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特許7364198ｉＰＳ細胞の生成に使用される新規ＲＮＡ組成物およびその製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-10
(45)【発行日】2023-10-18
(54)【発明の名称】ｉＰＳ細胞の生成に使用される新規ＲＮＡ組成物およびその製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20231011BHJP
C12N 15/40 20060101ALI20231011BHJP
C12N 15/50 20060101ALI20231011BHJP
C12N 15/51 20060101ALI20231011BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20231011BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20231011BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20231011BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20231011BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20231011BHJP
C12N 5/074 20100101ALN20231011BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20231011BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N15/40 ZNA
C12N15/50
C12N15/51
C12N15/11 Z
C12P19/34 A
C12N15/88 Z
C12N15/87 Z
C12N5/10
C12N5/074
C12Q1/686 Z
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2022046234
(22)【出願日】2022-03-23
(65)【公開番号】P2022189717
(43)【公開日】2022-12-22
【審査請求日】2022-04-01
(31)【優先権主張番号】63/209,969
(32)【優先日】2021-06-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/210,988
(32)【優先日】2021-06-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/212,657
(32)【優先日】2021-06-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/222,398
(32)【優先日】2021-07-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/489,357
(32)【優先日】2021-09-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/270,034
(32)【優先日】2021-10-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/280,226
(32)【優先日】2021-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/648,340
(32)【優先日】2022-01-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522115192
【氏名又は名称】シー‐ラン リン
(73)【特許権者】
【識別番号】522115206
【氏名又は名称】サム‐リン
(73)【特許権者】
【識別番号】522115217
【氏名又は名称】チュン‐ハン リン
(74)【代理人】
【識別番号】100087398
【弁理士】
【氏名又は名称】水野 勝文
(74)【代理人】
【識別番号】100128783
【弁理士】
【氏名又は名称】井出 真
(74)【代理人】
【識別番号】100128473
【弁理士】
【氏名又は名称】須澤 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100160886
【弁理士】
【氏名又は名称】久松 洋輔
(74)【代理人】
【識別番号】100192603
【弁理士】
【氏名又は名称】網盛 俊
(72)【発明者】
【氏名】シー‐ラン リン
(72)【発明者】
【氏名】サム‐リン
(72)【発明者】
【氏名】チュン‐ハン リン
【審査官】大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１９／０３３０５９１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５３９９３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５３５６８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５０００２８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
Ｃ１２Ｎ ５／００－２８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも一つのｍｉＲ－３０２前駆ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）構造物と少なくとも一つのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）ｍＲＮＡの混合物を含み、前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物は、その５’末端及び３’末端に、ＲｄＲｐ結合部位を少なくとも含み、
前記５’末端ＲｄＲｐ結合部位は、配列表の配列番号１で表される塩基配列又は配列表の配列番号２で表される塩基配列のいずれか一方の配列を含み、
前記３’末端ＲｄＲｐ結合部位は、配列表の配列番号７で表される塩基配列又は配列表の配列番号８で表される塩基配列のいずれかの一方の配列を含み、
前記ＲｄＲｐｍＲＮＡは、コロナウイルスであるＲＮＡウイルスから単離及び／又は改変されたものである、
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成に用いる新規ＲＮＡ組成物。
【請求項2】
前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２と前記ＲｄＲｐｍＲＮＡの重量比率が、２０：１～１：２０である請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記５’末端ＲｄＲｐ結合部位が、配列表の配列番号３で表される塩基配列、配列表の配列番号４で表される塩基配列、配列表の配列番号５で表される塩基配列、配列表の配列番号６で表される塩基配列、又はこれらを組み合わせた塩基配列を含む配列から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記３’末端ＲｄＲｐ結合部位が、配列表の配列番号９で表される塩基配列、配列表の配列番号１０で表される塩基配列、配列表の配列番号１１で表される塩基配列、配列表の配列番号１２で表される塩基配列、又はこれらを組み合わせた塩基配列を含む配列から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２が、配列表の配列番号１３で表される塩基配列、配列表の配列番号１４で表される塩基配列、配列表の配列番号１５で表される塩基配列、配列表の配列番号１６で表される塩基配列、又はこれらを組み合わせた塩基配列を含む少なくとも一つの配列から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２が、ＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合活性を用いる、新規なポリメラーゼ連鎖反応インビトロ転写法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＰＣＲ－ＩＶＴ） ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を使用して製造される請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＲｄＲｐｍＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合活性を用いる、新規なポリメラーゼ連鎖反応インビトロ転写法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＰＣＲ－ＩＶＴ） ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を使用して製造される請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記ヘリカーゼが、ＤＮＡとＲＮＡの両方の二次元構造を巻き戻すことができる酵素である請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項9】
前記ＰＣＲ－ＩＶＴ法のＩＶＴ反応が、０．００１～１０ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン、ＴＭＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、またはそれらの組み合わせが追加された１ｘ転写バッファーを含む改良されたバッファーシステムで行われる、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項10】
前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞内トランスフェクションを促進する少なくとも一つのデリバリー剤でさらに製剤化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
前記デリバリー剤が、グリシルグリセリン、リポソーム、ナノ粒子、リポソームナノ粒子、コンジュゲート分子、輸液用化学物質、遺伝子銃材料、電気穿孔剤、トランスポゾン及びこれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記ｉＰＳＣが、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の３つすべての胚葉に由来する様々な組織細胞に分化することができる請求項１に記載の組成物。
【請求項13】
前記ｉＰＳＣ由来組織細胞が、細胞療法（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）の開発に使用される請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記ｉＰＳＣが、幹細胞療法（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）の開発に使用される請求項１に記載の組成物。
【請求項15】
前記ｉＰＳＣが、新規な薬物材料の調査及び／又は製造に使用される請求項１に記載の組成物。
【請求項16】
前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物が、初期化関連治療及び薬物の開発に使用される請求項１に記載の組成物。
【請求項17】
前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物が、薬物又は治療の材料として使用される請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、成体幹細胞（ＡＳＣ）と同様に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞；ＩＰＳＣ）の生成及び増殖に有用な新規ＲＮＡ組成物およびその製造方法に関する。本発明のＲＮＡ組成物は、非遺伝子組み換え（ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）ｉＰＳ細胞のみならず、腫瘍のない（ｔｕｍｏｒ－ｆｒｅｅ）ｉＰＳ細胞の製造にも使用することができる。このＲＮＡ組成物は、２種類の異なるＲＮＡ構造物（ＲＮＡ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）を含んでおり、一つは「ｍｉＲ－３０２前駆ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）」であり、もう一方は「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）」ｍＲＮＡである。ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの両方は、ヘアピンやステムループといった高度なＲＮＡ立体配座（ＲＮＡ ｃｏｍｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）を有する。高度に構造化されたＲＮＡを製造するために、新規なＰＣＲ－ＩＶＴ法が開発され、特別に設計されたＲＮＡポリメラーゼ－ヘリカーゼ混合活性（ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ－ｈｅｌｉｃａｓｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）とともに使用された。
【背景技術】
【0002】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣ）は、２００６年にＹａｍａｎａｋａ等によって、３～４種類のタンパク質転写因子を用いて初めて報告された（Ｙａｍａｎａｋａ等に対する米国特許第８，０４８，９９９号および第８，０５８，０６５号；Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ及びＹａｍａｎａｋａ ＳのＣｅｌｌ １２６:６６３－６７６,２００６）。また、その直後の２００７年に、Ｌｉｎ等がマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のｍｉＲ－３０２を用いて、ヒト体細胞を初めてｉＰＳＣに初期化した（Ｌｉｎ等に対する欧州特許第２１９８０２５Ｂ１及び米国特許第９，５６７，５９１号）。Ｌｉｎ等は、ｍｉＲ－３０２を用いて、正常組織細胞だけでなく癌細胞からも腫瘍のないｉＰＳＣを精製した（Ｌｉｎ等，ＲＮＡ １４：２１１５－２１２４，２００８；Ｌｉｎ等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．７０：９４７３－９４８２，２０１０；Ｌｉｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：１０５４－１０６５，２０１１；Ｌｉｎ ＳＬ ａｎｄ Ｙｉｎｇ ＳＹ， ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ Ｅｄ．２３章、２９５－３２４頁，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１２）。その後、２０１１年にＬｉｎ等は、このｍｉＲ－３０２を介した体細胞初期化現象の根底にあるメカニズムをさらに明らかにした（Ｌｉｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：１０５４－１０６５，２０１１；Ｌｉｎ ＳＬ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２９：１６４５－１６４９、２０１１）。２０１１年のＬｉｎの発見に加え、Ｍｉｙｏｓｈｉ等とＡｎｏｋｙｅ－Ｄａｎｓｏ等の２つの独立した研究グループも同時に、ｉＰＳＣ生成におけるｍｉＲ－３０２の必須な役割を確認した（Ｍｉｙｏｓｈｉ等,Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：６３３－６３８，２０１１；Ａｎｏｋｙｅ－Ｄａｎｓｏ等，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：３７６－３８８，２０１１）。結局、これらすべての主要な先行研究および発明は、以下の多くの他のＲＮＡを介したｉＰＳＣ技術のさらなる研究および開発のため、新しい道を切り開くものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
引用した先行研究で示されたように、Ｌｉｎ等は、ｉＰＳＣ生成の初期化効率は、細胞内レベルにおけるｍｉＲ－３０２濃度によって決定されることを明らかにした（Ｌｉｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：１０５４－１０６５，２０１１）。ｉＰＳＣの完全な形成に必要なｍｉＲ－３０２の濃度レベルは、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）株ＷＡ０１－ｈ１またはＷＡ０９－ｈ９で見られるレベルの約１．１～１．３倍以上である。しかし、現在の非ウイルス性ベクターに基づくｍｉＲ－３０２又はｍｉＲ－３０２－ｍｉｍｉｃ ｓｉＲＮＡの体細胞への導入効率は制御が難しく、通常は完全な初期化に必要なｍｉＲ－３０２濃度レベルよりも低くなる。従って、初期化効率を高めるために、ｍｉＲ－３６９やｍｉＲ－３６７のような他の種類のマイクロＲＮＡを加える必要がある（Ｍｉｙｏｓｈｉ等，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：６３３－６３８，２０１１；Ａｎｏｋｙｅ－Ｄａｎｓｏ等，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：３７６－３８８，２０１１）。しかし、ｍｉＲ－３６７及びｍｉＲ－３６９は、ｐ５７（ｋｉｐ２）やｐ６３などのヒト腫瘍抑制遺伝子も不活化するため、得られたｉＰＳＣは、ｍｉＲ－３０２のみを用いて初期化したｉＰＳＣよりも高い腫瘍形成能を示すことが多い。そのため、このような腫瘍形成能の問題を克服するために、デリバリー効率及び／又は初期化効率を高める方法、あるいは細胞内のｍｉＲ－３０２の発現レベルを高める方法が強く望まれている。
【0004】
それだけでなく、ｍｉＲ－３０２を介したｉＰＳＣ生成のもう一つの問題は、ｍｉＲ－３０２前駆ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）の高度な構造の立体配座（ｈｉｇｈｌｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）に起因し、従来の酵素合成法や機械的合成法を用いて製造することが非常に困難であることである。先行するｍＲＮＡ／ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの製造方法は、主にポリメラーゼ連鎖反応およびインビトロ転写（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｖｉｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＰＣＲ－ＩＶＴ））に依存している（Ｌｉｎ等に対する米国特許第７，６６２，７９１号、第８，０８０，６５２号、第８，３７２，９６９号、第８，６０９，８３１号）。しかしながら、これらの先行ＰＣＲ－ＩＶＴ法は、高度な構造のＲＮＡの低生産率を克服できるよう設計されていない。図１に描かれているように、Ｌｉｎの方法はまず、ＩＶＴのためのプロモーター駆動型ＤＮＡテンプレート（ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｄｒｉｖｅｎ ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅｓ）を生成するために、ＰＣＲおよび／または逆転写（ＲＴ）を使用して、得られたＰＣＲ産物に特定のＲＮＡプロモーター－プライマー（ＲＮＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｐｒｉｍｅｒ）を組み込む。次に、ＤＮＡテンプレートから所望のＲＮＡ分子を生成し増幅するためにＩＶＴ反応を行う（Ｌｉｎ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２２１：９３－１０１、２００３）。このＰＣＲ－ＩＶＴ反応を複数回繰り返して、さらに所望のＲＮＡ分子を増幅することができる。その後、所望のＲＮＡを標的細胞にトランスフェクトして、特定の遺伝子をサイレンシングするためのｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を生成することができる（Ｌｉｎ等に対する米国特許第８，３７２，９６９号および同第８，６０９，８３１号）。しかしながら、Ｌｉｎの方法は、少なくとも特定の生物学的効果および／または遺伝子サイレンシング効果を引き出すためのｍＲＮＡ及びｐｉＲＮＡの生産に成功したものの、このように生産されたｍＲＮＡ及びｐｉＲＮＡは高度な構造を有するＲＮＡではなかった。従って、ＬｉｎのＰＣＲ－ＩＶＴ法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの高度な構造を有するＲＮＡの生産効率が低いという問題を克服する有効な方法を開示しない。
