特許 7364073 微生物識別用マーカーの特定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-10

(45)【発行日】2023-10-18

(54)【発明の名称】微生物識別用マーカーの特定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20231011BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20231011BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V ZNA

C12Q1/04

G01N27/62 D

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2022529184

(86)(22)【出願日】2020-06-02

(86)【国際出願番号】 JP2020021808

(87)【国際公開番号】W WO2021245798

(87)【国際公開日】2021-12-09

【審査請求日】2022-07-25

(73)【特許権者】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】100179969

【弁理士】

【氏名又は名称】駒井 慎二

(72)【発明者】

【氏名】福山 裕子

【審査官】伊藤 裕美

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１６８７４０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１６８７４２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１７／１６８７４３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１５－１８４０２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５１３３８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００７－５２６２４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４－５３６２９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１０８５０９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０２１－１８９０８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】OJIMA-KATO, T. et al.，Application of proteotyping Strain Solution TM ver. 2 software and theoretically calculated mass dat，Applied microbial and cell physiology，2017年10月14日，101，8557-8569

【文献】JABBOUR, R. E., et al.，Double-Blind Characterization of Non-Genome-Sequenced Bacteria by Mass Spectrometry-Based Proteomics，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Vol. 76, No. 11，3637-3644

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ２７／６０ － Ｇ０１Ｎ ２１／７０

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － Ｇ０１Ｎ ３３／９８

Ｃ１２Ｑ １／０４ － Ｃ１２Ｑ １／１６

Ｃ１２Ｍ １／３４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記ステップ１から８を含む微生物識別用マーカーの特定方法。
ステップ１：全ゲノムが解読されている微生物を選定する。
ステップ２：上記ステップ１で選定した微生物が有するタンパク質
の質量分析を行い、タンパク質のアミノ酸配列に基づく分子量関連イオンピークを得る。
ステップ３：上記ステップ２で得られた分子量関連イオンピークから各ピークの実測ｍ／ｚ値を得る。
ステップ４：上記ステップ１で選定された微生物について、遺伝子データベースより、当該微生物が有するタンパク質情報とそのアミノ酸配列情報を得、当該得られたアミノ酸配列情報から当該タンパク質の理論ｍ／ｚ値を算出する。
ステップ５：ステップ４で算出した理論ｍ／ｚ値と、上記ステップ３で得られた実測ｍ／ｚ値と比較し、実測ｍ／ｚ値に一致する理論ｍ／ｚ値を有するタンパク質とそのアミノ酸配列に、実測ｍ／ｚ値を帰属する。
ステップ６：ステップ５で帰属されたタンパク質と類似のアミノ酸配列情報を遺伝子データベースより入手する。
ステップ７：上記ステップ６で入手したアミノ酸配列情報からこれに類似のアミノ酸配列を有する微生物のうち、識別分類に応じて微生物を選別し、その微生物が有するタンパク質のアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値を算出する。
ステップ８：ステップ７で算出したアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値を比較し、分類ごとに差異のある理論ｍ／ｚ値を有するタンパク質を識別のためのマーカーとして特定する。

【請求項2】

記質量分析がＭＡＬＤＩ－ＭＳである請求項１に記載の微生物識別用マーカーの特定方法。

【請求項3】

微生物がサルモネラである請求項１から２のいずれか１項に記載の微生物識別用マーカーの特定方法。

【請求項4】

請求項１に記載の方法により特定された微生物識別用マーカーを用いた微生物の識別方法。

【請求項5】

微生物がサルモネラである請求項４に記載の微生物の識別方法。

【請求項6】

微生物識別用マーカーとその理論ｍ／ｚ値、および該マーカーに対応する微生物の属、種、亜種、血清型および株とからなる群から選ばれる少なくとも１種を含むデータベースの構築方法において、前記微生物識別用マーカーを請求項１に記載の方法により特定することを特徴とするデータベースの構築方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物の識別に用いるマーカーの特定方法に関する。より詳細には、本発明は質量分析を利用して微生物を識別するためのマーカーを特定する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、微生物の種類を識別する手法の１つとしてＤＮＡ塩基配列に基づく相同性解析が広く用いられている。こうしたＤＮＡ塩基配列を利用した手法では、識別対象微生物からのＤＮＡ抽出やＤＮＡ塩基配列の決定などに比較的長い時間を要する。

【0003】

しかしながら、さまざまな疾患を引き起こす細菌に罹患した場合、その細菌を迅速かつ正確に特定することは患者の治癒とともに二次感染の予防のために極めて重要である。したがって、迅速かつ正確な細菌の分析方法が求められている。

【0004】

そこで、近年では識別対象微生物を質量分析して得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物同定を行う手法が用いられている。質量分析によれば、ごく微量の微生物試料を用いて短時間で分析結果を得ることができ、且つ多検体の連続分析も容易であるため、簡便且つ迅速な微生物同定が可能となる。特に、タンパク質等の生体高分子をできるだけ分解せずにイオン化するソフトイオン化法が実用化されて以来、微生物の分析に質量分析が広く応用されている。

【0005】

ソフトイオン化法のなかでも、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（以下、ＭＡＬＤＩ－ＭＳと称する場合がある）と呼ばれるイオン化法を用いた質量分析は、近年、微生物の分析手段として注目を浴びている。ＭＡＬＤＩ－ＭＳにより得られたマススペクトルパターンを、予めデータベースに多数収録された既知微生物のマススペクトルパターンと照合することにより、識別対象微生物の同定が行われる。こうした手法はマススペクトルパターンを各微生物に特異的な情報（すなわち指紋）として利用するため、フィンガープリント法と呼ばれている。

