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特許7362617Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の環境にやさしい抽出物を含む特にアンチエイジング効果を有する化粧品組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-06
(45)【発行日】2023-10-17
(54)【発明の名称】Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の環境にやさしい抽出物を含む特にアンチエイジング効果を有する化粧品組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 8/9794 20170101AFI20231010BHJP
A61K 8/34 20060101ALI20231010BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20231010BHJP
【ＦＩ】
A61K8/9794
A61K8/34
A61Q19/08
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2020534548
(86)(22)【出願日】2018-12-18
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-02-25
(86)【国際出願番号】 FR2018053367
(87)【国際公開番号】W WO2019122683
(87)【国際公開日】2019-06-27
【審査請求日】2021-10-04
(31)【優先権主張番号】1762974
(32)【優先日】2017-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(73)【特許権者】
【識別番号】302071210
【氏名又は名称】エルヴェエムアッシュ ルシェルシュ
(74)【代理人】
【識別番号】110000729
【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ニザール、カリーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ジャントン、オリビエ
(72)【発明者】
【氏名】ルブラン－ノブレッセ、エマニエル
(72)【発明者】
【氏名】ペッシェ、ヴィルジニー
【審査官】田中 雅之
(56)【参考文献】
【文献】特表２００９－５１０１５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１０－０４３０７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１５－１２４２０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００７／０２６４３６４（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ８／００－ ８／９９
Ａ６１Ｑ １／００－９０／００
Ｍｉｎｔｅｌ ＧＮＰＤ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ブチレングリコールを含むかまたはそれからなる、生態学的に優しく美容的に許容され得る極性溶媒を用いて生成された、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の抽出物を美容的に許容され得る賦形剤中に活性成分として含むことを特徴とする、化粧品組成物。
【請求項2】
前記植物の種子の抽出物が、環境に優しく美容的に許容され得る溶媒、グリコール、またはアルコールもしくは含水アルコール混合物を含む溶媒に再度溶解されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記グリコールが、プロピレングリコール、ブチレングリコールまたは１，３－ブチレングリコール、ペンチレングリコールおよびそれらの混合物から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
ロンゴザ種子の前記抽出物が、乾燥抽出物として表されるとき、前記組成物の総重量に基づいて、０．００１重量％～５重量％の濃度で存在することを特徴とする、請求項１～３の１項に記載の組成物。
【請求項5】
ロンゴザ種子の前記抽出物が、乾燥抽出物として表されるとき、前記組成物の総重量に基づいて、０．０１重量％～１重量％の濃度で存在することを特徴とする、請求項１～４の１項に記載の組成物。
【請求項6】
化粧品組成物を製造するための、生態学的に優しく美容的に許容され得る極性溶媒を用いて生成されたＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の抽出物の、化粧剤としての使用であって、前記抽出物は、請求項１～５のいずれか１項に定義されたとおりである、使用。
【請求項7】
ロンゴザ抽出物が、ＡＴＰシンターゼサブユニット６の刺激作用によって、アンチエイジング効果のために使用されることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
美容ケアを必要とする人物の皮膚への、美容有効量の請求項１～５のいずれか１項に定義されたＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の抽出物の局所適用を含むことを特徴とする、美容ケアプロセス。
【請求項9】
上述のＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子抽出物の適用が、しわを減少させるため、しわを無くすため、もしくはしわの出現を遅らせるため、またはミトコンドリア機能不全に起因する加齢作用に対抗するためのしわ対策効果、
あるいはＡＴＰシンターゼサブユニット６の刺激作用による、皮膚の構造を保つもしくは回復させる作用、皮膚の弾性および／もしくは張りに対する保護効果、修復効果または回復効果によるしわ対策効果、からなる群より選択されるアンチエイジングケアを必要とする皮膚の領域において行われることを特徴とする、請求項８に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、本質的に、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の環境にやさしい抽出物を活性成分として含むことを特徴とする、特にアンチエイジング効果を有する、化粧品組成物に関する。
【0002】
本発明は、特にアンチエイジング効果を有する特に化粧品組成物を製造するための化粧剤としてのＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の環境にやさしい抽出物の使用にも関する。
【0003】
本明細書中以後、明細書および請求項において、ロンゴザという用語は、単純化のために使用されるが、明らかにＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ植物のことも意味する。
【0004】
さらに、環境にやさしい抽出物は、その抽出物の生態学的および美容的な適合性をもたらす溶媒による抽出物を意味し、その溶媒は、例えば、ポリオール、特にグリコール、より詳細には、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ペンチレングリコールから選択されるグリコールを含むかまたはそれからなる極性溶媒である。この抽出物はまた、特定の実施形態によると、以下の理由で環境にやさしい。
