特許7362895シトクロムＣの活性が強化されたＬ－アミノ酸生産微生物およびこれを用いたＬ－アミノ酸の生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-06
(45)【発行日】2023-10-17
(54)【発明の名称】シトクロムＣの活性が強化されたＬ－アミノ酸生産微生物およびこれを用いたＬ－アミノ酸の生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20231010BHJP
C12P 13/08 20060101ALI20231010BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20231010BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20231010BHJP
C12R 1/15 20060101ALN20231010BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21
C12P13/08 A
C12N15/31 ZNA
C12N15/63 Z
C12R1:15
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2022506836
(86)(22)【出願日】2020-12-22
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-07
(86)【国際出願番号】 KR2020018896
(87)【国際公開番号】W WO2021133030
(87)【国際公開日】2021-07-01
【審査請求日】2022-02-02
(31)【優先権主張番号】10-2019-0173087
(32)【優先日】2019-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2019-0173088
(32)【優先日】2019-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
【微生物の受託番号】KCCM KCCM12640P
(73)【特許権者】
【識別番号】507406611
【氏名又は名称】シージェイ チェルジェダン コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】イ，ハン・ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】パク，サン・ミン
(72)【発明者】
【氏名】ベ，ヒュン・ウォン
(72)【発明者】
【氏名】ビュン，ヒョ・ジョン
(72)【発明者】
【氏名】シン，ヨン・ウク
(72)【発明者】
【氏名】イム，ボラム
(72)【発明者】
【氏名】ジャン，ジェウォン
(72)【発明者】
【氏名】ジュン，ム・ヨン
(72)【発明者】
【氏名】チョイ，ユン・ジョン
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００２／００４８７９５（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５３５２７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５０３３９５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２３５４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５１０６２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５２３８０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００４／００１４１８０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２００２－０１７３６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Database GenBank [online], Accession No.ADC50799.1 <URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ADC50799> 2014.01.30, [検索日2023.01.26] Definition: cytochrome c551 [Alkalihalophilus pseudofirmus OF4]
【文献】Database GenBank [online], Accession No.ADC49161.1 <URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ADC49161> 2014.01.30, [検索日2023.01.26] Definition: cytochrome c551 [Alkalihalophilus pseudofirmus OF4]
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
シトクロムＣの活性が強化された、Ｌ－アミノ酸生産微生物であって、
前記シトクロムＣは、バチルス・シュードファーマスＯＦ４（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓ ｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＯＦ４）由来のシトクロムＣ－５５１であり、
前記Ｌ－アミノ酸生産微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である、Ｌ－アミノ酸生産微生物。
【請求項2】
前記バチルス・シュードファーマスＯＦ４由来のシトクロムＣ－５５１は、ｃｃｃＡによってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｃｃｃＢによってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または、
これら両方を、含むものである、請求項１に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項3】
前記ｃｃｃＡは、配列番号１６のアミノ酸配列をコードするものである、請求項２に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項4】
前記ｃｃｃＢは、配列番号２７のアミノ酸配列をコードするものである、請求項２に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項5】
シトクロムＣの活性が強化されていない同種の非改変微生物と比較して、糖消耗速度が増加した、請求項１に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項6】
シトクロムＣの活性が強化されていない同種の非改変微生物と比較して、Ｌ－アミノ酸生産能が増加した、請求項１～５のいずれか１項に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項7】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リシンである、請求項６に記載のＬ－アミノ酸生産微生物。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載のＬ－アミノ酸生産微生物を培地で培養する工程と、前記培養された微生物、培地、またはこれらすべてからＬ－アミノ酸を回収する工程とを含む、Ｌ－アミノ酸の生産方法。
【請求項9】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リシンである、請求項８に記載のＬ－アミノ酸の生産方法。
【請求項10】
バチルス・シュードファーマスＯＦ４由来のシトクロムＣ－５５１をコードする遺伝子、または、
前記遺伝子を含む組換えベクター、を含む、コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるＬ－アミノ酸生産用組成物。
【請求項11】
前記バチルス・シュードファーマスＯＦ４由来のシトクロムＣ－５５１は、ｃｃｃＡによってコードされるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド、
ｃｃｃＢによってコードされるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチド、または
これら両方を含むものである、請求項１０に記載のＬ－アミノ酸生産用組成物。
【請求項12】
前記ｃｃｃＡは、配列番号１６のアミノ酸配列をコードするものである、請求項１１に記載のＬ－アミノ酸生産用組成物。
【請求項13】
前記ｃｃｃＢは、配列番号２７のアミノ酸配列をコードするものである、請求項１１に記載のＬ－アミノ酸生産用組成物。
【請求項14】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リシンである、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のＬ－アミノ酸生産用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１９年１２月２３日付の大韓民国特許出願第１０－２０１９－０１７３０８７号および２０１９年１２月２３日付の大韓民国特許出願第１０－２０１９－０１７３０８８号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
本出願は、２０１９年１２月２３日付の大韓民国特許出願第１０－２０１９－０１７３０８７号および２０１９年１２月２３日付の大韓民国特許出願第１０－２０１９－０１７３０８８号に基づく優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書の一部として含まれる。
【0002】
シトクロムＣ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ）の活性が強化された、Ｌ－アミノ酸生産微生物および前記微生物を用いたＬ－アミノ酸の生産方法が提供される。
【背景技術】
【0003】
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物はＬ－アミノ酸の生産に多く用いられているグラム陽性の微生物である。Ｌ－アミノ酸、特にＬ－リシンは動物飼料、人間の医薬品および化粧品産業に使用されており、主にコリネバクテリウム菌株を用いた発酵によって生成されている。
【0004】
コリネバクテリウム属菌株を用いたＬ－アミノ酸の製造方法を改善するために多くの試みが行われている。なかでも、組換えＤＮＡ技術を利用して特定の遺伝子をノックダウンさせるか減衰発現させることによってＬ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム菌株を改良しようとする研究がある。また、それぞれのＬ－アミノ酸の生合成に関連する遺伝子を増幅させてＬ－アミノ酸の生成に及ぼす効果を研究し、Ｌ－アミノ酸生産コリネバクテリウム菌株を改良するための研究が進められてきた。
【0005】
一方、発酵によるリシン生産産業において、高濃度のリシン生産および微生物のリシン生産能の増加は重要な要素である。したがって、微生物のリシン生産能の向上およびこれを発酵培養中に持続的に維持するための努力が続いてきた。しかし、微生物の活性を阻害させる多様な内部または外部要素によって培養後半までリシン生産能を維持しにくい問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、Ｌ－アミノ酸、例えば、Ｌ－リシンの生産能が向上し、持続的に維持可能な菌株の開発が要求されている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
