(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-11
(45)【発行日】2023-10-19
(54)【発明の名称】感染症治療用ラクトフェリシン及びラクトフェランピン
(51)【国際特許分類】
A61K 38/40 20060101AFI20231012BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231012BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20231012BHJP
A61P 31/10 20060101ALI20231012BHJP
A23L 33/17 20160101ALI20231012BHJP
A23K 20/147 20160101ALI20231012BHJP
【ＦＩ】
A61K38/40
A61P43/00 121
A61P31/04
A61P31/10
A23L33/17 ZNA
A23K20/147
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2020503691
(86)(22)【出願日】2018-07-24
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-09-24
(86)【国際出願番号】 IB2018055496
(87)【国際公開番号】W WO2019021175
(87)【国際公開日】2019-01-31
【審査請求日】2021-07-20
(31)【優先権主張番号】102017000085409
(32)【優先日】2017-07-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】520023514
【氏名又は名称】ビイチティ エッセ エッレ エッレ
(74)【代理人】
【識別番号】110001416
【氏名又は名称】弁理士法人信栄事務所
(72)【発明者】
【氏名】ラパシオリ，シルビア
(72)【発明者】
【氏名】ヴェルガ，ロベルト
(72)【発明者】
【氏名】マゼイ，エマ
(72)【発明者】
【氏名】ズッキナーリ，ステファノ
【審査官】伊藤 基章
(56)【参考文献】
【文献】XU, G. et al.，J Appl Microbiol，2010年，Vol. 109、No. 4，pp. 1311-1318
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００
Ａ６１Ｋ ３６／００
Ａ２３Ｌ ３３／００
Ａ２３Ｋ ２０／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
病原体に起因する感染症の治療用組成物であって、ラクトフェリシン及びラクトフェランピンを含み、ラクトフェリシンがラクトフェランピンよりも少ないモル量で含まれる、病原体に起因する感染症の治療用組成物。
【請求項2】
ラクトフェリシンとラクトフェランピンの重量比が少なくとも１：１．５である、請求項１に記載の病原体に起因する感染症の治療用組成物。
【請求項3】
ラクトフェリシンとラクトフェランピンの重量比が１：１００以下である、請求項１又は２に記載の病原体に起因する感染症の治療用組成物。
【請求項4】
ラクトフェリシンとラクトフェランピンの重量比が１：２～１：５０である、請求項３に記載の病原体に起因する感染症の治療用組成物。
【請求項5】
組成物重量に基づいて、０．０１重量％～１重量％のラクトフェリシン及び０．０２重量％～１０重量％のラクトフェランピンを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の病原体に起因する感染症の治療用組成物。
【請求項6】
ラクトフェリシン及びラクトフェランピンを含み、ラクトフェリシンがラクトフェランピンよりも少ないモル量で含まれる、ヒト又は動物の摂食用の製品におけるプレバイオティクス剤。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか１項に記載の病原体に起因する感染症の治療用組成物及び少なくとも植物抽出物を含む、病原体に起因する感染症の治療用製剤。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載の病原体に起因する感染症の治療用組成物及び少なくとも１つのさらなる天然抗菌ペプチドを含む、病原体に起因する感染症の治療用製剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細菌、真菌又は酵母等の病原体に起因する感染症の治療用組成物に関する。特に、本発明の組成物は、２つのペプチド、すなわちラクトフェリシン及びラクトフェランピンの相乗的関連性を有し、前記病原体に対して有意に活性であることが示されている。
【背景技術】
【0002】
抗生物質耐性は、現在世界中で認識され広まっている現象である。
【0003】
薬剤耐性の発達は、通常の進化過程である。通常、特定の薬剤に感受性の強い微生物のコロニー内には、自然に耐性のある微生物がいくつか存在する。この現象は「初期非感受性（ｐｒｉｍａｒｙ ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）」として知られている。抗生物質が感受性の強い細菌を破壊した場合、その瞬間まで休眠状態にあったその薬剤に非感受性の細菌が増殖し始める。又は、細菌の遺伝物質中の変異の結果として、もしくは細菌間の耐性を付与する遺伝子の交換において、耐性が発生することがある。