ロンゴザ種子からなる再生可能な植物起源を使用すること；
廃溶媒、特にヘキサンまたはヘプタンなどの有機溶媒が存在しないこと、
ポリオール、特にグリコール、より詳細には、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ペンチレングリコールから選択されるグリコールを含むかまたはそれからなる化粧品において使用される代替の環境にやさしい溶媒を使用すること；
抽出プロセスが、特に第１の低温抽出、約５５℃という中温での第２の抽出を行うことによる、エネルギー消費量が少ないいくつかの工程を必要とすること；および
このプロセスが、産業上の実施可能性を維持しつつ、毒物学的なリスクを回避するためにロンゴザに含まれるテルペンのパーセンテージを上昇させず、色に影響が及ばないようにするはずであること。
ロンゴザ種子からなる再生可能な植物起源を使用すること；
廃溶媒、特にヘキサンまたはヘプタンなどの有機溶媒が存在しないこと、
ポリオール、特にグリコール、より詳細には、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ペンチレングリコールから選択されるグリコールを含むかまたはそれからなる化粧品において使用される代替の環境にやさしい溶媒を使用すること；
抽出プロセスが、特に第１の低温抽出、約５５℃という中温での第２の抽出を行うことによる、エネルギー消費量が少ないいくつかの工程を必要とすること；および
このプロセスが、産業上の実施可能性を維持しつつ、毒物学的なリスクを回避するためにロンゴザに含まれるテルペンのパーセンテージを上昇させず、色に影響が及ばないようにするはずであること。
【背景技術】
【0005】
関連技術
Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ植物をはじめとしたマダガスカルのいくつかの植物の種子から抽出された油の脂肪酸組成物に関する研究である、Ｒｅｖｕｅ ｆｒａｎｃａｉｓｅ ｄｅｓ Ｃｏｒｐｓ Ｇｒａｓ，Ｎｏ．１ ｏｆ Ｊａｎｕａｒｙ １９８３の２１～２５頁に公開されたＥ．Ｍ．Ｇａｙｄｏｕらによる論文（表１、続き２、２４頁を参照のこと）。それは、無極性溶媒、特にヘキサンを用いた、その植物の種子の抽出物である（２４頁、「実験の項」、第１パラグラフを参照のこと）。
Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ植物をはじめとしたマダガスカルのいくつかの植物の種子から抽出された油の脂肪酸組成物に関する研究である、Ｒｅｖｕｅ ｆｒａｎｃａｉｓｅ ｄｅｓ Ｃｏｒｐｓ Ｇｒａｓ，Ｎｏ．１ ｏｆ Ｊａｎｕａｒｙ １９８３の２１～２５頁に公開されたＥ．Ｍ．Ｇａｙｄｏｕらによる論文（表１、続き２、２４頁を参照のこと）。それは、無極性溶媒、特にヘキサンを用いた、その植物の種子の抽出物である（２４頁、「実験の項」、第１パラグラフを参照のこと）。
【0006】
さらに、ＡＮＤＲＥら、ＬＶＭＨ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥの特許である米国特許第７，３８１，４３６（Ｂ２）号には、７０／３０の体積比のエタノール／水の含水アルコール混合物から実際になる極性溶媒によるＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の抽出物を含む化粧品組成物が記載されている。この書類には、真皮表皮接合部もしくはＪＤＥに存在するコラーゲン、特にコラーゲンＶＩＩの合成を刺激する作用および／またはオキシタラン線維および／もしくはエラウニン線維に対する作用によるアンチエイジング効果；ならびに化学線の作用、特に紫外線に起因する作用から生じる加齢から皮膚を保護するアンチエイジング効果が記載されている。
【0007】
また、ＮＩＺＡＲＤ、ＬＶＭＨ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥの米国特許出願第２０１０／００５５２１７号は、ＡＮＤＲＥの上記特許と似ているが、相乗効果を得るためにリポクロナ（ｌｉｐｏｃｈｒｏｎａｅ）－６とともに用いられたロンゴザの含水アルコール抽出物が記載されている。
【0008】
さらに、Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１６，９ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２３（２）：３０３－３１４におけるＷｉｌｅｙらによる論文には、ミトコンドリア機能不全が、年齢とともに増加し、種々の分泌表現型を有するミトコンドリアの老化が誘導されることを示す研究結果が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】米国特許第７，３８１，４３６（Ｂ２）号明細書
【文献】米国特許出願第２０１０／００５５２１７号
【非特許文献】
【0010】
【文献】Ｒｅｖｕｅ ｆｒａｎｃａｉｓｅ ｄｅｓ Ｃｏｒｐｓ Ｇｒａｓ，Ｎｏ．１ ｏｆ Ｊａｎｕａｒｙ １９８３
【文献】Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．２０１６，９ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２３（２）：３０３－３１４
【発明の概要】
【0011】
発明の目的
本発明は、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の含水アルコール抽出物を含むこれまでに知られているアンチエイジング化粧剤と比べて、良好なアンチエイジング効果または改善されたアンチエイジング効果を有する、かつ／または美容目的での特に皮膚への局所適用の状況において非常に良好な適合性を有する、かつ／または副作用もしくは刺激作用がないもしくは実質的にない、化粧剤として、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の新規抽出物または活性成分を見出すための解決策を提供するという技術的課題を解決することを目的とする。
本発明は、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の含水アルコール抽出物を含むこれまでに知られているアンチエイジング化粧剤と比べて、良好なアンチエイジング効果または改善されたアンチエイジング効果を有する、かつ／または美容目的での特に皮膚への局所適用の状況において非常に良好な適合性を有する、かつ／または副作用もしくは刺激作用がないもしくは実質的にない、化粧剤として、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の新規抽出物または活性成分を見出すための解決策を提供するという技術的課題を解決することを目的とする。
【0012】
本発明はまた、ミトコンドリアの老化および皮膚の早期老化に至るミトコンドリア機能不全を遅らせることまたは予防することができるＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の新規抽出物または活性成分の助けを用いて、上記で述べた技術的課題を解決することも目的とする。
【0013】