一例は、シトクロムＣ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ）の活性が強化されたＬ－アミノ酸生産微生物を提供する。例えば、前記シトクロムＣの活性の強化は、シトクロムＣコード遺伝子の導入によるものであってもよい。例えば、前記シトクロムＣコード遺伝子は、外来遺伝子であってもよい。
【0008】
他の例は、前記Ｌ－アミノ酸生産微生物を培養する段階を含む、Ｌ－アミノ酸の生産方法を提供する。
【0009】
他の例は、シトクロムＣコード遺伝子、前記遺伝子を含む組換えベクター、またはこれらすべてを含む、微生物におけるＬ－アミノ酸生産用またはＬ－アミノ酸生産増進用組成物を提供する。
【0010】
本明細書で提供される一実施例において、コリネバクテリウム属微生物のリシン生産能の増加を目的として遺伝子を増幅してリシンの生産に及ぼす影響を確認し、これに基づいてアミノ酸生産のための菌株改良技術を提案する。一般に、リシンなどのアミノ酸の生産能増加のための方法として、菌株が有するリシンなどのアミノ酸生産収率を向上させるか、時間あたりのリシンなどのアミノ酸生産量（生産性）を増加させる方法などが挙げられる。特に、リシンなどのアミノ酸生産性は、発酵培地の成分、発酵培地の浸透圧、温度、撹拌速度、酸素供給速度などの多様な因子によって影響を受けられる。例えば、発酵液内に存在する多様な物質および代謝物によるストレス、微生物菌体の増加による酸素供給の低下、温度および撹拌速度のような物理条件などの問題によって微生物のリシン生産能および微生物の細胞活性は持続的に減少する。本明細書の一例では、このような多様な因子によるストレスを克服し、微生物の目的産物の生産活性を発酵後半まで維持できるようにする菌株の改良技術が提供される。
【0011】
以下、より詳しく説明する。
【0012】
一例は、シトクロムＣ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ）の活性が強化された、Ｌ－アミノ酸生産微生物を提供する。
【0013】
本明細書において、用語「Ｌ－アミノ酸生産微生物」は、Ｌ－アミノ酸生産能を有する微生物がシトクロムＣの活性が強化されたことにより増加したＬ－アミノ酸生産能を有する場合、および／またはＬ－アミノ酸生産能を有しない微生物がシトクロムＣの活性が強化されたことによりＬ－アミノ酸生産能を有する場合を意味するために使用できる。本明細書において、「微生物」は、単細胞バクテリアを包括するもので、「細胞」と交換可能に使用される。
【0014】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－リシンであってもよい。
【0015】
本明細書において、シトクロムＣの活性が強化される前の微生物を、前記シトクロムＣの活性が強化されてＬ－アミノ酸生産能が増加するかＬ－アミノ酸生産能が付与された「Ｌ－アミノ酸生産微生物」と区別するために、前記シトクロムＣの活性が強化される前の微生物を宿主微生物と表現することができる。
【0016】
一例において、前記宿主微生物は、Ｌ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リシン）生産能を有するすべての微生物から選択されたものであってもよい。一例において、前記宿主微生物は、自然にＬ－リシン生産能を有する微生物、またはＬ－リシン生産能がなかったり顕著に少ない親菌株に変異が導入されてＬ－リシン生産能を有する微生物であってもよい。
【0017】
一例において、前記宿主微生物は、自然にＬ－リシン生産能を有する微生物、またはＬ－リシン生産能がなかったり顕著に少ない親菌株に変異が導入されてＬ－リシン生産能を有するすべてのグラム陽性細菌、例えば、コリネバクテリウム属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）微生物およびエシェリキア属（ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）微生物からなる群より選択された１種以上であってもよい。前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・エフィシェンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）などを含むことができるが、必ずしもこれに限定されるものではない。例えば、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であってもよい。
【0018】
本明細書において、用語「シトクロムＣ」は、バクテリア由来であり、平均分子量１５ｋＤａ以下、例えば、約８ｋＤａ～約１５ｋＤａ程度、および／または９０～１５０個、１００～１５０個、１２０～１５０個、９０～１２５個、１００～１２５個、または１２０～１２５個のアミノ酸長であり、膜結合特性を有する単量体のシトクロムＣを意味する。一具体例において、前記シトクロムＣは、バチルス属微生物由来のものであってもよいし、還元状態で最も低い準位エネルギーの吸収バンド（吸光度）が現れる波長区間が５５０～５５５ｎｍまたは５５０～５５１ｎｍであるシトクロムＣの中から選択された１種以上であってもよい。一例において、前記シトクロムＣは、バチルス属微生物由来のシトクロムｃ－５５１（吸光度約５５１ｎｍ）、シトクロムｃ－５５０（吸光度約５５０ｎｍ）などからなる群より選択された１種以上、例えば、１種、２種、または３種であってもよい（前記シトクロムＣの後ろに記載された数値は吸光度を意味する）。前記バチルス属微生物は、バチルス・シュードファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【0019】
一例において、前記シトクロムＣ、例えば、シトクロムｃ－５５１およびシトクロムｃ－５５０の中から選択された１種以上は、それぞれ独立してｃｃｃＡまたはｃｃｃＢによってコードされるアミノ酸配列を含むものであってもよい。一具体例において、前記シトクロムＣは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＯＦ４など）および／またはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のシトクロムｃ－５５１、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のシトクロムｃ－５５０などからなる群より選択された１種以上であってもよい。
【0020】
より具体的には、前記シトクロムＣ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のシトクロムｃ－５５１）は、ｃｃｃＡ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＯＦ４由来のＢｐＯＦ４＿１３７４０）によってコードされるアミノ酸配列（例えば、配列番号１６）を含むポリペプチド、ｃｃｃＢ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＯＦ４由来のＢｐＯＦ４＿０５４９５）によってコードされるアミノ酸配列（例えば、配列番号２７）を含むポリペプチド、またはこれらすべてを含むものであってもよい。
【0021】
また、他に定義されない限り、本明細書に記載されたシトクロムＣは、一例として記載された配列番号１６または配列番号２７のアミノ酸配列と２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８２％以上、８５％以上、８７％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上（例えば、６０％～９９．５％、７０％～９９．５％、８０％～９９．５％、８５％～９９．５％、９０％～９９．５％、９１％～９９．５％、９２％～９９．５％、９３％～９９．５％、９４％～９９．５％、９５％～９９．５％、９６％～９９．５％、９７％～９９．５％、９８％～９９．５％、または９９％～９９．５％）の配列同一性を有するタンパク質を含む意味で解釈される。
【0022】
このように、本明細書に記載されたシトクロムＣの範疇に含むことが可能な前記配列同一性を有するタンパク質は、
（１）先に説明したシトクロムＣの特徴、例えば、（ａ）バクテリア由来、（ｂ）平均分子量１５ｋＤａ以下、例えば、約８ｋＤａ～約１５ｋＤａ程度、および／または９０～１５０、１００～１５０、１２０～１５０、９０～１２５、１００～１２５、または１２０～１２５のアミノ酸長、（ｃ）膜結合特性、および（ｄ）単量体特性のうちの１つ以上を有するか、および／または、
（２）微生物内の活性の強化による効果、例えば、非改変微生物に比べて、（ｅ）Ｌ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リシン）生産能の増加、および／または（ｆ）糖消耗速度の増加効果が前記例示された配列番号１６または配列番号２７のアミノ酸配列を含むタンパク質と同等程度レベルのものであってもよい。
（１）先に説明したシトクロムＣの特徴、例えば、（ａ）バクテリア由来、（ｂ）平均分子量１５ｋＤａ以下、例えば、約８ｋＤａ～約１５ｋＤａ程度、および／または９０～１５０、１００～１５０、１２０～１５０、９０～１２５、１００～１２５、または１２０～１２５のアミノ酸長、（ｃ）膜結合特性、および（ｄ）単量体特性のうちの１つ以上を有するか、および／または、
（２）微生物内の活性の強化による効果、例えば、非改変微生物に比べて、（ｅ）Ｌ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リシン）生産能の増加、および／または（ｆ）糖消耗速度の増加効果が前記例示された配列番号１６または配列番号２７のアミノ酸配列を含むタンパク質と同等程度レベルのものであってもよい。
【0023】
一例において、前記シトクロムＣの活性が強化されたＬ－アミノ酸生産微生物は、シトクロムＣの活性が強化されていない同種の非改変微生物と比較して、Ｌ－アミノ酸生産能が増加したものであってもよい。
【0024】
本明細書において、用語「シトクロムＣの活性の強化」は、微生物へのシトクロムＣの活性の導入を含む、微生物が持つ内在的活性または操作前の活性に比べてシトクロムＣの活性が向上できるすべての操作を意味することができる。前記「導入」は、微生物が本来もっていなかったシトクロムＣの活性が自然的あるいは人為的に現れることを意味する。用語「非改変微生物」は、シトクロムＣが強化されていない宿主微生物（例えば、シトクロムＣ活性を強化するために改変されていない宿主微生物）、または強化される前の宿主微生物を意味することができる。用語「内在的活性」は、シトクロムＣが強化されていない、または、強化される前の宿主微生物が本来持っていたシトクロムＣの活性を意味することができる。本明細書において、用語「非改変」は、遺伝的改変が誘導されていない、内在的活性を有する状態と同義に使用できる。
【0025】
例えば、シトクロムＣの活性の強化は、外来のシトクロムＣを導入して強化すること、または内在的シトクロムＣの活性を強化することをすべて含むことができる。一例において、シトクロムＣの活性の強化は、外来のシトクロムＣを導入して強化するものであってもよい。
【0026】
一例において、微生物におけるシトクロムＣの活性の強化は、前記微生物の糖消耗速度などがシトクロムＣの活性の強化されていない非改変微生物と比較して向上したことによって確認できる。特に、一具体例で例示されるシトクロムＣの活性強化された微生物は、非改変微生物と特定の増殖期間内の増殖速度（ＯＤ値）および／またはＬ－アミノ酸、例えば、Ｌ－リシン生産収率が類似し糖消耗速度が向上したものであってもよいし、これは、前記シトクロムＣの活性強化された微生物が、非改変微生物に比べて、より短時間内により多くのＬ－アミノ酸を生産して、Ｌ－アミノ酸の生産性が改善された特徴を有することを提案する。
