特許 7365654 抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-12

(45)【発行日】2023-10-20

(54)【発明の名称】抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20231013BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20231013BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20231013BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231013BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231013BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231013BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231013BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20231013BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231013BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20231013BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231013BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231013BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/28

C07K16/46

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12P21/08

A61K39/395 N

A61P35/00

【請求項の数】 30

(21)【出願番号】P 2023515503

(86)(22)【出願日】2022-04-21

(86)【国際出願番号】 JP2022018350

(87)【国際公開番号】W WO2022224997

(87)【国際公開日】2022-10-27

【審査請求日】2023-08-03

(31)【優先権主張番号】P 2021072429

(32)【優先日】2021-04-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000006677

【氏名又は名称】アステラス製薬株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】510097747

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立がん研究センター

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100196243

【弁理士】

【氏名又は名称】運 敬太

(72)【発明者】

【氏名】天田 由幸

(72)【発明者】

【氏名】由利 正利

(72)【発明者】

【氏名】八木 繁典

(72)【発明者】

【氏名】佐竹 佳樹

(72)【発明者】

【氏名】平山 和▲徳▼

(72)【発明者】

【氏名】白井 宏樹

(72)【発明者】

【氏名】佐々木 博己

(72)【発明者】

【氏名】千脇 史子

(72)【発明者】

【氏名】小松 将之

【審査官】福間 信子

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０２０／０１１９６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／１３２６４７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１９／１７８３５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０２１－５１００６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０２０－５３２５７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】RAJENDRAN, Sakthi et al.，Development of a Bispecific Antibody Targeting CD30 and CD137 on Hodgkin and Reed-Sternberg Cells，Frontiers in Oncology，2019年，vol. 9，Article 945

【文献】LI, Xiangru et al.，Development of an Anti-Claudin-3 and -4 Bispecific Monoclonal Antibody for Cancer Diagnosis and Therapys，J Pharmacol Exp Ther，2014年，vol. 351，no. 1，p. 206-213

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、並びに抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体であって、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、二重特異性抗体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号４のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域；又は
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号８のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。

【請求項2】

抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、請求項１に記載の二重特異性抗体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；又は
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。

【請求項3】

抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含む軽鎖からなるＩｇＧ抗体（抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体）を含む、請求項１に記載の二重特異性抗体。

【請求項4】

抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体のＦｃ領域にＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ここで、前記変異位置はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である））を含む、請求項３に記載の二重特異性抗体。

【請求項5】

抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体のＦｃ領域にＰ３３１Ｇ変異（ここで、前記変異位置はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である）を含む、請求項３に記載の二重特異性抗体。

【請求項6】

抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体のＦｃ領域にＬＡＬＡ変異及びＰ３３１Ｇ変異を含む、請求項３に記載の二重特異性抗体。

【請求項7】

抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかである、請求項１に記載の二重特異性抗体：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２０のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２のアミノ酸番号９８から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２４のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２４のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。

【請求項8】

抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が以下の（ａ）～（ｉ）のいずれかである、請求項２に記載の二重特異性抗体：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｇ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；
（ｈ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；又は
（ｉ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。

【請求項9】

抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７一本鎖可変領域フラグメント（抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ）を含む、請求項３に記載の二重特異性抗体。

【請求項10】

抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖが以下の（ａ）～（ｅ）のいずれかである、請求項９に記載の二重特異性抗体：
（ａ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｄ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；又は
（ｅ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ。

【請求項11】

抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体の重鎖又は軽鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている、請求項１０に記載の二重特異性抗体。

【請求項12】

以下の（ａ）～（ｊ）のいずれかの抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｇ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｈ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｉ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；又は
（ｊ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体。

【請求項13】

リンカーがＧＳリンカーである、請求項１２に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体。

【請求項14】

ＧＳリンカーが配列番号５４のアミノ酸配列からなるリンカーである、請求項１３に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体。

【請求項15】

以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかの抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖を含む二重特異性抗体；又は
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖を含む二重特異性抗体。

【請求項16】

翻訳後修飾された、請求項１５に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体。

【請求項17】

翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端リジン欠失である、請求項１６に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体。

【請求項18】

下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項19】

下記（ａ）～（ｒ）からなる群より選択される、抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｒ）配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項20】

下記（ａ）～（ｅ）からなる群より選択される、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項21】

請求項１５に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の生産に用いる、下記（ａ）～（ｅ）からなる群より選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項22】

請求項１８～２１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項23】

請求項２２に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。

【請求項24】

以下の（ａ）～（ｄｄ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｍ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｓ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｕ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｗ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｙ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｚ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ａａ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｂｂ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃｃ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｄｄ）配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項25】

以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む、宿主細胞：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項26】

抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の生産方法であって、請求項２４又は２５に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法。

【請求項27】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項28】

がんの治療に使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体。

【請求項29】

がんの治療に用いるための、請求項２７に記載の医薬組成物。

【請求項30】

がんの治療に用いる医薬組成物の製造における、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がんの治療に用いる医薬組成物の有効成分として有用であると期待される抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｃｌａｕｄｉｎ－４（ＣＬＤＮ４）はクローディンファミリーに属する４回膜貫通タンパク質である。上皮細胞や内皮細胞に発現しており、タイトジャンクションを構成する主要分子として重要な役割を果たしている。ＣＬＤＮ４は大腸がん、膀胱がん、卵巣がん等のがん組織でも高発現が認められており、抗ＣＬＤＮ４抗体はがんの治療又は診断に応用できる可能性が示唆されている（特許文献１、非特許文献１）。さらに、動物モデルにおいて、抗ＣＬＤＮ４抗体と抗Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）抗体の併用による抗腫瘍効果が示されている（非特許文献２）。

【0003】

Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １３７（ＣＤ１３７、別名４－１ＢＢ）は、Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ（ＴＮＦＲＳＦ）に属する分子であり、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）細胞、樹状細胞、好酸球、マスト細胞等の免疫細胞表面に発現していることが報告されている。特に、Ｔ細胞上のＣＤ１３７は抗原提示細胞上のＣＤ１３７リガンドと結合し、共刺激分子としてＴ細胞の活性化と生存に関与していることが知られている（非特許文献３）。抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体は、動物モデルにおいて腫瘍微小環境内の免疫細胞の活性化を介した抗腫瘍効果を示している（非特許文献４）。抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体であるウレルマブは臨床試験で治療効果を示したが、肝障害の副作用を引き起こすことも報告されている（非特許文献５）。

【0004】

低い抗体濃度でがん細胞選択的な細胞傷害活性を得ることができる画期的な方法として、種々の抗体フォーマットの二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）が報告されている。二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体は、がん細胞表面に発現する腫瘍関連抗原（Ｔｕｍｏｒ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ；ＴＡＡ）に対する抗体と、Ｔ細胞に結合する抗体を含む二重特異性抗体であり、Ｔ細胞媒介性免疫療法に対するそれらの抗体の効果が検討されつつある（非特許文献６）。Ｔ細胞に結合する抗体として抗ＣＤ３抗体が多く用いられており、現在も種々のＴＡＡに対する二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体の研究開発がなされている。

【0005】

さらに、近年では、ＣＤ１３７及びＴＡＡに対する二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体の研究も盛んに行われている。ＴＡＡであるＧｌｙｐｉｃａｎ３（ＧＰＣ３）、Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｐｅ２（ＨＥＲ２）、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ－Ｌｉｇａｎｄ１（ＰＤ－Ｌ１）、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＡＰ）を認識する抗ＧＰＣ３－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体、抗ＨＥＲ２－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体、抗ＰＤＬ１－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体、抗ＦＡＰ－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体等の研究がなされている（特許文献２及び３、非特許文献７～９）。
しかしながら、現在までに、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体についての報告はない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】国際公開番号２００８／１１４７３３号

【文献】国際公開番号２０１５／１５６２６８号

【文献】国際公開番号２０１６／１７７８０２号

【非特許文献】

【0007】

【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９：１００（９）：ｐ．１６２３－１６３０

【文献】Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、２０１８：９（１００）：ｐ．３７３６７－３７３７８

【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０２０：１１１（５）：ｐ．１４６１－１４６７

【文献】Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、２０１２：６１（５）：ｐ．１７２１－１７３３

【文献】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１７：２３（８）：ｐ．１９２９－１９３６

【文献】ｍＡｂｓ、２０１７：９（２）：ｐ．１８２－２１２

【文献】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１９：２５（１９）：ｐ．５８７８－５８８９

【文献】Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０２０：２６（１５）：ｐ．４１５４－４１６７

【文献】Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ、２０２０；８（２）：ｅ０００２３８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の課題は、がんの治療に用いることができる抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明者らは、腹膜播種がん細胞に発現する抗原に選択的に結合する抗体の探索を行い、抗ＣＬＤＮ４抗体である３Ｄ１１を取得した（実施例１及び２）。３Ｄ１１及び抗ＣＤ３抗体を用いた二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体はがん患者の治療には使用できないことが判明した（参考例）。そこで、３Ｄ１１及び公知の抗ＣＬＤＮ４抗体であるＫＭ３９００抗体を用い、抗ＣＤ１３７抗体との二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体の取得を試みた（実施例３及び４）。取得した抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、ＣＬＤＮ４及びＣＤ１３７に結合し（実施例５）、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＴ細胞のインターフェロンγ産生を促進し、細胞表面にＣＬＤＮ４を発現するがん細胞に対して細胞傷害活性を示した（実施例６）。さらに、取得した抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体はｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおいて抗腫瘍作用を発揮し（実施例７－１）、カニクイザルにおいても安全に使用できることが確認された（実施例７－２）。本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体はがんの治療に有用であることが示唆された。

【0010】

即ち、本発明は、以下の［１］～［３２］に関する。
［１］ 抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、並びに抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体であって、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、二重特異性抗体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号４のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号８のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
［２］ 抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、［１］に記載の二重特異性抗体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；又は
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
［３］ 抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域を含む重鎖及び軽鎖可変領域を含む軽鎖からなるＩｇＧ抗体（抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体）を含む、［１］又は［２］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
［４］ 抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体のＦｃ領域にＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ここで、前記変異位置はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である））を含む、［３］に記載の二重特異性抗体。
［５］ 抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体のＦｃ領域にＰ３３１Ｇ変異（ここで、前記変異位置はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である）を含む、［３］に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体。
［６］ 抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体のＦｃ領域にＬＡＬＡ変異及びＰ３３１Ｇ変異を含む、［３］に記載の二重特異性抗体。
［７］ 抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかである、［１］～［６］のいずれかに記載の二重特異性抗体：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２０のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２のアミノ酸番号９８から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２４のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２４のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
［８］ 抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が以下の（ａ）～（ｉ）のいずれかである、［１］～［７］のいずれかに記載の二重特異性抗体：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
（ｅ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｇ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；
（ｈ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；又は
（ｉ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。
［９］ 抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７一本鎖可変領域フラグメント（抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ）を含む、［７］又は［８］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
［１０］ 抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖが以下の（ａ）～（ｅ）のいずれかである、［９］に記載の二重特異性抗体：
（ａ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｄ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；又は
（ｅ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ。
［１１］ 抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体の重鎖又は軽鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている、［９］又は［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
［１２］ 以下の（ａ）～（ｊ）のいずれかの抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｇ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｈ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｉ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；又は
（ｊ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体。
［１３］ リンカーがＧＳリンカーである、［１１］又は［１２］のいずれかに記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体。
［１４］ ＧＳリンカーが配列番号５４のアミノ酸配列からなるリンカーである、［１３］に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体。
［１５］ 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかの抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖を含む二重特異性抗体；又は
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチド並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖を含む二重特異性抗体。
［１６］ 翻訳後修飾された、［１］～［１５］のいずれかに記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体。
［１７］ 翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端リジン欠失である、［１６］に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体。
［１８］ 下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［１９］ 下記（ａ）～（ｒ）からなる群より選択される、抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｒ）配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［２０］ 下記（ａ）～（ｅ）からなる群より選択される、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［２１］ ［１５］に記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の生産に用いる、下記（ａ）～（ｅ）からなる群より選択されるポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［２２］ ［１８］～［２１］のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
［２３］ ［２２］に記載の発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
［２４］ 以下の（ａ）～（ｄｄ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｍ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｓ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｕ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｗ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｙ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｚ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ａａ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｂｂ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃｃ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｄｄ）配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［２５］ 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかのポリヌクレオチドを含む、宿主細胞：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［２６］ 抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の生産方法であって、［２３］～［２５］のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法。
［２７］ ［１］～［１７］のいずれかに記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［２８］ がんの治療に使用するための、［１］～［１７］のいずれかに記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体。
［２９］ がんの治療に用いるための、［２７］に記載の医薬組成物。
［３０］ ［１］～［１７］のいずれかに記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の治療有効量を対象に投与する工程を含む、がんを治療する方法。
［３１］ がんの治療に用いる医薬組成物の製造における、［１］～［１７］のいずれかに記載の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の使用。

【発明の効果】

【0011】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、がん抗原であるＣＬＤＮ４とＴ細胞等の免疫細胞の表面に発現しているＣＤ１３７の両方に結合し、がん細胞周辺の免疫細胞を活性化することによりがん細胞に対する殺傷作用を増強させるものである。本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体又は前記抗体を含む医薬組成物は、各種がんの治療のために使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1-1】図１－１はＥＬＩＳＡ法により測定評価した被験抗体のＣＤ１３７への結合活性を示す。図の縦軸は４５０ｎｍの吸光度から５７０ｎｍの吸光度を引いた値を、横軸は被験抗体の濃度を表す。シンボルはそれぞれの被験抗体添加時の吸光度の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。