また、本発明は、環境に有害な溶媒の使用を回避することで環境に優しい活性成分を得るためのプロセスを提供することによって上記の技術的課題を解決することを目的とし、そのプロセスは、エネルギーの必要量が少なく、工業規模、特に化粧品規模で使用するために十分な量が調製されるのを可能にする。
【発明を実施するための形態】
【0014】
発明の要旨
本発明は、上記で説明した技術的課題の解決策を、工業規模、特に化粧品規模で使用できる単純かつ安価な形式で提供する。
本発明は、上記で説明した技術的課題の解決策を、工業規模、特に化粧品規模で使用できる単純かつ安価な形式で提供する。
【0015】
第１の態様によると、本発明は、ポリオール、特にグリコールといった極性溶媒を含むかまたはそれからなる、生態学的に優しく美容的に許容され得る極性溶媒を用いて生成された、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の環境にやさしい抽出物と呼ばれる抽出物を美容的に許容され得る賦形剤中に活性成分として含むことを特徴とする化粧品組成物を提供する。
【0016】
第２の態様によると、本発明は、ポリオール、特にグリコールといった極性溶媒を含むかまたはそれからなる環境に優しく美容的に許容され得る溶媒を用いて生成された、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の環境にやさしい抽出物としても知られる抽出物の、化粧剤としての使用であって、化粧品組成物を製造するための使用にも関する。
【0017】
本発明の特定の実施形態によると、ロンゴザの環境にやさしい抽出物は、アンチエイジング効果を有する化粧剤として使用される。
【0018】
本発明の有益な代替の実施形態によると、ロンゴザ植物の種子の環境にやさしい抽出物は、しわ対策効果のために、特に、しわを減少させるため、しわを無くすため、もしくはしわの出現を遅らせるため、または特に、ミトコンドリアによるＡＴＰシンターゼ６の合成を刺激する作用を介して、皮膚の構造を保つもしくは回復させる作用のために、使用される。
【0019】
したがって、本発明は、ミトコンドリアの老化を予防して、アンチエイジング効果、特にしわ対策効果をもたらす、ミトコンドリアの活性の保護、修復および回復の効果を提供する。
【0020】
本発明はまた、特に紫外線に起因する化学線の作用から生じる加齢から皮膚を保護する。
【0021】
第３の態様によると、本発明は、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザの種子を抽出するための新規プロセスに関する。
【0022】
本発明の文脈において、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子は、生態学的に優しく美容的に許容され得る極性溶媒、特に、ポリオール、特にグリコールを含むかまたはそれからなる極性溶媒で抽出され、それにより、「環境にやさしい」抽出物が得られる。
【0023】
本発明の各態様において、使用されるポリオールは、一般化学式ＨＯ－Ｒ－ＯＨを有することがあり、式中、Ｒは、炭化水素ラジカル－（ＣＨ２）ｎを表すことがあり、ｎは、２～１６個の炭素原子、特に３～８個の炭素原子を有する。
【0024】
本発明の特定の実施形態によると、使用されるポリオールは、幅広く産業上利用可能かつ安価な一般的なグリコール（例えば、プロピレングリコール、ブチレングリコールまたは１，３－ブチレングリコール、ペンチレングリコールおよびそれらの混合物）である。
【0025】
別の代替の実施形態において、上記種子は、微粉に粉砕される。この粉末の粒は、０．０１～１ｍｍの直径を有することが有益である。
【0026】
さらに別の代替の実施形態において、抽出される材料が、溶媒ポリオール、特にグリコールによって使い果たされるまで、いくつかの逐次抽出が行われ得る。
【0027】
代替の実施形態によると、ポリオール、特にグリコールによる抽出は、いわゆる「低温」である室温において一度行い、２回目は約５５℃といった温度で行う。
【0028】
本発明の特定の実施形態によると、抽出プロセスは、１００％ポリオール、特にグリコールからなる極性溶媒で、粉砕された乾燥種子を抽出する少なくとも１つの工程を含む。代替の実施形態によると、植物／溶媒のｍ／ｖ比は、１／１．７５であり得る。
【0029】
別の代替の実施形態によると、適切な抽出の前に、粉砕された種子を、例えば１２～１５時間、室温における、ポリオール、特にグリコール中での穏やかな浸軟によって含浸し、それにより、目的の分子の入手可能性および利用可能性を高める。
【0030】
さらに別の代替物によると、浸軟の後、第１の濾過を行って、第１の濾液および粉砕された種子のケークを得て、次いで、そのケークを、中温、例えば約５５℃の中温において、数時間、例えば約３時間にわたって抽出し、次いで、例えば、２０～２５マイクロメートルの孔を有するフィルターにおいて濾過を行って、第２の濾液を得る。特定の代替物によると、得られた２つの濾液を合わせ、それらを、例えば０．５～０．１マイクロメートルの滅菌フィルターまたは非滅菌フィルターによって、再度濾過し得る。得られた溶液は、約１重量％の乾燥抽出物が得られるように、ポリオール、特にグリコール、または他の生体適合性の美容的に許容され得る溶媒で調整され得る。
【0031】
この抽出プロセスの特定の実施形態によると、ポリオール、特にグリコール中の抽出物は、本発明に係る活性成分または作用物質を本質的に構成する。
【0032】
別の特定の代替物によると、抽出溶媒を実質的に完全に蒸発させて乾燥抽出物を得ることが可能であり、その乾燥抽出物は、上述の活性成分などとして使用され得るか、または上述の活性成分の別の代替物を得るために、環境に優しく美容的に許容され得る溶媒（例えば、ポリオール、特にグリコール、もしくはアルコール、または含水アルコール混合物）に再度溶解され得る。
【0033】
本発明の別の有益な代替物によると、再溶解に使用される溶媒は、グリコールである。
【0034】
本発明の特定の実施形態によると、上で示されたように、産業上広く利用可能かつ安価な一般的なグリコール（例えば、プロピレングリコール、ブチレングリコールまたは１，３－ブチレングリコール、ペンチレングリコールおよびそれらの混合物）が使用される。特定の代替の実施形態は、ブチレングリコールを使用する。
【0035】
本発明の文脈において、得られる抽出物は、化粧剤として使用しやすく、水相に組み込まれるのかそれとも脂肪相に組み込まれるのかを問わず、調製される化粧品組成物の他の成分と混合しやすい。
【0036】
第５の態様によると、本発明は、美容ケアプロセスを必要とする人物の皮膚への、美容有効量の、先に定義されたようなＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の環境にやさしい抽出物と呼ばれる抽出物の局所適用を含むことを特徴とする美容ケアプロセスにも関する。
【0037】
本発明の有益な実施形態によると、この美容ケアプロセスは、上述のＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子抽出物を、アンチエイジングケアを必要とする皮膚の領域に適用するため、特に、ミトコンドリア機能不全に起因する加齢の作用に対抗するために、使用される。
【0038】
本発明の環境にやさしいグリコール抽出物は、エネルギー代謝に対して有意な影響を及ぼすことが予想外に発見された。アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）シンターゼは、ミトコンドリアのクリステに見られる酵素複合体である。この酵素の役割は、ＡＤＰ＋ＩＰ＝ＡＴＰが得られるように、電気化学勾配、および呼吸鎖によって維持されるアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、ならびに無機リン酸（ＩＰ）からＡＴＰを合成することである。