【0005】
高度な構造を有するＲＮＡの生産効率が低いという問題を解決するため、原核生物（すなわち、バクテリア）におけるプラスミド駆動型ＲＮＡ発現（ｐｌａｓｍｉｄ－ｄｒｉｖｅｎ ＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を利用する方法が、Ｌｉｎ等によって開発された（Ｌｉｎ等に対する米国特許第９，６３７，７４７号および第９，７８３，８１１号）。これらの原核生物産生ＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２クラスターＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２ ｃｌｕｓｔｅｒ ＲＮＡｓ）を含む１つまたは複数のヘアピン様ステムループ構造を含むことができる。このアプローチでは、ヘアピンＲＮＡによって引き起こされる内在性転写終結（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）の問題を克服するために、化学的転写誘導剤（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｒ）を原核生物細胞培養の培地に加える必要があり（ＭｃＤｏｗｅｌｌ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５，１９９４）、結果としてヘアピン様ＲＮＡ生産が著しく増加することになった。しかしながら、このプラスミド駆動型ＲＮＡ発現方法論は、原核細胞を用いる必要があり、原核生物ではＲＮＡの生産が制限されることも指摘されている。
【0006】
高い処理能力でｉＰＳ細胞生成を実現するため、高度な構造のｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物の細胞内濃度を高めることが本発明の重要な新規性の一つであるため、ここでは、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２産生の低効率問題を克服するだけでなく、標的細胞におけるｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２のデリバリー／初期化効率を高める方法論を持つことが要求される。残念ながら、これまでのＰＣＲ－ＩＶＴとｉＰＳＣ生成法のいずれも、その組み合わせでさえもこの目標を達成することはできていない。したがって、ｉＰＳ細胞生成を誘導及び促進するための新規な細胞内ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２産生方法が強く望まれている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の要旨は、以下のとおりである。
［１］ 少なくとも一つのｍｉＲ－３０２前駆ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）構造物と少なくとも一つのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）ｍＲＮＡの混合物を含み、前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物は、その５’末端、３’末端、又はそれらの両方に、ＲｄＲｐ結合部位を少なくとも含み、前記ＲｄＲｐｍＲＮＡは、ＲＮＡウイルスから単離及び／又は改変されたものである、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成に用いる新規ＲＮＡ組成物。
［２］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２と前記ＲｄＲｐｍＲＮＡの比率が、２０：１～１：２０である［１］に記載の組成物。
［３］ 前記５’末端ＲｄＲｐ結合部位が、配列表の配列番号１で表される塩基配列又は配列表の配列番号２で表される塩基配列のいずれか一方の配列を含む［１］に記載の組成物。
［４］ 前記５’末端ＲｄＲｐ結合部位が、配列表の配列番号３で表される塩基配列、配列表の配列番号４で表される塩基配列、配列表の配列番号５で表される塩基配列、配列表の配列番号６で表される塩基配列、又はこれらを組み合わせた塩基配列を含む配列から選択される［３］に記載の組成物。
［５］ 前記３’末端ＲｄＲｐ結合部位が、配列表の配列番号７で表される塩基配列又は配列表の配列番号８で表される塩基配列のいずれかの一方の配列を含む［１］に記載の組成物。
［６］ 前記３’末端ＲｄＲｐ結合部位が、配列表の配列番号９で表される塩基配列、配列表の配列番号１０で表される塩基配列、配列表の配列番号１１で表される塩基配列、配列表の配列番号１２で表される塩基配列、又はこれらを組み合わせた塩基配列を含む配列から選択される［５］に記載の組成物。
［７］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２が、配列表の配列番号１３で表される塩基配列、配列表の配列番号１４で表される塩基配列、配列表の配列番号１５で表される塩基配列、配列表の配列番号１６で表される塩基配列、又はこれらを組み合わせた塩基配列を含む少なくとも一つの配列から選択される［１］に記載の組成物。
［８］ 前記ＲｄＲｐｍＲＮＡが、ＲＮＡウイルスから単離されたものである［１］に記載の組成物。
［９］ 前記ＲｄＲｐｍＲＮＡが、コロナウイルス又はＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼｍＲＮＡである［１］に記載の組成物。
［１０］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２が、ＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合活性を用いる、新規なポリメラーゼ連鎖反応インビトロ転写法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＰＣＲ－ＩＶＴ） ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を使用して製造される［１］に記載の組成物。
［１１］ 前記ＲｄＲｐｍＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合活性を用いる、新規なポリメラーゼ連鎖反応インビトロ転写法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＰＣＲ－ＩＶＴ） ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を使用して製造される［１］に記載の組成物。
［１２］ 前記ヘリカーゼが、ＤＮＡとＲＮＡの両方の二次元構造を巻き戻すことができる酵素である［１０］又は［１１］に記載の組成物。
［１３］ 前記ＰＣＲ－ＩＶＴ法のＩＶＴ反応が、０．００１～１０ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン、ＴＭＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、またはそれらの組み合わせが追加された１ｘ転写バッファーを含む改良されたバッファーシステムで行われる、［１０］又は［１１］に記載の組成物。
［１４］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞内トランスフェクションを促進する少なくとも一つのデリバリー剤でさらに製剤化されている、［１］に記載の組成物。
［１５］ 前記デリバリー剤が、グリシルグリセリン、リポソーム、ナノ粒子、リポソームナノ粒子、コンジュゲート分子、輸液用化学物質、遺伝子銃材料、電気穿孔剤、トランスポゾン及びこれらの組み合わせを含む、［１４］に記載の組成物。
［１６］ 前記ｉＰＳＣが、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の３つすべての胚葉に由来する様々な組織細胞に分化することができる［１］に記載の組成物。
［１７］ 前記ｉＰＳＣ由来組織細胞が、細胞療法（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）の開発に使用される［１６］に記載の組成物。
［１８］ 前記ｉＰＳＣが、幹細胞療法（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）の開発に使用される［１］に記載の組成物。
［１９］ 前記ｉＰＳＣが、新規な薬物材料の調査及び／又は製造に使用される［１］に記載の組成物。
［２０］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物が、初期化関連治療及び薬物の開発に使用される［１］に記載の組成物。
［２１］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物が、薬物又は治療の材料として使用される［１］に記載の組成物。
［１］ 少なくとも一つのｍｉＲ－３０２前駆ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）構造物と少なくとも一つのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）ｍＲＮＡの混合物を含み、前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物は、その５’末端、３’末端、又はそれらの両方に、ＲｄＲｐ結合部位を少なくとも含み、前記ＲｄＲｐｍＲＮＡは、ＲＮＡウイルスから単離及び／又は改変されたものである、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成に用いる新規ＲＮＡ組成物。
［２］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２と前記ＲｄＲｐｍＲＮＡの比率が、２０：１～１：２０である［１］に記載の組成物。
［３］ 前記５’末端ＲｄＲｐ結合部位が、配列表の配列番号１で表される塩基配列又は配列表の配列番号２で表される塩基配列のいずれか一方の配列を含む［１］に記載の組成物。
［４］ 前記５’末端ＲｄＲｐ結合部位が、配列表の配列番号３で表される塩基配列、配列表の配列番号４で表される塩基配列、配列表の配列番号５で表される塩基配列、配列表の配列番号６で表される塩基配列、又はこれらを組み合わせた塩基配列を含む配列から選択される［３］に記載の組成物。
［５］ 前記３’末端ＲｄＲｐ結合部位が、配列表の配列番号７で表される塩基配列又は配列表の配列番号８で表される塩基配列のいずれかの一方の配列を含む［１］に記載の組成物。
［６］ 前記３’末端ＲｄＲｐ結合部位が、配列表の配列番号９で表される塩基配列、配列表の配列番号１０で表される塩基配列、配列表の配列番号１１で表される塩基配列、配列表の配列番号１２で表される塩基配列、又はこれらを組み合わせた塩基配列を含む配列から選択される［５］に記載の組成物。
［７］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２が、配列表の配列番号１３で表される塩基配列、配列表の配列番号１４で表される塩基配列、配列表の配列番号１５で表される塩基配列、配列表の配列番号１６で表される塩基配列、又はこれらを組み合わせた塩基配列を含む少なくとも一つの配列から選択される［１］に記載の組成物。
［８］ 前記ＲｄＲｐｍＲＮＡが、ＲＮＡウイルスから単離されたものである［１］に記載の組成物。
［９］ 前記ＲｄＲｐｍＲＮＡが、コロナウイルス又はＣ型肝炎ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼｍＲＮＡである［１］に記載の組成物。
［１０］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２が、ＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合活性を用いる、新規なポリメラーゼ連鎖反応インビトロ転写法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＰＣＲ－ＩＶＴ） ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を使用して製造される［１］に記載の組成物。
［１１］ 前記ＲｄＲｐｍＲＮＡが、ＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合活性を用いる、新規なポリメラーゼ連鎖反応インビトロ転写法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ－ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（ＰＣＲ－ＩＶＴ） ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）を使用して製造される［１］に記載の組成物。
［１２］ 前記ヘリカーゼが、ＤＮＡとＲＮＡの両方の二次元構造を巻き戻すことができる酵素である［１０］又は［１１］に記載の組成物。
［１３］ 前記ＰＣＲ－ＩＶＴ法のＩＶＴ反応が、０．００１～１０ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン、ＴＭＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、またはそれらの組み合わせが追加された１ｘ転写バッファーを含む改良されたバッファーシステムで行われる、［１０］又は［１１］に記載の組成物。
［１４］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞内トランスフェクションを促進する少なくとも一つのデリバリー剤でさらに製剤化されている、［１］に記載の組成物。
［１５］ 前記デリバリー剤が、グリシルグリセリン、リポソーム、ナノ粒子、リポソームナノ粒子、コンジュゲート分子、輸液用化学物質、遺伝子銃材料、電気穿孔剤、トランスポゾン及びこれらの組み合わせを含む、［１４］に記載の組成物。
［１６］ 前記ｉＰＳＣが、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の３つすべての胚葉に由来する様々な組織細胞に分化することができる［１］に記載の組成物。
［１７］ 前記ｉＰＳＣ由来組織細胞が、細胞療法（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）の開発に使用される［１６］に記載の組成物。
［１８］ 前記ｉＰＳＣが、幹細胞療法（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）の開発に使用される［１］に記載の組成物。
［１９］ 前記ｉＰＳＣが、新規な薬物材料の調査及び／又は製造に使用される［１］に記載の組成物。
［２０］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物が、初期化関連治療及び薬物の開発に使用される［１］に記載の組成物。
［２１］ 前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物が、薬物又は治療の材料として使用される［１］に記載の組成物。
【図面の簡単な説明】
【0008】
図面は、説明を目的とするものであり、ここに示されるものに限定されない。
【図1】図１は、ＰＣＲ－ＩＶＴ法の段階的な手順を示したものである。ＲＮＡの製造には、このＰＣＲ－ＩＶＴ法の一部または全部の手順を採用し、所望のＲＮＡ産物の単一サイクルによる増幅や複数サイクルによる増幅のいずれもが可能である。
【図2】図２は、ｍｉＲ－３０２前駆ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）構造物の好ましい設計の１つを描いたものである。少なくとも一つまたはそれ以上のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）結合部位は、プレ－ｍｉＲ－３０２構造物の５’末端または３’末端領域のいずれか、または両方に配置することができる。
【図3】図３は、ノーザンブロット解析による、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２のみを導入した場合（中央）と比較した、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの両方を共導入した後（右）の初期化細胞におけるｍｉＲ－３０２ｓ（すなわち上からｂ、ｃ、ｄ、ａ）及びＲｄＲｐｍＲＮＡの顕著な発現増加を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明は、２０２１年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／２０９，９６９号（名称「Ｎｏｖｅｌ ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」）の優先権を主張するものである。本発明はまた、「Ｎｏｖｅｌ ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」を名称とする、２０２１年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／２１０，９８８号、２０２１年６月１９日に出願された６３／２１２，６５７号、及び２０２１年７月１５日に出願された６３／２２２，３９８号の優先権を主張するものである。本発明はさらに、Ｎｏｖｅｌ ＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ ｉＰＳ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」を名称とする、２０２１年１０月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／２７０，０３４号、及び２０２１年１１月１７日に出願された６３／２８０，２２６号の優先権を主張するものである。本発明はさらに、「Ｎｏｖｅｌ ｍＲＮＡ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉ－Ｖｉｒａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」を名称とする、２０２１年９月２９日に出願された米国特許出願第１７／４８９，３５７号の優先権を主張するものである。また、本出願は、２０２２年１月１９日に出願された米国特許出願第１７／６４８，３４０号の優先権を主張するものである。
【0010】
本発明は、人工的に添加したＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）増幅活性により刺激される細胞内ｍｉＲ－３０２前駆ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）生成の新規なメカニズムを利用して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）生成を誘導及び促進する方法である。ＲｄＲｐは、ＲＮＡウイルス、好ましくはコロナウイルスやＣ型肝炎ウイルスなど、から単離及び／又は改変されたものである。従来のトランスフェクション法は、体細胞を完全に初期化してｉＰＳＣを形成するために必要な十分なｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２をデリバリーすることが困難であるため、本発明は、このトランスフェクション／デリバリーの問題を克服するために、新規な細胞内ＲｄＲｐ仲介増幅機構（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ＲｄＲｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を採用する。この新規なＲｄＲｐ仲介増幅機構によって、デリバリーされたわずかな量のｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２でさえ、トランスフェクトされた細胞内で少なくとも４０～１０００倍以上に増幅され、ｉＰＳ細胞を形成するための体細胞の初期化を完全に誘導し増強するのに十分な細胞内ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２濃度を提供することが可能である。また、考えられる限り、ＲｄＲｐを介したＲＮＡ増幅機構を利用して、少なくともＲｄＲｐ結合部位を有する他の種々のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡ、特に、ウイルス性、病原性抗原ＲＮＡや既知の機能性ＲＮＡ／ｍＲＮＡを製造及び増幅し、抗ウイルスおよび／または抗病／癌ワクチンや医薬の開発に役立てることが可能である。
【0011】
