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特許7365720肝細胞への非肝細胞細胞のリプログラミングのための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-12
(45)【発行日】2023-10-20
(54)【発明の名称】肝細胞への非肝細胞細胞のリプログラミングのための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20231013BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20231013BHJP
C12N 5/074 20100101ALI20231013BHJP
C12N 5/0775 20100101ALI20231013BHJP
C12N 5/0797 20100101ALI20231013BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20231013BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20231013BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20231013BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20231013BHJP
C12N 9/99 20060101ALN20231013BHJP
C12N 1/00 20060101ALN20231013BHJP
C12Q 1/04 20060101ALN20231013BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
C12N5/071 ZNA
C12N5/074
C12N5/0775
C12N5/0797
C12N5/078
C12N5/0735
C12N15/113 Z
C12N15/63 Z
C12N9/99
C12N1/00 G
C12Q1/04
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021549703
(86)(22)【出願日】2019-02-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-04-13
(86)【国際出願番号】 CN2019076180
(87)【国際公開番号】W WO2020172796
(87)【国際公開日】2020-09-03
【審査請求日】2021-10-21
(73)【特許権者】
【識別番号】507232478
【氏名又は名称】北京大学
【氏名又は名称原語表記】ＰＥＫＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５， Ｙｉｈｅｙｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００８７１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】デン，ホンクイ
(72)【発明者】
【氏名】シェ，ビンキン
(72)【発明者】
【氏名】スン，ダ
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ，ユアンユアン
【審査官】小金井 悟
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５１１１５０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／０５６９９９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Cell Stem Cell，2014年03月06日，Vol.14, No.3，pp.394-403
【文献】PLoS One，2014年06月25日，Vol.9, No.6, e100134，pp.1-11
【文献】Hepatology，2015年01月，Vol.61, No.1，pp.337-347
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）造血系で発現するホメオボックスタンパク質（ＨＨＥＸ）、肝細胞核因子４－α（ＨＮＦ４Ａ）、肝細胞核因子６－αＡ（ＨＮＦ６Ａ）、ＧＡＴＡ４及びフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＭＹＣをアップレギュレートし、ｐ５３遺伝子発現及び／又はタンパク質活性をダウンレギュレートするために、非肝細胞細胞を処理すること；（ｂ）体細胞培地において非肝細胞細胞を培養すること；
（ｃ）少なくとも１つのグリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）阻害剤及び少なくとも１つのＴＧＦβ受容体阻害剤を含む肝細胞増殖培地（ＨＥＭ）中で細胞を増殖させること；及び
（ｄ）少なくとも１つの環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）アゴニスト及び少なくとも１つのＴＧＦβ受容体阻害剤を含む肝細胞分化培地（２Ｃ培地）中で細胞を培養すること
を含む、非肝細胞細胞を肝細胞様細胞（ｉＨｅｐ）に誘導する方法。
【請求項2】
ｐ５３ｓｉＲＮＡを発現するベクターを用いて細胞をトランスフェクトすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項3】
細胞が、少なくとも７日の期間、体細胞培養培地中で培養される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項4】
細胞が、約１５～３０日、好ましくは２０～３０日、より好ましくは約２０～２５日の期間、ＨＥＭ中で培養される、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
【請求項5】
細胞が、少なくとも５日の期間、肝細胞分化培地中で培養される、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
【請求項6】
非肝細胞細胞が、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、線維芽細胞、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、神経由来幹細胞、血液細胞、ケラチノサイト及び腸上皮細胞からなる群より選択される、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
【請求項7】
非肝細胞細胞が、哺乳動物由来である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
【請求項8】
哺乳動物が、ヒト、ラット、マウス、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウサギ、ウマ、ブタからなる群より選択される、請求項７記載の方法。
【請求項9】
哺乳動物がヒトであり、そして細胞が、場合により、線維芽細胞である、請求項８記載の方法。
【請求項10】
ＴＧＦβ受容体阻害剤が、ＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）；Ｅ－６１６４５２（［２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン］）である、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
【請求項11】
ｃＡＭＰアゴニストが、フォルスコリン又はｄｂｃＡＭＰである請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項12】
ＧＳＫ阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１（［６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル］－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル］）である、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項13】
２Ｃ培地中の培養の後、細胞はＡＬＢ＋であり、ここでＡＬＢ＋細胞は、ＦＡＣＳ分析により測定して、細胞集団の９０％超を構成する、請求項１～１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項14】
（ａ）非肝細胞細胞が得られた生物由来の、培養された初代肝細胞に類似した典型的な肝細胞形態；（ｂ）Ｅ－カドヘリン、アルブミン（ＡＬＢ）、及び／又はＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＥＢＰＡ及びＣＥＢＰＢからなる群より選択される肝転写因子の発現；
（ｃ）重要な薬物代謝酵素であるＣＹＰ４５０、ＵＧＴ１Ａ１及びＰＯＲの発現；及び
（ｄ）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）取り込み、脂肪滴合成及びグリコーゲン合成の能力
からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を用いて、ｉＨｅｐを同定することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項15】
ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２及びＭＹＣ遺伝子をアップレギュレートするための因子及びｐ５３をダウンレギュレートするための因子からなる、非肝細胞細胞をｉＨｅｐにリプログラミングするためのキット。
【請求項16】
ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２及びＭＹＣ遺伝子を過剰発現するレンチウイルス、並びにｐ５３ｓｉＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドからなる、請求項１５記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は一般に、真核細胞を肝細胞様特性を有する細胞にリプログラミングするための転写因子並びに小分子の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
様々な転写因子を用いたリプログラミングにおける最近の進歩は、成熟体細胞型間の変換を可能にした。
【0003】
以前の研究は、確定した細胞培養スキームを用いて非肝細胞の細胞から肝細胞様細胞を得るためのＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１及びＣＥＢＰＡの組み合わせを特定した。Du, et al., Cell Stem Cell, 14:394-403 (2014)。
【0004】
しかしながら、１つの細胞系統を別の細胞系統に直接変換しようとする現在のアプローチは、初期細胞の残留記憶及び標的細胞の限定された機能的変換(Cahan, et al., Cell, 158:903-915 (2014))を含むいくつかの欠点に苦しんでいる。Ｚａｒｅｔらは、凝集したＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンドメインなどの直接的なリプログラミングに対するエピジェネティックな障壁により、転写因子（ＴＦ）が標的細胞の組織特異的な遺伝子を活性化するためにアクセスすることが困難となり、不完全な細胞運命変換をもたらすことに注目した（Becker, et al., Trends in Genetics, 32:29-41 (2016)）。他の研究では、直接線維芽細胞から肝細胞への変換戦略により、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ドメインに位置する重要な肝遺伝子の限定的な活性化のみが観察された(Gao, et al., Stem Cell Reports, 9:1813-1824 (2017); Becker, et al., Mol. Cell., 68:1023-1037 e1015 (2017))。
【0005】
したがって、既知の誘導性肝細胞と比較して、改善された肝細胞の機能活性を示す機能的誘導性肝細胞に、非肝細胞の細胞を誘導する方法の要望が存在する。
【0006】
したがって、本発明の目的は、代謝機能を有する誘導性肝細胞（ｉＨｅｐ）への非肝細胞の変換を誘導する方法を提供することである。
【0007】
また、本発明の目的は、代謝機能を有する誘導性肝細胞を提供することである。
【0008】
本発明の目的は更に、薬物開発、バイオ人工肝臓システム、並びにインビボ及びインビトロでの肝臓の適用に誘導性肝細胞を使用する方法を提供することである。
【0009】
本発明の更なる目的は、非肝細胞をｉＨｅｐにリプログラミングするためのキットを提供することである。
【発明の概要】
【0010】
肝細胞ではない（すなわち、非肝細胞の）第１型の細胞の、機能的肝薬物代謝及び輸送能力によって示される、肝細胞様細胞へのリプログラミングを誘導する方法が開示される。本明細書では、これらの細胞を誘導性肝細胞（ｉＨｅｐ）と表する。非肝細胞を、肝細胞誘導因子をアップレギュレートするように処理し、体細胞培養培地で培養し（形質転換相）、肝細胞培養培地で増殖させ（増殖相）、そして更に２Ｃ培地で十分な時間培養して（成熟相）、肝細胞様の性質を有する細胞に変換する。
【0011】
リプログラミングする方法は、肝前駆細胞生成相（第Ｉ相）及び誘導性肝細胞（ｉＨｅｐ）生成相（第ＩＩ相）の２つの相を含む。第Ｉ相は、（ａ）肝細胞誘導因子及びＭＹＣをアップレギュレートし、及びｐ５３をダウンレギュレートするように細胞を処理し、細胞培養培地中で細胞を培養すること（形質転換相）、及び（ｂ）ＨＥＭ（肝増殖培地）中で細胞を再播種及び培養すること（増殖相）、の工程を含む。第ＩＩ相は、細胞を独自の分化培地中で、例えば本明細書に開示される２Ｃ培地中で培養することを含む。誘導性肝細胞（ｉＨｅｐ）は、この細胞培養スキームに従って得られる。
【0012】
第Ｉ相（ａ）において、好ましくは、前記非肝細胞は、以下の肝細胞誘導因子：造血系で発現するホメオボックスタンパク質（ＨＨＥＸ）、肝細胞核因子４－α（ＨＮＦ４Ａ）、肝細胞核因子６－αＡ（ＨＮＦ６Ａ）、ＧＡＴＡ４及びフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＭＹＣを過剰発現し、そしてｐ５３遺伝子発現及び／又はタンパク質活性をダウンレギュレートするように形質転換される。次いで、（肝細胞誘導因子及びＭＹＣをアップレギュレートし、及びｐ５３をダウンレギュレートするように処理された）非肝細胞を培養し、ＨＥＭ（肝増殖培地）中でインビトロで培養し増殖させ（増殖相）、そして第１相で肝前駆細胞を生成した。更に、これらの肝前駆細胞は、少なくとも１つの環状ＡＭＰアゴニスト及び少なくとも１つのＴＧＦβ受容体阻害剤（２Ｃと称される）を補充した細胞培養培地中で成熟して、第ＩＩ相（成熟相）においてｉＨｅｐを得た。
【0013】
前記細胞は、肝細胞の既知の構造的及び機能的特性に基づいてｉＨｅｐとして同定される。
【0014】
また、機能的誘導性肝細胞（ｉＨｅｐ）も開示される。好ましい実施態様では、誘導性肝細胞は、ヒト誘導性肝細胞（ｈｉＨｅｐ）である。ｉＨｅｐは、アルブミン、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＵＧＴ１Ａ１及びＰＯＲからなる群より選択される少なくとも１つの肝細胞マーカーを発現する。好ましい実施態様では、ｉＨｅｐは、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）１Ａ１及びＰＯＲの、１０個全てのマーカーを発現する。
【0015】
ｉＨｅｐへの非肝細胞のリプログラミングを誘導するためのキットも開示される。前記キットは、本明細書中に開示される、肝細胞誘導因子及びＭＹＣをアップレギュレートする因子、及びｐ５３遺伝子発現及び／又はタンパク質のレベルをダウンレギュレートする因子を含む。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1F】図１Ｆは、ＲＴ－ｑＰＣＲによる、異なる時点でのリプログラミングされた細胞における、ｈＨＰＣマーカーＡＬＢ、ＡＦＰ、ＥＰＣＡＭ並びに線維芽細胞マーカーＣＯＬ１Ａ１及びＴＨＹ１の動的遺伝子発現分析を示す。ｎ＝２。
【図2A】図２Ａは、２Ｃで培養した肝細胞（ｎ＝３）、成体肝組織（ＡＬ、ｎ＝３）及びｈｅｐＧ２細胞（ｎ＝２）における重要な肝機能マーカー及び転写因子のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。遺伝子発現レベルは、ＡＬに対して正規化した（上のパネル）。下のパネルは、培養３０日目の肝細胞の２つのバッチの薬物代謝活性分析を示す。質量分析を用いて、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｄ６の活性を分析した。ＣＹＰ４５０に特異的な基質として以下：ＣＹＰ３Ａ４－Ｔ（テストステロン）、ＣＹＰ１Ａ２（フェナセチン）、ＣＹＰ２Ｃ９（ジクロフェナク）及びＣＹＰ２Ｄ６（デキストロメトルファン）を用いた。ｎ＝３。スケールバーは５０μmを表す。データは平均±ＳＥＭとして示す。データが検出されずは「n.d」。
【図2D】図２Ｄは、ＨｅｐＧ２細胞（ｎ＝２）、ｈＨＰＬＣ（ｎ＝２）、ｈｉＨｅｐ（ｎ＝８）、及びＦ－ＰＨＨ（ｎ＝５）及び成体肝組織（ＡＬ、ｎ＝４）における主要な成熟肝細胞機能遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。相対的な発現はＦ－ＰＨＨに対して正規化した。
【図2I】図２Ｉは、異なる継代での、ｈＨＰＬＣに由来する、ＨｅｐＧ２細胞、ＨＥＦ、Ｆ－ＰＨＨ、ＡＬ及びｈｉＨｅｐの全体の遺伝子発現の階層的クラスタリングを示す。アスタリスクは同じドナーからのＰＨＨ及びＡＬを表す。
【図3A】図３Ａ～Ｄは、ｈｉＨｅｐのＰＨＨと同等なＣＹＰ薬物代謝活性及び毒性予測能を示す。図３Ａは、ｈｉＨｅｐ、ＨｅｐＧ２細胞及びＦ－ＰＨＨにおける７つのＣＹＰ４５０の薬物代謝活性の質量分析を示す棒グラフである。ｎ＝３。
【図3C】図３Ｃは、ｈｉＨｅｐ、ＰＨＨ及びＨｅｐＧ２細胞における２５個の化合物のＴＣ５０値の比較を示す。（灰色領域：２．５倍未満の差。ｈｉＨｅｐ、ＰＨＨ及びＨｅｐＧ２細胞における全ての化合物はｎ＝３，ただしＰＨＨにおけるアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）はｎ＝２。ｒ：ピアソン相関係数。）
【図3E】図３Ｅは、ｈｉＨｅｐ、Ｆ－ＰＨＨ及びＨＥＦの全体のＣｐＧメチル化パターンの階層的なクラスタリングを示す。「ｎ」は、ｈｉＨｅｐ、Ｆ－ＰＨＨ及びＨＥＦにおけるＣｐＧ部位及び異なってメチル化されたＣｐＧ部位の階層的クラスタリングの数を表す。
【図3G】図３Ｇは、ＨＥＦ、ＨｅｐＧ２細胞、異なるドナーの線維芽細胞由来のｈｉＨｅｐ、Ｆ－ＰＨＨ及びＡＬの全体の遺伝子発現の階層的なクラスタリングを示す。アスタリスクは同じドナーからのＦ－ＰＨＨ及びＡＬを表す。
【図3I】図３Ｉは、ＨＥＦ（ｎ＝３）、ＣＲＬ－２０９７由来のｈｉＨｅｐ（ｎ＝３）及びＦ－ＰＨＨ（ｎ＝５）における主要な成熟肝細胞の機能遺伝子のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す。相対的な発現はＦ－ＰＨＨに対して正規化した。
【図4A】図４Ａは、ＣＲＬ－２０９７、ＨｅｐＧ２細胞及びＦ－ＰＨＨ由来のｈｉＨｅｐにおける７つのＣＹＰ４５０の薬物代謝活性のＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を示す棒グラフである。結果は百万細胞あたりのpmol/分として表す。ｎ＝３。
【図4B】図４Ｂは、ＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる、ＣＲＬ－２０９７由来のｈｉＨｅｐ、ＨｅｐＧ２細胞及びＰＨＨにおけるリファンピン、β－ナフトフラボン、ランソプラゾール及びフェノバルビタールに対するＣＹＰ３Ａ４（テストステロン）、ＣＹＰ１Ａ２（フェナセチン）及びＣＹＰ２Ｂ６（ブプロピオン）の活性の誘導を示す棒グラフである。スケールバーは５０μmを表す。データは平均値±ＳＥＭで示した。
【図4D】図４Ｄは、ＡＦＢ１で処理したｈｉＨｅｐ、Ｆ－ＰＨＨ及びＨｅｐＧ２細胞の用量依存性生存率曲線を示す。細胞生存率の５０％減少を引き起こすと算出された濃度（茶色の線）をＴＣ５０と決定した。全データをビヒクル対照で処理した培養物に対して標準化した。
【図4E】図４Ｅ及び４Ｆは、脂肪沈着／リン脂質沈着を引き起こす化合物（図３Ｅ）、リファンピン（非脂肪沈着／リン脂質沈着を引き起こす化合物）又はＤＭＳＯへの曝露後のｈｉＨｅｐにおける用量依存的な脂肪沈着及びリン脂質沈着の定量化を示す。ｎ＝４；ａ．ｕは任意単位。
【図4F】図４Ｅ及び４Ｆは、脂肪沈着／リン脂質沈着を引き起こす化合物（図３Ｅ）、リファンピン（非脂肪沈着／リン脂質沈着を引き起こす化合物）又はＤＭＳＯへの曝露後のｈｉＨｅｐにおける用量依存的な脂肪沈着及びリン脂質沈着の定量化を示す。ｎ＝４；ａ．ｕは任意単位。
【図4G】図４Ｇは、薬物－薬物相互作用を介した毒性を示す。ＤＭＳＯ、ＣＹＰ３Ａ４誘導剤リファンピン（ＲＩＦ）又はＲＩＦ及びＣＹＰ３Ａ４阻害剤ケトコナゾール（ＫＣ）の併用で処理した後の、ｈｉＨｅｐ及びＨｅｐＧ２細胞におけるＡＦＢ１（ＴＣ５０値により示される）及びフルタミド（０．３mM又は３mMでの細胞生存率により示される）の毒性。両細胞型において、ＡＦＢ１についてはｎ＝３及びフルタミドについてはｎ＝６。データは平均±ＳＥＭとして示す。１元配置分散分析を実施した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。これらの図において、上部パネル（左及び右）は、ｈｉＨｅｐ又はＨｅｐＧ２の５０％の細胞死をもたらす濃度を示し、そしてカラムは濃度を表した。下のパネル（左及び右）は、０．３mMのフルマイド（flumaide）でのｈｉＨｅｐについての細胞生存率及び３mMのフルマイドでのＨｅｐＧ２についての細胞生存率を示した。ＨｅｐＧ２は、０．３mMのフルマイドでは、１００％生存していたので、ＨｅｐＧ２の死をもたらす可能性のある３mMでのＨｅｐＧ２の細胞生存率を示した。
【図5D】図５Ｄ～Ｇは、異なるＨＢＶマーカーの動的発現を示す。ＨＢＶタンパク質（図５Ｄ）、ＨＢＶ－ＲＮＡ（図５Ｅ）、上清ＨＢＶ－ＤＮＡ（図５Ｆ）及び細胞内ＨＢＶ－ＤＮＡ（図５Ｇ）を、ＨＢＶに感染したｈｉＨｅｐ及びＥＴＶ、ＬＡＭ及びＩＦＮ－αで処理したｈｉＨｅｐにおいて分析した。ｎ＝３。
【図5E】図５Ｄ～Ｇは、異なるＨＢＶマーカーの動的発現を示す。ＨＢＶタンパク質（図５Ｄ）、ＨＢＶ－ＲＮＡ（図５Ｅ）、上清ＨＢＶ－ＤＮＡ（図５Ｆ）及び細胞内ＨＢＶ－ＤＮＡ（図５Ｇ）を、ＨＢＶに感染したｈｉＨｅｐ及びＥＴＶ、ＬＡＭ及びＩＦＮ－αで処理したｈｉＨｅｐにおいて分析した。ｎ＝３。
【図5F】図５Ｄ～Ｇは、異なるＨＢＶマーカーの動的発現を示す。ＨＢＶタンパク質（図５Ｄ）、ＨＢＶ－ＲＮＡ（図５Ｅ）、上清ＨＢＶ－ＤＮＡ（図５Ｆ）及び細胞内ＨＢＶ－ＤＮＡ（図５Ｇ）を、ＨＢＶに感染したｈｉＨｅｐ及びＥＴＶ、ＬＡＭ及びＩＦＮ－αで処理したｈｉＨｅｐにおいて分析した。ｎ＝３。
【図5G】図５Ｄ～Ｇは、異なるＨＢＶマーカーの動的発現を示す。ＨＢＶタンパク質（図５Ｄ）、ＨＢＶ－ＲＮＡ（図５Ｅ）、上清ＨＢＶ－ＤＮＡ（図５Ｆ）及び細胞内ＨＢＶ－ＤＮＡ（図５Ｇ）を、ＨＢＶに感染したｈｉＨｅｐ及びＥＴＶ、ＬＡＭ及びＩＦＮ－αで処理したｈｉＨｅｐにおいて分析した。ｎ＝３。
【図5H】図５Ｈは、ＨＢＶに感染したｈｉＨｅｐ、ＩＦＮ－αで処理したＨＢＶに感染したｈｉＨｅｐ、非感染のｈｉＨｅｐ及びＩＦＮ－αで処理した非感染のｈｉＨｅｐにおける重要なＩＳＧの遺伝子発現分析を示す。ｎ＝３。スケールバー＝５０μm。データは平均値±ＳＥＭとして示した。