【0027】
一例において、前記シトクロムＣの活性の強化は、シトクロムＣの遺伝子（ｍＲＮＡ）レベルおよび／またはタンパク質レベルでの発現量増加、および／またはシトクロムＣとしての活性増加によるものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0028】
一例において、前記シトクロムＣの活性の強化は、シトクロムＣをコードする遺伝子の導入によるものであってもよい。このようなシトクロムＣをコードする遺伝子の導入によって、Ｌ－アミノ酸生産能を有する微生物のＬ－アミノ酸生産能が増加するか、Ｌ－アミノ酸生産能を有しない微生物にＬ－アミノ酸生産能が付与される。
【0029】
一例において、前記シトクロムＣまたはこれをコードする遺伝子は、宿主微生物由来（内在）のもの、またはこれとは異なる微生物由来（外来）のものであってもよい。一具体例において、前記シトクロムＣの活性の強化は、宿主微生物に外来のシトクロムＣをコードするポリヌクレオチドを導入することによって行われる。前記シトクロムＣは先に説明した通りであり、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＯＦ４由来のシトクロムＣ（シトクロムｃ－５５１）であってもよいし、例えば、配列番号１６（例えば、ｃｃｃＡ（ＢｐＯＦ４＿１３７４０）によってコード）または配列番号２７（例えば、ｃｃｃＢ（ＢｐＯＦ４＿０５４９５）によってコード）のアミノ酸配列で表現されるものであってもよい。
【0030】
一例において、前記シトクロムＣをコードする遺伝子または前記遺伝子が導入されたＬ－アミノ酸生産微生物は、配列番号１６をコードするポリヌクレオチド、配列番号２７をコードするポリヌクレオチド、またはこれらすべてを含むものであってもよい。一具体例において、前記Ｌ－アミノ酸生産微生物は、配列番号１６をコードするポリヌクレオチド、配列番号２７をコードするポリヌクレオチド、またはこれらすべてを含むコリネバクテリウム属微生物、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であってもよい。例えば、前記Ｌ－アミノ酸生産微生物は、寄託番号ＫＣＣＭ１２６４０Ｐであってもよい。
【0031】
本明細書で使用されるポリヌクレオチド（「遺伝子」と交換可能に使用される）またはポリペプチド（「タンパク質」と交換可能に使用される）に関して、「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」、「特定の核酸配列またはアミノ酸配列からなる」、または、「特定の核酸配列またはアミノ酸配列として発現される」との表現は、等価的意味で相互交換可能な表現で、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を本質的に含むことを意味することができ、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの本来の機能および／または目的とする機能を維持する範囲で前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列に変異（欠失、置換、改変、および／または付加）が加えられた「実質的に同等の配列」を含む（または前記変異が導入されたものを排除しない）と解釈される。
【0032】
一例において、本明細書で提供される核酸配列またはアミノ酸配列は、これらの本来の機能または目的とする機能を維持する範囲で通常の突然変異誘発法、例えば、指向性進化法（ｄｉｒｅｃｔ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）および／または部位特異的突然変異法（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）などによって改変したものを含むことができる。一例において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を含む」というのは、前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、（ｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列を実質的に含むか、または、これから実質的になるか、または（ｉｉ）前記特定の核酸配列またはアミノ酸配列と６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上（例えば、６０％～９９．５％、７０％～９９．５％、８０％～９９．５％、８５％～９９．５％、９０％～９９．５％、９１％～９９．５％、９２％～９９．５％、９３％～９９．５％、９４％～９９．５％、９５％～９９．５％、９６％～９９．５％、９７％～９９．５％、９８％～９９．５％、または９９％～９９．５％）の相同性を有するアミノ酸配列を実質的に含むか、または、これから実質的になり、本来の機能および／または目的とする機能を維持することを意味することができる。本明細書において、前記本来の機能は、シトクロムＣの機能（アミノ酸配列の場合）、または前記シトクロムＣの機能を有するタンパク質をコードする機能（核酸配列の場合）であってもよく、前記目的とする機能は、微生物のＬ－アミノ酸（例えば、Ｌ－リシン）生産能を増加させるか付与する機能を意味することができる。
【0033】
本明細書に記載された核酸配列は、コドンの縮重性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）によって前記タンパク質（シトクロムＣ）を発現させようとする微生物で好まれるコドンを考慮して、コード領域から発現するタンパク質のアミノ酸配列および／または機能を変化させない範囲内でコード領域に多様な改変が行われる。
【0034】
本明細書において、用語「同一性」は、与えられた核酸配列またはアミノ酸配列と一致する程度を意味し、百分率（％）で表示される。核酸配列に対する同一性の場合、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（参照：ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３，１９９３）やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３，１９９０）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参照：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
【0035】
一例において、本明細書で提供される特定の核酸配列を含むポリヌクレオチドは、前記特定の核酸配列またはこれと実質的に同等の核酸配列だけでなく、前記特定の核酸配列に相補的な核酸配列を含むポリヌクレオチド断片を含むと解釈される。具体的には、前記相補性を有するポリヌクレオチドは、目的に応じて、当業者によって適切に調節可能なＴｍ値、例えば、５５℃、６０℃、６３℃または６５℃のＴｍ値でハイブリダイズし、後述の条件で分析することができる。このような条件は公知の文献に具体的に記載されている。例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８％以上、９９．５％以上、または９９．９％以上の高い相補性を有する遺伝子同士でハイブリダイズし、それより低い相補性を有する遺伝子同士はハイブリダイズしない条件、または通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ－ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）、および０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）；６０℃、０．１×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳ；または６８℃、０．１×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件などが挙げられるが、これに限定されるものではない。ハイブリダイズには２つのヌクレオチドが相補的配列を有することが要求されるか、ハイブリダイズのストリンジェシーにより塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が許容される。前記用語「相補的」は、互いにハイブリダイズ可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用できる。例えば、ＤＮＡの場合、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェシーはポリヌクレオチドの長さおよび相補性の程度に依存し、これはかかる技術分野にてよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ，９．５０－９．５１，１１．７－１１．８参照）。
【0036】
前記シトクロムＣの活性の強化のうちシトクロムＣの遺伝子（ｍＲＮＡ）レベルでの強化のための方法をより詳しく説明すれば、
１）前記シトクロムＣをコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の改変、または
３）前記１）および２）の組み合わせ、などを例示することができるが、これに限定されない。
１）前記シトクロムＣをコードするポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の改変、または
３）前記１）および２）の組み合わせ、などを例示することができるが、これに限定されない。
【0037】
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに限定されないが、前記ポリヌクレオチドがベクターを介して宿主微生物に導入されるか、前記ポリヌクレオチドが宿主微生物の染色体内に挿入されることによって行われる。例えば、前記コピー数の増加は、外来のシトクロムＣをコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主微生物内に導入して行われる。前記外来ポリヌクレオチドは、これがコードするシトクロムＣと同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限なく使用可能である。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適切に選択および／または改変して行われる。前記導入によって宿主微生物内で導入されたポリヌクレオチドが発現することによって外来シトクロムＣが生成されるようにできる。
【0038】
