(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-10
(45)【発行日】2023-10-18
(54)【発明の名称】観察容器、及び、試料作製方法
(51)【国際特許分類】
G01N 1/36 20060101AFI20231011BHJP
G01N 1/28 20060101ALI20231011BHJP
【ＦＩ】
G01N1/36
G01N1/28 J
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2020091643
(22)【出願日】2020-05-26
(65)【公開番号】P2021188941
(43)【公開日】2021-12-13
【審査請求日】2022-12-15
(73)【特許権者】
【識別番号】322004393
【氏名又は名称】株式会社エビデント
(74)【代理人】
【識別番号】100121083
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 宏義
(74)【代理人】
【識別番号】100138391
【弁理士】
【氏名又は名称】天田 昌行
(74)【代理人】
【識別番号】100074099
【弁理士】
【氏名又は名称】大菅 義之
(74)【代理人】
【識別番号】100182936
【弁理士】
【氏名又は名称】矢野 直樹
(72)【発明者】
【氏名】島田 佳弘
(72)【発明者】
【氏名】篠原 千尋
(72)【発明者】
【氏名】小江 克典
(72)【発明者】
【氏名】西脇 大介
(72)【発明者】
【氏名】杉山 崇
【審査官】外川 敬之
(56)【参考文献】
【文献】実開昭５８－１６９５５３（ＪＰ，Ｕ）
【文献】特開２０１９－００００８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５１６１０９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ １／３６
Ｇ０１Ｎ １／２８
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
観察対象物を保持する保持部と、少なくとも一部が透明な曲面からなり、前記保持部を位置決めする収容部と、を備え、
前記保持部は、前記収容部によって第１の位置に位置決めされた第１の状態で、前記観察対象物を前記曲面から前記曲面の曲率中心に向かって離間した設定位置に保持する
ことを特徴とする観察容器。
【請求項2】
請求項１に記載の観察容器において、前記保持部は、前記第１の状態で、前記観察対象物を包埋したゲル又は固体を吊り下げることによって、前記観察対象物を前記設定位置に保持する
ことを特徴とする観察容器。
【請求項3】
請求項２に記載の観察容器において、前記保持部は、前記観察対象物を含む媒質溶液のハンギングドロップを形成するハンギングドロップ形成部を含み、
前記ハンギングドロップは、液面に沿って働く重力の分力によって前記保持部に対して所定の相対位置に移動した前記観察対象物を含み、
前記ゲル又は前記固体は、前記ハンギングドロップがゲル化又は固体化することで形成される
ことを特徴とする観察容器。
【請求項4】
請求項２に記載の観察容器において、前記ゲル又は前記固体は、前記収容部に収容された媒質溶液であって、前記曲面に沿って働く重力の分力によって前記保持部に対して所定の相対位置に移動した前記観察対象物を含む媒質溶液が、ゲル化又は固体化することで形成され、
前記保持部は、前記収容部内で摺動することによって、前記ゲル又は前記固体を前記曲面から剥離する剥離部を兼ねる
ことを特徴とする観察容器。
【請求項5】
請求項４に記載の観察容器において、前記収容部は、
前記保持部を前記第１の位置に位置決めする第１の係止部と、
前記保持部を第２の位置に位置決めする第２の係止部と、を含み、
前記保持部は、前記収容部によって前記第２の位置に位置決めされた第２の状態で、前記ゲル又は前記固体に包埋された前記観察対象物を前記曲面上に保持する
ことを特徴とする観察容器。
【請求項6】
請求項１に記載の観察容器において、前記保持部は、
前記観察対象物を保持する凹部を含み、
前記凹部を鉛直上方に向けた状態で前記曲面上に配置若しくは形成される
ことを特徴とする観察容器。
【請求項7】
請求項６に記載の観察容器において、前記保持部は、シリコーンゴムである
ことを特徴とする観察容器。
【請求項8】
請求項６に記載の観察容器において、前記保持部は、前記収容部に配置された吸水性ポリマーが吸水して膨張することによって形成される
ことを特徴とする観察容器。
【請求項9】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の観察容器において、前記収容部は、少なくとも一部が透明な平面からなり、
前記設定位置は、前記平面の法線上に位置する
ことを特徴とする観察容器。
【請求項10】
請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の観察容器において、前記曲面は、三次元曲面である
ことを特徴とする観察容器。
【請求項11】
請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載の観察容器において、前記曲面は、球面である
ことを特徴とする観察容器。
【請求項12】
請求項１乃至請求項１１のいずれか１項に記載の観察容器において、前記曲面は、所定の曲率を有する
ことを特徴とする観察容器。
【請求項13】
請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の観察容器において、前記曲面から前記設定位置に保持された前記観察対象物までの距離をｄ、前記曲面の曲率半径をＲとするとき、以下の条件式
Ｒ／２＜ｄ＜Ｒ ・・・・（１）
を満たすことを特徴とする観察容器。
【請求項14】
請求項１乃至請求項１３のいずれか１項に記載の観察容器において、一次元又は二次元に配列された複数の要素を含み、
前記複数の要素の各々は、前記収容部と前記保持部とを含む
ことを特徴とする観察容器。
【請求項15】
観察対象物を保持する保持部と、少なくとも一部が透明な曲面からなる収容部と、を含む観察容器を用いた試料作製方法であって、前記収容部によって前記保持部を第１の位置に位置決めし、
前記保持部が前記第１の位置に位置決めされた第１の状態で、前記観察対象物を前記曲面から前記曲面の曲率中心に向かって離間した設定位置に保持する
ことを特徴とする試料作製方法。
【請求項16】
請求項１５に記載の試料作製方法において、さらに、前記保持部によって前記観察対象物を含む媒質溶液のハンギングドロップを形成し、
前記ハンギングドロップをゲル化又は固体化することによって前記観察対象物が包埋されたゲル又は固体を形成し、
前記第１の状態で前記観察対象物を前記設定位置に保持することは、前記観察対象物を包埋した前記ゲル又は前記固体を吊り下げることを含む
ことを特徴とする試料作製方法。
【請求項17】
請求項１５に記載の試料作製方法において、さらに、前記収容部に注がれた前記観察対象物を含む媒質溶液で前記曲面を覆い、
前記媒質溶液をゲル化又は固化することによって前記観察対象物が包埋されたゲル又は固体を形成し、
前記ゲル又は前記固体を前記曲面から剥離し、
前記第１の状態で前記観察対象物を前記設定位置に保持することは、前記観察対象物を包埋した前記ゲル又は前記固体を吊り下げることを含む
ことを特徴とする試料作製方法。
【請求項18】