【図5I】図５Ｉは、感染後３０日における異なるＨＢＶマーカーの動的発現を示す。ＨＢＶタンパク質、ＨＢＶ－ＲＮＡ，上清ＨＢＶ－ＤＮＡ及び細胞内ＨＢＶ－ＤＮＡを、ＨＢＶに感染したｈｉＨｅｐ及びウイルス侵入阻害剤であるＮ末端ミリストイル化ペプチド（ＭＹＲ）で処理したｈｉＨｅｐにおいて分析した。ｎ＝３。スケールバーは５０μmを表す。データは平均±ＳＥＭとして示す。
【0017】
［発明の詳細な説明］
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、「２Ｃ培地」は、１つ以上のｃＡＭＰシグナル伝達活性化剤及び１つ以上のＴＧＦβ受容体阻害剤で補充した肝細胞のための基礎細胞培養培地、例えば、フォルスコリン及びＳＢ４３１５４２を補充した、２％ Ｂ２７、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを含有するＨＣＭ（肝細胞培養培地）又はウィリアムズＥ培地を指す。
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、「２Ｃ培地」は、１つ以上のｃＡＭＰシグナル伝達活性化剤及び１つ以上のＴＧＦβ受容体阻害剤で補充した肝細胞のための基礎細胞培養培地、例えば、フォルスコリン及びＳＢ４３１５４２を補充した、２％ Ｂ２７、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを含有するＨＣＭ（肝細胞培養培地）又はウィリアムズＥ培地を指す。
【0018】
本明細書中で使用される場合、「培養」は、培地中で増殖され、場合により継代された細胞の集団を意味する。細胞培養は、初代培養（例えば、継代されていない培養）、又は二次培養又はその後の培養（例えば、継代培養した又は１回以上継代した細胞の集団）であってもよい。
【0019】
本明細書で使用される場合、「ダウンレギュレーション」又は「ダウンレギュレートする」は、細胞が、それにより外的変数に反応して、細胞成分、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の量及び／又は活性を減少させるプロセスを指す。
【0020】
本明細書中で使用される場合、「機能的誘導性肝細胞（ｉＨｅｐ）」は、肝臓から得られた単離したばかりの初代ヒト肝細胞（Ｆ－ＰＨＨ）における同一酵素の発現と同等のレベルで、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＵＧＴ１Ａ１又はＰＯＲの少なくとも１つの発現を示す誘導性肝細胞を指す。
【0021】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、ベクターなどの組換えヌクレオチドが導入され得る非肝細胞の真核細胞を指す。
【0022】
本明細書で使用される用語「誘導性肝細胞」（ｉＨｅｐ）は、天然に存在する肝細胞ではなく、非肝細胞から人工的に派生させた細胞を指す。
【0023】
用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、又は修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。したがって、例えば、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドは、とりわけ、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖又は、より典型的には二本鎖又は一本鎖領域及び二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を指す。用語「核酸」又は「核酸配列」はまた、上記で定義されたポリヌクレオチドも包含する。
【0024】
更に、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、又はＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。このような領域の鎖は、同じ分子又は異なる分子に由来していてもよい。前記領域は、１つ以上の分子の全てを含み得るが、より典型的には、いくつかの分子の領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。
【0025】
本明細書中で使用される場合、用語ポリヌクレオチドは、１以上の修飾塩基を含有する、上記のＤＮＡ又はＲＮＡを含む。したがって、安定性又は他の理由のために修飾されたバックボーンを有するＤＮＡ又はＲＮＡは、本明細書で意図されているように「ポリヌクレオチド」である。更に、２例のみを挙げると、イノシンなどの異常な塩基、又はトリチル化された塩基などの修飾された塩基を含むＤＮＡ又はＲＮＡは、本明細書で使用される用語のポリヌクレオチドである。
【0026】
用語「パーセント（％）配列同一性」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後の、参照核酸配列中のヌクレオチド又はアミノ酸と同一である候補配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸のパーセンテージとして定義される。パーセント配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの一般に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当分野の技術範囲内である様々な方法において達成することができる。比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータは、公知の方法により決定することができる。
【0027】
本明細書の目的のために、所与の核酸配列Ｄへの、との、又は、に対する所与のヌクレオチド又はアミノ酸配列Ｃのパーセント配列同一性（これは、代替的に、所与の配列Ｄへの、との、又は、に対する、あるパーセント配列同一性を有する、又は含む所与の配列Ｃとして表現することができる）は、以下のように算出される：
１００×分数Ｗ／Ｚ、
ここでＷは、シーケンスアラインメントプログラムによって、Ｃ及びＤのプログラムのアラインメントにおいて同一一致として採点されたヌクレオチド又はアミノ酸の数であり、そしてＺは、Ｄにおけるヌクレオチド又はアミノ酸の総数である。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さと等しくない場合、ＤへのＣのパーセント配列同一性はＤへのＣのパーセント配列同一性と等しくないことが理解されよう。
１００×分数Ｗ／Ｚ、
ここでＷは、シーケンスアラインメントプログラムによって、Ｃ及びＤのプログラムのアラインメントにおいて同一一致として採点されたヌクレオチド又はアミノ酸の数であり、そしてＺは、Ｄにおけるヌクレオチド又はアミノ酸の総数である。配列Ｃの長さが配列Ｄの長さと等しくない場合、ＤへのＣのパーセント配列同一性はＤへのＣのパーセント配列同一性と等しくないことが理解されよう。
【0028】
本明細書中で使用される場合、「形質転換された」及び「トランスフェクトされた」は、多くの当該技術分野で公知の技術による細胞への核酸（例えばベクター）の導入を包含する。
【0029】
本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、挿入されたセグメントの複製がもたらされるように別のＤＮＡセグメントを挿入できる、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどのレプリコンである。本明細書に記載されるベクターは、発現ベクターで有り得る。
【0030】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」は、１つ以上の発現制御配列を含むベクターである。
【0031】
本明細書で使用される場合、「リプログラミング」は、ある特定の細胞型から別の細胞型への変換を指す。たとえば、肝細胞でない細胞は、形態的及び機能的に肝細胞に似た細胞にリプログラミングすることができる。
【0032】
本明細書で使用される場合、「細胞／細胞（複数）を処理する」は、細胞成分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の量及び／又は活性をダウンレギュレート又はアップレギュレートするために、細胞を、本明細書で開示される核酸などの因子と接触させることを指す。このフレーズはまた、細胞を、関心対象の遺伝子／タンパク質をダウンレギュレート又はアップレギュレートすることができるタンパク質及び小分子を含む任意の因子と接触させることを包含する。
【0033】
用語「発現をアップレギュレートする」は、例えば、発現に影響を与えて、例えば、発現又は活性を誘導するか、又は未処理の細胞と比較して、増加した／より大きな発現又は活性を誘導することを意味する。
【0034】
本明細書で使用される場合、「アップレギュレーション」又は「アップレギュレートする」は、細胞が、そのプロセスによって、外的変数に反応して、細胞成分、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質の量及び／又は活性を増加させるプロセスを指す。
【0035】
「変異体」は、参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドとは異なるが、必須の特性を保持するポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。ポリペプチドの典型的な変異体は、他の参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般に、違いは、参照ポリペプチド及び変異体の配列が全体的によく類似しており、多くの領域において同一であるように制限される。変異体及び参照ポリペプチドは、１つ以上の改変（例えば、置換、付加及び／又は欠失）によってアミノ酸配列が異なっていてもよい。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによってコードされるものであっても、そうでなくてもよい。ポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの天然に存在するものであってもよく、又は天然に存在することが知られていない変異体であってもよい。
【0036】
ＩＩ．組成物
Ａ．非肝細胞を肝細胞特性を有する細胞に誘導する因子
非肝細胞から完全に機能する肝細胞を得ることは、特に分化した細胞からは困難でなままである。機能的ヒト誘導性肝細胞（ｈｉＨｅｐ）は、以下の因子：造血系で発現するホメオボックスタンパク質であるＨＨＥＸ；肝細胞核因子であるＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ；ＧＡＴＡ結合性タンパク質であるＧＡＴＡ４及びフォークヘッドボックスタンパク質であるＦＯＸＡ２、並びにＭＹＣ遺伝子のｍＲＮＡレベル（又はｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベル）をアップレギュレートし、及び非肝細胞におけるｐ５３発現レベルをダウンレギュレートした後に、本明細書に開示される定義された細胞培養プロトコルを行うことにより、線維芽細胞から生成することができる。本明細書に開示される肝細胞誘導因子の全ての既知の機能的変異体及びアイソフォームが企図される。
Ａ．非肝細胞を肝細胞特性を有する細胞に誘導する因子
非肝細胞から完全に機能する肝細胞を得ることは、特に分化した細胞からは困難でなままである。機能的ヒト誘導性肝細胞（ｈｉＨｅｐ）は、以下の因子：造血系で発現するホメオボックスタンパク質であるＨＨＥＸ；肝細胞核因子であるＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ；ＧＡＴＡ結合性タンパク質であるＧＡＴＡ４及びフォークヘッドボックスタンパク質であるＦＯＸＡ２、並びにＭＹＣ遺伝子のｍＲＮＡレベル（又はｍＲＮＡによりコードされるタンパク質のレベル）をアップレギュレートし、及び非肝細胞におけるｐ５３発現レベルをダウンレギュレートした後に、本明細書に開示される定義された細胞培養プロトコルを行うことにより、線維芽細胞から生成することができる。本明細書に開示される肝細胞誘導因子の全ての既知の機能的変異体及びアイソフォームが企図される。
【0037】
これらの既知の配列は、アメリカ国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）のGenebankデータベースから容易に入手できる。ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４及びＦＯＸＡ２のGenBankアクセッション番号を表１に列挙する。
【0038】
いくつかの実施態様では、前記方法は、ＦＯＸＡ２の代わりに、又はＦＯＸＡ２と組み合わせて、アップレギュレートされるフォークヘッドボックスタンパク質遺伝子／タンパク質としてＦＯＸＡ１又はＦＯＸＡ３を選択することを含む。いくつかの好ましい実施態様は、ＦＯＸＡ２がアップレギュレートされる場合、ＦＯＸＡ１又はＦＯＸＡ３の発現をアップレギュレートすること含まない。
【0039】
いくつかの実施態様では、前記方法は、ＧＡＴＡ４の代わりに、又はＧＡＴＡ４と組み合わせて、アップレギュレートされるＧＡＴＡ結合性タンパク質遺伝子／タンパク質としてＧＡＴＡ６を選択することを含む。いくつかの好ましい実施態様は、ＧＡＴＡ４がアップレギュレートされる場合、ＧＡＴＡ６の発現をアップレギュレートすること含まない。
【0040】
好ましくは、ｐ５３活性は、ｐ５３遺伝子、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルのダウンレギュレーションによって示されるように、更にダウンレギュレートされる。
【0041】
ｉ．ＨＨＥＸ
ＨＨＥＸ遺伝子は、造血系で発現するホメオボックスタンパク質ＨＨＥＸをコードする。
ＨＨＥＸ遺伝子は、造血系で発現するホメオボックスタンパク質ＨＨＥＸをコードする。
【0042】
ＨＨＥＸ転写因子は、ある場合にはプロモーターとして働き、そして別の場合には阻害剤として働く。この転移因子は、他の多くのシグナル分子と相互作用し、肝臓、甲状腺及び前脳などの複数の臓器の発生に重要な役割を果たす。この転写因子の重要性は、ＨＨＥＸノックアウトマウスの胚が妊娠中に生存できないことから例証される。
【0043】
例示的なＨＨＥＸ遺伝子は、ＮＭ＿００２７２９．４によって表される。
【化1】
【0044】
ｉｉ．ＨＮＦ４Ａ
肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α、ＮＲ２Ａ１、遺伝子記号ＨＮＦ４Ａ）はリガンド依存性転写因子の核受容体（ＮＲ）スーパーファミリーの高度に保存されたメンバーである(Sladeck, et al., Genes Dev., 4(12B): 2353-65 (1990))。ＨＮＦ４Ａ１は、肝臓（肝細胞）、腎臓、小腸などにおいて発現しており、ＨＮＦ４Ａ２は、肝臓において最も優勢なアイソフォームである。ＨＮＦ４Ａは肝臓においてアポリポタンパク質遺伝子の全てではないにしてもほとんどを調節し、多くのチトクロームＰ４５０遺伝子（例えば、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６）及び第ＩＩ相酵素の発現を調節し、従って薬物代謝の役割を果たし得る(Gonzalez, et al., Drug Metab. Pharmacokinet, 23(1):2-7 (2008))。
肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４α、ＮＲ２Ａ１、遺伝子記号ＨＮＦ４Ａ）はリガンド依存性転写因子の核受容体（ＮＲ）スーパーファミリーの高度に保存されたメンバーである(Sladeck, et al., Genes Dev., 4(12B): 2353-65 (1990))。ＨＮＦ４Ａ１は、肝臓（肝細胞）、腎臓、小腸などにおいて発現しており、ＨＮＦ４Ａ２は、肝臓において最も優勢なアイソフォームである。ＨＮＦ４Ａは肝臓においてアポリポタンパク質遺伝子の全てではないにしてもほとんどを調節し、多くのチトクロームＰ４５０遺伝子（例えば、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６）及び第ＩＩ相酵素の発現を調節し、従って薬物代謝の役割を果たし得る(Gonzalez, et al., Drug Metab. Pharmacokinet, 23(1):2-7 (2008))。
【0045】
例示的なＨＮＦ４Ａ遺伝子は、ＮＭ＿１７８８４９．２によって表される。ＨＮＦ４Ａをコードする核酸は、この配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、又はその機能性断片又はバリアントを含むことができる。
【0046】
ＨＮＦ４Ａ及びそれらの活性をコードする核酸の多くの天然に存在する変異体は当該技術分野で知られている。ヒト肝細胞核因子４遺伝子はNCBI GenBankのアクセッション番号ＢＣ１３７５３９．１として記載されている。
【0047】
ｉｉｉ．ＨＮＦ６Ａ
ＨＮＦ６はもともと、６－ホスホフルクト－２－キナーゼ（ｐｆｋ－２）遺伝子の肝臓プロモーターの転写活性化因子として特徴付けられており、肝臓、脳、脾臓、膵臓及び精巣において発現する。Lannoy, et al., J. Biol. Chem., 273:13552-13562 (1998)。選択的スプライシングにより複数の転写産物変異体が生じる。
ＨＮＦ６はもともと、６－ホスホフルクト－２－キナーゼ（ｐｆｋ－２）遺伝子の肝臓プロモーターの転写活性化因子として特徴付けられており、肝臓、脳、脾臓、膵臓及び精巣において発現する。Lannoy, et al., J. Biol. Chem., 273:13552-13562 (1998)。選択的スプライシングにより複数の転写産物変異体が生じる。
【0048】
ホモ・サピエンス転写産物変異体ｍＲＮＡは、Genbankアクセッション番号ＮＭ＿００４４９８．２として開示されている。
【0049】
ＨＮＦ６をコードする核酸は、この配列、すなわちGenbankアクセッション番号ＮＭ＿００４４９８．２に示される配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する配列、又はその機能性断片又は変異体を含むことができる。
【0050】
ＨＮＦ６をコードする核酸の多くの天然に存在する変異体及びそれらの活性は、当該技術分野で知られている。ヒト肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）遺伝子は、NCBI Genbankアクセッション番号ＡＦ０３５５８１として記載されている。ＨＮＦ６Ａはワンカットホメオボックス１（ＯＮＥＣＵＴ１）としても知られている。
【0051】
ｉｖ．ＧＡＴＡ４
ＧＡＴＡ結合性タンパク質は、構造的に関連した転写因子の群であり、さまざまな細胞型において遺伝子の発現及び分化を制御する。このＤＮＡ結合性タンパク質ファミリーのメンバーは、多くの遺伝子のプロモーターにおいて重要なシス配列である、「ＧＡＴＡ」モチーフとして知られるコンセンサス配列を認識する。ＧＡＴＡ４は、成体脊椎動物の心臓、腸上皮、及び生殖腺で発現する。胎児の発育期の間、ＧＡＴＡ４は、卵黄嚢内胚葉及び心臓形成に関与する細胞において発現する。例示的なＧＡＴＡ４遺伝子は、ＮＭ＿００２０５２により表される。
ＧＡＴＡ結合性タンパク質は、構造的に関連した転写因子の群であり、さまざまな細胞型において遺伝子の発現及び分化を制御する。このＤＮＡ結合性タンパク質ファミリーのメンバーは、多くの遺伝子のプロモーターにおいて重要なシス配列である、「ＧＡＴＡ」モチーフとして知られるコンセンサス配列を認識する。ＧＡＴＡ４は、成体脊椎動物の心臓、腸上皮、及び生殖腺で発現する。胎児の発育期の間、ＧＡＴＡ４は、卵黄嚢内胚葉及び心臓形成に関与する細胞において発現する。例示的なＧＡＴＡ４遺伝子は、ＮＭ＿００２０５２により表される。
【0052】
ｖ．ＦＯＸＡ２
ＦＯＸＡ２遺伝子は、肝細胞核因子３－β（ＨＮＦ－３Ｂ）をコードし、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）又は転写因子３Ｂ（ＴＣＦ－３Ｂ）としても知られている。フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２は、ＤＮＡ結合性タンパク質のフォークヘッドクラスのメンバーである。これらの肝細胞核因子は、アルブミン及びトランスチレチンなどの肝臓に特異的な遺伝子のための転写活性化因子であり、クロマチンとも相互作用する。マウスにおける類似のファミリーメンバーは、代謝の調節及び膵臓及び肝臓の分化における役割を有する。ＦＯＸＡ２遺伝子はアカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、及びカエルにおいて保存される。
例示的なＦＯＸＡ２遺伝子は、ＮＭ＿０２１７８４により表される。
ＦＯＸＡ２遺伝子は、肝細胞核因子３－β（ＨＮＦ－３Ｂ）をコードし、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）又は転写因子３Ｂ（ＴＣＦ－３Ｂ）としても知られている。フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２は、ＤＮＡ結合性タンパク質のフォークヘッドクラスのメンバーである。これらの肝細胞核因子は、アルブミン及びトランスチレチンなどの肝臓に特異的な遺伝子のための転写活性化因子であり、クロマチンとも相互作用する。マウスにおける類似のファミリーメンバーは、代謝の調節及び膵臓及び肝臓の分化における役割を有する。ＦＯＸＡ２遺伝子はアカゲザル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、及びカエルにおいて保存される。
例示的なＦＯＸＡ２遺伝子は、ＮＭ＿０２１７８４により表される。
【0053】
ｖｉ．ＭＹＣ
ＭＹＣ（ｃ－Ｍｙｃ）は、細胞周期の進行、アポトーシス及び細胞形質転換において役割を果たす多機能で、核リンタンパク質である転写因子をコードする調節遺伝子である。
ＭＹＣ（ｃ－Ｍｙｃ）は、細胞周期の進行、アポトーシス及び細胞形質転換において役割を果たす多機能で、核リンタンパク質である転写因子をコードする調節遺伝子である。
【0054】
１つの実施態様では、ＭＹＣは以下の配列によって表される。
【化2】
【0055】
ｖｉｉ.ｐ５３（ＴＰ５３）
リプログラミングされる細胞におけるｐ５３の活性又はレベルは、当該技術分野で公知の任意の方法を用いてダウンレギュレートされる。ｐ５３レベル／発現をダウンレギュレートするために用いることができる組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、リボザイム、及びアプタマーを含むが、これらに限定されず、以下で更に議論する。好ましくは、ｐ５３遺伝子発現は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを用いて阻害される。
リプログラミングされる細胞におけるｐ５３の活性又はレベルは、当該技術分野で公知の任意の方法を用いてダウンレギュレートされる。ｐ５３レベル／発現をダウンレギュレートするために用いることができる組成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、リボザイム、及びアプタマーを含むが、これらに限定されず、以下で更に議論する。好ましくは、ｐ５３遺伝子発現は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを用いて阻害される。
【0056】
好ましい実施態様では、前記組成物はｓｉＲＮＡである。ｐ５３ｓｉＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドの例は、５’－ＴＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣ－３’及び５’－ＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＡ－３’である。
【0057】
Ｂ．肝細胞誘導因子をコードするベクター