【図1-2】図１－２はＥＬＩＳＡ法により測定評価した被験抗体のＣＤ１３７への結合活性を示す。図の縦軸は４５０ｎｍの吸光度から５７０ｎｍの吸光度を引いた値を、横軸は被験抗体の濃度を表す。シンボルはそれぞれの被験抗体添加時の吸光度の平均値を示す。

【図1-3】図１－３はＥＬＩＳＡ法により測定評価した被験抗体のＣＤ１３７への結合活性を示す。図の縦軸は４５０ｎｍの吸光度から５７０ｎｍの吸光度を引いた値を、横軸は被験抗体の濃度を表す。シンボルはそれぞれの被験抗体添加時の吸光度の平均値を示す。

【図1-4】図１－４はＥＬＩＳＡ法により測定評価した被験抗体のＣＤ１３７への結合活性を示す。図の縦軸は４５０ｎｍの吸光度から５７０ｎｍの吸光度を引いた値を、横軸は被験抗体の濃度を表す。シンボルはそれぞれの被験抗体添加時の吸光度の平均値を示す。

【図2-1】図２－１はＣＬＤＮ４発現がん細胞（ＮＣＩ－Ｈ３２２細胞）と４－１ＢＢ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓの共培養試験における被験抗体のＣＤ１３７アゴニスト活性を示す。図の縦軸は相対発光量、横軸は被験抗体の濃度を表す。シンボルはそれぞれの被験抗体添加時の相対発光量の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。

【図2-2】図２－２はＣＬＤＮ４発現がん細胞（ＮＣＩ－Ｈ３２２細胞）と４－１ＢＢ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓの共培養試験における被験抗体のＣＤ１３７アゴニスト活性を示す。図の縦軸は相対発光量、横軸は被験抗体の濃度を表す。シンボルはそれぞれの被験抗体添加時の相対発光量の平均値を示す。

【図2-3】図２－３はＣＬＤＮ４発現がん細胞（ＮＣＩ－Ｈ３２２細胞）と４－１ＢＢ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓの共培養試験における被験抗体のＣＤ１３７アゴニスト活性を示す。図の縦軸は相対発光量、横軸は被験抗体の濃度を表す。シンボルはそれぞれの被験抗体添加時の相対発光量の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。

【図2-4】図２－４は４－１ＢＢ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓの単独培養試験における被験抗体のＣＤ１３７アゴニスト活性を示す。図の縦軸は相対発光量、横軸は被験抗体の濃度を表す。シンボルはそれぞれの被験抗体添加時の相対発光量の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。

【図2-5】図２－５は４－１ＢＢ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓの単独培養試験における被験抗体のＣＤ１３７アゴニスト活性を示す。図の縦軸は相対発光量、横軸は被験抗体の濃度を表す。シンボルはそれぞれの被験抗体添加時の相対発光量の平均値を示す。

【図2-6】図２－６は４－１ＢＢ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓの単独培養試験における被験抗体のＣＤ１３７アゴニスト活性を示す。図の縦軸は相対発光量、横軸は被験抗体の濃度を表す。シンボルはそれぞれの被験抗体添加時の相対発光量の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。

【図3-1】図３－１は、６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎＴ細胞の共培養系における各被験抗体添加時のインターフェロン－γ産生促進機能を示す。縦軸は抗体添加６日後におけるインターフェロン－γ産生量（ｐｇ／ｍＬ）を、横軸は抗体濃度を示す。シンボルは抗体の各濃度におけるインターフェロン－γ産生量の平均値を示す。

【図3-2】図３－２は、６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎＴ細胞の共培養系における各被験抗体添加時のインターフェロン－γ産生促進機能を示す。図の縦軸は抗体添加４日後におけるインターフェロン－γ産生量（ｐｇ／ｍＬ）を、横軸は抗体濃度を示す。シンボルは抗体の各濃度におけるインターフェロン－γ産生量の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。

【図3-3】図３－３は、Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎＴ細胞の単培養系における各被験抗体添加時のインターフェロン－γ産生量を示す。図の縦軸は抗体添加６日後におけるインターフェロン－γ産生量（ｐｇ／ｍＬ）を、横軸は抗体濃度を示す。シンボルは抗体の各濃度におけるインターフェロン－γ産生量の平均値を示す。

【図3-4】図３－４は、Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎＴ細胞の単培養系における各被験抗体添加時のインターフェロン－γ産生量を示す。図の縦軸は抗体添加５日後におけるインターフェロン－γ産生量（ｐｇ／ｍＬ）を、横軸は抗体濃度を示す。シンボルは抗体の各濃度におけるインターフェロン－γ産生量の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。

【図4】図４は、６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎＴ細胞の共培養系における各被験抗体によるがん細胞傷害活性（がん細胞の増殖抑制作用）を示す。図の縦軸は測定開始０時間から１６８時間に増加した蛍光面積において被験抗体非添加ウェルを１００％とした時の細胞増殖率を示す。横軸は抗体濃度を示す。シンボルは各抗体におけるがん細胞増殖率の平均値を示す。

【図5】図５は、６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎＴ細胞の共培養系における各被験抗体添加時のがん細胞傷害活性を示す。図の縦軸は抗体添加６日後における６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の化学発光の測定値において、抗体非添加の平均値を殺傷率０％、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００添加の平均値を殺傷率１００％とした時の、がん細胞殺傷率（％）を示す。横軸は抗体濃度を示す。シンボルは抗体の各濃度におけるがん細胞殺傷率の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。

【図6】図６はＮＣＩ－Ｈ３２２細胞を皮下担癌したＰＢＭＣ移入マウスにおける腫瘍体積変化を示す。図の横軸は初回投与後日数を、縦軸は腫瘍体積の平均値を、エラーバーは標準誤差を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下に、本発明について詳述する。
＜定義＞
本明細書の用語は、以下で特に定義されない限り、当該技術分野で当業者に一般に使用されている意味にて使用される。

【0014】

抗体（又は免疫グロブリン）は、単一の配列を有する重鎖２本と、単一の配列を有する軽鎖２本からなる左右対称Ｙ字型の構造を有する４本鎖構造を基本構造とする糖タンパク質である。抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５つのクラスが存在する。抗体分子の基本構造は各クラス共通であり、分子量５万～７万の重鎖２本と２万～３万の軽鎖２本がジスルフィド結合及び非共有結合によって結合し、分子量１５万～１９万のＹ字型の４本鎖構造からなる抗体分子を形成する。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してそれぞれ、Ｉｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれる。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、λ型とκ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκという。前記２種の軽鎖は、いずれの種類の重鎖とも対をなすことができる。

【0015】

抗体分子の鎖内ジスルフィド結合は、重鎖には４つ（Ｉｇμ、Ｉｇεには５つ）、軽鎖には２つ存在し、アミノ酸１００～１１０残基ごとに１つのループを成している。それらの立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位又はドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは可変領域とよばれ、同種動物の同一クラス（又はサブクラス）から産生された抗体であっても多様なアミノ酸配列を有し、抗体と抗原との結合特異性結合に関与することが知られている。可変領域よりも下流のＣ末端側のドメインのアミノ酸配列は各クラス又はサブクラスごとにほぼ一定で、定常領域とよばれている。重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を有する。ＣＨはさらにＮ末端側からＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインの３つのドメインに分けられる。軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を有す。

【0016】

ＶＨ及びＶＬに存在する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列は変化が非常に大きく、可変領域の可変性に寄与している。ＣＤＲは５～１０アミノ酸残基からなる領域であって、重鎖と軽鎖のぞれぞれのＮ末端にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の順番で存在し、抗原に接触して抗体結合部位を形成する。軽鎖のＣＤＲよりも重鎖のＣＤＲが抗原結合への寄与が大きく、ＣＤＲ１～３の中ではＣＤＲ３の寄与が最も高いことが知られている。一方、可変領域のＣＤＲ以外の部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、ＦＲ１～４からなり、アミノ酸配列の変化は比較的少ない。

【0017】

抗体をタンパク質分解酵素のパパインで処理すると、３つの抗体断片が得られる。Ｎ末端側の２つの断片はＦａｂ（抗原結合断片、Ｆｒａｇｍｅｎｔ，ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ）領域と呼ばれている。Ｆａｂ領域とは、重鎖のＶＨ、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域の一部、並びに軽鎖（ＶＬとＣＬ）からなる領域を指し、当該Ｆａｂ領域が構成するＶＨ及びＶＬ（抗原結合部位）で抗原と結合する。また、Ｃ末端側の断片はＦｃ（結晶化可能断片、Ｆｒａｇｍｅｎｔ，ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域と呼ばれている。

【0018】

本明細書において「ＩｇＧ抗体」とは、２つのＦａｂ領域とＦｃ領域からなるＹ字型の構造を有する抗体をいう。１つの実施形態において、ＩｇＧ抗体の２つのＦａｂ領域は、同一の配列からなるＦａｂ領域である。１つの実施形態において、ＩｇＧ抗体の２つのＦａｂ領域は、異なる配列からなるＦａｂ領域である。

【0019】

本明細書において「抗原結合フラグメント」及び「フラグメント抗体」は相互互換的に使用することができ、免疫グロブリン分子の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、抗原結合活性を有する、少なくとも１つのポリペプチド鎖を含む分子をいう。代表的な抗原結合フラグメントとしては、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントが挙げられる。本明細書において、「ｓｃＦｖ」とは、リンカーで連結されたＶＨとＶＬから構成される一価の抗原結合フラグメントをいう。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖のＶＨ、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含むフラグメントから構成される一価の抗原結合フラグメントである。Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖と、重鎖のＶＨ、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含むフラグメントから構成される一価の抗原結合フラグメントであり、このヒンジ領域の部分には重鎖間ジスルフィド結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントは、Ｆａｂ’フラグメントがジスルフィド結合で繋がっている二価の抗原結合フラグメントである。一価とは、抗原結合部位を１つ含むことを、二価とは、抗原結合部位を２つ含むことを意味する。

【0020】

本明細書において、「二重特異性抗体」とは、異なる抗原に特異的に結合する２つの抗体又は抗原結合フラグメントから構成され、各抗原に対する結合活性を有する抗体分子をいう。二重特異性抗体としては、様々な構造の二重特異性抗体が当業者に公知である（非特許文献６）。本明細書で使用される用語「抗体」には、文脈上特に限定されない限り、完全長の抗体（各種免疫グロブリン、特にＩｇＧ抗体）、抗原結合フラグメント、及びあらゆる構造の二重特異性抗体が含まれる。

【0021】

本明細書において、ＩｇＧ型の抗ＣＬＤＮ４抗体を「抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体」と称する。

【0022】

本明細書において「ヒト抗体」とはヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有する抗体を表す。本明細書において「ヒト化抗体」は、ＣＤＲ以外のアミノ酸残基の一部、大部分、又は全部がヒト免疫グロブリン分子に由来するアミノ酸残基で置換された抗体を表す。ヒト化の方法は特に制限されないが、例えば、米国特許第５２２５５３９号、米国特許第６１８０３７０号等を参照してヒト化抗体を作製することができる。

【0023】

本明細書中で使用される抗体のアミノ酸残基番号はＫａｂａｔナンバリング又はＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ，１９９１，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２）を指定することで、それらのナンバリングシステムに従って規定することができる。

【0024】

本明細書において、「連結」又は「連結された」とは、複数の成分（例えば、Ｆａｂ領域及びＦｃ領域）が、直接又は仲介物（例えば、ペプチドリンカー）を介して結合していることを意味する。本明細書において「ペプチドリンカー」とは、複数の成分を連結するために用いられる、遺伝子工学的手法により導入され得る１以上の任意のアミノ酸配列を意味する。本発明で使用されるペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能である。

【0025】

本明細書において、「同一性」とは、ＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０１５、Ｖｏｌ．４３、ｐＷ５８０－Ｗ５８４）を用いて、デフォルトで用意されているパラメータによって得られたＩｄｅｎｔｉｔｙの値を意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ Ｏｐｅｎ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２
Ｅｎｄ Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ｆａｌｓｅ

【0026】

＜本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体＞
本発明は、ＣＬＤＮ４及びＣＤ１３７に結合する二重特異性抗体（「抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体」とも称する）を提供する。本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、並びに抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体には、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体と抗ＣＤ１３７抗体のｓｃＦｖ（「抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ」とも称する）を含む二重特異性抗体が含まれる。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体と抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体である。

【0027】

本明細書において、「抗ＣＬＤＮ４抗体」はヒトＣＬＤＮ４に結合可能な抗体であり、「抗ＣＤ１３７抗体」はヒトＣＤ１３７に結合可能な抗体である。ヒトＣＬＤＮ４又はヒトＣＤ１３７に結合するか否かは、公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。結合活性を測定する方法としては、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法、フローサイトメトリー法等の方法が挙げられる。ＥＬＩＳＡ法又はフローサイトメトリー法は、当業者が通常用いる方法にて実施することができ、例えば実施例３又は５に記載される方法を用いることができる。

【0028】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、ＣＬＤＮ４及びＣＤ１３７に結合する限りにおいてどのような構造であってもよく、例えば、非特許文献６に記載されている構造を有する二重特異性抗体が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４抗体のＦａｂ領域と抗ＣＤ１３７抗体のＦａｂ領域が連結された連結体、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及びＩｇＧ型の抗ＣＤ１３７抗体（「抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ抗体」とも称する）の連結体、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７抗体の抗原結合フラグメントの連結体、抗ＣＬＤＮ４抗体の抗原結合フラグメント及び抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ抗体の連結体、又は抗ＣＬＤＮ４抗体の抗原結合フラグメント及び抗ＣＤ１３７抗体の抗原結合フラグメントの連結体であってよい。