請求項１５に記載の試料作製方法において、さらに、前記収容部に注がれた前記観察対象物を含む媒質溶液で前記第１の位置に位置決めされた前記保持部の凹部を覆い、
前記保持部を前記第１の位置に位置決めすることは、前記凹部を鉛直上方に向けた状態で前記保持部を前記曲面上に配置若しくは形成することを含み、
前記第１の状態で前記観察対象物を前記設定位置に保持することは、前記観察対象物を前記凹部に保持することを含む
ことを特徴とする試料作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書の開示は、観察容器、試料作製方法、及び、観察方法に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、多数の細胞からなり、３次元的に培養したスフェロイドやオルガノイドのような細胞凝集塊を使った研究が注目されている。近年では、スフェロイドやオルガノイドを顕微鏡で撮影し、取得した顕微鏡画像データに対して画像解析技術を用いて創薬のためにスクリーニングを行い、薬効を評価するといったことも行われている。
【0003】
創薬スクリーニングの対象となる上記のような観察対象物は、１００μｍから５００μｍ程度の大きさを有している。このため、観察対象物内部での散乱を抑制するための透明化処理を施した上で、深部撮影やＺシリーズ撮影（Ｚスタック撮影ともいう。）を行うことで顕微鏡画像データを取得するのが一般的である。
【0004】
また、創薬スクリーニングでは、大量の観察対象物を効率よくスクリーニングすることが求められるため、ディスク型共焦点倒立顕微鏡のような高速撮影が可能な顕微鏡が利用される。深部観察に適したライトシート顕微鏡が利用されることもある（特許文献１参照）。いずれの場合も、高い分解能を実現し且つ発生した観察光を効率よく集光して露光時間を短縮するため、高い開口数を有する液浸対物レンズの利用が欠かせない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特表２０１６－５１７９７１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ところで、観察対象物の深部を撮影する場合、媒質間の屈折率ミスマッチに起因する球面収差の影響が大きくなる。対物レンズの開口数が高いほどその影響はより顕著になるため、液浸対物レンズを用いた観察においては、この課題に対して何らかの対処が望まれている。なお、透明化処理が施されている場合を想定すると、容器内の媒質の屈折率はほぼ均一と見做すことができる。このため、容器の厚さが均一であれば、浸液と容器内の媒質（観察対象物を含む）との間の屈折率差が及ぼす影響が、屈折率ミスマッチに起因する球面収差において支配的である。
【0007】
透明化された観察対象物の屈折率は、一般的な透明化溶液の屈折率と同様に、水の屈折率（１．３３）よりもかなり高い。このため、屈折率ミスマッチを抑制するといった観点から見ると、浸液は、水よりもオイル（例えば、屈折率１．５２）やシリコーンオイル（例えば、屈折率１．４０）であることが望ましい。
【0008】
一方、浸液にオイルやシリコーンオイルを用いることには、運用面での課題がある。創薬スクリーニングの対象となる観察対象物の数は非常に多く、人手による浸液の供給は大きな負担となる。このため、自動供給装置が用いられるのが一般的であるが、浸液がオイル等の場合には、その高い粘性によって気泡が生じやすく、浸液の供給を自動化することが難しい。また、オイルが付着した容器の洗浄に手間がかかるといった課題もある。
【0009】
このような理由から、現在の創薬スクリーニングでは、収差性能よりも運用面で優位性を重視して、水浸対物レンズが利用されているのが実情である。以上のような実情を踏まえ、本発明の一側面に係る目的は、浸液と観察対象物の屈折率差が大きい場合であっても光学性能の劣化を抑制可能な技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の一態様に係る観察容器は、観察対象物を保持する保持部と、少なくとも一部が透明な曲面からなり、前記保持部を位置決めする収容部と、を備え、前記保持部は、前記収容部によって第１の位置に位置決めされた第１の状態で、前記観察対象物を前記曲面から前記曲面の曲率中心に向かって離間した設定位置に保持する。
【0011】
本発明の一態様に係る試料作製方法は、観察対象物を保持する保持部と、少なくとも一部が透明な曲面からなる収容部と、を含む観察容器を用いた試料作製方法であって、前記収容部によって前記保持部を第１の位置に位置決めし、前記保持部が前記第１の位置に位置決めされた第１の状態で、前記観察対象物を前記曲面から前記曲面の曲率中心に向かって離間した設定位置に保持する。
【発明の効果】
【0013】
上記の態様によれば、浸液と観察対象物の屈折率差が大きい場合であっても光学性能の劣化を抑制可能な技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】第１の実施形態に係る観察容器１の構成を示した図である。
【図2】収容部１０の形状を説明するための図である。
【図3】第１の実施形態に係る試料作製方法を説明するフローチャートである。
【図4】第１の実施形態に係るハンギングドロップ形成工程を説明するための図である。
【図5】第１の実施形態に係るゲル化工程を説明するための図である。
【図6】第１の実施形態に係る固定化・蛍光染色工程を説明するための図である。
【図7】第１の実施形態に係る透明化工程を説明するための図である。
【図8】第１の実施形態に係る観察容器１を用いた観察方法を説明するための図である。
【図9】観察容器１における収差抑制効果について説明するための図である。
【図10】第２の実施形態に係る観察容器２の構成を示した図である。
【図11】第２の実施形態に係る試料作製方法を説明するフローチャートである。
【図12】第２の実施形態に係る曲面を媒質溶液で覆う工程を説明するための図である。
【図13】第２の実施形態に係るゲル化工程を説明するための図である。
【図14】第２の実施形態に係る剥離工程を説明するための図である。
【図15】第２の実施形態に係る位置決め・保持工程から透明化工程を説明するための図である。
【図16】第２の実施形態に係る観察容器２を用いた観察方法を説明するための図である。
【図17】第３の実施形態に係る観察容器３の構成を示した図である。
【図18】第３の実施形態に係る試料作製方法を説明するフローチャートである。
【図19】第３の実施形態に係る位置決め工程から保持工程までを説明するための図である。
【図20】第３の実施形態に係る透明化工程を説明するための図である。
【図21】第３の実施形態に係る観察容器３を用いた観察方法を説明するための図である。
【図22】第４の実施形態に係る観察容器４を用いた観察方法を説明するための図である。
【図23】第５の実施形態に係る観察容器５の構成を示した図である。
【図24】収容部８０の形状を説明するための図である。
【図25】第５の実施形態に係る観察容器５を用いた観察方法を説明するための図である。
【図26】第６の実施形態に係る観察容器６を用いた観察方法を説明するための図である。
【図27】第７の実施形態に係る観察容器７を用いた観察方法を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