適切な形質転換ベクターを用いて、肝細胞誘導因子を宿主細胞に導入する。上記に述べたような核酸は、細胞における発現のためにベクターに挿入することができる。本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、挿入されたセグメントの複製がもたらされるように別のＤＮＡセグメントを挿入できる、プラスミド、ファージ、ウイルス又はコスミドなどのレプリコンである。ベクターは発現ベクターで有り得る。「発現ベクター」は、１つ以上の発現制御配列を含むベクターであり、そして「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節するＤＮＡ配列である。
適切な形質転換ベクターを用いて、肝細胞誘導因子を宿主細胞に導入する。上記に述べたような核酸は、細胞における発現のためにベクターに挿入することができる。本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、挿入されたセグメントの複製がもたらされるように別のＤＮＡセグメントを挿入できる、プラスミド、ファージ、ウイルス又はコスミドなどのレプリコンである。ベクターは発現ベクターで有り得る。「発現ベクター」は、１つ以上の発現制御配列を含むベクターであり、そして「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写及び／又は翻訳を制御及び調節するＤＮＡ配列である。
【0058】
ベクターにおける核酸は、１つ以上の発現制御配列に操作可能に連結することができる。例えば、発現制御配列が、関心対象のコーディング配列の発現を効果的に制御するように、制御配列を遺伝子構築物に組み込むことができる。発現制御配列の例には、プロモーター、エンハンサー、及び転写終結領域が含まれる。プロモーターは、典型的には転写が開始される点（一般的にはＲＮＡポリメラーゼＩＩの開始部位の近く）の上流１００ヌクレオチド以内の、ＤＮＡ分子の領域で構成される発現制御配列である。コーディング配列をプロモーターの制御下に置くためには、ポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位をプロモーターの下流１～約５０ヌクレオチドの間に置く必要がある。エンハンサーは、時間、位置、及びレベルに関して発現の特異性を提供する。プロモーターとは異なり、エンハンサーは、転写部位からさまざまな距離に位置して機能する。エンハンサーはまた、転写開始部位から下流に位置することもできる。コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写することができ、次いでコーディング配列によってコードされるタンパク質に翻訳することができる場合、細胞における発現制御配列に「機能的に連結され」、そしてその「制御下」にある。
【0059】
適切な発現ベクターは、例えばバクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス及びアデノ関連ウイルスに由来するプラスミド及びウイルスベクターを含むが、それらに限定されない。多数のベクター及び発現系は、Novagen (Madison, WI)、Clontech (Palo Alto, CA)、Stratagene (La Jolla, CA)、及びInvitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)などの企業から市販されている。
【0060】
Ｃ．誘導される細胞
リプログラミング可能な細胞には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、線維芽細胞、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、神経由来幹細胞、血液細胞、ケラチノサイト、腸上皮細胞及び他の非肝細胞の体細胞が含まれる。好ましい実施態様では、非肝細胞は、線維芽細胞、例えば、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）又は包皮線維芽細胞である。細胞は好ましくは哺乳動物、例えばラット、マウス、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウサギ、ウマ、ブタから得られる。好ましくは、細胞はヒト被験体から得られる。
リプログラミング可能な細胞には、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、線維芽細胞、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）、神経由来幹細胞、血液細胞、ケラチノサイト、腸上皮細胞及び他の非肝細胞の体細胞が含まれる。好ましい実施態様では、非肝細胞は、線維芽細胞、例えば、ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）又は包皮線維芽細胞である。細胞は好ましくは哺乳動物、例えばラット、マウス、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウサギ、ウマ、ブタから得られる。好ましくは、細胞はヒト被験体から得られる。
【0061】
Ｄ．誘導性肝細胞
例えば、非肝細胞細胞を処理して、肝運命変換因子であるＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４及びＦＯＸＡ２を過剰発現させることを含む方法により得られるｉＨｅｐが開示される。
例えば、非肝細胞細胞を処理して、肝運命変換因子であるＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４及びＦＯＸＡ２を過剰発現させることを含む方法により得られるｉＨｅｐが開示される。
【0062】
誘導される細胞が上皮細胞でない、いくつかの実施態様では、ｉＨｅｐは、更に、少なくとも１つの上皮細胞マーカー、例えばＥ－カドヘリンを発現し、そして誘導される細胞が線維芽細胞である場合、本明細書に開示される方法を用いた線維芽細胞の誘導後に得られるｉＨｅｐは、例えばＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるＣＯＬ１Ａ１及び／又はＴＨＹ１などの線維芽細胞マーカー遺伝子を発現しない。
【0063】
成熟肝細胞に関連する機能特性に関して、ｉＨｅｐは、非肝細胞が得られた生物由来の培養した初代肝細胞に類似する典型的な肝細胞形態からなる群から選択される少なくとも１つの特徴を有する。例えば、非肝細胞がヒト細胞である場合、ｉＨｅｐは、培養した初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）に類似した肝細胞形態を有する。ｉＨｅｐは、Ｅ－カドヘリン及び肝ＴＦである、ＨＮＦ４Ａ，ＨＮＦ１Ａ，ＣＥＢＰＡ，ＣＥＢＰＡに対して免疫陽性である。ｉＨｅｐ細胞は、同様にＡＬＢ＋であり、例えば、フローサイトメトリー分析によって測定すると、第Ｉ相及び第ＩＩ相細胞培養後に得られた細胞集団におけるＡＬＢ＋細胞は、細胞集団の９０％以上を占める。第二に、ｉＨｅｐは、ｈＨＰＬＣと比較した場合、主要な成熟肝細胞の機能遺伝子のアップレギュレートされた発現レベルを示す；これらの発現レベルは、非肝細胞が得られた生物由来の単離したばかりの初代肝細胞（Ｆ－ＰＨＨ）及び成体肝組織（ＡＬ）における発現レベルに匹敵する。例えば、非肝細胞がヒト細胞である場合、主要な成熟肝細胞機能遺伝子の発現レベルは、Ｆ－ＰＨＨ及び成体肝組織（ＡＬ）における発現レベルと同等である（図２Ｂ及び２Ｄ）。成体肝組織（ＡＬ）は、６０％以上の肝細胞及び４０％未満のクッパー細胞、内皮細胞、胆管細胞などの非肝細胞の混合物である。Ｆ－ＰＨＨは、ＡＬから単離し、そして典型的には９５％よりも多い肝細胞を含む。Ｆ－ＰＨＨは、消化の約２～４時間後にＡＬから単離した。Ｆ－ＰＨＨ及びＡＬの両方は、インビトロで生成したｈｉＨｅｐ又はその他の誘導性肝細胞の良好な対照と考えられる。
【0064】
第三に、機能遺伝子ＡＬＢ及びＣＹＰ４５０の発現は、少なくとも４０日間安定して維持され、その間、胎児マーカーＡＦＰは消失し（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＴ－ｑＰＣＲ又は免疫蛍光染色において検出不能なレベルのＡＦＰ分泌として測定される）、ＤＬＫ１及びＥＰＣＡＭを含む他の胎児肝細胞マーカーもｉＨｅｐにおいてダウンレギュレートされる。第四に、ｉＨｅｐは、ＣＹＰ４５０、ＵＧＴ１Ａ１及びＰＯＲの重要な薬物代謝酵素を発現し、例えば、ｉＨｅｐはこれらの酵素に対して免疫陽性である。第五に、ｉＨｅｐは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の取り込み、脂肪滴合成及びグリコーゲン合成を行う能力がある。最後に、ｉＨｅｐによるＡＬＢ分泌は、ＰＨＨのそれと同等のレベルで少なくとも４０日間維持できる。これらのデータは、ｈＨＰＬＣが機能性肝細胞を生じさせたことを示した。
【0065】
したがって、初代肝細胞と同様に、ｈｉＨｅｐは、第Ｉ相及び第ＩＩ相の薬物代謝酵素及び第ＩＩＩ相薬物輸送体及びアルブミンの更なるスペクトルを発現する。ｉＨｅｐは、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ１０、ＵＧＴ２Ｂ７、ＵＧＴ２Ｂ１５及びＰＯＲからなる群より選択される少なくとも１つの薬物代謝酵素を発現する。
【0066】
ＣＹＰ３Ａ４、ＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＵＧＴ１Ａ１及びＰＯＲの少なくとも１つの発現レベルは、ｉＨｅｐと単離したばかりの初代ヒト肝細胞との間で同等であった。好ましい実施態様では、ｉＨｅｐは、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、及びＵＧＴ１Ａ１を発現し、そしてその発現は、単離したばかりの初代肝細胞及び／又は成体肝組織におけるレベルと同等である。いくつかの好ましい実施態様では、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ１Ａ２、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ８、ＵＧＴ１Ａ１０、ＵＧＴ２Ｂ７、ＵＧＴ２Ｂ１５、ＮＴＣＰ及びＰＯＲの少なくとも１つの発現レベルは、単離したばかりの初代肝細胞及び／又は成体肝組織における発現レベルよりも優れている。
【0067】
いくつかの実施態様では、ｉＨｅｐにおけるＭＹＣ発現レベルは、例えば、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）によって測定される、対応する生物における正常な肝細胞において検出されるレベルよりも低く、すなわち、誘導される非肝細胞のためのドナー生物がヒト被験体である場合、そのレベルは、ヒトにおいて見出される正常な肝細胞と比較される。
【0068】
重要なことに、ｉＨｅｐにおけるＣＹＰ４５０の代謝活性は、同じ生物由来のＰＨＨにおける活性と同等であった（統計的有意差なしとして測定された）（図３Ａ）。
【0069】
ＩＩＩ．作製方法
非肝細胞細胞を肝細胞様特性を有する細胞に変換するために開示される様々な方法は、重要な肝遺伝子の限定された活性化及び／又は機能性細胞の低い収率を伴う問題を認識しないか、又は対処しない。
非肝細胞細胞を肝細胞様特性を有する細胞に変換するために開示される様々な方法は、重要な肝遺伝子の限定された活性化及び／又は機能性細胞の低い収率を伴う問題を認識しないか、又は対処しない。
【0070】
米国特許出願公開第２０１２／２３１４９０号は、ＳＯＸ１７、ＨＨＥＸ及びＨＮＦ４Ａに加えて、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＦＯＸＡ１／ＨＮＦ３Ａ、ＦＯＸＡ２／ＨＮＦ３Ｂ、ＦＯＸＡ３／ＨＮＦ３Ｇ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢ、ＴＢＸ３及びＰＲＯＸ１などの１つ以上の遺伝子を導入することによってｉＰＳ細胞から肝細胞を得る方法を開示している。米国特許出願公開第２０１３／０２５１６９４号は、ＦＯＸＡ２、ＨＮＦ４Ａ、及びＨＨＥＸ、ＨＮＦ１Ａ、ＦＯＸＡ１、ＴＢＸ３－１、ＧＡＴＡ４、ＮＲ０Ｂ２、ＳＣＭＬ１、ＣＥＢＰＢ、ＨＬＦ、ＨＬＸ、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ３、ＮＲ５Ａ２、ＳＥＢＯＸ、及びＺＮＦ３９１からなる群より選択される１つ以上の更なる肝細胞プログラミング因子遺伝子を含み得る外因性発現カセットを用いることを開示している。
【0071】
Huang, et al., Nature, 475:386-389 (2011)は、Ｇａｔａ４、Ｈｎｆ１α及びＦｏｘａ３の形質導入及びｐ１９（Ａｒｆ）の不活性化による、マウス尾部線維芽細胞からの肝細胞様細胞の直接誘導を開示している。誘導された細胞は典型的な上皮形態を示す。Sekiya and Suzuki, Nature, 475:390-393 (2011))は、マウスの胎生の及び成体の線維芽細胞をインビトロで肝細胞に類似した細胞に変換することができる、２つ転写因子Ｈｎｆ４α＋Ｆｏｘａ１、Ｆｏｘａ２又はＦｏｘａ３の３つの特異的な組合せを同定した。以前の研究は、ワンステップの誘導戦略を用いて非肝細胞細胞から肝細胞様細胞を得るためのＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１及びＣＥＢＰＡの組み合わせを同定した。Du, et al., Cell Stem Cell, 14:394-403 (2014)。しかしながら、凝集したＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチンドメインのような直接的な再プログラミング化に対するエピジェネティックな障壁が存在し、転写因子（ＴＦ）が、標的細胞の組織特異的な遺伝子を活性化するためにアクセスすることを困難にし、不完全な細胞運命変換をもたらしている（Becker, et al., Trends in Genetics, 32:29-41 (2016)）。一貫して、以前の直接的な線維芽細胞から肝細胞への変換研究では、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３ドメインに位置する重要な肝遺伝子の活性化は限定されていた（図６Ｂ）（Gao, et al., Stem Cell Reports, 9:1813-1824 (2017); Becker, et al., Mol. Cell., 68:1023-1037 e1015 (2017)も参照のこと）。
【0072】
理論に拘束はされないが、本明細書に開示される研究は、再生中の間接的な細胞運命変換経路を介して系統障壁を克服することにより、この問題を解決する。この系では、先に議論した直接的な線維芽細胞－肝細胞変換（すなわち、ワンステップ方式）とは逆に、最終的に分化した細胞は、まず増殖性の前駆細胞に脱分化し、その後、ある種の発生プログラムを反復することにより、様々な分化シグナルに反応して、後成的風景（epigenetic landscape）に沿って高い能力の機能性細胞に再分化する。これは２つの原理に基づいている。すなわち、比較的開いたクロマチン構造を有する前駆細胞は、正確な細胞運命の誘導をより受けやすく、そしてこのような細胞の増殖は、豊富な機能性細胞の生成を可能にする。従って、本明細書に開示される方法は、増殖可能な増殖前駆細胞の可塑性の中間段階を、系統リプログラミングに導入することによって機能的能力のあるヒト肝細胞を生成するための新たなツーステップ戦略を調査した（図１Ａ）。
【0073】
本明細書に開示される方法では、ＭＹＣをアップレギュレートすること及びｐ５３をダウンレギュレートすることを組み合わせて、細胞における肝細胞誘導因子をアップレギュレートすることによって、非肝細胞をｉＨｅｐにリプログラミングし、そして本明細書に開示されるように細胞を十分な期間培養して、細胞を肝前駆細胞様細胞（ＨＰＬＣ）と呼ばれる細胞に変換し、次いで、肝細胞様特性を有する細胞（ｉＨｅｐ）に変換する。誘導される非肝細胞細胞は、当該技術分野で公知の方法を用いてドナー動物から得られる。
【0074】
リプログラミングする方法は、肝前駆細胞生成相（第Ｉ相）及び誘導性肝細胞（ｉＨｅｐ）生成相（第ＩＩ相）の２つの相を含む。第Ｉ相は、リプログラミングする相であり、以下の工程を含む：（ａ）非肝細胞において肝細胞誘導因子をアップレギュレートして、形質転換細胞を得ること、及び細胞培養培地中で細胞を培養すること（形質転換相）、及び（ｂ）ＨＥＭ（肝増殖培地）中で形質転換細胞を再播種及び培養すること（増殖相）。第ＩＩ相は、少なくとも１つのｃＡＭＰアゴニスト／ｃＡＭＰ類似体及びＴＧＦβ受容体阻害剤を用いた独自の分化培地中で細胞を培養することを含む（成熟相）。開示される方法の概略図を図１Ａに示す。
【0075】
Ａ．第Ｉ相
第Ｉ相（ａ）の最初の段階では、肝細胞誘導因子ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４及びＦＯＸＡ２をアップレギュレート／過剰発現するように細胞を処理する。好ましくは、ＭＹＣをアップレギュレート／過剰発現させ、及び／又はｐ５３をダウンレギュレートするように、細胞を更に処理する。いくつかの実施態様では、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１Ａ、ＦＯＸＡ１、ＴＢＸ３－１、ＮＲ０Ｂ２、ＳＣＭＬ１、ＣＥＢＰＢ、ＨＬＦ、ＨＬＸ、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１I２、ＮＲ１I３、ＮＲ５Ａ２、ＳＥＢＯＸ、ＺＮＦ３９１、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１、ＨＮＦ１Ｂ、ＦＯＸＡ１／ＨＮＦ３Ａ、ＦＯＸＡ２／ＨＮＦ３Ｂ、ＦＯＸＡ３／ＨＮＦ３Ｇ、ＣＥＢＰＡ、又はＴＢＸ３をアップレギュレート／過剰発現させるように、第Ｉ相において細胞を処理しない。
第Ｉ相（ａ）の最初の段階では、肝細胞誘導因子ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４及びＦＯＸＡ２をアップレギュレート／過剰発現するように細胞を処理する。好ましくは、ＭＹＣをアップレギュレート／過剰発現させ、及び／又はｐ５３をダウンレギュレートするように、細胞を更に処理する。いくつかの実施態様では、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１Ａ、ＦＯＸＡ１、ＴＢＸ３－１、ＮＲ０Ｂ２、ＳＣＭＬ１、ＣＥＢＰＢ、ＨＬＦ、ＨＬＸ、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１I２、ＮＲ１I３、ＮＲ５Ａ２、ＳＥＢＯＸ、ＺＮＦ３９１、ＡＴＦ５、ＰＲＯＸ１、ＨＮＦ１Ｂ、ＦＯＸＡ１／ＨＮＦ３Ａ、ＦＯＸＡ２／ＨＮＦ３Ｂ、ＦＯＸＡ３／ＨＮＦ３Ｇ、ＣＥＢＰＡ、又はＴＢＸ３をアップレギュレート／過剰発現させるように、第Ｉ相において細胞を処理しない。
【0076】
肝細胞誘導因子をアップレギュレート／過剰発現させる処理は、好ましくは、細胞に遺伝子を導入するための当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２及びＭＹＣをコードする遺伝子、及びｐ５３ｓｉＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを細胞に導入して、トランスフェクトされた細胞を得ることを含む。好ましくは、遺伝子は、当該技術分野で公知のアデノウイルス、レンチウイルス等の発現系を用いて導入される。
【0077】
従って、第Ｉ相（ａ）から得られる形質転換細胞は、本明細書に開示されるように細胞をトランスフェクトすることにより、又は当該技術分野における他の任意の非トランスフェクション方法（例えば小分子での処理）により、関心対象の遺伝子の発現をアップレギュレートすることによって得ることができる。
【0078】
（ｉ）ＨＥＦ細胞培養
第Ｉ相（ａ）では、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２及びＭＹＣを過剰発現し、そしてｐ５３をダウンレギュレートするようにトランスフェクト／処理された細胞（本明細書では、形質転換細胞）を、従来の細胞培養培地中、例えば、ＨＥＦ（ヒト胚性線維芽細胞）培地中で５～１０日間、好ましくは、この最初の段階で少なくとも７日間、例えば、７、８、９又は１０日間培養する。最も好ましくは、細胞を約７日間ＨＥＦ培地中で維持する。例示的なＨＥＦ培地は、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１％ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）及び１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。
第Ｉ相（ａ）では、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２及びＭＹＣを過剰発現し、そしてｐ５３をダウンレギュレートするようにトランスフェクト／処理された細胞（本明細書では、形質転換細胞）を、従来の細胞培養培地中、例えば、ＨＥＦ（ヒト胚性線維芽細胞）培地中で５～１０日間、好ましくは、この最初の段階で少なくとも７日間、例えば、７、８、９又は１０日間培養する。最も好ましくは、細胞を約７日間ＨＥＦ培地中で維持する。例示的なＨＥＦ培地は、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１％ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）及び１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。
【0079】
（ｉｉ）ＨＥＭ中で培養された形質転換細胞
次いで、形質転換細胞を、ＨＥＭ（補充された肝細胞維持／増殖培地である）中で約１５～４０日、好ましくは約２０～３０日、より好ましくは約２０～２５日の期間、再播種及び増殖させる（増殖相）。好ましい実施態様では、形質転換細胞は、トランスフェクションによって得られ、そしてトランスフェクトされた細胞を富化するための適切な薬剤、例えば、ピューロマイシンを用いて、再播種前に約２４時間、処理される。ピューロマイシンは抗生物質である。感染した細胞は、ベクター中に耐性遺伝子があるため、ピューロマイシンに対して耐性がある。。
次いで、形質転換細胞を、ＨＥＭ（補充された肝細胞維持／増殖培地である）中で約１５～４０日、好ましくは約２０～３０日、より好ましくは約２０～２５日の期間、再播種及び増殖させる（増殖相）。好ましい実施態様では、形質転換細胞は、トランスフェクションによって得られ、そしてトランスフェクトされた細胞を富化するための適切な薬剤、例えば、ピューロマイシンを用いて、再播種前に約２４時間、処理される。ピューロマイシンは抗生物質である。感染した細胞は、ベクター中に耐性遺伝子があるため、ピューロマイシンに対して耐性がある。。
【0080】
好ましいＨＥＭを表２Ｂに示す。
Ｍ１０培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）、形質転換成長因子β受容体阻害剤（Ｅ－６１６４５２）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１－リン酸（Ｓ１Ｐ）；インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）、ニコチンアミド及び２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸（ｐＶｃ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２である（表２Ａ及び２Ｂ）。対照的に、特に好ましい実施態様では、ＨＥＭは、５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％ ＰＳ［［ペニシリン及びストレプトマイシン］］などの抗生物質を補充した５０％ ウイリアムズＥ培地、２％ Ｂ２７（ＶＡなし）、５ｍM ニコチンアミド、２００μM ２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸、３μM ＣＨＩＲ９９０２１、５μM ＳＢ４３１５４２、０．５μM スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）、５μMリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、及び４０ng／mL 上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む。