体細胞にはｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２もＲｄＲｐも存在しないため、当業者が体細胞におけるｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２の増幅を予想することは妥当ではない。ｍｉＲ－３０２は、ヒトＥＳＣやｉＰＳＣなどの多能性幹細胞でのみ発現する主要な標準胚性幹細胞（ＥＳＣ）マーカーの１つである。一方、ＲｄＲｐは、主にＲＮＡウイルスに存在し、ＲＮＡウイルスの増殖に必要である。そのため、自然環境下では、ＲＮＡウイルスの感染させた後であっても、体細胞では初期化は起こらない。しかしながら、本発明は、ＲＮＡウイルス感染前に、特別に設計したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物で体細胞をあらかじめトランスフェクトしておくと、体細胞の初期化が容易に起こることを初めて明らかにした。ＲＮＡウイルス感染時、ウイルスＲｄＲｐは、全ての細胞内ＲＮＡを同じ割合でランダムに増幅するのではなく、ウイルスＲＮＡのような少なくともＲｄＲｐ結合部位を持つＲＮＡをより好ましく増幅する。この増幅率の差は、数百倍から千倍以上にもなる。同じメカニズムを使用して、我々が設計したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物は、少なくとも単離されたＲｄＲｐ結合部位を持っている。このようにして、ＲｄＲｐはトランスフェクトされた細胞内で設計されたｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物を４０～１０００倍に増幅して、細胞内のｍｉＲ－３０２濃度を著しく上昇し、そのレベルはｉＰＳ細胞の生成を完全に誘導及び促進するのに十分なレベルである。
【0012】
私たちが特別に設計したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物の一般的な構造は、少なくともヘアピン状のｍｉＲ－３０２前駆（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）配列を含み、その５'末端または３'末端領域のいずれか、あるいは両方に少なくともＲｄＲｐ結合部位（プロモーターおよび／またはエンハンサーに相当）が隣接されている。図２に示すように、所望のＲｄＲｐ活性を効率的に開始させるために、設計されたｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物は、少なくとも一つの５'末端のフォワードＲｄＲｐ開始/結合部位（５’－ｅｎｄ ｆｏｒｗａｒｄ ＲｄＲｐ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ／ｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ）、または少なくとも一つの３'末端のリバースＲｄＲｐ開始/結合部位（３’－ｅｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ＲｄＲｐｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ／ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）、またはその両方を含む必要がある。開始／結合部位の前後に、所望のＲｄＲｐ伸長活性に由来する、アデノシン／ウリジン－リッチ（Ａ／Ｕ－ｒｉｃｈ）モチーフの約１～５５ヌクレオチドの短い配列をさらに含んでいてもよい。５'末端ＲｄＲｐ開始／結合部位は、少なくとも５’－ＡＵ（Ｇ／Ｃ）（Ｕ／－）Ｇ（Ａ／Ｕ）－３’（すなわち、５’－ＡＵＳＵＧＷ－３’：配列番号１）または５’－Ｕ（Ｃ／－）（Ｕ／Ａ）Ｃ（Ｕ／Ｃ）（Ｕ／Ａ）Ａ－３’（すなわち、５’－ＵＣＷＣＹＷＡ－３’：配列番号２）のいずれか一方、またはその両方の配列を含む。例えば、５'末端ＲｄＲｐ開始／結合部位は、５’－ＡＵＣＵＧＵ－３’（配列番号３）、５’－ＵＣＵＣＵＡＡ－３’（配列番号４）、５’－ＵＣＵＣＣＵＡ－３’（配列番号５）、及び／又は５’－ＵＵＣＡＡ－３’（配列番号６）又はその組み合わせを含む少なくとも一つの配列から選択することが好ましい。一方、３’末端ＲｄＲｐ開始／結合部位は、少なくとも５’－（Ｕ／Ａ）Ｃ（Ａ／－）（Ｃ／Ｇ）ＡＵ－３’（すなわち５’－ＷＣＡＳＡＵ－３’；配列番号７）または５’－Ｕ（Ａ／Ｕ）（Ａ／Ｇ）Ｇ（Ａ／Ｕ）（Ｇ／－）Ａ－３’（すなわち、５’－ＵＷＲＧＷＲ－３’；配列番号８）のいずれか一方、またはその両方の配列を含む。例えば、３’末端ＲｄＲｐ開始／結合部位は、少なくとも５’－ＡＣＡＧＡＵ－３’（配列番号９），５’－ＵＵＡＧＡＧＡ－３’（配列番号１０），５’－ＵＡＧＧＡＧＡ－３’（配列番号１１）および／または５’－ＵＵＧＡＡ－３’（配列番号１２）、あるいはその組み合わせを含む少なくとも一つの配列から選択することが好ましい。注目すべきは、これらの定義されたＲｄＲｐ開始／結合部位は、本発明の発明者らによって排他的に同定されたことである。この特別な新規な設計により、所望のＲｄＲｐ活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、設計されたｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか、あるいは両方を、細胞内で効率的に転写および増幅させることが可能である。
【0013】
好ましい一実施形態では、特別に設計されたＲＮＡ（すなわち、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２および／またはＲｄＲｐ ｍＲＮＡ、または他のＲＮＡ／ｍＲＮＡ）構造物は、その５’－および３’末端領域の両方に、少なくともＲｄＲｐ結合部位を含んでいる。設計されたＲＮＡ構造物の両末端は、ＲｄＲｐによるＲＮＡ増幅のために、少なくともＲｄＲｐ結合部位を有するので、センス鎖ＲＮＡはその相補的アンチセンスＲＮＡ（ｃＲＮＡまたはａＲＮＡ）を増幅するために用いられ、アンチセンス鎖ＲＮＡはセンスＲＮＡも増幅するために用いられ、その結果センスおよびアンチセンス鎖ＲＮＡの両方の増幅サイクルを形成し、その設計ＲＮＡ構造物の増幅率を最大にすることができる。また、得られた増幅ＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、トランスフェクション後の細胞内でさらに二本鎖ＲＮＡを形成し、設計されたＲＮＡ構造物のｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、および／またはｐｉＲＮＡの形成を促進することができる。
【0014】
あるいは、別の好ましい実施形態では、特別に設計されたＲＮＡ構造物は、その５’末端または３’末端の領域のいずれかに少なくとも一つのＲｄＲｐ結合部位を含む。このようにして、設計されたＲＮＡ構造物のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを選択的に増幅することができ、設計されたＲＮＡ構造物の所望の鎖をより特異的に増幅させることにつながる。特に、この方法は、トランスフェクション後の細胞において、特定の機能性タンパク質のアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）またはｍＲＮＡのいずれかを生成及び増幅し、トランスフェクション後の細胞における機能性タンパク質を生成／増加又は抑制／減少させるために有用な手法である。
【0015】
また、設計されたｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物は、好ましくは５’－ＣＣＵＵＵＧＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＧＧＧ ＵＡＣＣＵＧＣＵＧＵ ＧＵＧＡＡＡＣＡＡＡ ＡＧＵＡＡＧＵＧＣＵ ＵＣＣＡＵＧＵＵＵＣ ＡＧＵＧＧＡＧＧ－３’（６８塩基；配列番号１３）、５’－ＧＣＵＣＣＣＵＵＣＡ ＡＣＵＵＵＡＡＣＡＵ ＧＧＡＡＧＵＧＣＵＵ ＵＣＵＧＵＧＡＣＵＵ ＵＡＡＡＡＧＵＡＡＧ ＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧ ＵＵＵＵＡＧＵＡＧＧ ＡＧＵ－３’（７３塩基；配列番号１４）、５’－ＣＣＡＣＣＡＣＵＵＡ ＡＡＣＧＵＧＧＡＵＧ ＵＡＣＵＵＧＣＵＵＵ ＧＡＡＡＣＵＡＡＡＧ ＡＡＧＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＵＧＧＵＧＡＵＧＧ－３’（６９塩基；配列番号１５）、及び／又は５’－ＣＣＵＣＵＡＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＡＧＧ ＣＡＣＵＵＧＣＵＧＵ ＧＡＣＡＵＧＡＣＡＡ ＡＡＡＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＧＡＧＵＧＵＧＧ－３’（６８塩基；配列番号１６）、またはそれらの組合せから選ばれる１または複数のヘアピン様ｍｉＲ－３０２前駆配列（ｈａｉｒｐｉｎ－ｌｉｋｅ ｍｉＲ－３０２ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）が含まれていてもよい。２つの個々のｍｉＲ－３０２前駆配列の間には、ヘアピンのもつれ形成（ｔａｎｇｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を防止するための５０～５００ヌクレオチドのスペーサー配列（ｓｐａｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）がさらに含まれていてもよい。これらのｍｉＲ－３０２前駆配列は、考えられる限りでは、同じ機能的目的を引き出すために、ｍｉＲ－３０２－ｍｉｍｉｃ短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））および／または小ヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））配列で置き換えることができる。また、これらの配列のウリジン（Ｕ）含有量をシュードウリジンおよび／または他の修飾ヌクレオチドで置換して、設計したプレｍｉＲ－３０２構造物およびＲｄＲｐｍＲＮＡの安定性を向上させることができる。
【0016】
このような高度な構造のｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物及びＲｄＲｐｍＲＮＡを効率よく作製するために、我々は、高度な構造のＲＮＡ生成の低効率問題を克服する新規なＰＣＲ－ＩＶＴ法を開発した（Ｌｉｎ等に対する米国特許出願第１７／４８９，３５７号に示す）。ヘアピン様ＲＮＡ構造の存在がＲＮＡ転写を大きく阻害することが知られているため、従来、当業者はｉｎ ｖｉｔｒｏで高度な構造のＲＮＡを効率的に生成することを予想し得なかった。実際、ヘアピン様ステムループ構造は、原核生物ＲＮＡポリメラーゼにとって固有の転写終了のシグナルである（ＭｃＤｏｗｅｌｌ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５，１９９４）。この問題を解決するために、本発明では、ＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの活性を混合した新規なＩＶＴシステムを採用した。ＩＶＴにヘリカーゼ活性を加えることにより、鋳型ＤＮＡと得られるＲＮＡ生成物の二次構造を顕著に減少させ、より効率的に高度な構造のＲＮＡを生産することができる。従って、ＩＶＴにおけるＲＮＡポリメラーゼとヘリカーゼの混合活性の効率を、維持及び向上する改良されたバッファーシステムも必要である。興味深いことに、いくつかの先行研究では、ヘリカーゼが原核生物の転写終結に関与している可能性が報告されていたが、本発明は、ＩＶＴ中のＲＮＡ生産におけるヘリカーゼの全く異なる機能性を実証するものであった。
【0017】
限定されるものではないが、特別に設計されたｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物及びＲｄＲｐｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの細胞内デリバリー／トランスフェクションを促進するために、グリシルグリセリン由来化学物質、リポソーム、ナノ粒子、リポソームナノ粒子（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＬＮＰ））、コンジュゲート分子（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、輸液・輸血用化学物質（ｉｎｆｕｓｉｏｎ／ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、遺伝子銃材料（ｇｅｎｅ ｇｕｎ ｍａｔｅｒｉａｌｓ）、電気穿孔剤（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔｓ）、トランスポゾン／レトランスポゾン、およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも少なくとも一つの送達／トランスフェクション剤（ｄｅｌｉｖｅｒｙ／ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）と混合、複合化、カプセル化および／または製剤化することができる。
【0018】
設計したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物とＲｄＲｐｍＲＮＡを目的の標的細胞にコトランスフェクション（共移入）すると、体細胞の初期化と呼ばれる誘導生物学的プロセス（ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ）により、初期化する細胞の種類にもよるが、１週間から２週間でｉＰＳＣが速やかに形成される。Ｌｉｎの先行する総説論文では、この初期化事象の基礎的なメカニズムは既に開示されている（Ｌｉｎ ＳＬ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２９：１６４５－１６４９，２０１１）。実験において、発明者等は、単離正常線維芽細胞、単離正常皮膚細胞（ｉｎ ｖｉｔｒｏならびにｅｘ ｖｉｖｏ）、単離ヒト白血病細胞、ヒト肺上皮細胞株 ＢＥＡＳ－２Ｂならびに癌性肺ＮＳＣＬＣ Ａ５４９、乳腺癌 ＭＣＦ７、前立腺癌 ＰＣ３、肝細胞癌 ＨｅｐＧ２および皮膚メラノーマ Ｃｏｌｏ－８２９細胞などの、ヒト正常体細胞と癌性体細胞の両方でこの新規な初期化方法論をすでにテストしている。従って、これらの様々なヒト細胞の高いゲノム類似性に鑑みて、ｉＰＳＣに初期化可能な細胞タイプとしては、正常ヒト組織細胞（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｃｅｌｌｓ）、体細胞、疾患細胞（ｄｉｓｅａｓｅｄ ｃｅｌｌｓ）、腫瘍／癌細胞、皮膚内容物関連細胞（ｓｋｉｎ－ｃｏｎｔｅｎｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）、および／または血液内容物関連細胞（ｂｌｏｏｄ－ｃｏｎｔｅｎｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）、およびこれらの組み合わせを含む細胞基質が挙げられるが、これらに限定されない。
【0019】
本発明者らは、本発明を用いて、（１）ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡをコトランスフェクションした後の初期化細胞におけるｍｉＲ－３０２発現の顕著な増加（図３）、（２）ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡをコトランスフェクションして２～３日後の初期化細胞に見られるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇなどの標準ＥＳＣマーカーの高い発現（図４）、（３）ｉＰＳＣ由来の胚様体形成（図５）、（４）接合体ゲノムと同様の広域のゲノムＤＮＡの脱メチル化の観察（図６）、（５）ヒトＥＳＣ ＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９）細胞株と比較してゲノム全体の遺伝子発現パターンの類似度が９２％以上高いこと（図７）、及び、（６）３胚葉（外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉）由来の組織を含むｉＰＳＣ由来のテラトーマ形成（図８）の６つの領域で、ｉＰＳＣの作製が成功したという証拠を集めた。さらに、本発明者等は、エレクトロポレーションに基づくデリバリー方法を用いて、同様のｉＰＳＣ生成の結果を得ることにも成功した。ｍｉＲ－３０２の機能は、７０％超の高い成功率で、正常および癌組織細胞を腫瘍のないＥＳＣ様のｉＰＳＣに再プログラムすることが知られていることから、この新規発明の知見は、幹細胞治療および抗癌治療の双方における高度なアプリケーションの設計および開発に大きな利益をもたらすと考えられる。
【0020】
設計されたｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２及びＲｄＲｐｍＲＮＡ混合組成物を使用してｉＰＳＣ生成を誘導する利点には、（１）トランスジェニックの懸念がない、（２）倫理的懸念がない、（３）無腫瘍グレードの高い安全性（tｕｍｏｒ－ｆｒｅｅ ｇｒａｄｅｈｉｇｈ ｓａｆｅｔｙ）、（４）取り扱いと準備が容易、（５）７０％を超えるｉＰＳＣ形成効率、（７）１～２週間以内の安定で速い初期化効率、及び（８）ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞初期化で使用できる複数の用途、が含まれる。さらに、Ｌｉｎ等に対する先行米国特許出願第１５／６６１，３４６号および第１６／１３５，７２３号を考慮すると、本発明はまた、同様に成人幹細胞集団（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ（ＡＳＣ） ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）を生成および拡大するために使用することができる。本発明は、考えられる限り、医薬品と同様に、細胞ベースおよび／または初期化関連治療などの新しい医薬および治療用途またはデバイスを設計および開発するのに有用である。
【0021】
ここで、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【0022】
核酸：デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）のポリマーで、一本鎖または二本鎖のいずれかをいう。
【0023】
ヌクレオチド：糖成分（ペントース）、リン酸、及び含窒素複素環塩基（ｎｉｔｒｏｇｅｎｏｕｓ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ｂａｓｅ）からなる、ＤＮＡまたはＲＮＡの単量体単位である。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖成分に結合しており、塩基と糖の組み合わせがヌクレオシドである。ペントースの３’または５’位に結合した少なくとも１つのリン酸基を含むヌクレオシドがヌクレオチドである。ＤＮＡはデオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡはリボヌクレオチドという異なる種類のヌクレオチド単位から構成されている。
【0024】
オリゴヌクレオチド：ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの２個以上の単量体単位からなる分子で、好ましくは３個以上、通常は１０個以上である。１３個以上のヌクレオチド単量体のオリゴヌクレオチドを、ポリヌクレオチドと呼ぶこともある。正確なサイズは、多くの要因に依存し、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または用途に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、逆転写、またはそれらの組み合わせなど、どのような方法で生成されてもよい。
【0025】
ヌクレオチド類似体（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ）：アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、またはウラシル（Ｕ）とは構造的に異なるが、核酸分子中の通常のヌクレオチドに置き換えるには十分に類似しているプリンまたはピリミジンヌクレオチドである。
【0026】
核酸組成物：核酸組成物とは、一本鎖または二本鎖の分子構造で、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、若しくはＤＮＡ／ＲＮＡ混合配列などのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのことをいう。
【0027】