【0029】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、完全長の抗ＣＬＤＮ４抗体及び完全長の抗ＣＤ１３７抗体を含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７ ＩｇＧ抗体を含む。２つの抗体はリンカーを介して連結されていてもよい。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、完全長の抗ＣＬＤＮ４抗体及び抗ＣＤ１３７抗体の抗原結合フラグメントを含む。２つの抗体の連結部位は特に限定されず、直接又はリンカーを介して連結されている。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７抗体のｓｃＦｖ（本明細書において「抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ」と称する）を含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端が連結されている。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端が連結されている。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖のアミノ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのカルボキシ末端が連結されている。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖のアミノ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのカルボキシ末端が連結されている。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４抗体の抗原結合フラグメント及び抗ＣＤ１３７の抗原結合フラグメントを含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４抗体のｓｃＦｖ及び抗ＣＤ１３７のｓｃＦｖを含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含む。

【0030】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体において、抗ＣＬＤＮ４抗体及び抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、ヒト抗体由来、ヒト化抗体由来、又はそれらの組み合わせであってよい。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はその組み合わせからなる抗体である。

【0031】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域、並びに抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体であって、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである二重特異性抗体である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号４のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号８のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。

【0032】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；又は
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。

【0033】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４抗体として、ＩｇＧ抗体等の完全長の抗体を含んでもよく、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント又はｓｃＦｖ等の抗原結合フラグメントを含んでもよい。

【0034】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体に含まれる抗ＣＬＤＮ４抗体に含まれる重鎖定常領域としては、Ｉｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ又はＩｇεのいずれの定常領域も選択可能である。Ｉｇγとしては、例えば、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４から選択することが可能である。本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体に含まれる抗ＣＬＤＮ４抗体に含まれる軽鎖定常領域としては、Ｉｇλ又はＩｇκのいずれの定常領域も選択可能である。本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体に含まれる抗ＣＬＤＮ４抗体がＩｇＧ抗体である場合、１つの実施形態において、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び軽鎖は、それぞれ、ヒトＩｇγ１及びＩｇκである。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は完全長の抗ＣＬＤＮ４抗体を含む。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体に含まれる抗ＣＬＤＮ４抗体は、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むＩｇＧ抗体（抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体）である。

【0035】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体がＦｃ領域を含む場合、該二重特異性抗体におけるＦｃ領域は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）や補体依存性傷害活性（ＣＤＣ）を低下させる変異を含んでもよい。Ｌ２３４Ａとは、ヒトＩｇγ１定常領域のアミノ酸２３４位のロイシンのアラニンへの置換である。Ｌ２３５Ａとは、ヒトＩｇγ１定常領域のアミノ酸２３５位のロイシンのアラニンへの置換である。ヒトＩｇγ１定常領域Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異を「ＬＡＬＡ変異」という。ここで、前記２３４位及び２３５位はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である。当該変異は、抗体のＡＤＣＣやＣＤＣを低下させることが知られている（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９２、Ｖｏｌ．２９、ｐ．６３３－６３９；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、Ｖｏｌ．１６４、ｐ．４１７８－４１８４）。Ｐ３３１Ｇ又はＰ３３１Ｓとは、ヒトＩｇγ１定常領域のアミノ酸３３１位のプロリンのグリシン又はセリンへの置換である。ここで、前記３３１位はヒトＩｇγ１定常領域におけるＥＵインデックスに従うアミノ酸位置である。当該変異は、抗体のＣＤＣを低下させることが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、Ｖｏｌ．１６４（８）、ｐ．４１７８－４１８４）。

【0036】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体に含まれる抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異（ＬＡＬＡ変異）を含むＦｃ領域を含む。１つの実施形態において、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体はＰ３３１Ｇ又はＰ３３１Ｓ変異のいずれかを含むＦｃ領域を含む。１つの実施形態において、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体は、ＬＡＬＡ変異及びＰ３３１Ｇ又はＰ３３１Ｓ変異のいずれかの変異を含むＦｃ領域を含む。

【0037】

本発明者らは、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の創出の過程において、新規な抗ＣＤ１３７抗体又はその結合フラグメント（ｓｃＦｖ）を創出した。本発明者らは、ＣＤ１３７にのみ結合する場合にはＣＤ１３７シグナルを伝達せず、ＣＤ１３７とＣＬＤＮ４に同時に結合した場合にのみＣＤ１３７シグナルを伝達する抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体を同定した。これらの抗体は、ＣＬＤＮ４に結合していない場合にはアゴニスト活性を示さない。一方で、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体によるＣＬＤＮ４及びＣＤ１３７へ結合により、ＣＤ１３７シグナル伝達及びＴ細胞の活性化をもたらす。この作用は、ウレルマブの臨床試験において見られた肝毒性等を軽減しうることが期待されるため、二重特異性抗体に用いる抗ＣＤ１３７抗体として好ましいプロファイルであることが期待される。

【0038】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかに記載の抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２０のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２のアミノ酸番号９８から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２４のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２４のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。

【0039】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、以下の(ａ）～（ｉ）のいずれかに記載の抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
（ｅ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｇ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；
（ｈ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；又は
（ｉ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。

【0040】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＤ１３７抗体として、ＩｇＧ抗体等の完全長の抗体を含んでもよく、又はＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント、ｓｃＦｖ等の抗原結合フラグメントを含んでもよい。１つの実施形態において、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体に含まれる抗ＣＤ１３７抗体は、抗ＣＤ１３７抗体の抗原結合フラグメントである。１つの実施形態において、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体に含まれる抗ＣＤ１３７抗体の抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖである。

【0041】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、以下の（ａ）～（ｍ）に記載の抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含む：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２０のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２のアミノ酸番号９８から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２４のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２４のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｇ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｈ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
（ｉ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｊ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｋ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；
（ｌ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；又は
（ｍ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。

【0042】

抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖにおいて、抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を連結するリンカーの種類及び長さは特に限定されず、当業者が適宜選択することが可能である。リンカーとしては、ペプチドリンカーを用いてもよい。好ましい長さは５アミノ酸以上（上限は特に限定されないが、通常、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下）であり、特に好ましくは１５アミノ酸である。リンカーとして、例えば、グリシン－セリンリンカー（ＧＳリンカー）や、グリシン－リジン－プロリン－グリシン－セリンリンカー（ＧＫＰＧＳリンカー）を使用することができる。このようなリンカーとしては、例えば、以下が挙げられる。
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ－Ｓｅｒ
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号４６）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号４７）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号４８）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号４９）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号５０）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号５１）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号５２）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号５３）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号５４）
（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ
（Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）ｎ
Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号５５）
（Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ
上記のｎは１以上の整数を示す。また、ある態様では、上記のｎは１～１０、２～８、又は２～６である。リンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。１つの実施形態において、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖにおいて使用されるリンカーは、ＧＳリンカーである。１つの実施形態において、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖにおいて使用されるリンカーは、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎのＧＳリンカーであり、ｎは３又は４のいずれかである。

【0043】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、以下の（ａ）～（ｅ）のいずれかの抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含む：
（ａ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｄ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；又は
（ｅ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ。

【0044】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体において、抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントと抗ＣＤ１３７抗体又はその抗原結合フラグメントはリンカーで連結されていてもよい。抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントと抗ＣＤ１３７抗体又はその抗原結合フラグメントを連結するリンカーの種類及び長さは特に限定されず、当業者が適宜選択することが可能である。リンカーとしては、ペプチドリンカーを用いてもよい。好ましい長さは５アミノ酸以上（上限は特に限定されないが、通常、３０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下）であり、特に好ましくは１０アミノ酸である。ペプチドリンカーとして、例えば、グリシン－セリンリンカー（ＧＳリンカー）や、グリシン－リジン－プロリン－グリシン－セリンリンカー（ＧＫＰＧＳリンカー）を使用することができる。このようなリンカーとしては、例えば、以下が挙げられる。
Ｓｅｒ
Ｇｌｙ－Ｓｅｒ
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号４６）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号４７）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号４８）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号４９）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号５０）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号５１）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号５２）
Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ （配列番号５３）
Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号５４）
（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ
（Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）ｎ
Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ （配列番号５５）
（Ｇｌｙ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎ
上記のｎは１以上の整数を示す。また、ある態様では、上記のｎは１～１０、２～８、又は２～６である。ペプチドリンカーの長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。１つの実施形態において、抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントと抗ＣＤ１３７抗体又はその抗原結合フラグメントを連結するリンカーとして使用されるリンカーは、ＧＳリンカー又はＧＫＰＧＳリンカーであり、１つの実施形態において、配列番号５４のアミノ酸配列からなるリンカーである。

【0045】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体と抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖがリンカーを介して連結されている構造を有する。抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体と抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖの連結部位は特に限定されないが、例えば、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのカルボキシ末端に抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体の重鎖アミノ末端が連結されている、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのカルボキシ末端に抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体の軽鎖アミノ末端が連結されている、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体の重鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端が連結されている、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体の軽鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端が連結されている等の種々の構造をとることができる。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体の重鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端が連結されている、又は抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体の軽鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端が連結されている。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体の重鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端が連結されている。

【0046】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体の重鎖又は軽鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されており、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域が以下の（ａ）～（ｍ）のいずれかである、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体である：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２０のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２のアミノ酸番号９８から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２４のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２４のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｇ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｈ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域
（ｉ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｊ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｋ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；
（ｌ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；又は
（ｍ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。

【0047】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、抗ＣＬＤＮ４ ＩｇＧ抗体の重鎖又は軽鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されており、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖが以下の（ａ）～（ｅ）のいずれかである、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体である：
（ａ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｄ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；又は
（ｅ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ。

【0048】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、以下の（ａ）～（ｈ）のいずれかの抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、配列番号４のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号４のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、配列番号４のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号４のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、配列番号４のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号４のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号１８のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２０のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、配列番号４のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号４のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２のアミノ酸番号９８から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２４のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２４のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｅ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号８のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号８のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｇ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号８のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号１８のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２０のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；又は
（ｈ）配列番号６のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号６のアミノ酸番号９９から１１２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、配列番号８のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号８のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２のアミノ酸番号９８から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２４のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２４のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体。

【0049】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、以下の（ａ）～（ｊ）のいずれかの抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｇ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｈ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｉ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｊ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｋ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｌ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｍ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｎ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｏ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｐ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｑ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｒ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；
（ｓ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体；又は
（ｔ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている二重特異性抗体。

【0050】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、以下の（ａ）又は（ｂ）の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体である：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖を含むポリペプチドを含む二重特異性抗体；又は
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖を含む二重特異性抗体。

【0051】

本明細書において「翻訳後修飾」とは、抗体を細胞内で発現させた場合に抗体が翻訳後に修飾を受けることをいう。翻訳後修飾の例として、重鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等の修飾や、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断によるリジン欠失が挙げられる。種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、２００８、Ｖｏｌ．９７、ｐ．２４２６－２４４７）。

【0052】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、翻訳後修飾されていてもよい。１つの実施形態において、翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端リジン欠失である。Ｎ末端のピログルタミル化又はＣ末端リジン欠失による翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６、Ｖｏｌ．３４８、ｐ．２４－３９）。

【0053】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、ヒトＣＬＤＮ４及びヒトＣＤ１３７に結合する。ヒトＣＬＤＮ４及びヒトＣＤ１３７に結合するか否かは、公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。結合活性を測定する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー法等の方法が挙げられる。ＥＬＩＳＡ法又はフローサイトメトリー法は、当業者が通常用いる方法にて実施することができ、例えば実施例３又は５に記載される方法を用いることができる。

【0054】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、ヒトＣＬＤＮ４及びヒトＣＤ１３７を抗原として用いて当該分野で公知の抗体作製技術を使用して当業者に容易に作製され得、或いは、本明細書に開示される抗ＣＬＤＮ４抗体及び抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報等に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。

【0055】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、特に限定されるものではないが、例えば、後述の＜本発明の二重特異性抗体を生産する方法＞に記載の方法に従い製造することができる。

【0056】

＜本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチド＞
本発明はまた、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の生産に使用されうるポリヌクレオチド（「本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチド」とも称する）を提供する。

【0057】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0058】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、下記（ａ）又は（ｂ）より選択される、抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0059】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、下記（ａ）～（ｒ）からなる群より選択される、抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｍ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｒ）配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0060】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、下記（ａ）～（ｉ）からなる群より選択される、抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｉ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0061】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、下記（ａ）～（ｅ）からなる群より選択される、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0062】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、下記（ａ）～（ｅ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｅ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0063】

本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、国際公開番号９０／０７８６１号に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。

【0064】

＜本発明の二重特異性抗体の発現ベクター＞
本発明はまた、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドを含む発現ベクター（「本発明の二重特異性抗体の発現ベクター」とも称する）を提供する。これらのポリヌクレオチドは、それぞれが別々のベクターに含まれていてもよく、又は複数のポリヌクレオチドが１つのベクターに含まれていてもよい。

【0065】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、下記（ａ）～（ａａ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｍ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｓ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｕ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｗ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｙ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｚ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ａａ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0066】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、下記（ａ）～（ｋ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｋ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0067】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0068】

１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、下記（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0069】

本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）等の各種宿主細胞中において本発明のポリヌクレオチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ｐＡＬＴＥＲ（登録商標）－ＭＡＸ（プロメガ）、ｐＨＥＫ２９３ Ｕｌｔｒａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社）、ｐＥＥ６．４又はｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）等を使用することができる。ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスを使用することができる。例えば、細胞へ本発明のポリヌクレオチドを導入するためにレンチウイルスを使用する場合、当該レンチウイルスは、ｐＬＶＳＩＮ－ＣＭＶ／ＥＦ１αベクター（タカラバイオ社）、ｐＬｅｎｔｉベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等を用いることができる。１つの実施形態において、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターに使用されるベクターは、ｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）である。