前記２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の改変は、外来ポリヌクレオチドおよび内在ポリヌクレオチドともに適用可能であり、特にこれに限定されないが、前記発現調節配列を発現調節活性がさらに強化されるようにヌクレオチドの欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで変異させるか、さらに強い活性を有する発現調節配列に切り替えることによって行われる。前記発現調節配列は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写および／または翻訳終結を調節する配列などからなる群より選択された１種以上であってもよい。一具体例において、発現増加のために、ポリヌクレオチド発現単位の上部に本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが作動可能に連結される。前記強力なプロモーターとして、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ－Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡまたはａｃｅＢプロモーターなどを例示することができる。さらに具体的には、前記強力なプロモーターは、コリネバクテリウム属由来プロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーター（ＷＯ２００９／０９６６８９）またはＣＪ７プロモーター（ＷＯ２００６／０６５０９５）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0039】
以下、前記説明したシトクロムＣをコードする遺伝子がベクターを介して宿主微生物に導入されるか、宿主微生物の染色体内に挿入される場合をより詳しく説明する。本明細書に記載された遺伝子の導入は、外来（宿主微生物と異種由来および／または同種の他の個体由来）の遺伝子が、ｉ）組換えベクターに作動可能に連結された形態で宿主細胞に導入されて行われるか、ｉｉ）宿主細胞の染色体（遺伝体）内に挿入（例えば、ランダム挿入）されることによって行われる。前記ｉｉ）宿主細胞の染色体（遺伝体）内に挿入される場合、挿入位置は宿主細胞の成長に影響がない位置（例えば、非転写スペーサー（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｐａｃｅｒ；ＮＴＳ）など）および／またはランダム挿入効率を高められる位置（例えば、レトロトランスポゾンなど）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0040】
前記遺伝子またはベクターの導入は、公知の形質転換方法を当業者が適切に選択して行われる。本明細書において、用語「形質転換」は、標的タンパク質（シトクロムＣ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主微生物内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主微生物内で発現できさえすれば、宿主微生物の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらすべてを含むことができる。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡおよびＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主微生物内に導入されて発現できるものであれば、その導入される形態は制限がない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自主的に発現するのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主微生物に導入される。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位および／または翻訳終結シグナルなどの発現調節要素を含むことができる。前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクター形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよい。前記において、用語「作動可能に連結」されているというのは、発現調節要素が目的タンパク質（シトクロムＣ）をコードするポリヌクレオチドの転写調節（例、転写開始）を行えるように発現調節要素（例、プロモーター）とポリヌクレオチドとが機能的に連結されていることを意味することができる。作動可能な連結は、当業界における公知の遺伝子組換え技術を利用して行うことができ、例えば、通常の部位－特異的ＤＮＡの切断および連結によって行われるが、これに限定されない。
【0041】
前記ポリヌクレオチドを宿主微生物に形質転換する方法は、核酸を細胞（微生物）内に導入するいかなる方法でも行うことが可能であり、宿主微生物により当分野にて公知の形質転換技術を適切に選択して行うことができる。前記公知の形質転換方法として、エレクトロポレーション法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿法、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿法、マイクロインジェクション法（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが例示されるが、これに限定されるものではない。
【0042】
前記遺伝子の宿主細胞遺伝体（染色体）内挿入は、公知の方法を当業者が適切に選択して行われ、例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼシステム（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ；例えば、（ａ）ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼ（例、Ｃａｓ９タンパク質など）、そのコード遺伝子、または前記遺伝子を含むベクター；および（ｂ）ガイドＲＮＡ（例、ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）など）、そのコードＤＮＡ、または前記ＤＮＡを含むベクターを含む混合物（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼタンパク質とガイドＲＮＡとの混合物など）、複合体（例えば、リボ核酸融合タンパク質（ＲＮＰ）、組換えベクター（例えば、ＲＮＡ－ガイドエンドヌクレアーゼコード遺伝子およびガイドＲＮＡコードＤＮＡを共に含むベクターなど）などからなる群より選択された１つ以上）を用いて行われるが、これに限定されるものではない。
【0043】
他の例において、シトクロムＣコード遺伝子、前記遺伝子を含む組換えベクター、および／または前記遺伝子または前記組換えベクターを含む細胞の微生物におけるＬ－アミノ酸生産能増加および／またはＬ－アミノ酸生産能付与のための用途が提供される。
【0044】
一例は、シトクロムＣをコードする遺伝子、前記遺伝子を含む組換えベクター、または前記遺伝子または前記組換えベクターを含む細胞を含むＬ－アミノ酸生産用組成物を提供する。
【0045】
他の例は、シトクロムＣコード遺伝子、前記遺伝子を含む組換えベクター、またはこれらすべてを含む、Ｌ－アミノ酸生産用組成物であってもよい。前記Ｌ－アミノ酸生産用組成物は、微生物におけるＬ－アミノ酸生産、Ｌ－アミノ酸生産能増加および／またはＬ－アミノ酸生産能付与のためのものであってもよい。
【0046】
他の例は、シトクロムＣコード遺伝子または前記遺伝子を含む組換えベクターを微生物に導入（形質転換）させる工程を含む、前記微生物のＬ－アミノ酸生産能の増加方法または前記微生物へのＬ－アミノ酸生産能の付与方法を提供する。
【0047】
前記シトクロムＣ、これをコードする遺伝子、および微生物は先に説明した通りである。
【0048】
本明細書において、用語「ベクター」は、好適な宿主内で目的タンパク質を発現させられるように好適な調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡコンストラクトを意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および／または転写および／または翻訳終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適当な宿主微生物内に形質転換された後、宿主微生物のゲノムと関係なく発現するか、宿主微生物のゲノム内に統合される。
【0049】
本明細書で使用可能なベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、通常使用されるすべてのベクターの中から選択可能である。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換えられた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージなどが挙げられる。例えば、前記ベクターとして、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、およびＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系およびｐＥＴ系などを使用することができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを例示することができるが、これに限定されない。
【0050】
本明細書で使用可能なベクターは、公知の発現ベクターおよび／またはポリヌクレオチドの宿主細胞染色体内挿入用ベクターであってもよい。前記ポリヌクレオチドの宿主細胞染色体内挿入は、当業界にて知られた任意の方法、例えば、相同組換えによって行われるが、これに限定されない。前記ベクターは、前記染色体内挿入の有無を確認するための選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）を追加的に含むことができる。前記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択、つまり、前記ポリヌクレオチドの挿入の有無を確認するためのもので、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能表現型を付与する遺伝子の中から選択されて使用できる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）が処理された環境では選択マーカーを発現する細胞のみ生存したり他の表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【0051】
他の例は、前記Ｌ－アミノ酸生産微生物を培地で培養する工程を含む、Ｌ－アミノ酸の生産方法を提供する。前記方法は、前記培養する工程の後に、前記培養された微生物、培地、またはこれらすべてからＬ－アミノ酸を回収する工程を追加的に含むことができる。
前記方法において、前記微生物を培養する工程は、特にこれに限定されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などによって行われる。この時、培養条件は、特にこれに限定されないが、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ６～８、最も具体的にはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素－含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。培養温度は２０～４５℃、または２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間培養することができるが、これに限定されるものではない。前記培養によって生産されたＬ－アミノ酸（例、Ｌ－リシン）は培地中に分泌されるか、細胞内に残留することができる。