以下では、３次元的な構造を有する生体試料の観察に用いられる観察容器と試料作製方法について説明する。なお、本明細書において、観察とは、目視観察に限らず、デジタルカメラによる撮影を含むものとする。また、観察対象物としての生体試料は、特に限定しないが、例えば、スフェロイドやオルガノイドのような細胞凝集塊である。以降では、観察対象物が細胞凝集塊である場合を例にして、各実施形態を説明する。
【0016】
［第１の実施形態］
図１は、本実施形態に係る観察容器１の構成を示した図である。図２は、収容部１０の形状を説明するための図である。観察容器１は、図１に示すように、観察対象物を内部に収容する収容部１０と、観察対象物を保持する保持部２０と、を含んでいる。以下、図１及び図２を参照しながら観察容器１の構成について詳細に説明する。
図１は、本実施形態に係る観察容器１の構成を示した図である。図２は、収容部１０の形状を説明するための図である。観察容器１は、図１に示すように、観察対象物を内部に収容する収容部１０と、観察対象物を保持する保持部２０と、を含んでいる。以下、図１及び図２を参照しながら観察容器１の構成について詳細に説明する。
【0017】
収容部１０は、図１に示すように、保持部２０を位置決めする。また、収容部１０は、少なくとも一部が透明な曲面１１からなり、試験管に類似した形状を有している。より詳細には、収容部１０は、一端が開放され且つ他端が曲面１１で塞がれた円筒形を有している。収容部１０は、開口を鉛直上方に向け、曲面１１を鉛直下方に向けた状態で使用される。曲面１１で構成する収容部１０の底部は、実質的に均一な厚さを有している。
【0018】
収容部１０全体が透明であってもよく、曲面１１のみが透明であってもよい。また、曲面１１の一部のみが透明であってよい。収容部１０は、観察時に対物レンズへ入射する光が通過する領域が透明であればよく、従って、少なくとも光が通過する曲面１１の一部が透明であればよい。
【0019】
図２（ａ）は、収容部１０を円筒形状の軸方向に沿って切断したときの断面図であり、収容部１０を横から見たときの形状を示している。また、図２（ｂ）は、収容部１０を上から見た平面図である。曲面１１は、図２（ａ）及び図２（ｂ）に示すように、所定の曲率（１／Ｒ）を有する球面である。なお、曲面１１が有する曲率は、一定であることが望ましいが、必ずしも曲面１１の全領域において一定でなくてもよい。また、曲面１１は、三次元曲面であることが望ましいが、球面には限らない。なお、曲率の正負は、曲面１１の全領域において同じであることが望ましく、曲面１１は、少なくとも曲率中心が収容部１０内に位置するような形状であることが望ましく、従って、収容部１０の内側に凹面を向けた形状であることが望ましい。
【0020】
保持部２０は、開口２１から分注される媒質溶液のハンギングドロップを形成するハンギングドロップ形成部２２を含んでいる。ハンギングドロップ形成部２２を収容部１０の上端開口から収容部１０の内部に挿入し、保持部２０に形成された切り欠き部分が収容部１０の開口端に係合するように調整することで、図１に示すように、保持部２０の位置が確定し、保持部２０が収容部１０によって所定の位置（以降、第１の位置と記す。）に位置決めされる。また、以降では、保持部２０が収容部１０によって第１の位置に位置決めされた状態を第１の状態と記す。なお、収容部１０に収容される観察対象物である細胞凝集塊は、保持部２０が形成したハンギングドロップ内に閉じ込められた状態で、観察される。
【0021】
ハンギングドロップ形成部２２には、媒質溶液を通す管路が形成されている。ハンギングドロップ形成部２２は、開口２１側から見ると、漏斗のような形状を有している。開口２１から最も管路の径が絞り込まれた最絞部２３に至るまでの間の管路は、管路の径が徐々に絞り込まれるテーパー形状を有し、より詳細には、凡そ円錐形状を有している。また、最絞部２３から開口２１とは反対側の開口に至るまでの間の管路は、最絞部２３を通過した媒質溶液が徐々に空気と接する表面積を増やすように、逆テーパー形状を有している。より詳細には、凡そ円錐形状であってもよく、表面積の増加をさらに緩やかにするために三次元曲面で構成されてもよい。
【0022】
図３は、本実施形態に係る試料作製方法を説明するフローチャートである。図４は、本実施形態に係るハンギングドロップ形成工程を説明するための図である。図５は、本実施形態に係るゲル化工程を説明するための図である。図６は、本実施形態に係る固定化・蛍光染色工程を説明するための図である。図７は、本実施形態に係る透明化工程を説明するための図である。以下、図３から図７を参照しながら、観察容器１を用いた試料作製方法について説明する。
【0023】
まず、ハンギングドロップＤを形成する（ステップＳ１）。ここでは、図４に示すように、細胞凝集塊ＣＡを含む媒質溶液を、ピペット３０によって開口２１から保持部２０に分注する。これにより、ハンギングドロップ形成部２２によって媒質溶液のハンギングドロップＤが形成される。なお、分注される媒質溶液は、例えば、アクリルアミド溶液、アガロース溶液などである。これらの溶液は、一定温度以下まで冷やすことでゲル化する。
【0024】
ステップＳ１で媒質溶液とともに分注された細胞凝集塊ＣＡは、媒質溶液よりも高い比重を有する。このため、ステップＳ１では、細胞凝集塊ＣＡは、図４に示すように、ハンギングドロップＤの液面に沿って働く重力の分力によって、自動的に保持部２０に対して所定の相対位置へ、より具体的には、ハンギングドロップＤの最下点へ移動する。即ち、ステップＳ１で形成されたハンギングドロップＤは、液面に沿って働く重力の分力によって保持部２０に対して所定の相対位置に移動した細胞凝集塊ＣＡを含んでいる。
【0025】
ハンギングドロップＤが形成され、細胞凝集塊ＣＡが最下点に落ちつくと、ハンギングドロップＤをゲル化する（ステップＳ２）。ここでは、ハンギングドロップＤを構成する媒質溶液がアクリルアミド溶液やアガロース溶液であれば、ハンギングドロップＤをゲル化温度以下に冷やす。これにより、図５に示すように、ハンギングドロップＤ（より厳密には媒質溶液）がゲル化し、細胞凝集塊ＣＡを包埋したゲルＤ１が得られる。ゲルＤ１は、媒質溶液がゲル化することで形成された細胞凝集塊ＣＡを包埋したゲルである。
【0026】
次に、細胞凝集塊ＣＡの固定化及び蛍光染色を行う（ステップＳ３）。ここでは、図６に示すように、容器４０に入れられた専用の溶液４１にゲルＤ１を浸すことで、ゲルＤ１内の細胞凝集塊ＣＡを固定化し、蛍光色素で染色する。また、ステップＳ３では、細胞凝集塊ＣＡの洗浄が行われてもよい。なお、細胞凝集塊ＣＡの蛍光染色は、必ずしもゲル化工程の後に行われる必要はなく、例えば、予め蛍光染色されたスフェロイドなどを含む媒質溶液でハンギングドロップを形成し、その後、ハンギングドロップをゲル化してもよい。
【0027】
その後、保持部２０を位置決めし、細胞凝集塊ＣＡを設定位置に保持する（ステップＳ４）。ここでは、図７に示すように、保持部２０が透明化溶液１２で満たされた収容部１０に載置されることで、保持部２０と収容部１０が係合する。これにより、収容部１０は、保持部２０を第１の位置に位置決めし、保持部２０は、第１の位置に位置決めされた第１の状態で、細胞凝集塊ＣＡを、収容部１０の曲面１１から曲面１１の曲率中心に向かって離間した設定位置に保持する。より詳細には、保持部２０は、細胞凝集塊ＣＡを包埋したゲルであるゲルＤ１を、収容部１０の収容空間内において吊り下げることで、細胞凝集塊ＣＡを設定位置に保持する。なお、設定位置は、曲面１１の曲率中心またはその近傍である。収容部１０と保持部２０は、保持部２０が収容部１０によって位置決めされた第１の状態で曲面１１の曲率中心近傍にハンギングドロップの最下点が位置するように、予め設計されている。
