肪組織中のＦＡＴＰ発現の発現レベルを改変すること、優先的には、これが脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現を減少させること、
－ これが肝脂肪化、肝臓中の脂肪の量、肝臓中の脂肪滴のサイズ及び／又は脂肪肝指数を減少させること、
－ これが少なくとも４個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これがヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用すること、
－ これが架橋により修飾されていること。
－ これが１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを同時に含まないこと、
－ これがヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用すること、及び
－ これがＰＫＣ（タンパク質キナーゼＣ）のキナーゼドメインの断片からの配列を含むか、それにおいて本質的に存在するか、又はそれにおいて存在すること
を提示し、並びに、１つ、２つ、３つ、４つ又は全ての以下の特徴を更に提示する：
－ これが脂肪組織中のＦＡＴＰ発現の発現レベルを改変すること、優先的には、これが脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現を減少させること、
－ これが肝脂肪化、肝臓中の脂肪の量、肝臓中の脂肪滴のサイズ及び／又は脂肪肝指数を減少させること、
－ これが少なくとも４個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これがヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用すること、
－ これが架橋により修飾されていること。
【0100】
より具体的な実施形態では、本開示によるペプチドは、以下の特徴を提示する：
－ これが肝脂肪化、肝臓中の脂肪の量、肝臓中の脂肪滴のサイズ及び／又は脂肪肝指数を減少させること、
－ これが１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを同時に含まないこと、
－ これが少なくとも４個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これがヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用すること。
－ これが肝脂肪化、肝臓中の脂肪の量、肝臓中の脂肪滴のサイズ及び／又は脂肪肝指数を減少させること、
－ これが１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを同時に含まないこと、
－ これが少なくとも４個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これがヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用すること。
【0101】
別のより具体的な実施形態では、本開示によるペプチドは、以下の特徴を提示する：
－ これが脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現を減少させること、
－ これが１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを同時に含まないこと、
－ これが少なくとも４個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これがヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用すること。
－ これが脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現を減少させること、
－ これが１つのメチオニン、１つのプロリン及び１つのアルギニンを同時に含まないこと、
－ これが少なくとも４個のアミノ酸、且つ４０個未満のアミノ酸の長さ、好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ３０個未満のアミノ酸の長さ、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸、且つ２５個未満のアミノ酸の長さを有すること、
－ これがヘリックス、好ましくはアルファヘリックスである二次構造を採用すること。
【0102】
一実施形態では、本開示によるペプチドは、コラーゲン、特に、コラーゲンＩＶ及びＬＯＸＬ２の発現を減少させ得る。優先的には、これはＬＯＸＬ２の発現、特に、肝臓中及び／又は血漿中のＬＯＸＬ２発現を減少させる。
【0103】
これは、組織中及び循環中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の脂質含有量、優先的には、１８：２ ＬＰＣを減少させ得る。
【0104】
本開示によるペプチドは、その細胞内取り込み又は侵入を容易にするための部分、特にＰＴＤ（タンパク質導入ドメイン）を更に含み得る。ＰＴＤは、一般的に、１０～２０個のアミノ酸の特定のアミノ酸配列を含む（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ ａｎｄ Ｍａｔｓｕｉ，（２００５），Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８３，３２４－３２８；Ｖｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，２００８，１７８６，１２６－１３８）。ＰＴＤは、主にアルギニン又はリジンなどの塩基性アミノ酸から構成され、ＰＴＤの代表的な例としては、ポリＲ８（ＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３３））又は（ＲＲＰＲＲＰＲＲＰＲＲＰＲＲＰ（配列番号３４））などのアルギニンリッチペプチド、（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３５））又はＨＩＶ－Ｔａｔ（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号３６））などのアンテナペディア若しくはペネトラチンペプチドが挙げられる。
【0105】
本開示によるペプチドは、天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸から作ることができる。「非天然アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸（すなわちアラニン、バリン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、プロリン、スレオニン、システイン、メチオニン）の類似体又は誘導体と定義される。これらは、修飾された側鎖、例えばより短いか、より長いか、又は異なる官能基を有する側鎖を提示する。特に、Ｄ異性体がプロテアーゼに感じやすくないため、Ｄ異性体及びＬ異性体が企図される。加えて、タンパク質分解耐性を増加させるために、ペプチド結合の一部又は全てにおける修飾も企図され、特に（－ＣＯ－ＮＨ－）よる、（－ＣＨ２－ＮＨ－）、（－ＮＨ－ＣＯ－）、（－ＣＨ２－Ｏ－）、（－ＣＨ２－Ｓ－）、（－ＣＨ２－ＣＨ２－）、（－ＣＯ－ＣＨ２－）、（－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－）、（－Ｎ＝Ｎ－）及び／又は（－ＣＨ＝ＣＨ－）によるものである。ペプチドは、カルボキシルＣ末端（－ＣＯＯ－）及びアミド末端（－ＣＯＮＨ２）を提示することができる。本ペプチドは、本明細書に開示されるにように、ペプチドのＤ－レトロ－インベルソ（ｒｅｔｒｏ－ｉｎｖｅｒｓｏ）配列でもあり得る。Ｎ末端は、特にアセチルラジカルで修飾され得る。
【0106】
任意選択的に、本ペプチドは、その安定性を増加させるために、ペグ化することができる。更に、任意選択的に、本ペプチドは、プロピレングリコール及びポリエチレングリコールなどの非水性のプロトン性溶媒中で製剤化することができる。本ペプチドは、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体ミクロスフェアデポー製剤にもパッケージ化され得る。多くの徐放性送達システムが存在し、これらの多くは、本開示で使用するのに適切である。例えば、ＰＬＧＡ、ポリ乳酸又はポリグリコール酸などの分解性ポリマーに基づくポリマーベースの徐放性組成物は、例えば、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／１１７８３０号パンフレット及び／又は国際公開第２００６／０７５１２４号パンフレットに記載されるものなど、脂質ベースのデポー製剤として好適である。活性剤の生体分解性ポリマーデポー製剤への製剤化は、十分に確立されており、且つ当該技術分野において周知であり、したがって、本開示のペプチドは、これらの既知の方法を用いて製剤化され得る。好ましくは、本開示の組成物は、ペプチドを機能的濃度で少なくとも１ヶ月間放出することができる。
【0107】
追加の態様では、本開示によるペプチドは、肝臓中のＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨに関連する脂肪化及び任意の肝障害の現象を減少させる。肝臓中の脂肪化の現象は、当業者から既知の任意の方法により評価することができる。特に、これは、実施例のセクションに記載の方法により評価される。例えば、脂肪化は、撮像又は生検により測定することができる。肝臓中の脂肪化の現象を減少させるペプチドは、当該技術分野において既知の任意の技術を使用して簡便にスクリーニングすることができる。特に、肝臓中の脂肪化を評価する方法は、肝臓中の脂肪、肝臓中の脂肪滴のサイズの測定及び／又は脂肪肝指数の測定に好適な任意の方法を含み得る（Ｂｅｄｇｎｉ ｅｔ ａｌ，ＢＭＣ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００６ Ｎｏｖ ２；６：３３）。
【0108】
「ペプチド」とは、上記開示のペプチド又は上記開示の異なるペプチドの組み合わせを指すことを意図している。例えば、２、３、４、５又は６つの異なるペプチド、好ましくは２又は３つ、好ましくは２つのペプチドを使用することができる。
【0109】
組み合わせ