【0006】

ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いた微生物同定において、種までの分析は、フィンガープリント法が知られており、臨床分野の一部では実用化されている。一方、亜種や血清型までの分析は、例えば、特許文献１にリボソームタンパク質等をマーカーとして用いる手法が報告されている。特許文献１の方法では、あらかじめ実測されたマススペクトルの検出ピーク情報（ｍ／ｚ値など）を分析対象物の実測データと照会し、マーカーに帰属される特定のｍ／ｚ値のピークの有無により微生物の識別が行われる。

【0007】

特許文献２には、複数のデータからなる複数のグループにおいて、各グループのデータを比較して差異解析を行い、各グループを識別するためのマーカーを探索する方法が記載されている。
さらに上記特許文献１あるいは２の方法を用いて、マーカーを特定し微生物を識別した結果も得られている。

【0008】

例えば、サルモネラ属のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ. ｅｎｔｅｒｉｃａについて、種までの同定をフィンガープリント法による手法で行い、血清型の識別を１２種のマーカーを用いて行う手法が報告されている（特許文献３、非特許文献1）。
非特許文献１によれば、特許文献１の方法により、ｍ／ｚ値などあらかじめ実測されたマススペクトルの検出ピーク情報を実データと照会することで、まず識別対象微生物がサルモネラ属であることを特定している。次に、血清型ごとにグループ分けされた複数の菌株のデータを比較して、各血清型を識別するためのマーカーを特定している。このような方法により、サルモネラの血清型識別マーカーとして１２種が特定され、これらマーカーにより２２種の血清型が識別できることが報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】特開２０１５-１８４０２０号公報

【文献】特開２０１８-５０５０６３号公報

【文献】ＷＯ２０１７／１６８７４０公報

【非特許文献】

【0010】

【文献】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１７， Ｖｏｌ．１０１， No． ２３－２４，ｐｐ. ８５５７－８５６９.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

微生物は同一属に属していても、その種、亜種、血清型および株等に細かく分類され、それぞれの性質が異なることが知られている。例えば上述のサルモネラ属の場合、種はｅｎｔｅｒｉｃａとｂｏｎｇｏｒｉの２菌種、あるいはこれらにｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａを加えた３菌種あり、ｅｎｔｅｒｉｃａには６種の亜種がある。さらに亜種ごとに異なる血清型や株があり、例えば亜種ｅｎｔｅｒｉｃａには２０００種以上の血清型が存在するといわれている。

【0012】

また微生物によってはヒトに対して病原性がある場合とない場合があり、血清型はそれぞれ生物学的に異なる性質を有している。したがって微生物の亜種、血清型、株を簡便かつ迅速な方法で識別する必要がある。

【0013】

微生物には多数の血清型や株が存在することから、すべてを分析することは容易ではない。またヒトに対し病原性がある微生物の分析では、できるだけ実測件数を抑えることが、検査者の安全性の観点からも重要である。さらに購入できる試料の種類も限られている。したがって上記方法のように実測データにのみ基づきマーカー探索を行うには限界がある。そのため、これまで報告されているマーカー数は限られ、マーカーにより識別できる種、亜種、血清型も限られていた。

【0014】

また血清型や株の数が膨大な微生物の場合、識別に利用できる実測データも少なく、実測データのデータベース化もまだ十分に整備されていない。

【0015】

したがって、できるだけ少ない実測データに基づき微生物を識別するためのマーカーを特定する方法が望まれていた。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明者らは、質量分析法により得られた分析結果と入手可能な公共の遺伝子情報とから、識別対象微生物の属、種、亜種、血清型を識別できるマーカーの探索方法を検討し、できるだけ少ない実測データに基づきマーカーを特定する方法を見出し、本発明に至った。

【0017】

すなわち本発明は
下記ステップ１から８を含む微生物識別用マーカーの特定方法に関する。
ステップ１：全ゲノムが解読されている微生物を選定する。
ステップ２：上記ステップ１で選定した微生物が有するタンパク質
の質量分析を行い、タンパク質のアミノ酸配列に基づく分子量関連イオンピークを得る。
ステップ３：上記ステップ２で得られた分子量関連イオンピークから各ピークの実測ｍ／ｚ値を得る。
ステップ４：上記ステップ１で選定された微生物について、遺伝子データベースより、当該微生物が有するタンパク質情報とそのアミノ酸配列情報を得、当該得られたアミノ酸配列情報から当該タンパク質の理論ｍ／ｚ値を算出する。
ステップ５：ステップ４で算出した理論ｍ／ｚ値と、上記ステップ３で得られた実測ｍ／ｚ値と比較し、実測ｍ／ｚ値に一致する理論ｍ／ｚ値を有するタンパク質とそのアミノ酸配列に、実測ｍ／ｚ値を帰属する。
ステップ６：ステップ５で帰属されたタンパク質と類似のアミノ酸配列情報を遺伝子データベースより入手する。
ステップ７：上記ステップ６で入手したアミノ酸配列情報からこれに類似のアミノ酸配列を有する微生物のうち、識別分類に応じて微生物を選別し、その微生物が有するタンパク質のアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値を算出する。
ステップ８：ステップ７で算出したアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値を比較し、分類ごとに差異のある理論ｍ／ｚ値を有するタンパク質を識別のためのマーカーとして特定する。

【発明の効果】

【0018】

本発明によれば、少ない実測データに基づき微生物を識別するためのマーカーを特定することができ、例えばサルモネラにおいては、非特許文献１で特定されたマーカー以外に、新たに２６種のマーカーを特定することができた。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】本発明の微生物識別に用いるマーカーの特定方法を示すフローチャートである。