前記方法において、前記微生物を培養する工程は、特にこれに限定されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などによって行われる。この時、培養条件は、特にこれに限定されないが、塩基性化合物（例：水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例：リン酸または硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的にはｐＨ６～８、最も具体的にはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素－含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。培養温度は２０～４５℃、または２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間培養することができるが、これに限定されるものではない。前記培養によって生産されたＬ－アミノ酸（例、Ｌ－リシン）は培地中に分泌されるか、細胞内に残留することができる。
【0052】
前記培養に使用可能な培地は、炭素供給源として、糖および炭水化物（例：グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプンおよびセルロース）、乳脂および脂肪（例：大豆油、ヒマワリ種子油、ピーナッツ油およびココナッツ油）、脂肪酸（例：パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸）、アルコール（例：グリセロールおよびエタノール）、有機酸（例：酢酸）などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用するか、または２種以上を混合して使用することができるが、これに限定されない。窒素供給源としては、窒素－含有有機化合物（例：ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉および尿素）、無機化合物（例：硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム）などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用するか、または２種以上を混合して使用することができるが、これに限定されない。リン供給源として、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などからなる群より選択された１種以上を個別的に使用するか、または２種以上を混合して使用することができるが、これに限定されない。また、前記培地は、その他の金属塩（例：硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸、および／またはビタミンなどのような必須成長－促進物質を含むことができる。
【0053】
前記Ｌ－アミノ酸（例、Ｌ－リシン）を回収する工程は、培養方法により当該分野にて公知の好適な方法を利用して培地、培養液、または微生物から目的とするアミノ酸を収集するものであってもよい。例えば、前記回収する工程は、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどから選択された１つ以上の方法で行われる。
【0054】
前記Ｌ－アミノ酸（例、Ｌ－リシン）を回収する方法は、その前、同時、またはその後に、精製工程を追加的に含むことができる。
【発明の効果】
【0055】
外来遺伝子の導入により、リシン生産菌株のリシン生産活性が増進し培養後半まで維持されることによって、リシン生産能を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0056】
【図1】一実施例で得られたライブラリーベクターの核酸配列の分析結果を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【0057】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これは例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限しようとするものではない。以下に記載の実施例は発明の本質的な要旨を逸脱しない範囲で改変できることは当業者にとって自明である。
【0058】
実施例１：遺伝子導入用ベクターライブラリーの作製
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のリシン生産能の向上に有効な遺伝子を探索するために、多様な極限環境で適応し生きていく極限微生物（ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）由来ゲノムＤＮＡライブラリー（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ）を作製した。極限微生物としては、高浸透圧、高温、低酸素、多様な水素イオン濃度の極限条件で増殖可能な代表微生物４種、つまり、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）（ＡＴＣＣ４９３３７）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＫＣＴＣ１０３０）、ラクトバチル・スファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）（ＫＣＴＣ３１１２）、およびバチルス・シュードファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ） ＯＦ４（ＡＴＣＣ ＢＡＡ２１２６）を使用した。
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のリシン生産能の向上に有効な遺伝子を探索するために、多様な極限環境で適応し生きていく極限微生物（ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）由来ゲノムＤＮＡライブラリー（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ）を作製した。極限微生物としては、高浸透圧、高温、低酸素、多様な水素イオン濃度の極限条件で増殖可能な代表微生物４種、つまり、バチルス・アトロファエウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ）（ＡＴＣＣ４９３３７）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＫＣＴＣ１０３０）、ラクトバチル・スファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）（ＫＣＴＣ３１１２）、およびバチルス・シュードファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ） ＯＦ４（ＡＴＣＣ ＢＡＡ２１２６）を使用した。
【0059】
まず、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて前記菌株４種からゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を抽出した。抽出されたゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）は、制限酵素Ｓａｕ３Ａ１（ＮＥＢ）を処理し、３７℃で１０分間反応後、６５℃で３０分間反応して不完全な遺伝子断片を作り、これを１％アガロースゲルに電気泳動して５～７ｋｂの遺伝子断片のみ取得した。取得した遺伝子断片は、ＧｅｎｅＡｌｌ Ｅｘｐｉｎ ＧＥＬ ＳＶ ｋｉｔ（ｓｅｏｕｌ、ＫＯＲＥＡ）を用いて挿入用遺伝子断片を溶出した。
【0060】
このように確保された遺伝子断片は、制限酵素ＢａｍＨＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）を３７℃で１時間反応、３７℃でＣＩＰ（ＮＥＢ）酵素３０分処理後に取得したｐＥＣＣＧ１１７ ｖｅｃｔｏｒ（大韓民国登録特許第００５７６８４号）にライゲーションした。得られた組み換えベクターを、大腸菌ＤＨ５αに形質転換してカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換されたコロニーは下記の表１の配列番号１および２のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ条件は９５℃で１０分間の変性後、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で４分間の伸長を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間の最終伸長を行った。
【0061】
【表1】
【0062】
前記ＰＣＲ増幅された遺伝子断片を通して３～５ｋｂの極限微生物（ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）由来ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）断片が挿入されたことを確認し、ｐＥＣＣＧ１１７ベクター内遺伝子挿入率は９９％以上であった。このように形質転換されたコロニーを菌株あたり１００００個確保し、ｐｌａｓｍｉｄ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを抽出し、これらそれぞれのライブラリーベクターをｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｂａｔ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ由来）、ｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｂｌｉ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来）、ｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｌｆｅ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ由来）、およびｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｂｐｓ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＯＦ４由来）とそれぞれ名付けた。
【0063】
実施例２：ベクターライブラリー導入菌株の作製およびスクリーニング
前記実施例１で作製されたライブラリーベクター４種（ｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｂａｔ、ｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｂｌｉ、ｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｌｆｅ、およびｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｂｐｓ）をリシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株（大韓民国登録特許第１０－０１５９８１２号）に電気パルス法（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．５２：５４１－５４５、１９９９）で形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれている複合平板培地に塗抹した。最終的に各ライブラリーベクターごとに約５０００個のコロニーを確保し、これをそれぞれＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｂａｔ、ＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｂｌｉ、ＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｌｆｅ、およびＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｂｐｓライブラリーと名付けた。前記ライブラリー菌株の対照群としては、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株にｇＤＮＡ由来遺伝子断片が挿入されていないｐＥＣＣＧ１１７ベクターを形質転換して使用し、ＬＹＳ＿１１７ ｃｏｎｔｒｏｌと名付けた。