本開示によるペプチドは、１つ以上の追加の活性薬物、例えば、抗糖尿病薬、脂質低下剤、抗肥満症剤、降圧剤、抗脂肪化薬、抗炎症剤及びペルオキシソーム増殖因子活性化因子受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のアゴニストと組み合わせて使用することができる。
本開示によるペプチドは、１つ以上の追加の活性薬物、例えば、抗糖尿病薬、脂質低下剤、抗肥満症剤、降圧剤、抗脂肪化薬、抗炎症剤及びペルオキシソーム増殖因子活性化因子受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のアゴニストと組み合わせて使用することができる。
【0110】
したがって、本発明は、
－ 特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物と組み合わせた、疾患の治療又は予防において使用するための本明細書に開示のペプチド又はそのペプチドを含む医薬組成物であって、疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される線維症であるペプチド又はそのペプチドを含む医薬組成物、
－ 非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される疾患の治療又は予防において使用するための、本明細書に開示のペプチド及び特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物を含む医薬組成物、
－ 非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される疾患の治療又は予防における同時、別個又は逐次使用のための、本開示によるペプチド及び特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物を含む製品、併用製剤又はキット、
－ 特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物と組み合わせた、疾患を治療又は予防するための医薬品の製造のためのペプチドの使用であって、疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される使用、
－ 非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される疾患を治療又は予防するための医薬品の製造のための、本明細書に開示のペプチド及び特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物の使用、
－ 治療有効量の本明細書に開示のペプチド及び特に、本明細書に開示の治療有効量の１つ以上の追加の活性薬物を投与することを含む、対象における疾患の治療又は予防のための方法であって、疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される方法、
－ 本明細書に開示のペプチド及び特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、対象における疾患の治療又は予防のための方法であって、疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される方法
に関する。
－ 特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物と組み合わせた、疾患の治療又は予防において使用するための本明細書に開示のペプチド又はそのペプチドを含む医薬組成物であって、疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される線維症であるペプチド又はそのペプチドを含む医薬組成物、
－ 非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される疾患の治療又は予防において使用するための、本明細書に開示のペプチド及び特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物を含む医薬組成物、
－ 非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される疾患の治療又は予防における同時、別個又は逐次使用のための、本開示によるペプチド及び特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物を含む製品、併用製剤又はキット、
－ 特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物と組み合わせた、疾患を治療又は予防するための医薬品の製造のためのペプチドの使用であって、疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される使用、
－ 非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される疾患を治療又は予防するための医薬品の製造のための、本明細書に開示のペプチド及び特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物の使用、
－ 治療有効量の本明細書に開示のペプチド及び特に、本明細書に開示の治療有効量の１つ以上の追加の活性薬物を投与することを含む、対象における疾患の治療又は予防のための方法であって、疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される方法、
－ 本明細書に開示のペプチド及び特に、本明細書に開示の１つ以上の追加の活性薬物を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む、対象における疾患の治療又は予防のための方法であって、疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肝脂肪化（脂肪肝）、肝炎、肝硬変、肝細胞癌及び線維症、特に、肝硬変を含む肝線維症、腎線維症、心房線維症、心内膜心筋線維症及び陳旧性心筋梗塞を含む心臓線維症、嚢胞性線維症及び放射線誘発性肺線維症を含む肺線維症、動脈線維症などの血管線維症、脳線維症、骨髄線維症、関節線維症、腸線維症、腹膜線維症、後腹膜線維症及び皮膚線維症からなる群から選択される線維症からなる群から選択される方法
に関する。
【0111】
特に、治療有効量又は治療有効量以下の１つ以上の追加の活性薬物を使用することができる。「治療量以下」とは、例えば、従来の治療薬量（特に同じ適応症及び／又は同じ投与経路及び／又は投与頻度についての）の９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０又は１０％であり得る量を指すことを意図する。
【0112】
抗糖尿病薬は、例えば、インスリン、インスリン誘導体及び模倣体；インスリン分泌促進物質（例えば、スルホニル尿素（例えば、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、トルブタミド、グリブリド、グリメピリド、グリピジド））；グリフロジン（例えば、エンパグリフロジン及びダパグリフロジン）；グリブリド及びＡｍａｒｙｌ；リラグルチド（ＮＮ２２１１）；インスリン分泌促進性スルホニル尿素受容体リガンド（例えば、メグリチニド、例えば、ナテグリニド及びレパグリニド）；チアゾリジンジオン（例えば、（例えば、インスリン感受性促進により）インスリン作用を増強させ、したがって末梢組織中のグルコース利用を促進するロシグリタゾン（ＡＶＡＮＤＩＡ）、トログリタゾン（ＲＥＺＵＬＩＮ）、ピオグリタゾン（ＡＣＴＯＳ）、バラグリタゾン、リボグリタゾン、ネトグリタゾン、トログリタゾン、エングリタゾン、シグリタゾン、アダグリタゾン、ダルグリタゾン；タンパク質チロシンホスファターゼ－ＩＢ（ＰＴＰ－１Ｂ）阻害剤（例えば、ＰＴＰ－１１２）；コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）阻害剤（例えば、トルセトラピブ）、ＧＳＫ３（グリコゲンシンターゼキナーゼ－３）阻害剤（例えば、ＳＢ－５１７９５５、ＳＢ－４１９５０５２、ＳＢ－２１６７６３、ＮＮ－５７－０５４４１及びＮＮ－５７－０５４４５）；ＲＸＲリガンド（例えば、ＧＷ－０７９１及びＡＧＮ－１９４２０４）；ナトリウム依存性グルコース共輸送体阻害剤（例えば、Ｔ－１０９５又はカナグリフロジン）；グリコゲンホスホリラーゼＡ阻害剤（例えば、ＢＡＹ Ｒ３４０１）；ビグアニド（例えば、メトホルミン及びグルコース利用を促進し、肝グルコース産生を低減させ、及び／又は腸グルコース放出を縮小することにより作用する他の薬剤）；アルファ－グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース及びミギイトイ（ｍｉｇｉｉｔｏｉ））並びに炭水化物消化及び結果的に腸からの吸収を減速させ、食後高血糖を低減させる他の薬剤；ＧＬＰ－１（グルカゴン様ペプチド－１）、ＧＬＰ－１類似体（例えば、エクセンジン－４及びＧＬＰ－１模倣薬）；並びにＤＰＰＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）阻害剤（例えば、ビルダグリプチン）であり得る。これは、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ ２００３，１２（４）：６２３－６３３の図１～７に記載の抗糖尿病薬でもよい。抗糖尿病薬は、αＰＫＣ及びＡＬＭＳ１の結合を防止する分子（例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５／１１４０６２号パンフレットに開示のもの）も含み得る。
【0113】
脂質低下剤は、例えば、３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤、例えば、ロバスタチン、ピタバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、セリバスタチン、メバスタチン、ベロスタチン（ｖｅｌｏｓｔａｔｉｎ）、フルバスタチン、ダルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン及びリバスタチン；スクアレンシンターゼ阻害剤；ＦＸＲ（ファルネソイドＸ受容体）及びＬＸＲ（肝臓Ｘ受容体）リガンド（例えば、オベチコール酸）；胆汁酸吸着剤（例えば、コレスチラミン及びコレセベラム）；フィブラート；ニコチン酸及びアスピリン；アラムコール、膜貫通Ｇタンパク質共役受容体（ＴＧＲ）５アゴニストであり得る。
【0114】