【0039】
ＡＤＰおよびＩＰは、細胞の生活に不可欠な真の分子モーターである。ＡＴＰは、化学エネルギーおよび力学的エネルギーに変換される化学エネルギーの唯一の形態である。
【0040】
ゆえに、本発明は、予想外にも、特にＡＴＰシンターゼサブユニット６の刺激作用によって、皮膚の構造を保つまたは回復させる作用、皮膚の弾性および／または張りを保護する、修復するおよび回復させる効果を有する。
【0041】
本発明は、アンチエイジング効果も有し、より詳細には、しわを減少させるため、しわを無くすため、またはしわの出現を遅らせるためのしわ対策効果を目的とする。
【0042】
本発明の任意の態様において、前記環境にやさしい抽出物は、乾燥抽出物または乾燥物質として表されるとき、組成物の総重量に基づいて、０．００１重量％～５重量％、特に０．０１重量％～１重量％の濃度で存在する。
【0043】
本発明の他の目的、特徴および利点は、本発明のいくつかの実施形態（例として提供され、本発明の範囲を決して限定しない）を含む以下の説明から当業者に明らかになるだろう。
【0044】
下記の実施例では、別段述べられない限り、すべてのパーセンテージは、重量基準で与えられ、温度は、室温、すなわち２５℃であるか、または摂氏温度で与えられ、圧力は、気圧である。
【実施例】
【0045】
本発明に係る実施例１
本発明に係る、グリコール、例えばブチレングリコールを用いた、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の環境にやさしい抽出物の研究室での調製の例
様々な市販のロットの２００ｇのロンゴザ植物種子から、以下の抽出手順を行う。
ａ）まず、商業的に入手可能な乾燥種子を粉砕して、例えば、０．０１ｍｍ～１ｍｍという平均粉末サイズにする。
ｂ）次いで、その粉末を、一定の室温において、３５０ｍＬのブチレングリコール中でまたは１／１．７５という種子／溶媒比（ｗ／ｖ）で約１２時間にわたって一晩浸軟する。
ｃ）浸軟の後、１回目の濾過を、例えば２０～２５マイクロメートルの孔を有するフィルターで行って、およそ２０ｇ／Ｌの乾燥残渣または浸軟汁および粉砕された種子のケークを含む不透明な橙赤色溶液を得ることによって、第１の濾液を得る。
ｄ）さらなる３５０ｍＬのブチレングリコールを用いた、そのケークに対する抽出を、中温、例えばおよそ５５℃において、数時間、例えばおよそ３時間にわたって、行う。
ｅ）２回目の濾過を、例えば２０～２５マイクロメートルの孔を有するフィルターで行って、第２の濾液を得て、およそ５ｇ／Ｌの乾燥残渣を含む不透明の橙色溶液を得る。
ｆ）特定の代替物によると、得られた２つの濾液または抽出物を合わせ、それらを、例えば０．５～０．１マイクロメートルの滅菌フィルターによって、再度濾過し得る。その濾液は、透明のやや橙色から橙色の溶液であり、その溶液に対して、活性成分のアッセイおよび薄層クロマトグラフィーおよび微生物学検査が行われ得る。
ｇ）得られた濾液または抽出溶液は、１０ｇ／Ｌという乾物含有量または約１重量％という乾物が得られるように、ブチレングリコールまたは他の生体適合性の美容的に許容され得る溶媒で調整され得る。
本発明に係る、グリコール、例えばブチレングリコールを用いた、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の環境にやさしい抽出物の研究室での調製の例
様々な市販のロットの２００ｇのロンゴザ植物種子から、以下の抽出手順を行う。
ａ）まず、商業的に入手可能な乾燥種子を粉砕して、例えば、０．０１ｍｍ～１ｍｍという平均粉末サイズにする。
ｂ）次いで、その粉末を、一定の室温において、３５０ｍＬのブチレングリコール中でまたは１／１．７５という種子／溶媒比（ｗ／ｖ）で約１２時間にわたって一晩浸軟する。
ｃ）浸軟の後、１回目の濾過を、例えば２０～２５マイクロメートルの孔を有するフィルターで行って、およそ２０ｇ／Ｌの乾燥残渣または浸軟汁および粉砕された種子のケークを含む不透明な橙赤色溶液を得ることによって、第１の濾液を得る。
ｄ）さらなる３５０ｍＬのブチレングリコールを用いた、そのケークに対する抽出を、中温、例えばおよそ５５℃において、数時間、例えばおよそ３時間にわたって、行う。
ｅ）２回目の濾過を、例えば２０～２５マイクロメートルの孔を有するフィルターで行って、第２の濾液を得て、およそ５ｇ／Ｌの乾燥残渣を含む不透明の橙色溶液を得る。
ｆ）特定の代替物によると、得られた２つの濾液または抽出物を合わせ、それらを、例えば０．５～０．１マイクロメートルの滅菌フィルターによって、再度濾過し得る。その濾液は、透明のやや橙色から橙色の溶液であり、その溶液に対して、活性成分のアッセイおよび薄層クロマトグラフィーおよび微生物学検査が行われ得る。
ｇ）得られた濾液または抽出溶液は、１０ｇ／Ｌという乾物含有量または約１重量％という乾物が得られるように、ブチレングリコールまたは他の生体適合性の美容的に許容され得る溶媒で調整され得る。
【0046】
このブチレングリコール抽出物は、特定の実施形態によると、以下の実施例に示されるように化粧品組成物を製造するための化粧剤または活性成分として使用され得る本発明に係るロンゴザまたはＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ種子の環境にやさしい抽出物を本質的に構成する（１ｇの抽出物）。このブチレングリコール溶液は、１重量％の乾燥抽出物を含む。
ｈ）この乾燥抽出物を本発明に係る化粧品組成物に組み込むために、美容的に許容され得る溶媒、特に、水、アルコール、１，３－ブチレングリコールまたはこれらの溶媒の混合物において前記組成物を製造する際に、その新鮮な溶液を調製することも可能である。ゆえに、この実施形態は、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の環境にやさしい乾燥抽出物の溶液を所望の濃度で調製することを可能にする。
ｉ）最後に、上に記載された抽出物の様々な溶液を包装して、所望の化粧品組成物を製造する際に使用するのを保留してもよい。この文脈では、まず、ポアの直径が０．２２μｍであるフィルターで濾過滅菌した後、適切な容積のボトルに包装し、次いで、低温室、例えば４℃において貯蔵することが推奨される。
ｈ）この乾燥抽出物を本発明に係る化粧品組成物に組み込むために、美容的に許容され得る溶媒、特に、水、アルコール、１，３－ブチレングリコールまたはこれらの溶媒の混合物において前記組成物を製造する際に、その新鮮な溶液を調製することも可能である。ゆえに、この実施形態は、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の環境にやさしい乾燥抽出物の溶液を所望の濃度で調製することを可能にする。
ｉ）最後に、上に記載された抽出物の様々な溶液を包装して、所望の化粧品組成物を製造する際に使用するのを保留してもよい。この文脈では、まず、ポアの直径が０．２２μｍであるフィルターで濾過滅菌した後、適切な容積のボトルに包装し、次いで、低温室、例えば４℃において貯蔵することが推奨される。
【0047】
平均して、１ｋｇの粉砕されたロンゴザまたはＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍの種子から約３～３．５ｋｇの抽出物が、ブチレングリコール中に１重量％の乾物で得られ、これは、３０～３５グラムの乾燥抽出物に対応する。得られる抽出質量収率は、以下のとおり計算して平均して３５％である：