Ｍ１０培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）、形質転換成長因子β受容体阻害剤（Ｅ－６１６４５２）、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、スフィンゴシン１－リン酸（Ｓ１Ｐ）；インスリン－トランスフェリン－亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）、ニコチンアミド及び２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸（ｐＶｃ）で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２である（表２Ａ及び２Ｂ）。対照的に、特に好ましい実施態様では、ＨＥＭは、５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％ ＰＳ［［ペニシリン及びストレプトマイシン］］などの抗生物質を補充した５０％ ウイリアムズＥ培地、２％ Ｂ２７（ＶＡなし）、５ｍM ニコチンアミド、２００μM ２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸、３μM ＣＨＩＲ９９０２１、５μM ＳＢ４３１５４２、０．５μM スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）、５μMリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、及び４０ng／mL 上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む。
【0081】
好ましいＧＳＫ阻害剤は、約３μMの濃度で使用される、化学名［６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル］－５－（５－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］－３－ピリジンカルボニトリル］を有するＣＨＩＲ９９０２１であるアミノピリミジンである。他のＧＳＫ阻害剤もまた、本明細書に開示される方法において使用することができ、それらには、ＢＩＯ－アセトキシム（例えば１μM）；ＧＳＫ３Ｉ阻害剤ＸＶ；ＳＢ－２１６７６３；ＣＨＩＲ９９０２１の塩酸塩であるＣＨＩＲ９９０２１三塩酸塩；ＧＳＫ－３阻害剤ＩＸ［（（２Ｚ，３Ｅ）－６’－ブロモ－３－（ヒドロキシイミノ）－［２，３’－ビインドリニリデン］－２’－オン］；ＧＳＫ３ＩＸ［６－ブロモインジルビン－３’－オキシム］；ＧＳＫ－３β阻害剤ＸＩＩ［３－［［６－（３－アミノフェニル）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－４－イル］オキシ］フェノール］；ＧＳＫ－３阻害剤ＸＶＩ［６－（２－（４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ピリミジン－２－イルアミノ）エチル－アミノ）－ニコチノニトリル］；ＳＢ－４１５２８６［３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン］；及びＢｉｏ［（２’Ｚ，３’Ｅ）－６－ブロモインジルビン－３’－オキシム］を含むがそれらに限定されない。
【0082】
ＴＧＦβ阻害剤は、好ましくは、いくつかの実施態様で、ＴＧＦβ１型受容体アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）５を阻害し、そして他の実施態様では、ＡＬＫ４及び節性受容体１受容体ＡＬＫ７を更に阻害することができる。ＴＧＦβ受容体阻害剤は、ＳＢ４３１５４２（４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド）、Ｅ－６１６４５２（［２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン］）；又は当該技術分野で公知であり、市販されている他のＴＧＦβ阻害剤で有り得る。例としてはＡ８３－０１［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド］、ＳＢ５０５１２４［２－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－２－（１，１－ジメチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－６－メチル－ピリジン］；ＧＷ７８８３８８［４－［４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－２－ピリジニル］－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）－ベンズアミド］；ＳＢ５２５３３４［６－［２－（１，１－ジメチルエチル）－５－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］キノキサリン］、及びドルソモルフィンが挙げられる。
【0083】
特に好ましい実施態様では、サプリメント、小分子及び成長因子の組み合わせは、同じ培養時間でＭ１０を用いて得られたＨＰＬＣの収率よりも高いＨＰＬＣの収率を提供するように選択される。任意の所与の時点でのＨＰＬＣの収率は、第Ｉ相の終了時でＡＬＢ＋細胞の百分率として測定することができる。好ましくは、サプリメント、小分子及び成長因子の選択された組み合わせは、ＡＬＢ＋細胞の収率の２倍以上の増加、例えば、収率の少なくとも２倍～３０倍の間の増加、好ましくは、収率の少なくとも１０倍～３０倍の増加、更により好ましくは、収率の少なくとも２０倍～３０倍の間の増加を提供する。例えば、収率の増加は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０倍で有り得る。基礎培地、サプリメント、小分子及び成長因子の好ましい組み合わせは、表２Ｂに示されており、これは、本出願で例示されているように、Ｍ１０培地（２．７％ ＡＬＢ＋細胞）を用いた収量と比較した場合、１５日目で２００％を超えるＡＬＢ＋細胞（６．５％ ＡＬＢ＋細胞）の増加した収量を提供する。ＳＢ４３１５４２は、１～１０μMの間の、より好ましくは１～７μMの間の、そして更により好ましくは３～７μMの間の、そして最も好ましくは約５μMの濃度で使用される。
【0084】
ＡＬＢ＋細胞の百分率を決定するための方法は当該技術分野で公知であり、そして免疫蛍光の組み合わせを用いて本明細書で例示される。
【0085】
第Ｉ相の終了に続いて、場合により増殖／継代を行い、続いて、細胞を、第Ｉ相からの細胞を独自の分化培地中で培養することによって、第ＩＩ相に供する。
【0086】
Ｂ．第ＩＩ相
第Ｉ相から回収した細胞を、コンフルエントになるまでＨＥＭ培地中で培養し、更に、少なくとも１つのｃＡＭＰアゴニスト及びＴＧＦβ受容体阻害剤、好ましくはＳＢ４３１５４２を補充した培地（２Ｃ培地）中で、少なくとも５日の期間、好ましくは５～４０日の期間、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５日間、そして４０日間まで、培養し、続いて誘導性肝細胞を回収した。細胞が更なる用途のために生存し続ける（すなわち、それらが死なない）限り、より長い期間にわたって２Ｃ培地中で培養させることができるために、これらの期間は、限定されない。
第Ｉ相から回収した細胞を、コンフルエントになるまでＨＥＭ培地中で培養し、更に、少なくとも１つのｃＡＭＰアゴニスト及びＴＧＦβ受容体阻害剤、好ましくはＳＢ４３１５４２を補充した培地（２Ｃ培地）中で、少なくとも５日の期間、好ましくは５～４０日の期間、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５日間、そして４０日間まで、培養し、続いて誘導性肝細胞を回収した。細胞が更なる用途のために生存し続ける（すなわち、それらが死なない）限り、より長い期間にわたって２Ｃ培地中で培養させることができるために、これらの期間は、限定されない。
【0087】
好ましいｃＡＭＰアゴニストは、フォルスコリンである。しかしながら、任意のｃＡＭＰアゴニストを使用することができる。例としては、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ロリプラム、ゲニステイン、及びｄｂｃＡＭＰ又は８－ブロモ－ｃＡＭＰなどのｃＡＭＰ類似体が挙げられるが、これらに限定されない。ｃＡＭＰアゴニストは、３０μM～８０μMの間、より好ましくは４０μM～６０μMの間、更により好ましくは４５μM～５５μMの間の濃度で使用される。
【0088】
ＳＢ４３１５４２は、５μM～２０μMの間、より好ましくは５μM～１５μMの間、更により好ましくは１０μM～１５μMの間、最も好ましくは約１０μMの濃度で使用される。
【0089】
２Ｃ培地を作製するために使用することができる肝細胞のための基礎細胞培養培地の例としては、ＨＣＭ（肝細胞培養培地）；２％ Ｂ２７（Gibco）、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを含有するウイリアムズＥ培地；ＲＰＭＩ１６４０；ダルベッコ変法イーグル培地；ダルベッコ改変イーグル培地／栄養素混合物Ｆ－１２イスコフ改変ダルベッコ培地が挙げられるが、これに限定されない。特に好ましい実施態様では、２Ｃ培地は、５０μM フォルスコリン又は５０μM ｄｂｃＡＭＰ、及び１０μM ＳＢ４３１５４２を補充したＨＣＭである。
【0090】
前記方法は、場合により（ａ）非肝細胞細胞が第Ｉ相後に肝細胞－前駆体様特性を獲得したことを確認する工程、及び（ｂ）形態学的及び機能的特性並びに遺伝子発現を用いて、第ＩＩ相後に、非肝細胞が肝細胞様特性を獲得したことを確認する工程を含む。
【0091】
形態学的確認方法は、肝細胞前駆細胞様（ＨＰＬＣ）及び成熟肝細胞様（ｉＨＥＰ）に特異的な形態学的特徴の確認を含む。
【0092】
ＨＰＬＣは、ｈＨＰＣの既知の役割を有する遺伝子、例えばＡＬＢ、ＡＦＰ、ＥＰＣＡＭ、ＣＫ８、ＣＫ１８、ＨＮＦ１Ｂ、ＤＬＫ１、及びＭＥＴ、を含むｈＨＰＣにおいて富む遺伝子のアップレギュレーションに基づいて同定することができる。
【0093】
処理された細胞は、以下の特徴：（ｉ）Ｅ－カドヘリン及び肝臓－ＴＦのＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢに対する免疫陽性；（ｉｉ）主要な成熟肝細胞機能遺伝子の発現レベルがｈＨＰＬＣと比較してｈｉＨｅｐにおいて劇的にアップレギュレートされたことが見出され、Ｆ－ＰＨＨ及び成体肝組織（ＡＬ）における発現レベルと同等であった。（ｉｉｉ）初代ヒト肝細胞のレベルと同等のレベルでＡＬＢを発現する処理された細胞の能力、好ましくは機能遺伝子ＡＬＢ及びＣＹＰ４５０の発現が、少なくとも４０日間維持され、好ましくは胎児マーカーＡＦＰが消失するまでの間ＰＨＨに匹敵するレベルで、安定して維持された。ＤＬＫ１及びＥＰＣＡＭを含む他の胎児肝細胞マーカーもｈｉＨｅｐにおいてダウンレギュレートされた。（iｖ）主なチトクロームＰ４５０酵素である、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９の１つ以上の発現；ＵＧＴ１Ａ１、ＰＯＲ、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ９、ＵＧＴ２Ｂ７、ＵＧＴ２５１５、ＮＴＣＰ、ＭＲＰ６、ＭＲＰ２、ＦＭＯ５、ＭＡＯＡ、ＭＡＯＢ、ＥＰＨＸ１からなる群より選択される第ＩＩ相酵素又は第ＩＩ相輸送体の発現；（ｖ）低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）取り込み、脂肪滴合成及びグリコーゲン合成の能力、の１つ以上を用いて、誘導性肝細胞として同定することができる。成功した誘導は、上皮マーカーの存在、及び誘導される細胞のマーカーの不在によって確認できる。例えば、誘導される細胞が線維芽細胞である場合、細胞が肝細胞様細胞に誘導されたことの更なる指標は、少なくとも１つの上皮細胞マーカー、例えばＥ－カドヘリンなどの発現、及び例えばＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるようなＣＯＬ１Ａ１、ＴＨＹ１、及びα－フェトプロテインなどの線維芽細胞マーカー遺伝子の発現の欠如で有り得る。
【0094】
Ａ．肝細胞誘導因子及びＭＹＣのアップレギュレーション
肝細胞誘導因子及びＭＹＣは、非肝細胞を、肝細胞誘導因子及びＭＹＣの遺伝子発現及び／又はタンパク質レベル／活性をアップレギュレートする因子と接触させることによってアップレギュレートされる。これらの事実は、核酸、タンパク質及び小分子を含むが、これらに限定されない。
肝細胞誘導因子及びＭＹＣは、非肝細胞を、肝細胞誘導因子及びＭＹＣの遺伝子発現及び／又はタンパク質レベル／活性をアップレギュレートする因子と接触させることによってアップレギュレートされる。これらの事実は、核酸、タンパク質及び小分子を含むが、これらに限定されない。
【0095】
例えば、アップレギュレーションは、肝細胞誘導因子（単数又は複数）及び場合によりＭＹＣをコードする核酸を非肝細胞（宿主細胞）に外因的に導入することによって達成されてもよい。核酸は同種又は異種であってもよい。核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡで有り得る。好ましくは、核酸分子はレンチウイルス発現により非肝細胞細胞に導入される。
【0096】
宿主細胞は、形質転換されて、肝細胞を誘導するＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ６Ａ、及びＦＯＸＡ２を過剰発現する。好ましくは、細胞は、増殖因子ＭＹＣを過剰発現するように更に形質転換される。発現されるべき核酸を含有するベクターは、宿主細胞に導入することができる。核酸は、例えば、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、又はマイクロインジェクションを含む技術によって哺乳動物細胞にトランスフェクトすることができる。本明細書に開示されるエクスビボ法は、例えば、被験体／ドナーから細胞を回収する工程、細胞を培養する工程、細胞に発現ベクターを形質導入する工程、及びコード化されたポリペプチドの発現に適した条件下で細胞を維持する工程を含むことができる。これらの方法は、分子生物学の技術分野で公知である。
【0097】
アップレギュレーションはまた、肝細胞誘導因子／ＭＹＣをコードする遺伝子の発現を増加させることが知られている因子及び／又は対応するタンパク質レベルを増加させることが知られている因子を用いて細胞を処理することによって達成されてもよい。例えば、Zhao, et al., Cell Res., 23(1):157-161 (2013)は、誘導因子ＦＧＦ７、ＢＭＰ２及びＢＭＰ４を用いて、ｈＥＳＣからのＰＲＯＸ１及びＨＮＦ６発現細胞の出現を促進する方法を開示する。肝細胞誘導因子の遺伝子発現又はタンパク質レベルをアップレギュレートする小分子及び／又はタンパク質を含む公知の因子もまた使用することができる。
【0098】
Ｂ．ｐ５３のダウンレギュレーション
ｐ５３は、ｐ５３遺伝子発現、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルをダウンレギュレートするように細胞を処理することによりダウンレギュレートすることができる。この工程は、細胞を、ｐ５３遺伝子発現、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルをダウンレギュレートすることが知られる、核酸分子、小分子及びタンパク質を含むがこれらに限定されない、公知で任意の分子と接触させることを含む。
ｐ５３は、ｐ５３遺伝子発現、ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルをダウンレギュレートするように細胞を処理することによりダウンレギュレートすることができる。この工程は、細胞を、ｐ５３遺伝子発現、ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルをダウンレギュレートすることが知られる、核酸分子、小分子及びタンパク質を含むがこれらに限定されない、公知で任意の分子と接触させることを含む。
【0099】
ｐ５３遺伝子発現は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、リボザイム、及びアプタマーからなる群より選択される、機能性核酸、又はそれらをコードするベクターを用いて阻害することができる。好ましくは、ｐ５３遺伝子発現は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを用いて阻害される。
【0100】
１．ＲＮＡ干渉
いくつかの実施態様では、Ｐ５３遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉を介して阻害される。遺伝子発現はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して高度に特異的な様式で効果的にサイレンシングすることができる。このサイレンシングはもともと二本鎖ＲＮＡの添加と共に観察された(Fire, et al. (1998) Nature, 391:806-11; Napoli, et al. (1990) Plant Cell 2:279-89; Hannon, (2002) Nature, 418:244-51)。一旦ｄｓＲＮＡが細胞内に入ると、ＲＮａｓｅIIIに似た酵素であるＤｉｃｅｒによって切断され、３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む、２１～２３ヌクレオチド長の２本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になる(Elbashir, et al. (2001) Genes Dev., 15:188-200; Bernstein, et al. (2001) Nature, 409:363-6; Hammond, et al. (2000) Nature, 404:293-6)。ＡＴＰに依存する段階では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列に導く、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として一般的に知られる多サブユニットタンパク質複合体に組み込まれる(Nykanen, et al. (2001) Cell, 107:309-21)。ある時点で、ｓｉＲＮＡ二本鎖は巻き戻され、そしてアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣに結合したままで、エンドおよびエキソヌクレアーゼの組み合わせによる相補的なｍＲＮＡ配列の分解を指向するようである(Martinez, et al. (2002) Cell, 110:563-74)。しかしながら、ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡの効果又はそれらの使用は、いずれのタイプのメカニズムにも限定されない。
いくつかの実施態様では、Ｐ５３遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉を介して阻害される。遺伝子発現はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して高度に特異的な様式で効果的にサイレンシングすることができる。このサイレンシングはもともと二本鎖ＲＮＡの添加と共に観察された(Fire, et al. (1998) Nature, 391:806-11; Napoli, et al. (1990) Plant Cell 2:279-89; Hannon, (2002) Nature, 418:244-51)。一旦ｄｓＲＮＡが細胞内に入ると、ＲＮａｓｅIIIに似た酵素であるＤｉｃｅｒによって切断され、３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを含む、２１～２３ヌクレオチド長の２本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）になる(Elbashir, et al. (2001) Genes Dev., 15:188-200; Bernstein, et al. (2001) Nature, 409:363-6; Hammond, et al. (2000) Nature, 404:293-6)。ＡＴＰに依存する段階では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列に導く、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として一般的に知られる多サブユニットタンパク質複合体に組み込まれる(Nykanen, et al. (2001) Cell, 107:309-21)。ある時点で、ｓｉＲＮＡ二本鎖は巻き戻され、そしてアンチセンス鎖は、ＲＩＳＣに結合したままで、エンドおよびエキソヌクレアーゼの組み合わせによる相補的なｍＲＮＡ配列の分解を指向するようである(Martinez, et al. (2002) Cell, 110:563-74)。しかしながら、ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡの効果又はそれらの使用は、いずれのタイプのメカニズムにも限定されない。
【0101】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列に特異的な転写後の遺伝子サイレンシングを誘導し、それにより遺伝子発現を低下又は阻害さえもすることができる二本鎖ＲＮＡである。一例では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡの両方の間の配列同一性の領域内で、ｍＲＮＡのような相同なＲＮＡ分子の特異的分解を引き起こす。例えば、国際公開公報第０２／４４３２１号は、３’オーバーハング末端をもつ、塩基対向した場合、標的ｍＲＮＡの配列に特異的な分解が可能なｓｉＲＮＡを開示しており、これらのｓｉＲＮＡを作製する方法については、参照により本明細書に組み込まれる。
【0102】
配列特異的な遺伝子のサイレンシングは、酵素Ｄｉｃｅｒによって産生されるｓｉＲＮＡを模倣する、合成の短い二本鎖ＲＮＡを用いて、哺乳動物細胞において達成することができる(Elbashir, et al. (2001) Nature, 411:494 498) (Ui-Tei, et al. (2000) FEBS Lett 479:79-82)。ｓｉＲＮＡは、化学的に又はインビトロで合成することができ、又は短い二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が、細胞内でｓｉＲＮＡに加工された結果であることもできる。合成ｓｉＲＮＡは、一般に、アルゴリズム及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて設計される。サプライヤーには、Ambion (Austin, Texas)、ChemGenes (Ashland, Massachusetts)、Dharmacon (Lafayette, Colorado)、Glen Research (Sterling, Virginia)、MWB Biotech (Esbersberg, Germany)、Proligo (Boulder, Colorado)、及び Qiagen (Vento, The Netherlands)が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、Ambion’s SILENCER(登録商標) siRNA Construction Kitなどのキットを用いてインビトロでも合成できる。
【0103】