抗肥満症剤は、例えば、オルリスタット、リモナバント、フェンテルミン、トピラマート、ｑｎｅｘａ及びロカセリン（ｌｏｃａｓｅｒｉｎ）であり得る。
【0115】
降圧剤は、例えば、ループ利尿薬（例えば、エタクリン酸、フロセミド及びトラセミド）；アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリノドプリル、キナプリル、ラミプリル及びトランドラプリル）；Ｎａ－Ｋ－ＡＴＰアーゼ膜ポンプの阻害剤（例えば、ジゴキシン）；ニュートラルエンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）阻害剤（例えば、サクビトリル）；ＡＣＥ／ＮＥＰ阻害剤（例えば、オマパトリラト、サムパトリラト及びファシドトリル）；アンジオテンシンＩＩアンタゴニスト（例えば、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタン及びバルサルタン、特に、バルサルタン）；ＮＥＰ阻害剤及びアンジオテンシンＩＩアンタゴニストの組み合わせ（例えば、サクビトリル及びバルサルタン（すなわち、Ｅｎｔｒｅｓｔｏ））；レニン阻害剤（例えば、ジテキレン、ザンキレン、テルラキレン、アリスキレン、ＲＯ６６－１１３２及びＲＯ－６６－１１６８）；ベータアドレナリン作動性受容体遮断剤（例えば、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロール及びチモロール）；強心剤（例えば、ジゴキシン、ドブタミン及びミルリノン）；カルシウムチャネル遮断剤（例えば、アムロジピン、ベプリジル、ジルチアゼム、フェロジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ニフェジピン、ニソルジピン及びベラパミル）；アルドステロン受容体アンタゴニスト；並びにアルドステロンシンターゼ阻害剤であり得る。
【0116】
ペルオキシソーム増殖因子活性化因子受容体のアゴニストは、例えば、フェノフィブラート、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、テサグリタザル、ＢＭＳ－２９８５８５、Ｌ－７９６４４９、特許出願の国際公開第２００４／１０３９９５号パンフレットに具体的に記載されている化合物、すなわち、実施例１～３５の化合物若しくは請求項２１に具体的に列挙されている化合物又は特許出願の国際公開第０３／０４３９８５号パンフレットに具体的に記載されている化合物、すなわち、実施例１～７の化合物若しくは請求項１９に具体的に列挙されている化合物、特に、（Ｒ）－１－｛４－［５－メチル－２－（４－トリフルオロメチル－フェニル）－オキサゾール－４－イルメトキシ］－ベンゼンスルホニル｝－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－インドール－２－カルボン酸又はその塩であり得る。
【0117】
他の目的薬物は、例えば、セニクリビロク、シムツズマブ、セロンセルチブ、エムリカサンであり得る。
【0118】
特定の実施形態では、本ペプチドと組み合わせて使用される１つ以上の追加の活性薬物は、ＧＬＰ－１類似体（例えば、リラグルチド）、オベチコール酸、グリフロジン、シムツズマブ（ＧＳ６６２４）、セリクリビロク、アラムコール、ガレクチン３阻害剤（例えば、ＧＲ－ＭＤ－０２）、ＴＧＲ５アゴニスト及び二重ＦＸＲ／ＴＧＲ５アゴニスト（例えば、ＩＮＴ－７７７又はＩＮＴ－７６７）並びにエムリカサンのうちから選択することができる。
【0119】
抗炎症剤は、当業者に既知の任意の薬物（例えば、サリチル酸、種々の形態のイブプロフェン及び種々の形態のナプロキセンを含む非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド系抗炎症剤（例えば、コルチコステロイド）、抗炎症性抗ＴＮＦアルファ抗体）並びにこれらの組み合わせであり得る。
【0120】
医薬組成物の剤型、投与の経路、投与量及びレジメンは、当然ながら、治療される病態、病気の重症度、患者の年齢、体重及び性別などに依存する。
【0121】
本開示の医薬組成物又は治療用組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下又は眼内投与などに製剤化することができる。
【0122】
本開示の医薬組成物で使用されるペプチドは、治療有効量で存在する。
【0123】
本ペプチドを含む医薬組成物は、当業者に既知である標準的な医薬品実践規範（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００ ａｎｄ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８－１９９９，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に従って製剤化される。
【0124】
一態様では、本発明は、ペプチド又はその塩を含む、本開示による医薬組成物の非経口注射のための安定な製剤を提供し、このペプチドは、乾燥され、次いで使用前に溶媒中で再構成される。本ペプチド（又は製剤が２つ以上のペプチドを含む実施形態では、ペプチドのそれぞれ）は、非揮発性緩衝液と混合され、乾燥ペプチド粉末に乾燥される。好適な緩衝液としては、グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、緩衝液は、グリシン緩衝液である。別の実施形態は、緩衝液は、クエン酸緩衝液とリン酸緩衝液との混合物である。製剤が２つ以上のペプチドを含むいくつかの実施形態では、第１の緩衝液と第２の緩衝液とは、同じである。製剤が２つ以上のペプチドを含むいくつかの実施形態では、第１の緩衝液と第２の緩衝液とは、異なる。或いは、本開示による医薬組成物は、水溶液状態で保存され得る。この溶液は、必要に応じて、更なる添加剤又は賦形剤を含有し得、更なる添加剤又は賦形剤は、有効成分と適合性がなければならず、これらが凍結乾燥段階中に除去されない場合、これらは、投与の経路とも適合性がなければならない。非経口投与について、本組成物は、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内注射され得る。好ましくは、本組成物又はペプチドは、特に、脂肪組織中で皮下注射し、又は皮下注射することができる。
【0125】
これは、好ましくは体内に埋め込まれた浸透圧ミニポンプ又は他の制御送達装置を用いて配置され得る。好ましくは、これは、他の化合物と混合されて、徐放性デポー製剤を作製することができる。好ましい投与経路は、例えば、インスリンペンに類似する使い捨て又はマルチユニット分配装置を使用することによる皮下注射である。本ペプチドは、いかなる針も用いない皮下投与を可能とする装置、非侵襲系により投与することもできる。
【0126】
更に、本ペプチドは、利用可能な任意の薬物送達系を使用することにより投与することができる。特に、適切な同時投与療法のための皮下薬物送達を可能とし、且つ最適化するために組換えヒトヒアルロニダーゼ酵素ｒＨｕＰＨ２０の使用が企図される。
【0127】
本技術を用いると、静脈内投与される一部の生物剤及び化合物を、代わりに皮下送達するか、又は皮膚下で送達することができ、このことは、患者についてより良好な体感を潜在的に提供し、投与時間、注射痛及び注入部位反応を低減させることにより健康系効率を増加させる。
【0128】
一実施形態では、本開示のペプチドは、他の化合物と混合されて、徐放性デポー製剤を作製し得る。次いで、これが皮下注射されて、徐放性デポーを形成することができる。
【0129】
経口投与について、本組成物は、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤及びシロップ剤、エリキシル剤並びに濃縮滴剤などの液状製剤などの従来の経口剤形に製剤化することができる。例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、炭酸塩などを含む非毒性固体担体又は希釈剤が使用され得る。圧縮錠剤について、粉末状材料に粘着性を付与する薬剤である結合剤も必要である。例えば、デンプン、ゼラチン、乳糖又はデキストロースなどの糖類及び天然又は合成ガムは、結合剤として使用することができる。錠剤の崩壊を容易にするために、錠剤では崩壊剤も必要である。崩壊剤としては、デンプン、粘土、セルロース、アルギン、ガム及び架橋ポリマーが挙げられる。更に、製造プロセス中の錠剤材料の表面への接着を防止し、製造中の粉末材料の流動特性を改善するために、滑沢剤及び流動促進剤も錠剤中に含まれる。コロイド状二酸化ケイ素は、流動促進剤として最も一般的に使用され、タルク又はステアリン酸などの化合物は、滑沢剤として最も一般的に使用される。
【0130】
経皮投与について、本組成物は、軟膏剤、クリーム剤又はゲル剤の剤型に製剤化することができ、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド及びジメチルホルムアミドなどの適切な浸透剤又は洗浄剤を用いて浸透を容易にすることができる。
【0131】
経粘膜投与について、鼻腔スプレー、肺内吸入、直腸又は膣坐剤を使用することができる。一実施形態では、本発明は、当該技術分野において既知の方法に従って肺内薬物送達装置を使用して投与される乾燥粉末又は液体製剤のいずれかを用いる肺内経路によって投与され得る。活性化合物は、当該技術分野において既知の方法により、既知の坐剤基剤のいずれかに組み込むことができる。このような基剤の例としては、ココアバター、ポリエチレングリコール（カーボワックス）、ポリエチレンソルビタンモノステアレート及びこれらと、融点又は溶出速度を修正するための他の適合性材料との混合物が挙げられる。
【0132】
本開示による医薬組成物は、活性薬物を実質的に投与時に放出するか、又は投与後の任意の所定の時間若しくは期間に放出するように製剤化され得る。
【0133】
本開示による医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤及び／又は担体と共に、本開示の１つ以上のペプチドを含むことができる。これらの賦形剤及び／又は担体は、上に記載した投与の剤型に従って選択される。
【0134】
特定の実施形態では、本開示による医薬組成物は、０．０１ｎｇ～１０ｇの本開示のペプチドを含む。一実施形態では、本開示による医薬組成物は、０．１ｎｇ～１ｇの本開示のペプチドを含む。
【0135】
科学論文及び研究要約、公開された特許出願、付与された特許又は任意の他の文献を含む、本出願で引用された全ての文献は、これらの文献の全ての結果、表、図及びテキストを含む全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0136】