質量収率＝最終抽出物中に含まれる乾燥抽出物の質量×１００／開始時に投入された粉砕された種子の質量。
質量収率＝最終抽出物中に含まれる乾燥抽出物の質量×１００／開始時に投入された粉砕された種子の質量。
【0048】
本発明に係る実施例２
本発明に係る、グリコール、例えばブチレングリコールによるＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の環境にやさしい抽出物の工業用のパイロット規模での調製の例
１）パイロット規模試験
パイロット規模試験１、２および３に対するＧ１、Ｇ２およびＧ３と特定される３つのロットの種子、ならびに下記に記載される適切な濾過システムに従って、マダガスカル由来のＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ種子のパイロット規模試験１つあたり１０ｋｇを処理するようにパイロット規模試験をデザインする。
本発明に係る、グリコール、例えばブチレングリコールによるＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子の環境にやさしい抽出物の工業用のパイロット規模での調製の例
１）パイロット規模試験
パイロット規模試験１、２および３に対するＧ１、Ｇ２およびＧ３と特定される３つのロットの種子、ならびに下記に記載される適切な濾過システムに従って、マダガスカル由来のＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ種子のパイロット規模試験１つあたり１０ｋｇを処理するようにパイロット規模試験をデザインする。
【0049】
２）パイロット規模試験における本発明に係る抽出手順
予め粉砕しておいたＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍの乾燥種子から１００％ブチレングリコールからなる極性溶媒を用いて１／１．７５という植物／溶媒の比（ｍ／ｖ）にて従来の方法で本発明に係る抽出物を生成し、それは、まず、ブチレングリコール中、室温における１２～１５時間の穏やかな浸軟によって植物を含浸して、目的の分子をより入手可能および利用可能にすることによって行う。第１の濾過工程を行って、濾液１を得る。
予め粉砕しておいたＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍの乾燥種子から１００％ブチレングリコールからなる極性溶媒を用いて１／１．７５という植物／溶媒の比（ｍ／ｖ）にて従来の方法で本発明に係る抽出物を生成し、それは、まず、ブチレングリコール中、室温における１２～１５時間の穏やかな浸軟によって植物を含浸して、目的の分子をより入手可能および利用可能にすることによって行う。第１の濾過工程を行って、濾液１を得る。
【0050】
第２の抽出を、上記ケークに対して５５℃において３時間行い、次いで、２０～２５μｍの孔を有するフィルターで濾過を行って、濾液２を得る。
【0051】
得られた２つの濾液１および２を合わせ、再度、０．５～０．１μｍフィルターで濾過する。
【0052】
得られた溶液を、１％乾燥抽出物となるようにブチレングリコールで調整する。
【0053】
結果は、透明のやや橙色のグリコール溶液である。
【0054】
上記３つのパイロット規模試験で得られた、３つのロットＧ１、Ｇ２およびＧ３の３つの抽出物を、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３と命名する。
【0055】
平均して、１０ｋｇの粉砕された種子から、ブチレングリコール中に１％ＤＭの約３０～３５ｋｇの抽出物が生成される（３００～３５０ｇの乾燥抽出物に対応する）。
【0056】
得られる抽出質量収率は、平均して３５％である。これは、以下のとおり計算される。
質量収率＝最終抽出物に含まれる乾燥抽出物の質量×１００／開始時に投入された粉砕された種子の質量。
質量収率＝最終抽出物に含まれる乾燥抽出物の質量×１００／開始時に投入された粉砕された種子の質量。
【0057】
３）抽出物の物理化学的解析
３－１）比較可能な乾燥重量（ＤＭ）：０．９６～１％（９．６ｇ／Ｌ～１０．０ｇ／Ｌ）
６．６の範囲内のｐＨ；比較可能な色調：７．８～７．９（Ｇａｒｄｎｅｒ）
Ｌａｂ値８７．８～８８．９；－３．３～－２．５；６７．７～６９．３。
３－２）総ポリフェノール：欧州薬局方の方法２．８．１４
試験量は、０．０５ｇ／サンプルである。読み取りは、可視域の７５０ｎｍで行う。
３－１）比較可能な乾燥重量（ＤＭ）：０．９６～１％（９．６ｇ／Ｌ～１０．０ｇ／Ｌ）
６．６の範囲内のｐＨ；比較可能な色調：７．８～７．９（Ｇａｒｄｎｅｒ）
Ｌａｂ値８７．８～８８．９；－３．３～－２．５；６７．７～６９．３。
３－２）総ポリフェノール：欧州薬局方の方法２．８．１４
試験量は、０．０５ｇ／サンプルである。読み取りは、可視域の７５０ｎｍで行う。
【0058】
【表1-1】
【0059】
０．０１２～０．０１６ｇ／Ｌの含有率が得られる。この含有率は、Ｅ２およびＥ３の種子抽出物とともに用いられた抽出物の場合にわずかに高いことが観察できる。
【0060】
４）全糖類の測定
アントロン－硫酸アッセイ法。読み取りは、６２０ｎｍで行う。
アントロン－硫酸アッセイ法。読み取りは、６２０ｎｍで行う。
【0061】
【表1-2】
【0062】
含有率は、Ｅ２およびＥ３の種子抽出物とともに用いられた抽出物の場合にわずかに高い。
【0063】
本発明に係るＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子からブチレングリコールによって環境にやさしい抽出物を得る、実施例２の本発明に係るプロセスと、Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子から７０／３０体積比のアルコール／水抽出物を得る、米国特許第７，３８１，４３６号の実施例１に係るプロセスとの比較実施例３。
３－１）この比較試験を行うために、以下の２つのサンプルを使用した：
ａ）含水アルコールエタノール／水混合物（７０／３０体積比）を抽出溶媒として使用する米国特許第７，３８１，４３６号の実施例１に記載されている抽出プロセスに供されたロットＳＸ０００ＨＨと呼ばれるマダガスカルのＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子である比較ロット。その抽出物を抽出物ロットＳＸ０００ＨＨと呼ぶ。
ｂ）本発明の上記実施例２に係る環境にやさしい抽出物Ｅ２。
３－２）ミトコンドリアによるＡＴＰシンターゼサブユニット６の合成に対する作用による、正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）細胞に対するロンゴザ（Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）の実施例２の環境にやさしい抽出物Ｅ２のアンチエイジング効果の測定
３－１）この比較試験を行うために、以下の２つのサンプルを使用した：
ａ）含水アルコールエタノール／水混合物（７０／３０体積比）を抽出溶媒として使用する米国特許第７，３８１，４３６号の実施例１に記載されている抽出プロセスに供されたロットＳＸ０００ＨＨと呼ばれるマダガスカルのＡｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍまたはロンゴザ植物の種子である比較ロット。その抽出物を抽出物ロットＳＸ０００ＨＨと呼ぶ。
ｂ）本発明の上記実施例２に係る環境にやさしい抽出物Ｅ２。