【0028】
最後に、透明化溶液１２がゲルＤ１に浸透し、これにより細胞凝集塊ＣＡが透明化される（ステップＳ５）。ここでは、図７に示すように、ゲルＤ１及び細胞凝集塊ＣＡが、透明化溶液１２の働きによって、透明化溶液１２の屈折率とほぼ同じ屈折率を有するゲルＤ２及び細胞凝集塊ＣＡ２に変化する。これにより、収容部１０内において媒質（透明化溶液１２、ゲルＤ２、細胞凝集塊ＣＡ２）の屈折率がほぼ均一な試料が完成する。
【0029】
以上はハンギングドロップをゲル化する方法で説明したが、例えば、ハンギングドロップを構成する媒質溶液として紫外線硬化型の樹脂溶液を用い、ハンギングドロップに紫外線を照射することでハンギングドロップを固体化してもよい。この場合も細胞凝集塊を媒質溶液に含めることで、細胞凝集塊を包埋したハンギングドロップが得られる。この場合、ハンギングドロップは、媒質溶液を固体化することで形成された固体である。なお、固体化したハンギングドロップを溶液に浸漬しても、ゲル化したハンギングドロップの場合とは異なり、その溶液はハンギングドロップ内に浸み込まない。このため、紫外線硬化型の樹脂溶液を使用してハンギングドロップを形成する場合には、予め、細胞凝集塊に対して蛍光染色などの処理を施しておくことが望ましい。
【0030】
図８は、本実施形態に係る観察容器１を用いた観察方法を説明するための図である。図９は、観察容器１における収差抑制効果について説明するための図である。図３に示す手順で作製された試料を用いて細胞凝集塊ＣＡ２を観察する場合、倒立顕微鏡が用いられる。具体的な観察手順は、まず、図３に示す手順で試料を作製することで、上述した設定位置に観察対象物である細胞凝集塊ＣＡ２を保持する。その後に、収容部１０と倒立顕微鏡の対物レンズＯＢの間を浸液ＩＭで満たす。最後に、図８に示すように、対物レンズＯＢと観察容器１との間を浸液ＩＭで満たした状態で、設定位置に保持された細胞凝集塊ＣＡ２からの光を、曲面１１を経由して対物レンズＯＢに取り込む。これにより、曲面１１を経由して細胞凝集塊ＣＡ２が観察される。
【0031】
観察時において、曲面１１から曲率中心に向かって離間した設定位置にある細胞凝集塊ＣＡ２からの光線は、透明化した媒質と浸液ＩＭとの間の収容部１０（曲面１１）を経由して対物レンズＯＢに取り込まれるが、その際、観察容器１では、収容部１０（曲面１１）への光線の入射角を小さく抑えることが可能である。これは、収容部１０を曲面１１で構成し、且つ、曲面１１から細胞凝集塊ＣＡ２を離間させているためである。特に、細胞凝集塊ＣＡ２が保持されている設定位置が曲面１１の曲率中心又はその近傍である場合には、入射角を特に小さく抑えることが可能となる。この点について図９を参照しながら、説明する。
【0032】
図９（ａ）は、平面Ｆ上に細胞凝集塊ＣＡ２が配置された例が示されている。図９（ｂ）には、曲面Ｃ上に細胞凝集塊ＣＡ２が配置された例が示されている。図９（ｃ）には、曲面Ｃから曲率中心に向かって曲率半径よりも小さな距離だけ離間した位置に細胞凝集塊ＣＡ２が配置された例が示されている。図９（ｄ）には、曲面Ｃから曲率中心に向かって曲率半径だけ離間した位置に細胞凝集塊ＣＡ２が配置された例が示されている。
【0033】
図９（ａ）から図９（ｄ）を参照すると、対物レンズの光軸方向に進行する光線Ａ１については、いずれもの場合も、境界面（平面Ｆ、曲面Ｃ）へ入射角０°で入射している。従って、光線Ａ１は、図９（ａ）から図９（ｄ）の何れの場合も屈折しない。一方で、光軸に対して傾いた方向に進行する光線Ａ２については、境界面（平面Ｆ、曲面Ｃ）への入射角がそれぞれ異なっている。具体的には、図９（ａ）から図９（ｄ）に状態が変化するのに従って入射角が減少するため、図９（ｄ）から図９（ａ）の順に小さな入射角を有する（入射角θ１＞θ２＞θ３＞０°）。
【0034】
光線を小さな入射角で収容部１０に入射させることで収容部１０での屈折角を小さく抑えることができる。その結果、収容部１０を挟んで配置されている媒質（浸液ＩＭと透明化溶液）間の屈折率ミスマッチに起因する球面収差を抑制することが可能であり、屈折率ミスマッチに起因する観察装置（倒立顕微鏡）の光学性能の劣化を抑制することができる。従って、本実施形態に係る観察容器１及び試料作製方法によれば、観察装置の性能を十分に発揮することが可能であり、高い解像度の画像を取得することが可能となる。また、球面収差を抑制することができるため、球面収差に敏感な高い開口数を有する対物レンズを使用して効率よく光を集めることが可能であり、短時間で画像を得ることができる。
【0035】
また、細胞凝集塊のような大きな観察対象物を観察する場合、観察対象物内での散乱を抑制するために透明化処理が行われるが、現在市場に広く流通している透明化溶液の屈折率は、水の屈折率（１．３３）よりも高い。さらに、透明化溶液の種類によって屈折率が異なっている。例えば、透明化溶液ＳＣＡＬＥＶＩＥＷ－Ｓ４の屈折率は１．４７であり、透明化溶液ＣＵＢＩＣの屈折率は１．５２である。このため、用途等に応じて使用される透明化溶液の屈折率に液浸の屈折率を合わせることで屈折率ミスマッチを解消する、といった対処を実践することは容易ではない。しかしながら、本実施形態によれば、屈折率ミスマッチに起因する球面収差を小さく抑えることができるため、浸液ＩＭを自由に選択することができる。
【0036】
特に、本実施形態によれば、上記の理由により、浸液ＩＭに水を用いることが可能であり、水浸対物レンズを用いて高い解像度の画像を短時間で取得することができる。粘性が比較的低い水を浸液に用いることで、観察容器１と対物レンズＯＢの間に浸液ＩＭを供給する際に、気泡が発生しにくいため、自動供給装置による浸液ＩＭの自動供給を行うことができる。また、浸液ＩＭにオイルを用いた場合と比較すると、水は蒸発するので残留せず、洗浄が不要であるというメリットがある。
【0037】
従って、本実施形態に係る観察容器１及び試料作製方法は、作業の自動化に好適であり、創薬スクリーニングのような大量の試料を検査する用途に利用することで、高いスループットを実現することができる。
【0038】
なお、本実施形態のステップＳ１では、予め培養された細胞凝集塊ＣＡを媒質溶液とともに分注することでハンギングドロップを形成する例を示したが、細胞凝集塊ＣＡはハンギングドロップ内で形成されてもよい。例えば、細胞を播種した培養液を保持部２０に分注することでハンギングドロップを形成し、ハンギングドロップの最下点に集まった細胞をハンギングドロップ内で培養することで、細胞凝集塊ＣＡを形成してもよい。その後、培養液を吸引し、代わりに、媒質溶液を分注することで、ハンギングドロップの成分を培養液から媒質溶液へ入れ替える。この場合も、ステップＳ２以降については、本実施形態と同様の手順で試料を作製することができる。
【0039】
また、本実施形態のステップＳ３では、容器４０を用いて細胞凝集塊ＣＡの固定化等を行う例を示したが、ステップＳ３の処理は、収容部１０を用いて行われてもよい。例えば、収容部１０に入れた溶液４１にゲルＤ１を浸すことで、ゲルＤ１内の細胞凝集塊ＣＡを固定化し、蛍光色素で染色してもよい。また、図３に示す各工程の順番は、図３に示す順番に限られない。例えば、上述したように、ゲル化前に蛍光染色を行ってもよい。
【0040】
なお、以上では、細胞凝集塊ＣＡを、曲面から前記曲面の曲率中心に向かって離間した設定位置、望ましくは、曲面１１の曲率中心又はその近傍である設定位置に位置決めすることが望ましいことを説明したが、より具体的には、曲面１１から設定位置に保持された細胞凝集塊ＣＡまでの距離をｄとし、曲面１１の曲率半径をＲとするとき、以下の条件式（１）を満たすことが望ましい。