【0004】
この現象は自然の過程によるが、抗生物質の誤った使用により加速され、さらに悪化する。耐性に寄与する主な要因の１つは、集約農場の過密環境内で成長を促進し、病気を予防するために、低用量の抗生物質で家畜を治療するという慣行である。この慣行は２００６年以降ヨーロッパでは禁止されているが、現在米国で使用されている抗生物質の約８０％は動物に使用されている。
【0005】
最も有害と考えられる慣行の１つは、それらが全く役に立たない場合に、抗生物質を使用してウイルス感染症を治療する習慣である。抗生物質を服用するときに、例えば低用量での服用又は推奨される時間とは異なる時間での服用など、指示に従わなかったとしても、耐性の発生に役立つと考えられている。近年非難されている別の慣行は、多くの病院で遭遇する、予防目的で一連の抗生物質を処方する傾向である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって本発明の目的は、耐性現象を引き起こすことなく、細菌、真菌又は酵母に起因する感染症を効果的に治療することができる、抗生物質の使用に代わる解決策を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記目的は、請求項１に記載されているラクトフェリシン及びラクトフェランピンを含む組成物によって達成された。
【0008】
さらなる態様において、本発明は、病原体に起因する感染症の治療のための前記組成物の使用に関する。
【0009】
さらなる態様において、本発明は、ヒトの食物又は動物の飼料用の製品におけるプレバイオティクス剤としての前記組成物の使用に関する。
【0010】
さらなる態様において、本発明は、前記組成物及び少なくとも１つの植物抽出物を含む製剤に関する。
【0011】
さらなる態様において、本発明は、前記組成物及び少なくとも１つの別の天然抗菌ペプチドを含む製剤に関する。
【0012】
本発明の特徴及び利点は、非限定的な例として提供される以下の詳細な説明及び実施形態から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【0013】
［発明の詳細な説明］
したがって、本発明は、ラクトフェリシン及びラクトフェランピンを含む組成物であって、ラクトフェリシンがラクトフェランピンよりも少ない量で含まれる組成物に関する。
したがって、本発明は、ラクトフェリシン及びラクトフェランピンを含む組成物であって、ラクトフェリシンがラクトフェランピンよりも少ない量で含まれる組成物に関する。
【0014】
ラクトフェリシンは、ラクトフェリンペプシンが媒介する消化により生成されるカチオン性ペプチドである。完全なラクトフェリシンの配列は、ラクトフェリンのフラグメント１７～４１（ＦＫＣＲＲＷＱＷＲＭ ＫＫＬＧＡＰＳＩＴＣＶＲＲＡＦ；ＬＦＢ００８４）に対応している。ヒトでは、ラクトフェリシンはラクトフェリンのフラグメント１～４７に対応するが、ジスルフィド架橋で結合した２つのサブユニット（すなわち、フラグメント１～１１及び１２～４７）で構成されている。
【0015】
ラクトフェランピンは、高い正電荷と疎水性ドメインを特徴とするカチオン性ペプチドであり、したがって両親媒性の特性を有する。それは、２６８～２８４残基を含み、ラクトフェリシンに近接したラクトフェリンのＮ１ドメインに位置している。
【0016】
ラクトフェランピンとラクトフェリシンは両者とも両親媒性とカチオン性の特性を有するが、アミノ酸組成が異なり、したがって構造も異なるため、抗菌活性は相当に異なる。
【0017】
「よりも少ない量」なる用語は、ラクトフェリシンがラクトフェランピンよりも低いモル量であることを意味する。「モル」とは、国際単位（ＩＳ）に基づく物質の量の測定単位である。化学物質の１モルには、６．０２２１４０７６×１０２３の構成粒子が含まれている。構成粒子は、原子、分子、イオン、電子又はその他の物理的粒子である。
【0018】
驚くべきことに、ラクトフェリシンがラクトフェランピンよりも少ない量で存在する組成物において、以下に提供される実施例に見られるように、有意な抗菌相乗効果が達成されることが見出された。
【0019】
したがって、本発明の組成物では、ラクトフェリシンとラクトフェランピンは少なくとも１：１．５の重量比である。
【0020】
最も好ましくは、ラクトフェリシンとラクトフェランピンの重量比は１：１００以下である。
【0021】
好ましい実施形態では、ラクトフェリシンとラクトフェランピンの重量比は１：２～１：５０である。
【0022】
さらなる実施形態において、ラクトフェリシンとラクトフェランピンの重量比は１：１．５～１：５０、好ましくは１：１．５～１：２０、より好ましくは１：１．５～１：１０である。
【0023】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、組成物重量に基づいて、０．０００５重量％～１５重量％のラクトフェリシンとラクトフェランピンを含む。好ましくは、本発明の組成物は、０．００５重量％～５重量％のラクトフェリシンとラクトフェランピンを含む。より好ましくは、本発明の組成物は、０．０１重量％～１重量％のラクトフェリシンとラクトフェランピンを含む。