異なる意味を有するが、「含む」、「有する」、「～において存在する」及び「含有する」は、本出願全体において一方を他方に置き換えることができる。
【0137】
本開示の更なる態様及び利点は、以下の実施例で記載されるが、実施例は、例示的なものであり、非限定的なものとして解釈されたい。
【実施例】
【0138】
実施例１：注射１１日後の重要な脂肪酸輸送体及び受容体の発現レベルに対する脂肪組織標的化ＰＡＴＡＤ処置の効果
ＰＡＴＡＤ皮下注射は脂肪組織中のグルコース吸収の回復に関連するため、本発明者らは、ＦＡＴＰ（１～６）（脂肪酸輸送タンパク質１～６）についての６つ全てのアイソフォーム及びＦＦＡＲ（遊離脂肪酸受容体）についての４つのアイソフォームの発現レベルを測定してそれらの遺伝子に対する任意の効果を評価した。
ＰＡＴＡＤ皮下注射は脂肪組織中のグルコース吸収の回復に関連するため、本発明者らは、ＦＡＴＰ（１～６）（脂肪酸輸送タンパク質１～６）についての６つ全てのアイソフォーム及びＦＦＡＲ（遊離脂肪酸受容体）についての４つのアイソフォームの発現レベルを測定してそれらの遺伝子に対する任意の効果を評価した。
【0139】
興味深いことに、ＰＡＴＡＤ注射は、脂肪組織中のＦＡＴＰ２の極めて特異的で且つ大幅な減少を誘発させ、ＰＡＴＡＤ処置の効果をＦＡＴＰ２発現降下に直接相関付けることを可能とした（図１Ａ）。ＰＡＴＡＤペプチドは体内を循環しないこと、その効果は脂肪組織に限定されることが既に示されたため、及びＡＬＭＳ１－ＰＫＣ相互作用を妨害するその作用機序にも基づき、脂肪組織中のＰＡＴＡＤの新規作用は、ＦＡＴＰ２を減少させることである。２つの他の主要器官中の輸送体及び受容体の発現レベルは、間接的効果に関連し得る（図１Ｂ～Ｃ）。
【0140】
実施例２：ＡＤＰＩＦペプチドは、脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現レベルの減少においてＰＡＴＡＤペプチドよりも活性である
マウスに単一用量のスクランブルペプチド又はＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦのいずれかを注射した。注射１１日後、マウスを安楽死させ、ＲＮＡ抽出のために脂肪組織を採取し、次いでリアルタイムＰＣＲを行った。ＦＡＴＰ２の発現レベルは低脂肪対照と類似する一方、ＰＡＴＡＤは、脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現レベルの低減において有効であるが、ＡＤＰＩＦよりも有効でない（図２Ａ）。
マウスに単一用量のスクランブルペプチド又はＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦのいずれかを注射した。注射１１日後、マウスを安楽死させ、ＲＮＡ抽出のために脂肪組織を採取し、次いでリアルタイムＰＣＲを行った。ＦＡＴＰ２の発現レベルは低脂肪対照と類似する一方、ＰＡＴＡＤは、脂肪組織中のＦＡＴＰ２発現レベルの低減において有効であるが、ＡＤＰＩＦよりも有効でない（図２Ａ）。
【0141】
実施例３：ＡＤＰＩＦは、脂肪組織注射１１日後のＧＬＰ－１の循環レベルの増加において有効である。
マウスに単一用量のスクランブルペプチド又はＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦのいずれかを注射した。注射１１日後、マウスを安楽死させ、血漿を得、指示される処置のマウスからの循環ＧＬＰ１の決定のために使用した。ＰＡＴＡＤ及びＡＤＰＩＦの両方がＧＬＰ１の高い循環レベルを回復させ、ＡＤＰＩＦがＰＡＴＡＤよりも高い増加を誘発させた（図２Ｂ）。
マウスに単一用量のスクランブルペプチド又はＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦのいずれかを注射した。注射１１日後、マウスを安楽死させ、血漿を得、指示される処置のマウスからの循環ＧＬＰ１の決定のために使用した。ＰＡＴＡＤ及びＡＤＰＩＦの両方がＧＬＰ１の高い循環レベルを回復させ、ＡＤＰＩＦがＰＡＴＡＤよりも高い増加を誘発させた（図２Ｂ）。
【0142】
実施例４：脂肪組織標的化ＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦ処置のいずれかの単一注射３ヵ月後の肝臓に対する保護効果
提供されたマウスを安楽死させ、分析のためにその血漿及び器官を採取した。日齢に対する肝重量と体重との比を決定し、図３Ｂに提示した。ＰＡＴＡＤ処置に応答する肝臓のサイズは、ビヒクルのみを受容させたＤＩＯ糖尿病マウス対照である対照と比べて明らかに減少した。次いで、肝臓の冷凍切片をＡｄｉｐｏｒｅｄ及びＤＡＰＩにより染色して脂肪滴のレベルを検出した。ＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦにより処置されたマウスは、肝脂肪滴のサイズの減少を明らかに示した（図３Ａ、右パネル；図７、右パネル）。肝機能を、肝損傷に正比例してレベルが増加する２つの肝臓関連の強力なバイオマーカー、すなわち（ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ））により評価する。興味深いことに、ＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦにより処置されたマウス（単一皮下ペプチド注射による３ヵ月の期間後）は、それら２つのロバストな肝バイオマーカーの大幅な減少を示し（図３Ｃ）、このことは、脂肪化の現象の減少に関連する肝臓に対するＰＡＴＡＤ及びＡＤＰＩＦの保護効果を示す。ＰＡＴＡＤ及びＡＤＰＩＦは、ＡＳＴ及びＡＬＴの循環レベルの低減において両方とも有効である。ＡＤＰＩＦはＡＬＴの循環レベルの低減においてより活性であり、このことは、肝細胞損傷の改善を意味する。
提供されたマウスを安楽死させ、分析のためにその血漿及び器官を採取した。日齢に対する肝重量と体重との比を決定し、図３Ｂに提示した。ＰＡＴＡＤ処置に応答する肝臓のサイズは、ビヒクルのみを受容させたＤＩＯ糖尿病マウス対照である対照と比べて明らかに減少した。次いで、肝臓の冷凍切片をＡｄｉｐｏｒｅｄ及びＤＡＰＩにより染色して脂肪滴のレベルを検出した。ＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦにより処置されたマウスは、肝脂肪滴のサイズの減少を明らかに示した（図３Ａ、右パネル；図７、右パネル）。肝機能を、肝損傷に正比例してレベルが増加する２つの肝臓関連の強力なバイオマーカー、すなわち（ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）及びＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ））により評価する。興味深いことに、ＰＡＴＡＤ又はＡＤＰＩＦにより処置されたマウス（単一皮下ペプチド注射による３ヵ月の期間後）は、それら２つのロバストな肝バイオマーカーの大幅な減少を示し（図３Ｃ）、このことは、脂肪化の現象の減少に関連する肝臓に対するＰＡＴＡＤ及びＡＤＰＩＦの保護効果を示す。ＰＡＴＡＤ及びＡＤＰＩＦは、ＡＳＴ及びＡＬＴの循環レベルの低減において両方とも有効である。ＡＤＰＩＦはＡＬＴの循環レベルの低減においてより活性であり、このことは、肝細胞損傷の改善を意味する。
【0143】
実施例５：ＡＤＰＩＦペプチドは、高血糖症の予防においてＰＡＴＡＤペプチドよりも活性である。
これらは、一連の耐糖能試験（ＧＴＴ）から得られた結果であり、２時点、すなわち、３０分及び１２０分からのデータを使用して両方の対照及びＰＡＴＡＤ処置食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）及び糖尿病野生型雄Ｃ５７／Ｂ６マウス（対照）についてのそれらの曲線を作成した。
これらは、一連の耐糖能試験（ＧＴＴ）から得られた結果であり、２時点、すなわち、３０分及び１２０分からのデータを使用して両方の対照及びＰＡＴＡＤ処置食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）及び糖尿病野生型雄Ｃ５７／Ｂ６マウス（対照）についてのそれらの曲線を作成した。
【0144】
これらのデータは、ペプチドベースＡＤＰＩＦが耐糖能試験においてＰＡＴＡＤペプチドよりも良好な効果を有することを示す（図４）。
【0145】
実施例６：ＡＤＰＩＦペプチドは、ＬＯＸＬ２及びＦＡＢＰ４タンパク質の肝レベルの低減においてＰＡＴＡＤペプチドよりも活性である
ＬＯＸＬ２は、コラーゲンの重合化を推進することにより線維症病変の発症を促進する酵素であり、ＦＡＢＰ４は、肝臓中の脂質沈着が増加するにつれてレベルが増加する脂質代謝に関与するタンパク質である。単独注射による処置３ヵ月後、指示されるマウスについてのマウスからの肝抽出物を使用し、それらのデータは、ペプチドＡＤＰＩＦが、ＬＯＸＬ２の肝レベルの減少において、それにより肝臓中のより多くの線維症病変を生成する能力の減少において、及び肝トリグリセリドレベルの減少と相関するＦＡＢＰ４のレベルの減少においてＰＡＴＡＤよりも強力であることを示す（図５）。
ＬＯＸＬ２は、コラーゲンの重合化を推進することにより線維症病変の発症を促進する酵素であり、ＦＡＢＰ４は、肝臓中の脂質沈着が増加するにつれてレベルが増加する脂質代謝に関与するタンパク質である。単独注射による処置３ヵ月後、指示されるマウスについてのマウスからの肝抽出物を使用し、それらのデータは、ペプチドＡＤＰＩＦが、ＬＯＸＬ２の肝レベルの減少において、それにより肝臓中のより多くの線維症病変を生成する能力の減少において、及び肝トリグリセリドレベルの減少と相関するＦＡＢＰ４のレベルの減少においてＰＡＴＡＤよりも強力であることを示す（図５）。
【0146】
実施例７：脂肪組織中のＡＤＰＩＦ処置に応答する循環脂質プロファイル
予想外に、ＡＤＰＩＦ脂肪組織注射は脂肪組織中のＦＡＴＰ２の発現レベルの特異的減少並びに筋肉及び肝臓中のＦＡＴＰ及びＦＦＡＲの関連プロファイルに対して肝臓保護性であることを証明した。これらの変化は、循環する異なる脂質の集団に影響を与える。セラミドは、ＮＡＦＬＤに関与することが既知の生物活性脂質のグループである。本発明者らは、皮下脂肪組織中の週１回注射の頻度におけるＡＤＰＩＦの３回注射後のセラミドプロファイルに対するＡＤＰＩＦ注射の効果を測定し、決定した。ＡＤＰＩＦは、全体的に肝セラミド含有量の減少を誘発させ、異なるセラミド間で変動する（図６）。