【図2】S. EnteritidisとS.Typhimuriumにおける本発明の方法により特定されたマーカーの一つであるＣｈａＢのマススペクトルである。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、本発明の微生物を識別するために用いるマーカーの特定方法について説明する。
微生物は上述のとおり同じ属および種に属していても、さらに多数の亜種、血清型、株に分類される。また種や亜種、血清型によっては人体に対して毒性を有する場合もあり、また効果的な治療薬も異なる。したがって微生物を簡便かつ迅速な方法で識別することは重要である。本発明において識別対象となる微生物としては、主に細菌、放線菌、枯草菌、菌類などが含まれ、例えば、サルモネラ、大腸菌などが挙げられるが、これに限定されない。

【0021】

マーカーとは一般にある群に帰属する異なる各要素を識別するために用いられる各要素に特有な特徴である。微生物の場合は、例えば、異なる属、同一属に属する異なる種、または同一種に属する異なる亜種、血清型、または株ごとにアミノ酸配列の一部が異なるタンパク質などがマーカーとして用いられる。

【0022】

本発明では、微生物が有するタンパク質に着目し、識別対象の微生物に共通する遺伝情報（ゲノム情報）に基づき、属、種、亜種、血清型または株を識別できるタンパク質を特定する。特定されたタンパク質は識別対象の微生物を識別するためのマーカーとして用いることができる。また特定されたマーカーは必ずしも亜種、血清型または株まで識別するマーカーである必要はなく、目的に応じて属のみ、または種のみを識別するマーカーであってもよい。

【0023】

マーカーとして用いるタンパク質は微生物が有するタンパク質であればよく、例えば微生物の細胞内のタンパク質がマーカーとして好適に用いられる。細胞内のタンパク質としてはリボソームタンパク質などが挙げられるが、これに限定されない。
マーカーの特定には質量分析法を用いる。特に高分子をできるだけ分解せずにイオン化するソフトイオン化法を採用したＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いることが好ましい。マーカーの特定には質量分析測定により、プロトンが中性分子のタンパク質Ｍに付加した分子（以下、[Ｍ+Ｈ]⁺と称する場合がある。）などの分子量関連イオンピークのデータを用いる。このとき、タンパク質のｍ／ｚの値としては、各タンパク質の塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することにより求められた計算質量を用いることが望ましい。さらに、前記アミノ酸配列から計算質量を求める際には、翻訳後修飾としてＮ－末端メチオニン残基の切断を考慮することが望ましい。具体的には、最後から２番目のアミノ酸残基がGly、 Ala、 Ser、 Pro、 Val、 Thr、 またはCysである場合に、Ｎ－末端メチオニンが切断されるものとして理論値を算出する。

【0024】

本発明の微生物識別用マーカーの特定方法は図１のフローチャートに示したように以下の手順で行われる。
ステップ１：識別対象微生物の中から全ゲノムが解読されている微生物を選定する。
ステップ２：上記ステップ１で選定した微生物が有するタンパク質の質量分析を行い、タンパク質のアミノ酸配列に基づく[Ｍ+Ｈ]⁺などの分子量関連イオンのピーク（以下、分子量関連イオンピークと称する場合がある）を得る。
ステップ３：上記ステップ２で得られた分子量関連イオンピークから各ピークのｍ/ｚ値を実測された値として得る（以下、実測ｍ／ｚ値と称する場合もある）。
ステップ４：上記ステップ１で選定された微生物について、遺伝子データベースより、当該微生物が有するタンパク質とアミノ酸配列を得、当該アミノ酸配列情報から当該タンパク質のｍ／ｚ値の理論値を算出する（以下、理論ｍ／ｚ値と称する場合がある）。

【0025】

ステップ５：上記ステップ４で算出した理論ｍ／ｚ値と、上記ステップ３で得られた実測ｍ／ｚ値と比較し、実測ｍ／ｚ値に一致する理論ｍ／ｚ値を有するタンパク質とそのアミノ酸配列に、実測ｍ／ｚ値を帰属する。
ステップ６：上記ステップ５で帰属されたタンパク質と類似のアミノ酸配列をデータベースより入手する。
ステップ７：上記ステップ６で入手した類似のアミノ酸配列を有する微生物のうち、識別分類に応じて微生物を選別し、その微生物が有するタンパク質のアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値を算出する。
ステップ８：ステップ７で算出したアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値を識別分類ごとに比較し、属、種、亜種、血清型、株など識別分類ごとに差異のある理論ｍ／ｚ値を有するタンパク質を識別のためのマーカーとして特定する。

【0026】

通常、微生物の場合、異なる属、種、亜種、血清型および株において、複数の同じタンパク質を持ち、上記マーカータンパク質のｍ／ｚ値を複数組み合わせることで、微生物の属、種、亜種、血清型、株を識別することができる。

【0027】

以下に各ステップをより詳細に説明する。
［ステップ１から３］
ステップ1で識別対象微生物の中から選定される全ゲノムが解読されている微生物は、遺伝子データベース等の公知のデータベース、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（登録商標 別名Ｔｈｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）、ＮＣＢＩや購入先情報に基づき選定すればよい。全ゲノムが解読されている微生物が選定されたら、当該微生物を入手し、ステップ２にて、質量分析を行い、タンパク質のアミノ酸配列に基づく分子量関連イオンピークを得る。質量分析方法は上述のＭＡＬＤＩ－ＭＳが好ましい。ＭＡＬＤＩ－ＭＳではタンパク質毎にアミノ酸配列に基づく[Ｍ+Ｈ]⁺などの分子量関連イオンピークが得られ、それぞれのピークに対して、ステップ３で、そのｍ／ｚ値を得る。

【0028】

［ステップ４］
一方、ステップ１で選定した微生物は、全ゲノム解読がなされているので、その微生物に含まれるタンパク質とそのアミノ酸配列は判明しており、通常、遺伝子データベースに収録されている。したがって、ステップ１で選定した微生物に含まれる全タンパク質のアミノ酸配列をデータベースより入手し、それぞれの理論ｍ／ｚ値を算出することができる。用いるデータベースは、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ（登録商標 別名Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）、ＮＣＢＩ等が挙げられる。