【0024】
特に好ましい実施形態では、本発明の組成物は、０．０１重量％～１重量％のラクトフェリシン及び０．０２重量％～１０重量％のラクトフェランピンを含む。さらにより好ましいのは、本発明の組成物が０．０３重量％～０．１重量％のラクトフェリシン及び１重量％～８重量％のラクトフェランピンを含む実施形態である。
【0025】
特定の実施形態において、ラクトフェリンの酵素加水分解、好ましくは固定化酵素を使用する酵素加水分解によりラクトフェリシンとラクトフェランピンが得られる。そのため、ラクトフェリシンを含むラクトフェリン加水分解物及びラクトフェランピンを含むラクトフェリン加水分解物がそれぞれ得られる。
【0026】
適切な酵素は、問題となっているタンパク質（この場合はラクトフェリン）の２つの連続したアミノ酸の間のペプチド結合の切断を触媒する加水分解酵素の分類に属する。これらの酵素は、存在する種々のアミノ酸に対して異なる選択性を示すため、個々のアミノ酸成分のタンパク質の完全な分解は行われず、使用される加水分解酵素が認識するアミノ酸の位置に応じて様々な長さのペプチド断片が生成される。加水分解に使用される酵素は生成物中の不純物に相当する可能性があるため、当該プロセスは前記酵素の不活性基質への共有結合による固定化に基づくことが好ましい。固定化は、物理的方法（例えば、ろ過）を使用することにより反応の終了時に生体触媒の除去を可能にし、したがって、遊離酵素の不活性化に必要であるが製品の活性に悪影響を及ぼすｐＨの変化と温度の上昇を阻止する。
【0027】
好ましい酵素はプロテアーゼであり、特に、好ましくはペプシン、クロストリパイン、プロテアーゼＸＶＩＩ型、ＡＳＰ－Ｎエンドペプチダーゼ、ＡＲＧ－Ｃプロテイナーゼ、グルタミルエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼ、トリプシン、サーモリシン、サブチリシン、キモトリプシン及びそれらの混合物を含むエンドプロテアーゼである。
【0028】
好ましい実施形態では、前記酵素は、豚肉のペプシン、クロストリパイン、プロテアーゼＸＶＩＩ型、ＡＳＰ－Ｎエンドプロテアーゼ、ＡＲＧ－Ｃエンドプロテアーゼ又はそれらの混合物である。
【0029】
好ましくは、酵素加水分解が実施されるｐＨは３以下であり、より好ましくは約２である。
【0030】
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。「賦形剤」なる用語は、細菌、真菌又は酵母に起因する感染症の治療用製剤における使用に適した化合物又はその混合物をいう。例えば、医薬製剤に使用する賦形剤は、一般に患者に有害反応を引き起こすべきではなく、組成物の有効性を著しく阻害すべきでもない。
【0031】
適切な賦形剤には、酸性化剤、ｐＨ調整剤、固化防止剤、抗酸化剤、増量剤、耐性剤、ゲル化剤、コーティング剤、加工デンプン、金属イオン封鎖剤、増粘剤、甘味料、希釈剤、凝集阻害剤（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、着色剤、バインダー、潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｎｔ）、安定剤、吸着剤、防腐剤、保湿剤、香料、フィルム化剤（ｆｉｌｍｏｇｅｎｉｃ ａｇｅｎｔ）、乳化剤、湿潤剤、放出阻害剤（ｒｅｌｅａｓｅ ｒｅｔａｒｄａｎｔ）及びそれらの混合物が含まれる。
【0032】
賦形剤の添加は、当該分野で公知の方法を使用することにより実施することができる。実際、例えば成分はそのまま混合することもできるし、１もしくは複数の賦形剤（ソフトゲルカプセルに密封された賦形剤又は錠剤、ミニタブレット、マイクロタブレット、顆粒、マイクロ顆粒、ペレット、多粒子（ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ）、微粒子化された粒子、粉末等の固体形態の賦形剤又は溶液、エマルジョン、ゲル、バイアル、ドロップもしくはスプレーの形態の賦形剤）と混合することもできる。
【0033】
本発明の組成物は、経口、経鼻、鼻腔内、舌下、口腔内、筋肉内、静脈内、経皮、皮下、外用、内用、直腸又は眼経路（ｏｃｕｌａｒ ｒｏｕｔｅ）を介して投与することができる。
【0034】
さらなる態様では、本発明は、細菌、真菌又は酵母等の病原体に起因する感染症の治療のための上記組成物の使用に関する。
【0035】
「治療」なる用語は、本発明の組成物の効果を指し、例えば、患者の容態の改善又は疾患の進行の遅延など、感染症を患う患者に利益をもたらすことができる。本明細書では、「感染」なる用語又はその同義語である「感染性病理」は、別の宿主生物内又は別の宿主生物上への微生物の侵入、定着及び／又は増殖を意味する。「感染症」なる用語は、病原体、例えば細菌、寄生虫、原虫、ウイルス又は酵母を含む真菌に起因する感染性の疾病をいう。
【0036】