Ｒ／２＜ｄ＜Ｒ ・・・・（１）
Ｒ／２＜ｄ＜Ｒ ・・・・（１）
【0041】
距離ｄが曲率半径Ｒと等しい場合には、１００μｍから５００μｍ程度の厚さを有する細胞凝集塊ＣＡの最下部に曲率中心が位置することになる。このため、細胞凝集塊ＣＡの最下部と最上部を撮影するときで光学性能の違いが大きくなりすぎてしまうことがある。従って、距離ｄは曲率半径Ｒ未満であることが望ましい。また、距離ｄが曲率半径Ｒの半分以下の場合には、細胞凝集塊ＣＡ中の物点からの光線束を構成する光線が曲面１１へ入射する入射角が大きすぎ、十分に屈折角を小さくすることができないことがある。従って、距離ｄは曲率半径Ｒの半分よりも長いことが望ましい。条件式（１）を満たすことで、細胞凝集塊ＣＡ内の位置によって光学性能が大きく異なってしまう事態を回避することができる。
【0042】
［第２の実施形態］
図１０は、本実施形態に係る観察容器２の構成を示した図である。観察容器２は、図１０に示すように、観察対象物を内部に収容する収容部５０と、観察対象物を保持部６０と、を含んでいる。なお、保持部６０は、観察対象物を包埋したゲルを吊り下げることで観察対象物を設定位置に保持するものであり、この点は、第１の実施形態に係る収容部１０と同様である。以下、図１０を参照しながら観察容器２の構成について詳細に説明する。
図１０は、本実施形態に係る観察容器２の構成を示した図である。観察容器２は、図１０に示すように、観察対象物を内部に収容する収容部５０と、観察対象物を保持部６０と、を含んでいる。なお、保持部６０は、観察対象物を包埋したゲルを吊り下げることで観察対象物を設定位置に保持するものであり、この点は、第１の実施形態に係る収容部１０と同様である。以下、図１０を参照しながら観察容器２の構成について詳細に説明する。
【0043】
収容部５０は、少なくとも一部が透明な曲面５１を備える点は、収容部１０と同様である。なお、曲面５１は、収容部５０の底面を構成する三次元曲面であり、例えば、球面である。また、収容部５０は、観察時に対物レンズへ入射する光が通過する領域が透明であればよく、従って、少なくとも曲面５１の一部が透明であればよい。この点についても、収容部１０と同様である。
【0044】
収容部５０は、２つの係止部（係止部５２、係止部５３）を備える点が収容部１０とは異なっている。係止部５２は、保持部６０を第１の位置に位置決めする第１の係止部であり、係止部５３は、保持部６０を第１の位置とは異なる第２の位置に位置決めする第２の係止部である。
【0045】
さらに、収容部５０は、ゲルを形成するための型としても機能する。このため、収容部５０は、後述する剥離工程においてゲルが剥離しやすいように、収容部５０の内部空間が底部に向かって径が小さくなるテーパー形状を有しており、この点においても、収容部１０とは異なっている。
【0046】
保持部６０は、収容部５０を型として利用して曲面５１上に形成されたゲルを曲面５１から剥離する剥離部としても機能する。保持部６０は、収容部５０の内径に凡そ一致した外径を有する嵌合部６２を備えている。嵌合部６２は、Ｏリング７０が収容部５０の係止部と係合することで、Ｏリング７０をして収容部５０によって支持される。その結果として、保持部６０は、収容部５０によって位置決めされる。なお、Ｏリング７０は、嵌合部６２に形成された溝に嵌め込まれた状態で接着されている。
【0047】
保持部６０は、さらに、嵌合部６２から突出したアーム部６３と把持部６４を備えている。把持部６４は、保持部６０が収容部５０によって位置決めされた状態で、収容部５０の上部開口から外側に向かって突出するように、嵌合部６２から延びている。一方、アーム部６３は、保持部６０が収容部５０によって位置決めされた状態で、曲面５１に向かって突出するように、嵌合部６２から延びている。なお、開口６１は、把持部６４に形成されている。嵌合部６２とアーム部６３と把持部６４には、開口６１から延びる管路が貫通している。
【0048】
アーム部６３の下端開口の付近には、管路の径方向に突出したフランジが形成されている。アーム部６３に形成されたフランジは、後述するように、細胞凝集塊を包埋したゲルを持ち上げる役割を担っている。アーム部６３の途中にも開口が設けられていて、開口６１から注がれた液体は、アーム部６３の下端の開口が塞がれている場合には、アーム部６３の途中に設けられた開口から外部へ排出される。
【0049】
把持部６４にも、管路の径方向に突出したフランジが形成されている。把持部６４に形成されたフランジは、後述するように、保持部６０を摺動するときに機械又は人間によって把持される。
【0050】
図１１は、本実施形態に係る試料作製方法を説明するフローチャートである。図１２は、本実施形態に係る曲面を媒質溶液で覆う工程を説明するための図である。図１３は、本実施形態に係るゲル化工程を説明するための図である。図１４は、本実施形態に係る剥離工程を説明するための図である。図１５は、本実施形態に係る位置決め・保持工程から透明化工程を説明するための図である。以下、図１１から図１５を参照しながら、観察容器２を用いた試料作製方法について説明する。
【0051】
まず、保持部６０を経由して収容部５０に注がれた、細胞凝集塊ＣＡを含む媒質溶液で曲面５１を覆う（ステップＳ１１）。ここでは、図１２に示すように、Ｏリング７０を係止部５３に係合することで保持部６０が収容部５０によって第２の位置に位置決めされている状態（第２の状態と記す。）で、細胞凝集塊ＣＡを含む媒質溶液ＭＳを、ピペット３０によって開口６１から保持部６０に分注する。その結果、保持部６０を貫通する管路を通って媒質溶液ＭＳが収容部５０に注がれ、収容部５０に収容される。これにより、曲面５１が媒質溶液ＭＳで覆われる。なお、分注される媒質溶液ＭＳは、第１の実施形態と同様であり、例えば、アクリルアミド溶液、アガロース溶液などである。
【0052】
ステップＳ１１で媒質溶液ＭＳとともに分注された細胞凝集塊ＣＡは、媒質溶液ＭＳよりも高い比重を有する。このため、ステップＳ１１では、図１２に示すように、細胞凝集塊ＣＡは収容部５０の曲面５１に沿って働く重力の分力によって、自動的に保持部６０に対して所定の相対位置へ、より具体的には、曲面５１の最下点へ移動する。
【0053】
細胞凝集塊ＣＡが最下点に落ちつくと、媒質溶液ＭＳをゲル化する（ステップＳ１２）。ここでは、媒質溶液ＭＳがアクリルアミド溶液やアガロース溶液であれば、媒質溶液ＭＳをゲル化温度以下に冷やす。これにより、図１３に示すように、媒質溶液ＭＳがゲル化したゲルＭＳ１が得られ、保持部６０は、収容部５０によって第２の位置に位置決めされた第２の状態で、ゲルＭＳ１に包埋された細胞凝集塊ＣＡを曲面５１上に保持する。ゲルＭＳ１は、媒質溶液ＭＳがゲル化することで形成された細胞凝集塊ＣＡを包埋したゲルである。
【0054】
次に、細胞凝集塊ＣＡの固定化及び蛍光染色を行う（ステップＳ１３）。ここでは、機械又は人間が把持部６４を把持し持ち上げることで、保持部６０が収容部５０内で摺動する。ステップＳ１３では、ゲルＭＳ１は流動性を失っている。このため、保持部６０の移動に伴って、ゲルＭＳ１はアーム部６３によって持ち上げられる。これにより、保持部６０は、図１４に示すように、曲面５１からゲルＭＳ１を剥離させ、収容部５０から取り外される。即ち、保持部６０は、収容部５０内で摺動することによって、ゲルＭＳ１を曲面５１から剥離する剥離部を兼ねている。その後、収容部５０から取り外された保持部６０に吊り下げられているゲルＭＳ１を、予め用意されている溶液に浸すことでゲルＭＳ１内の細胞凝集塊ＣＡを固定化し、蛍光色素で染色する。また、ステップＳ１３では、細胞凝集塊ＣＡの洗浄が行われてもよい。