ベクターからのｓｉＲＮＡの産生は、より一般的にはショートヘアピン型ＲＮＡｓｅ（ｓｈＲＮＡ）の転写を介して行われる。ｓｈＲＮＡを含むベクターを産生するためのキットは、例えば、Imgenex社の GENESUPPRESSOR(商標) Construction Kits及びInvitrogen社のBLOCK-IT(商標) 誘導性ＲＮＡｉプラスミド及びレンチウイルスベクターが利用可能である。
【0104】
２．アンチセンス
ｐ５３遺伝子発現を阻害するには、アンチセンス分子を用いることができる。アンチセンス分子は、標準的又は非標準的な塩基対形成のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分解を介して、標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写又は複製などの標的分子上で通常行われるプロセッシング機能を中断するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセスしやすい領域を見つけることによってアンチセンス効率を最適化するための方法は、数多くある。例示的な方法は、インビトロでの選択実験及びＤＭＳ及びＤＥＰＣを用いるＤＮＡ修飾研究を含む。アンチセンス分子は、１０－６、１０－８、１０－１０又は１０－１２以下の解離定数（Ｋｄ）で標的分子に結合することが好ましい。
ｐ５３遺伝子発現を阻害するには、アンチセンス分子を用いることができる。アンチセンス分子は、標準的又は非標準的な塩基対形成のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分解を介して、標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写又は複製などの標的分子上で通常行われるプロセッシング機能を中断するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最もアクセスしやすい領域を見つけることによってアンチセンス効率を最適化するための方法は、数多くある。例示的な方法は、インビトロでの選択実験及びＤＭＳ及びＤＥＰＣを用いるＤＮＡ修飾研究を含む。アンチセンス分子は、１０－６、１０－８、１０－１０又は１０－１２以下の解離定数（Ｋｄ）で標的分子に結合することが好ましい。
【0105】
「アンチセンス」核酸配列（アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に相補的な、又はｐ５３をコードするｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。アンチセンス核酸配列及び送達方法は、当該技術分野において周知である(Goodchild, Curr. Opin. Mol. Ther., 6(2):120-128 (2004); Clawson, et al., Gene Ther., 11(17):1331-1341 (2004)。アンチセンス核酸は、標的配列のコーディング鎖全体又はその一部のみに相補的で有り得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、長さが約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０又はそれ以上のヌクレオチドであり得る。
【0106】
アンチセンス核酸配列は、ｐ５３ｍＲＮＡ配列全体に相補的であるように設計することができるが、ｐ５３ｍＲＮＡの一部分のみにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドであることもできる。アンチセンス核酸は、化学合成及び当該技術分野で公知の方法を用いた酵素的連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド又は様々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができ、これらのヌクレオチドは、分子の生物学的安定性を増大させるか、又はアンチセンス及びセンス核酸の間に形成される二重鎖の物理的安定性を増大させるように設計されており、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換されたヌクレオチドを使用することができる。アンチセンス核酸はまた、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に産生することもできる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、次のサブセクションに更に説明される、関心対象の標的核酸に対するアンチセンス配向となる）。
【0107】
有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例では、α－異性体核酸が挙げられる。α異性体核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のβユニットとは逆に、鎖は互いに平行に走る(Gaultier et al., Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641 (1987))。アンチセンス核酸分子はまた、２’－ｏ－メチルリボヌクレオチド(Inoue et al. FEBS Lett., 215:327-330 (1987))又はキメラＲＮＡ－ＤＮＡ類似体(Inoue et al. FEBS Lett., 215:327-330 (1987))を含むことができる。
【0108】
３．アプタマー
いくつかの実施態様では、阻害分子は、アプタマーである。アプタマーは、標的分子と、好ましくは特定の方法で相互作用する分子である。アプタマーは非常に高い特異性で標的分子に結合することができる。例えば、標的分子と、その分子の単に１つの位置においてのみ異なる別の分子との間の結合親和性において、１万倍以上の差を有するアプタマーが単離されている。それらの強固な結合特性のため、及びアプタマー標的の表面形態がタンパク質標的の機能に関連する部分に多くの場合対応するために、アプタマーは強力な生物学的アンタゴニストであり得る。典型的には、アプタマーは、ステム－ループ又はＧ－カルテットのように定義された二次及び三次構造に折り畳まれる、長さが１５～５０塩基の範囲の小さい核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ及びテオフィリンなどの低分子、並びに逆転写酵素及びトロンビンなどの高分子に結合することができる。アプタマーは、標的分子に対し１０－１２Ｍ未満のＫｄで非常に強く結合することができる。アプタマーは、標的分子に１０－６、１０－８、１０－１０又は１０－１２未満のＫｄで結合することが好ましい。アプタマーは、標的分子とのＫｄが、バックグラウンド結合分子とのＫｄよりも、少なくとも１０，１００倍、１０００倍、１万倍、又は１０万倍低いことが好ましい。ポリペプチドのような分子について比較を行う場合、バックグラウンド分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。
いくつかの実施態様では、阻害分子は、アプタマーである。アプタマーは、標的分子と、好ましくは特定の方法で相互作用する分子である。アプタマーは非常に高い特異性で標的分子に結合することができる。例えば、標的分子と、その分子の単に１つの位置においてのみ異なる別の分子との間の結合親和性において、１万倍以上の差を有するアプタマーが単離されている。それらの強固な結合特性のため、及びアプタマー標的の表面形態がタンパク質標的の機能に関連する部分に多くの場合対応するために、アプタマーは強力な生物学的アンタゴニストであり得る。典型的には、アプタマーは、ステム－ループ又はＧ－カルテットのように定義された二次及び三次構造に折り畳まれる、長さが１５～５０塩基の範囲の小さい核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ及びテオフィリンなどの低分子、並びに逆転写酵素及びトロンビンなどの高分子に結合することができる。アプタマーは、標的分子に対し１０－１２Ｍ未満のＫｄで非常に強く結合することができる。アプタマーは、標的分子に１０－６、１０－８、１０－１０又は１０－１２未満のＫｄで結合することが好ましい。アプタマーは、標的分子とのＫｄが、バックグラウンド結合分子とのＫｄよりも、少なくとも１０，１００倍、１０００倍、１万倍、又は１０万倍低いことが好ましい。ポリペプチドのような分子について比較を行う場合、バックグラウンド分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。
【0109】
４．リボザイム
ｐ５３遺伝子発現はリボザイムを用いて阻害することができる。リボザイムは、分子内又は分子間のいずれかで、化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムが分子間反応を触媒することが好ましい。ヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼ型の反応を触媒するリボザイムには、ハンマーヘッドリボザイムなどの自然系で見いだせるリボザイムに基づく多くの異なるタイプがある。また、自然系では見いだせないが、特定のデノボ反応を触媒するように改変されたリボザイムも多数存在する。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ又はＤＮＡ基質を切断し、そしてより好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識及び結合とそれに続く切断を介して、核酸基質を切断する。この認識は、多くの場合標準又は非標準の塩基対の相互作用に基づいている。標的基質の認識が標的基質配列に基づいているために、この特性は、リボザイムを、核酸の標的特異的切断のための特に良好な候補にしている。
ｐ５３遺伝子発現はリボザイムを用いて阻害することができる。リボザイムは、分子内又は分子間のいずれかで、化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムが分子間反応を触媒することが好ましい。ヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼ型の反応を触媒するリボザイムには、ハンマーヘッドリボザイムなどの自然系で見いだせるリボザイムに基づく多くの異なるタイプがある。また、自然系では見いだせないが、特定のデノボ反応を触媒するように改変されたリボザイムも多数存在する。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ又はＤＮＡ基質を切断し、そしてより好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識及び結合とそれに続く切断を介して、核酸基質を切断する。この認識は、多くの場合標準又は非標準の塩基対の相互作用に基づいている。標的基質の認識が標的基質配列に基づいているために、この特性は、リボザイムを、核酸の標的特異的切断のための特に良好な候補にしている。
【0110】
５．三本鎖形成オリゴヌクレオチド
ｐ５３遺伝子発現は、三重鎖形成分子を用いて阻害することができる。三本鎖形成機能性核酸分子は、二本鎖又は一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用する場合、三本鎖と呼ばれる構造が形成され、そこにはワトソン－クリック塩基対及びフーグスティーン塩基対の両方に依存して複合体を形成するＤＮＡの三本鎖が存在する。高い親和性及び特異性で標的領域に結合することができるので、三本鎖分子は好ましい。三重鎖形成分子は、１０－６、１０－８、１０－１０又は１０－１２未満のＫｄで標的分子と結合することが好ましい。
ｐ５３遺伝子発現は、三重鎖形成分子を用いて阻害することができる。三本鎖形成機能性核酸分子は、二本鎖又は一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用する場合、三本鎖と呼ばれる構造が形成され、そこにはワトソン－クリック塩基対及びフーグスティーン塩基対の両方に依存して複合体を形成するＤＮＡの三本鎖が存在する。高い親和性及び特異性で標的領域に結合することができるので、三本鎖分子は好ましい。三重鎖形成分子は、１０－６、１０－８、１０－１０又は１０－１２未満のＫｄで標的分子と結合することが好ましい。
【0111】
６．外部ガイド配列
ｐ５３発現は、外部ガイド配列を用いて阻害することができる。外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子に結合する分子であり、ＲＮａｓｅＰによって認識され、その後標的分子が切断される。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に、適切に標的とするように設計することができる。ＲＮＡｓｅＰは、細胞内の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを助ける。細菌のＲＮＡｓｅＰを、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然のｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを用いて、実質的に任意のＲＮＡ配列を切断するためにリクルートすることができる。同様に、真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅＰ指向性のＲＮＡ切断を利用して、真核生物細胞内の所望の標的を切断することができる。種々の異なる標的分子の切断を容易にするために、ＥＧＳ分子を作製及び使用する方法の代表的な例は、当該技術分野において公知である。
ｐ５３発現は、外部ガイド配列を用いて阻害することができる。外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、複合体を形成する標的核酸分子に結合する分子であり、ＲＮａｓｅＰによって認識され、その後標的分子が切断される。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に、適切に標的とするように設計することができる。ＲＮＡｓｅＰは、細胞内の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを助ける。細菌のＲＮＡｓｅＰを、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然のｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを用いて、実質的に任意のＲＮＡ配列を切断するためにリクルートすることができる。同様に、真核生物ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅＰ指向性のＲＮＡ切断を利用して、真核生物細胞内の所望の標的を切断することができる。種々の異なる標的分子の切断を容易にするために、ＥＧＳ分子を作製及び使用する方法の代表的な例は、当該技術分野において公知である。
【0112】
７．ｓｈＲＮＡ
ｐ５３発現は、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びｓｈＲＮＡを発現するように改変された発現構築物を用いて阻害することができる。ｓｈＲＮＡの転写は、ポリメラーゼIII（ｐｏｌIII）プロモーターで開始され、４－５－チミン転写終結部位の２位で終結すると考えられている。発現すると、ｓｈＲＮＡは、３’ＵＵ－オーバーハングを有するステム－ループ構造に折りたたまれると考えられ；次いで、これらのｓｈＲＮＡの末端はプロセシングされ、ｓｈＲＮＡは約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ様分子に変換される(Brummelkamp et al., Science 296:550-553 (2002); Lee et al., Nature Biotechnol. 20:500-505 (2002); Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol. 20:497-500 (2002); Paddison et al., Genes Dev. 16:948-958 (2002); Paul et al., Nature Biotechnol. 20:505-508 (2002); Sui (2002) supra; Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052 (2002)。
ｐ５３発現は、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びｓｈＲＮＡを発現するように改変された発現構築物を用いて阻害することができる。ｓｈＲＮＡの転写は、ポリメラーゼIII（ｐｏｌIII）プロモーターで開始され、４－５－チミン転写終結部位の２位で終結すると考えられている。発現すると、ｓｈＲＮＡは、３’ＵＵ－オーバーハングを有するステム－ループ構造に折りたたまれると考えられ；次いで、これらのｓｈＲＮＡの末端はプロセシングされ、ｓｈＲＮＡは約２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ様分子に変換される(Brummelkamp et al., Science 296:550-553 (2002); Lee et al., Nature Biotechnol. 20:500-505 (2002); Miyagishi and Taira, Nature Biotechnol. 20:497-500 (2002); Paddison et al., Genes Dev. 16:948-958 (2002); Paul et al., Nature Biotechnol. 20:505-508 (2002); Sui (2002) supra; Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052 (2002)。
【0113】
Ｃ．送達ビヒクル
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、リボザイム、及びアプタマーなどの機能性核酸のインビボ発現のためのベクターを作製及び使用する方法は、当該分野において公知である。
アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、リボザイム、及びアプタマーなどの機能性核酸のインビボ発現のためのベクターを作製及び使用する方法は、当該分野において公知である。
【0114】
例えば、送達ビヒクルは、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクター(Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Canada)などの市販の製剤であり得る。ウイルスベクター送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージすることができるレトロウイルスベクター系などのウイルス系を介して行うことができる。次いで、組換えレトロウイルスを用いて感染させ、それにより、肝細胞誘導因子をコードする核酸を感染した細胞に送達することができる。改変された核酸を宿主細胞に導入する正確な方法は、もちろん、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、偽型レトロウイルスベクター、及びSoofiyani, et al., Advanced Pharmaceutical Bulletin, 3(2):249-255 (2013)に記載されているその他の使用を含む、他の技術がこの方法に広く利用可能である。ウイルスを改変して、安全性を高め、特異的な取り込みを増加させ、効率を改善することができる（例えば、Zhang, et al., Chinese J Cancer Res., 30(3):182-8 (2011), Miller, et al., FASEB J, 9(2):190-9 (1995), Verma, et al., Annu Rev Biochem., 74:711-38 (2005)を参照のこと）。
【0115】
リポソーム送達並びに受容体媒介性及び他のエンドサイトーシス機序などの、物理的形質導入技術を使用することもできる（例えば、Schwartzenberger et al., Blood, 87:472-478 (1996)を参照のこと）。LIPOFECTIN、LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, Md.)、SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Germany)及びTRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wis.)などの市販のリポソーム製剤、並びに当該技術分野において標準的な方法に従って開発された他のリポソームはよく知られている。更に、肝細胞誘導因子をコードする核酸又はベクターは、エレクトロポレーション並びにソノポレーションの方法によってインビボで送達することができる。エレクトロポレーションの間、電気パルスは、細胞膜を横切って印加されて、膜貫通電位差を生じさせ、不安定化された膜を介した核酸の一時的な膜透過及びトランスフェクションを可能にする(Soofiyani, et al., Advanced Pharmaceutical Bulletin, 3(2):249-255 (2013))。ソノポレーションは、超音波の局所的適用とガスマイクロバブルの血管内又は組織内への投与とを組み合わせて、血管及び組織の透過性を一時的に増加させる(Escoffre, et al., Curr Gene Ther., 13(1):2-14 (2013))。エレクトロポレーション及び超音波に基づく技術は、電気パルス又は超音波を標的組織又は器官に集中させることができ、したがって、遺伝子の送達及び発現がそれに限定されることから、標的トランスフェクション法である。これら又は他の一般的に使用される遺伝子導入方法のいずれかで達成される、開示された肝細胞誘導因子の発現又は過剰発現は、流体力学的注入、遺伝子銃の使用を含むが、それらに限定されない。
【0116】
ＩＶ．使用方法
本明細書に開示される研究は、薬物代謝機能を有するヒト肝細胞が、系統リプログラミングによって生成することができ、従って、医薬用途のための細胞資源を提供することを示す。
本明細書に開示される研究は、薬物代謝機能を有するヒト肝細胞が、系統リプログラミングによって生成することができ、従って、医薬用途のための細胞資源を提供することを示す。
【0117】
Ａ．インビトロ及び研究での用途
（ｉ）薬物試験
肝臓が薬物の代謝活性において中心的役割を果たすため、肝実質細胞は、薬物開発において重要な役割を果たす。現在、薬物候補の失敗の主な原因は、そのＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝、排泄）が理想的でないことである。創薬研究の根幹は、薬物代謝の全てに関与するヒト肝実質細胞である肝細胞における候補薬物の、代謝及び毒性の効果に対するものである。現在、インビトロでの薬物開発に使用される主な肝細胞は、ヒト成体の初代肝細胞である。それらの限られた供給源、及び初代肝細胞の機能をインビトロで維持することの困難さのために、薬剤開発における薬剤候補の適用は極めて限られている。薬物代謝酵素を発現する、本明細書に開示されるｈｉＨｅｐは、インビトロの薬物代謝研究に使用することができる。
（ｉ）薬物試験
肝臓が薬物の代謝活性において中心的役割を果たすため、肝実質細胞は、薬物開発において重要な役割を果たす。現在、薬物候補の失敗の主な原因は、そのＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝、排泄）が理想的でないことである。創薬研究の根幹は、薬物代謝の全てに関与するヒト肝実質細胞である肝細胞における候補薬物の、代謝及び毒性の効果に対するものである。現在、インビトロでの薬物開発に使用される主な肝細胞は、ヒト成体の初代肝細胞である。それらの限られた供給源、及び初代肝細胞の機能をインビトロで維持することの困難さのために、薬剤開発における薬剤候補の適用は極めて限られている。薬物代謝酵素を発現する、本明細書に開示されるｈｉＨｅｐは、インビトロの薬物代謝研究に使用することができる。