病原細菌は、下記の細菌種の１つに由来することができる：ブドウ球菌属、例えば黄色ブドウ球菌（例えば黄色ブドウ球菌 ＡＴＣＣ ２５９２３）又はＳ．インターメディウス ＡＴＣＣ ２９６６３、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌；プロピオニバクテリウム・アクネス；ポルフィロモナス・ジンジバリス；腸球菌属、例えばエンテロコッカス・フェカリス ＡＴＣＣ ２９２１２；シュードモナス属、例えば緑膿菌 ＡＴＣＣ ２７８５３；マイコバクテリウム属、例えば結核菌；エンテロバクター属；カンピロバクター属；サルモネラ属（例えばサルモネラ・エンテリティディス ＡＴＣＣ １３０７６）；ストレプトコッカス属、例えばＡ群もしくはＢ群連鎖球菌、肺炎連鎖球菌；ヘリコバクター属、例えばヘリコバクター・ピロリ；ナイセリア属、例えば淋菌、髄膜炎菌；ボレリア・ブルグドルフェリ；赤痢菌属、例えば赤痢菌；大腸菌（ＡＴＣＣ ２５９２２）；ヘモフィルス属、例えばインフルエンザ菌；フランシセラ・ツラレンシス；バチルス属、例えば炭疽菌；クロストリジウム属、ボツリヌス菌；エルシニア属、例えばペスト菌；トレポネマ属；バークホルデリア属、例えばバークホルデリア・セパシア ＡＴＣＣ １７７５９、Ｂ．マレイ及びＢ．シュードマレー；ステノトロフォモナス属、例えばステノトロフォモナス・マルトフィリア ＡＴＣＣ １３６３７。
【0037】
真菌病原体は、下記の真菌種（酵母を含む）の１つに由来することができる：カンジダ属（例えばＣ．アルビカンス）；表皮菌属；エキソフィラ属；ミクロスポラム属；トリコフィトン属（例えば、紅色白癬菌及びＴ．インテルジキターレ）；白癬属；アスペルギルス属；ブラストミセス属；ブラストシゾミセス属；コクシジオイデス属；クリプトコッカス属（例えば、クリプトコッカス・ネオフォルマンス）；ヒストプラズマ属；パラコクシジオミセス属；スポロトリクス属；アブシディア属；クラドフィアロフォラ属；フォンセケア属；フィアロフォラ属；ラカジア属；アルスログラフィス属；アクレモニウム属；アクティノマドゥラ属；アポフィソミセス属；エモンシア属；バシディオボラス属；ボーベリア属；クリソスポリウム属；コニディオボラス属；カニングハメラ属；フザリウム属；ゲオトリクム属；グラフィウム属；レプトスフェリア属；マラセジア属（例えばマラセジア・フルフル又はＭ．パキデルマティス ＤＳＭ ６１７２）；ムコール属；ネオテスツジナ属；ノカルジア属；ノカルディオプシス属；パエシロマイセス属；フォーマ属；ピエドライア属；プネウモキスチス属；シュードアレシェリア属；ピレノケータ属；リゾムコール属；リゾプス属；ロドトルラ属；サッカロミセス属；スケドスポリウム属；スコプラリオプシス属；スポロボロミセス属；ハリサシカビモドキ属；トリコデルマ属；トリコスポロン属；ウロクラジウム属；ウスティラゴ属；バーティシリウム属；ワンギエラ属。
【0038】
好ましくは、治療は、シュードモナス属、エスケリキア属、ブドウ球菌属、カンジダ属及びマラセジア属から選択される病原体に対するものである。
【0039】
以下の実施例に見られるように、本発明の組成物は、上記のラクトフェリシンとラクトフェランピンの関連性により、前記病原体に対して驚くべき相乗効果を示した。
【0040】
さらなる態様において、本発明は、ヒト又は動物の摂食用の製品におけるプレバイオティクス剤としての前記組成物の使用に関する。実際、本発明の組成物は、上記の病原体に対して相乗的に有効であるだけでなく、一般的に使用されるプレバイオティクス、すなわちＦＯＳ（フルクトオリゴ糖）やＧＯＳ（ガラクトオリゴ糖）について得られるものよりも高いプレバイオティクス指数を有することが予想外に発見された。実際、当該組成物は、有益なプロバイオティクス細菌（Ｅ．フェシウム、Ｌ．プランタルム、Ｌ．ラムノサスを含む）の増殖とその代謝活性をもたらし、同時に腐敗性微生物又は上記のような潜在的病原性微生物の減少をもたらす。
【0041】
プレバイオティクス指数は、下記式を使用して計算した。
【0042】
【数1】
【0043】
結果として、指数が高いほど、試験された化合物のプレバイオティクス特性が大きくなる。
【0044】
以下の実施例において、本発明の組成物のプレバイオティクス特性は、ＦＯＳのそれと比較して示されている。
【0045】
本発明は、本明細書に記載の組成物及び適切な食品グレードの成分を含む食品又は飼料製品に関する。
【0046】
さらなる態様において、本発明は、前記組成物及び少なくとも１つの植物抽出物を含む製剤に関する。
【0047】
好ましい植物抽出物は、クマコケモモ、緑茶、クランベリー、ブルーベリー、ユーカリ、マンサク、大豆及びそれらの混合物の抽出物である。
【0048】
驚くべきことに、本発明の組成物は、少なくとも１つの植物抽出物と混合すると、さらなる相乗効果を示すことが観察された。
【0049】
さらなる態様において、本発明は、前記組成物と少なくとも１つの別の天然抗菌ペプチドとを含む製剤に関する。
【0050】
好ましくは、前記天然抗菌ペプチドは、ナイシン、ベータデフェンシン、ＬＬ－３７、テンポリンＡ、テンポリンＢ、テンポリンＬ、インドリシジン、メリチン、プロテグリン－１、プロテグリン－２、プロテグリン－３、プロテグリン－４、プロテグリン－５、マガイニン２、ＲＴＤ－１、ＲＴＤ－２、ＲＴＤ－３、ＲＴＤ－４、ＲＴＤ－５、アレニシン－１、アレニシン－２、アレニシン－３、ダームシジン、セクロピン、アンドロピン、モリシン、セラトトキシン、デルマセプチン、ボンビニンであり、好ましくはマキシミンＨ１、マキシミンＨ２、マキシミンＨ３、マキシミンＨ４又はマキシミンＨ５、エスクレンチン、ラナレキシン、ブフォリンＩＩ、ヒトＣＡＰ１８、アバエシン、アピダエシン、プロフェニン、バクテネシン、ブレビニン－１、ブレビニン－２、タチプレシン、ドロソマイシン又はそれらの混合物である。