予想外に、ＡＤＰＩＦ脂肪組織注射は脂肪組織中のＦＡＴＰ２の発現レベルの特異的減少並びに筋肉及び肝臓中のＦＡＴＰ及びＦＦＡＲの関連プロファイルに対して肝臓保護性であることを証明した。これらの変化は、循環する異なる脂質の集団に影響を与える。セラミドは、ＮＡＦＬＤに関与することが既知の生物活性脂質のグループである。本発明者らは、皮下脂肪組織中の週１回注射の頻度におけるＡＤＰＩＦの３回注射後のセラミドプロファイルに対するＡＤＰＩＦ注射の効果を測定し、決定した。ＡＤＰＩＦは、全体的に肝セラミド含有量の減少を誘発させ、異なるセラミド間で変動する（図６）。
【0147】
実施例８：ＡＤＰＩＦは、肝臓中の脂肪滴のサイズの減少において有効である
図７において、処置マウス（実施例６と同じ投与量レジメン）の肝臓からの冷凍切片を脂肪滴について染色し、それはＡＤＰＩＦ処置後の肝臓中の脂肪滴のサイズの全体的減少を証明し、それにより肝臓中の脂肪の蓄積の減少を示した。
図７において、処置マウス（実施例６と同じ投与量レジメン）の肝臓からの冷凍切片を脂肪滴について染色し、それはＡＤＰＩＦ処置後の肝臓中の脂肪滴のサイズの全体的減少を証明し、それにより肝臓中の脂肪の蓄積の減少を示した。
【0148】
実施例９：驚くべきことに、脂肪組織中のＡＤＰＩＦ処置は、肝臓中の重要な脂質合成及びモジュレート酵素の発現レベルを抑制した
ＡＣＣ及びＦＡＳＮは、脂質ハンドリングに関与する重要なタンパク質であるＳｒｅｂｆ１と一緒に、肝臓中で脂肪酸が合成される脂質合成経路の一部を形成する。ＡＤＰＩＦ処置後、それらの酵素は抑制され、それは、脂肪組織中の投与後のＡＤＰＩＦ作用が、肝臓中のデノボ脂質合成を遮断し得ることを示した（図８）。
ＡＣＣ及びＦＡＳＮは、脂質ハンドリングに関与する重要なタンパク質であるＳｒｅｂｆ１と一緒に、肝臓中で脂肪酸が合成される脂質合成経路の一部を形成する。ＡＤＰＩＦ処置後、それらの酵素は抑制され、それは、脂肪組織中の投与後のＡＤＰＩＦ作用が、肝臓中のデノボ脂質合成を遮断し得ることを示した（図８）。
【0149】
実施例１０：脂肪組織中のＡＤＰＩＦ処置は、ＤＩＯ－ＮＡＳＨマウスモデルにおいて肝線維症の進行を遮断する
ＡＤＰＩＦ処置マウス（実施例８と同じもの）からの肝冷凍切片をＬＯＸＬ２又はコラーゲンＩＶのいずれかの免疫検出に使用し、ＡＤＰＩＦが線維症マーカーの進行の予防において有効であることを示した（図９Ａ）。血漿中の分泌ＬＯＸＬ２のレベルも有意に低減した（図９Ｂ）。ＬＯＸＬ２の減少及びコラーゲン貯留の減少の結果として、透過型電子顕微鏡観察で非処置ＤＩＯ－ＮＡＳＨ肝臓中で容易に検出された線維症病変（図９Ｃ、左パネル）は、ＡＤＰＩＦ処置肝臓中ではもはや検出されなかった。
ＡＤＰＩＦ処置マウス（実施例８と同じもの）からの肝冷凍切片をＬＯＸＬ２又はコラーゲンＩＶのいずれかの免疫検出に使用し、ＡＤＰＩＦが線維症マーカーの進行の予防において有効であることを示した（図９Ａ）。血漿中の分泌ＬＯＸＬ２のレベルも有意に低減した（図９Ｂ）。ＬＯＸＬ２の減少及びコラーゲン貯留の減少の結果として、透過型電子顕微鏡観察で非処置ＤＩＯ－ＮＡＳＨ肝臓中で容易に検出された線維症病変（図９Ｃ、左パネル）は、ＡＤＰＩＦ処置肝臓中ではもはや検出されなかった。
【0150】
実施例１１：ＡＤＰＩＦは、肝臓及び他の組織中の標的化されたリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）を選択的に低減させる
ＬＰＣについての脂質含有量を、脂肪組織中のＡＤＰＩＦ注射３ヵ月後に分析して線維症進行における役割を担う重要な分泌酵素オートタキシンについての既知基質ＬＰＣのレベルにＡＤＰＩＦがどのように影響を与え得るかを確認した。驚くべきことに、ＡＤＰＩＦは、試験器官において、選択的なＬＰＣの低減において有効であり、ＬＰＣ１８：２が膵臓、脂肪組織及び肝臓中で最も顕著な低減を提示した（図１０）。
ＬＰＣについての脂質含有量を、脂肪組織中のＡＤＰＩＦ注射３ヵ月後に分析して線維症進行における役割を担う重要な分泌酵素オートタキシンについての既知基質ＬＰＣのレベルにＡＤＰＩＦがどのように影響を与え得るかを確認した。驚くべきことに、ＡＤＰＩＦは、試験器官において、選択的なＬＰＣの低減において有効であり、ＬＰＣ１８：２が膵臓、脂肪組織及び肝臓中で最も顕著な低減を提示した（図１０）。
【0151】
実施例１２：ＡＤＰＩＦペプチドは、腎臓中のコラーゲンＩＶ貯留の予防、したがって、線維症からの腎臓の保護において有効である
ＤＩＯビヒクル処置及びＤＩＯ ＡＤＰＩＦ処置マウスからの処置３ヵ月後の腎臓の冷凍切片を、コラーゲンＩＶ沈着及びタイトジャンクションについてＺＯ－１抗体により免疫染色して他の軟部組織中の線維症進行に対するＡＤＰＩＦペプチドの効果を評価した。
ＤＩＯビヒクル処置及びＤＩＯ ＡＤＰＩＦ処置マウスからの処置３ヵ月後の腎臓の冷凍切片を、コラーゲンＩＶ沈着及びタイトジャンクションについてＺＯ－１抗体により免疫染色して他の軟部組織中の線維症進行に対するＡＤＰＩＦペプチドの効果を評価した。
【0152】
驚くべきことに、ビヒクル処置マウスと比べてＡＤＰＩＦ処置マウスの腎臓中のコラーゲンＩＶの明確な低減が観察され、このことは、ＡＤＰＩＦペプチドが線維症からの腎臓の保護においても有効であることを示した（図１１）。
【0153】
材料及び方法
マウスの飼育
本試験について、マウスはＣ５７／ＢＬ６遺伝子バックグランドのものであった。全ての動物を温度及び湿度制御施設中で収容し、１２時間ごとの明／暗周期において全期間の間に給餌し、マウスにＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓからの６０％の高脂肪食餌（Ｄ１２４９２）を給餌し、水道水を自由に提供した。マウスに給餌し、グルコース負荷試験のためにそれらのグルコース負荷について定期的に試験し、耐糖能異常であれば、それらを処置に使用した。
マウスの飼育
本試験について、マウスはＣ５７／ＢＬ６遺伝子バックグランドのものであった。全ての動物を温度及び湿度制御施設中で収容し、１２時間ごとの明／暗周期において全期間の間に給餌し、マウスにＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓからの６０％の高脂肪食餌（Ｄ１２４９２）を給餌し、水道水を自由に提供した。マウスに給餌し、グルコース負荷試験のためにそれらのグルコース負荷について定期的に試験し、耐糖能異常であれば、それらを処置に使用した。
【0154】
ペプチド配列及び合成
ＰＡＴＡＤは、脂肪組織中で特異的にグルコース吸収を誘発する能力について生物活性であるＰＫＣアルファアイソフォームに由来する一連のペプチドに与えられた名称である。
ステープルドペプチド配列Ａ：ＶＥ ＣＴＭ－［２－（４－ペンテニル）アラニン］－ＥＫ ＲＶＬ Ａ－［２－（４－ペンテニル）アラニン］－Ｌ ＤＫＰ ＰＦＬ ＴＱＬ ＨＳ（配列番号４９）
ステープルドペプチド配列Ｂ：Ｓ－［２－（４－ペンテニル）アラニン］－ＣＫＧ ＬＭＴ－［２－（４－ペンテニル）アラニン］－ＨＰ ＡＫＲ ＬＧＣ ＧＰＥ Ｇ（配列番号５０）
スクランブルペプチド配列Ａ：ＫＥＶＰＶＤＴＣＨＬＴＬＭＬＬＦＲＳＶＡＬＫＱＨＰＥ（配列番号５１）
スクランブルペプチド配列Ｂ：ＳＡＥＣＫＧＲＨＧＴＰＰＧＫＬＭＩＣＫＧＬ（配列番号２２）。
ＰＡＴＡＤは、脂肪組織中で特異的にグルコース吸収を誘発する能力について生物活性であるＰＫＣアルファアイソフォームに由来する一連のペプチドに与えられた名称である。
ステープルドペプチド配列Ａ：ＶＥ ＣＴＭ－［２－（４－ペンテニル）アラニン］－ＥＫ ＲＶＬ Ａ－［２－（４－ペンテニル）アラニン］－Ｌ ＤＫＰ ＰＦＬ ＴＱＬ ＨＳ（配列番号４９）
ステープルドペプチド配列Ｂ：Ｓ－［２－（４－ペンテニル）アラニン］－ＣＫＧ ＬＭＴ－［２－（４－ペンテニル）アラニン］－ＨＰ ＡＫＲ ＬＧＣ ＧＰＥ Ｇ（配列番号５０）
スクランブルペプチド配列Ａ：ＫＥＶＰＶＤＴＣＨＬＴＬＭＬＬＦＲＳＶＡＬＫＱＨＰＥ（配列番号５１）
スクランブルペプチド配列Ｂ：ＳＡＥＣＫＧＲＨＧＴＰＰＧＫＬＭＩＣＫＧＬ（配列番号２２）。
【0155】
ＡＤＰＩＦは、ＰＡＴＡＤペプチドのＰＫＣアルファアイソフォーム誘導体に由来し、２つの特異的突然変異を提示する一連のペプチドに与えられた名称である。
ステープルドペプチドＡＤＰＩＦ配列：
（
は、ステープリングを担持し、好ましくはそれぞれ２－（７－オクテニル）アルギニン及び２－（４－ペンテニル）セリンである）。
ステープルドペプチドＡＤＰＩＦ配列：
【化11】
【化12】
【0156】
ステープルド及びスクランブルペプチドは、ＣＰＣ，ＵＳＡから９５％の純度で購入した。全てのペプチドを最初のＤＭＳＯ中で溶解させ、次いで無菌生理食塩溶液中で１０ｎｇ／μＬの濃度において希釈した。２．５μＬの各ペプチド（ステープルド又はスクランブル）を混合し、次いで各マウスにおける皮下脂肪組織中に直接注射した。
【0157】
ペプチドの投与量レジメン
対照マウスには、スクランブル対照又はビヒクル（０．９％の生理食塩溶液）のいずれかを注射した（後腹膜脂肪／皮下注射：０日目における１回の注射及び指示される試験を実行した。処置マウスには、２つのＰＡＴＡＤステープルドペプチドの混合物及びＰＡＴＡＤペプチドと同じ手順に従うＡＤＰＩＦステープルドペプチド及びＡＤＰＩＦペプチド試験品を注射した（後腹膜脂肪／皮下注射：０日目における１回の注射及び指示される試験を実行した）。第２の実験系列において、ＡＤＰＩＦを、３週間、後腹膜区域中の皮下脂肪組織中にマウス１匹当たり２５ｕｇの投与量において週１回注射し、マウスを最後の注射から１週間後に安楽死させた。マウスを安楽死させ、組織試料及び血漿を単離し、更なる試験のために－８０℃において保持した。
対照マウスには、スクランブル対照又はビヒクル（０．９％の生理食塩溶液）のいずれかを注射した（後腹膜脂肪／皮下注射：０日目における１回の注射及び指示される試験を実行した。処置マウスには、２つのＰＡＴＡＤステープルドペプチドの混合物及びＰＡＴＡＤペプチドと同じ手順に従うＡＤＰＩＦステープルドペプチド及びＡＤＰＩＦペプチド試験品を注射した（後腹膜脂肪／皮下注射：０日目における１回の注射及び指示される試験を実行した）。第２の実験系列において、ＡＤＰＩＦを、３週間、後腹膜区域中の皮下脂肪組織中にマウス１匹当たり２５ｕｇの投与量において週１回注射し、マウスを最後の注射から１週間後に安楽死させた。マウスを安楽死させ、組織試料及び血漿を単離し、更なる試験のために－８０℃において保持した。
【0158】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、ｑ－ＲＮＡ及びＴａｑｍａｎ
ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キット（カタログ番号：ＡＭ１９２４；Ａｍｂｉｏｎ）を使用して全ＲＮＡを異なる組織及び細胞から調製し、次いでＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ（商標）（カタログ番号：ＡＭ１９０７；Ａｍｂｉｏｎ）によるＤＮＡアーゼ処置を行った。ＲＮＡインテグリティを電気泳動により、且つＲＮＡ濃度をＨｅｌｌｍａ（登録商標）Ｔｒａｙ Ｃｅｌｌ（カタログ番号：１０５．８１０－ｕｖｓ；Ｈｅｌｌｍａ）を用いるＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｐｌｕｓにより評価した。ＢｉｏＲａｄｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号：１７０－８８９１；ＢｉｏＲａｄ）を使用して１μｇの全ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を実行した。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応増幅を、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍにおいて、ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（カタログ番号：１７０－８８８６；ＢｉｏＲＡｄ）及びリアルタイムＰＣＲのためのＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎベースリアルタイムＰＣＲのための試験標的について最適化されたプライマーセットを使用して実行した。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号：４４４４５５７；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて特異的遺伝子アッセイを用いてＴａｑｍａｎ分析を実行した。ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．５を使用して標的ｍＲＮＡ ＣｔをＧＡＰＤＨについてのものに正規化することにより比較サイクル閾値（Ｃｔ）法を使用して標的遺伝子の正規化発現倍率を計算し、Ｌｉｎ－Ｒｅｇプログラム（Ｒｕｉｊｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）を使用して確認した。全てのプライマーペアは、Ｂｉｏｒａｄ又はＱｕａｎｔｉｔｅｃｔのいずれかから購入した。
ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）キット（カタログ番号：ＡＭ１９２４；Ａｍｂｉｏｎ）を使用して全ＲＮＡを異なる組織及び細胞から調製し、次いでＴＵＲＢＯ ＤＮＡ－ｆｒｅｅ（商標）（カタログ番号：ＡＭ１９０７；Ａｍｂｉｏｎ）によるＤＮＡアーゼ処置を行った。ＲＮＡインテグリティを電気泳動により、且つＲＮＡ濃度をＨｅｌｌｍａ（登録商標）Ｔｒａｙ Ｃｅｌｌ（カタログ番号：１０５．８１０－ｕｖｓ；Ｈｅｌｌｍａ）を用いるＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ Ｐｌｕｓにより評価した。ＢｉｏＲａｄｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号：１７０－８８９１；ＢｉｏＲａｄ）を使用して１μｇの全ＲＮＡのｃＤＮＡへの逆転写を実行した。リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応増幅を、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ９６（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍにおいて、ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（カタログ番号：１７０－８８８６；ＢｉｏＲＡｄ）及びリアルタイムＰＣＲのためのＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎベースリアルタイムＰＣＲのための試験標的について最適化されたプライマーセットを使用して実行した。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（カタログ番号：４４４４５５７；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて特異的遺伝子アッセイを用いてＴａｑｍａｎ分析を実行した。ＣＦＸ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．５を使用して標的ｍＲＮＡ ＣｔをＧＡＰＤＨについてのものに正規化することにより比較サイクル閾値（Ｃｔ）法を使用して標的遺伝子の正規化発現倍率を計算し、Ｌｉｎ－Ｒｅｇプログラム（Ｒｕｉｊｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９）を使用して確認した。全てのプライマーペアは、Ｂｉｏｒａｄ又はＱｕａｎｔｉｔｅｃｔのいずれかから購入した。
【0159】
プライマー仕様は以下の表に見出される。
【0160】
【表1】
【0161】
肝切片のＡｄｉｐｏＲｅｄ染色
肝臓を単離し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で簡単に洗浄した。乾燥肝臓を秤量した後、肝臓と体重との比のため、肝臓のスライス試料を４％のパラホルムアルデヒド（０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２中）中に１５分間配置し、ＰＢＳで洗浄し、３０μＭのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を含むＡｄｉｐｏＲｅｄ色素（１／２５；Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、試料をスライドグラス上に載せ、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を使用して写真を撮影した。
肝臓を単離し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で簡単に洗浄した。乾燥肝臓を秤量した後、肝臓と体重との比のため、肝臓のスライス試料を４％のパラホルムアルデヒド（０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２中）中に１５分間配置し、ＰＢＳで洗浄し、３０μＭのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）を含むＡｄｉｐｏＲｅｄ色素（１／２５；Ｌｏｎｚａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で１５分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、試料をスライドグラス上に載せ、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡を使用して写真を撮影した。
【0162】
免疫蛍光実験
免疫蛍光実験のため、新たに採取された肝臓及び腎臓をＯｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（商標）（ＯＣＴ（商標）、カタログ番号４５８３、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴ（商標）、Ｓａｋｕｒａ（登録商標）Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中に含め、Ｃｒｙｏｓｔａｔ Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０を用いて７μｍの冷凍切片を切断した。冷凍切片を１×ＰＢＳにより洗浄し、４％のホルムアルデヒド溶液中で１５分間固定し（カタログ番号：Ｆ５５５－４Ｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ－Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）、次いで０．０２％のＳＤＳ－ＰＢＳにより３０秒間透過処理した。ブロッキング溶液は、ＰＢＳ中５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であった。一次抗体をブロッキング溶液中で希釈し、一晩インキュベートし、指示される二次抗体をＰＢＳ中で３０分間希釈した。ヘキスト（カタログ番号Ｄ１３０６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）により核を対比染色した。次いで、スライドにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：Ｈ－１０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を載せた。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ又はＺｅｉｓｓ ＺＥＮ ２０１２ソフトウェアのいずれかを備えるＺｅｉｓｓ Ｉｍａｇｅｒ．Ｚ２顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて画像を取得し、分析した。
免疫蛍光実験のため、新たに採取された肝臓及び腎臓をＯｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（商標）（ＯＣＴ（商標）、カタログ番号４５８３、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴ（商標）、Ｓａｋｕｒａ（登録商標）Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中に含め、Ｃｒｙｏｓｔａｔ Ｌｅｉｃａ ＣＭ１９５０を用いて７μｍの冷凍切片を切断した。冷凍切片を１×ＰＢＳにより洗浄し、４％のホルムアルデヒド溶液中で１５分間固定し（カタログ番号：Ｆ５５５－４Ｌ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ－Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）、次いで０．０２％のＳＤＳ－ＰＢＳにより３０秒間透過処理した。ブロッキング溶液は、ＰＢＳ中５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であった。一次抗体をブロッキング溶液中で希釈し、一晩インキュベートし、指示される二次抗体をＰＢＳ中で３０分間希釈した。ヘキスト（カタログ番号Ｄ１３０６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）により核を対比染色した。次いで、スライドにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（登録商標）Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（カタログ番号：Ｈ－１０００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を載せた。Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ又はＺｅｉｓｓ ＺＥＮ ２０１２ソフトウェアのいずれかを備えるＺｅｉｓｓ Ｉｍａｇｅｒ．Ｚ２顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｃ．，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて画像を取得し、分析した。