３－２）ミトコンドリアによるＡＴＰシンターゼサブユニット６の合成に対する作用による、正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）細胞に対するロンゴザ（Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）の実施例２の環境にやさしい抽出物Ｅ２のアンチエイジング効果の測定
【0064】
１．緒言
米国特許第７，３８１，４３６（Ｂ２）号の実施例１に係る以前の７０／３０体積比のエタノール／水の含水アルコール抽出物と比較した、実施例１のロンゴザ（Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）のブチレングリコールによる環境にやさしい抽出物の転写効果に関する研究を、ＴａｑＭａｎ低密度アレイ（ＴＬＤＡ）法を用いて評価した。この手法を用いて、正常ヒトケラチノサイトの処理に応答した、特定のタンパク質をコードする９６個の遺伝子の発現の調節を調べる。
米国特許第７，３８１，４３６（Ｂ２）号の実施例１に係る以前の７０／３０体積比のエタノール／水の含水アルコール抽出物と比較した、実施例１のロンゴザ（Ａｆｒａｍｏｍｕｍ ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｍ）のブチレングリコールによる環境にやさしい抽出物の転写効果に関する研究を、ＴａｑＭａｎ低密度アレイ（ＴＬＤＡ）法を用いて評価した。この手法を用いて、正常ヒトケラチノサイトの処理に応答した、特定のタンパク質をコードする９６個の遺伝子の発現の調節を調べる。
【0065】
処理の２４時間後、細胞単層を溶解して、ＲＮＡを回収した。これらのＲＮＡを定量し、正規化して、逆転写を行った。次いで、得られたｃＤＮＡを、ＮＨＦ、ＮＨＫおよびＮＨＭ ＴＬＤＡマイクロ流体カードにおいて９６個の「クロノバイオロジープロファイル」遺伝子を解析するために調製した。
【0066】
２．材料および方法
２．１．試験される活性な作用物質およびコントロールの活性な作用物質の調製
本発明に係る活性な作用物質１：上記の実施例２に係るマダガスカルのロンゴザ種子由来の１００％ブチレングリコール抽出物ＧＲＥＥＮ Ｅ２。
２．１．試験される活性な作用物質およびコントロールの活性な作用物質の調製
本発明に係る活性な作用物質１：上記の実施例２に係るマダガスカルのロンゴザ種子由来の１００％ブチレングリコール抽出物ＧＲＥＥＮ Ｅ２。
【0067】
比較用の活性な作用物質２：米国特許第７，３８１，４３６（Ｂ２）号の実施例１および上記の実施例３－１ａ）に係るマダガスカルのロンゴザ種子のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ７０／３０ｖ／ｖ混合物による抽出物。
【0068】
試験される最終濃度は、活性な作用物質１および活性な作用物質２に対して０．０１２５重量％である。
【0069】
２．２．細胞処理
本研究は、３１歳の女性ドナー（コード１４７７）の腹壁形成術で得られた正常ヒトケラチノサイトに対して行った。まず、継代数４（Ｐ４）の細胞を、１２ウェルプレートに１ウェルあたり１２５０００細胞の密度でＥｐｉｌｉｆｅ完全培地（ＨＫＧＳ補充）に播種した。次いで、その細胞を、０．０１２５％Ｐｅｒｌｅ ｄｅ Ｍａｄａｇａｓｃａｒ Ｇｒｅｅｎおよび０．０１２５％Ｐｅｒｌｅ ｄｅ Ｍａｄａｇａｓｃａｒならびにそれらのそれぞれの賦形剤コントロール（ＢＧ１００％およびＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ７０／３０ｖ／ｖ）で処理した。
本研究は、３１歳の女性ドナー（コード１４７７）の腹壁形成術で得られた正常ヒトケラチノサイトに対して行った。まず、継代数４（Ｐ４）の細胞を、１２ウェルプレートに１ウェルあたり１２５０００細胞の密度でＥｐｉｌｉｆｅ完全培地（ＨＫＧＳ補充）に播種した。次いで、その細胞を、０．０１２５％Ｐｅｒｌｅ ｄｅ Ｍａｄａｇａｓｃａｒ Ｇｒｅｅｎおよび０．０１２５％Ｐｅｒｌｅ ｄｅ Ｍａｄａｇａｓｃａｒならびにそれらのそれぞれの賦形剤コントロール（ＢＧ１００％およびＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ７０／３０ｖ／ｖ）で処理した。
【0070】
処理の４時間後、全ＲＮＡを抽出するために、細胞を回収する。
【0071】
２．３．ＴａｑＭａｎ低密度アレイ（ＴＬＤＡ）法
２．３．１．Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いた全ＲＮＡ抽出
細胞培養液を除去し、２５０μＬのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡトレースキット（製品コード７４０７０９、ロット番号１４１２／００１、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌに提供されるもの）を加える。細胞をセルスクレーパーでこそげ取り、次いで、細胞溶解産物を１．２ｍＬの深ウェル（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡキットに提供されるもの）に回収する。予め作成しておいたプロトコル（ＮＳ＿９６ＲＮＡ＿ＫＨＮまたはＮＳ＿９６ＲＮＡ＿ＦＨＮ．ｄｗｓ）に従って、全ＲＮＡを抽出する。
２．３．１．Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を用いた全ＲＮＡ抽出
細胞培養液を除去し、２５０μＬのＲＬＴ溶解緩衝液（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡトレースキット（製品コード７４０７０９、ロット番号１４１２／００１、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌに提供されるもの）を加える。細胞をセルスクレーパーでこそげ取り、次いで、細胞溶解産物を１．２ｍＬの深ウェル（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡキットに提供されるもの）に回収する。予め作成しておいたプロトコル（ＮＳ＿９６ＲＮＡ＿ＫＨＮまたはＮＳ＿９６ＲＮＡ＿ＦＨＮ．ｄｗｓ）に従って、全ＲＮＡを抽出する。
【0072】
得られた全ＲＮＡ溶液をアッセイし、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲに連結されたマイクロプレートリーダーＳＰＥＣＴＲＯｓｔａｒ Ｎａｎｏ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いてその溶液の品質をチェックする。このデバイスは、ロボットプラットフォームを制御するコンピュータに接続されており、結果を解析するための特定のソフトウェア（ＭＡＲＳソフトウェア）を備える。ロボットが行ったピペット操作ならびにＳＰＥＣＴＲＯｓｔａｒ Ｎａｎｏリーダーが生成した値を検証するために、この手法には、３８４ウェルマイクロプレート（３８４マイクロクリアブラックプレートＬｏＢａｓｅ、製品コード：７８８８７６ ロット：１３０５０５５ Ｇｒｅｉｎｅｒ）、ポジティブコントロール（ＲＮＡ２５０、製品コード：ＡＭ７１５５、ロット：１３０１０２８（ＮＨＦ）、ロット：１２０８０２５（ＮＨＫ）、ロット：１２０８０２６（ＮＨＭ），Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）が必要である。
【0073】