【0051】
好ましい実施形態では、前記天然抗菌ペプチドはナイシンである。
【0052】
実際、本発明の組成物は、少なくとも１つの別の天然抗菌ペプチドと混合されたとき、さらなる相乗効果を示すことが観察された。
【0053】
上記に報告したように、組成物の成分の好ましい態様の全ての可能な組み合わせは、本明細書に開示されているとみなされると理解されるべきである。
【0054】
組成物及びその成分にとって好ましく、有利であると特定された全ての態様は、その調製及び使用についても同様に好ましく、有利であるとみなされることも理解されるべきである。
【0055】
以下は、例示目的で提供される本発明の実施例である。
【実施例】
【0056】
実施例１
以下に、目的の組成物を含むラクトフェリン加水分解物の生産に使用される生体触媒を得るために実施できる酵素固定化の手順の実施例を示す。
以下に、目的の組成物を含むラクトフェリン加水分解物の生産に使用される生体触媒を得るために実施できる酵素固定化の手順の実施例を示す。
【0057】
ａ）酵素固定化＃１（塩酸）
１０ｍＭの濃度のＨＣｌ水溶液を作製する。
粉末にしたポークペプシンを２５ｍｇ／ｍＬの濃度で加え、完全に溶解するまで攪拌下に置く。
ｐＨを測定し、塩酸又は水酸化ナトリウムの水溶液を使用して２．００±０．２０に調整する。
酵素懸濁液に、エポキシ樹脂を２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、４時間攪拌する。
ＨＣｌ １０ｍＭ＋ＮａＣｌ １Ｍの等量溶液を用いて少なくとも３回洗浄する手段によって、未結合の酵素溶液を除去する。
最後の洗浄後、真空ポンプを使用して、樹脂に固定された酵素から液体画分を除去し、当該樹脂を４℃で保存する。
基質として２％（ｗ／ｖ）ヘモグロビンを用いる標準プロトコル（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｆ．（１９５６），Ｂｕｌｌ．Ａｇｒｉ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｊａｐａｎ ２０，２５２－２５６）を使用して、酵素活性を滴定する。
１０ｍＭの濃度のＨＣｌ水溶液を作製する。
粉末にしたポークペプシンを２５ｍｇ／ｍＬの濃度で加え、完全に溶解するまで攪拌下に置く。
ｐＨを測定し、塩酸又は水酸化ナトリウムの水溶液を使用して２．００±０．２０に調整する。
酵素懸濁液に、エポキシ樹脂を２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、４時間攪拌する。
ＨＣｌ １０ｍＭ＋ＮａＣｌ １Ｍの等量溶液を用いて少なくとも３回洗浄する手段によって、未結合の酵素溶液を除去する。
最後の洗浄後、真空ポンプを使用して、樹脂に固定された酵素から液体画分を除去し、当該樹脂を４℃で保存する。
基質として２％（ｗ／ｖ）ヘモグロビンを用いる標準プロトコル（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｆ．（１９５６），Ｂｕｌｌ．Ａｇｒｉ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｊａｐａｎ ２０，２５２－２５６）を使用して、酵素活性を滴定する。
【0058】
ｂ）酵素固定化＃２（リン酸）
１．２５％（ｖ／ｖ）の濃度の８５％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液を作製する。
粉末にしたポークペプシンを２５ｍｇ／ｍＬの濃度で加え、完全に溶解するまで攪拌下に置く。
ｐＨを測定し、リン酸又は水酸化カリウムの水溶液を使用して２．００±０．２０に調整する。
酵素懸濁液に、エポキシ樹脂を２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、４時間攪拌する。
１．２５％（ｖ／ｖ）リン酸＋ＮａＣｌ １Ｍの等量溶液を用いて少なくとも３回洗浄する手段によって、未結合の酵素溶液を除去する。
最後の洗浄後、真空ポンプを使用して、樹脂に固定された酵素から液体画分を除去し、当該樹脂を４℃で保存する。
基質として２％（ｗ／ｖ）ヘモグロビンを用いる標準プロトコル（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｆ．（１９５６），Ｂｕｌｌ．Ａｇｒｉ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｊａｐａｎ ２０，２５２－２５６）を使用して、酵素活性を滴定する。
１．２５％（ｖ／ｖ）の濃度の８５％（ｗ／ｗ）リン酸水溶液を作製する。
粉末にしたポークペプシンを２５ｍｇ／ｍＬの濃度で加え、完全に溶解するまで攪拌下に置く。
ｐＨを測定し、リン酸又は水酸化カリウムの水溶液を使用して２．００±０．２０に調整する。
酵素懸濁液に、エポキシ樹脂を２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、４時間攪拌する。
１．２５％（ｖ／ｖ）リン酸＋ＮａＣｌ １Ｍの等量溶液を用いて少なくとも３回洗浄する手段によって、未結合の酵素溶液を除去する。