【0029】

［ステップ５］
ステップ５では、ステップ３で得られた実測ｍ/ｚ値とステップ４で算出した理論ｍ/ｚ値を比較することで、ステップ２の質量分析で得られた全ての分子量関連イオンピークを既知のタンパク質およびそのアミノ酸配列に帰属することができる。

【0030】

［ステップ６］
微生物の場合、属、種、亜種、血清型または株により、タンパク質の質量が異なる場合がある。この質量の違いは、タンパク質を構成するアミノ酸が変異したためであると考えられる。ステップ６ではアミノ酸配列の変異体を検索するため、帰属されたタンパク質と類似のアミノ酸配列を検索する。

【0031】

上記ステップ６で類似のアミノ酸配列を有するタンパク質は、例えば既存の微生物のデータベースから検索により特定することができる。検索の方法は例えば、データベースとしてＵｎｉＰｒｏｔやＮＣＢＩなどを用いたＳｉｍｉｌａｒｉｔｙ検索（相同性検索）が挙げられる。Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ検索を行う場合、例えば配列類似度５０％以上の条件で検索する。配列類似度については識別の目的等に応じて、適宜、設定すればよい。

【0032】

［ステップ７］
上記ステップ６で選定された類似のアミノ酸配列を有するタンパク質は様々な属または種に属する微生物のアミノ酸配列が含まれるため、そのなかから、識別分類に応じて微生物を選別する。例えば識別分類が種、亜種、血清型、または株である場合、ステップ１で選別した微生物と同一の属の微生物を選別する。また識別分類が属の場合、その属に関わらず全ての微生物を選別する。そして、これらの選別された微生物のアミノ酸配列の理論ｍ/ｚ値を求める。

【0033】

［ステップ８］
ステップ４から７により全ゲノムが解読されている微生物を質量分析することで検出されるタンパク質とそのアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値が得られる。併せて全ゲノムが解読されている微生物のアミノ酸配列と類似のアミノ酸配列をもつ、例えば同属異種の微生物が有するタンパク質の理論ｍ／ｚ値が求められる。ステップ８では、例えば同属異種の微生物が有するタンパク質のアミノ酸配列に基づく理論ｍ/ｚ値を比較し、種間で差異のあるｍ／ｚ値を有するタンパク質が特定できれば、該タンパク質を種の識別用のマーカーとして特定する。ステップ８で、差異のあるｍ／ｚ値を有するタンパク質が複数特定できる場合、差異のあるｍ／ｚ値を有するタンパク質を全てマーカーとして特定してよいし、これらタンパク質のうち、例えば高い強度のｍ／ｚ値を有するタンパク質をマーカーとして特定してもよいし、他のマーカーのｍ／ｚ値との差が２００ｐｐｍ以上、好ましくは５００ｐｐｍ以上、より好ましくは８００ｐｐｍ以上であるｍ／ｚ値を有するタンパク質をマーカーとして特定してもよい。

【0034】

上記ステップにより特定されたマーカーは、属、種、亜種、または血清型が異なる場合、同じタンパク質であっても理論ｍ／ｚ値がそれぞれ異なる。すなわち各タンパク質は属、種、亜種または血清型毎に異なる理論ｍ／ｚ値を有するので、これらの識別に用いるマーカーとすることができる。このとき、全体のうち幾つかの属、種、亜種または血清型で同じ理論ｍ／ｚ値を有する場合も、複数のタンパク質の理論ｍ／ｚ値を組み合わせることで、全体として識別に寄与する場合は、これらの識別に用いるマーカーとすることができる。

【0035】

以下に微生物としてサルモネラ属を例にとり、上記方法についてさらに詳細に説明する。
ステップ1で選定される全ゲノムが解読されているサルモネラとして、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ. ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ａｂａｅｔｅｔｕｂａ（以下、Ｓ.Ａｂａｅｔｅｔｕｂａと称する場合がある）（菌株：ＡＴＣＣ ３５６４０）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ. ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（菌株：ＡＴＣＣ ７００７２０）などが挙げられる。

【0036】

例えば、上記Ｓ.ＡｂａｅｔｅｔｕｂａをＭＡＬＤＩ－ＭＳにて質量分析を行うことで、タンパク質のアミノ酸配列に基づく[Ｍ+Ｈ]⁺などの分子量関連イオンピークが得られる。

【0037】

実測されたタンパク質の分子量関連イオンピークに対して、自己キャリブレーションを適用すると、より精密なｍ／ｚ値が求められる。

【0038】

一方、Ｓ.Ａｂａｅｔｅｔｕｂａはゲノム情報が公開されており、例えば、上記データベースＵｎｉＰｒｏｔなどから保有する全てのタンパク質名とアミノ酸配列のデータを入手することができる。得られたアミノ酸配列情報から各タンパク質の分子量関連イオンピークのｍ／ｚ値が算出できる。このようにして算出された理論ｍ／ｚ値を、先に実測されたタンパク質の分子量関連イオンピークの実測ｍ／ｚ値と対比させることで、実測されたタンパク質の分子量関連イオンピークのｍ／ｚ値を、タンパク質およびアミノ酸配列に帰属できる。

【0039】

Ｓ.Ａｂａｅｔｅｔｕｂａの実測された分子量関連イオンピーク数は膨大となるので、適宜、帰属する分子量関連イオンピークを選定してもよい。例えば、ｍ／ｚ値が２０００から２００００、好ましくは３０００から１５０００の範囲のピークを選定し、それらを帰属してもよい。またピークのＳ／Ｎが２以上、好ましくは３以上のピークを選定し、それらを帰属してもよい。