２．３．２．相補ＤＮＡの合成
使用する逆転写（ＲＴ）キットは、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（製品コード：４３６８８１３、ロット：００２８８６４７；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）であり、提供されるプロトコルに従って使用した。５００ｎｇの全ＲＮＡを、最終体積が２５μＬとなるように水で希釈する。次いで、それを２５℃で１０分間インキュベートし、次いで、下に示されるように予め調製しておいた２５μＬのＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔの２×反応混合物の存在下において３７℃で２時間インキュベートする。種々のインキュベーションをＴＲｏｂｏｔ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）において行う。
使用する逆転写（ＲＴ）キットは、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（製品コード：４３６８８１３、ロット：００２８８６４７；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）であり、提供されるプロトコルに従って使用した。５００ｎｇの全ＲＮＡを、最終体積が２５μＬとなるように水で希釈する。次いで、それを２５℃で１０分間インキュベートし、次いで、下に示されるように予め調製しておいた２５μＬのＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔの２×反応混合物の存在下において３７℃で２時間インキュベートする。種々のインキュベーションをＴＲｏｂｏｔ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）において行う。
【0074】
【表2】
【0075】
２．３．３．ＰＣＲ－ＴａｑＭａｎ低密度アレイ
１５μＬの各ＲＴを６０μＬの水と混合し、次いで、７５μＬのＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（製品コード：４３６９０１６、ロット：１５０７２３５；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を加える。均質化の後、１００μＬを９６遺伝子クロノバイオロジープロファイルマイクロ流体カード（ロットＢ１８８５（ＮＨＦ）、ロットＢ１８８４（ＮＨＫ）およびロットＢ１９４２（ＮＨＭ））の上に堆積させ、それを遠心し、次いでシールした。
１５μＬの各ＲＴを６０μＬの水と混合し、次いで、７５μＬのＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（製品コード：４３６９０１６、ロット：１５０７２３５；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を加える。均質化の後、１００μＬを９６遺伝子クロノバイオロジープロファイルマイクロ流体カード（ロットＢ１８８５（ＮＨＦ）、ロットＢ１８８４（ＮＨＫ）およびロットＢ１９４２（ＮＨＭ））の上に堆積させ、それを遠心し、次いでシールした。
【0076】
プレート上に堆積させた遺伝子のプロファイルに対応するＣＤをＳＤＳ２．４ソフトウェアにロードし、これにより、カード上の各遺伝子の位置を特定することが可能になる。結果を正規化するために使用されるコントロール遺伝子（このソフトウェアでは「内在性」遺伝子と呼ばれる）を、ＰＣＲを開始する前に指定する。ＰＣＲを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓが提供するプロトコルに従って、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍにおいて行う。ｑＰＣＲ工程は、５０℃で２分、９４．５℃で１０分、次いで９７℃で３０分、および５９．７℃で１分を４０サイクルである。
【0077】
２．３．４．結果の統計解析
リアルタイム定量的ＰＣＲは、その効率が９０％～１１０％である場合、活用できる。
リアルタイム定量的ＰＣＲは、その効率が９０％～１１０％である場合、活用できる。
【0078】
ＲＴ－ＰＣＲ／ＴＬＤＡ法では、ΔＣｔの比較法、すなわち、相対定量（ＲＱ）を用いて定量を行う。この方法は、各遺伝子に対するバックグラウンドノイズを考慮に入れるＲＱ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを使用して、カード上の各遺伝子のＣｔを測定する。このＣｔを、並行してそのカードにおいて調べたハウスキーピング遺伝子（本発明者らの研究ではベータ－２－ミクログロブリン）のＣｔに対して正規化する。この遺伝子は、細胞において不変であり、その変動は、実験（全ＲＮＡアッセイ、ピペット操作、逆転写工程、マイクロ流体カードへの堆積、カードの品質、装置におけるＰＣＲ）のばらつきを反映する。このＲＱ Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを用いて、本発明者らのコントロールと比較される発現の振幅レベル（コントロールよりもｘ倍高いまたは低い）に対応するＲＱ（相対定量）値を得る。前者は、無処置コントロールまたは賦形剤であり得る。以下の計算によってＲＱを得る（無処置の値は１に等しい）：
ＲＱ＝２－ΔΔＣｔ＝２－（処置ΔＣｔ－無処置ΔＣｔ）
処置ΔＣｔ＝Ｃｔ処置標的遺伝子－Ｃｔ処置ハウスキーピング遺伝子
無処置ΔＣｔ＝Ｃｔ無処置標的遺伝子－Ｃｔ無処置ハウスキーピング遺伝子
この方法が信頼できるものとなるためには、目的の遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の増幅効率が同じであることが肝要である。これは、プレートをルーチン的に使用する前の開発プロセス中に検証される。
ＲＱ＝２－ΔΔＣｔ＝２－（処置ΔＣｔ－無処置ΔＣｔ）
処置ΔＣｔ＝Ｃｔ処置標的遺伝子－Ｃｔ処置ハウスキーピング遺伝子
無処置ΔＣｔ＝Ｃｔ無処置標的遺伝子－Ｃｔ無処置ハウスキーピング遺伝子
この方法が信頼できるものとなるためには、目的の遺伝子およびハウスキーピング遺伝子の増幅効率が同じであることが肝要である。これは、プレートをルーチン的に使用する前の開発プロセス中に検証される。
【0079】
スチューデントのｔ検定を用いて、転写活性の統計学的に有意な変動を評価する。各条件を３つ組で行う（同じ条件下において３つの無処置および３つの処置）。まず、２つのデータ行列を比較することによって、フィッシャーのＦ検定を適用する。値がα＝０．０５より大きいとき、スチューデントのｔ検定の分散は２であり、フィッシャーのＦ検定がα＝０．０５未満であるとき、その分散は３に等しい。選択された転写の変動は、α＝０．０５より低いスチューデントのｔ検定に対応する変動である。
【0080】
【表3】
【0081】
予想される効果を考慮に入れた判定基準（増加の場合、＋、阻害の場合、－）によって、結果の第１の解釈を行うことが可能になる。
得られた効果が、予想される方向に行く場合は、上記のようにグレースケールコードが適用される。
得られた結果が、予想される効果と逆の場合、グレースケールコードは適用されないが、有意な結果であるため、結果は可視のままである。
得られた効果が、予想される方向に行く場合は、上記のようにグレースケールコードが適用される。
得られた結果が、予想される効果と逆の場合、グレースケールコードは適用されないが、有意な結果であるため、結果は可視のままである。