前記実施例１で作製されたライブラリーベクター４種（ｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｂａｔ、ｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｂｌｉ、ｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｌｆｅ、およびｐ１１７－Ｌｉｂ．Ｂｐｓ）をリシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株（大韓民国登録特許第１０－０１５９８１２号）に電気パルス法（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．５２：５４１－５４５、１９９９）で形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれている複合平板培地に塗抹した。最終的に各ライブラリーベクターごとに約５０００個のコロニーを確保し、これをそれぞれＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｂａｔ、ＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｂｌｉ、ＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｌｆｅ、およびＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｂｐｓライブラリーと名付けた。前記ライブラリー菌株の対照群としては、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株にｇＤＮＡ由来遺伝子断片が挿入されていないｐＥＣＣＧ１１７ベクターを形質転換して使用し、ＬＹＳ＿１１７ ｃｏｎｔｒｏｌと名付けた。
【0064】
前記使用された複合平板培地の組成は次の通りである。
＜複合平板培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖 １０ｇ、ペプトン １０ｇ、ビーフ抽出物（Ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ） ５ｇ、酵母抽出物 ５ｇ、ブレイン・ハート・インフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ） １８．５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、尿素 ２ｇ、ソルビトール ９１ｇ、寒天 ２０ｇ（蒸留水１リットル基準）
＜複合平板培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖 １０ｇ、ペプトン １０ｇ、ビーフ抽出物（Ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ） ５ｇ、酵母抽出物 ５ｇ、ブレイン・ハート・インフュージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ） １８．５ｇ、ＮａＣｌ ２．５ｇ、尿素 ２ｇ、ソルビトール ９１ｇ、寒天 ２０ｇ（蒸留水１リットル基準）
【0065】
前記確保された４種のＫＣＣＭ１１０１６Ｐベースのライブラリー菌株は、それぞれ４００ｕｌのスクリーニング培地が含まれている９６－Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅ－Ｄｏｍｅ（Ｂｉｏｎｅｅｒ）にｃｏｌｏｎｙ－ｐｉｃｋｅｒ（ＳＩＮＧＥＲ、ＰＩＸＬ）を用いて接種し、ｐｌａｔｅ ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（ＴＡＩＴＥＣ）で３２℃、１２０００ｒｐｍの条件で１５時間の間培養した。
【0066】
前記使用された種培地の組成は次の通りである。
＜スクリーニング培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖 ４５ｇ、サトウダイコン由来糖蜜 １０ｇ、大豆浸漬液 １０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５５ｇ、尿素 ５．５ｇ、ビオチン ０．９ｍｇ、チアミンＨＣｌ ４．５ｍｇ、カルシウム－パントテン酸 ４．５ｍｇ、ニコチンアミド ３０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ＺｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．４５ｍｇ、ＦｅＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、カナマイシン ２５ｍｇ（蒸留水１リットル基準）
＜スクリーニング培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖 ４５ｇ、サトウダイコン由来糖蜜 １０ｇ、大豆浸漬液 １０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５５ｇ、尿素 ５．５ｇ、ビオチン ０．９ｍｇ、チアミンＨＣｌ ４．５ｍｇ、カルシウム－パントテン酸 ４．５ｍｇ、ニコチンアミド ３０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ＺｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．４５ｍｇ、ＦｅＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、カナマイシン ２５ｍｇ（蒸留水１リットル基準）
【0067】
培養中の細胞成長はマイクロプレート－リーダー（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－ｒｅａｄｅｒ、ＢｉｏＴｅｋ）を用いてモニタリングし、培養液内に存在するブドウ糖の濃度および生成されたリシンの濃度はそれぞれ糖分析器（ＹＳＩ）およびＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）分析機器を用いて測定した。
【0068】
前記実験を通して最終的に対照群に比べて細胞成長に優れ、ブドウ糖の消耗速度が速い菌株３種を選別した（表２）。選別された菌株３種はＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｂｐｓライブラリーベクターが挿入された菌株であり、対照群菌株であるＬＹＳ＿１１７ ｃｏｎｔｒｏｌに比べて収率およびＯＤ値は類似しているが、サンプリングポイント区間の時間あたりの糖消耗速度（ｇ／時間）がＬＹＳ＿１１７ ｃｏｎｔｒｏｌ １００％対比１１８％水準に増加し、生産性に優れていることを確認した。
【0069】
【表2】
【0070】
実施例３：ｇＤＮＡライブラリー塩基配列の分析
前記実施例２で選別されたコロニー３種ＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｂｐｓ＃２５７、＃８８１、および＃４２１３に挿入された遺伝子の配列を確認するために、実施例１の表１に記載された配列番号１と２のプライマーを用いて前記コロニーが持つｇＤＮＡライブラリー遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は実施例１と同様に進行させ、増幅されたＤＮＡ断片をＧｅｎｅＡｌｌ Ｅｘｐｉｎ ＧＥＬ ＳＶ ｋｉｔ（ｓｅｏｕｌ、ＫＯＲＥＡ）を用いて取得し塩基配列分析を進行させた。分析結果はＢＬＡＳＴを通して遺伝子情報を確認した（ＮＣＢＩ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＣ＿０１３７９１．２）。
前記実施例２で選別されたコロニー３種ＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｂｐｓ＃２５７、＃８８１、および＃４２１３に挿入された遺伝子の配列を確認するために、実施例１の表１に記載された配列番号１と２のプライマーを用いて前記コロニーが持つｇＤＮＡライブラリー遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件は実施例１と同様に進行させ、増幅されたＤＮＡ断片をＧｅｎｅＡｌｌ Ｅｘｐｉｎ ＧＥＬ ＳＶ ｋｉｔ（ｓｅｏｕｌ、ＫＯＲＥＡ）を用いて取得し塩基配列分析を進行させた。分析結果はＢＬＡＳＴを通して遺伝子情報を確認した（ＮＣＢＩ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＮＣ＿０１３７９１．２）。
【0071】
前記得られた分析結果を図１に示した。図１に示されているように、遺伝子塩基配列の分析結果、ＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｂｐｓ ＃２５７コロニーには４７９４ｂｐ、＃８８１コロニーには３９８５ｂｐ、そして＃４２１３コロニーには４４８３ｂｐの遺伝子断片が含まれていた。前記３つのコロニーに共通して含まれている完全な遺伝子ＯＲＦはＢｐＯＦ４＿１３７３５とＢｐＯＦ４＿１３７４０であると確認され、以後、前記２つの遺伝子の影響性に対する追加実験を進行させた。
【0072】
実施例４：個別遺伝子導入ベクターの作製および菌株の作製
前記実施例３で確認された遺伝子２つに対する個別遺伝子の影響性を確認するために、ゲノム挿入用ベクターを作製した。まず、遺伝子挿入のための基盤ベクターを作製するために、トランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）のうちの１つであるＮｃｇｌ２２８４遺伝子をターゲットとしてｐＤＺ＿Δ２２８４ベクターを作製した。
前記実施例３で確認された遺伝子２つに対する個別遺伝子の影響性を確認するために、ゲノム挿入用ベクターを作製した。まず、遺伝子挿入のための基盤ベクターを作製するために、トランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）のうちの１つであるＮｃｇｌ２２８４遺伝子をターゲットとしてｐＤＺ＿Δ２２８４ベクターを作製した。
【0073】
具体的には、ＰＣＲを進行させるためのＤＮＡ鋳型としてＡＴＣＣ１３０３２ ｇＤＮＡを用い、ＮＣＢＩ塩基配列（ＮＣ＿００３４５０．３）を参照してプライマーを作製した。配列番号３と４のプライマーで９５℃で１０分間の変性後、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間の伸長反応を行う条件でＰＣＲを進行させて約９００ｂｐの５’ＤＮＡ断片を得た。同様に、プライマー配列番号５と６を用いて前記と同一の条件でＰＣＲを進行させて３’ＤＮＡ断片を増幅した。増幅された２つのＤＮＡ断片はＧｅｎｅＡｌｌ Ｅｘｐｉｎ ＧＥＬ ＳＶ ｋｉｔ（ｓｅｏｕｌ、ＫＯＲＥＡ）を用いて精製し、制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ）で処理した後、６５℃で２０分間熱処理したｐＤＺ（大韓民国特許第２００９－００９４４３３号）ベクターとＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。前記菌株をカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）が含まれているＬＢ固体培地に塗抹し、ｐＤＺベクターに挿入された遺伝子の塩基配列を確認して、最終的にｐＤＺ＿Δ２２８４ベクターを調製した。