【0055】
その後、保持部６０を第１の位置に位置決めし、細胞凝集塊ＣＡを設定位置に保持する（ステップＳ１４）。ここでは、保持部６０を再び収容部５０に挿入することで、図１５に示すように、Ｏリング７０が係止部５２に係合する。これにより、収容部５０は、保持部６０を第１の位置に位置決めし、保持部６０は、第１の位置に位置決めされた第１の状態で、細胞凝集塊ＣＡを曲面５１から曲面５１の曲率中心に向かって離間した設定位置に保持する。より詳細には、保持部６０は、細胞凝集塊ＣＡを包埋したゲルであるゲルＭＳ１を、収容部５０の収容空間内において吊り下げることで、細胞凝集塊ＣＡを設定位置に保持する。
【0056】
なお、設定位置は、曲面５１の曲率中心またはその近傍である。収容部５０と保持部６０は、保持部６０が収容部５０によって位置決めされた第１の状態で曲面５１の曲率中心近傍にゲルＭＳ１の最下点が位置するように、予め設計されている。
【0057】
最後に、ゲルＭＳ１内の細胞凝集塊ＣＡが透明化される（ステップＳ１５）。ここでは、図１５に示すように、透明化溶液５４を、ピペット３０によって開口６１から保持部６０に分注する。透明化溶液５４は、アーム部６３下端からゲルＭＳ１内に浸透するとともに、アーム部６３の途中に設けられた開口から溢れ出して収容部５０に注がれる。その結果、ゲルＭＳ１には、その周囲からも透明化溶液５４が浸透する。これにより、細胞凝集塊ＣＡが透明化され、ゲルＭＳ２及び細胞凝集塊ＣＡ２に変化する。以上により、収容部５０内において媒質（透明化溶液５４、ゲルＭＳ２、細胞凝集塊ＣＡ２）の屈折率がほぼ均一な試料が完成する。
【0058】
図１６は、本実施形態に係る観察容器２を用いた観察方法を説明するための図である。図１１に示す手順で作製された試料を用いて細胞凝集塊ＣＡ２を観察する場合、倒立顕微鏡が用いられる。具体的な観察手順は、第１の実施形態と同様である。図１６に示すように、対物レンズＯＢと観察容器２との間を浸液ＩＭで満たした状態で、設定位置に保持された細胞凝集塊ＣＡ２からの光を、曲面５１を経由して対物レンズＯＢに取り込むことで、曲面５１を経由して細胞凝集塊ＣＡ２を観察する。
【0059】
本実施形態においても、第１の実施形態と同様の理由により、観察時に、細胞凝集塊ＣＡ２から収容部５０（曲面５１）への光線の入射角を小さく抑えることが可能であり、それによって、収容部５０での屈折角を小さく抑えることができる。その結果、収容部５０を挟んで配置されている媒質（浸液ＩＭと透明化溶液）の間の屈折率ミスマッチに起因する球面収差を抑制することが可能であり、屈折率ミスマッチに起因する観察装置（倒立顕微鏡）の光学性能の劣化を抑制することができる。従って、本実施形態に係る観察容器２及び試料作製方法によっても、第１の実施形態に係る観察容器１及び試料作製方法と同様に、観察装置の性能を十分に発揮することが可能であり、高い解像度の画像を取得することが可能となる。また、球面収差を抑制することができるため、球面収差に敏感な高い開口数を有する対物レンズを使用して効率よく光を集めることが可能であり、短時間で画像を得ることができる。
【0060】
また、屈折率ミスマッチに起因する球面収差を小さく抑えることができるため、浸液ＩＭを自由に選択することができる点も、第１の実施形態と同様である。本実施形態に係る観察容器２及び試料作製方法も、作業の自動化に好適であり、創薬スクリーニングのような大量の試料を検査する用途に利用することで、高いスループットを実現することができる。
【0061】
また、本実施形態では、固定化や蛍光染色に用いる溶液を廃液する必要がない場合であれば、保持部６０を収容部５０から取り外すことなく、一連の手順を効率良く実施することができる。つまり、ゲルを剥離した後に直ちに第１の位置に保持部６０を位置決めしてもよく、第１の状態で固定化や蛍光染色に用いる溶液を注入することで固定化や蛍光染色を行ってもよい。さらに、その後、透明化溶液を追加することで透過化工程を実施してもよい。
【0062】
なお、本実施形態のステップＳ１１では、保持部６０が収容部５０によって第２の位置に位置決めされている状態で媒質溶液を分注したが、媒質溶液は、収容部５０から保持部６０から取り外した状態で行われてもよい。その場合、ステップＳ１２までに保持部６０を収容部５０に挿入することで、保持部６０が収容部５０によって第２の位置に位置決めされればよい。
【0063】
また、本実施形態のステップＳ１４では、収容部５０に透明化溶液５４が満たされていない状態で収容部５０が保持部６０を位置決めし、その後、透明化溶液５４を分注する例を示したが、収容部５０に透明化溶液５４が満たされている状態で収容部５０が保持部６０を位置決めしてもよい。
【0064】
本実施形態では、媒質溶液をゲル化する方法で説明したが、媒質溶液として紫外線硬化型の樹脂溶液を用い、媒質溶液に紫外線を照射することで媒質溶液を固体化してもよい点は、第１の実施形態と同様である。媒質溶液を固体化することにより形成される固体は溶液に浸漬しても、ゲルの場合とは異なり、その溶液は固体内に浸み込まない。このため、紫外線硬化型の樹脂溶液を使用する場合には、予め、細胞凝集塊に対して蛍光染色などの処理を施しておくことが望ましい。
【0065】
［第３の実施形態］
図１７は、本実施形態に係る観察容器３の構成を示した図である。観察容器３は、図１７に示すように、保持部２０を有さず、その代わりに、観察時に吸水性ポリマーＰが用いられる点が、観察容器１とは異なっている。吸水性ポリマーＰは、凹部を有し、凹部を上に向けた状態で収容部１０内に投入され、曲面１１上に配置される。吸水性ポリマーＰは、後述するように吸水によって膨張し、その結果、曲面１１上に透明な層を形成することで、保持部として機能する。即ち、観察容器３の保持部は、収容部１０に配置された吸水性ポリマーが吸水して膨張することによって形成される。
図１７は、本実施形態に係る観察容器３の構成を示した図である。観察容器３は、図１７に示すように、保持部２０を有さず、その代わりに、観察時に吸水性ポリマーＰが用いられる点が、観察容器１とは異なっている。吸水性ポリマーＰは、凹部を有し、凹部を上に向けた状態で収容部１０内に投入され、曲面１１上に配置される。吸水性ポリマーＰは、後述するように吸水によって膨張し、その結果、曲面１１上に透明な層を形成することで、保持部として機能する。即ち、観察容器３の保持部は、収容部１０に配置された吸水性ポリマーが吸水して膨張することによって形成される。
【0066】
図１８は、本実施形態に係る試料作製方法を説明するフローチャートである。図１９は、本実施形態に係る位置決め工程を説明するための図である。図２０は、本実施形態に係る透明化工程を説明するための図である。以下、図１８から図２０を参照しながら、観察容器３を用いた試料作製方法について説明する。
【0067】
まず、収容部１０内の吸水性ポリマーＰが吸水して膨張する（ステップＳ２１）。ここでは、培養液１３を、ピペット３０を用いて収容部１０に分注する。これにより、培養液１３を吸水した吸水性ポリマーＰが膨張し、中央に凹部を有する保持部Ｐ１が、凹部を鉛直上方に向けた状態で曲面１１上に形成される。保持部Ｐ１は、吸水性ポリマーＰとおよそ相似形であるが、重力の作用によって曲面１１に隙間なく接触するように変形している。ステップＳ２１では、収容部１０に対する保持部Ｐ１の位置が確定する。このため、この工程は、保持部Ｐ１が収容部１０によって第１の位置に位置決めされる工程と見做すことができる。