【0040】

上記で帰属されたタンパク質に対して、例えば上記ＵｎｉＰｒｏｔを用いたＳｉｍｉｌａｒｉｔｙ検索を行うことで、類似のアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値が得られる。この中からサルモネラに属するアミノ酸配列とそのタンパク質を選択することで、サルモネラの各種、各亜種、各血清型、あるいは各株とその理論ｍ／ｚ値がそれぞれ得られる。

【0041】

上述のようにして得られたサルモネラの種、亜種、血清型毎の理論ｍ／ｚ値を比較し、種、亜種、血清型、あるいは株毎に異なるｍ／ｚ値を示すタンパク質をマーカーとして選定することができる。

【0042】

上述の方法で選定されたマーカーが正しいかどうかは、例えば以下の手順により確認することができる。まず種、亜種、血清型のいずれかが判明している微生物を、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにより質量分析を行い、上記と同様にして実測により得られたタンパク質の分子量関連イオンピークに対するｍ／ｚ値を求める。質量分析の結果、マーカーとして選定されたタンパク質が理論ｍ／ｚ値で検出されるかどうかにより、確認することができる。

【0043】

上記サルモネラを例にとると、まず血清型が判明している複数のサルモネラを、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにより質量分析を行い、上記と同様にして実測により得られたタンパク質の分子量関連イオンピークに対するｍ／ｚ値を求める。質量分析の結果、マーカーとして選定されたタンパク質が上記血清型におけるタンパク質のアミノ酸配列に基づく理論ｍ／ｚ値どおりに再現良く検出されるかどうかにより、確認することができる。

【0044】

なお、通常、微生物の亜種が判明している場合はその種は判明しており、血清型が判明している場合は、その種と亜種は判明している。一方、種が判明していてもその亜種または血清型が判明していない場合がある。したがって、上記の確認方法において、例えば、種を識別するためのマーカーを確認するためには、種、あるいは種と亜種、あるいは種と亜種と血清型が判明している微生物を用いる必要がある。また、種および亜種を識別するためのマーカーを確認するためには種と亜種、あるいは種と亜種と血清型が判明している微生物を用いる必要がある。

【0045】

上述の方法により特定されたマーカーを用いて、識別対象の微生物を識別する。識別方法は、例えばマーカーの特定方法と同様に、識別対象の微生物を質量分析する方法が採用できる。特に高分子をできるだけ分解せずにイオン化するソフトイオン化法を採用したＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いることが好ましい。

【0046】

識別対象の微生物を質量分析し、タンパク質の分子量関連イオンピークを得る。得られた分子量関連イオンピークから上記マーカーとして特定されたタンパク質に帰属される理論ｍ／ｚ値におけるピークの存在の有無を確認する。あるいは、そのマーカータンパク質のピークがどの理論ｍ／ｚ値で検出されるかを確認する。マーカーとして特定されたタンパク質に帰属される理論ｍ／ｚ値におけるピークの存在が識別対象の微生物に確認されれば、当該タンパク質を有する種、亜種または血清型などが識別される。あるいは、そのマーカータンパク質のピークのｍ／ｚ値に基づき、識別対象の微生物の種、亜種または血清型などが識別される。

【0047】

上述のとおり、微生物の識別に用いることができるマーカーを予め選定しておくことで、識別対象の微生物を質量分析すれば、その微生物が属する属、種、亜種、または血清型を識別することができる。また想定される属、種、亜種、血清型を全て別途分析して識別対象の微生物と比較する必要はなく、識別対象の微生物のみを分析するだけよい。

【0048】

選定されたマーカーは属、種、亜種、血清型の識別を容易にし、微生物の属、種、亜種および血清型を簡便かつ迅速に識別することができる。また、属、種、亜種、血清型毎にマーカーを特定し、特定されたマーカーの少なくとも一つとその理論ｍ／ｚ値、および属、種、亜種または血清型のいずれか少なくとも一つとからなるデータベースを構築することもできる。例えば亜種を識別することができるマーカーを特定し、各亜種とそのマーカーとのデータベースを構築することができる。このようなデータベースを構築することで、識別対象微生物の質量分析の結果から直ちにその属、種、亜種、または血清型を識別することができる。また本発明のマーカーの選定方法は全ゲノムが解明している微生物だけを分析すればよく、ヒトに対し病原性がある微生物などの実測件数を抑えることができ、検査者の安全性や労力の観点からも有用である。

【実施例】

【0049】

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
微生物としてサルモネラを被検試料とし、サルモネラの種、亜種、血清型を識別するのに用いることができるマーカーの特定を行った。

【0050】

被検試料をＭＡＬＤＩ－ＭＳで質量分析を行った。ＭＡＬＤＩ－ＭＳに用いた装置は島津製作所製ＡＸＩＭＡ（登録商標）
Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅであり、測定条件は以下のとおりである。

【0051】

［質量分析条件］
装置：島津製作所製ＡＸＩＭＡ（登録商標） Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
条件: ｐｏｓｉｔｉｖｅモード。Ｌｉｎモード。ラスター分析。

【0052】

［手順］
下記手順１から９によりサルモネラのマーカーの特定およびその確認を行った。
１.サルモネラの全ゲノム解読株としてＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｕｂｓｐ. ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒ Ａｂａｅｔｅｔｕｂａ（以下、Ｓ.Ａｂａｅｔｅｔｕｂａと称する）の菌株: ＡＴＣＣ ３５６４０を選定し、ＬＢ寒天培地で、温度３７℃で２０時間培養した。同様に、サルモネラ属の血清型２種の各株: Ｓ. Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（菌株：ＧＴＣ００１３１、ＧＴＣ０９４９１、ＨｙｏｇｏＳＥ１１００２、ＨｙｏｇｏＳＥ１２００１）とＳ. Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（菌株：ＮＢＲＣ１４２１０、ＮＢＲＣ１５１８１、ＮＢＲＣ１２５２９、ＮＢＲＣ１３２４５）を、ＬＢ寒天培地で、温度３７℃で２０時間培養した。