【0070】

本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドに動作可能なように連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０等のウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター等が挙げられる。酵母で本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。

【0071】

宿主細胞として、動物細胞、昆虫細胞又は酵母を用いる場合、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、エンハンサー配列、本発明の抗体又はその重鎖若しくは軽鎖をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位等を含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる薬剤選択マーカー遺伝子（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。

【0072】

＜本発明の宿主細胞＞
本発明はまた、本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチド又は本発明の二重特異性抗体の発現ベクター（「本発明のポリヌクレオチド等」とも称する）によって形質転換された宿主細胞（「本発明の宿主細胞」とも称する）を提供する。本発明の宿主細胞は、細胞内に本発明のポリヌクレオチド等を含む。導入された本発明のポリヌクレオチド等は宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれていてもよく、組み込まれていなくてもよい。宿主細胞として用いる細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養可能な細胞又は生体内の細胞のいずれでもよい。宿主細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで培養可能な細胞である場合、本発明のポリヌクレオチド等をｉｎ ｖｉｔｒｏにて細胞に導入することで、本発明の宿主細胞を作製することができる。宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、又はリポフェクション方等の当業者に一般的に用いられる方法を使用することができる。宿主細胞が生体内の細胞である場合、宿主細胞に本発明のポリヌクレオチド等を導入する方法は、特に限定されるものではないが、核酸送達用キャリア（カチオン性キャリア又は非カチオン性キャリア（例えば、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含むがこれに限らない）等）を用いることができる。

【0073】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養可能な細胞としては、使用する発現ベクター又はエレクトロポレーション等の方法によって形質転換され、抗体又はポリペプチドを発現することができるものである限り特に限定されるものではない。ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養可能な細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される従来細胞又は人工的に樹立された細胞等種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（登録商標）細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＮＳ０細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、細菌（エシェリキア属菌等）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属等）等）が挙げられる。１つの実施形態において、本発明の宿主細胞はＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、又はＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞である。

【0074】

ｉｎ ｖｉｔｒｏにて形質転換された宿主細胞の選別は、当業者に一般に使用されている方法にて行うことができる。選別方法には、例えば、薬剤選択マーカー遺伝子とテトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシン又はハイグロマイシン等の薬剤を用いた薬剤選択法や、限外希釈法、シングルセルソーティング法、又はコロニーピックアップ法等の細胞単離法を用いることができる。

【0075】

本発明の宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、下記（ａ）～（ａａ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｋ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｌ）配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（ｍ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｎ）配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｏ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｐ）配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｑ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｒ）配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｓ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｔ）配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｕ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｗ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｘ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｙ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｚ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ａａ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0076】

１つの実施形態において、該宿主細胞は、下記（ａ）～（ｋ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｊ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｋ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0077】

本発明の宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｃ）配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0078】

１つの実施形態において、該宿主細胞は、下記（ａ）又は（ｂ）より選択されるポリヌクレオチドを含む：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0079】

本発明の宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は下記の（ａ）～（ｊ）のポリペプチドを含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｈ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｉ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；又は
（ｊ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。

【0080】

本発明の宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、下記の（ａ）又は（ｂ）の宿主細胞である：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、宿主細胞；又は
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【0081】

本発明の宿主細胞の１つの実施形態において、該宿主細胞は、配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む、宿主細胞である。

【0082】

＜本発明の二重特異性抗体を生産する方法＞
本発明はまた、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体を生産する方法（「本発明の生産方法」とも称する）を提供する。本発明の生産方法には、前述の本発明の二重特異性抗体のポリヌクレオチドの生産方法、本発明の二重特異性抗体の発現ベクターの生産方法及び本発明の宿主細胞の生産方法が含まれうる。さらに、本発明の生産方法には、前述の＜本発明の宿主細胞＞に記載の宿主細胞を培養し該細胞又は該培養上清中に該抗体を発現させる工程、該抗体を回収、単離及び精製する方法等も含まれうる。しかしながら、本発明の生産方法は、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体が生産される限りにおいて、これらの方法に限定されるものではない。

【0083】

１つの実施形態において、本発明の生産方法は、下記の（ａ）～（ｊ）の宿主細胞を培養する工程を含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞；
（ｇ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞；
（ｈ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞；
（ｉ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞；又は
（ｊ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７抗体の軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されているポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞。

【0084】

１つの実施形態において、本発明の生産方法は、下記の（ａ）又は（ｂ）の宿主細胞を培養する工程を含む：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞；又は
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞。

【0085】

本発明の宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、当業者により適宜選択されうる。宿主細胞が動物細胞の場合、培地としては、例えば、約５～２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９５９、Ｖｏｌ．１３０、ｐ．４３２－４３７）、Ｄ－ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌ．、１９５９、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６）、ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、１９６７、Ｖｏｌ．１９９、ｐ．５１９）、１９９培地（Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１９５０、Ｖｏｌ．７３、ｐ．１－８）等を用いることができる。培地のｐＨは、例えば、約６～８であり、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約３０～４０℃で約１５～３３６時間行われる。宿主細胞が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９８５、Ｖｏｌ．８２、ｐ．８４０４）等を用いることができる。培地のｐＨは、例えば、約５～８であり、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０～４０℃で約１５～１００時間行われる。宿主細胞が大腸菌又は酵母である場合、培地としては、例えば、栄養源を含有する液体培地が適当である。栄養培地は、例えば、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源、又は有機窒素源を含んでいる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖等が、無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液等が挙げられる。所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン）等を含んでいてもよい。培地のｐＨは、例えば、約５～８である。宿主細胞が大腸菌の場合、培地としては、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｖｏｌ．３、Ａ２．２）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約１４～４３℃で約３～２４時間行われる。宿主細胞が酵母の場合、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９８０、Ｖｏｌ．７７、ｐ．４５０５）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０～３５℃で約１４～１４４時間行われる。上述のような培養により、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体を発現させることができる。

【0086】

本発明の生産方法は、本発明の宿主細胞を培養し、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体を発現させる工程に加え、該宿主細胞から抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体を回収、単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法等が挙げられる。１つの実施形態において、培養上清中に分泌された抗体は、各種クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。

【0087】

本発明の生産方法によって生産される抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体は本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体に含まれる。

【0088】

＜本発明の医薬組成物等＞
本発明はまた、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体を含む医薬組成物等（「本発明の医薬組成物」とも称する）を提供する。本発明の医薬組成物には、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、腫瘍内投与等の適切な方法により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。

【0089】

本発明の医薬組成物には、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の翻訳後修飾体を含み得る。例えば、Ｃ末端リジンの欠失やＮ末端のピログルタミル化の両方又は一方を受けた抗体等を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。

【0090】

１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下の（ａ）～（ｊ）のいずれかの本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体を含有する医薬組成物である：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体；
（ｅ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体；
（ｆ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体；
（ｇ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体；
（ｈ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体；
（ｉ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体；又は
（ｊ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖、並びに配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含み、該抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖カルボキシ末端に該抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端がリンカーを介して連結されている抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体。

【0091】

１つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、以下の（ａ）又は（ｂ）の本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体を含有する医薬組成物である：
（ａ）配列番号３６のアミノ酸番号１から７０５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖を含む、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体；又は
（ｂ）配列番号３８のアミノ酸番号１から７１２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖及び抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを含むポリペプチド、並びに配列番号４０のアミノ酸番号１から２１５までのアミノ酸配列からなる抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖を含む、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体。

【0092】

製剤化における本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体及び／又は当該抗体の翻訳後修飾体の添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。

【0093】

＜本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の医薬用途＞
本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体、及びそれらを含有する医薬組成物は、対象のがんの治療のために用いることができる。また、本発明には、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の治療有効量を対象に投与する工程を包含する、がんを治療する方法が含まれる。また、本発明には、がんの治療に使用するための、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体を含む。また、本発明には、がんの治療用医薬組成物の製造における、本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体の使用が含まれる。本発明による治療の対象となるがんは、特に限定されないが、例えば、種々の腹膜播種がん、胃がん、肺がん、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫等の血液がん、骨髄異形成症候群、腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、中皮腫、皮膚がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、肝臓がん、胆のうがん、胆管がん、腎臓がん、膵臓がん、結腸がん、大腸がん、直腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、精巣がん、卵巣がん、脳腫瘍等の固形がん、並びに骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんの他、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫等の肉腫や、膠芽腫、多形性膠芽腫、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫などの芽腫等が挙げられる。１つの実施形態において、本発明による治療の対象となるがんは、大腸がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、卵巣がん、乳がん、前立腺がんである。１つの実施形態において、本発明による治療の対象となるがんは、正常組織と比較してＣＬＤＮ４が高発現しているがんである。本発明による治療の対象となるがんは、好ましくは、正常組織と比較してＣＬＤＮ４が高発現しているがん、又は大腸がん、直腸がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、卵巣がん、乳がん、前立腺がんからなる群から選択されるがんである。

【0094】

＜本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体＞
本発明はまた、以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかの抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４のアミノ酸番号２４から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９０から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメント；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメント；又は
（ｃ）配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメント。

【0095】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメント、又は配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントである。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域である。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号６のアミノ酸番号１から１２３までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号８のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントである。

【0096】

本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖定常領域としては、Ｉｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ又はＩｇεのいずれの定常領域も選択可能である。Ｉｇγとしては、例えば、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４から選択することが可能である。１つの実施形態において、重鎖定常領域はＩｇγ１定常領域であり、例えば、ヒトＩｇγ１定常領域である。また、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体の重鎖定常領域は、ＡＤＣＣやＣＤＣを低下させるためにＬＡＬＡ変異、Ｐ３３１Ｇ又はＰ３３１Ｓ変異等のアミノ酸変異を含んでもよい。本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体の軽鎖定常領域としては、Ｉｇλ又はＩｇκのいずれの定常領域も選択可能であり得る。１つの実施形態において、軽鎖定常領域はＩｇκ定常領域であり、例えば、ヒトＩｇκ定常領域である。

【0097】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体の抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）_２である。

【0098】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体は、配列番号２のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ＣＬＤＮ４抗体、又は配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ＣＬＤＮ４抗体である。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体は、配列番号２のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ＣＬＤＮ４抗体である。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体は、配列番号６のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ＣＬＤＮ４抗体である。

【0099】

本発明はまた、糖質、脂質、金属（放射性同位体を含む）、有機化合物（毒素、近赤外蛍光色素、キレート剤を含む）等（「修飾剤」ともいう）が結合した、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメント（「本発明の複合体」ともいう）を提供する。本明細書において、「修飾剤」とは抗体又はその抗原結合フラグメントに直接又はリンカー等を介して結合している、非ペプチド性の物質を指す。本発明の複合体に用いられる修飾剤は特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、放射線同位体（例えば、ジルコニウム－８９（^８９Ｚｒ）、イットリウム－９０（^９０Ｙ）、インジウム－１１１（^１１１Ｉｎ）、アスタチン－２１１（^２１１Ａｔ）、アクチニウム－２２５（^２２５Ａｃ））、有機化合物、毒素、近赤外蛍光色素（例えばＩＲＤｙｅ（登録商標））、キレート剤等が挙げられる。当該複合体に用いられる修飾剤は、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントに直接結合していてもよく、また、任意のリンカーを介して結合していてもよい。１つの実施形態において、本発明の複合体は、抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントの薬物複合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＡＤＣ）である。ＡＤＣに用いられる薬物及びリンカーは、当業者が一般に用いる薬剤及びリンカーの中より選定されうる。

【0100】

本発明はまた、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞（例えば、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｔ ｃｅｌｌ；ＣＡＲ－Ｔ細胞）を提供する。このような細胞は、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドを用いて、当業者であれば作製することができる。本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる細胞としては、各種免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞等）を用いることができる。

【0101】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメント、本発明の複合体、及び本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞における抗体又は抗原結合フラグメント部分は、翻訳後修飾されていてもよい。１つの実施形態において、翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端リジン欠失である。

【0102】

本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメント、本発明の複合体、及び本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞は、本明細書に開示される本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＨ及びＶＬの配列情報、本発明の複合体に用いられる修飾剤の情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者であれば作製し得る。本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントは、特に限定されるものではないが、例えば、＜本発明の二重特異性抗体を生産する方法＞の項に記載の方法に従って生産することができる。

【0103】

本発明はまた、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメント、本発明の複合体及び本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントを細胞表面に発現させた細胞（纏めて以下本項において「本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体等」と称する）、並びに薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、がんの治療のために用いることができる。本発明はまた、本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体等の治療有効量を対象に投与する工程を含むがんを治療する方法、がんの治療に使用するための本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体等、がんの治療用医薬組成物の製造における本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体等の使用を提供する。本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体等の医薬用途は、前述の＜本発明の医薬組成物等＞の記載に準じて当業者であれば実施し得る。本発明の抗ＣＬＤＮ４抗体等の医薬用途の治療の対象となるがんは、前述の＜本発明の医薬組成物等＞に記載のがんが挙げられる。

【0104】

＜本発明の抗ＣＤ１３７抗体＞
本発明はまた、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかの抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１０のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１２のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１２のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１２のアミノ酸番号８９から９８までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１４のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１６のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１６のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号１８のアミノ酸番号９８から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２０のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２０のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２２のアミノ酸番号９８から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２４のアミノ酸番号２３から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸番号５１から５７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２及び配列番号２４のアミノ酸番号９０から１００までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。