【0163】
Ａｂｃａｍからの抗コラーゲンＩＶ抗体ａｂ６５８６及びＧｅｎｅＴｅｘからのＬＯＸＬ２抗体ＧＴＸ１０５０８５を使用した。
【0164】
肝抽出物に対する電子顕微鏡撮像のため、試料をカコジル酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ７．４）中のグルタルアルデヒド（２．５％）及びパラホルムアルデヒド（２．５％）中で浸漬した。試料を１％の四酸化オスミウム中で後固定し、段階系列アルコール（５０、７０、９０、及び１００％）及びプロピレンオキシドを介してそれぞれ３０分間脱水し、Ｅｐｏｎ ８１２中に包埋した。準超薄切片をウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｕｌｔｒａｃｕｔ ＵＣＴ）上で２μｍにおいて切断し、超薄切片を７０ｎｍにおいて切断し、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛を用いて造影し、Ｍｏｒｇａｇｎｉ ２６８Ｄ電子顕微鏡を用いて７０ｋｖにおいて試験した。画像をＭｅｇａ Ｖｉｅｗ ＩＩＩカメラ（Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）によりデジタル的にキャプチャーした。
【0165】
生化学的アッセイ
血漿決定について
ＡＳＴ及びＡＬＴのＥＬＩＳＡ測定
指示されるマウスからの血漿試料を使用してＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）又はＡＳＬ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）（両方とも肝損傷のロバストな指標因子）のいずれかの血漿含有量を決定し、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。これらのパラメータを製造業者の手順に従って決定した。
－ ＳＥＢ２１４Ｍｕ（９６個試験用）：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）用の酵素結合免疫吸着アッセイキット、Ｃｌｏｕｄ Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ
－ ＳＥＡ２０７Ｍｕ（９６個試験用）：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）用の酵素結合免疫吸着アッセイキット、Ｃｌｏｕｄ Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ。
血漿決定について
ＡＳＴ及びＡＬＴのＥＬＩＳＡ測定
指示されるマウスからの血漿試料を使用してＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）又はＡＳＬ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）（両方とも肝損傷のロバストな指標因子）のいずれかの血漿含有量を決定し、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。これらのパラメータを製造業者の手順に従って決定した。
－ ＳＥＢ２１４Ｍｕ（９６個試験用）：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）用の酵素結合免疫吸着アッセイキット、Ｃｌｏｕｄ Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ
－ ＳＥＡ２０７Ｍｕ（９６個試験用）：アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）用の酵素結合免疫吸着アッセイキット、Ｃｌｏｕｄ Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ。
【0166】
ＬＯＸＬ２及びＧＬＰ－１測定のため、２つの市販のキット
リジルオキシダーゼ様タンパク質２（ＬＯＸＬ２）酵素結合免疫吸着アッセイキット、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ＳＥＦ５５２Ｍｕ、Ｃｌｏｕｄ Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ
ＲａｙＢｉｏヒト／マウス／ラットＧＬＰ－１酵素免疫アッセイキット、ＥＩＡ－ＧＬＰ１、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ
を、製造業者からの指示手順を用いて使用した。
リジルオキシダーゼ様タンパク質２（ＬＯＸＬ２）酵素結合免疫吸着アッセイキット、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ＳＥＦ５５２Ｍｕ、Ｃｌｏｕｄ Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ
ＲａｙＢｉｏヒト／マウス／ラットＧＬＰ－１酵素免疫アッセイキット、ＥＩＡ－ＧＬＰ１、ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ
を、製造業者からの指示手順を用いて使用した。
【0167】
肝抽出物の測定のため、ＬＯＸＬ２のための同じキットを使用し、ＦＡＢＰ４のため、使用される市販のキットは、脂肪酸結合タンパク質４、脂肪細胞（ＦＡＢＰ４）用のＥｌｉｓａキット、ＳＥＢ６９３Ｍｕ、Ｃｌｏｕｄ Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．であった。
【0168】
異なる組織及び血漿中の脂質組成のため、全ての試料を犠死直後の採取時にフラッシュ冷凍し、Ｄｉｊｏｎのリピドミックコア施設（Ｐｌａｔｅｆｏｒｍｅ ｄｅ Ｌｉｐｉｄｏｍｉｑｕｅ－ｕＢｏｒｇｏｇｎｅ ＩＮＳＥＲＭ ＵＭＲ８６６／Ｌａｂｅｘ ＬｉｐＳＴＩＣ）に送付した。
【0169】
実施例１３．非アルコール性脂肪性肝炎ＳＴＡＭモデルにおけるＡＤＰＩＦペプチドのインビボ効力試験
材料及び方法
試験物質
ペプチドは、上記のＡＤＰＩＦペプチドであった。投与溶液を配合説明書に従って調製した。
材料及び方法
試験物質
ペプチドは、上記のＡＤＰＩＦペプチドであった。投与溶液を配合説明書に従って調製した。
【0170】
ＮＡＳＨの誘発
１２匹の雄マウスにおいて、生後２日目の２００μｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）溶液の単一皮下注射及び４週齢後の高脂肪食餌（ＨＦＤ、５７ｋｃａｌ％の脂肪、カタログ番号ＨＦＤ３２、ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．，日本）の給餌によりＮＡＳＨを誘発した。
１２匹の雄マウスにおいて、生後２日目の２００μｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＳＡ）溶液の単一皮下注射及び４週齢後の高脂肪食餌（ＨＦＤ、５７ｋｃａｌ％の脂肪、カタログ番号ＨＦＤ３２、ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．，日本）の給餌によりＮＡＳＨを誘発した。
【0171】
薬物投与経路
ペプチドを脂肪組織中にマウス１匹当たり１００ｍＬの容量で皮下投与した。
ペプチドを脂肪組織中にマウス１匹当たり１００ｍＬの容量で皮下投与した。
【0172】
処置用量
ペプチドをマウス１匹当たり２５マイクログラム（μｇ）の用量において週１回投与した。
ペプチドをマウス１匹当たり２５マイクログラム（μｇ）の用量において週１回投与した。
【0173】
動物
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（妊娠１４日の雌）をＪａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．（Ｊａｐａｎ）から入手した。試験において使用される全ての動物を収容し、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｕｓｅに従ってケアした。
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（妊娠１４日の雌）をＪａｐａｎ ＳＬＣ，Ｉｎｃ．（Ｊａｐａｎ）から入手した。試験において使用される全ての動物を収容し、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｕｓｅに従ってケアした。
【0174】
動物をＳＰＦ施設中で温度（２３±２℃）、湿度（４５±１０％）、照明（１２時間の人工明及び暗周期；８：００～２０：００の明期）及び換気の制御条件下で維持した。実験室中で高圧を維持して施設の汚染を防止した。
【0175】
動物を、ＴＰＸケージ（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ）中で収容し、ケージ当たり最大３匹のマウスであった。Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ Ｐａｐｅｒ－Ｃｌｅａｎ（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）を寝床に使用し、週１回交換した。
【0176】