【0068】
次に、収容部１０に観察対象物を含む媒質溶液で保持部Ｐ１の凹部を覆い（ステップＳ２２）、観察対象物を凹部に保持する（ステップＳ２３）。なお、媒質溶液は、例えば、培養液１３であり、観察対象物は、培養液１３中に播種された細胞である。ここでは、吸水性ポリマーＰが吸水できる量を超える培養液１３を収容部１０に分注し、保持部Ｐ１上を培養液１３で満たす。このとき、培養液１３に細胞を播種することで、培養液１３より比重が大きい細胞が保持部Ｐ１の凹部に集まる。この状態で細胞を培養することで、図１９に示すように、凹部に細胞凝集塊ＣＡが形成され、凹部に細胞凝集塊ＣＡが保持される。
【0069】
なお、凹部の底面は、曲面１１の曲率中心またはその近傍である。収容部１０と保持部Ｐ１は、保持部Ｐ１が収容部１０によって位置決めされた第１の状態で曲面１１の曲率中心近傍に凹部の底面が位置するように、予め設計されている。即ち、凹部の底面は上述した第１の実施形態及び第２の実施形態における設定位置に相当する。
【0070】
最後に、細胞凝集塊ＣＡの固定化、蛍光染色、及び透明化を行う（ステップＳ２４）。ここでは、まず、培養液１３を抜き取って、その後、図２０に示すように、固定化、蛍光染色、及び透明化に用いられる溶液１４をピペット３０によって収容部１０に分注する。これにより、溶液１４が保持部Ｐ１に浸透する。さらに、細胞凝集塊ＣＡが固定化され、蛍光色素で染色されるとともに、細胞凝集塊ＣＡが透明化される。以上により、収容部１０内において媒質（溶液１４が浸透した保持部Ｐ２、溶液１４、細胞凝集塊ＣＡ２）の屈折率がほぼ均一な試料が完成する。
【0071】
図２１は、本実施形態に係る観察容器３を用いた観察方法を説明するための図である。図１８に示す手順で作製された試料を用いて細胞凝集塊ＣＡ２を観察する場合、倒立顕微鏡が用いられる。具体的な観察手順は、第１の実施形態及び第２の実施形態と同様である。図２１に示すように、対物レンズＯＢと観察容器３との間を浸液ＩＭで満たした状態で、設定位置（凹部）に保持された細胞凝集塊ＣＡ２からの光を、曲面１１を経由して対物レンズＯＢに取り込むことで、曲面１１を経由して細胞凝集塊ＣＡ２を観察する。
【0072】
本実施形態においても、第１及び第２の実施形態と同様の理由により、屈折率ミスマッチに起因する観察装置（倒立顕微鏡）の光学性能の劣化を抑制することができる。従って、本実施形態に係る観察容器３及び試料作製方法によっても、観察装置の性能を十分に発揮することが可能であり、高い解像度の画像を短時間で取得することが可能となる。また、屈折率ミスマッチに起因する球面収差を小さく抑えることができるため、浸液ＩＭを自由に選択することができる点も、第１及び第２の実施形態と同様である。従って、本実施形態に係る観察容器３及び試料作製方法も、作業の自動化に好適であり、創薬スクリーニングのような大量の試料を検査する用途に利用することで、高いスループットを実現することができる。
【0073】
［第４の実施形態］
図２２は、本実施形態に係る観察容器４を用いた観察方法を説明するための図である。観察容器４は、吸水性ポリマーＰが膨張した保持部Ｐ２の代わりに、観察対象物を保持する凹部が形成されたシリコーンゴムＳＬを含んでいる点が、観察容器３とは異なっている。シリコーンゴムＳＬは、図２２に示すように、凹部を鉛直上方に向けた状態で曲面１１上に配置される。なお、シリコーンゴムＳＬの屈折率は、約１．４１であり、同等の屈折率を有する透明化溶液が存在する。このため、溶液１４にシリコーンゴムＳＬと同様の屈折率を有する溶液を用いることで、シリコーンゴムＳＬと溶液１４の間での屈折を回避することができる。
図２２は、本実施形態に係る観察容器４を用いた観察方法を説明するための図である。観察容器４は、吸水性ポリマーＰが膨張した保持部Ｐ２の代わりに、観察対象物を保持する凹部が形成されたシリコーンゴムＳＬを含んでいる点が、観察容器３とは異なっている。シリコーンゴムＳＬは、図２２に示すように、凹部を鉛直上方に向けた状態で曲面１１上に配置される。なお、シリコーンゴムＳＬの屈折率は、約１．４１であり、同等の屈折率を有する透明化溶液が存在する。このため、溶液１４にシリコーンゴムＳＬと同様の屈折率を有する溶液を用いることで、シリコーンゴムＳＬと溶液１４の間での屈折を回避することができる。
【0074】
本実施形態に係る観察容器４及び試料作製方法によっても、第３の実施形態に係る観察容器３及び試料作製方法と同様の効果を得ることができる。
【0075】
［第５の実施形態］
図２３は、本実施形態に係る観察容器５の構成を示した図である。図２４は、収容部８０の形状を説明するための図である。図２３に示す観察容器５は、収容部１０の代わりに収容部８０を含む点が、観察容器１とは異なる。観察容器５は、その他の点については、観察容器１と同様である。
図２３は、本実施形態に係る観察容器５の構成を示した図である。図２４は、収容部８０の形状を説明するための図である。図２３に示す観察容器５は、収容部１０の代わりに収容部８０を含む点が、観察容器１とは異なる。観察容器５は、その他の点については、観察容器１と同様である。
【0076】
収容部８０は、少なくとも一部が透明な曲面（曲面８１）からなる点は、観察容器１の収容部１０と同様である。収容部８０は、図２３及び図２４に示すように、少なくとも一部が透明な平面（平面８２）からなる点が、収容部１０とは異なっている。なお、図２４は、図２３に示す線ＳＳにおける断面図である。
【0077】
曲面８１と平面８２はいずれもほぼ均一な厚さを有する。また、平面８２は、観察容器５を使用するときに鉛直方向と平行な平面である。また、平面８２は、平面８２に対して直交する方向から入射するライトシートを保持部２０によって保持された細胞凝集塊ＣＡ２に照射することができる位置に、形成されている。さらに、平面８２は、平面８２と平行で且つ設定位置を含む面が曲面８１と交わるように、形成されている。
【0078】
【0079】
図２５は、本実施形態に係る観察容器５を用いた観察方法を説明するための図である。観察容器５を用いて細胞凝集塊ＣＡ２を観察する場合、ライトシート顕微鏡が用いられる。具体的には、図２５に示すように、ライトシート顕微鏡の観察用の対物レンズＯＢと観察容器５の曲面８１との間を浸液ＩＭで満たした状態で、照明用の対物レンズＯＢ１から平面８２を経由して細胞凝集塊ＣＡ２にライトシートを照射する。そして、細胞凝集塊ＣＡ２から発生した蛍光を、曲面８１を経由して対物レンズＯＢが取り込むことで、細胞凝集塊ＣＡ２を観察する。なお、観察用の対物レンズＯＢの光軸ＡＸは、鉛直方向に向けられていて、照明用の対物レンズＯＢ１の光軸ＡＸ１に直交している。
【0080】
本実施形態においても、第１から第４の実施形態と同様の理由により、屈折率ミスマッチに起因する観察装置（倒立顕微鏡）の光学性能の劣化を抑制することができる。従って、本実施形態に係る観察容器５及び試料作製方法によっても、観察装置の性能を十分に発揮することが可能であり、高い解像度の画像を取得することが可能となる。また、球面収差を抑制することができるため、球面収差に敏感な高い開口数を有する対物レンズを使用して効率よく光を集めることが可能であり、短時間で画像を得ることができる。また、屈折率ミスマッチに起因する球面収差を小さく抑えることができるため、浸液ＩＭを自由に選択することができる点も、第１から第４の実施形態と同様である。従って、本実施形態に係る観察容器５及び試料作製方法も、作業の自動化に好適であり、創薬スクリーニングのような大量の試料を検査する用途に利用することで、高いスループットを実現することができる。