最後の洗浄後、真空ポンプを使用して、樹脂に固定された酵素から液体画分を除去し、当該樹脂を４℃で保存する。
基質として２％（ｗ／ｖ）ヘモグロビンを用いる標準プロトコル（Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｆ．（１９５６），Ｂｕｌｌ．Ａｇｒｉ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ Ｊａｐａｎ ２０，２５２－２５６）を使用して、酵素活性を滴定する。
【0059】
実施例２
固定化酵素＃１（ＨＣｌ／グリシン）を使用したラクトフェリン加水分解プロセス
３ｇ／Ｌの濃度のグリシン水溶液を作製する。
溶液を攪拌し続けて、ラクトフェリン粉末を１３０ｇ／Ｌの濃度までゆっくりと加え、それが完全に溶解するまで待つ。
塩酸の水溶液を使用して、懸濁液のｐＨを２．１±０．１０に調整する。
固定化ペプシンを添加して、３２．５～６５Ｕ／ｍＬの濃度にする（標準２％（ｗ／ｗ）ヘモグロビン基質における滴定により測定）。
２時間以内に、２０～３０℃の温度で反応させ、液体画分（ラクトフェリンの加水分解物）を固体画分（使用済み固定化酵素）から効率的に分離する校正ふるいを使用して、固定化酵素を除去する。
ＨＰＬＣを用いて生成物の加水分解プロファイルを分析し、ラクトフェリシンの存在を測定する。
固定化酵素＃１（ＨＣｌ／グリシン）を使用したラクトフェリン加水分解プロセス
３ｇ／Ｌの濃度のグリシン水溶液を作製する。
溶液を攪拌し続けて、ラクトフェリン粉末を１３０ｇ／Ｌの濃度までゆっくりと加え、それが完全に溶解するまで待つ。
塩酸の水溶液を使用して、懸濁液のｐＨを２．１±０．１０に調整する。
固定化ペプシンを添加して、３２．５～６５Ｕ／ｍＬの濃度にする（標準２％（ｗ／ｗ）ヘモグロビン基質における滴定により測定）。
２時間以内に、２０～３０℃の温度で反応させ、液体画分（ラクトフェリンの加水分解物）を固体画分（使用済み固定化酵素）から効率的に分離する校正ふるいを使用して、固定化酵素を除去する。
ＨＰＬＣを用いて生成物の加水分解プロファイルを分析し、ラクトフェリシンの存在を測定する。
【0060】
実施例３
固定化酵素＃２（リン酸）を使用したラクトフェリン加水分解プロセス
１３０ｇ／Ｌの濃度のラクトフェリン水溶液を調製し、溶液を攪拌し続けて、それが完全に溶解するまで待つ。
８５％（ｗ／ｖ）リン酸水溶液を使用して、懸濁液のｐＨを２．１±０．１０に調整する。
固定化ペプシンを添加して、６５～１３０Ｕ／ｍＬの濃度にする（標準２％（ｗ／ｗ）ヘモグロビン基質における滴定により測定）。
２時間以内に、２０～３０℃の温度で反応させ、液体画分（ラクトフェリンの加水分解物）を固体画分（使用済み固定化酵素）から効率的に分離する校正ふるいを使用して、固定化酵素を除去する。
ＨＰＬＣを用いて生成物の加水分解プロファイルを分析し、ラクトフェリシンの存在を測定する。
固定化酵素＃２（リン酸）を使用したラクトフェリン加水分解プロセス
１３０ｇ／Ｌの濃度のラクトフェリン水溶液を調製し、溶液を攪拌し続けて、それが完全に溶解するまで待つ。
８５％（ｗ／ｖ）リン酸水溶液を使用して、懸濁液のｐＨを２．１±０．１０に調整する。
固定化ペプシンを添加して、６５～１３０Ｕ／ｍＬの濃度にする（標準２％（ｗ／ｗ）ヘモグロビン基質における滴定により測定）。
２時間以内に、２０～３０℃の温度で反応させ、液体画分（ラクトフェリンの加水分解物）を固体画分（使用済み固定化酵素）から効率的に分離する校正ふるいを使用して、固定化酵素を除去する。
ＨＰＬＣを用いて生成物の加水分解プロファイルを分析し、ラクトフェリシンの存在を測定する。
【0061】
実施例４
固定化酵素＃３（乳酸／リン酸）を使用したラクトフェリン加水分解プロセス
２％（ｖ／ｖ）の濃度の８０％（ｗ／ｗ）乳酸水溶液を作製する。
溶液を攪拌し続けて、ラクトフェリン粉末を１３０ｇ／Ｌの濃度までゆっくりと加え、それが完全に溶解するまで待つ。
８５％（ｗ／ｖ）リン酸水溶液を使用して、懸濁液のｐＨを２．１±０．１０に調整する。
固定化ペプシンを添加して、６５～１３０Ｕ／ｍＬの濃度にする（標準２％（ｗ／ｗ）ヘモグロビン基質における滴定により測定）。
２時間以内に、２０～３０℃の温度で反応させ、液体画分（ラクトフェリンの加水分解物）を固体画分（使用済み固定化酵素）から効率的に分離する校正ふるいを使用して、固定化酵素を除去する。
ＨＰＬＣを用いて生成物の加水分解プロファイルを分析し、ラクトフェリシンの存在を測定する。
固定化酵素＃３（乳酸／リン酸）を使用したラクトフェリン加水分解プロセス
２％（ｖ／ｖ）の濃度の８０％（ｗ／ｗ）乳酸水溶液を作製する。
溶液を攪拌し続けて、ラクトフェリン粉末を１３０ｇ／Ｌの濃度までゆっくりと加え、それが完全に溶解するまで待つ。
８５％（ｗ／ｖ）リン酸水溶液を使用して、懸濁液のｐＨを２．１±０．１０に調整する。
固定化ペプシンを添加して、６５～１３０Ｕ／ｍＬの濃度にする（標準２％（ｗ／ｗ）ヘモグロビン基質における滴定により測定）。
２時間以内に、２０～３０℃の温度で反応させ、液体画分（ラクトフェリンの加水分解物）を固体画分（使用済み固定化酵素）から効率的に分離する校正ふるいを使用して、固定化酵素を除去する。
ＨＰＬＣを用いて生成物の加水分解プロファイルを分析し、ラクトフェリシンの存在を測定する。