【0053】

２.マトリックス溶液として、以下のｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｗａｋｏ社製、以下、ＳＡ）溶液を調製して以下の手順に用いた。
ＳＡ－１: ＳＡ２５ｍｇ／ｍＬのエタノール（以下、ＥｔＯＨ）溶液
ＳＡ－２: ＳＡ２５
ｍｇ／ｍＬのメチレンジホスホン酸（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、以下、ＭＤＰＮＡ）１重量％ 、ｎ－ｄｅｃｙｌ－β－Ｄ－ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、以下、ＤＭＰ）１ｍＭ、トリフルオロ酢酸（Ｗａｋｏ社製、ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、以下、ＴＦＡ）０．６重量％、およびアセトニトリル（Ｗａｋｏ社製、ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ、以下、ＡＣＮ）５０重量％からなる水溶液。

【0054】

３.上記手順１のサルモネラ約１ｍｇを微量天秤で秤量し、手順２で調整したＳＡ－２溶液を加え、サルモネラの濃度が１ｍｇ／０．０７５
ｍＬ（１×１０⁷個／μＬ）となるよう、ニードルで懸濁後、超音波に１ｍｉｎかけ、得られた懸濁液に対し、遠心分離を１２０００ｒｐｍ、５ｍｉｎの条件で行った。

【0055】

４.上記手順２.で調整したＳＡ－１溶液を、ＭＡＬＤＩプレートに、０．５μＬずつ滴下し、プリコートした。その後、上記３.の遠心分離後の上清液を、プリコートされたウェル上に、１μＬずつ滴下した。自然乾燥後、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにプレートを挿入し、ｐｏｓｉｔｉｖｅ、Ｌｉｎモードで、ラスター分析で測定した。ｎ数は４とした。測定後、サルモネラの自己キャリブレーションを適用し、得られたマススペクトルを評価し、検出されたタンパク質のピークのｍ/ｚ値を確認した。

【0056】

５.全ゲノム解読株であるＳ. Ａｂａｅｔｅｔｕｂａの公開遺伝子情報から、全てのアミノ酸配列とタンパク質名を入手した。このアミノ酸配列情報から、各タンパク質のアミノ酸配列に基づく理論ｍ／ｚ値を算出した。

【0057】

６.上記手順５で入手したタンパク質に対し、上記４.で得られたマススペクトルのピークのうち、ｍ／ｚ値が３０００～２００００範囲、ピークのシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が３以上、質量精度５００ｐｐｍ以内で、ｎ数４のうち３回以上検出され、また手順５から入手したタンパク質のｍ／ｚ値の理論値の近似値がひとつのピークに対し２つ以上存在しないピークに帰属されるタンパク質を選択した。

【0058】

７.上記手順６の各タンパク質に対し、公開遺伝子情報のSimilarity検索（配列類似度５０％以上）により類似のアミノ酸配列情報を検索し、サルモネラ属菌の各株における理論ｍ／ｚ値を、種、亜種、血清型情報とともに入手した。

【0059】

８.上記手順７で得られた理論ｍ／ｚ値をサルモネラ属の種、亜種、血清型ごとに比較し、種、亜種、血清型ごとに異なるｍ／ｚ値を示すタンパク質をマーカーとして特定した。

【0060】

［結果］
まず、Ｓ. Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（菌株：ＧＴＣ００１３１、ＧＴＣ０９４９１、ＨｙｏｇｏＳＥ１１００２、ＨｙｏｇｏＳＥ１２００１）とＳ. Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（菌株：ＮＢＲＣ１４２１０、ＮＢＲＣ１５１８１、ＮＢＲＣ１２５２９、ＮＢＲＣ１３２４５）のマススペクトルにおいて、上記手順６と同様にして選択した主なタンパク質のうちの代表ピークの検出状況を表１にまとめた。結果、実測データは、遺伝子情報から算出したタンパク質のｍ／ｚ値情報をほぼ反映していた。

【0061】

【表1】

検出率は以下のようにして求めた。
血清型毎に上記各株について４回測定し、Ｓ／Ｎ ＞３、質量精度５００ｐｐｍ以内で、タンパク質が３回以上検出された場合を、そのタンパク質が検出された株と判定した。検出された株の数を測定した株の総数で割って検出率とした。例えば。タンパク質が検出された株が４株中、４株であれば検出率１００％、４株中３株であれば検出率は７５％である。

【0062】

表１から分かるように一部を除き、ほぼ理論値通りにピークが検出されている。タンパク質によって検出率の低い場合がある理由としては、タンパク質のピークが低感度であるためだった。この結果から、遺伝子情報から検出ピークのｍ／ｚ値を予測することが可能であることが確かめられた。これにより、遺伝子情報に基づきマーカータンパク質を予測できると考えられた。

【0063】

次に、上記手順８において、理論ｍ／ｚ値をサルモネラ属の種、亜種、血清型ごとに比較し、種、亜種、血清型ごとに異なるｍ／ｚ値を示す以下のタンパク質２６種をマーカータンパク質として特定した。

【0064】

Ｓ２２、ＹｃａＲ、Ｌ３５、ＢｃｓＲ、ＳｓａＧ、
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＹｉｂＪ、ＯａｄＧ、
ＣｈａＢ、ＺａｐＢ、ＨＵ－１、ＹｅｉＳ、ＨＵ－２、ＩｒａＰ、Ｓ１５、
ｒｐｏＺ、ＩＨＦｂ、ＩＨＦａ、ＹｇａＭ、ＲａｉＡ、ＹｉｆＥ、
ＹｅｅＸ、Ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ、ＲＮａｓｅＰ、ＣｈｅＹ、Ｓ５