【0105】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＤ１３７抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下の（ａ）～（ｉ）のいずれかの抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む；
（ａ）配列番号１０のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１２のアミノ酸番号１から１０９までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号１４のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号１６のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２４のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号２６のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２６のアミノ酸番号１３４から２４２までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号２８のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号２８のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；
（ｇ）配列番号３０のアミノ酸番号１から１１１までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３０のアミノ酸番号１３２から２４９までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域；
（ｈ）配列番号３２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸番号１３４から２４４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域；又は
（ｉ）配列番号３４のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号３４のアミノ酸番号１３７から２４７までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域。

【0106】

１つの実施形態において、本発明の抗ＣＤ１３７抗体の抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖである。１つの実施形態において、本発明の抗ＣＤ１３７抗体の抗原結合フラグメントは、以下の（ａ）～（ｅ）のいずれかである；
（ａ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｄ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；又は
（ｅ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ。

【0107】

本発明の抗ＣＤ１３７抗体又はその抗原結合フラグメントは、＜本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体＞等の本明細書中の記載を参照して、当業者であれば作製し得る。本発明の抗ＣＤ１３７抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、がんの治療において使用される、任意のＴＡＡに対する抗体（抗ＴＡＡ抗体）との二重特異性抗体に使用されうる。すなわち、本発明はまた、本発明の抗ＣＤ１３７抗体又はその抗原結合フラグメント及び抗ＴＡＡ抗体又はその抗原結合フラグメントを含む二重特異性抗体（「本発明の抗ＴＡＡ－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体」とも称する）を提供する。ＴＡＡとしては、腫瘍の細胞表面に発現している限りにおいて特に限定されないが、例えばＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ＢＣＭＡ、ＰＳＭＡ，ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＧＰＣ２、ＧＰＣ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＷＴ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６、ＣＬＤＮ１８．２、ＴＳＰＡＮ８が使用されうる。１つの実施形態において、本発明の抗ＴＡＡ－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、抗ＣＤ１３７抗体のｓｃＦｖを含む、１つの実施形態において、本発明の抗ＴＡＡ－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、以下の（ａ）～（ｅ）のいずれかである抗ＣＤ１３７抗体のｓｃＦｖを含む；
（ａ）配列番号２６のアミノ酸番号１から２４２までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｂ）配列番号２８のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｃ）配列番号３０のアミノ酸番号１から２４９までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；
（ｄ）配列番号３２のアミノ酸番号１から２４４までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ；又は
（ｅ）配列番号３４のアミノ酸番号１から２４７までのアミノ酸配列からなる抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ。

【0108】

１つの実施形態において、本発明の抗ＴＡＡ－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は抗ＣＬＤＮ４抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、１つの実施形態において、本発明の抗ＴＡＡ－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体はＩｇＧ型の抗ＣＬＤＮ４抗体を含む。

【0109】

本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。

【実施例】

【0110】

［実施例１：腹膜播種がん細胞に発現する抗原に選択的に結合する抗体の取得］
［１－１．患者由来の腹膜播種がん細胞の取得］
患者からの腹膜播種がん細胞の取得は、千脇史子、佐々木博己による文献「腹膜転移がん（胃、膵、卵巣がんなど）細胞株の樹立」（佐々木博己編『患者由来がんモデルを用いたがん研究実践ガイド』羊土社、２０１９年、p.２８-３７）に記載の方法に準じて行った。
患者より採取した腹水を室温、４３０×ｇで３分間遠心し、上清を除去した後に、沈殿に溶血緩衝液を添加して溶血させた。遠心後に上清を除去し、ダルベッコＰＢＳ（－）（日水製薬社、０５９１３、以下「ＰＢＳ（－）と称する」）を５０ｍＬ加えて細胞を洗浄した。その後、室温、４３０×ｇで３分間遠心して細胞を回収した。回収した腹水中の全細胞を１０％ ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１０２７０?１０６）、×１ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１５２４００６２）を含むＲＰＭＩ－１６４０（Ｌ－グルタミン含有）培地（富士フイルム和光純薬社、１８９－０２０２５）、（以下、実施例１においてＦＢＳ等を添加後の培地を「ＲＰＭＩ－１６４０培地」と称す）に再懸濁した。懸濁液を希釈し、１００ｍｍコラーゲンコートディッシュ（以下「ディッシュ」と称する）（ＩＷＡＫＩ社、４０２０－０１０）に細胞を５×１０^６～１×１０^７個／１０ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターで培養した。
腹水中の細胞には、接着系細胞と浮遊系細胞が存在し、接着系細胞にはがん細胞だけでなくがん細胞以外の細胞（線維芽細胞、腹膜中皮細胞等）も含まれている。がん細胞以外の細胞はがん細胞より短時間で剥離する性質を有するため、これらの細胞を腹水中の全細胞より分離して除去した。がん細胞以外の細胞を除いた後、がん細胞がディッシュ面積の８０％コンフルエント程度まで増殖した後に、全細胞の１／２を新しいディッシュへ継代する作業を繰り返し、５回以上継代したものを接着系がん細胞とした。浮遊系細胞については、培養ディッシュより培養上清５ｍＬとＲＰＭＩ－１６４０培地５ｍｌを新しい１００ｍｍディッシュへ播種して継代し、５回以上継代したものを浮遊系がん細胞とした。１人の患者に由来する腹膜播種がん細胞が接着系がん細胞と浮遊系がん細胞の両方を含んだまま増殖する場合は、それらを混合系がん細胞とした。
本明細書において、上記方法にて単離した接着系がん細胞、浮遊系がん細胞又は混合系がん細胞を総称して「腹膜播種がん細胞」と称する。取得した６細胞（ＮＳＣ－９Ｃ、ＮＳＣ－１５ＣＦ、ＮＳＣ－１６Ｃ、ＮＳＣ－２０Ｃ、ＮＳＣ－２２Ｃ、ＮＳＣ－３２Ｃ、（以下「６種の腹膜播種がん細胞」とも称する））を以後の検討に用いた。

【0111】

［１－２：抗胃がん抗原抗体産生ハイブリドーマの作製］
ヒ卜モノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標） ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（米国特許６５９６５４１号））を用いて作製されたベロシミューンマウスに腹膜播種がん細胞を免疫して抗腹膜播種がん細胞に発現するがん抗原に対する抗体を取得した。
実施例１－１にて取得した腹膜播種がん細胞のうちＮＳＣ－９Ｃ、ＮＳＣ－１５ＣＦ、ＮＳＣ－１６Ｃの３細胞又はＮＳＣ－２０Ｃ、ＮＳＣ－２２Ｃ、ＮＳＣ－３２Ｃの３細胞を混合し、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ ＡＤＪＵＶＡＮＴ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｔ２６８４）又はＰＢＳ（－）に懸濁し、腹膜播種がん細胞懸濁液を調製した。この懸濁液をベロシミューンマウスに数回投与して免疫を行った。常法に従い、免疫したマウスのリンパ節からリンパ球を回収し、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５８１）と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。自動ピッキング装置にてハイブリドーマの単コロニーを単離し、モノクローン化ハイブリドーマ細胞（以下「クローン」と称する）を取得した。単離したクローンを３７℃、８％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養し、約１４日後の上清を９６ウェルプレートに回収し、以下の実験に用いた。

【0112】

［１－３：腹膜播種がん細胞に選択的に結合する抗体の選別］
（１）腹膜播種がん細胞及びＥｐＣＡＭ発現細胞への結合確認
実施例１－２にて得られたクローンの細胞上清には抗体（以下「クローン上清に含まれる抗体」と称する）が含まれている。
まず、クローン上清に含まれる抗体と実施例１－１で取得した６種の腹膜播種がん細胞との結合をフローサイトメトリー法にて測定し、腹膜播種がん細胞に強く結合する抗体を産生するクローンを選抜した。フローサイトメトリーにはＢＶ４２１ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ（Ｂｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、５６３８４６）を用いた。
また、がん抗原であるＥｐＣＡＭに結合する抗体を提供するクローンを除外するために、クローン上清に含まれる抗体とヒトＥｐＣＡＭ－Ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞との結合を測定した。ヒトＥｐＣＡＭ－Ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＥＰＣＡＭ（Ｍｙｃ－ＤＤＫ－ｔａｇｇｅｄ）－Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥＰＣＡＭ）（ＯＲＩＧＥＮＥ社、ＲＣ２０１９８９）をＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）にトランスフェクションすることにより作製した。当該細胞とクローン上清に含まれる抗体の結合をフローサイトメトリー法にて測定した。フローサイトメトリーには、ＢＶ４２１ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇを用いた。ＥｐＣＡＭ発現細胞に結合活性を示さない上清を提供するクローンを選択するために、当該細胞に結合するクローンを除外した。陽性コントロールとして、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ） Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１Ｂ７），（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、１４－９３２６）を使用した。
さらに、腹膜播種がん細胞に選択的に結合するクローンを選抜するために、培養ヒト腹膜中皮細胞に結合するクローンを除外した。培養ヒト腹膜中皮細胞としてＨｕｍａｎ Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｚｅｎｂｉｏ社、ＭＥＳ－Ｆ、Ｌｏｔ．ＭＥＳＭ０５０３１１Ａ）（以下「培養ヒト腹膜中皮細胞」とも称する）を用い、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｚｅｎｂｉｏ社、ＭＳＯ－１）にて培養した培養ヒト腹膜中皮細胞とクローンとの結合の測定にはフローサイトメ卜リ一法を用いた。フローサイトメ卜リ一法には、ＢＶ４２１ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇを用いた。培養ヒト腹膜中皮細胞に結合しないクローンのみを選別した。
上記実験により、６種の腹膜播種がん細胞中の５種以上に結合し、且つ、ヒトＥｐＣＡＭ及び培養腹膜中皮細胞には結合しない抗体を提供するクローンとして３Ｄ１１クローンを取得した。

【0113】

（２）ハイブリドーマ上清からの抗体精製
３Ｄ１１クローンをＣＤハイブリドーマメディウム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１１２７９０２３）で培養した。培養上清から、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社、１７－５４３８－０２）を用いて、３Ｄ１１抗体を精製した（以下「３Ｄ１１」と称する）。抗体の精製は常法に従った。

【0114】

［１－４：３Ｄ１１が認識する抗原分子の同定］
（１）ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定による抗原候補分子の同定
３Ｄ１１の抗原候補分子の同定を行った。本実験におけるコントロール抗体として、１Ｄ１０、１０Ｂ５を使用した。これらの抗体は、３Ｄ１１を取得する過程にて３Ｄ１１と異なる腹膜播種がん細胞への結合パターンを示した。
ＮＳＣ－１５ＣＦの細胞破砕液を作製した。細胞破砕液に、３Ｄ１１及びコントロール抗体２種（１Ｄ１０、１０Ｂ５）のうちのいずれか１抗体を添加し、さらにＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１０００３Ｄ）を加えて攪拌及び洗浄を行った。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇに結合したタンパク質をＴｒｙｐｓｉｎ／ＬｙｓＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｖ５０７２）を用いて消化し、ペプチド混合物を得た。ペプチド混合物を含む溶液をＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ＲＳＬＣｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）及びＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いたＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定に供した。得られたＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータについて、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ＱＩ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（Ｗａｔｅｒｓ社）及びＭａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ社）ソフトを用いて比較定量解析及びペプチド／タンパク質同定を行い、結合タンパク質を同定した。３Ｄ１１とコントロール抗体の結合タンパク質を比較し、３Ｄ１１の抗原候補分子としてＣＬＤＮ４を同定した。

【0115】

（２）３Ｄ１１の抗原決定
（１）にて同定したＣＬＤＮ４が３Ｄ１１の抗原であるかどうかを決定するために、ヒトＣＬＤＮ４－Ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞に対する結合実験を行った。ヒトＣＬＤＮ４－Ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞にＣＬＤＮ４（Ｍｙｃ－ＤＤＫ－ｔａｇｇｅｄ）－Ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ ４ （ＣＬＤＮ４）（ＯＲＩＧＥＮＥ社、ＲＣ２００４９０）をトランスフェクションすることにより作製した。結果、３Ｄ１１はヒトＣＬＤＮ４－Ｍｙｃ－ＤＤＫ発現ＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合したため、ＣＬＤＮ４を抗原として認識することが確認された。

【0116】

［実施例２：３Ｄ１１の配列決定及びヒト抗体の作製］
常法に従い３Ｄ１１の重鎖及び軽鎖をコ一ドする遺伝子をクロ一ニングし、３Ｄ１１の塩基配列及びアミノ酸配列を決定した。３Ｄ１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号２に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号４に示す。ベロシミュ一ンマウスにより作製される抗体は内因性の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域が対応するヒ卜可変領域で置換された抗体である。すなわち、ベロシミュ一ン技術を用いて得られた抗体は、ヒ卜抗体の可変領域とマウス抗体の定常領域を有する抗体（「キメラ抗体」とも称する）である。

【0117】

［参考例：がん腹膜播種治療に用いる抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ３二重特異性抗体］
がん細胞に選択的に発現するＴＡＡに対する治療薬として、抗体、抗体－薬物複合体（ＡＤＣ）抗体、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ（ＣＡＲ－Ｔ）等の様々な種類の薬剤が知られている。その中でも低い抗体濃度でがん細胞選択的な細胞傷害活性を得ることができる画期的な方法として、二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体（Ｔ－ｃｅｌｌ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が知られている。そこで、３Ｄ１１を用いた二重特異性Ｔ細胞リクルート抗体の作製を検討した。