遺伝子：オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列がＲＮＡおよび／またはポリペプチド（タンパク質）をコードしている核酸組成物である。遺伝子は、ＲＮＡでもＤＮＡでもよい。遺伝子は、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、およびそれらのＲＮＡ前駆体ならびに誘導体などのノンコーディングＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）をコードしていてもよい。あるいは、遺伝子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびそのＲＮＡ前駆体ならびに誘導体など、タンパク質／ペプチド合成に必須のタンパク質コーディングＲＮＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）をコードするものであってもよい。あるケースでは、遺伝子は、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ配列の少なくとも一つを含むタンパク質コードＲＮＡをコードしていてもよい。
【0028】
一次ＲＮＡ転写産物：ＲＮＡのプロセシングや修飾を行わず、遺伝子から直接転写されたＲＮＡ配列である。
【0029】
メッセンジャーＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ））：タンパク質コーティング遺伝子の一次ＲＮＡ転写産物で、転写と呼ばれる細胞内機構を介して、真核生物におけるＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ－ＩＩ）機構によって生成される。ｐｒｅ－ｍＲＮＡの配列には、５’－非翻訳領域（５’－ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ（ＵＴＲ））、３’－ＵＴＲ、エクソン、及びイントロンが含まれる。
【0030】
イントロン：インフレームイントロン（ｉｎ－ｆｒａｍｅ ｉｎｔｒｏｎ）、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲなどの非タンパク質リーディングフレーム（ｎｏｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ－ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ）をコードする遺伝子転写配列の一部または部分である。
【0031】
エクソン：細胞遺伝子、成長因子、インスリン、抗体およびそれらのアナログ／ホモログ、ならびに誘導体のためのｃＤＮＡのようなタンパク質リーディングフレーム（ｃＤＮＡ）をコードする遺伝子転写配列の一部または全部である。
【0032】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：ｐｒｅ－ｍＲＮＡエクソンの集合体で、細胞内のＲＮＡスプライシング機構（スプライソソームなど）によってイントロンが除去されて形成され、ペプチド／タンパク質合成のためのタンパク質コーディングＲＮＡとして機能する。ｍＲＮＡがコードするペプチド／タンパク質には、酵素、成長因子、インスリン、抗体およびそれらのアナログ／ホモログ、ならびに誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0033】
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）：ｍＲＮＡの配列と相補的な配列を持つ、イントロン配列を含まない一本鎖または二本鎖のＤＮＡである。
【0034】
センス：相同ｍＲＮＡ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｍＲＮＡ）と同じ配列順序及び組成の核酸分子。センス型は「＋」、「ｓ」または「ｓｅｎｓｅ」の記号で表示される。
【0035】
アンチセンス：それぞれのｍＲＮＡ分子に相補的な核酸分子。アンチセンス型は、「－」の記号で表示されるか、または、「ａＤＮＡ」や「ａＲＮＡ」のように、ＤＮＡやＲＮＡの前に「ａ」や「ａｎｔｉｓｅｎｓｅ」を付けて表示される。
【0036】
塩基対（ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の相互関係、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の相互関係のこと。ＲＮＡでは、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）が使われている。一般に、相互関係は水素結合によって達成される。例えば、センスヌクレオチド配列「５’－Ａ－Ｔ－Ｃ－Ｇ－Ｕ－３’」は、アンチセンス配列「５’－Ａ－Ｃ－Ｇ－Ａ－Ｔ－３’」と完全に塩基対を形成することができる。
【0037】
５’末端：あるヌクレオチドの５’－水酸基が次のヌクレオチドの３’－水酸基とホスホジエステル結合で接合している連続するヌクレオチドにおける５’位のヌクレオチドが欠けた末端である。末端には、１つ以上のリン酸塩などの他の基が存在してもよい。
【0038】
３’末端：あるヌクレオチドの５’－水酸基が次のヌクレオチドの３’－水酸基とホスホジエステル結合で接合している連続するヌクレオチドにおける３’位のヌクレオチドが欠けた末端である。末端には、他の基、多くの場合は水酸基、が存在してもよい。
【0039】
テンプレート：核酸ポリメラーゼによってコピーされる核酸分子である。テンプレートは、ポリメラーゼに応じて、一本鎖、二本鎖、部分二本鎖、ＲＮＡ、ＤＮＡのいずれでもよい。合成されたコピーは、テンプレートに相補的であるか、二本鎖または部分的に二本鎖のテンプレートの少なくとも一本の鎖に相補的である。ＲＮＡもＤＮＡも５’から３’の方向で合成される。核酸二重鎖の２本鎖は、常に２本鎖の５’末端が二重鎖の反対側の端になるように（必然的に３’端もそうなるように）整列している。
【0040】
核酸テンプレート：二本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、ＤＮＡ－ＲＮＡあるいはＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドなどのハイブリッド分子、又は一本鎖ＤＮＡあるいは一本鎖ＲＮＡ分子である。
【0041】
保存される：事前に選択された配列の正確な相補物に非ランダムにハイブリダイズする場合、事前に選択された（参照された）配列に対してヌクレオチド配列が保存されていると言える。
【0042】
相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｏｒ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）：ポリヌクレオチドと遺伝子又はｍＲＮＡ配列との類似性を示す用語である。核酸配列は、例えば、特定の遺伝子やｍＲＮＡ配列と部分的または完全に相同であることがある。相同性は、ヌクレオチドの総数に対する類似ヌクレオチドの数によって決定される割合で表すことができる。
【0043】
相補性又は相補的（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｏｒ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）：前述の「塩基対（ｂｐ）」の規則で関連付けられた２つのポリヌクレオチド（すなわち、ｍＲＮＡとｃＤＮＡの配列）間でマッチした塩基対（ｍａｔｃｈｅｄ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）を指す用語である。例えば、「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－３’」という配列は、「５’－Ａ－Ｃ－Ｔ－３’」だけでなく「５’－Ａ－Ｃ－Ｕ－３’」にも相補的である。相補性は、２本のＤＮＡ鎖間、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖間、２本のＲＮＡ鎖間であり得る。相補性は「部分的」であっても「完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）」であっても「全体的（ｔｏｔａｌ）」であってもよい。部分的な相補性又は相補的（Ｐａｒｔｉａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、核酸塩基の一部のみが塩基対形成規則に従ってマッチする場合に生じる。完全又は全体的な相補性（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｏｒ ｔｏｔａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）は、塩基が核酸鎖間で完全にまたは完璧にマッチする場合に生じる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率と強さに大きな影響を与える。これは、増幅反応や、核酸同士の結合に依存する検出方法において特に重要である。相補性の割合は、核酸の１本の鎖の全塩基数に対するミスマッチ塩基（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｂａｓｅｓ）数の割合を指す。したがって、５０％の相補性は、半分の塩基がミスマッチで、半分がマッチしていることを意味する。塩基数が２本の鎖で異なっていても、核酸の２本鎖が相補的になることがある。この場合、長い方の鎖の塩基が短い方の鎖の塩基と対になっている部分の間で相補性が生じる。
【0044】
相補的塩基：ＤＮＡまたはＲＮＡが二本鎖構造をとる際に、通常対になるヌクレオチドである。
【0045】
相補的ヌクレオチド配列：他の一本鎖上のヌクレオチドと十分に相補的で、二本鎖間で特異的にハイブリダイズし、結果として水素結合が生じる、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖分子におけるヌクレオチド配列。
【0046】
ハイブリダイズおよびハイブリダイゼーション：塩基対を介して複合体を形成するのに十分な相補性を持つヌクレオチド配列間の二重鎖の形成を指す。プライマー（またはスプライステンプレート）が標的（テンプレート）と「ハイブリダイズ」する場合、そのような複合体（またはハイブリッド）は、ＤＮＡ合成を開始するためにＤＮＡポリメラーゼに要求されるプライミング機能を果たすのに十分安定である。２つの相補的なポリヌクレオチドの間には、特異的な、すなわち非ランダムな相互作用が存在し、競合的に阻害されることがある。
【0047】
転写後遺伝子サイレンシング（Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）：ｍＲＮＡの分解や翻訳抑制のレベルで標的遺伝子をノックアウトまたはノックダウンする効果であり、通常、外来／ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡ導入遺伝子、若しくは低分子抑制ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡｓ）のいずれかが引き金となる。
【0048】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）：真核生物における転写後の遺伝子サイレンシングで、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））などの低分子阻害性ＲＮＡ分子（ｓｍａｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）が引き金となり得る。これらの低分子ＲＮＡ分子は通常、遺伝子サイレンサーとして機能し、低分子ＲＮＡに完全または部分的に相補な部分を含む細胞内遺伝子の発現を阻害する。
【0049】
遺伝子サイレンシング効果：遺伝子の機能が抑制された後の細胞応答であり、限定されるものではないが、細胞周期の減衰、Ｇ０／Ｇ１チェックポイントの停止、腫瘍抑制、抗腫瘍性、癌細胞のアポトーシス、およびそれらの組み合わせからなる。
【0050】
ノンコーディングＲＮＡ：細胞内の翻訳機構を介してペプチドやタンパク質を合成することができないＲＮＡ転写産物。ノンコーディングＲＮＡには、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）など、長い調節ＲＮＡ分子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）及び短い調節ＲＮＡ分子が含まれる。これらの調節ＲＮＡ分子は通常、遺伝子サイレンサーとして機能し、ノンコーディングＲＮＡと完全または部分的に相補な部分を含む細胞内遺伝子の発現を阻害する。
【0051】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：ｍｉＲＮＡと部分的に相補性を持つ標的遺伝子の転写産物に結合することができる一本鎖ＲＮＡ。ｍｉＲＮＡは通常１７－２７オリゴヌクレオチド程度の長さで、ｍｉＲＮＡとその標的ｍＲＮＡの相補性に応じて、細胞内の標的ｍＲＮＡを直接分解（ｄｅｇｒａｄｅ）したり、標的ｍＲＮＡのタンパク質翻訳を抑制したりすることが可能である。天然のｍｉＲＮＡは、ほぼ全ての真核生物に存在し、ウイルス感染に対する防御や、動植物の発達過程における遺伝子発現の制御を可能にしている。
【0052】
マイクロＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ＭｉｃｒｏＲＮＡ（Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ））：ヘアピン状の一本鎖ＲＮＡであり、細胞内のＲＮａｓｅＩＩＩエンドリボヌクレアーゼと相互作用し、マイクロＲＮＡ配列と相補的な遺伝子又は標的遺伝子をサイレンシングできる１つまたは複数のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を生成するためのステムアーム領域とステムループ領域を持つ。Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのステムアームは、完全（１００％）または部分的（ミスマッチ）なハイブリッド二重鎖を形成することでき、ステムループはステムアーム二重鎖の一端を連結して円またはヘアピンループ構造を形成する。ただし、本発明では、マイクロＲＮＡの前駆体はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡも含むことができる。
【0053】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））：約１８～２７個の完全な塩基対リボヌクレオチド二重鎖（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｂａｓｅ－ｐａｉｒｅｄ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｄｕｐｌｅｘｅｓ）のサイズであり、ほぼ完全に相補的な標的遺伝子転写物を分解することができる短い二本鎖ＲＮＡである。
【0054】
スモール又はショートヘアピンＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｏｒ ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））：一本鎖ＲＮＡで、部分的または完全にマッチしたステムアームヌクレオチド配列のペアが、ミスマッチのループまたはバブルオリゴヌクレオチド（ｌｏｏｐ ｏｒ ｂｕｂｂｌｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）で分割され、ヘアピン状の構造を形成したものである。多くの天然ｍｉＲＮＡは、スモールヘアピン様ＲＮＡ前駆体、すなわちマイクロＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）に由来する。
【0055】
ベクター：異なる遺伝子環境（ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ）中を移動及び滞留可能な組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）などの組換え核酸組成物である。一般に、そこに別の核酸が作動可能に連結されている。ベクターは、細胞内で自律的に複製することが可能であり、その場合、ベクターおよび付随するセグメントが複製される。好ましいベクターの１つのタイプは、エピソーム、すなわち、染色体外複製（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が可能な核酸分子である。好ましいベクターは、核酸の自律的な複製および発現が可能なベクターである。１つ以上のポリペプチドおよび／またはノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子の発現を指示することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ）」または「発現可能ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ）」と呼ばれる。特に重要なベクターは、逆転写酵素を用いて産生されたｍＲＮＡからｃＤＮＡをクローニングすることを可能にする。ベクターは、ウイルスまたはＩＩ型ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ－ＩＩまたはｐｏｌ－２）プロモーター、あるいはその両方、コザックコンセンサス翻訳開始点（Ｋｏｚａｋ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）、ポリアデニル化シグナル、複数の制限／クローニングサイト、ｐＵＣ複製起点（ｐＵＣ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、複製可能原核細胞（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌｓ）において少なくとも抗生物質耐性遺伝子を発現するためのＳＶ４０アーリープロモーター（ＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、哺乳動物細胞における複製のためのオプショナルＳＶ４０起点（ｏｐｔｉｏｎａｌ ＳＶ４０ ｏｒｉｇｉｎ）、及び／又はテトラサイクリン応答性要素（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔ）からなる構成要素を含むことができる。ベクターの構造は、プラスミド、ウイルスベクター、トランスポゾン、レトロトランスポゾン、ＤＮＡ導入遺伝子（ＤＮＡ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）、ジャンピング遺伝子（ｊｕｍｐｉｎｇ ｇｅｎｅ）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される一本鎖または二本鎖ＤＮＡの線形または環状の形態であり得る。
【0056】
プロモーター：ポリメラーゼ分子が認識し、おそらく結合し、ＲＮＡの転写を開始する核酸。本発明の目的によると、プロモーターは、既知のポリメラーゼ結合部位、エンハンサー等であり得、所望のポリメラーゼによるＲＮＡ転写産物の合成を開始させることができる任意の配列であり得る。
【0057】
制限部位：制限酵素切断のためのＤＮＡモチーフであり、限定されるものではないが、ＡａｔＩＩ，ＡｃｃＩ，ＡｆｌＩＩ／ＩＩＩ，ＡｇｅＩ，ＡｐａＩ／ＬＩ，ＡｓｅＩ，Ａｓｐ７１８Ｉ，ＢａｍＨＩ，ＢｂｅＩ，ＢｃｌＩ／ＩＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｓｍＩ，Ｂｓｐ１２０Ｉ，ＢｓｐＨＩ／ＬＵ１１Ｉ／１２０Ｉ，ＢｓｒＩ／ＢＩ／ＧＩ，ＢｓｓＨＩＩ／ＳＩ，ＢｓｔＢＩ／Ｕ１／ＸＩ，ＣｌａＩ，Ｃｓｐ６Ｉ，ＤｐｎＩ，ＤｒａＩ／ＩＩ，ＥａｇＩ，Ｅｃｌ１３６ＩＩ，ＥｃｏＲＩ／ＲＩＩ／４７ＩＩＩ／ＲＶ，ＥｈｅＩ，ＦｓｐＩ，ＨａｅＩＩＩ，ＨｈａＩ，ＨｉｎＰＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＨｐａＩ／ＩＩ，ＫａｓＩ，ＫｐｎＩ，ＭａｅＩＩ／ＩＩＩ，ＭｆｅＩ，ＭｌｕＩ，ＭｓｃＩ，ＭｓｅＩ，ＮａｅＩ，ＮａｒＩ，ＮｃｏＩ，ＮｄｅＩ，ＮｇｏＭＩ，ＮｏｔＩ，ＮｒｕＩ，ＮｓｉＩ，ＰｍｌＩ，Ｐｐｕ１０Ｉ，ＰｓｔＩ，ＰｖｕＩ／ＩＩ，ＲｓａＩ，ＳａｃＩ／ＩＩ，ＳａｌＩ，Ｓａｕ３ＡＩ，ＳｍａＩ，ＳｎａＢＩ，ＳｐｈＩ，ＳｓｐＩ，ＳｔｕＩ，ＴａｉＩ，ＴａｑＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩ，ＸｍａＩ切断部位を含む。
【0058】
シストロン：アミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ分子内のヌクレオチド配列であり、上流および下流のＤＮＡ発現制御要素（ｕｐｓｔｒｅａｍ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ＤＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含む。
【0059】
ＲＮＡプロセシング：ＲＮＡの成熟、修飾、分解を担う細胞機構であり、ＲＮＡスプライシング、イントロン切除、エクソソーム消化、ナンセンス依存分解（ｎｏｎｓｅｎｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｃａｙ （ＮＭＤ））、ＲＮＡ編集、ＲＮＡプロセシング、５’末端キャッピング、３’末端ポリ（Ａ）テーリング、およびそれらの組合せが含まれる。
【0060】