【0062】
実施例５
固定化酵素＃４（乳酸）を使用したラクトフェリン加水分解プロセス
１３０ｇ／Ｌの濃度のラクトフェリン水溶液を調製し、溶液を攪拌し続けて、それが完全に溶解するまで待つ。
８０％（ｗ／ｗ）乳酸を２％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加える。
固定化ペプシンを添加して、３２．５～６５Ｕ／ｍＬの濃度にする（標準２％（ｗ／ｗ）ヘモグロビン基質における滴定により測定）。
２０～３０℃の温度で２時間反応させた後、液体画分（ラクトフェリンの加水分解物）を固体画分（使用済み固定化酵素）から効率的に分離する校正ふるいを使用して、固定化酵素を除去する。
ＨＰＬＣを用いて生成物の加水分解プロファイルを分析し、ラクトフェリシンの存在を測定する。
固定化酵素＃４（乳酸）を使用したラクトフェリン加水分解プロセス
１３０ｇ／Ｌの濃度のラクトフェリン水溶液を調製し、溶液を攪拌し続けて、それが完全に溶解するまで待つ。
８０％（ｗ／ｗ）乳酸を２％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加える。
固定化ペプシンを添加して、３２．５～６５Ｕ／ｍＬの濃度にする（標準２％（ｗ／ｗ）ヘモグロビン基質における滴定により測定）。
２０～３０℃の温度で２時間反応させた後、液体画分（ラクトフェリンの加水分解物）を固体画分（使用済み固定化酵素）から効率的に分離する校正ふるいを使用して、固定化酵素を除去する。
ＨＰＬＣを用いて生成物の加水分解プロファイルを分析し、ラクトフェリシンの存在を測定する。
【0063】
実施例６
固定化酵素＃４を使用したラクトフェリン加水分解プロセス（ラクトフェランピンの生産用）
１３０ｇ／Ｌの濃度のラクトフェリン水溶液を調製し、溶液を攪拌し続けて、それが完全に溶解するまで待つ。
１０ｍＭ～１００ｍＭの濃度のトリス－Ｃｌ又は重炭酸アンモニウム緩衝液を使用して、溶液をｐＨ７．０～９．０に緩衝する。
固定化酵素＃４を使用したラクトフェリン加水分解プロセス（ラクトフェランピンの生産用）
１３０ｇ／Ｌの濃度のラクトフェリン水溶液を調製し、溶液を攪拌し続けて、それが完全に溶解するまで待つ。
１０ｍＭ～１００ｍＭの濃度のトリス－Ｃｌ又は重炭酸アンモニウム緩衝液を使用して、溶液をｐＨ７．０～９．０に緩衝する。
【0064】
０．０１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度で、以下の遊離又は固定化酵素のペアを添加する：
－クロストリパイン及びＸＶＩＩ型プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧＬＵ－Ｃ）；
－クロストリパイン及びエンドプロテアーゼＡＳＰ－Ｎ；
－エンドプロテイナーゼＡＲＧ－Ｃ及びＸＶＩＩ型プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧＬＵ－Ｃ）
－エンドプロテイナーゼＡＲＧ－Ｃ及びエンドプロテアーゼＡＳＰ－Ｎ。
－クロストリパイン及びＸＶＩＩ型プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧＬＵ－Ｃ）；
－クロストリパイン及びエンドプロテアーゼＡＳＰ－Ｎ；
－エンドプロテイナーゼＡＲＧ－Ｃ及びＸＶＩＩ型プロテアーゼ（エンドプロテイナーゼＧＬＵ－Ｃ）
－エンドプロテイナーゼＡＲＧ－Ｃ及びエンドプロテアーゼＡＳＰ－Ｎ。
【0065】
使用前に、クロストリパイン酵素は２．５ｍＭ ＤＴＴ及び１ｍＭ ＣａＣｌ２の存在下で４時間の活性化段階を必要とする。
ＨＰＬＣを用いてラクトフェランピンの産生をモニターしながら、２５～３７℃の温度で反応物をインキュベートする。加水分解が完了したら、固定化酵素を除去するか（固体基板上の生体触媒の場合）、３Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを４．００に下げる（遊離酵素の場合）ことにより、反応を抑制する。
ＨＰＬＣを用いてラクトフェランピンの産生をモニターしながら、２５～３７℃の温度で反応物をインキュベートする。加水分解が完了したら、固定化酵素を除去するか（固体基板上の生体触媒の場合）、３Ｍ ＨＣｌを使用してｐＨを４．００に下げる（遊離酵素の場合）ことにより、反応を抑制する。
【0066】
実施例７
本発明の組成物の抗菌活性は、抗菌剤希釈法（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（ＣＬＳＩプロトコル－Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ感受性試験により、グラム陽性及びグラム陰性細菌、並びに真菌及び酵母に関して評価された。その結果、問題となっている微生物の各々について、ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）が測定された。
本発明の組成物の抗菌活性は、抗菌剤希釈法（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（ＣＬＳＩプロトコル－Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ感受性試験により、グラム陽性及びグラム陰性細菌、並びに真菌及び酵母に関して評価された。その結果、問題となっている微生物の各々について、ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）が測定された。