【0118】

（１）ヒト化抗ＣＬＤＮ４抗体の作製
ヒト型抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体の作製を以下の方法で行った。
ヒト型抗ＣＬＤＮ４抗体部分は、常法に従い３Ｄ１１の重鎖可変領域にヒト重鎖のＩｇＧ１の定常領域を、軽鎖可変領域にヒト軽鎖κ鎖の定常領域をそれぞれ連結して設計した。更に重鎖のアミノ酸番号２３８及び２３９（ＥＵインデックス：２３４及び２３５）のアミノ酸をそれぞれロイシン（Ｌ）からアラニン（Ａ）に置換したＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ）、アミノ酸番号３７０、３７２及び４１１（ＥＵインデックス：３６６、３６８及び４０７）のアミノ酸をそれぞれトレオニン（Ｔ）からセリン（Ｓ）、ＬからＡ、チロシン（Ｙ）からバリン（Ｖ）に置換するノブズ・イントゥー・ホールズ（Ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）変異、並びに、アミノ酸番号３０１（ＥＵインデックス：２９７）のアミノ酸をアスパラギン（Ｎ）からＡに置換する変異を導入した。作製したヒト化抗ＣＬＤＮ４抗体を３Ｄ１１．１と称する。３Ｄ１１．１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを常法に従って合成し、ｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に挿入した。

【0119】

（２）抗ＣＤ３ｓｃＦｖの作製
抗ＣＤ３ｓｃＦｖ部分は、日本特許第５６８６９５３号に記載のマウス抗ＣＤ３抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列に基づき作製した。抗ＣＤ３ｓｃＦｖのヒト化は、文献（Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．、２００８、Ｖｏｌ．１３、ｐ．１６１９－１６３３）記載の方法に準じて行った。この際に、バックミューテーションを導入した。立体構造情報（ＰＤＢ Ｃｏｄｅ：５ＦＣＳ）をＭＯＬＳＩＳ Ｉｎｃ．社が提供する統合計算化学システムＭＯＥで解析して、フレームワーク領域内のバックミューテーション導入位置を決定した。ヒト化抗ＣＤ３ｓｃＦｖのアミノ酸配列を配列番号４１に示す。配列番号４１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを常法に従って合成し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 、Ｖ７９０２０）に挿入した。

【0120】

（３）抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体の作製
３Ｄ１１．1と抗ＣＤ３ｓｃＦｖをコードするベクターを用いて、ＰＣＴ／ＪＰ２０２１／４１８３９の実施例７に記載の方法に準じて、抗ＣＬＤＮ４抗体のＦａｂ領域と抗ＣＤ３抗体のｓｃＦｖ領域とＦｃ領域により構成される二重特異性抗体を作製した。作製した二重特異性抗体を、抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体と称する。

【0121】

（４）抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体の薬効評価
抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ（ＲＴＣＣ）活性をＰＣＴ／ＪＰ２０２１／４１８３９の実施例９に記載の方法に準じて測定した。抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体がＲＴＣＣ活性を有することを確認した。またＰＣＴ／ＪＰ２０２１／４１８３９の実施例１１に記載の方法に準じて抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏにおける抗腫瘍活性を評価した。抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体は胃がん腹膜播種ｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおいて抗腫瘍効果を示した。これらの結果より、抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体はがんの治療に有効であることが示唆された。
さらに、抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体の安全性について検討をするため、カニクイザルの静脈内に抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体を単回投与した。結果、抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体を投与したサルにおいて死亡例及び瀕死例が確認された。死亡したサルにおいては投与１時間後及び６時間後、瀕死のサルにおいては投与１時間後、６時間後及び２４時間後において血中のＩＬ－６量が著しく増加していた。これらの結果より、抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体はｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて薬効を発揮する一方で、サイトカインの増加によると思われる重篤な副作用の懸念が生じた。よって、抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体は、ヒトのがんの治療に用いる抗体としては不適格であると判断した。

【0122】

［実施例３：抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体の作製］
３Ｄ１１を用いて抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖとの二重特異性抗体（以下「抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体」と称する）を作製し、検討を実施した。

【0123】

［３－１．抗ＣＤ１３７抗体の取得］
（１）ＣＤ１３７―Ｆｃ融合タンパク質の作製
配列番号４２のアミノ酸番号１から１８６までのアミノ酸配列からなるヒトＣＤ１３７細胞外領域又は配列番号４３のアミノ酸番号１から１８６までのアミノ酸配列からなるサルＣＤ１３７細胞外領域をコードするポリヌクレオチドを、それぞれｐＦＵＳＥ－ｈＩｇＧ１－Ｆｃ１ベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、ｐｆｕｓｅ－ｈｇ１ｆｃ１）に挿入し、ＣＤ１３７の細胞外領域とヒトＦｃとの融合タンパク質（以下それぞれ、「ヒトＣＤ１３７－ヒトＦｃ融合タンパク質」及び「サルＣＤ１３７－ヒトＦｃ融合タンパク質」と称する）をコードする発現用ベクターを作製した。作製したベクターをＥｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ１４６３５）又はＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ２９１３３）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ１４５２７）又はＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ２９１３３）に導入し、培養を行った。培養上清中に分泌したタンパク質をＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ又はＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア社、１１－００３４－９４）を用いて精製し、ヒトＣＤ１３７－ヒトＦｃ融合タンパク質及びサルＣＤ１３７－ヒトＦｃ融合タンパク質を取得した。

【0124】

（２）サルＣＤ１３７－Ｈｉｓタグ－３×ＦＬＡＧタグ融合タンパク質の作製
配列番号４３のアミノ酸番号１から１８３までのアミノ酸配列からなるサルＣＤ１３７細胞外領域、配列番号４４のＨｉｓタグ、及び配列番号４５の３×ＦＬＡＧタグをコードするポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクターにタンデムに挿入してベクターを作製した。作製したベクターを、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ２９１２９）を用いてＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞に導入し、培養を行った。培養上清中に分泌したタンパク質をＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社、１７－３７１２－０６）を用いて精製した。得られた融合タンパク質を「サルＣＤ１３７－Ｈｉｓタグ－３×ＦＬＡＧタグ融合タンパク質」と称する。

【0125】

（３）抗ＣＤ１３７抗体産生ハイブリドーマクローンの作製及びスクリーニング
ベロシミューンマウス、又はＡｌｉｖａＭａｂマウス（Ａｂｌｅｘｉｓ社、米国特許９３４６８７３号）に、ヒトＣＤ１３７－ヒトＦｃ融合タンパク質又はヒトＣＤ１３７－Ｈｉｓタグタンパク質（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ社、９２２０－４Ｂ）と免疫アジュバントを数回投与して免疫を行った。常法に従い、免疫したマウスのリンパ節からリンパ球を回収し、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。自動ピッキング装置にてハイブリドーマの単コロニーを単離し、モノクローン化ハイブリドーマ細胞（以下「クローン」と称する）を取得した。各クローンを数日間培養し、培養上清を得た。培養上清に含まれる抗体のＣＤ１３７に対する結合の確認を以下の方法で行った。
ＣＤ１３７に対する結合は、ＥＬＩＳＡ法にて評価した。評価には、ヒトＣＤ１３７－Ｈｉｓタグタンパク質、ヒトＣＤ１３７－ヒトＦｃ融合タンパク質、サルＣＤ１３７－ヒトＦｃ融合タンパク質又はヒトＦｃタンパク質のいずれかでコーティングしたプレートを用い、二次抗体にはＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｈｕｍａｎ ａｄｓ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、１０３０－０５）を用いた。上記方法によりヒトＣＤ１３７及びサルＣＤ１３７のいずれにも結合するクローンを複数取得した。

【0126】

（４）抗ＣＤ１３７抗体の取得とアゴニスト活性の確認
（３）で取得したクローンをＨｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１２０４５－０７６）で培養し、培養上清からＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅを用いて抗ＣＤ１３７抗体を精製した。精製した抗ＣＤ１３７抗体について、ＣＤ１３７への結合及びＣＤ１３７アゴニスト活性の確認を行った。
抗ＣＤ１３７抗体のＣＤ１３７への結合の確認は、（３）に記載したＥＬＩＳＡ法を用いて行った。抗ＣＤ１３７抗体のＣＤ１３７アゴニスト活性の測定は、４－１ＢＢ Ｂｉｏａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＪＡ２３５１）を用いて、以下の方法で行った。ＦｃγＲＩＩｂ ＣＨＯ－Ｋ１ Ｃｅｌｌｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＪＡ２２５１）を３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社、７８１０８０）に播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２で終夜培養した。培養上清を除去し、前述の各クローンの精製抗体と４－１ＢＢ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＪＡ２３５１）を加えて、３７℃、５％ ＣＯ_２で６時間静置した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＪＡ２３５１）を加え、ＣＤ１３７アゴニスト活性に応答するルシフェラーゼの発現誘導による化学発光を測定した。ＦｃγＲＩＩｂ ＣＨＯ－Ｋ１ Ｃｅｌｌｓの非存在下におけるＣＤ１３７アゴニスト活性を評価するために、ＦｃγＲＩＩｂ ＣＨＯ－Ｋ１ Ｃｅｌｌｓ非含有条件にて上記と同様の実験を行った。
評価を行った抗ＣＤ１３７抗体のうち、ベロシミューンマウス由来の３－３４、並びにＡｌｉｖａＭａｂマウス由来のＡ２－３２、Ａ２－４８及びＡ２－７３がヒト及びサルＣＤ１３７への強い結合活性を有し、且つＦｃγＲＩＩｂ ＣＨＯ－Ｋ１ Ｃｅｌｌｓの存在に依存したＣＤ１３７アゴニスト活性を示した。

【0127】

（５）抗ＣＤ１３７抗体の遺伝子配列の同定
常法に従い、抗ＣＤ１３７抗体（３－３４、Ａ２－３２、Ａ２－４８、Ａ２－７３）を提供するクローンから細胞溶解液を調製してｃＤＮＡを合成し、抗体塩基配列を同定した。同定した塩基配列の配列番号を表１に示す。

【表1】

【0128】

［３－２．抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７（３－３４）ｓｃＦｖ二重特異性抗体の作製］
３Ｄ１１及び３－３４の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列に基づき、抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７（３－３４）ｓｃＦｖ二重特異性抗体（以下「３Ｄ１１＿３－３４－ｊ６＿Ｓ」とも称する）の設計を行った。作製した３Ｄ１１＿３－３４－ｊ６＿Ｓは、ヒトＩｇＧ１κ型の抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）抗体の重鎖カルボキシ末端（「Ｃ末端」とも称する）にＧＳリンカーが連結されており、ＧＳリンカーのＣ末端に抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７（３－３４）ｓｃＦｖ（配列番号２６）のアミノ末端が結合している。さらに、３Ｄ１１のヒトＩｇＧ１定常領域にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を導入した。設計した抗体をコードするポリヌクレオチドを作製し、常法に従いｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクターに挿入した。前記発現ベクターをＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞に遺伝子導入し、培養上清から３Ｄ１１＿３－３４－ｊ６＿Ｓを精製した。作製した３Ｄ１１＿３－３４－ｊ６＿Ｓは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて抗ＣＤ１３７結合活性及びＣＤ１３７アゴニスト作用を有することが確かめられ、がん治療薬としての有効性が期待できることが示唆された。

【0129】

［実施例４：抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体の作製］
［４－１．ヒト化抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）抗体の作製］
抗ＣＬＤＮ４抗体であるＫＭ３９００は他のクローディンファミリー分子であるＣＬＤＮ６等に比べてＣＬＤＮ４に選択的に結合することが報告されている（特許文献１）。そこで、報告に基づきＫＭ３９００のヒト化抗体の作製を行った。具体的には、ＫＭ３９００の可変領域のヒト化アミノ酸配列に基づき、ヒトＩｇγ１の定常領域及びヒトＩｇκの定常領域の配列からヒト化抗体の設計を行なった。ヒトＩｇγ１定常領域には、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｇのアミノ酸変異、又は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を導入した。常法に従ってヒト化抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）抗体を作製し、以後の検討に使用した。Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｇのアミノ酸変異を有する抗体を「ｈＫＭ３９００」と、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を有する抗体を「ｈＫＭ３９００＿Ｓ」と称する。ｈＫＭ３９００の重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号６に、軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号８に記載する。

【0130】

［４－２．抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体の作製］
実施例３にて取得した抗ＣＤ１３７抗体（３－３４、Ａ２－３２、Ａ２－４８、Ａ２－７３）から抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖを設計し、ｈＫＭ３９００と抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖとの二重特異性抗体の作製を行った（表２）。作製した抗体を総称して「抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ」と称する。

【0131】

（１）抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体をコードするベクターの作製
抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体を、ｈＫＭ３９００の配列及び抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列に基づき設計した。抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体は、ＩｇＧ１型の抗ＣＬＤＮ４抗体（ｈＫＭ３９００）の重鎖又は軽鎖Ｃ末端にＧＳリンカーが連結されており、ＧＳリンカーのＣ末端に抗ＣＤ１３７抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖのアミノ末端が結合している。さらに、ｈＫＭ３９００のヒトＩｇＧ１定常領域にＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３３１Ｇ又はＰ３３１Ｓのアミノ酸変異を導入した。設計した抗体の情報を表２に記載する。設計した抗体をコードするポリヌクレオチドを作製し、常法に従いｐｃＤＮＡ３．４ ＴＯＰＯベクターへ挿入した。作製したベクターを総称して、「抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体発現ベクター」と称する。

【0132】

【表2】

【0133】

（２）抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体の作製
抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体発現ベクターを用いて、表２に記載の１１種の抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体を作製した。具体的には、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞に抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体発現ベクターを導入し、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体を培養上清中に分泌させた。得られた培養上清からＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅを用いたアフィニティ精製法により抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体を精製した。更に、一部の抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体はＨｉＬｏａｄ ２６／６００ ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ（ＧＥヘルスケア社、２８－９８９３－３６）又はＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬ（ＧＥヘルスケア社、２８－９９０９－４４）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー精製法による追加の精製を行った。
以後、実施例３及び４にて作製した抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７（３－３４）ｓｃＦｖ二重特異性抗体及び抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体を総称して「抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体」と称することもある。