無菌固体ＨＦＤを自由摂取で提供し、ケージ頂部の金属蓋中に配置した。ゴム栓及び吸水管を備える水ボトルから純水を自由摂取で提供した。水ボトルを週１回交換し、清浄し、オートクレーブ中で滅菌し、再使用した。
【0177】
マウスを耳パンチにより識別した。各ケージを規定の識別コードにより標識した。
【0178】
血漿生化学的検査の測定
血漿生化学的検査のため、抗凝固剤（Ｎｏｖｏ－Ｈｅｐａｒｉｎ、Ｍｏｃｈｉｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を有するポリプロピレンチューブ中で非絶食血液を回収し、１，０００×ｇにおいて４℃において１５分間遠心分離した。上清を回収し、使用まで－８０℃において貯蔵した。血漿ＡＬＴレベルを、ＦＵＪＩ ＤＲＩ－ＣＨＥＭ ７０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｊａｐａｎ）により測定した。
血漿生化学的検査のため、抗凝固剤（Ｎｏｖｏ－Ｈｅｐａｒｉｎ、Ｍｏｃｈｉｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）を有するポリプロピレンチューブ中で非絶食血液を回収し、１，０００×ｇにおいて４℃において１５分間遠心分離した。上清を回収し、使用まで－８０℃において貯蔵した。血漿ＡＬＴレベルを、ＦＵＪＩ ＤＲＩ－ＣＨＥＭ ７０００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｊａｐａｎ）により測定した。
【0179】
肝トリグリセリド含有量の測定
肝総脂質抽出物をＦｏｌｃｈ法（Ｆｏｌｃｈ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５７；２２６：４９７）により得た。肝試料をクロロホルム－メタノール（２：１、ｖ／ｖ）中でホモジナイズし、室温において一晩インキュベートした。クロロホルム－メタノール－水（８：４：３、ｖ／ｖ／ｖ）を用いて洗浄した後、抽出物を蒸発乾固させ、イソプロパノール中で溶解させた。肝トリグリセリド含有量を、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ｅ－ｔｅｓｔ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）により測定した。
肝総脂質抽出物をＦｏｌｃｈ法（Ｆｏｌｃｈ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９５７；２２６：４９７）により得た。肝試料をクロロホルム－メタノール（２：１、ｖ／ｖ）中でホモジナイズし、室温において一晩インキュベートした。クロロホルム－メタノール－水（８：４：３、ｖ／ｖ／ｖ）を用いて洗浄した後、抽出物を蒸発乾固させ、イソプロパノール中で溶解させた。肝トリグリセリド含有量を、Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ｅ－ｔｅｓｔ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）により測定した。
【0180】
組織学的分析
ＨＥ染色のため、ブアン溶液中で前固定された肝組織のパラフィンブロックから切片を切断し、リリー・マイヤーヘマトキシリン（Ｍｕｔｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）及びエオシン溶液（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）により染色した。ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）をＫｌｅｉｎｅｒ（Ｋｌｅｉｎｅｒ ＤＥ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００５；４１：１３１３）の基準に従って計算した。
ＨＥ染色のため、ブアン溶液中で前固定された肝組織のパラフィンブロックから切片を切断し、リリー・マイヤーヘマトキシリン（Ｍｕｔｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｊａｐａｎ）及びエオシン溶液（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）により染色した。ＮＡＦＬＤ活動性スコア（ＮＡＳ）をＫｌｅｉｎｅｒ（Ｋｌｅｉｎｅｒ ＤＥ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００５；４１：１３１３）の基準に従って計算した。
【0181】
コラーゲン沈着を可視化するため、ピクロシリウスレッド溶液（Ｗａｌｄｅｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してブアン固定肝切片を染色した。線維症面積の定量的分析のため、デジタルカメラ（ＤＦＣ２９５；Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を２００倍の倍率において使用してシリウスレッド染色切片の明視野画像を中心静脈付近でキャプチャーし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を使用して５つの視野／切片の陽性面積を測定した。
【0182】
試料回収
血漿試料について、残りの血漿を回収し、更なる分析のために－８０℃において貯蔵した。
血漿試料について、残りの血漿を回収し、更なる分析のために－８０℃において貯蔵した。
【0183】
肝試料について、左側葉を回収し、６つの小片に切断した。左側葉の２つの小片、左及び右中葉並びに尾状葉を液体窒素中で急速冷凍し、更なる分析のために－８０℃において貯蔵した。左側葉の他の２つの小片をブアン溶液中で固定し、次いでパラフィン中に包埋した。試料を組織学的検査のために室温において貯蔵した。左側葉の残りの小片をＯ．Ｃ．Ｔ．化合物中で包埋し、液体窒素中で急速冷凍した。試料を更なる分析のために－８０℃において貯蔵した。
【0184】
統計的検定
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）でスチューデントｔ検定を使用して統計的分析を実行した。＜０．０５のＰ値を統計的に有意であるとみなした。トレンド又は傾向は、片側ｔ検定が＜０．１のＰ値を返した場合に仮定した。結果を平均±ＳＤとして表現した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）でスチューデントｔ検定を使用して統計的分析を実行した。＜０．０５のＰ値を統計的に有意であるとみなした。トレンド又は傾向は、片側ｔ検定が＜０．１のＰ値を返した場合に仮定した。結果を平均±ＳＤとして表現した。
【0185】
実験設計及び処置
試験群
第１群：ＡＤＰＩＦペプチド
６匹のＮＡＳＨマウスに、マウス１匹当たり２５ｍｇの用量におけるＡＤＰＩＦペプチドが補給されたビヒクルを、４～９週齢で週１回、脂肪組織中で皮下投与した。
試験群
第１群：ＡＤＰＩＦペプチド
６匹のＮＡＳＨマウスに、マウス１匹当たり２５ｍｇの用量におけるＡＤＰＩＦペプチドが補給されたビヒクルを、４～９週齢で週１回、脂肪組織中で皮下投与した。
【0186】
第２群：ビヒクル
６匹のＮＡＳＨマウスに、マウス１匹当たり１００ｍＬの容量におけるビヒクル［生理食塩水中のＤＭＳＯ］を、４～９週齢で週１回、脂肪組織中で皮下投与した。
６匹のＮＡＳＨマウスに、マウス１匹当たり１００ｍＬの容量におけるビヒクル［生理食塩水中のＤＭＳＯ］を、４～９週齢で週１回、脂肪組織中で皮下投与した。
【0187】
以下の表は、処置スケジュールをまとめる。
【0188】
【表2】
【0189】
動物監視及び犠死
生存率、臨床的兆候及び挙動を毎日監視した。処置前に体重を記録した。マウスを毒性、瀕死及び致死の有意な臨床的兆候について各投与の約６０分後に観察した。動物を、イソフルラン麻酔（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）下での直接心臓穿刺を介する放血により９週齢において犠死させた。
生存率、臨床的兆候及び挙動を毎日監視した。処置前に体重を記録した。マウスを毒性、瀕死及び致死の有意な臨床的兆候について各投与の約６０分後に観察した。動物を、イソフルラン麻酔（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）下での直接心臓穿刺を介する放血により９週齢において犠死させた。
【0190】
結果
体重変化及び全身状態
○体重変化
全ての群の平均体重は、処置期間の間に漸増した。処置期間のいずれの日においても、ＡＤＰＩＦペプチド群とビヒクル群との間の平均体重の有意差は見られなかった。
体重変化及び全身状態
○体重変化
全ての群の平均体重は、処置期間の間に漸増した。処置期間のいずれの日においても、ＡＤＰＩＦペプチド群とビヒクル群との間の平均体重の有意差は見られなかった。
【0191】
処置期間の間、全ての群の動物は死亡しなかった。本試験において、動物は全身状態の悪化を示さなかった。
【0192】
○肝トリグリセリド
ＡＤＰＩＦペプチド群は、ビヒクル群と比べて肝トリグリセリド含有量の有意な減少を示した。
ＡＤＰＩＦペプチド群は、ビヒクル群と比べて肝トリグリセリド含有量の有意な減少を示した。
【0193】
【表3】
【0194】
●シリウスレッド染色及び線維症面積
ビヒクル群からの肝切片は、肝小葉の末梢領域中の増加したコラーゲン沈着を示した。ＡＤＰＩＦペプチド群は、ビヒクル群と比べて線維症面積（シリウスレッド陽性面積）の有意な減少を示した。
ビヒクル群からの肝切片は、肝小葉の末梢領域中の増加したコラーゲン沈着を示した。ＡＤＰＩＦペプチド群は、ビヒクル群と比べて線維症面積（シリウスレッド陽性面積）の有意な減少を示した。
【0195】
【表4】
【0196】
結論
ＡＤＰＩＦペプチドによる処置は、ビヒクル群と比べて肝トリグリセリド含有量及び線維症面積の有意な減少を示した。ＡＤＰＩＦペプチドは、ビヒクル群と比べて線維症面積を有意に低減させ、このことは本試験において抗線維症効果を実証した。
ＡＤＰＩＦペプチドによる処置は、ビヒクル群と比べて肝トリグリセリド含有量及び線維症面積の有意な減少を示した。ＡＤＰＩＦペプチドは、ビヒクル群と比べて線維症面積を有意に低減させ、このことは本試験において抗線維症効果を実証した。
【0197】
まとめると、ＡＤＰＩＦペプチドは、このＮＡＳＨモデルにおいて抗線維症効果を示した。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3AB】
【図3CD】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】