【0065】

例えば、手順８でマーカーとして特定されたタンパク質、ＣｈａＢについて、サルモネラ属の血清型２種（Ｓ. ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓとＳ. Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の実測ピークを図２に、理論ｍ／ｚ値を表２に示した。図２および表２から分かるように、マーカーとして特定したタンパク質、ＣｈａＢ、により血清型２種（Ｓ. ＥｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓとＳ. Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）が識別できることが確認できた。

【0066】

【表2】

【0067】

さらに、上記でマーカーとして特定したタンパク質２６種の種、亜種、血清型の理論ｍ/z値をまとめた結果を表３、５、７に示す。併せて、非特許文献1で報告されているサルモネラ血清型識別用１２マーカータンパク質の理論ｍ/z値をまとめた結果を表４、６、８に示す。

【0068】

【表3】

【0069】

表３は、サルモネラ属の２種（S. bongori、S. enterica）に対する、上記でマーカーとして特定したタンパク質２６種のうち代表１７種（S15、S22、YeiS、YcaR、YgaM、RaiA、IraP、HU2、BcsR、IHFa、CheY、rpoZ、YifE、IHFb、YeeX、HU1、Endolysin）の理論ｍ／ｚ値を示している。表中の下線の数値は、その種のみで確認された理論ｍ／ｚ値を示している。ただし種間に５００ ppm以内のｍ／ｚ値がある場合は下線をつけていない。複数のｍ／ｚ値がある場合は、代表値以外を”etc.”として示している。その場合、代表値としては、種間で差異のある代表的なｍ／ｚ値とともに、種間に近似するｍ／ｚ値がある場合はそのｍ／ｚ値を優先して例示している。
下線の数値のｍ／ｚ値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで識別できる可能性があることがわかる。併せて、後述の表４のような既知マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難な識別もできる可能性がある。

【0070】

【表4】

【0071】

表４は、サルモネラ属の２種（S. bongori、S. enterica）に対する、非特許文献１で報告された血清型識別用として既知のマーカータンパク質１２種のうち代表６種の理論ｍ／ｚ値を示している。下線の数値は、その種のみで確認された理論ｍ／ｚ値を示している。ただし種間で５００ ppm以内のｍ／ｚ値がある場合は下線をつけていない。複数のｍ／ｚ値がある場合は、代表値以外を”etc.”として示している。その場合、代表値としては、種間で差異のある代表的なｍ／ｚ値とともに、種間に近似するｍ／ｚ値がある場合はそのｍ／ｚ値を優先して例示している。
なお、例示した6種のタンパク質は、非特許文献１で報告された血清型識別用の１２マーカーのうちの６つであり、表４に例示した種の識別用マーカーとしては知られていない。
表４の下線の数値のｍ／ｚ値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで、識別できる可能があることがわかる。併せて、前記の表３のような新規マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。

【0072】

【表5】

【0073】

表５は、Salmonella entericaの６亜種（houtenae、salamae、indica、diarizonae、arizonae、enterica）に対する新規マーカータンパク質２６種のうち代表６種（ChaB、YeiS、SsaG、IraP、BcsR、Endolysin）の理論ｍ／ｚ値を示している。表中のハイフンはデータべースに記載のないことを示している。下線の数値は、その亜種のみで確認された理論ｍ／ｚ値を示している。ただし種間に５００ ppm以内のｍ／ｚ値がある場合は下線をつけていない。複数のｍ／ｚ値がある場合は代表値以外を”etc.”として示している。その場合、代表値としては、種間で差異のある代表的なｍ／ｚ値とともに、種間に近似するｍ／ｚ値がある場合はそのｍ／ｚ値を優先して例示している。
下線の数値のｍ／ｚ値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで、識別できる可能があることがわかる。併せて、後述の表６のような既知マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。

【0074】

【表6】

【0075】

表６は、Salmonella entericaの６亜種（houtenae、salamae、indica、diarizonae、arizonae、enterica）に対する、非特許文献１で報告された血清型識別用として既知のマーカータンパク質１２種のうち代表４種（YibT、L15、YaiA、Gns）の理論ｍ／ｚ値を示している。表中のハイフンはデータべースに記載のないことを示している。下線の数値は、その亜種のみで確認された理論ｍ／ｚ値を示している。ただし種間に５００ ppm以内のｍ／ｚ値がある場合は下線を示していない。複数のｍ／ｚ値がある場合は代表値以外を”etc.”として示している。その場合、代表値としては、種間で差異のある代表的なｍ／ｚ値とともに、種間に近似するｍ／ｚ値がある場合はそのｍ／ｚ値を優先して例示している。
なお、例示した４種のタンパク質は、非特許文献１で報告された血清型識別用の１２マーカーのうちの４つで、表６に例示した亜種の識別用マーカーとしては知られていない。
下線の数値のｍ／z値でピークが確認された場合は、そのピークのみで種の識別ができる可能性があることを示している。また、ひとつのタンパク質で識別困難な場合も、複数のタンパク質のｍ／ｚ値を確認することで、識別できる可能があることがわかる。
併せて、前記の表５のような新規マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。