遺伝子導入：ポリソームトランスフェクション（ｐｏｌｙｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、リポソームトランスフェクション、化学（ナノ粒子）トランスフェクション、エレクトロポレーション、ウイルス感染、ＤＮＡ組み換え、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子挿入（ｊｕｍｐｉｎｇ ｇｅｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、遺伝子銃ペネトレーション（ｇｅｎｅ－ｇｕｎ ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子工学的方法である。
【0061】
遺伝子工学：ＤＮＡの制限およびライゲーション（ＤＮＡ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）、相同組換え、導入遺伝子組み込み（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、トランスポゾン挿入、ジャンピング遺伝子組み込み（ｊｕｍｐｉｎｇ ｇｅｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、レトロウイルス感染、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるＤＮＡ組換え方法である。
【0062】
腫瘍抑制：細胞性の抗腫瘍および抗癌機構であり、限定されるものではないが、細胞周期の減衰、Ｇ０／Ｇ１チェックポイント停止、腫瘍抑制、抗腫瘍性、癌細胞アポトーシス、およびこれらの組み合わせから群から選択される。
【0063】
標的細胞：体細胞、組織細胞、幹細胞、生殖細胞系列細胞、腫瘍細胞、癌細胞、ウイルス感染細胞、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される単一又は複数のヒト細胞である。
【0064】
癌組織：皮膚癌、前立腺癌、乳癌、肝臓癌、肺癌、脳腫瘍／癌、リンパ腫、白血病、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される新生物組織である。
【0065】
抗体：あらかじめ選択されたリガンドと結合できる受容体をコードする、あらかじめ選択された保存ドメイン構造（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有するペプチドまたはタンパク質分子である。
【0066】
医薬品および／または治療用途（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ／ｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）：幹細胞生成、幹細胞研究および／または治療開発、癌治療、疾患治療、創傷治癒および組織再生治療、医薬品および／または食料品の高収率生産、およびこれらの組み合わせに有用な生物医学的利用および／または装置（ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ａｐｐａｒａｔｕｓ）。
【0067】
原核生物または原核細胞：明確な膜で包まれた核を持たず、連続したＤＮＡ鎖の形で遺伝物質を持つ、バクテリアなどの単細胞生物である。
【0068】
真核生物または真核細胞：酵母、植物および動物細胞のような、膜に囲まれた核及び他の細胞小器官（organelles）を含む細胞を備える単細胞又は多細胞生物である。
【0069】
転写誘導因子（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｉｎｄｕｃｅｒ）：原核細胞におけるｐｏｌ－２に相当するプロモーターまたは真核性ｐｏｌ－２から、真核性ＲＮＡおよび／または遺伝子の転写を誘導および／または増強できる化学物質である。転写誘導因子は、限定されるものではないが、例えば、３－モルフォリノプロパン－１－スルホン酸（ＭＯＰＳ）、エタノール及び／又はグリセリン、並びにそれらの機能性アナログ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｏｇｓ）、例えばマンニトール，２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）及び４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、又はそれらの混合物等に類似した化学構造を含む。
【0070】
以下、本発明の組成と用途について説明する。
【0071】
本発明は、少なくとも一つのｍｉＲ－３０２前駆ＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２）構造物と、少なくとも一つのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）ｍＲＮＡと、を含み、前記ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物は、少なくとも一つの５’末端ＲｄＲｐ結合部位、又は少なくとも一つの３’末端ＲｄＲｐ結合部位、あるいはその両方を含み、前記ＲｄＲｐｍＲＮＡは、ＲＮＡウイルス、好ましくはコロナウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス、から単離及び／又は改変されたものである、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の生成に用いる新規ＲＮＡ組成物及びその製造方法である。
【0072】
構造的には、５’末端ＲｄＲｐ結合部位は、少なくとも５’－ＡＵ（Ｇ／Ｃ）（Ｕ／－）Ｇ（Ａ／Ｕ）－３’（５’－ＡＵＳＵＧＷ－３’；配列番号１）または５’－Ｕ（Ｃ／－）（Ｕ／Ａ）Ｃ（Ｕ／Ｃ）（Ｕ／Ａ）Ａ－３’（５’－ＵＣＷＣＹＷＡ－３’；配列番号２）のいずれか、あるいは両方の配列を含む。例えば、５’末端ＲｄＲｐ結合部位は、５’－ＡＵＣＵＧＵ－３’（配列番号３）、５’－ＵＣＵＣＵＡＡ－３’（配列番号４）、５’－ＵＣＵＣＣＵＡ－３’（配列番号５）、及び／又は５’－ＵＵＣＡＡ－３’（配列番号６）、あるいはそれらの組み合わせを含む少なくとも一つのＲＮＡ配列から選ばれることが好ましい。一方、３’末端ＲｄＲｐ結合部位は、少なくとも５’－（Ｕ／Ａ）Ｃ（Ａ／－）（Ｃ／Ｇ）ＡＵ－３’（５’－ＷＣＡＳＡＵ－３’；配列番号７）、又は５’－Ｕ（Ａ／Ｕ）（Ａ／Ｇ）Ｇ（Ａ／Ｕ）（Ｇ／－）Ａ－３’（５’－ＵＷＲＧＷＲ－３’；配列番号８）のいずれか、あるいはその両方の配列を含む。３’末端ＲｄＲｐ結合部位は、例えば、５’－ＡＣＡＧＡＵ－３’（配列番号９）、５’－ＵＵＡＧＡＧＡ－３’（配列番号１０）、５’－ＵＡＧＧＡＧＡ－３’（配列番号１１）、及び／又は５’－ＵＵＧＡＡ－３’（配列番号１２）、あるいはそれらの組み合わせを含む少なくとも一つのＲＮＡ配列から選ばれることが好ましい。
【0073】
また、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物は、好ましくは、５’－ＣＣＵＵＵＧＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＧＧＧ ＵＡＣＣＵＧＣＵＧＵ ＧＵＧＡＡＡＣＡＡＡ ＡＧＵＡＡＧＵＧＣＵ ＵＣＣＡＵＧＵＵＵＣ ＡＧＵＧＧＡＧＧ－３’（配列番号１３）、５’－ＧＣＵＣＣＣＵＵＣＡ ＡＣＵＵＵＡＡＣＡＵ ＧＧＡＡＧＵＧＣＵＵ ＵＣＵＧＵＧＡＣＵＵ ＵＡＡＡＡＧＵＡＡＧ ＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧ ＵＵＵＵＡＧＵＡＧＧ ＡＧＵ－３’（配列番号１４）、５’－ＣＣＡＣＣＡＣＵＵＡ ＡＡＣＧＵＧＧＡＵＧ ＵＡＣＵＵＧＣＵＵＵ ＧＡＡＡＣＵＡＡＡＧ ＡＡＧＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＵＧＧＵＧＡＵＧＧ－３’（配列番号１５）、及び／又は５’－ＣＣＵＣＵＡＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＡＧＧ ＣＡＣＵＵＧＣＵＧＵ ＧＡＣＡＵＧＡＣＡＡ ＡＡＡＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＧＡＧＵＧＵＧＧ－３’（配列番号１６）、またはそれらの組み合わせから選択されるヘアピン様ｍｉＲ－３０２前駆配列を少なくとも一つ含む。２つの個々のｍｉＲ－３０２前駆配列の間には、ヘアピンのもつれ形成（ｈａｉｒｐｉｎ ｔａｎｇｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を防止するための５０～５００ヌクレオチドのスペーサー配列（ｓｐａｃｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）がさらに含まれていてもよい。これらのｍｉＲ－３０２前駆配列は、考えられる限りでは、同じ細胞初期化機能を引き出すために、ｍｉＲ－３０２－ｍｉｍｉｃ ｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡ配列を用いることによって置き換えることができる。また、これらのＲＮＡ配列のウリジン（Ｕ）含有量を、シュードウリジンおよび／または他の修飾ヌクレオチドで置換して、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２構造物およびＲｄＲｐｍＲＮＡの安定性を向上させることができる。
【0074】
ヘアピン様ＲＮＡの低生産効率の問題を克服するために、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２およびＲｄＲｐｍＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ－ヘリカーゼ混合活性および改良されたバッファーシステムを有する新規なＰＣＲ－ＩＶＴ方法を用いて製造されることが好ましい。また、細胞内デリバリーの効率を高めるために、設計されたｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２およびＲｄＲｐｍＲＮＡ混合組成物は、グリシルグリセリン、リポソーム、ナノ粒子、リポソームナノ粒子（ＬＮＰ）、コンジュゲート分子（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、輸液化学物質（ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、遺伝子銃材料、トランスポゾン、電気穿孔剤およびこれらの組み合わせから選択される少なくとも一つのデリバリー剤（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔ）とさらに混合、複合化、カプセル化および／または製剤化することができる。
【実施例】
【0075】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【0076】
［１．ヒト細胞の分離と培養］
出発組織細胞は、Ａａｓｅｎのプロトコル（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５，３７１－３８２，２０１０）を用いて酵素的に解離させた皮膚細胞、または単にヘパリン処理した末梢血細胞のバフィーコートフラクションから得ることができる。単離した組織サンプルは、新鮮に保ち、４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩと０．２５％のＴｒｙｐＬＥを用いて細胞密度に応じて１５～４５分間混合し、トリプシン阻害剤を含むＨＢＳＳで２回すすいだ後、０．３ｍＬのフィーダーフリーのＳＦＭ培地（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ）を含む新しい滅菌マイクロチューブに移してすぐに使用する必要がある。その後、マイクロチューブインキュベーターで３７℃、１分間振盪して細胞をさらに解離させ、０．３ｍＬの細胞懸濁液全体を、製剤化したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、または他の特定因子（ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ）が添加された１ｍＬのフィーダーフリーＳＦＭ培養液を含む３５ｍｍマトリゲルコート培養シャーレに移した。ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および他の特定因子の使用濃度は、細胞培養液中、それぞれ０．１～５００マイクログラム（μｇ）／ｍＬの範囲である。細胞培養液およびすべての添加物は２～３日ごとに新しい物にする必要があり、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡに１分間さらし、トリプシン阻害剤を含むＨＢＳＳで２回すすぐことにより約５０～６０％の細胞密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で継代される。ＡＳＣの拡大のために、細胞を、製剤化したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および／または他の特定因子を添加した新鮮なフィーダーフリーＭＳＣ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ培養培地において１：５～１：５００希釈で再播種した。ケラチノサイトを培養するために、細胞は、皮膚組織から単離され、適切な抗生物質の存在下、ヒトケラチノサイト成長サプリメント（ＨＫＧＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加したＥｐｉＬｉｆｅ無血清細胞培養培地で、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養する。培養細胞は、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液に１分間さらし、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一度すすぐことにより５０－６０％の細胞密度になった時点で剥離し、剥離した細胞を、ＨＫＧＳサプリメントを含む新鮮なＥｐｉＬｉｆｅ培地で１：１０希釈で再播種する。ヒト癌および正常細胞株Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＰＣ３、ＨｅｐＧ２、Ｃｏｌｏ－８２９およびＢＥＡＳ－２Ｂは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）または我々の共同研究者から入手し、その後、メーカーや提供者の提案に従って維持した。初期化後、得られたｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）は、ＬｉｎのフィーダーフリーまたはＴａｋａｈａｓｈｉのフィーダーベースのｉＰＳＣ培養プロトコル（Ｌｉｎ等、ＲＮＡ １４：２１１５－２１２４，２００８；Ｌｉｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９：１０５４－１０６５，２０１１；Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ，Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６，２００６）のいずれかに従って培養及び維持された。
出発組織細胞は、Ａａｓｅｎのプロトコル（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５，３７１－３８２，２０１０）を用いて酵素的に解離させた皮膚細胞、または単にヘパリン処理した末梢血細胞のバフィーコートフラクションから得ることができる。単離した組織サンプルは、新鮮に保ち、４ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩと０．２５％のＴｒｙｐＬＥを用いて細胞密度に応じて１５～４５分間混合し、トリプシン阻害剤を含むＨＢＳＳで２回すすいだ後、０．３ｍＬのフィーダーフリーのＳＦＭ培地（ＩｒｖｉｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ）を含む新しい滅菌マイクロチューブに移してすぐに使用する必要がある。その後、マイクロチューブインキュベーターで３７℃、１分間振盪して細胞をさらに解離させ、０．３ｍＬの細胞懸濁液全体を、製剤化したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、または他の特定因子（ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ）が添加された１ｍＬのフィーダーフリーＳＦＭ培養液を含む３５ｍｍマトリゲルコート培養シャーレに移した。ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および他の特定因子の使用濃度は、細胞培養液中、それぞれ０．１～５００マイクログラム（μｇ）／ｍＬの範囲である。細胞培養液およびすべての添加物は２～３日ごとに新しい物にする必要があり、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡに１分間さらし、トリプシン阻害剤を含むＨＢＳＳで２回すすぐことにより約５０～６０％の細胞密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で継代される。ＡＳＣの拡大のために、細胞を、製剤化したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２＋ＲｄＲｐｍＲＮＡ混合物、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ／ＦＧＦ２、および／または他の特定因子を添加した新鮮なフィーダーフリーＭＳＣ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ培養培地において１：５～１：５００希釈で再播種した。ケラチノサイトを培養するために、細胞は、皮膚組織から単離され、適切な抗生物質の存在下、ヒトケラチノサイト成長サプリメント（ＨＫＧＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を添加したＥｐｉＬｉｆｅ無血清細胞培養培地で、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養する。培養細胞は、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ溶液に１分間さらし、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で一度すすぐことにより５０－６０％の細胞密度になった時点で剥離し、剥離した細胞を、ＨＫＧＳサプリメントを含む新鮮なＥｐｉＬｉｆｅ培地で１：１０希釈で再播種する。ヒト癌および正常細胞株Ａ５４９、ＭＣＦ７、ＰＣ３、ＨｅｐＧ２、Ｃｏｌｏ－８２９およびＢＥＡＳ－２Ｂは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）または我々の共同研究者から入手し、その後、メーカーや提供者の提案に従って維持した。初期化後、得られたｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）は、ＬｉｎのフィーダーフリーまたはＴａｋａｈａｓｈｉのフィーダーベースのｉＰＳＣ培養プロトコル（Ｌｉｎ等、ＲＮＡ １４：２１１５－２１２４，２００８；Ｌｉｎ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９：１０５４－１０６５，２０１１；Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｓ，Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６，２００６）のいずれかに従って培養及び維持された。
【0077】
［２．Ｉｎ－Ｖｉｔｒｏ ＲＮＡトランスフェクション］
ＲＮＡトランスフェクションの場合、０．５～５００μｇの単離したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物（比率は約２０：１～１：２０）は、０．５ｍｌの新鮮な細胞培養液に溶解され、Ｉｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩまたは他の同様のトランスフェクション試薬を１～５０μｌ加えて混合された。１０～３０分インキュベートの後、この混合物を、培養細胞の５０～６０％の細胞密度を含む細胞培養液に添加する。培地は、細胞の種類に応じて、１２～４８時間ごとに新しいものにする。このトランスフェクションの手順は、トランスフェクションの効率を上げるために繰り返し行うことができる。トランスフェクションの結果は、さらに種々の検出方法によって解析され、それぞれ図３～図８に示される。