【0134】

［実施例５：抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体の結合活性及びアゴニスト活性評価］
抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＣＬＤＮ４及びＣＤ１３７に対する結合活性、並びにＣＤ１３７アゴニスト活性を評価した。

【0135】

［５－１．フローサイトメトリー法による抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＣＬＤＮ４に対する結合活性評価］
抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＣＬＤＮ４への結合活性を、フローサイトメトリー法を用いて評価した。ＣＬＤＮ４（Ｍｙｃ－ＤＤＫ－ｔａｇｇｅｄ）－Ｈｕｍａｎ ｃｌａｕｄｉｎ ４から調製したＣＬＤＮ４遺伝子をｐＣＭＶ６－ＡＣ－ＧＦＰ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ（ＯＲＩＧＥＮＥ社、ＰＳ１０００１０）に挿入し、ヒトＣＬＤＮ４の発現ベクターを作製した。ヒトＣＬＤＮ４の発現ベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞に導入し、ヒトＣＬＤＮ４発現ＣＨＯ－Ｋ１を取得した。
被験抗体として、ｈＫＭ３９００及び２種類の抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体（ｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨ及びｈＫＭ３９００＿３－３４－ｊ６）を用いた。被験抗体をＳｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＦＢＳ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、５５４６５６）で最高濃度１００μｇ／ｍＬから５．０８ｎｇ／ｍＬまで公比３倍で段階希釈し、それぞれの被験抗体希釈液でヒトＣＬＤＮ４発現ＣＨＯ－Ｋ１を染色した。二次抗体として、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ （ＡＰＣ） ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ， Ｆｃγ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９－１３６－１７０）を用いた。ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で蛍光強度を測定した。測定結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて解析し、ヒトＣＬＤＮ４と抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体の見かけの解離定数（ＫＤ）を算出した。表３に見かけのＫＤの値を示す。
２種類の抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体は、ヒト化抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）抗体と同様のヒトＣＬＤＮ４への結合活性を示した。他の抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体も同等のＣＬＤＮ４結合活性を示すと考えられる。

【0136】

【表3】

【0137】

［５－２．ＥＬＩＳＡ法による抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＣＤ１３７に対する結合活性評価］
抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＣＤ１３７への結合活性を、ＥＬＩＳＡ法を用いて検出した。ＥＬＩＳＡは、常法に従い行った。２０ｎｇ／２０μＬ／ｗｅｌｌのヒトＣＤ１３７－Ｈｉｓタグタンパク質（Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ、９２２０－４Ｂ）を３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、４６４７１８）に固相化した。被験抗体として表２に記載の１１種の抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体及びｃｔｒｌ ＩｇＧ＿Ｌ－３－３４－ｊ６抗体を用いた。ｃｔｒｌ ＩｇＧ＿Ｌ－３－３４－ｊ６抗体はアイソタイプコントロール抗体の軽鎖カルボキシ末端に抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ（３－３４－ｊ６）抗体を連結した抗体である。被験抗体を５％ブロッキングワン（ナカライテスク社、０３９５３－９５）含有ＴＢＳ－Ｔ（ニッポンジーン社、３１０－０７３７５）で段階希釈し、２０μＬ／ｗｅｌｌ添加した。抗体の終濃度は図１－１～１－４に示す通りである。二次抗体にはＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ， Ｍｕｌｔｉ－Ｓｐｅｃｉｅｓ ＳＰ ａｄｓ－ＨＲＰ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、２０１４－０５）を用いた。コントロール抗体にはｈＫＭ３９００を用いた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ＰＲＯ（ＴＥＣＡＮ社）を用いて４５０ｎｍと５７０ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１－１～１－４に示す。抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体はいずれも濃度依存的にヒトＣＤ１３７－Ｈｉｓタグタンパク質に結合した。この結果より、抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖの連結位置はヒトＣＤ１３７への結合活性に影響を及ぼさないことが明らかとなった。

【0138】

［５－３．表面プラズモン共鳴法による抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＣＤ１３７に対する結合活性評価］
抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＣＤ１３７への結合活性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いて検出した。ＳＰＲ解析には、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いた。リガンドとして２種の抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体（ｈＫＭ３９００－３－３４－ｊ６、ｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨ）をＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ（ＧＥヘルスケア社、２９－１２７５－５６）に固定したものを使用した。アナライトとしてヒトＣＤ１３７－Ｈｉｓタグ又は３－１（２）で作製したサルＣＤ１３７－Ｈｉｓタグ－３×ＦＬＡＧタグ融合タンパク質をＨＢＳ－ＥＰ＋を用いて最高濃度２００ｎＭから０．０９７７ｎＭまで公比２倍で段階希釈したものを用いた。アナライトをリガンドが結合している流路に５０μＬ／分にて２分間添加した後、ＨＢＳ－ＥＰ＋を５０μＬ／分にて１０分間添加することにより、抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＣＤ１３７への結合と解離を測定した。この実験により得られた結果を用いてヒトＣＤ１３７と抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体との結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を、データ解析ソフトウェア（ＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）を用いて計算した。表４にｋａ、ｋｄ及びＫＤの値を示す。
この結果、抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体はヒトＣＤ１３７及びサルＣＤ１３７抗体のいずれにも同等の結合活性を示すことが明らかとなった。

【0139】

【表4】

【0140】

［５－４．抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＣＬＤＮ４発現がん細胞の共存下でのＣＤ１３７アゴニスト活性の評価］
抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＣＬＤＮ４発現がん細胞を介した特異的なＣＤ１３７アゴニスト活性を４－１ＢＢ Ｂｉｏａｓｓａｙキットを用いて評価した。
１０％ＦＢＳ（Ｃｙｔｉｖａ社、ＳＨ３００７０．０３）含有ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１１８７５－０９３）にＮＣＩ－Ｈ３２２細胞（ＥＣＡＣＣ、９５１１１７３４）を懸濁し、懸濁液を調製した。ＮＣＩ－Ｈ３２２はＣＬＤＮ４を発現している。３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社、７８１０８０）にＮＣＩ－Ｈ３２２の懸濁液を１×１０^４個／ｗｅｌｌとなるように添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２で終夜培養した。翌日、培地を除去した。１％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０培地で希釈した被験抗体を１２．５μＬ／ｗｅｌｌずつ添加した。抗体の終濃度は図２－１～図２－３に示す通り。被験抗体には、３Ｄ１１＿３－３４－ｊ６＿Ｓ、表２に記載の抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体を用いた。コントロール抗体として、ｈＫＭ３９００、ｃｔｒｌ ＩｇＧ＿Ｌ－３－３４－ｊ６抗体及びウレルマブ（ＢＭＳ、国際公開番号２００５／０３５５８４号に記載される配列番号３及び配列番号６）を用いた。
４－１ＢＢ Ｂｉｏａｓｓａｙキットに付属されている４－１ＢＢ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓのバイアル１本につき７ｍＬの１％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ－１６４０に懸濁し、各ウェルに１２．５μＬずつ加えて、３７℃、５％ ＣＯ_２で６時間静置した。プレートにＢｉｏ－Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔを２５μＬ／ｗｅｌｌ加え、ＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて化学発光を測定した。結果を図２－１～図２－３に示す。抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体は、ＣＬＤＮ４発現がん細胞の共存下にて４－１ＢＢ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｃｅｌｌｓに対する顕著なＣＤ１３７アゴニスト活性を示した。
ＣＬＤＮ４発現がん細胞の非存在下におけるＣＤ１３７アゴニスト活性を評価するために、ＮＣＩ－Ｈ３２２非存在条件にて上記と同様の実験を行った。結果、ＣＬＤＮ４発現がん細胞の非存在下ではＣＤ１３７アゴニスト活性を示さなかった（図２－４～図２－６）。この結果より、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体はＣＬＤＮ４発現がん細胞が共存する場合にのみＣＤ１３７アゴニスト作用を発揮することが示された。
一方、ウレルマブはＣＬＤＮ４発現がん細胞の共存下でＣＤ１３７アゴニスト活性を示したものの、その作用は抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体に比べると弱かった。また、ウレルマブはＣＬＤＮ４発現がん細胞の非存在下でもＣＤ１３７アゴニスト活性を示した。
これらの結果より、抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体はウレルマブより毒性の懸念が低く、ＣＬＤＮ４が高発現している腫瘍組織で特異的かつ強力なＣＤ１３７アゴニスト作用を示すと期待できる。

【0141】

［実施例６：抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ薬効評価］
抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のインターフェロン－γ産生促進機能及びがん細胞傷害活性の評価を実施した。

【0142】

［６－１．Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の作製及び凍結保存］
（１）Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の調製
実施例６において、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ社、Ｒ８７５８）に終濃度１０％のＦＢＳ（Ｃｙｔｉｖａ社、ＳＨ３００８４．０３）と、終濃度１％のペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１５０７０－０６３）を加えたものを「培養培地」と称する。培養培地にはそれぞれ終濃度１％でＭＥＭ Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｍ７１４５）、Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｓ８６３６）、ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、３５０５０－０６１）、ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１５６３０－０８０）を加える場合もある。終濃度１－３μｇ／ｍＬとなるように希釈した抗ＣＤ３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、３１７３２５）をディッシュに添加し、抗ＣＤ３抗体を固相化した。ＰａｎＴ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社、１３０－０９６－５３５）を用い、メーカー推奨プロトコルに従ってヒト末梢血単核細胞（ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）（ＬＯＮＺＡ社、ＣＣ－２７０２）からＰａｎＴ細胞（ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ８Ｔ細胞の両方を含む、以下「ＰａｎＴ細胞」と称す）を単離した。単離したＰａｎＴ細胞を遠心分離し、上清を取り除いた後に培養培地に懸濁した。前述の抗ＣＤ３抗体を固相化したディッシュに、培養培地に懸濁したＰａｎＴ細胞を全量播種した。更に終濃度１００－２００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社、２００－２）及び終濃度１－４μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社、３０２９２３）を添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養を行った。３日後に細胞を回収し、回収した細胞を培養培地に懸濁してディッシュに播種した。更に終濃度１００－２００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ－２を添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養を行った。４日後、細胞を全量回収して遠心分離し、上清を取り除いた後にセルバンカー（Ｔａｋａｒａ社、ＣＢ０１１）又はバンバンカー（ＧＳリンフォテック社、ＣＳ－０２－００１）に再懸濁し、チューブに分取して－８０℃で凍結保存した。ここで凍結保存した細胞を、本明細書において「Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞」と称する。

【0143】

［６－２．６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ発現細胞の作製］
Ｌｕｃ／ＧＦＰを含むレンチウイルス溶液の調製は、Ｌ２９３Ｔ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｋ４９７５－００）を用いて、常法に従って実施した。Ｌ２９３Ｔ細胞へのｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＧＬ３－ＥＦ１ａ－ＧＦＰ－Ｔ２Ａ－ｐｕｒｏ改変ベクター（広島大学 医系科学研究科 細胞分子生物学研究室 高橋陵宇准教授より寄贈（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、 ２０１５、Ｖｏｌ．１０、ｅ０１２３４０７））の導入には、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ，ＧｌｕｔａＭＡＸ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、５１９８５－０３４）、ＭＩＳＳＩＯＮ（登録商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（ＳＩＧＭＡ社、ＳＨＰ００１）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、１５３３８１００）を使用した。Ｌ２９３Ｔ細胞にて増殖したＧＦＰ発現レンチウイルスの回収には、４５μｍ Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＨＶフィルター（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＳＬＨＶ０３３ＲＳ）を使用した。ウイルス溶液はクライオバイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ社、５０００－００２０）に１ｍＬずつ分注し、－８０℃で凍結保存した。
常法に従い、６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ発現レンチウイルスをＣＬＤＮ４発現がん細胞株である６０Ａｓ６細胞（バイオマテリアル研究所柳原 五吉 先生より譲受）に感染させ、６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ発現細胞を作製した。感染効率を上げるためにＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、ｓｃ－１３４２２０）を用いた。培地として、１０％ＦＢＳ、２μｇ／ｍＬ Ｐｕｒｏｍａｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ａ－１１１３８－０２）含むＲＰＭＩ－１６４０を使用した。本明細書において、樹立した細胞を、「６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞」と称する。６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞は内因性にＣＬＤＮ４が高発現していることをフローサイトメトリー法により確認した。構築した細胞は後の実験で使用した。

【0144】

［６－３．抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のがん細胞とＴ細胞の共培養系におけるインターフェロン－γ産生促進機能評価］
６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の共培養系における抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のインターフェロン-γ産生促進機能を評価した。０．１μｇ／１００μＬ／ｗｅｌｌの抗ＣＤ３抗体を平底９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社、３８６０－０９６）に添加して抗ＣＤ３抗体をプレートに固相化した。プレートに６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を５×１０^４個／５０μＬ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。翌日、前記プレートに、２×１０^５個／３０μＬ／ｗｅｌｌのＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞を播種した。被験抗体及びアイソタイプコントロールを培養培地で最高濃度５００００ｎｇ／ｍＬから５倍公比で段階希釈し、２０μＬずつ添加した。被験抗体としてウレルマブ及び抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体（３Ｄ１１＿３－３４－ｊ６＿Ｓ）を、アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ（リゾチーム）－ｓｃＦｖ（ＣＤ１３７）（社内調製）を用いた。６日後、ＡｌｐｈａＬＩＳＡインターフェロン－γ測定キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、ＡＬ２１７Ｃ）を用いてメーカー推奨プロトコルに従い上清中のインターフェロン－γ産生量を測定した。図３－１にインターフェロン－γ産生量と抗体濃度の反応曲線を示す。抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体はＣＬＤＮ４発現がん細胞株である６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の共培養系においてインターフェロン－γ産生促進作用を示した。抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のインターフェロン－γ産生促進機能はウレルマブより顕著に強かった。