【0082】
Ｅｘｃｅｌマクロが、予想される方向に調節された遺伝子の数／調節された遺伝子の総数を示すので、これらのデータはすべて、互いに関連して抽出物を記述することができる。スクリーニングの文脈において、このスコアは、選択基準として使用できる。
【0083】
米国特許第７，３８１，４３６（Ｂ２）号の実施例１のエタノール／水７０／３０ｖｏｌ／ｖｏｌ含水アルコール混合物の前のロンゴザと比較した、４時間後の正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＫ）に対する、本発明の実施例２に係るロンゴザの環境にやさしいブチレングリコール抽出物Ｅ２の効果に関する結果。
【0084】
【表4】
【0085】
上記の結論として、ＮＨＫに対する上記試験によって、本発明に係るロンゴザの環境にやさしいブチレングリコール抽出物のミトコンドリア機能不全の有意な修復効果を実証することができ、この効果により、ミトコンドリア細胞の老化に対抗し、ゆえに、皮膚の加齢に対抗する。
【0086】
したがって、本発明は、ミトコンドリアを保つためおよび皮膚加齢に対抗するために局所使用するための化粧品組成物を調製するために化粧剤として使用できる。
【0087】
化粧品組成物の製剤の様々な実施例を下記に例証として示し、ゆえにそれらの実施例は、決して本発明の範囲を限定しない。
【0088】
本発明に係る実施例４
顔の張りを改善するための化粧品ゲル
・実施例１ｇ）で得られたロンゴザのブチレングリコール１００％の
環境にやさしい抽出物、 ２％
・グリコール ３％
・商業的に入手可能なＡＭＰＳポリマー
（商品名Ｓｅｐｉｇｅｌ３０５（登録商標）） ３％
・硬化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＣＯ－６０（登録商標）） ２％
・ポリエチレングリコール １．５％
・保存剤 ０．５％
・濃縮香料 ０．３％
・ＵＶフィルター（ベンゾフェノン－４） １％
・水、１００％まで十分量
このゲルは、特にしわのある領域の顔の皮膚の張りを改善するために、数週間にわたって１日１回、顔に適用することができ、この処置の終わりに、しなやかさの回復ならびに皮膚の若返りおよびこれらのしわの薄化または消失の明確な効果を観察する。
顔の張りを改善するための化粧品ゲル
・実施例１ｇ）で得られたロンゴザのブチレングリコール１００％の
環境にやさしい抽出物、 ２％
・グリコール ３％
・商業的に入手可能なＡＭＰＳポリマー
（商品名Ｓｅｐｉｇｅｌ３０５（登録商標）） ３％
・硬化ヒマシ油（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＣＯ－６０（登録商標）） ２％
・ポリエチレングリコール １．５％
・保存剤 ０．５％
・濃縮香料 ０．３％
・ＵＶフィルター（ベンゾフェノン－４） １％
・水、１００％まで十分量
このゲルは、特にしわのある領域の顔の皮膚の張りを改善するために、数週間にわたって１日１回、顔に適用することができ、この処置の終わりに、しなやかさの回復ならびに皮膚の若返りおよびこれらのしわの薄化または消失の明確な効果を観察する。
【0089】
本発明に係る実施例５
エマルジョンの形態のしわ対策デイクリーム
・実施例２で得られたロンゴザのブチレングリコール１００％の
環境にやさしい抽出物Ｅ１ ２％
・ステアレス－２１（Ｂｒｉｊ７２１） ２．５％
・ステアリン酸グリセリル（Ｔｅｇｒｉｎ） １．１％
・ステアリルアルコール ５％
・トリカプリル酸／カプリル酸グリセロール １２．５％
・ブチレングリコール ３％
・グリセリン ２％
・保存剤 ０．５％
・濃縮香料 ０．５％
・ＵＶフィルター（メトキシケイ皮酸オクチル） ７．５％
・水、１００％まで十分量
エマルジョンの形態のしわ対策デイクリーム
・実施例２で得られたロンゴザのブチレングリコール１００％の
環境にやさしい抽出物Ｅ１ ２％
・ステアレス－２１（Ｂｒｉｊ７２１） ２．５％
・ステアリン酸グリセリル（Ｔｅｇｒｉｎ） １．１％
・ステアリルアルコール ５％
・トリカプリル酸／カプリル酸グリセロール １２．５％
・ブチレングリコール ３％
・グリセリン ２％
・保存剤 ０．５％
・濃縮香料 ０．５％
・ＵＶフィルター（メトキシケイ皮酸オクチル） ７．５％
・水、１００％まで十分量
【0090】
本発明に係る実施例６
しわ対策トニックローション
・実施例２で得られたロンゴザのブチレングリコール１００％の
環境にやさしい抽出物Ｅ２ ２％
・ブチレングリコール ３％
・ＥＤＴＡ ０．１％
・可溶化剤 １％
・濃縮香料 ０．３％
・エタノール ５％
・ＵＶフィルター（ベンゾフェノン－４） ０．１３％
・水、１００％まで十分量
しわ対策トニックローション
・実施例２で得られたロンゴザのブチレングリコール１００％の
環境にやさしい抽出物Ｅ２ ２％
・ブチレングリコール ３％
・ＥＤＴＡ ０．１％
・可溶化剤 １％
・濃縮香料 ０．３％
・エタノール ５％
・ＵＶフィルター（ベンゾフェノン－４） ０．１３％
・水、１００％まで十分量
【0091】
本発明に係る実施例７
顔用の紫外線保護メーキャップパウダー
・実施例２で得られたロンゴザのブチレングリコール１００％の
環境にやさしい抽出物Ｅ３ ０．２５％
・タルカム １７％
・雲母 ２０％
・絹雲母 ２０％
・色素 ８％
・有機粉末（ナイロン） ２０％
・シリカ ８．７５％
・鉱油またはシリコーン ３％
・ＵＶフィルター（メトキシケイ皮酸オクチル） ３％
顔用の紫外線保護メーキャップパウダー
・実施例２で得られたロンゴザのブチレングリコール１００％の
環境にやさしい抽出物Ｅ３ ０．２５％
・タルカム １７％
・雲母 ２０％
・絹雲母 ２０％
・色素 ８％
・有機粉末（ナイロン） ２０％
・シリカ ８．７５％
・鉱油またはシリコーン ３％
・ＵＶフィルター（メトキシケイ皮酸オクチル） ３％
【0092】
本発明に係る実施例８
しわ対策トリートメントファンデーション
・実施例２で得られたロンゴザのブチレングリコール１００％の
環境にやさしい抽出物Ｅ２ ２％
・イソステアリン酸ポリグリセリル－４および
セチルジメチコンコポリオールおよびラウリン酸ヘキシル ５．１％
・シクロペンタシロキサンおよびシクロヘキサシロキサン ５．０％
・セチルジメチコン １．０％
・カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド ２．２％
・ステアリン酸オクチル １．４％
・鉱油 ３．５％
・硬化ヒマシ油 １．２％
・蜜ろう ０．８％
・ポリメタクリル酸メチル １．１％
・酸化鉄 ０．４５％
・二酸化チタン ５．２％
・ＮａＣｌ ０．６％
・濃縮香料 ０．１％
・ＵＶフィルター（ケイ皮酸オクチル） ３％
・水、１００％まで十分量
しわ対策トリートメントファンデーション
・実施例２で得られたロンゴザのブチレングリコール１００％の
環境にやさしい抽出物Ｅ２ ２％
・イソステアリン酸ポリグリセリル－４および
セチルジメチコンコポリオールおよびラウリン酸ヘキシル ５．１％
・シクロペンタシロキサンおよびシクロヘキサシロキサン ５．０％
・セチルジメチコン １．０％
・カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド ２．２％
・ステアリン酸オクチル １．４％
・鉱油 ３．５％
・硬化ヒマシ油 １．２％
・蜜ろう ０．８％
・ポリメタクリル酸メチル １．１％
・酸化鉄 ０．４５％
・二酸化チタン ５．２％
・ＮａＣｌ ０．６％
・濃縮香料 ０．１％
・ＵＶフィルター（ケイ皮酸オクチル） ３％
・水、１００％まで十分量