【0076】

【表7】

【0077】

表７は、Salmonella enterica subsp. entericaの血清型１４種（Adelaide、Agama、Agona、Alachua、Albany、Altona、Anatum、Barreilly、Berta、Bovismorbificans、Braenderup、Brancaster、Bredeney、Cerro）に対する新規マーカータンパク質２６種のうち代表７種（YjbJ、ChaB、YeiS、SsaG、YgaM、RaiA、Endolysin）の理論ｍ／ｚ値を示している。表中のハイフンはデータべースのないことを示している。複数のタンパク質のｍ／ｚ値を組み合わせることで識別できる可能性があることがわかる。併せて、後述の表８のような既知マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。

【0078】

【表8】

【0079】

表８は、Salmonella enterica subsp. entericaの血清型１４種（Adelaide、Agama、Agona、Alachua、Albany、Altona、Anatum、Barreilly、Berta、Bovismorbificans、Braenderup、Brancaster、Bredeney、Cerro）に対する既知マーカータンパク質の代表6種（SodA、YibT、L15、PPlase、L25、Gns）の理論ｍ／ｚ値を示している。表中のハイフンはデータべースのないことを示している。複数のタンパク質のｍ／ｚ値を組み合わせることで識別できる可能があることがわかる。なお、SodAは高質量タンパク質のため、他のタンパク質と比べ低感度であること、高質量域で確認されるピーク形状が変異しやすいことなどから、ｍ／ｚ値の精度が低下しやすいことが知られている。
例示した６種のタンパク質は、非特許文献１で報告された２２種の血清型識別用の１２マーカーのうちの６つで、２２種以外の血清型の識別マーカーとして有効なことは厳密には知られていない。表８.では、S. Altona、S. Braenderup以外は２２種以外の血清型にあたる。
また、表７のような新規マーカータンパク質のｍ／ｚ値の検出状況と組み合わせることで、既知マーカータンパク質だけでは困難だった識別もできる可能性がある。

【0080】

表３から８の結果から、遺伝子情報を用いた今回のプロトコルにより確認された新規マーカータンパク質２６種が、サルモネラの種、亜種、血清型の識別に有効であることが判明した。併せて、これらのマーカータンパク質により、既知のマーカータンパク質だけでは困難な識別もできる可能性が示唆された。加えて、本発明の微生物識別用マーカーの特定方法は、遺伝子情報を用いることで、より多くの種、亜種、血清型に対する識別マーカーを特定できる。

【0081】

以上の結果から、遺伝子情報から実測データを予測することが可能であり、遺伝子情報から得られた理論ｍ／ｚ値を比較することで、微生物を識別するマーカーを特定できることが分かった。特に本発明の微生物識別用マーカーの特定方法は、全ゲノム情報が判明しているサルモネラの質量分析を１回行うことにより得られた検出ピークのｍ/ｚ値を利用している。すなわち、１回の実測データを用いて遺伝子情報から異なる種等の実測データを予測し、遺伝子情報からの理論値を比較することで、サルモネラの種、亜種、血清型の識別に有効なマーカーを特定できる。

【0082】

［態様］
上述した例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。

【0083】

［１］下記ステップ１から８を含む微生物識別用マーカーの特定方法。
ステップ１：全ゲノムが解読されている微生物を選定する。
ステップ２：上記ステップ１で選定した微生物が有するタンパク質の質量分析を行い、タンパク質のアミノ酸配列に基づく分子量関連イオンピークを得る。
ステップ３：上記ステップ２で得られた分子量関連イオンピークから各ピークの実測ｍ/ｚ値を得る。
ステップ４：上記ステップ１で選定された微生物について、遺伝子データベースより、当該微生物が有するタンパク質とアミノ酸配列を得、当該アミノ酸配列情報から当該タンパク質の理論ｍ／ｚ値を算出する。
ステップ５：ステップ４で算出した理論ｍ／ｚ値と、上記ステップ３で得られた実測ｍ／ｚ値と比較し、実測ｍ／ｚ値に一致する理論ｍ／ｚ値を有するタンパク質とそのアミノ酸配列に、実測ｍ／ｚ値を帰属する。
ステップ６：上記ステップ５で帰属されたタンパク質と類似のアミノ酸配列をデータベースより入手する。
ステップ７：上記ステップ６で入手した類似のアミノ酸配列を有する微生物のうち、識別分類に応じて微生物を選別し、その微生物が有するタンパク質のアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値を算出する。
ステップ８：ステップ７で算出したアミノ酸配列の理論ｍ／ｚ値を比較し、分類ごとに差異のあるｍ／ｚ値を有するタンパク質を識別のためのマーカーとして特定する。

【0084】

上記［１］の発明によれば、少ない実測データに基づき微生物を識別するためのマーカーを特定する方法が提供される。

【0085】

［２］上記質量分析がＭＡＬＤＩ－ＭＳである上記［１］に記載の微生物識別用マーカーの特定方法。

【0086】

上記［２］の発明によれば、ごく微量の微生物試料を用いて短時間で分析結果を得ることができ、且つ多検体の連続分析も容易である。

【0087】

［３］微生物がサルモネラである上記［１］から［２］のいずれかに記載の微生物識別用マーカーの特定方法。

【0088】

上記［３］の発明によればサルモネラの識別用マーカーを特定することができる。

【0089】

［４］上記［１］に記載の方法により特定された微生物識別用マーカーを用いた微生物の識別方法。

【0090】

上記［４］の発明によれば、微生物を少ない実測で迅速に識別することができる。

【0091】

［５］微生物がサルモネラである上記［４］に記載の微生物の識別方法。

【0092】

上記［５］の発明によればサルモネラを迅速に識別することができる。

【0093】

［６］上記［１］に記載の方法により特定した微生物識別用マーカーとその理論ｍ／ｚ値、および該マーカーに対応する微生物の属、種、亜種、血清型および株とからなる群から選ばれる少なくとも１種を含むデータベース。

【0094】

上記［６］の発明を用いることにより、簡便に微生物を識別することができる。

【図1】

【図2】