【0118】
（ｉｉ）研究
感染症に関する研究で遭遇する問題は、十分な動物モデルの欠如である。ｈＨＰＬＣ及びｈｉＨｅｐの両方は、感染症、例えばＢ型及びＣ型肝炎感染症の研究のためのヒト化マウスモデルを構築するために使用することができる。これらの動物モデルは、感染症、特に肝臓を感染させる疾患を処置するためのワクチン及び薬物の開発において、信頼性の高いインビボプラットフォームを提供することができる。
感染症に関する研究で遭遇する問題は、十分な動物モデルの欠如である。ｈＨＰＬＣ及びｈｉＨｅｐの両方は、感染症、例えばＢ型及びＣ型肝炎感染症の研究のためのヒト化マウスモデルを構築するために使用することができる。これらの動物モデルは、感染症、特に肝臓を感染させる疾患を処置するためのワクチン及び薬物の開発において、信頼性の高いインビボプラットフォームを提供することができる。
【0119】
ｉＨｅｐは、ＨＢＶ感染を再現するためのインビトロモデルとしての役割を果たすことができる。ｈｉＨｅｐは、ｈｉＨｅｐにおいてＨＢＶ受容体ＮＴＣＰを発現する。ＨＢＶに感染したｈｉＨｅｐは、ＨＢｃＡｇに対して免疫陽性であった。ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌、及びｈｉＨｅｐにおけるＨＢＶ－ＤＮＡ、ＨＢＶ－ＲＮＡ、ＨＢＶ－ｃｃｃＤＮＡの発現の分析は、ｈｉＨｅｐにおけるＨＢＶマーカーが、ＰＨＨにおけるそれらと同等であることを示す。ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌は、徐々に増加し、そして２０dpiでピークに達し；上清及び細胞内のＨＢＶ－ＤＮＡは少なくとも３６日間それらの発現を保持した。まとめると、これは、本明細書に開示される方法に従って得られたｈｉＨｅｐが、インビトロで長期間ＨＢＶ感染を支持し得ることを示す。
【0120】
Ｂ．インビボ用途
肝不全及び機能喪失は、肝疾患の最も重篤な結果の１つである。その急速な発症、急速な進行のため、肝移植は、これらの疾患の処置の主要な手段である。しかしながら、ドナー不足は、肝移植を待っている間に死亡する多くの患者において深刻な欠如を示す。
肝不全及び機能喪失は、肝疾患の最も重篤な結果の１つである。その急速な発症、急速な進行のため、肝移植は、これらの疾患の処置の主要な手段である。しかしながら、ドナー不足は、肝移植を待っている間に死亡する多くの患者において深刻な欠如を示す。
【0121】
したがって、ｉＨｅｐは、例えば、肝不全及び機能喪失疾患の処置に使用することができる。
【0122】
門脈への経皮又は経頸静脈注入、又は脾髄又は腹腔への注射による単離したｉＨｅｐ又はＨＰＬＣの移植は、肝移植と比較して侵襲性の低い方法である。ｉＨｅｐは、好ましくは、処置される同じ動物から得られる。宿主の肝臓は除去又は切除されないので、移植片機能の喪失が肝機能を悪化させることはない。更に、単離したｉＨｅｐは、潜在的には、容易なアクセスのために凍結保存され得る。ｉＨｅｐは、例えば、肝腫瘍に対する放射線療法に起因する放射線誘発肝障害から患者を救済するためのエクスビボ遺伝子療法のビヒクルとして使用することができる。ｉＨｅｐは、肝細胞の移植のために知られているマトリックスなどの担体を用いて、レシピエントの生体内に移植することができる。例えば、Zhou, et al., Liver Transpl., 17(4):418-27 (2011)は、肝細胞移植のための担体としての脱細胞化肝マトリックス（ＤＬＭ）の使用を開示している。Schwartz, et al., Int. J. Gastroentrol., 10(1)は、組織試料から肝臓及び膵臓細胞を単離し、ポリ－Ｌ－乳酸マトリックス上に播種し、同じ患者の腸間膜に再移植したことを開示している。
【0123】
ｉＨｅｐはまた、バイオ人工肝臓支持システムにおいて使用することができる。開示された細胞に基づくバイオ人工肝臓支持システムは、移植のための適切なドナー源が見つかるまでの間、肝不全の主な機能を一時的に代替して（有害物質を除去し、肝臓合成生理活性物質を供給して）、患者の内部環境を安定化及び改善するために構築される。バイオ人工肝臓の製造方法は、例えば、米国公開第２００８／０２０６７３３号に開示されている。
【0124】
Ｖ．キット
機能性肝細胞代謝特性を有する誘導性肝細胞への非肝細胞のインビトロリプログラミングを誘導するためのキットが開示される。前記キットは、肝細胞誘導因子であるＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＭＹＣをアップレギュレートする因子、及びｐ５３遺伝子発現及び／又はタンパク質活性をダウンレギュレートする因子を含む。１つの実施態様では、前記キットは、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、及びＦＯＸＡ２、ＭＹＣの任意のＤＮＡ配列、及びｐ５３遺伝子発現をダウンレギュレートするためのＤＮＡ配列を含む。好ましい実施態様では、キットは、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、及びＦＯＸＡ２、ＭＹＣ遺伝子を過剰発現するレンチウイルス及びｐ５３遺伝子発現を阻害する核酸を含む。
機能性肝細胞代謝特性を有する誘導性肝細胞への非肝細胞のインビトロリプログラミングを誘導するためのキットが開示される。前記キットは、肝細胞誘導因子であるＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、ＦＯＸＡ２、ＭＹＣをアップレギュレートする因子、及びｐ５３遺伝子発現及び／又はタンパク質活性をダウンレギュレートする因子を含む。１つの実施態様では、前記キットは、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、及びＦＯＸＡ２、ＭＹＣの任意のＤＮＡ配列、及びｐ５３遺伝子発現をダウンレギュレートするためのＤＮＡ配列を含む。好ましい実施態様では、キットは、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、及びＦＯＸＡ２、ＭＹＣ遺伝子を過剰発現するレンチウイルス及びｐ５３遺伝子発現を阻害する核酸を含む。
【実施例】
【0125】
ヒト胚線維芽細胞（ＨＥＦ）からヒト肝前駆細胞（ｈＨＰＣ）を生成するために、スクリーニングのためのいくつかの候補ＴＦを、（ｉ）肝器官形成におけるそれらの重要性、及び（ｉｉ）ヒト胎児肝細胞（ｈＦＬＣ）、肝細胞を生じる特定のヒト肝前駆細胞の本発明者らのＲＮＡシーケンスデータのコンピュータ分析に基づいて同定した（表１）。
【0126】
【表1】
増殖停止及び細胞死を克服するために、ｃ－ＭＹＣ及びＰ５３小分子干渉ＲＮＡ（Ｐ５３ｓｉＲＮＡ）と組み合わせた、様々な候補ＴＦの組合せをスクリーニングした(Du, et al., Cell Stem Cell, 16:119-134 (2015)。
【0127】
材料及び方法
ヒト初代細胞の単離及び培養
本研究は、日中友好病院臨床研究倫理委員会（倫理認可番号：２００９－５０）及び北京大学幹細胞研究監視委員会（ＳＣＲＯ２０１１０３－０３）により承認され、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施された。妊娠１４週目のヒト胚皮膚及び胎児肝臓組織を、患者のインフォームドコンセントを得て堕胎した組織から入手した。ヒト胚皮膚組織を鉗子で細断し、１mg/mL コラゲナーゼＩＶ（Gibco）中で３７℃にて１～２時間インキュベートした。酵素処理後、遠心分離によって細胞を回収し、ＨＥＦ培地（１０％ ウシ胎児血清（FBS, Ausbian）、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco）、１％ 非必須アミノ酸（NEAA, Gibco）及び１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（PS, Gibco）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM, Gibco））に再懸濁した。細胞を１０cmの組織培養皿上にプレーティングし、ＨＥＦ培地中で増殖させた。
ヒト初代細胞の単離及び培養
本研究は、日中友好病院臨床研究倫理委員会（倫理認可番号：２００９－５０）及び北京大学幹細胞研究監視委員会（ＳＣＲＯ２０１１０３－０３）により承認され、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施された。妊娠１４週目のヒト胚皮膚及び胎児肝臓組織を、患者のインフォームドコンセントを得て堕胎した組織から入手した。ヒト胚皮膚組織を鉗子で細断し、１mg/mL コラゲナーゼＩＶ（Gibco）中で３７℃にて１～２時間インキュベートした。酵素処理後、遠心分離によって細胞を回収し、ＨＥＦ培地（１０％ ウシ胎児血清（FBS, Ausbian）、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco）、１％ 非必須アミノ酸（NEAA, Gibco）及び１％ ペニシリン／ストレプトマイシン（PS, Gibco）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM, Gibco））に再懸濁した。細胞を１０cmの組織培養皿上にプレーティングし、ＨＥＦ培地中で増殖させた。
【0128】
胎児肝細胞は、以前に記載されているように得た(Lilja et al., Transplantation 64, 1240-1248 (1997))。簡単に説明すると、胎児肝組織を１mg/mL コラゲナーゼＩＶを補充した１０mL ＲＰＭＩ１６４０培地中で消化するために１～３mm３の断片に切断した。３７℃で１５～２０分間、消化を実施して、低速の遠心により赤血球を除去した。細胞をＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄し、遠心分離によって回収した。
【0129】
インフォームドコンセントを受けた後、肝移植に使用されなかったヒトドナー肝からヒト初代肝細胞を単離した（Seglen, Preparation of isolated rat liver cells. Methods in cell biology 13, 29-83 (1976)）。簡単に説明すると、肝組織を、組織が緻密でなくなるまで、コラゲナーゼＩＶ及びディスパーゼ（Sigma-Aldrich）で灌流して、ピンセットで分離した。肝細胞をＨＣＭ（Lonza）で３回洗浄し、コラーゲンで被覆したプレートにプレーティングし、ＨＣＭ中で培養した。長期間のＰＨＨ実験のために、ＰＨＨは、２Ｃ培地（基礎培地を、２％ Ｂ２７（Gibco）、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを含有するＨＣＭ又はウイリアムズＥ培地とし、ｃＡＭＰシグナル伝達活性化因子（５０μMフォルスコリン又は５０μM ｄｂｃＡＭＰ）及び１０μM ＳＢ４３１５４２を加えた）で培養した。サンドイッチ培養実験のために、ＰＨＨをプレーティングし、次いで、１％ ＩＴＳ（Gibco）、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１％ ＮＥＡＡ、１％ ＰＳ及び１０－７Ｍ デキサメタゾンを補充したＤＭＥＭ中で、氷冷したＭａｔｒｉｇｅｌ(BD Biosciences)を用いて、２４時間重層した。培養及び更なる実験は全てこの培地で行った。
【0130】
ＨｅｐＧ２細胞は、Hui Zhuang氏（北京大学健康科学センター）から寄贈されたものであり、１０％ ＦＢＳ、１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ、１％ ＰＳ及び１％ ＮＥＡＡ（Gibco）を含有するＤＭＥＭ中で培養した。
【0131】
分子クローニングとレンチウイルスの産生
転写因子の相補ＤＮＡをヒト完全長ＴｒｕｅＣｌｏｎｅｓ（商標）(Origene)から増幅し、ユーザーマニュアルに従ってｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ(System Biosciences)に挿入した。ｃ－ＭＹＣをＦｕ－ｔｅｔ－ｈＯｃｔ４（ｈＯｃｔ４をｃ－ＭＹＣで置換した）の誘導系にクローン化した。(Hou et al., Science 341, 651-654 (2013))。ｐ５３ｓｉＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣ－３’及び５’ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＡ－３’であった。オリゴヌクレオチドを、Ｌｅｎｔｉ－Ｌｏｘ３．７（ｐＬＬ３．７）ベクター(Obach, et al., Drug metab Dispos., 27(11): 1350-9 (1999))中のＵ６プロモーターの下流に連結した。レンチウイルスの産生及び回収については、以前に記載した(Obach, et al., Drug metab Dispos., 27(11): 1350-9 (1999))。
転写因子の相補ＤＮＡをヒト完全長ＴｒｕｅＣｌｏｎｅｓ（商標）(Origene)から増幅し、ユーザーマニュアルに従ってｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ(System Biosciences)に挿入した。ｃ－ＭＹＣをＦｕ－ｔｅｔ－ｈＯｃｔ４（ｈＯｃｔ４をｃ－ＭＹＣで置換した）の誘導系にクローン化した。(Hou et al., Science 341, 651-654 (2013))。ｐ５３ｓｉＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドは、５’－ＴＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＣ－３’及び５’ＴＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣＴＣＴＣＴＴＧＡＡＧＴＡＧＡＴＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＧＴＣＡ－３’であった。オリゴヌクレオチドを、Ｌｅｎｔｉ－Ｌｏｘ３．７（ｐＬＬ３．７）ベクター(Obach, et al., Drug metab Dispos., 27(11): 1350-9 (1999))中のＵ６プロモーターの下流に連結した。レンチウイルスの産生及び回収については、以前に記載した(Obach, et al., Drug metab Dispos., 27(11): 1350-9 (1999))。
【0132】
ｈＨＰＬＣ及びｈｉＨｅｐの生成
ヒト線維芽細胞を、５つの転写因子、Ｆｕ－ｔｅｔ－ｃ－ＭＹＣ、ＦＵｄｅｌｔａＧＷ－ｒｔＴＡ及びＰ５３ｓｉＲＮＡを含有するレンチウイルスで、１０μg/mLポリブレンを含有するＨＥＦ培地中で１０－２０のm.o.iで１２時間感染させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＨＥＦ培地中で７日間培養した。感染した細胞を２μg/mL ピューロマイシンで２４時間処理し、次いで、全ての細胞が上皮形態に変換するまで、ＨＥＭ（５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％ ＰＳを補充した５０％ ウイリアムズＥ培地、２％ Ｂ２７（ＶＡなし）、５mM ニコチンアミド、２００μM ２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸（ｐＶｃ）、３μM ＣＨＩＲ９９０２１、５μM ＳＢ４３１５４２、０．５μM スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）、５μM リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、４０ng/mL ＥＧＦ及び２μg/mL ドキシサイクリン）中で５日毎に４～５回再播種した。ｈＨＰＬＣをＨＥＭ中で維持し、４日毎に１：５の比率で継代した。肝前駆細胞の維持又は増殖について試験した１０種類の培地を表２Ａに示す。
ヒト線維芽細胞を、５つの転写因子、Ｆｕ－ｔｅｔ－ｃ－ＭＹＣ、ＦＵｄｅｌｔａＧＷ－ｒｔＴＡ及びＰ５３ｓｉＲＮＡを含有するレンチウイルスで、１０μg/mLポリブレンを含有するＨＥＦ培地中で１０－２０のm.o.iで１２時間感染させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＨＥＦ培地中で７日間培養した。感染した細胞を２μg/mL ピューロマイシンで２４時間処理し、次いで、全ての細胞が上皮形態に変換するまで、ＨＥＭ（５０％ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％ ＰＳを補充した５０％ ウイリアムズＥ培地、２％ Ｂ２７（ＶＡなし）、５mM ニコチンアミド、２００μM ２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸（ｐＶｃ）、３μM ＣＨＩＲ９９０２１、５μM ＳＢ４３１５４２、０．５μM スフィンゴシン－１－リン酸（Ｓ１Ｐ）、５μM リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、４０ng/mL ＥＧＦ及び２μg/mL ドキシサイクリン）中で５日毎に４～５回再播種した。ｈＨＰＬＣをＨＥＭ中で維持し、４日毎に１：５の比率で継代した。肝前駆細胞の維持又は増殖について試験した１０種類の培地を表２Ａに示す。
【0133】
【表2A】
【0134】
【表2B】
【0135】
ｈＨＰＬＣから機能性ｈｉＨｅｐを更に生成するために、ｈＨＰＬＣをコンフルエントになるまで培養し、次いで２Ｃ培地（５０μM フォルスコリン又は５０μM ｄｂｃＡＭＰ、及び１０μM ＳＢ４３１５４２を含むＨＣＭ）で７～１０日間処理した。
【0136】
遺伝子発現分析
全ＲＮＡをDirect-zol RNA Miniprep (ZYMO RESEARCH)により単離し、次いで、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (TransGen Biotech)により逆転写した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、BIO-RAD CFX384(商標)Real-time SystemでKAPA SYBR(登録商標) FAST Universal qPCR Mix (KAPA Biosystems)を用いて実施した。定量値は２つのハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ１３Ａ又はＲＲＮ１８Ｓ）によって決定されたインプットに対して正規化した。ＲＴ－ｑＰＣＲプライマー配列は、表３により提供される。
全ＲＮＡをDirect-zol RNA Miniprep (ZYMO RESEARCH)により単離し、次いで、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (TransGen Biotech)により逆転写した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、BIO-RAD CFX384(商標)Real-time SystemでKAPA SYBR(登録商標) FAST Universal qPCR Mix (KAPA Biosystems)を用いて実施した。定量値は２つのハウスキーピング遺伝子（ＲＰＬ１３Ａ又はＲＲＮ１８Ｓ）によって決定されたインプットに対して正規化した。ＲＴ－ｑＰＣＲプライマー配列は、表３により提供される。
【0137】
【表3】
【0138】
免疫蛍光（ＩＦ）染色
細胞を４％パラホルムアルデヒド（PFA, DingGuo）中で、室温にて１５分間固定し、０．２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及び５％ 正常ロバ血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.）を含有するＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。サンプルを４℃で、一次抗体と共に一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで室温にて適切な二次抗体と共に暗所で１時間インキュベートした。核をＤＡＰＩ（Roche）で染色した。ＩＦ染色に用いられる一次抗体を表４に示す。
細胞を４％パラホルムアルデヒド（PFA, DingGuo）中で、室温にて１５分間固定し、０．２５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００及び５％ 正常ロバ血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.）を含有するＰＢＳで室温にて１時間ブロッキングした。サンプルを４℃で、一次抗体と共に一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで室温にて適切な二次抗体と共に暗所で１時間インキュベートした。核をＤＡＰＩ（Roche）で染色した。ＩＦ染色に用いられる一次抗体を表４に示す。
【0139】
【表4】
免疫蛍光に用いた二次抗体は以下の通りであった：ＤｙＬｉｇｈｔ(登録商標)５５０ロバ抗ウサギ、ＤｙＬｉｇｈｔ(登録商標)５５０ロバ抗ヤギ、ＤｙＬｉｇｈｔ(登録商標)５５０ロバ抗マウス、ＤｙＬｉｇｈｔ(登録商標)５５０ロバ抗ウサギ、ＤｙＬｉｇｈｔ(登録商標)６５０ロバ抗ヤギ、ＤｙＬｉｇｈｔ(登録商標)６５０ロバ抗マウス及びＤｙＬｉｇｈｔ(登録商標)６５０ロバ抗ウサギ（全てAbcamより）。ＡＬＢ陽性細胞の定量化のために、Operetta High-Content Imaging System (PerkinElmer)を用いて同じ露光量で１０倍と２０倍の倍率で画像をランダムに撮影し、次いで、Columbus Image Data Storage and Analysis Systemによって分析した。
【0140】
フローサイトメトリー
アキュターゼ（Millipore）を用いて３７℃で３～５分間処理することにより、細胞を単細胞懸濁液中に放出した。細胞を基礎培地で洗浄した。完全に再懸濁した細胞を、４℃で２０分間、固定／透過溶液（BD,554714）中に加えた。１×ＢＤ透過／洗浄緩衝液中で細胞を２回洗浄した。その後、細胞を、２％ 正常ヤギ血清を有する透過洗浄緩衝液からなる２００μLの染色緩衝液中で、４℃で２時間一次抗体にコンジュゲートさせた。染色された細胞をＢＤ洗浄緩衝液中で２回洗浄し、二次抗体を含有する２００μL 染色緩衝液中でインキュベートした。ＢＤ洗浄緩衝液中で２回洗浄した後、細胞をＢＤ洗浄緩衝液中に再懸濁し、BD FACSCalibur flow cytometry systemで分析した。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析した。
アキュターゼ（Millipore）を用いて３７℃で３～５分間処理することにより、細胞を単細胞懸濁液中に放出した。細胞を基礎培地で洗浄した。完全に再懸濁した細胞を、４℃で２０分間、固定／透過溶液（BD,554714）中に加えた。１×ＢＤ透過／洗浄緩衝液中で細胞を２回洗浄した。その後、細胞を、２％ 正常ヤギ血清を有する透過洗浄緩衝液からなる２００μLの染色緩衝液中で、４℃で２時間一次抗体にコンジュゲートさせた。染色された細胞をＢＤ洗浄緩衝液中で２回洗浄し、二次抗体を含有する２００μL 染色緩衝液中でインキュベートした。ＢＤ洗浄緩衝液中で２回洗浄した後、細胞をＢＤ洗浄緩衝液中に再懸濁し、BD FACSCalibur flow cytometry systemで分析した。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアにより分析した。
【0141】
アルブミンＥＬＩＳＡ、α１－フェトプロテインイムノアッセイ、ＰＡＳ染色、ＬＤＬ取り込み、オイルレッドＯ染色