ＲＮＡトランスフェクションの場合、０．５～５００μｇの単離したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物（比率は約２０：１～１：２０）は、０．５ｍｌの新鮮な細胞培養液に溶解され、Ｉｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩまたは他の同様のトランスフェクション試薬を１～５０μｌ加えて混合された。１０～３０分インキュベートの後、この混合物を、培養細胞の５０～６０％の細胞密度を含む細胞培養液に添加する。培地は、細胞の種類に応じて、１２～４８時間ごとに新しいものにする。このトランスフェクションの手順は、トランスフェクションの効率を上げるために繰り返し行うことができる。トランスフェクションの結果は、さらに種々の検出方法によって解析され、それぞれ図３～図８に示される。
【0078】
［３．ＤＮＡ脱メチル化アッセイ］
約２００万個の細胞からＲｏｃｈｅ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いてゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡの約２マイクログラム（μｇ）をＣＣＧＧ切断制限酵素であるＨｐａＩＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動で評価して、ゲノム全体の脱メチル化を決定した（図４）。
約２００万個の細胞からＲｏｃｈｅ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ，ＵＳＡ）を用いてゲノムＤＮＡを単離した。単離したゲノムＤＮＡの約２マイクログラム（μｇ）をＣＣＧＧ切断制限酵素であるＨｐａＩＩで消化し、１％アガロースゲル電気泳動で評価して、ゲノム全体の脱メチル化を決定した（図４）。
【0079】
［４．ゲノム全体マイクロアレイ（Ｇｅｎｏｍｅ－Ｗｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）による全体的な細胞内遺伝子発現パターンの解析］
ヒトゲノムＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、ＣＡ）を用いて、図７に示すように、ｉＰＳ細胞におけるゲノム全体での４７，０００のヒト遺伝子転写産物の発現パターンを検出した。各サンプルは３連で試験し、同じ実験を４回繰り返した。各試験サンプルからのトータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）を用いて単離した。マイクロアレイハイブリダイゼーション用の標識プローブを調製するために、Ｔ７プロモーター含有オリゴ（ｄＴ）２４プライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２４ｐｒｉｍｅｒ）とＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ二本鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＭＡ）をメーカーのプロトコルに従って用いて、抽出したトータルＲＮＡ（２μｇ）をｃＤＮＡに変換した。得られたｃＤＮＡはフェノール－クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈殿させ、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理したｄｄＨ２Ｏに０．５μｇ／μｌの濃度で再懸濁させた。次に、１μｇのｄｓＤＮＡ、７．５ｍＭの非標識ＡＴＰおよびＧＴＰ、５ｍＭの非標識ＵＴＰおよびＣＴＰ、２ｍＭのビオチン標識ＣＴＰおよびＵＴＰ（ｂｉｏｔｉｎ－１１－ＣＴＰ，ｂｉｏｔｉｎ－１６－ＵＴＰ，Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、および２０ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写を行った。反応は３７℃で４時間行い、得られたｃＲＮＡをＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ｃＲＮＡサンプルの一部を１％アガロースゲルで分離してサイズレンジを確認した後、１０μｇのｃＲＮＡを、４０ｍＭのＴｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＫＯＡｃ／３０ｍＭ ＭｇＯＡｃの中で、９４℃で３５分間加熱し、ランダムに断片化して平均サイズ５０塩基とした。ハイブリダイゼーションは、２００μｌのＡＦＦＹバッファー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＣＡ）中で、４０℃で１６時間、混合を繰り返しながら完了させた。ハイブリダイゼーション後、アレイを２００μｌの６ｘＳＳＰＥ－Ｔバッファー（１ｘ０．２５Ｍ 塩化ナトリウム／１５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ）で３回すすぎ、２００μｌの６ｘＳＳＰＥ－Ｔを用いて５０℃で１時間洗浄した。さらに、アレイを０．５ｘＳＳＰＥ－Ｔで２回すすぎ、０．５ｘＳＳＰＥ－Ｔを用いて５０℃で１５分間洗浄した。次に、６ｘＳＳＰＥ－Ｔ（ｐＨ７．６）中の２μｇ／ｍｌのストレプトアビジン－フィコエリスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、染色アッセイを行った。アレイは共焦点スキャナー（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｓｃａｎｎｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて７．５μｍで読み取った。
ヒトゲノムＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、ＣＡ）を用いて、図７に示すように、ｉＰＳ細胞におけるゲノム全体での４７，０００のヒト遺伝子転写産物の発現パターンを検出した。各サンプルは３連で試験し、同じ実験を４回繰り返した。各試験サンプルからのトータルＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ、ＭＤ）を用いて単離した。マイクロアレイハイブリダイゼーション用の標識プローブを調製するために、Ｔ７プロモーター含有オリゴ（ｄＴ）２４プライマー（Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２４ｐｒｉｍｅｒ）とＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ二本鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＭＡ）をメーカーのプロトコルに従って用いて、抽出したトータルＲＮＡ（２μｇ）をｃＤＮＡに変換した。得られたｃＤＮＡはフェノール－クロロホルム抽出により精製し、エタノールで沈殿させ、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理したｄｄＨ２Ｏに０．５μｇ／μｌの濃度で再懸濁させた。次に、１μｇのｄｓＤＮＡ、７．５ｍＭの非標識ＡＴＰおよびＧＴＰ、５ｍＭの非標識ＵＴＰおよびＣＴＰ、２ｍＭのビオチン標識ＣＴＰおよびＵＴＰ（ｂｉｏｔｉｎ－１１－ＣＴＰ，ｂｉｏｔｉｎ－１６－ＵＴＰ，Ｅｎｚｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、および２０ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含む、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ転写を行った。反応は３７℃で４時間行い、得られたｃＲＮＡをＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）により精製した。ｃＲＮＡサンプルの一部を１％アガロースゲルで分離してサイズレンジを確認した後、１０μｇのｃＲＮＡを、４０ｍＭのＴｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＫＯＡｃ／３０ｍＭ ＭｇＯＡｃの中で、９４℃で３５分間加熱し、ランダムに断片化して平均サイズ５０塩基とした。ハイブリダイゼーションは、２００μｌのＡＦＦＹバッファー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＣＡ）中で、４０℃で１６時間、混合を繰り返しながら完了させた。ハイブリダイゼーション後、アレイを２００μｌの６ｘＳＳＰＥ－Ｔバッファー（１ｘ０．２５Ｍ 塩化ナトリウム／１５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６／１ｍＭ ＥＤＴＡ／０．００５％ Ｔｒｉｔｏｎ）で３回すすぎ、２００μｌの６ｘＳＳＰＥ－Ｔを用いて５０℃で１時間洗浄した。さらに、アレイを０．５ｘＳＳＰＥ－Ｔで２回すすぎ、０．５ｘＳＳＰＥ－Ｔを用いて５０℃で１５分間洗浄した。次に、６ｘＳＳＰＥ－Ｔ（ｐＨ７．６）中の２μｇ／ｍｌのストレプトアビジン－フィコエリスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、染色アッセイを行った。アレイは共焦点スキャナー（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｓｃａｎｎｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて７．５μｍで読み取った。
【0080】
バックグラウンドの変動を確認するため、同じサンプルを用いてマイクロアレイテストを重複して行い、さらなる比較のため、片方のテストでわずかに存在した２００の遺伝子を選択した。サンプルのシグナルは、完全にマッチしたプローブとミスマッチのプローブの差の合計平均値を用いて正規化した。その後、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＣｏｎｓｏｌｅTM （Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）およびＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇｓ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）ソフトウェアを使用して、ゲノム全体の遺伝子発現パターンの変化を解析した。１倍以上の遺伝子発現率の変化を正の識別遺伝子（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ）とみなした。遺伝子クラスタリングアッセイ（ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇａｓｓａｙｓ）では、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのソフトウェアにプラグインプログラムＧｅｎｅｔｒｉｘ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を併用した。サンプルのシグナルは、各マイクロアレイの内部ハウスキーピングコントロール（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｈｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｖｅｒａｇe）の平均値を用いて正規化した。正規化後、シグナル強度がレベル１からレベル６５，５３５まで増加すると、対応する色は緑から黒、そして赤へと変化した。２３，０００以上のレベルは、ノーザンブロッティングアッセイでポジティブに検出できる点で、ポジティブコール（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃａｌｌ）とみなした。
【0081】
［５．テラトーマ形成とｉＰＳ細胞の分化誘導］
ｉＰＳ由来の胚様体を、６週齢の雌の免疫不全偽妊娠ＳＣＩＤベージュマウスにおける子宮または腹腔に異種移植すると、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉）由来の組織を含むテラトーマ様嚢胞が形成された（図８）。免疫不全ヌードマウスの使用は、移植療法を模倣したｉｎ ｖｉｖｏ環境を提供するためであった。擬妊娠マウスは、１ＩＵのヒト閉経期ゴナドトロフィン（ＨＭＧ）を２日間腹腔内注射し、その後、１日間ヒト絨毛性ゴナドトロフィン（ｈＣＧ）を注射することにより作製された。生殖細胞系列への幹細胞分化をＩｎ ｖｉｔｒｏで誘導するために、ｉＰＳ細胞は、チャコール処理済み１０％のＦＢＳ（ｃｈａｒｃｏａｌ－ｓｔｒｉｐｐｅｄ １０％ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｎｇ／ｍｌのアクチビン、及び５０ｎｇ／ｍｌのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１；高グルコース）培地を含むポリオルニチン／ラミニンコートシャーレ上で、１２時間、３７℃、５％二酸化炭素の条件で維持された。その後、細胞をトリプシン処理し、１ｘＰＢＳで洗浄し、冷やしたマトリゲル（各１００μｌ）の４アリコートと１００μｌの１ｘＰＢＳの１アリコートに回収した。その直後、細胞を、６週齢の免疫不全ＳＣＩＤベージュヌードマウスの後肢筋、腹膜、子宮、頚部皮下（マトリゲル使用）、及び尾静脈（ＰＢＳ使用）に移植した。実験処理中、マウスはジエチルエーテルで麻酔された。
ｉＰＳ由来の胚様体を、６週齢の雌の免疫不全偽妊娠ＳＣＩＤベージュマウスにおける子宮または腹腔に異種移植すると、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉）由来の組織を含むテラトーマ様嚢胞が形成された（図８）。免疫不全ヌードマウスの使用は、移植療法を模倣したｉｎ ｖｉｖｏ環境を提供するためであった。擬妊娠マウスは、１ＩＵのヒト閉経期ゴナドトロフィン（ＨＭＧ）を２日間腹腔内注射し、その後、１日間ヒト絨毛性ゴナドトロフィン（ｈＣＧ）を注射することにより作製された。生殖細胞系列への幹細胞分化をＩｎ ｖｉｔｒｏで誘導するために、ｉＰＳ細胞は、チャコール処理済み１０％のＦＢＳ（ｃｈａｒｃｏａｌ－ｓｔｒｉｐｐｅｄ １０％ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ－グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｎｇ／ｍｌのアクチビン、及び５０ｎｇ／ｍｌのジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１；高グルコース）培地を含むポリオルニチン／ラミニンコートシャーレ上で、１２時間、３７℃、５％二酸化炭素の条件で維持された。その後、細胞をトリプシン処理し、１ｘＰＢＳで洗浄し、冷やしたマトリゲル（各１００μｌ）の４アリコートと１００μｌの１ｘＰＢＳの１アリコートに回収した。その直後、細胞を、６週齢の免疫不全ＳＣＩＤベージュヌードマウスの後肢筋、腹膜、子宮、頚部皮下（マトリゲル使用）、及び尾静脈（ＰＢＳ使用）に移植した。実験処理中、マウスはジエチルエーテルで麻酔された。
【0082】
［６．免疫染色アッセイ］
細胞／組織サンプルは１００％メタノールで４℃、３０分間固定した後、４％パラホルムアルデヒド（１ｘＰＢＳ，ｐＨ７．４中）で２０℃、１０分間固定する。その後、０．１％～０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１ｘＰＢＳで１０分間インキュベートし、１ｘＰＢＳで３回、５分間洗浄する。免疫染色のために、一次抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ，ＵＳＡ）とＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ，ＵＳＡ）からそれぞれ購入した。二次抗体には色素標識ヤギ抗ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ）抗体またはウマ抗マウス（ｈｏｒｓｅ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）抗体を使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）。結果は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈイメージングプログラム（Ｎｉｋｏｎ）を搭載した蛍光８０ｉ顕微鏡定量システム（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ８０ｉ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）の下で、１００倍または２００倍の倍率で検査及び解析された。
細胞／組織サンプルは１００％メタノールで４℃、３０分間固定した後、４％パラホルムアルデヒド（１ｘＰＢＳ，ｐＨ７．４中）で２０℃、１０分間固定する。その後、０．１％～０．２５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む１ｘＰＢＳで１０分間インキュベートし、１ｘＰＢＳで３回、５分間洗浄する。免疫染色のために、一次抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ，ＵＳＡ）とＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＭＯ，ＵＳＡ）からそれぞれ購入した。二次抗体には色素標識ヤギ抗ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ）抗体またはウマ抗マウス（ｈｏｒｓｅ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）抗体を使用した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）。結果は、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈイメージングプログラム（Ｎｉｋｏｎ）を搭載した蛍光８０ｉ顕微鏡定量システム（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ８０ｉ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）の下で、１００倍または２００倍の倍率で検査及び解析された。
【0083】
［７．新規ＰＣＲ－ＩＶＴプロトコル］
所望のｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）は、約０．０１ｎｇ～１０マイクログラム（μｇ）の分離ｍＲＮＡを２０～５０μｌのＲＴ反応液（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ ＲＴ ｋｉｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）に加え、メーカーの提案に従って実施される。ｍＲＮＡの量に応じて、ＲＴ反応液には、ｍＲＮＡ、約０．０１～２０ｎモルのＲＴプライマー、適量のｄＮＴＰｓ、および逆転写酵素が１ｘＲＴバッファーに含まれる。その後、目的のｍＲＮＡの構造や長さに応じて、４６～６５oＣで１～３時間インキュベートし、次のステップのＰＣＲのための相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）テンプレートを少なくとも作製する。ウイルス性ＲｄＲｐｃＤＮＡのクローニングを行うために、ＲＴ－リバースプイライマー５’－ＧＡＣＡＡＣＡＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＡＧＧＴ ＣＣＴ－３’（配列番号１７）を設計及び使用し、コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９のｍＲＮＡをＲＴしてｃＤＮＡにする。
所望のｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）は、約０．０１ｎｇ～１０マイクログラム（μｇ）の分離ｍＲＮＡを２０～５０μｌのＲＴ反応液（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ ＲＴ ｋｉｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）に加え、メーカーの提案に従って実施される。ｍＲＮＡの量に応じて、ＲＴ反応液には、ｍＲＮＡ、約０．０１～２０ｎモルのＲＴプライマー、適量のｄＮＴＰｓ、および逆転写酵素が１ｘＲＴバッファーに含まれる。その後、目的のｍＲＮＡの構造や長さに応じて、４６～６５oＣで１～３時間インキュベートし、次のステップのＰＣＲのための相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）テンプレートを少なくとも作製する。ウイルス性ＲｄＲｐｃＤＮＡのクローニングを行うために、ＲＴ－リバースプイライマー５’－ＧＡＣＡＡＣＡＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＡＧＧＴ ＣＣＴ－３’（配列番号１７）を設計及び使用し、コロナウイルスＣＯＶＩＤ－１９のｍＲＮＡをＲＴしてｃＤＮＡにする。
【0084】