【0081】
また、本実施形態では、収容部８０に平面８２が形成されている。平面８２からライトシートを入射させることで、ライトシートを構成する光線の集光位置であって照明光の進行方向の集光位置が幅方向で異なるのを避けることができる。このため、収容部８０を経由して細胞凝集塊ＣＡ２を照明することによる照明性能の劣化を抑制することができる。
【0082】
［第６の実施形態］
図２６は、本実施形態に係る観察容器６を用いた観察方法を説明するための図である。図２６に示す観察容器６は、収容部８０の代わりに収容部９０を含む点が、観察容器５とは異なる。観察容器６は、その他の点については、観察容器５と同様である。
図２６は、本実施形態に係る観察容器６を用いた観察方法を説明するための図である。図２６に示す観察容器６は、収容部８０の代わりに収容部９０を含む点が、観察容器５とは異なる。観察容器６は、その他の点については、観察容器５と同様である。
【0083】
収容部９０は、少なくとも一部が透明な曲面（曲面９１）からなり、且つ、少なくとも一部が透明な平面（平面９２）からなる点は、観察容器５の収容部８０と同様である。収容部８０では、水平方向からライトシートの入射を想定して平面８２が形成されているのに対して、収容部９０では、図２６に示すように、斜め下からのライトシートの入射を想定して、平面９２が鉛直方向に対して傾斜するように形成されている点が、収容部８０とは異なっている。ただし、平面９２が平面９２と平行で且つ設定位置を含む面が曲面９１と交わるように形成されている点については、収容部８０と同様である。
【0084】
観察容器６を用いて細胞凝集塊ＣＡ２を観察する場合、第５の実施形態と同様に、ライトシート顕微鏡が用いられる。具体的には、図２６に示すように、照明用の対物レンズＯＢ１から平面９２を経由して細胞凝集塊ＣＡ２にライトシートを照射する。そして、細胞凝集塊ＣＡ２から発生した蛍光を、曲面９１を経由して対物レンズＯＢが取り込むことで、細胞凝集塊ＣＡ２を観察する。平面９２の向きに合わせて対物レンズＯＢ１の光軸ＡＸ１の向きと対物レンズＯＢの光軸ＡＸの向きが調整されている点を除き、第５の実施形態と同様である。具体的には、例えば、光軸ＡＸ１は水平方向と３０°の角度を成し、光軸ＡＸは水平方向と６０°の角度を成している。
【0085】
本実施形態に係る観察容器６及び試料作製方法によっても、第５の実施形態に係る観察容器５及び試料作製方法と同様の効果を得ることができる。
【0086】
［第７の実施形態］
図２７は、本実施形態に係る観察容器７を用いた観察方法を説明するための図である。図２７に示す観察容器７は、マルチウェルプレートであり、それぞれが第６の実施形態に係る観察容器６に相当する複数の要素（要素Ｅ１、要素Ｅ２、要素Ｅ３、・・・）を含む点が、観察容器６とは異なる。即ち、各要素は、それぞれ、保持部２０と収容部９０を含んでいる。観察容器７は、その他の点については、観察容器６と同様である。なお、複数の要素は、一次元または二次元に配列されている。
図２７は、本実施形態に係る観察容器７を用いた観察方法を説明するための図である。図２７に示す観察容器７は、マルチウェルプレートであり、それぞれが第６の実施形態に係る観察容器６に相当する複数の要素（要素Ｅ１、要素Ｅ２、要素Ｅ３、・・・）を含む点が、観察容器６とは異なる。即ち、各要素は、それぞれ、保持部２０と収容部９０を含んでいる。観察容器７は、その他の点については、観察容器６と同様である。なお、複数の要素は、一次元または二次元に配列されている。
【0087】
観察容器７を用いて細胞凝集塊ＣＡ２を観察する場合、第６の実施形態と同様に、ライトシート顕微鏡が用いられる。ライトシート顕微鏡の観察用の対物レンズＯＢには、図２７に示すように、浸液ホルダ１００が装着されている。図示しない給水装置によって浸液ホルダ１００に浸液ＩＭである水が供給されることで、浸液ホルダ１００に水が蓄えられる。これにより、観察用の対物レンズＯＢと観察容器７の曲面９１との間も水で満たされる。また、浸液ホルダ１００には、窓１０１が設けられている。窓１０１は、平面９２と略平行な透明な平板からなる。照明用の対物レンズＯＢ１から出射した光は、窓１０１及び平面９２を経由して観察容器７内に入射してライトシートを形成し、細胞凝集塊ＣＡ２に照射される。細胞凝集塊ＣＡ２から発生した蛍光を、曲面９１を経由して対物レンズＯＢが取り込むことで、細胞凝集塊ＣＡ２を観察することができる。
【0088】
本実施形態に係る観察容器７及び試料作製方法によっても、第６の実施形態に係る観察容器６及び試料作製方法と同様の効果を得ることができる。また、一般に、ライトシート顕微鏡でマルチウェルプレートを用いる場合、ウェルが整列している水平方向からライトシートを入射させることは困難である。しかしながら、水平方向に対して傾斜した方向からライトシートを入射させると、第５の実施形態に係る観察容器５のように水平方向からのライトシートの入射を想定して設計された観察容器では、ライトシートが観察容器で屈折してしまう。これに対して、本実施形態に係る観察容器７では、マルチウェルプレートを構成する各要素が予め斜め下方からのライトシートの入射を想定して設計されている。このため、ライトシートは屈折することなく、平面９２を経由してライトシートの幅方向で照明光の進行方向の集光位置が異なることなく照明できるので、良好な観察を行うことができる。従って、マルチウェルプレートである観察容器７を図示しない搬送装置で搬送し、観察容器７の各要素を順番に光軸（光軸ＡＸ、光軸ＡＸ１）上に配置して、ライトシート顕微鏡を用いて観察対象物を観察することができる。これにより、大量の観察対象物を効率よく観察することができる。
【0089】
上述した実施形態は、発明の理解を容易にするための具体例を示したものであり、本発明の実施形態はこれらに限定されるものではない。観察容器、試料作製方法、及び、観察方法は、特許請求の範囲の記載を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
【0090】
上述した実施形態では、少なくとも一部に平面を含むライトシート顕微鏡用の観察容器が、ハンギングドロップを形成する保持部２０を含む例を示したが、保持部の構成は、これらの例に限らない。少なくとも一部に平面を含むライトシート顕微鏡用の観察容器は、観察容器２のように、収容部を型として利用し、剥離部として機能する保持部を含んでもよく、上記の平面が型の一部を構成してもよい。
【符号の説明】
【0091】
１、２、３、４、５、６、７・・・観察容器、１０、５０、８０、９０・・・収容部、１１、５１、８１、９１・・・曲面、２０、６０、Ｐ１・・・保持部、２２・・・ハンギングドロップ形成部、５２、５３・・・係止部、６２・・・係合部、６３・・・アーム部、６４・・・把持部、７０・・・Ｏリング、８２、９２・・・平面、１００・・・浸液ホルダ、１０１・・・窓、ＣＡ、ＣＡ２・・・細胞凝集塊、Ｄ・・・ハンギングドロップ、Ｄ１、Ｄ２、ＭＳ１、ＭＳ２・・・ゲル、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３・・・要素、ＩＭ・・・浸液、Ｐ・・・吸水性ポリマー、ＯＢ、ＯＢ１・・・対物レンズ、ＳＬ・・・シリコーンゴム
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】