ヒトアルブミンの分泌は、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キット（Bethyl Laboratory）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。ヒトα１－フェトプロテインの分泌は、製造業者の指示に従って、ｃｏｂａｓ８０００によるイムノアッセイ（Roche）を用いて測定した。ＰＡＳ染色システムはSigma-Aldrichから購入した。培養物を４％ パラホルムアルデヒド（DingGuo）で固定し、製造業者の指示に従って染色した。ＬＤＬ取り込みアッセイのために、ｈｉＨｅｐを、１０μg/mL ＤｉＩ－Ａｃ－ＬＤＬ（Invitrogen）で４時間、及び１μg/mL Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Thermo Fisher Scientific）で３０分間、３７℃でインキュベートし、次いで、３回洗浄し、その後、蛍光顕微鏡を用いたイメージングを行った。脂質の検出は、製造業者の指示に従って、Lipid (Oil Red O) Staining Kit (Sigma)を用いて実施した。
ヒトアルブミンの分泌は、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ定量キット（Bethyl Laboratory）を用いて、製造業者の指示に従って測定した。ヒトα１－フェトプロテインの分泌は、製造業者の指示に従って、ｃｏｂａｓ８０００によるイムノアッセイ（Roche）を用いて測定した。ＰＡＳ染色システムはSigma-Aldrichから購入した。培養物を４％ パラホルムアルデヒド（DingGuo）で固定し、製造業者の指示に従って染色した。ＬＤＬ取り込みアッセイのために、ｈｉＨｅｐを、１０μg/mL ＤｉＩ－Ａｃ－ＬＤＬ（Invitrogen）で４時間、及び１μg/mL Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Thermo Fisher Scientific）で３０分間、３７℃でインキュベートし、次いで、３回洗浄し、その後、蛍光顕微鏡を用いたイメージングを行った。脂質の検出は、製造業者の指示に従って、Lipid (Oil Red O) Staining Kit (Sigma)を用いて実施した。
【0142】
チトクロムＰ４５０の活性の測定
ＣＹＰ４５０の活性を測定する方法については既に述べた。簡単に説明すると、ｈｉＨｅｐｓ及びＨｅｐＧ２細胞を、分離、懸濁して、それらのＣＹＰ４５０活性を測定し、Ｆ－ＰＨＨにおけるＣＹＰ４５０活性を単離直後に測定した。市販の凍結保存したＰＨＨをRILD (Shanghai)から購入し、蘇生後すぐに使用した。１つの５００μLの反応物は、２．５×１０５細胞及び示された基質を含んでいた。３７℃のオービタルシェーカー中で１５～３０分間インキュベートした後、反応物の三倍容量のクエンチング溶媒（メタノール）を含有する試験管にサンプルのアリコートを加えることにより反応を停止させ、－８０℃で凍結させた。同位体標識した参照代謝産物を、更なる質量分析（超高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析、ＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）のための内部標準として用いた。基質の詳細、内部標準及びその他の関連情報を表５に示す。
ＣＹＰ４５０の活性を測定する方法については既に述べた。簡単に説明すると、ｈｉＨｅｐｓ及びＨｅｐＧ２細胞を、分離、懸濁して、それらのＣＹＰ４５０活性を測定し、Ｆ－ＰＨＨにおけるＣＹＰ４５０活性を単離直後に測定した。市販の凍結保存したＰＨＨをRILD (Shanghai)から購入し、蘇生後すぐに使用した。１つの５００μLの反応物は、２．５×１０５細胞及び示された基質を含んでいた。３７℃のオービタルシェーカー中で１５～３０分間インキュベートした後、反応物の三倍容量のクエンチング溶媒（メタノール）を含有する試験管にサンプルのアリコートを加えることにより反応を停止させ、－８０℃で凍結させた。同位体標識した参照代謝産物を、更なる質量分析（超高速液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析、ＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）のための内部標準として用いた。基質の詳細、内部標準及びその他の関連情報を表５に示す。
【0143】
【表5】
【0144】
ＵＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析は、Sciex API4500Q-trap Mass Spectrometer (SCIEX)と連結したACQUITY H-Class UPLC System (Waters)を用いて行った。分析カラムは、プリガードカラムと連結したACQUITY UPLC(登録商標) BEH C18 1.7 μm 2.1 * 50 mmであった。結果は、１分当たり及び１００万細胞当たりの形成される代謝物のピコモルとして表される。ｈｉＨｅｐを直接用いてＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８及びＣＹＰ２Ｄ６の活性を測定した。ＣＹＰ１Ａ２の活性を測定するため、ｈＨＰＬＣを２Ｃ培地に３μM ＣＨＩＲ及び２μM Ｕ０１２６を加えて培養した。ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９の活性を測定するために、ｈｉＨｅｐを１０μMのリファンピンと共に培養した。
【0145】
ＣＹＰ３Ａ４，ＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ１Ａ２の誘導活性を測定するために、ｈｉＨｅｐを、更に、５０μM リファンピン、１mM フェノバルビタール、５０μM β－ナフトフラボン又は１０μM ランソプラゾールと共にＨＣＭ中で３日間培養した。ビヒクルで処理した群を用いて基礎活性を測定した。ＰＨＨの誘導活性を測定するために、ＰＨＨをサンドイッチ法で培養し、誘導した。
【0146】
肝クリアランスの測定
クリアランスの測定は、以前に記載されているように実施した(McGinnity, et al. Drug metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals 32, 1247-1253 (2004); Obach, et al.. Drug metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals 36, 1385-1405 (2008))。簡単に説明すると、１×１０６細胞／mLの細胞懸濁液及び２×薬物溶液を、インキュベーション培地（ウイリアムズＥ培地、１０mM ＨＥＰＥＳ［ｐＨ ７．４］、及び１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ）中で調製した。反応は、５００μLの薬物溶液を５００μLのｈｉＨｅｐに加える（１～２μMの最終基質濃度を得る）ことによって開始した。基質の詳細な情報を表６に示す。
クリアランスの測定は、以前に記載されているように実施した(McGinnity, et al. Drug metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals 32, 1247-1253 (2004); Obach, et al.. Drug metabolism and Disposition: The Biological Fate of Chemicals 36, 1385-1405 (2008))。簡単に説明すると、１×１０６細胞／mLの細胞懸濁液及び２×薬物溶液を、インキュベーション培地（ウイリアムズＥ培地、１０mM ＨＥＰＥＳ［ｐＨ ７．４］、及び１％ ＧｌｕｔａＭＡＸ）中で調製した。反応は、５００μLの薬物溶液を５００μLのｈｉＨｅｐに加える（１～２μMの最終基質濃度を得る）ことによって開始した。基質の詳細な情報を表６に示す。
【0147】
【表6】
これらの濃度は、ほとんどの基質に対してKm未満ではあるが、それでも十分な分析感度を有するように選択した。反応は、３７℃にて、インキュベーター中のオービタルシェーカーにおいて実施した。次いで、８０μLのアリコートを０、１５、３０、６０、９０，１２０，１８０及び２４０分で除去し、サンプルを、同位体標識した参照物質を含有する２４０μLのメタノール中でクエンチし、－８０℃で凍結した。これらの基質を、上述の有効な従来のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法を用いて定量した。アッセイは３回実施した。
【0148】
インビトロ内因性クリアランス（ＣＬｉｎｔ）は、以前に記載されているように、親の消失速度を用いて測定した（Houston, Biochemical pharmacology 47, 1469-1479 (1994); Levy et al., Nature biotechnology 33, 1264-1271 (2015)）。ｌｏｇ［基質］対時間のプロットからの線形回帰の勾配（－ｋ）を決定した。消失速度定数は、ｋ＝０．６９３／ｔ１／２であったので、ＣＬｉｎｔを親の消失のｔ１／２で表す式を、次式：Ｃｌｉｎｔ＝体積×０．６９３／ｔ１／２として導出した。ヒト肝重量２２g/kg体重、及び肝細胞密度１２０×１０６細胞/gの生理学的パラメータを用いて、肝細胞のＣＬｉｎｔ（単位、μL/分/１０６細胞）をインビボＣＬｉｎｔ（単位、mL/分/kg）にスケーリングした。ヒトのインビボ肝クリアランス（ＣＬｈ）の予測は、非制限的な、ｗｅｌｌｓｔｉｒｒｅｄモデルの改変版を用いて次のように行った：ＣＬｈ＝（ＣＬｉｎｔ×Ｑｈ）／（ＣＬｉｎｔ×Ｑｈ）、式中、Ｑｈは肝血流（ヒトＱｈ＝２０mL/分/kg）である。インビトロ及びインビボの結合の任意の差についての補正係数は作成せず、血漿と血液の間の薬物分布は単一であると仮定した。
【0149】
毒性アッセイ
毒性アッセイのために、ｈｉＨｅｐ、ＨｅｐＧ２細胞及びＰＨＨを９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレート中で培養した。７～８の希釈濃度を有する化合物を、ＨｅｐＧ２細胞を試験するために３％ ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中で、又はＰＨＨ及びｈｉＨｅｐを試験するためにＨＣＭ中で調製した。すべての条件下で最終のＤＭＳＯ濃度は一定であった。試験した化合物の詳細な情報を表７に列挙する((Seglen, et. Al., Methods in Cell Biology 13, 29-83 (1976)), Zhong et. Al., Clin Chim Acta. 412,1905-1911 (2011)))。
毒性アッセイのために、ｈｉＨｅｐ、ＨｅｐＧ２細胞及びＰＨＨを９６ウェルプレート又は３８４ウェルプレート中で培養した。７～８の希釈濃度を有する化合物を、ＨｅｐＧ２細胞を試験するために３％ ＦＢＳを有するＤＭＥＭ中で、又はＰＨＨ及びｈｉＨｅｐを試験するためにＨＣＭ中で調製した。すべての条件下で最終のＤＭＳＯ濃度は一定であった。試験した化合物の詳細な情報を表７に列挙する((Seglen, et. Al., Methods in Cell Biology 13, 29-83 (1976)), Zhong et. Al., Clin Chim Acta. 412,1905-1911 (2011)))。
【0150】
【表7】
【0151】
化合物を、半対数濃度増分による希釈系列において２群で試験した。細胞を化合物で２４時間処理した後、上清を廃棄し、蛍光プローブを含有する改変ＷＥＭ（２％ Ｂ２７及び１％ ＧｌｕｔａＭＡＸを補充したウィリアムズＥ培地）を細胞に加えた。以下の３つの蛍光プローブ：２μM CellTrace(商標) Calcein Red-Orange AM (Thermo Fisher Scientific)、０．１μM MitoTracker(商標) Deep Red FM (Thermo Fisher Scientific)及び１μg/mL Hoechst 33342 (Thermo Fisher Scientific)を、培養中の細胞をモニターするために同時に使用した。３０分間インキュベートした後、上清を廃棄し、細胞を二回洗浄した。画像はOperetta High-Content Imaging System (PerkinElmer)を用いて１０×対物レンズを用いて取得した。蛍光プローブを含有する上清を廃棄し、細胞を更に９．１％ ＣＣＫ－８（Dojindo）を含有する修飾したＷＥＭを用いてインキュベートした。インキュベーター内での１～４時間の発色反応後、SpectraMax i3x (Molecular Devices)を用いて４５０nmでの吸光度を読み取った。画像データはColumbus Image Data Storage and Analysis System (PerkinElmer)を用いて以下の工程でオンラインで分析した：（１）核の同定及び計数；（２）CellTrace(商標) Calcein Red-Orange AMによって標識した生細胞の同定及び計数；（３）MitoTracker(商標) Deep Red FMによって標識した生細胞の同定と計数。画像データ及びＣＣＫ－８アッセイデータから変換した各パラメータの生存率をＥｘｃｅｌに入力した。各パラメータの細胞生存率を生細胞比として表し、陰性対照に対して正規化した。これら４つのパラメータのＴＣ５０値を別々に算出し、最小ＴＣ５０値を最終ＴＣ５０として使用した。
【0152】
脂肪症及びリン脂質症アッセイ
細胞内脂質のイメージング及び定量は、製造業者の指示に従ってHCS LipidTOX(商標) Deep Red Neutral Lipid Stain (1000×) (Thermo Fisher Scientific)を用いて実施した。簡単に説明すると、ｈｉＨｅｐを以下の濃度勾配：ＴＣ５０の１００％、８０％、６０％、４０％、２０％及び０％を有する化合物と共にインキュベートした。アミオダロン、テトラサイクリン塩酸塩及びリファンピンのＴＣ５０値は、それぞれ３０μM，４００μM及び１００μMであり、使いやすいようにすべて丸めた。試験したウェル及び対照ウェルの全ての最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％であった。化合物と２４時間インキュベートした後、細胞を４％ ＰＦＡで固定した。核はＤＡＰＩで染色し、脂質は１×Neutral Lipid Stainで染色した。画像はOperetta High-Content Imaging System (PerkinElmer)を用いて撮影し、Columbus Image Data Storage and Analysis Systemを用いて分析した。
細胞内脂質のイメージング及び定量は、製造業者の指示に従ってHCS LipidTOX(商標) Deep Red Neutral Lipid Stain (1000×) (Thermo Fisher Scientific)を用いて実施した。簡単に説明すると、ｈｉＨｅｐを以下の濃度勾配：ＴＣ５０の１００％、８０％、６０％、４０％、２０％及び０％を有する化合物と共にインキュベートした。アミオダロン、テトラサイクリン塩酸塩及びリファンピンのＴＣ５０値は、それぞれ３０μM，４００μM及び１００μMであり、使いやすいようにすべて丸めた。試験したウェル及び対照ウェルの全ての最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％であった。化合物と２４時間インキュベートした後、細胞を４％ ＰＦＡで固定した。核はＤＡＰＩで染色し、脂質は１×Neutral Lipid Stainで染色した。画像はOperetta High-Content Imaging System (PerkinElmer)を用いて撮影し、Columbus Image Data Storage and Analysis Systemを用いて分析した。
【0153】
細胞内リン脂質の定量は、HCS LipidTOX(商標) Red Phospholipidosis Detection Reagent (1000×) (Thermo Fisher Scientific)を用いて、製造業者の指示に従って実施した。簡単に説明すると、ｈｉＨｅｐを、１×リン脂質症検出試薬及び以下の試験化合物の最終濃度で培養した：アミオダロン（ＴＣ５０≒３０μM）、クロルプロマジン（ＴＣ５０≒２５μM）及びリファンピン（ＴＣ５０≒１００μM）。ＴＣ５０値は、使いやすいようにすべて丸めた。化合物を以下の濃度勾配：ＴＣ５０の８０％、６０％、４０％、２０％及び０％で試験した。試験したすべてのウェルの最終ＤＭＳＯ濃度は一定であった。化合物及び検出試薬を２４時間インキュベートした後、細胞を４％ ＰＦＡで固定し、核をＤＡＰＩで染色した。画像はOperetta High-Content Imaging Systemを用いて撮影し、Columbus Image Data Storage and Analysis Systemを用いて分析した。
【0154】
薬物－薬物相互作用アッセイ
ＤＭＳＯ群のｈｉＨｅｐを、ＤＭＳＯを補充したＨＣＭ中で３日間培養した。ＲＩＦ群中のｈｉＨｅｐを、２０μMのリファンピンを補充したＨＣＭ中で３日間培養した。ＲＩＦ＋ＫＣ群中のｈｉＨｅｐを、２０μMのリファンピンを補充したＨＣＭ中で３日間培養し、３日目にＫＣを加えた。これらの条件の各日の最終ＤＭＳＯ濃度は、これら３群の中の最高濃度に統一した。アフラトキシンＢ１及びフルタミドは、毒性アッセイに続いてこれらの細胞に対して更に試験を行った。
ＤＭＳＯ群のｈｉＨｅｐを、ＤＭＳＯを補充したＨＣＭ中で３日間培養した。ＲＩＦ群中のｈｉＨｅｐを、２０μMのリファンピンを補充したＨＣＭ中で３日間培養した。ＲＩＦ＋ＫＣ群中のｈｉＨｅｐを、２０μMのリファンピンを補充したＨＣＭ中で３日間培養し、３日目にＫＣを加えた。これらの条件の各日の最終ＤＭＳＯ濃度は、これら３群の中の最高濃度に統一した。アフラトキシンＢ１及びフルタミドは、毒性アッセイに続いてこれらの細胞に対して更に試験を行った。
【0155】
ＨＢＶ感染及びＨＢＶ複製中間体の分析
ＨＢＶを、遠心フィルター装置(Centricon Plus-70, Biomax 100.000, Millipore Corp., Bedford, MA)を用いて、ＨＢＶ産生ＨｅｐＡＤ３８細胞系の上清から濃縮し、HBV-DNA RT-qPCR (KHB, Shanghai, China)により力価を測定した。ｈｉＨｅｐ及びＰＨＨを、２％ ＤＭＳＯ及び４％ ＰＥＧ８０００（Sigma Aldrich）を含有するＨＣＭ中で、約３００の感染多重度（ＭＯＩ）でＨｅｐＡＤ３８由来のＨＢＶで１６～２０時間感染させた。感染後、細胞をＰＢＳで９回洗浄し、高度２Ｃ培地で培養した。ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞を２％ ＦＢＳ、２％ ＤＭＳＯ及び４％ ＰＥＧ８０００を含有するＤＭＥＭ中、同じＭＯＩで感染させ、２％ ＦＢＳ及び２％ ＤＭＳＯを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ｈＨＰＬＣを、４％ ＰＥＧ８０００を含有するＨＥＭ中で感染させた。培地を３日毎に交換し、上清を採取した。ＨＢＶライフサイクルの阻害のために、ラミブジン（ＬＡＭ）（TargetMol）及びエンテカビル（ＥＴＶ）（TargetMol）を、感染中及び感染後にそれぞれ１μM及び０．５μMで使用した。ウイルス侵入阻害剤Ｎ末端ミリストイル化ペプチド（ＭＹＲ（Hui Zhuang氏の研究室提供））を感染中に５００μMで使用し、ＩＦＮ－α（Genway）を感染後に１０００U/mLで使用した。ＨＢＶウイルス抗原であるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを、製造業者の指示に従って市販のＥＬＩＳＡキット（Autobio, Henan, China）を用いて上清５０μLを用いて試験した。細胞外ＨＢＶ－ＤＮＡの定量を、ＨＢＶ検出キット（中国上海市ＫＨＢ）を用いたＤＮＡ抽出を介して実施した。細胞内ＨＢＶ－ＤＮＡはDNeasy Blood & Tissue kit (QIAGEN)を用いて抽出し、次の特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲにより定量した：５’－ＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴＣＣ－３’（順方向）及び５’－ＧＡＧＧＣＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴ－３’（逆方向）。ウイルスゲノム等価コピーは、既知のコピー数を有するサンプルから作成した標準曲線に基づいて算出した。リアルタイムＰＣＲは、KAPA SYBR(登録商標) FAST Universal qPCR Mix (KAPA Biosystems)及びBIO-RAD CFX384(商標) Real-time Systemを用いて実施した。
ＨＢＶを、遠心フィルター装置(Centricon Plus-70, Biomax 100.000, Millipore Corp., Bedford, MA)を用いて、ＨＢＶ産生ＨｅｐＡＤ３８細胞系の上清から濃縮し、HBV-DNA RT-qPCR (KHB, Shanghai, China)により力価を測定した。ｈｉＨｅｐ及びＰＨＨを、２％ ＤＭＳＯ及び４％ ＰＥＧ８０００（Sigma Aldrich）を含有するＨＣＭ中で、約３００の感染多重度（ＭＯＩ）でＨｅｐＡＤ３８由来のＨＢＶで１６～２０時間感染させた。感染後、細胞をＰＢＳで９回洗浄し、高度２Ｃ培地で培養した。ＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞を２％ ＦＢＳ、２％ ＤＭＳＯ及び４％ ＰＥＧ８０００を含有するＤＭＥＭ中、同じＭＯＩで感染させ、２％ ＦＢＳ及び２％ ＤＭＳＯを補充したＤＭＥＭ中で培養した。ｈＨＰＬＣを、４％ ＰＥＧ８０００を含有するＨＥＭ中で感染させた。培地を３日毎に交換し、上清を採取した。ＨＢＶライフサイクルの阻害のために、ラミブジン（ＬＡＭ）（TargetMol）及びエンテカビル（ＥＴＶ）（TargetMol）を、感染中及び感染後にそれぞれ１μM及び０．５μMで使用した。ウイルス侵入阻害剤Ｎ末端ミリストイル化ペプチド（ＭＹＲ（Hui Zhuang氏の研究室提供））を感染中に５００μMで使用し、ＩＦＮ－α（Genway）を感染後に１０００U/mLで使用した。ＨＢＶウイルス抗原であるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇを、製造業者の指示に従って市販のＥＬＩＳＡキット（Autobio, Henan, China）を用いて上清５０μLを用いて試験した。細胞外ＨＢＶ－ＤＮＡの定量を、ＨＢＶ検出キット（中国上海市ＫＨＢ）を用いたＤＮＡ抽出を介して実施した。細胞内ＨＢＶ－ＤＮＡはDNeasy Blood & Tissue kit (QIAGEN)を用いて抽出し、次の特異的プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲにより定量した：５’－ＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴＣＣ－３’（順方向）及び５’－ＧＡＧＧＣＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴ－３’（逆方向）。ウイルスゲノム等価コピーは、既知のコピー数を有するサンプルから作成した標準曲線に基づいて算出した。リアルタイムＰＣＲは、KAPA SYBR(登録商標) FAST Universal qPCR Mix (KAPA Biosystems)及びBIO-RAD CFX384(商標) Real-time Systemを用いて実施した。
【0156】