次に、ＲＴ由来のｃＤＮＡ約０．０１ｐｇ～１０μｇを２０～５０μＬのＰＣＲ調製用混合液（Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｋｉｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）に加え、メーカーの提案に従い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施する。その後、ＰＣＲ混合物を、所望のＤＮＡ及びプライマーの構造と長さに応じてまずインキュベートし、９４oＣで１分間の変性を５～２０サイクルを行い、３０～５５℃で３０秒～１分間のアニーリングを行い、そして７２℃で１～３分の伸長を行う。その後、得られたＰＣＲ産物の構造や長さに応じて、９４℃で１分間の変性、５０～５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１～３分間の伸長を順次行う一連の工程で、さらに１０～２０サイクルのＰＣＲが行われる。最後に、得られたＰＣＲ産物をＩＶＴのテンプレートとして使用する。ＩＶＴのテンプレートを調製するために、コロナウイルスｍＲＮＡからＲＮＡプロモーターを含むＲｄＲｐｃＤＮＡテンプレートを増幅するための、配列番号１７及び５’－ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧ ＧＴＡＴＧＧＴＡＣＴＴＧＧＴＡＧＴＴ－３’（配列番号１８）を含む特定のＰＣＲプライマー対を設計して使用する。その後、ＩＶＴ中またはＩＶＴ後に、得られたｍＲＮＡ産物にさらに５’キャップヌクレオチドを組み込んでもよい。一方、単離されたヒト細胞ゲノムＤＮＡから、ＲＮＡプロモーター含有ｍｉＲ－３０２ファミリアルクラスターｃＤＮＡテンプレート（ＲＮＡ ｐｒｏｍｏｔｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｉＲ－３０２ｆａｍｉｌｉａｌ ｃｌｕｓｔｅｒ ｃＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅｓ）を増幅するための、５’－ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴ ＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣ ＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡ ＡＧＧＴＡＡ－３’（配列番号１９）及び５’－ＧＴＴＣＴＣＣＴＡＡ ＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣ ＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡ ＣＡ－３’（配列番号２０）を含む別のＰＣＲプライマー対も設計して使用する。設計したプライマーには、Ｔ７、Ｔ３及び／又はＳＰ６プロモーター等の各種ＲＮＡプロモーター配列を用いることができ、５’－フォワード及び３’－リバースプライマー配列には、それぞれ少なくともＲｄＲｐ開始／結合部位が組み込まれた。また、得られたｍｉＲ－３０２ファミリアルクラスターテンプレート（ｍｉＲ－３０２ ｆａｍｉｌｉａｌ ｃｌｕｓｔｅｒ ｔｅｍｐｌａｔｅ）には、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２ａ（配列番号１３）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２ｂ（配列番号１４）、ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２ｃ（配列番号１５）、及び／又はｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２ｄ（配列番号１６）の少なくとも１つのｃＤＮＡ配列が含まれている。複数の同一または異なるｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２配列は、最大９つのヘアピン構造配列まで、ｍｉＲ－３０２ファミリアルクラスターに繰り返し配置することができる。
【0085】
得られたＰＣＲ産物にプロモーター－プライマーが組み込まれていることから、ｍＲＮＡを生産するために、ＰＣＲ産物をテンプレートとして使用し、所望のｍＲＮＡ配列を増幅する改良型ＩＶＴ反応を行うことができる。ＩＶＴ反応混合物は、０．０１ｎｇ～１０μｇのＰＣＲ産物、０．１～１０Ｕの単離コロナウイルスヘリカーゼ（すなわちＣＯＶＩＤ－１９由来）、適量のＮＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼ（すなわちＴ７、Ｔ３またはＳＰ６）を１ｘ転写バッファー（１ｘ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）中に含んでいる。１ｘ転写バッファーの内容は、使用するＲＮＡポリメラーゼに応じ、メーカーの提案にしたがって調整することができる。さらに、１ｘ転写バッファーは、ヘアピンやステムループ構造などの高度な構造のＲＮＡ／ＤＮＡ配列の変性を促進する、０．００１～１０ｍＭのベタイン（トリメチルグリシン、ＴＭＧ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または３－（Ｎ－モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、および／またはこれらの組み合わせをさらに含有してもよい。その後、使用するＲＮＡポリメラーゼの安定性や活性に応じて、ＩＶＴ反応を３７℃で１～６時間でインキュベートする。この改良された新規ＩＶＴ反応では、ヘアピン様ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏでの低産生効率の問題を克服するよう、ヘアピン様ステムループ構造などのＲＮＡ／ＤＮＡ二次構造の巻き戻しを促進するために、少なくともヘリカーゼ酵素が追加される。特に、ヘリカーゼ酵素は、ＤＮＡとＲＮＡの両方の鎖の二次構造を巻き戻すことができる。
【0086】
［８．ＲＮＡ精製とノーザンブロット解析］
目的のｍＲＮＡ（１０μｇ）は、ｍｉｒＶａｎａTM ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて、製造元のプロトコールに従って、単離され、さらに１５％ＴＢＥ－尿素ポリアクリルアミドゲル又は３．５％低融点アガロースゲル電気泳動で精製された。ノーザンブロット解析では、ゲル分画されたｍＲＮＡが、ナイロンメンブレンにエレクトロブロッティングされた。ｍＲＮＡとそのＩＶＴテンプレート（ＰＣＲ産物）の検出は、ｍＲＮＡの所望の標的配列に相補的な標識［ＬＮＡ］－ＤＮＡプローブを用いて行われる。このプローブはさらに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製され、色素標識ヌクレオチドアナログ（ｄｙｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇ）または［３２Ｐ］－ｄＡＴＰ（＞３０００ Ｃｉ／ｍＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）のいずれかの存在下で、２０分間ターミナルトランスフェラーゼ（２０ユニット）でテール標識（ｔａｉｌ－ｌａｂｅｌｅｄ）された。
目的のｍＲＮＡ（１０μｇ）は、ｍｉｒＶａｎａTM ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて、製造元のプロトコールに従って、単離され、さらに１５％ＴＢＥ－尿素ポリアクリルアミドゲル又は３．５％低融点アガロースゲル電気泳動で精製された。ノーザンブロット解析では、ゲル分画されたｍＲＮＡが、ナイロンメンブレンにエレクトロブロッティングされた。ｍＲＮＡとそのＩＶＴテンプレート（ＰＣＲ産物）の検出は、ｍＲＮＡの所望の標的配列に相補的な標識［ＬＮＡ］－ＤＮＡプローブを用いて行われる。このプローブはさらに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製され、色素標識ヌクレオチドアナログ（ｄｙｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇ）または［３２Ｐ］－ｄＡＴＰ（＞３０００ Ｃｉ／ｍＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）のいずれかの存在下で、２０分間ターミナルトランスフェラーゼ（２０ユニット）でテール標識（ｔａｉｌ－ｌａｂｅｌｅｄ）された。
【0087】
［９．タンパク質の抽出とウェスタンブロット分析］
細胞（１０６個）を、プロテアーゼ阻害剤、ロイペプチン、ＴＬＣＫ、ＴＡＭＥ、及びＰＭＳＦを添加したＣｅｌＬｙｔｉｃ－Ｍ ｌｙｓｉｓ／ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）で、メーカーの提案に従って溶解させる。溶解産物は、１２，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離され、上清が回収される。タンパク質濃度は、Ｅ－ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）で改良型ＳＯＦＴｍａｘプロテインアッセイパッケージを使用して測定される。各３０μｇの細胞溶解産物は、還元（＋５０ｍＭ ＤＴＴ）および非還元（ＤＴＴなし）条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファに加えられ、６～８％ポリアシルアミドゲルにロードする前に３分間ボイルされる。タンパク質は、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離され、ニトロセルロースメンブレンにエレクトロブロッティングされ、Ｏｄｙｓｓｅｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ試薬（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＢ）で室温で２時間インキュベートした。その後、一次抗体を試薬に適用し、その混合物を４℃でインキュベートした。一晩インキュベートした後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで３回すすぎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０反応色素（１：２，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を室温で１時間曝露する。さらに３回のＴＢＳ－Ｔによるすすぎの後、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ ＩｍａｇｅｒとＯｄｙｓｓｅｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．１０（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を用いてイムノブロットの蛍光スキャンと画像解析が行われる。
細胞（１０６個）を、プロテアーゼ阻害剤、ロイペプチン、ＴＬＣＫ、ＴＡＭＥ、及びＰＭＳＦを添加したＣｅｌＬｙｔｉｃ－Ｍ ｌｙｓｉｓ／ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）で、メーカーの提案に従って溶解させる。溶解産物は、１２，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離され、上清が回収される。タンパク質濃度は、Ｅ－ｍａｘマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＣＡ）で改良型ＳＯＦＴｍａｘプロテインアッセイパッケージを使用して測定される。各３０μｇの細胞溶解産物は、還元（＋５０ｍＭ ＤＴＴ）および非還元（ＤＴＴなし）条件下で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファに加えられ、６～８％ポリアシルアミドゲルにロードする前に３分間ボイルされる。タンパク質は、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離され、ニトロセルロースメンブレンにエレクトロブロッティングされ、Ｏｄｙｓｓｅｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ試薬（Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＢ）で室温で２時間インキュベートした。その後、一次抗体を試薬に適用し、その混合物を４℃でインキュベートした。一晩インキュベートした後、メンブレンをＴＢＳ－Ｔで３回すすぎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０反応色素（１：２，０００；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）と結合したヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体を室温で１時間曝露する。さらに３回のＴＢＳ－Ｔによるすすぎの後、Ｌｉ－Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ ＩｍａｇｅｒとＯｄｙｓｓｅｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．１０（Ｌｉ－Ｃｏｒ）を用いてイムノブロットの蛍光スキャンと画像解析が行われる。
【0088】
［１０．Ｉｎ Ｖｉｖｏトランスフェクションアッセイ］
分離したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物は、メーカーのプロトコルに従って、Ｉｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬等の適切な量のデリバリー剤（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔ）とよく混合され、用途に応じて動物の血液静脈または筋肉に注入される。デリバリー剤は、分離したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡ混合物を混合、複合化、カプセル化または製剤化するために用いられ、ＲＮＡ内容物を分解から保護するだけでなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで特定の標的細胞への分離ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡ混合物のデリバリーを促進する。
分離したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡの混合物は、メーカーのプロトコルに従って、Ｉｎ－ＶｉｖｏＪｅｔＰＥＩ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬等の適切な量のデリバリー剤（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔ）とよく混合され、用途に応じて動物の血液静脈または筋肉に注入される。デリバリー剤は、分離したｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡ混合物を混合、複合化、カプセル化または製剤化するために用いられ、ＲＮＡ内容物を分解から保護するだけでなく、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで特定の標的細胞への分離ｐｒｅ－ｍｉＲ－３０２とＲｄＲｐｍＲＮＡ混合物のデリバリーを促進する。
【0089】
［１１．統計解析］
すべてのデータは平均値および標準偏差（ＳＤ）で示した。各試験群の平均はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌのＡＶＥＲＡＧＥで算出した。ＳＤはＳＴＤＥＶにより行った。データの統計解析は、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより行った。各群のデータ差の有意性を確認するために、ＴｕｋｅｙおよびＤｕｎｎｅｔｔのｔ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔを用いた。ｐ＜０．０５を有意とした（ＳＰＳＳ ｖ１２．０，Ｃｌａｒｉｔａｓ Ｉｎｃ）。
すべてのデータは平均値および標準偏差（ＳＤ）で示した。各試験群の平均はＭｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｃｅｌのＡＶＥＲＡＧＥで算出した。ＳＤはＳＴＤＥＶにより行った。データの統計解析は、Ｏｎｅ－Ｗａｙ ＡＮＯＶＡにより行った。各群のデータ差の有意性を確認するために、ＴｕｋｅｙおよびＤｕｎｎｅｔｔのｔ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔを用いた。ｐ＜０．０５を有意とした（ＳＰＳＳ ｖ１２．０，Ｃｌａｒｉｔａｓ Ｉｎｃ）。
【0090】
［参照文献］
１．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＥｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．ＥＰ２１９８０２５Ｂ１。
２．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．７，６６２，７９１。
３．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８，０８０，６５２。
４．Ｙｉｎｇ ＳＹ及びＳｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎに対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８，３７２，９６９。
５．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ及びＹｉｎｇ ＳＹに対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８，６０９，８３１。
６．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．９，５６７，５９１。
７．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．９，６３７，７４７。
８．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．９，７８３，８１１。
９．Ｙａｍａｎａｋａ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８，０４８，９９９。
１０．Ｙａｍａｎａｋａ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８，０５８，０６５。
１１．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１５／６６１，３４６。
１２．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１６／１３５，７２３。
１３．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１７／４８９，３５７。
１４．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等；Ｍｉｒ－３０２ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ａ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ＥＳ－ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｓｔａｔｅ．ＲＮＡ １４：２１１５－２１２４，２００８。
１５．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等；ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ－３０２ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤＫ２ ａｎｄ ＣＤＫ４／６ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７０：９４７３－９４８２，２０１０。
１６．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等；Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｍｉｒ－３０２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９：１０５４－１０６５， ２０１１。