【0067】
実施された全ての試験で、フルコナゾール（真菌及び酵母用）及びセフトリアキソン（細菌株用）を使用して抗菌活性の陽性コントロールを実施し、そして、微生物の正しい増殖が評価される陰性コントロール（化合物なし）を実施した。
【0068】
最初に、２つのペプチド（ラクトフェリシンとラクトフェランピン）の個々の抗菌活性を測定した：
【0069】
【表1】
【0070】
【表2】
【0071】
次いで、組み合わせた（２つの）ペプチドの抗菌活性を測定した。
【0072】
【表3】
【0073】
ＦＩＣ指数は、下記式を用いて決定される。
【0074】
【数2】
【0075】
式中、Ａはラクトフェリシン、Ｂはラクトフェランピンである。
ＦＩＣ指数＜１＝＞は相乗効果を示した。すなわち、２つの成分を一緒にした活性は、別々に測定した場合の活性の合計よりも大きくなる。
ＦＩＣ指数＞１＝＞相乗効果なし
上記表で示された得られた実験データから、組み合わせた（２つの）ペプチドの相乗効果は明らかである。
ＦＩＣ指数＜１＝＞は相乗効果を示した。すなわち、２つの成分を一緒にした活性は、別々に測定した場合の活性の合計よりも大きくなる。
ＦＩＣ指数＞１＝＞相乗効果なし
上記表で示された得られた実験データから、組み合わせた（２つの）ペプチドの相乗効果は明らかである。
【0076】
実施例８
実施例２で得られたラクトフェリシンを含むラクトフェリン加水分解物と、実施例６で得られたラクトフェランピンを含むラクトフェリン加水分解物を混合することにより、ラクトフェリシンとラクトフェランピンが１：１．５の重量比である本発明の組成物を調製した。
実施例２で得られたラクトフェリシンを含むラクトフェリン加水分解物と、実施例６で得られたラクトフェランピンを含むラクトフェリン加水分解物を混合することにより、ラクトフェリシンとラクトフェランピンが１：１．５の重量比である本発明の組成物を調製した。
【0077】
実施例９
実施例８の組成物及びフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ，チコリ由来のフルクトオリゴ糖，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈが販売）を含む製品を（様々な濃度で）プロバイオティック微生物又は病原体と接触させた。
２４時間のインキュベーション後、ＣＦＵ／ｍｌで表した細菌数（最適な寒天培地におけるプレーティング）を算定して、増殖を評価した。このパラメータをグルコースの存在下における増殖と比較した。
プレバイオティクス指数の取得に使用される式は以下である。
実施例８の組成物及びフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ，チコリ由来のフルクトオリゴ糖，Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈが販売）を含む製品を（様々な濃度で）プロバイオティック微生物又は病原体と接触させた。
２４時間のインキュベーション後、ＣＦＵ／ｍｌで表した細菌数（最適な寒天培地におけるプレーティング）を算定して、増殖を評価した。このパラメータをグルコースの存在下における増殖と比較した。
プレバイオティクス指数の取得に使用される式は以下である。
【0078】
【数3】
【0079】
以下は、特定の濃度のＦＯＳと実施例８の組成物におけるプレバイオティクス指数である。
説明に記載の通り、指数が高いほど、試験された化合物のプレバイオティクス特性が大きくなる。
説明に記載の通り、指数が高いほど、試験された化合物のプレバイオティクス特性が大きくなる。
【0080】
【表4】
【0081】
【表5】
【0082】
【表6】
【0083】
上記のデータは、本発明の組成物のプレバイオティクス特性を明確に示す。
【0084】
実施例１０
この実施例では、最初に個々の天然抽出物の抗菌活性を以下の通り評価した：
この実施例では、最初に個々の天然抽出物の抗菌活性を以下の通り評価した：
【0085】
【表7】
【0086】
【表8】
【0087】
【表9】
【0088】
【表10】
【0089】
次いで、個々の天然抽出物の抗菌活性を、実施例８における本発明の組成物と組み合わせて評価した：
【0090】
【表11】
【0091】
またこの場合、本発明の組成物と植物抽出物との間に、さらなる予想外の相乗効果が観察された。
【0092】
実施例１１
実施例８の組成物とナイシン等の別の天然抗菌ペプチドとの相互作用を評価した。
得られたデータは、以下に示す通り、２つの化合物が互いに相乗的な相互作用を確立することを示す。
実施例８の組成物とナイシン等の別の天然抗菌ペプチドとの相互作用を評価した。
得られたデータは、以下に示す通り、２つの化合物が互いに相乗的な相互作用を確立することを示す。
【0093】
【表12】
【0094】
ナイシン単独の抗菌活性を測定した後、ナイシンの抗菌活性を、本発明の組成物と組み合わせて評価した：
【0095】
【表13】
【0096】
またこの場合、本発明の組成物と天然の抗菌ペプチドとの間に、さらなる予想外の相乗効果が観察された。