【0074】
個別遺伝子の追加強化（発現）ベクターは前記基盤ベクターｐＤＺ＿Δ２２８４を制限酵素ＮｄｅＩおよびＣＩＰ（ＮＥＢ）処理し、６５℃で２０分間熱処理して精製後に取得したベクターとプロモーター、それぞれの遺伝子ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔで連結して作製した。前記遺伝子の追加発現のためのプロモーターは配列番号１３のｇａｐＡ遺伝子プロモーターを用い、これを取得するために、ＡＴＣＣ１３０３２ ｇＤＮＡ（ＮＣ＿００３４５０．３）を鋳型としてプライマー配列番号７と８を用いてＰＣＲ増幅を進行させた。ＰＣＲはｐｆｕ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、９５℃で１０分間の変性後、９５℃で１分間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を３０回繰り返した後、７２℃で１０分間の伸長反応する条件で進行させた。２つの遺伝子ＢｐＯＦ４＿１３７３５とＢＰＯＦ４＿１３７４０ ＤＮＡ断片はプロモーターＰＣＲと同様の方法で進行させ、ＢｐＯＦ４＿１３７３５遺伝子（配列番号１４）のためには配列番号９と１０のプライマーを用い、ＢｐＯＦ４＿１３７４０（配列番号１５）のためには、配列番号１１と１２のプライマーを用いてＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＯＦ４ ｇＤＮＡから遺伝子を増幅した。このように取得したＤＮＡ断片はＧｅｎｅＡｌｌ Ｅｘｐｉｎ ＧＥＬ ＳＶ ｋｉｔ（ｓｅｏｕｌ、ＫＯＲＥＡ）を用いて精製して、ｐＤＺ＿Δ２２８４ベクターと連結して２種のベクターを作製した。最終的にｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７３５ベクター、およびｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０ベクターを作製した。
【0075】
前記作製された２種のベクターはリシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株（大韓民国登録特許第１０－０１５９８１２号）に電気パルス法で形質転換し、２次ＤＮＡ－ｃｒｏｓｓｏｖｅｒを経てそれぞれの遺伝子が強化された菌株を作製した。このように作製された菌株２種はＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７３５、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０と名付けた。
【0076】
前記使用されたプライマー、プロモーター、ＢｐＯＦ４遺伝子の核酸配列、および前記遺伝子がコードするアミノ酸配列を下記の表３にまとめた。
【0077】
【表3】
【0078】
実施例５：個別遺伝子挿入菌株のリシン生産能の分析
前記実施例４で作製された菌株２種を以下の方法で培養して、ＯＤ、リシン生産収率、および糖消耗速度（ｇ／時間）を測定した。まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、１５０ｒｐｍで振盪培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃で４０時間、１５０ｒｐｍで振盪培養した。前記種培地と生産培地の組成はそれぞれ下記の通りであり、培養結果は表４に示した。
前記実施例４で作製された菌株２種を以下の方法で培養して、ＯＤ、リシン生産収率、および糖消耗速度（ｇ／時間）を測定した。まず、種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃で２０時間、１５０ｒｐｍで振盪培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃で４０時間、１５０ｒｐｍで振盪培養した。前記種培地と生産培地の組成はそれぞれ下記の通りであり、培養結果は表４に示した。
【0079】
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖 ２０ｇ、ペプトン １０ｇ、酵母抽出物 ５ｇ、尿素 １．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン １００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、カルシウム－パントテン酸 ２０００μｇ、ニコチンアミド ２０００μｇ（蒸留水１リットル基準）
ブドウ糖 ２０ｇ、ペプトン １０ｇ、酵母抽出物 ５ｇ、尿素 １．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン １００μｇ、チアミンＨＣｌ １０００μｇ、カルシウム－パントテン酸 ２０００μｇ、ニコチンアミド ２０００μｇ（蒸留水１リットル基準）
【0080】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖 ４５ｇ、サトウダイコン由来糖蜜 １０ｇ、大豆浸漬液 １０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５５ｇ、尿素 ５．５ｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ、ビオチン ０．９ｍｇ、チアミンＨＣｌ ４．５ｍｇ、カルシウム－パントテン酸 ４．５ｍｇ、ニコチンアミド ３０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ＺｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．４５ｍｇ、ＦｅＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、カナマイシン ２５ｍｇ（蒸留水１リットル基準）
ブドウ糖 ４５ｇ、サトウダイコン由来糖蜜 １０ｇ、大豆浸漬液 １０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．５５ｇ、尿素 ５．５ｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ、ビオチン ０．９ｍｇ、チアミンＨＣｌ ４．５ｍｇ、カルシウム－パントテン酸 ４．５ｍｇ、ニコチンアミド ３０ｍｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、ＺｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．４５ｍｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．４５ｍｇ、ＦｅＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ９ｍｇ、カナマイシン ２５ｍｇ（蒸留水１リットル基準）
【0081】
【表4】
【0082】
ｇＤＮＡライブラリーを通して確保された２つの遺伝子のうちＢｐＯＦ４＿１３７３５を過発現させた菌株は、親菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４に比べてリシン収率および糖消耗速度で有意に向上した効果が現れなかった。しかし、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０菌株は、親菌株に比べて発酵最終ＯＤおよび収率は類似しているが、培養中間区間（１７～２４時間）への時間あたりの糖消耗速度が親菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４対比３１．５％増加する結果を確認した。
【0083】
最終的に実施例２で確認されたコロニーＬＹＳ＿Ｌｉｂ．Ｂｐｓ＃２５７、＃８８１、＃４２１３菌株の効果はＢｐＯＦ４＿１３７４０の強化による効果であることを確認した。
【0084】
実施例６：ＢｐＯＦ４＿１３７４０遺伝子強化菌株のリシン生産能の向上
前記実施例５で確認されたＢｐＯＦ４＿１３７４０遺伝子の効果を２次検証するために、他のプロモーターで遺伝子強化を実施した後、ＢｐＯＦ４＿１３７４０遺伝子を分析した。また、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ分析で追加確認されたＢｐＯＦ４＿０５４９５遺伝子に対しても効果の確認を進行させた。
前記実施例５で確認されたＢｐＯＦ４＿１３７４０遺伝子の効果を２次検証するために、他のプロモーターで遺伝子強化を実施した後、ＢｐＯＦ４＿１３７４０遺伝子を分析した。また、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ分析で追加確認されたＢｐＯＦ４＿０５４９５遺伝子に対しても効果の確認を進行させた。
【0085】
このために、遺伝子発現ベクターを追加的に作製した。前記実施例３で作製したベクターと同様の過程でベクターを作製した。
【0086】
ＡＴＣＣ１３０３２ ｇＤＮＡを鋳型として配列番号１７と１８のプライマーを用いてＰＣＲを進行させてｓｉｇＢプロモーターを増幅し、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ ＯＦ４ ｇＤＮＡを鋳型として配列番号１９と１２のプライマーを用いてＢｐＯＦ４＿１３７４０遺伝子をＰＣＲ増幅した。これら２つの遺伝子断片をｐＤＺ＿Δ２２８４ベクターと連結してｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０ベクターを追加作製した。
【0087】
ＢｐＯＦ４＿０５４９５遺伝子の強化も同様の方法で実施してｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿０５４９５およびｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿０５４９５ベクターを作製した。プライマーは配列番号２０と２１、配列番号２２と２１を用いてＢｐＯＦ４＿０５４９５遺伝子断片を確保した。一方、これら２つの遺伝子の同時強化の効果も確認するために、リボソーム付着配列（ＲＢＳ）を挿入した配列番号２３、２４プライマーを追加して、ｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５およびｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５ベクターも作製した。
【0088】
前記作製された追加の５種のベクター（ｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０ベクター、ｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿０５４９５ベクター、ｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿０５４９５ベクター、ｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５ベクター、およびｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５ベクター）をリシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株（大韓民国登録特許第１０－０１５９８１２号）に電気パルス法で形質転換し、２次ＤＮＡ－ｃｒｏｓｓｏｖｅｒを経てそれぞれの遺伝子が強化された菌株を作製した。