１７．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ及びＹｉｎｇ ＳＹ；Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ－ｆｒｅｅ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ３０２ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ． Ｓｈａｏ－Ｙａｏ Ｙｉｎｇ （Ｅｄ．） ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｈａｐｔｅｒ ２３， ｐｐ２９５－３２４， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１２。
１８．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ；Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂｅｈｉｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２９：１６４５－１６４９， ２０１１。
１９．Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ及びＹａｍａｎａｋａ Ｓ；Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６， ２００６。
２０．Ｍｉｙｏｓｈｉ等；Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：６３３－６３８，２０１１。
２１．Ａｎｏｋｙｅ－Ｄａｎｓｏ等；Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：３７６－３８８， ２０１１。
２２．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ及びＪｉ Ｈ；ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２１：９３－１０１，２００３。
２３．ＭｃＤｏｗｅｌｌ等；Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｂｙ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｒａｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５， １９９４。
２４．Ａａｓｅｎ等；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｓｋｉｎ ｏｒ ｐｌｕｃｋｅｄ ｈａｉｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５：３７１－３８２，２０１０。
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９．Ｙａｍａｎａｋａ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８，０４８，９９９。
１０．Ｙａｍａｎａｋａ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８，０５８，０６５。
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１２．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等に対するＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．１６／１３５，７２３。
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１４．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等；Ｍｉｒ－３０２ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｓ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ａ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ＥＳ－ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｓｔａｔｅ．ＲＮＡ １４：２１１５－２１２４，２００８。
１５．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等；ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ－３０２ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｃｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤＫ２ ａｎｄ ＣＤＫ４／６ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７０：９４７３－９４８２，２０１０。
１６．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ等；Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｍｉｒ－３０２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３９：１０５４－１０６５， ２０１１。
１７．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ及びＹｉｎｇ ＳＹ；Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ－ｆｒｅｅ ｉＰＳ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｔｒｏｎｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍｉＲ３０２ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ． Ｓｈａｏ－Ｙａｏ Ｙｉｎｇ （Ｅｄ．） ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２ｎｄ Ｅｄ． Ｃｈａｐｔｅｒ ２３， ｐｐ２９５－３２４， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０１２。
１８．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ；Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂｅｈｉｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２９：１６４５－１６４９， ２０１１。
１９．Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ及びＹａｍａｎａｋａ Ｓ；Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６， ２００６。
２０．Ｍｉｙｏｓｈｉ等；Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：６３３－６３８，２０１１。
２１．Ａｎｏｋｙｅ－Ｄａｎｓｏ等；Ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ． Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ８：３７６－３８８， ２０１１。
２２．Ｓｈｉ－Ｌｕｎｇ Ｌｉｎ及びＪｉ Ｈ；ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｎ－ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２１：９３－１０１，２００３。
２３．ＭｃＤｏｗｅｌｌ等；Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｂｙ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｒａｔｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：８２２－８２５， １９９４。
２４．Ａａｓｅｎ等；Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｓｋｉｎ ｏｒ ｐｌｕｃｋｅｄ ｈａｉｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ５：３７１－３８２，２０１０。
【0091】
［配列表］
（１）全般情報：
（ｉｉｉ）配列の数：２０
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１：
ＡＵＳＵＧＷ ６
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号２：
ＵＣＷＣＹＷＡ ７
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号３：
ＡＵＣＵＧＵ ６
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号４：
ＵＣＵＣＵＡＡ ７
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号５：
ＵＣＵＣＣＵＡ ７
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号６：
ＵＵＣＡＡ ５
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号７：
ＷＣＡＳＡＵ ６
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号８：
ＵＷＲＧＷＲ ６
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号９：
ＡＣＡＧＡＵ ６
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１０：
ＵＵＡＧＡＧＡ ７
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１１：
ＵＡＧＧＡＧＡ ７
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１２：
ＵＵＧＡＡ ５
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６８塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１３：
ＣＣＵＵＵＧＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＧＧＧ ＵＡＣＣＵＧＣＵＧＵ ＧＵＧＡＡＡＣＡＡＡ ＡＧＵＡＡＧＵＧＣＵ ＵＣＣＡＵＧＵＵＵＣ ＡＧＵＧＧＡＧＧ ６８
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７３塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１４：
ＧＣＵＣＣＣＵＵＣＡ ＡＣＵＵＵＡＡＣＡＵ ＧＧＡＡＧＵＧＣＵＵ ＵＣＵＧＵＧＡＣＵＵ ＵＡＡＡＡＧＵＡＡＧ ＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧ ＵＵＵＵＡＧＵＡＧＧ ＡＧＵ ７３
（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６９塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１５：
ＣＣＡＣＣＡＣＵＵＡ ＡＡＣＧＵＧＧＡＵＧ ＵＡＣＵＵＧＣＵＵＵ ＧＡＡＡＣＵＡＡＡＧ ＡＡＧＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＵＧＧＵＧＡＵＧＧ ６９
（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６８塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１６：
ＣＣＵＣＵＡＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＡＧＧ ＣＡＣＵＵＧＣＵＧＵ ＧＡＣＡＵＧＡＣＡＡ ＡＡＡＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＧＡＧＵＧＵＧＧ ６８
（２）配列番号１７の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１７：
ＧＡＣＡＡＣＡＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＡＧＧＴ ＣＣＴ ２３
（２）配列番号１８の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：４８塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１８：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧ ＧＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＧＧＴＡＧＴＴ ４８
（２）配列番号１９の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１９：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴ ＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣ ＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡ ＡＧＧＴＡＡ ５６
（２）配列番号２０の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列記述：配列番号２０：
ＧＴＴＣＴＣＣＴＡＡ ＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣ ＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡ ＣＡ ３２
（１）全般情報：
（ｉｉｉ）配列の数：２０
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１：
ＡＵＳＵＧＷ ６
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号２：
ＵＣＷＣＹＷＡ ７
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号３：
ＡＵＣＵＧＵ ６
（２）配列番号４の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号４：
ＵＣＵＣＵＡＡ ７
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号５：
ＵＣＵＣＣＵＡ ７
（２）配列番号６の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号６：
ＵＵＣＡＡ ５
（２）配列番号７の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号７：
ＷＣＡＳＡＵ ６
（２）配列番号８の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号８：
ＵＷＲＧＷＲ ６
（２）配列番号９の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号９：
ＡＣＡＧＡＵ ６
（２）配列番号１０の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１０：
ＵＵＡＧＡＧＡ ７
（２）配列番号１１の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１１：
ＵＡＧＧＡＧＡ ７
（２）配列番号１２の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１２：
ＵＵＧＡＡ ５
（２）配列番号１３の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６８塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１３：
ＣＣＵＵＵＧＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＧＧＧ ＵＡＣＣＵＧＣＵＧＵ ＧＵＧＡＡＡＣＡＡＡ ＡＧＵＡＡＧＵＧＣＵ ＵＣＣＡＵＧＵＵＵＣ ＡＧＵＧＧＡＧＧ ６８
（２）配列番号１４の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：７３塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１４：
ＧＣＵＣＣＣＵＵＣＡ ＡＣＵＵＵＡＡＣＡＵ ＧＧＡＡＧＵＧＣＵＵ ＵＣＵＧＵＧＡＣＵＵ ＵＡＡＡＡＧＵＡＡＧ ＵＧＣＵＵＣＣＡＵＧ ＵＵＵＵＡＧＵＡＧＧ ＡＧＵ ７３
（２）配列番号１５の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６９塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１５：
ＣＣＡＣＣＡＣＵＵＡ ＡＡＣＧＵＧＧＡＵＧ ＵＡＣＵＵＧＣＵＵＵ ＧＡＡＡＣＵＡＡＡＧ ＡＡＧＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＵＧＧＵＧＡＵＧＧ ６９
（２）配列番号１６の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：６８塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：ヘアピン
（ｉｉ）分子タイプ：ＲＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１６：
ＣＣＵＣＵＡＣＵＵＵ ＡＡＣＡＵＧＧＡＧＧ ＣＡＣＵＵＧＣＵＧＵ ＧＡＣＡＵＧＡＣＡＡ ＡＡＡＵＡＡＧＵＧＣ ＵＵＣＣＡＵＧＵＵＵ ＧＡＧＵＧＵＧＧ ６８
（２）配列番号１７の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：２３塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１７：
ＧＡＣＡＡＣＡＧＧＴ ＧＣＧＣＴＣＡＧＧＴ ＣＣＴ ２３
（２）配列番号１８の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：４８塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１８：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧ ＧＴＡＴＧＧＴＡＣＴ ＴＧＧＴＡＧＴＴ ４８
（２）配列番号１９の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：５６塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＮＯ
（ｘｉ）配列記述：配列番号１９：
ＧＡＴＡＴＣＴＡＡＴ ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ ＡＴＡＧＧＧＡＧＡＴ ＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣ ＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡ ＡＧＧＴＡＡ ５６
（２）配列番号２０の情報：
（ｉ）シーケンス特性：
（Ａ）長さ：３２塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）ストランド（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：シングル
（Ｄ）トポロジー：直線
（ｉｉ）分子タイプ：ＤＮＡ
（Ａ）記述（ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ）：／ｄｅｓｃ＝“ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ”
（ｉｉｉ）仮説（ＨＹＰＯＴＨＥＴＩＣＡＬ）：ＮＯ
（ｉｖ）アンチセンス：ＹＥＳ
（ｘｉ）配列記述：配列番号２０：
ＧＴＴＣＴＣＣＴＡＡ ＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣ ＡＡＧＡＡＣＴＧＣＡ ＣＡ ３２
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】