【0145】

［６－４．抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のがん細胞とＴ細胞の共培養系におけるインターフェロン－γ産生促進機能評価］
６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の共培養系における抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のインターフェロン-γ産生促進機能を６－３と同様の方法で評価した。抗ＣＤ３抗体は０．０３μｇ／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう９６ウェルプレートに固相化した。６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を２×１０^４個／５０μＬ／ｗｅｌｌで播種した。またＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞は８×１０^４個／３０μＬ／ｗｅｌｌで播種した。被験抗体として、最高濃度５０００ｎｇ／ｍＬから２倍公比で段階希釈したウレルマブ又は抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体（ｈＫＭ３９００＿３－３４－ｊ６又はｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨ）を使用した。被験抗体及びアイソタイプコントロール（リゾチーム抗体）をそれぞれ２０μＬずつ添加した。４日後に上清中のインターフェロン－γ産生量を測定した。図３－２にインターフェロン－γ産生量と抗体濃度の反応曲線を示す。抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体は６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の共培養系においてインターフェロン－γ産生促進機能を示した。これらの二重特異性抗体のインターフェロン－γ産生促進機能はウレルマブより顕著に強かった。

【0146】

［６－５．抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＴ細胞の単培養系におけるインターフェロン－γ産生促進機能評価］
Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の単培養系における抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のインターフェロン-γ産生促進機能を評価した。平底９６ウェルプレートに抗ＣＤ３抗体を０．１μｇ／１００μＬ／ｗｅｌｌで添加して抗ＣＤ３抗体をプレートに固相化した。固相化したプレートに２×１０^５個／８０μＬ／ｗｅｌｌのＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞を播種した。被験抗体として、ウレルマブ、抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ３ｓｃＦｖ二重特異性抗体（３Ｄ１１＿３－３４－ｊ６＿Ｓ）を、アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ（リゾチーム）－ｓｃＦｖ（ＣＤ１３７）（社内調製）を用いた。被験抗体及びアイソタイプコントロールを培養培地で最高濃度５００００ｎｇ／ｍＬから５倍公比で段階希釈し、２０μＬずつ添加した。６日後、ＡｌｐｈａＬＩＳＡインターフェロン－γ測定キットを用い、６－３．と同様の方法で上清中のインターフェロン－γ産生量を測定した。図３－３にインターフェロン－γ産生量と抗体濃度の反応曲線を示す。抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体は、Ｔ細胞の単培養系においてはインターフェロン－γ産生促進機能を示さなかったが、ウレルマブはインターフェロン－γ産生促進作用を示した。本結果は、ＣＬＤＮ４発現がん細胞株が存在しない環境では抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体はＴ細胞活性増強作用を示さないことを意味する。

【0147】

［６－６．抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のＴ細胞の単培養系におけるインターフェロン－γ産生促進機能評価］
Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の単培養系における抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のインターフェロン-γ産生促進機能を６－５と同様の方法にて評価した。抗ＣＤ３抗体は０．０３μｇ／１００μＬ／ｗｅｌｌとなるよう９６ウェルプレートに固相化した。Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞を８×１０^４個／８０μＬ／ｗｅｌｌ播種した。被験抗体としてウレルマブ、抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体（ｈＫＭ３９００＿３－３４－ｊ６、ｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨ）を用いた。被験抗体及びアイソタイプコントロール（リゾチーム抗体）は最高濃度５０００ｎｇ／ｍＬから２倍公比で段階希釈し、２０μＬずつ添加した。図３－４にインターフェロン－γ産生と抗体濃度の反応曲線を示す。抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体は、Ｔ細胞の単培養系においてはインターフェロン－γ産生促進機能を示さなかったが、ウレルマブはインターフェロン－γ産生促進機能を示した。
６－５及び６－６の結果より、ＣＬＤＮ４発現がん細胞株が存在しない環境では抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体はＴ細胞活性増強作用を示さないことを意味し、抗ＣＤ１３７抗体の副作用として報告されている全身的な免疫賦活化作用が低減される可能性を示唆する。

【0148】

［６－７．抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のがん細胞とＴ細胞の共培養系におけるがん細胞傷害活性評価］
６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の共培養系にて抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のがん細胞傷害活性（がん細胞の増殖抑制作用）を評価した。６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を平底９６ウェルプレートに１×１０^４個／５０μＬ／ｗｅｌｌずつ播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。２時間後、前記９６ウェルプレートにＥｘｐａｎｄｅｄ ｐａｎＴ細胞を１×１０⁵個／５０μＬ／ｗｅｌｌずつ播種した。被験抗体として、ウレルマブ及び抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体を用いた。これらの抗体を培養培地で最高濃度４００００ｎｇ／ｍＬから１０倍公比で段階希釈し、５０μＬずつ添加した。さらに、４０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体を５０μＬずつ添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーター内のＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）ＺＯＯＭ（ザルトリウス社）を用いて、各ウェルの蛍光（ＧＦＰ）面積の測定を開始した。測定開始０時間から増加した蛍光面積を細胞増殖の指標とした。図４に被験抗体のがん細胞傷害作用（がん細胞増殖率）を示す。図４の縦軸は、０時間から１６８時間に増加した蛍光面積において被験抗体非添加ウェルを１００％とした時の相対値を示す。図４に示す通り、抗ＣＬＤＮ４（３Ｄ１１）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体は６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の共培養系において細胞傷害作用を示した。本二重特異性抗体の細胞傷害活性はウレルマブより顕著に強かった。

【0149】

［６－８．抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のがん細胞とＴ細胞の共培養系におけるがん細胞傷害活性評価］
抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のがん細胞殺傷作用を６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の共培養系にて評価した。抗ＣＤ３抗体を平底９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、６００５６８０）に１ｎｇ／１００μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、プレートに固定化した。プレートをＰＢＳ（－）で２度洗浄した後に、２×１０^４個／５０μＬ／ｗｅｌｌの６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２インキュベーターにて培養した。翌日、９６ウェルプレートに、４．０×１０^４個／３０μＬ／ｗｅｌｌのＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞を播種した。さらに、５０００ｎｇ／ｍＬから０．８４４ｎｇ／ｍＬの濃度の被験抗体及びアイソタイプコントロールを２０μＬずつ添加した。被験抗体には、ウレルマブ及び抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体（ｈＫＭ３９００＿３－３４－ｊ６、ｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨ）を使用した。６日後に測定を行った。一部のウェルについて、細胞を殺傷するために、測定３０分前に１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔ－９２８４）を１１μＬずつ添加した。ＯＮＥ－Ｇｌｏルシフェラーゼ測定キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｅ６１２０）を用いてメーカー推奨プロトコルに従い、各ウェルの６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞のルシフェラーゼ活性をＡＲＶＯ Ｘ－３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて測定した。がん殺傷率は、抗体非添加ウェルのルシフェラーゼ化学発光の平均値を０％、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を添加したウェルの平均値を１００％としたときの相対値で示す。アイソタイプコントロールとして抗リゾチーム抗体（社内調製）を用いた。図５に６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の細胞殺傷率曲線を示す。６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞とＥｘｐａｎｄｅｄ ＰａｎＴ細胞の共培養系において抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体の添加により６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞殺傷率が顕著に増加した。一方で、抗ＣＤ１３７特異性抗体であるウレルマブによる６０Ａｓ６－Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞株に対する細胞殺傷率の増加はみられなかった。

【0150】

［実施例７：抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ評価］
［７－１．抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍効果］
ＮＣＩ－Ｈ３２２細胞をＰＢＳ（－）（ＷＡＫＯ社、０４５－２９７９５）に懸濁し、５．０×１０^６細胞/１００μＬの細胞懸濁液を７週齡の雌性マウス（ＮＯＧ、インビボサイエンス社）の皮下に植え付けた。植え付け６日後、３．４×１０^６細胞/２００μＬのヒト末梢血単核細胞（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－２７０２）を尾静脈から注入した。ヒト末梢血単核細胞移植１５日後に群分けを行い被験抗体の投与を開始した。一群は１０匹ずつとし、各群間の腫瘍体積がほぼ同等となるようにマウスを分配した（ｄａｙ０）。被験抗体としてｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨを用いた。被験抗体及びアイソタイプコントロール（抗リゾチーム抗体）はＰＢＳに混合して静脈内に投与した。投与はｄａｙ０、４及び８に行い、投与時に腫瘍径及び体重を測定した。腫瘍体積の算出には以下の式を用いた。
[腫瘍体積（ｍｍ^３）] = [腫瘍の長径（ｍｍ）] x [腫瘍の短径（ｍｍ）]^２ × ０．５
図６に示す通り、ｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨを０．１、１又は１０ｍｇ／ｋｇ投与した群においては、有意な腫瘍体積縮小作用が示された。縦軸は腫瘍体積を、横軸は初回投与後日数を示す。実線及び破線は各群の腫瘍体積の平均値の推移を、エラーバーは平均値の標準誤差を示す。有意確率Ｐ値（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊：Ｐ＜０．０１）は、ダネットの多重比較検定により、アイソタイプコントロール投与群とｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨ投与群の１２日目の腫瘍体積を比較することにより算出した。ｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨ０．１ｍｇ/ｋｇ投与群の１２日目の例数は９であった。

【0151】

［７－２．抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体のカニクイザルにおける安全性試験］
抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体（ｈＫＭ３９００＿３－３４－ｊ６及びｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨ）の安全性を検討するため、カニクイザルの静脈内に抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体を単回投与した。結果、抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体を投与したサルにおいて、血清中のＩＬ－６、ＴＮＦ－α等のサイトカイン濃度に特段の異常は確認されなかった。したがって、抗ＣＬＤＮ４（ｈＫＭ３９００）－抗ＣＤ１３７ｓｃＦｖ二重特異性抗体は、安全性の観点において、がんの治療に用いる抗体として適格であるとの判断を行った。

【0152】

［実施例８：抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体によるがんの治療］
［８－１．ＣＬＤＮ４の発現量の確認］
ＣＬＤＮ４のがん治療標的としての汎用性を調べるために、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）にて、がん組織におけるＣＬＤＮ４のＲＮＡの発現量を調査した。結果、大腸がん、膀胱がん、肺がん等のがん組織でＣＬＤＮ４の発現が亢進していることが確認された。これにより、ＣＬＤＮ４は腹膜播種がんのみならず他のがん種においても治療標的となる可能性が示唆された。さらにＴｈｅ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ－Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）にて、正常組織におけるＣＬＤＮ４のＲＮＡの発現量の調査を行った。結果、いくつかの正常組織においてＣＬＤＮ４が発現していることが認められた。しかしながら、正常組織においてはがん組織よりもＣＬＤＮ４の発現量が低かった。よって、ＣＬＤＮ４を治療標的とするがん治療薬は、広い安全域を確保することができ、副作用の懸念が低い治療薬となる可能性があることが示唆された。

【産業上の利用可能性】

【0153】

本発明の抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体は、がんの治療に有用であると期待される。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換された宿主細胞、及び抗体を生産する方法は、前記抗ＣＬＤＮ４－抗ＣＤ１３７二重特異性抗体を産生するために有用である。

【配列表フリーテキスト】

【0154】

以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号１は３Ｄ１１の重鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号２は３Ｄ１１の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号３は３Ｄ１１の軽鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号４は３Ｄ１１の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号５は、ｈＫＭ３９００の重鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号６は、ｈＫＭ３９００の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号７はｈＫＭ３９００の軽鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号８はｈＫＭ３９００の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号９は３－３４の重鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号１０は３－３４の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号１１は３－３４の軽鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号１２は３－３４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号１３はＡ２－３２の重鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号１４はＡ２－３２の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号１５はＡ２－３２の軽鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号１６はＡ２－３２の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号１７はＡ２－４８の重鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号１８はＡ２－４８の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号１９はＡ２－４８の軽鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号２０はＡ２－４８の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号２１はＡ２－７３の重鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号２２はＡ２－７３の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号２３はＡ２－７３の軽鎖可変領域の塩基配列であり、配列番号２４はＡ２－７３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。配列番号２５は３－３４－ｊ６ ｓｃＦｖの塩基配列であり、配列番号２６は３－３４－ｊ６ ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。配列番号２７はｔＡ２－３２ ｓｃＦｖの塩基配列であり、配列番号２８はｔＡ２－３２ ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。配列番号２９はｔＡ２－３２ＬＨ ｓｃＦｖの塩基配列であり、配列番号３０はｔＡ２－３２ＬＨ ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。配列番号３１はｔＡ２－４８ ｓｃＦｖの塩基配列であり、配列番号３２はｔＡ２－４８ ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。配列番号３３はｔＡ２－７３ ｓｃＦｖの塩基配列であり、配列番号３４はｔＡ２－７３ ｓｃＦｖのアミノ酸配列である。配列番号３５はｈＫＭ３９００＿３－３４－ｊ６の重鎖の塩基配列であり、配列番号３６はｈＫＭ３９００＿３－３４－ｊ６の重鎖のアミノ酸配列である。配列番号３７はｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨの重鎖の塩基配列であり、配列番号３８はｈＫＭ３９００＿ｔＡ２－３２ＬＨの重鎖のアミノ酸配列である。配列番号３９はｈＫＭ３９００の軽鎖の塩基配列であり、配列番号４０はｈＫＭ３９００の軽鎖のアミノ酸配列である。配列番号４１は抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ－ヒトＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号４２はヒトＣＤ１３７のアミノ酸配列である。配列番号４３はサルＣＤ１３７のアミノ酸配列である。配列番号４４はＨｉｓタグタンパク質のアミノ酸配列である。配列番号４５は３×ＦＬＡＧタグのアミノ酸配列である。配列番号４６～５４はＧＳリンカーのアミノ酸配列である。配列番号５５はＧＫＰＧＳリンカーのアミノ酸配列である。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図2-6】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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