【0089】
このように追加作製された菌株５種は、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿０５４９５、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿０５４９５、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、およびＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５とそれぞれ名付けた。
【0090】
前記使用されたプライマー、プロモーター、ＢｐＯＦ４＿０５４９５遺伝子の核酸配列および前記遺伝子がコードするアミノ酸配列を下記の表５にまとめた。
【0091】
【表5】
【0092】
前記作製された５種の菌株、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿０５４９５、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿０５４９５、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、およびＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５に対して実施例５と同一の条件でフラスコで（ｉｎ ｆｌａｓｋｓ）評価を進行させて、その結果を表６に示した。
【0093】
【表6】
【0094】
ＢｐＯＦ４＿１３７４０遺伝子をｓｉｇＢプロモーターおよびｇａｐＡプロモーターで発現した時、対照群ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４対比それぞれ７．１％および４２．１％の時間あたりの糖消耗速度増加の結果を確認した。また、類似タンパク質であるＢｐＯＦ４＿０５４９５遺伝子をｓｉｇＢおよびｇａｐＡプロモーターで追加導入した時も、それぞれ２０．２％、３６．６％の糖消耗速度の増加を示した。前記２つの結果を通して、プロモーターの強度に応じた遺伝子の強化程度により糖消耗速度（ｇ／時間）が増加することを確認できた。追加的に前記遺伝子ＢｐＯＦ４＿１３７４０およびＢｐＯＦ４＿０５４９５を同時発現強化した時、最も高い糖消耗速度を確認した。具体的には、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５菌株の時間あたりの糖消耗速度は、対照群ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４対比４５．９％向上した効果を示した。
【0095】
本実施例において、リシン生産能の増加を示したＫＣＣＭ１１０１６Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５菌株は、２０１９年１２月１３日付で大韓民国ソウル特別市西大門区弘済洞所在の韓国微生物保存センターに寄託してＫＣＣＭ１２６４０Ｐの寄託番号が付与された。
【0096】
実施例７：ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５強化菌株のリシン生産能の分析
Ｌ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（大韓民国登録特許第１０－０９２４０６５号）およびＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（大韓民国登録特許第１０－００７３６１０号）にそれぞれ実施例６で選別された遺伝子を強化した。強化方法としては、実施例６で実施した方法と同様に遺伝子の追加導入を進行させ、最終的に、３種のベクター、ｐＤＺ＿Δ２２８４、ｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、およびｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５を電気パルス法でコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０ＰおよびＫＣＣＭ１１３４７Ｐ菌株２種にそれぞれ導入して、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Δ２２８４、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ＿Δ２２８４、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、およびＫＣＣＭ１１３４７Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５の６種の菌株を作製した。
Ｌ－リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（大韓民国登録特許第１０－０９２４０６５号）およびＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（大韓民国登録特許第１０－００７３６１０号）にそれぞれ実施例６で選別された遺伝子を強化した。強化方法としては、実施例６で実施した方法と同様に遺伝子の追加導入を進行させ、最終的に、３種のベクター、ｐＤＺ＿Δ２２８４、ｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、およびｐＤＺ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５を電気パルス法でコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０ＰおよびＫＣＣＭ１１３４７Ｐ菌株２種にそれぞれ導入して、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Δ２２８４、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ＿Δ２２８４、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、およびＫＣＣＭ１１３４７Ｐ＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５の６種の菌株を作製した。
【0097】
前記作製された遺伝子強化菌株は実施例５と同様の方法で培養して、ＯＤ、リシン生産収率および時間あたりの相対糖消耗速度（それぞれＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Δ２２８４およびＫＣＣＭ１１３４７Ｐ＿Δ２２８４の時間あたりの糖消耗速度１００％基準）を測定し、その結果を下記表７に示した。
【0098】
【表7】
【0099】
前記表７に示されているように、本実施例で作製された遺伝子強化菌株において、ＯＤ、ＦＮリシン濃度およびリシン生産収率のレベルが類似しているにもかかわらず、糖消耗速度の向上による発酵時間短縮の効果を確認した。
【0100】
実施例８：ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５が導入されたＣＪ３Ｐ菌株の作製およびリシン生産能の分析
Ｌ－リシンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においても前記と同一の効果があるかを確認するために、野生株に３種の変異［ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ）、ｈｏｍ（Ｖ５９Ａ）、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）］を導入してＬ－リシン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ２０１２、１３：Ｒ４０）を対象に、実施例７と同様の方法でＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５が強化された菌株を作製した。前記作製された菌株はＣＪ３＿Δ２２８４、ＣＪ３＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、ＣＪ３＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５とそれぞれ名付けた。対照群であるＣＪ３Ｐ菌株（ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５の強化が行われていない）と作製菌株３種は前記実施例５と同様の方法で培養して、ＯＤ、リシン生産収率および時間あたりの相対糖消耗速度（それぞれＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Δ２２８４およびＫＣＣＭ１１３４７Ｐ＿Δ２２８４の時間あたりの糖消耗速度１００％基準）を測定し、その結果を下記表８に示した。
Ｌ－リシンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においても前記と同一の効果があるかを確認するために、野生株に３種の変異［ｐｙｃ（Ｐ４５８Ｓ）、ｈｏｍ（Ｖ５９Ａ）、ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）］を導入してＬ－リシン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ（Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ２０１２、１３：Ｒ４０）を対象に、実施例７と同様の方法でＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５が強化された菌株を作製した。前記作製された菌株はＣＪ３＿Δ２２８４、ＣＪ３＿Δ２２８４：：ＰｓｉｇＢ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５、ＣＪ３＿Δ２２８４：：ＰｇａｐＡ ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５とそれぞれ名付けた。対照群であるＣＪ３Ｐ菌株（ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５の強化が行われていない）と作製菌株３種は前記実施例５と同様の方法で培養して、ＯＤ、リシン生産収率および時間あたりの相対糖消耗速度（それぞれＫＣＣＭ１０７７０Ｐ＿Δ２２８４およびＫＣＣＭ１１３４７Ｐ＿Δ２２８４の時間あたりの糖消耗速度１００％基準）を測定し、その結果を下記表８に示した。
【0101】
【表8】
【0102】
表８に示されているように、ＢｐＯＦ４＿１３７４０＿０５４９５が強化された菌株において、ＯＤ値、ＦＮリシン濃度およびリシン生産収率のレベルが類似しているにもかかわらず、時間あたりの糖消耗速度が６０％以上向上した効果を確認した。
【0103】
以上、本明細書で開示されるそれぞれの説明および実施形態はそれぞれの他の説明および実施形態にも適用可能である。本明細書で開示された多様な要素の可能なすべての組み合わせが本明細書で提案される発明の範疇に属する。また、下記記述された具体的な記述によって本明細書の発明の範疇が制限されるといえず、当該技術分野における通常の知識を有する者が本明細書に記載された特定の態様に対する多数の等価物を認知または確認できる限り、このような等価物は本明細書で提案される発明に含まれると意図される。
【0104】
【図1】
【配列表】