ＨＢＶ特異的ＲＮＡを定量するために、Direct-zol RNA Miniprep kit (ZYMO RESEARCH)を用いて、ＨＢＶに感染した細胞から全ＲＮＡを単離した。ＨＢＶ特異的ＲＮＡの定量を前述のように実施した。約４００ngの全ＲＮＡを、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix (TransGen Biotech)を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。ＨＢＶ３．５kb転写産物には以下のプライマーを使用した：５’－ＧＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴＣＣ－３’及び５－ＧＡＧＧＣＧＡＧＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴ－３’。以下のプライマーを、ＨＢＶ特異的転写産物の全てに使用した：５’－ＴＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＣ－３’及び５’－ＡＡＧＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡＧ－３’。これらの転写産物の定量はリアルタイムＰＣＲにより実施した。
【0157】
ＨＢＶｃｃｃＤＮＡは、Yanwei Zhong et al.が以前に報告したように、ローリングサークル増幅とリアルタイムＰＣＲを組み合わせて定量化した。一本鎖及び弛緩環状ＤＮＡは、ＤＮＡテンプレートをプラスミドセーフアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）依存性デオキシリボヌクレアーゼＤＮａｓｅ(PSAD, Epicentre Technologies)で処理することにより増幅前に分解された。ＰＳＡＤで処理した試料は、ｃｃｃＤＮＡ選択性プライマーによって媒介されるリアルタイムＰＣＲに先駆けてローリングサークル増幅（ＲＣＡ）に供した。ＲＣＡを媒介するために４対のプライマーを設計した。
ＲＣＡ１ ＡＡＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＡ＊Ｃ＊Ｃ９９－１１３
ＲＣＡ２ ＡＣＣＴＡＴＴＣＴＣＣＴＣ＊Ｃ＊Ｃ１７５８－１７４４
ＲＣＡ３ ＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧ＊Ｇ＊Ｃ５１０－５２４
ＲＣＡ４ ＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＧ＊Ｇ＊Ｃ２６８９－２６７５
ＲＣＡ５ ＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＴＴＣ＊Ａ＊Ｃ１６８６－１７００
ＲＣＡ６ ＣＴＡＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧ＊Ｇ＊Ｔ２９－１５
ＲＣＡ７ ＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴ＊Ｃ＊Ｃ２２４０－２２５４
ＲＣＡ８ ＧＧＧＣＣＣＡＣＡＴＡＴＴ＊Ｇ＊Ｔ２５９９－２５８５
ＲＣＡ１ ＡＡＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＡ＊Ｃ＊Ｃ９９－１１３
ＲＣＡ２ ＡＣＣＴＡＴＴＣＴＣＣＴＣ＊Ｃ＊Ｃ１７５８－１７４４
ＲＣＡ３ ＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＴＧＧ＊Ｇ＊Ｃ５１０－５２４
ＲＣＡ４ ＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＧ＊Ｇ＊Ｃ２６８９－２６７５
ＲＣＡ５ ＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＴＴＣ＊Ａ＊Ｃ１６８６－１７００
ＲＣＡ６ ＣＴＡＧＣＡＧＡＧＣＴＴＧ＊Ｇ＊Ｔ２９－１５
ＲＣＡ７ ＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＴ＊Ｃ＊Ｃ２２４０－２２５４
ＲＣＡ８ ＧＧＧＣＣＣＡＣＡＴＡＴＴ＊Ｇ＊Ｔ２５９９－２５８５
【0158】
Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs, Worcester, MA)を用いて、３０℃で１６時間反応を行い、６５℃、１０分間で終了させた。テンプレートとしてＲＣＡ産物を用いて、ＨＢＶｃｃｃＤＮＡを更に増幅し、ｃｃｃＤＮＡ選択性プライマー対（５’－ＧＧＧＧＣＧＣＡＣＣＴＣＴＣＴＴＴＡ－３’１５２１－１５３８；５’－ＡＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣ－３’１８８６－１８７０）を介したリアルタイムＰＣＲにより定量した。
【0159】
ＨＢＶｃｃｃＤＮＡのサザンブロット分析については、Cai et al., (Methods in Molecular Biology 1030, 151-161 (2013))に記載された方法を修正して使用した。簡単に説明すると、修正したＨｉｒｔ法を、記載されたようにタンパク質非含有ウイルスＤＮＡを抽出するために使用し、抽出したＤＮＡサンプルの半分をＳｐｅ１（ＮＥＢ）で処理した。サザンブロッティングのために、ＤＮＡを１．２％ アガロースゲルで分離し、次いでＨｙｂｏｎｄ－ＸＬ膜に転写した。３．２kb及び２．０kbのＨＢＶ ＤＮＡ断片も同じアガロースゲルで泳動し、分子マーカーとして用いた。サザンブロットは、「Roche Techniques for Hybridization of DIG-labeled Probes to a Blot」を参照して、DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche, 11 585 614 910)を用いて実施した。レーン１～４は、患者の血清からのＨＢＶに感染したｈｉＨｅｐ由来のＨｉｒｔＤＮＡであり、レーン５～６はＨｅｐＡＤ３８由来のＨＢＶに感染したｈｉＨｅｐ由来のＨｉｒｔＤＮＡであった。
【0160】
ＲＮＡシーケンシング及びバイオインフォマティクス分析
RNeasyMini kit (QIAGEN)を用いて、ＨＥＦ、ｈＨＰＬＣ、ｈｉＨｅｐ、胎児肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、及びＦ－ＰＨＨから全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡシーケンシングライブラリーは、製造業者の推奨に従って、NEBNext Ultra(商標) RNA Library Prep kit for Illumina (NEB, USA)を用いて調製した。断片化しランダムにプライミングした１５０bpのペアエンドライブラリーをIllumina Hiseq 4000 platform上でシーケンスした。生成されたシーケンスリードは、ＳＴＡＲを用いてヒトゲノムビルドｈｇ１９に対してマッピングされ、各遺伝子についてのリードカウントは、フィーチャーカウントを用いて算出された。
RNeasyMini kit (QIAGEN)を用いて、ＨＥＦ、ｈＨＰＬＣ、ｈｉＨｅｐ、胎児肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、及びＦ－ＰＨＨから全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡシーケンシングライブラリーは、製造業者の推奨に従って、NEBNext Ultra(商標) RNA Library Prep kit for Illumina (NEB, USA)を用いて調製した。断片化しランダムにプライミングした１５０bpのペアエンドライブラリーをIllumina Hiseq 4000 platform上でシーケンスした。生成されたシーケンスリードは、ＳＴＡＲを用いてヒトゲノムビルドｈｇ１９に対してマッピングされ、各遺伝子についてのリードカウントは、フィーチャーカウントを用いて算出された。
【0161】
遺伝子発現はＤＥＳｅｑ２により正規化し、全サンプルの総計カウントが１未満の低発現遺伝子は除外した。ＲＮＡ－ｓｅｑデータの教師なしの階層的クラスタリングは、Ｒ(R 3.4.3, https://www.r-project.org)のｈｃｌｕｓｔパッケージにより行った。ヒートマップはｐｈｅａｔｍａｐパッケージによって生成された。
【0162】
マイクロＲＮＡシーケンシング及びｑＰＣＲ分析
マイクロＲＮＡシーケンシングのために、全ＲＮＡをTRNzol Universal (TIANGEN)を用いて抽出した。ＲＮＡシーケンシングライブラリーは、製造業者の推奨に従って、NEB Next(登録商標) Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (NEB, USA)を用いて調製した。断片化しランダムにプライミングした１４０～１６０bpのシングルエンドライブラリーをIllumina Hiseq 2500 platform上でシーケンシングした。最初に、生のマイクロＲＮＡディープシーケンシングデータの品質をソフトウェアＦａｓｔＱＣによってチェックした。その後、ヒトゲノムビルドｈｇ１９に対してマッピングされたシーケンサーから生成されたクリーンなｆａｓｔａフォーマットのシーケンシングリードを生成し、ｍｉＲＤｅｅｐ２によってリードカウントを算出した。同定されたｍｉＲＮＡの全てを、ｍｉＲＢａｓｅのリリース２２(２０１８年３月) (Kubota, et al., PNAS, 97, 12132-12137 (2000))において公表されたものと比較した。そして次に、マイクロＲＮＡ発現はＤＥＳｅｑ２により正規化した。ヒートマップは、Ｒ（Ｒ３．４．３）のｐｈｅａｔｍａｐパッケージ（ｐｈｅａｔｍａｐ１．０．８）によって実施した。重要な肝マイクロＲＮＡは、以前の報告 (Szabo, et al., Nature Reviews. Gastroenterology &hepatology 10, 542-552 (2013); Willeit, et al., European Heart Journal 37, 3260-3266 (2016); Lazaro et al., Hepatology 38, 1095-1106 (2003))に従って選択した。
マイクロＲＮＡシーケンシングのために、全ＲＮＡをTRNzol Universal (TIANGEN)を用いて抽出した。ＲＮＡシーケンシングライブラリーは、製造業者の推奨に従って、NEB Next(登録商標) Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina (NEB, USA)を用いて調製した。断片化しランダムにプライミングした１４０～１６０bpのシングルエンドライブラリーをIllumina Hiseq 2500 platform上でシーケンシングした。最初に、生のマイクロＲＮＡディープシーケンシングデータの品質をソフトウェアＦａｓｔＱＣによってチェックした。その後、ヒトゲノムビルドｈｇ１９に対してマッピングされたシーケンサーから生成されたクリーンなｆａｓｔａフォーマットのシーケンシングリードを生成し、ｍｉＲＤｅｅｐ２によってリードカウントを算出した。同定されたｍｉＲＮＡの全てを、ｍｉＲＢａｓｅのリリース２２(２０１８年３月) (Kubota, et al., PNAS, 97, 12132-12137 (2000))において公表されたものと比較した。そして次に、マイクロＲＮＡ発現はＤＥＳｅｑ２により正規化した。ヒートマップは、Ｒ（Ｒ３．４．３）のｐｈｅａｔｍａｐパッケージ（ｐｈｅａｔｍａｐ１．０．８）によって実施した。重要な肝マイクロＲＮＡは、以前の報告 (Szabo, et al., Nature Reviews. Gastroenterology &hepatology 10, 542-552 (2013); Willeit, et al., European Heart Journal 37, 3260-3266 (2016); Lazaro et al., Hepatology 38, 1095-1106 (2003))に従って選択した。
【0163】
マイクロＲＮＡのｑＰＣＲ分析のために、全ＲＮＡをTRNzol Universal (TIANGEN)を用いて抽出し、次いでmiRcute miRNA First-strand cDNA (TIANGEN)を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ｑＰＣＲは、下記に列挙したプライマーでmiRcute miRNA qPCR Detection (TIANGEN)を用いて実施した。マイクロＲＮＡの相対的な発現は、Ｕ６スプライソソームＲＮＡに対して正規化する。
ｍｉＲ－１５ａ ＴＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧ
ｍｉＲ－３７８ ＴＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＴＧＴ
ｍｉＲ－３０ｅ ＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＣＴＧＧＡＡＧ
ｍｉＲ－１９２－３ｐ ＣＴＧＣＣＡＡＴＴＣＣＡＴＡＧＧＴＣＡＣＡＧ
ｍｉＲ－１２２ ＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧ
ｍｉＲ－１９４ ＴＧＴＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡ
ｍｉＲ－２５ ＣＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＴＣＧＧＴＣＴＧＡ
ｍｉＲ－２６ｂ ＴＴＣＡＡＧＴＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＧＴ
Ｕ６－順方向 ＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡ
Ｕ６－逆方向 ＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴ
ｍｉＲ－１５ａ ＴＡＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＡＴＧＧＴＴＴＧＴＧ
ｍｉＲ－３７８ ＴＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＧＴＣＣＴＧＴＧＴ
ｍｉＲ－３０ｅ ＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＴＴＧＡＣＴＧＧＡＡＧ
ｍｉＲ－１９２－３ｐ ＣＴＧＣＣＡＡＴＴＣＣＡＴＡＧＧＴＣＡＣＡＧ
ｍｉＲ－１２２ ＴＧＧＡＧＴＧＴＧＡＣＡＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧ
ｍｉＲ－１９４ ＴＧＴＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡ
ｍｉＲ－２５ ＣＡＴＴＧＣＡＣＴＴＧＴＣＴＣＧＧＴＣＴＧＡ
ｍｉＲ－２６ｂ ＴＴＣＡＡＧＴＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＡＧＧＴ
Ｕ６－順方向 ＣＴＣＧＣＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＣＡ
Ｕ６－逆方向 ＡＡＣＧＣＴＴＣＡＣＧＡＡＴＴＴＧＣＧＴ
【0164】
ＤＮＡメチローム分析
細胞を細胞懸濁液中に放出し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡを、QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)を用いて抽出した。ＤＮＡメチル化のレベルはIllumina Infinium HD Methylation Assay (Illumina)を用いたIllumina 850K Genechipにより、製造業者の指示に従って、測定した。メチル化レベルの生データは、illumine 850k platformにより実施した。すべての部位およびプロモーター領域のＣｐＧメチル化レベルは、RnBeads (RnBeads_1.12.1, 1, https://github.com/thomasvangurp/epiGBS/tree/master/RnBeads) R packageにより算出した。すべてのＤＮＡメチル化部位およびプロモーターの教師なし階層的クラスタリングは、Ｒ（Ｒ３．４．３）のｈｃｌｕｓｔパッケージにより実施した。ヒートマップはｐｈｅａｔｍａｐパッケージによって生成した。全サンプルの特定領域の可視化は、ソフトウェアＩＧＶ(IGV_2.4.14, 4, https://github.com/igvteam/igv)により行った。
細胞を細胞懸濁液中に放出し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡを、QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)を用いて抽出した。ＤＮＡメチル化のレベルはIllumina Infinium HD Methylation Assay (Illumina)を用いたIllumina 850K Genechipにより、製造業者の指示に従って、測定した。メチル化レベルの生データは、illumine 850k platformにより実施した。すべての部位およびプロモーター領域のＣｐＧメチル化レベルは、RnBeads (RnBeads_1.12.1, 1, https://github.com/thomasvangurp/epiGBS/tree/master/RnBeads) R packageにより算出した。すべてのＤＮＡメチル化部位およびプロモーターの教師なし階層的クラスタリングは、Ｒ（Ｒ３．４．３）のｈｃｌｕｓｔパッケージにより実施した。ヒートマップはｐｈｅａｔｍａｐパッケージによって生成した。全サンプルの特定領域の可視化は、ソフトウェアＩＧＶ(IGV_2.4.14, 4, https://github.com/igvteam/igv)により行った。
【0165】
増殖曲線と倍加時間
異なる継代での線維芽細胞及びｈＨＰＬＣの細胞数を、１２ウェルプレートで中に細胞を播種した後、０、２、３及び４日目にカウントした。増殖量の測定値が、０日目でｑ１（単位、細胞）そして時間ｔ２（単位、時間）でｑ２だった場合、倍加時間Ｔｄ（単位、時間）は次のように算出した。
Ｔｄ＝（ｔ２×ｌｏｇ２）／（ｌｏｇ（ｑ２／ｑ１））。
異なる継代での線維芽細胞及びｈＨＰＬＣの細胞数を、１２ウェルプレートで中に細胞を播種した後、０、２、３及び４日目にカウントした。増殖量の測定値が、０日目でｑ１（単位、細胞）そして時間ｔ２（単位、時間）でｑ２だった場合、倍加時間Ｔｄ（単位、時間）は次のように算出した。
Ｔｄ＝（ｔ２×ｌｏｇ２）／（ｌｏｇ（ｑ２／ｑ１））。
【0166】
線維芽細胞におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３によりマークされたサイレントな肝細胞遺伝子の活性化に関するＲＮＡ－ｓｅｑデータの分析
図６Ｂにおいて分析した参照ＲＮＡ－ｓｅｑの生データをＧＥＯ（アクセッション番号ＧＳＥ１０３０７８）からダウンロードした。生のリードをｔｏｐｈａｔ２によってｈｇ１９にマッピングし、そしてＨＴｓｅｑを用いて遺伝子発現レベルを算出した。ＧＳＥ１０３０７８からの発現データ及び本発明者らの研究からのデータを、Ｒパッケージ（preprocessCore）を用いた分位法によって正規化した。遺伝子活性化レベルは、線維芽細胞においてＨ３Ｋ９ｍｅ３によってマークされ、Kenneth S. Zaret (Becker et al., Molecular Cell 68, 1023-1037 e1015 (2017))によって定義されるサイレントな肝遺伝子を用いて算出した。上記の方法を用いて、ｈｉＨｅｐのｌｏｇ２遺伝子発現を、０％が線維芽細胞のｌｏｇ２遺伝子発現を表し、１００％が初代ヒト肝細胞のｌｏｇ２遺伝子発現を表す、相対スケールで算出した。負の値（ｈｉＨｅｐｓの遺伝子発現が、線維芽細胞のそれより低かった）は０％に丸められた。ＧＳＥ１０３０７８からの相対的な発現値、及び発明者らの研究からのデータの分布を、Ｒのｇｇｐｌｏｔ２パッケージを用いてバイオリンプロットにより可視化した。
図６Ｂにおいて分析した参照ＲＮＡ－ｓｅｑの生データをＧＥＯ（アクセッション番号ＧＳＥ１０３０７８）からダウンロードした。生のリードをｔｏｐｈａｔ２によってｈｇ１９にマッピングし、そしてＨＴｓｅｑを用いて遺伝子発現レベルを算出した。ＧＳＥ１０３０７８からの発現データ及び本発明者らの研究からのデータを、Ｒパッケージ（preprocessCore）を用いた分位法によって正規化した。遺伝子活性化レベルは、線維芽細胞においてＨ３Ｋ９ｍｅ３によってマークされ、Kenneth S. Zaret (Becker et al., Molecular Cell 68, 1023-1037 e1015 (2017))によって定義されるサイレントな肝遺伝子を用いて算出した。上記の方法を用いて、ｈｉＨｅｐのｌｏｇ２遺伝子発現を、０％が線維芽細胞のｌｏｇ２遺伝子発現を表し、１００％が初代ヒト肝細胞のｌｏｇ２遺伝子発現を表す、相対スケールで算出した。負の値（ｈｉＨｅｐｓの遺伝子発現が、線維芽細胞のそれより低かった）は０％に丸められた。ＧＳＥ１０３０７８からの相対的な発現値、及び発明者らの研究からのデータの分布を、Ｒのｇｇｐｌｏｔ２パッケージを用いてバイオリンプロットにより可視化した。
【0167】
統計解析
サンプルサイズはいかなる統計的方法によっても事前決定されておらず、系統再プログラミング及び幹細胞生物学の分野における標準的な慣行に基づく、ならびに予備データに基づく実験タイプに依存していた。実験は無作為化されておらず、研究者らは、実験中の割り付け及び結果の評価について盲検化されていなかった。すべての測定において、「ｎ」は生物学的反復の数を表す。実験は少なくとも２回、独立にして繰り返され、そして代表的なデータを示した。群比較のためのＰ値は１元配置分散分析を用いて算出した。相関は、ピアソン相関係数を用いて評価した。全てのグラフにおける有意水準は、以下のように表される：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１。別途記載されていない限り、標準的な統計解析は、デフォルトパラメータを用いてＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７で実施した。エラーバーはすべてＳＥＭを表す。
サンプルサイズはいかなる統計的方法によっても事前決定されておらず、系統再プログラミング及び幹細胞生物学の分野における標準的な慣行に基づく、ならびに予備データに基づく実験タイプに依存していた。実験は無作為化されておらず、研究者らは、実験中の割り付け及び結果の評価について盲検化されていなかった。すべての測定において、「ｎ」は生物学的反復の数を表す。実験は少なくとも２回、独立にして繰り返され、そして代表的なデータを示した。群比較のためのＰ値は１元配置分散分析を用いて算出した。相関は、ピアソン相関係数を用いて評価した。全てのグラフにおける有意水準は、以下のように表される：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊ Ｐ＜０．００１。別途記載されていない限り、標準的な統計解析は、デフォルトパラメータを用いてＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７で実施した。エラーバーはすべてＳＥＭを表す。
【0168】
コード及びデータの可用性
研究において示されたデータを分析するために用いたバイオインフォマティクススクリプトは、ＧｉｔＨｕｂから入手可能である。ＲＮＡシーケンシングデータはＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）で、アクセッション番号ＧＳＥ１１２３３０として入手可能である。すべての図は関連する生データを有し、本試験の結論を支持するデータは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手可能である。
研究において示されたデータを分析するために用いたバイオインフォマティクススクリプトは、ＧｉｔＨｕｂから入手可能である。ＲＮＡシーケンシングデータはＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）で、アクセッション番号ＧＳＥ１１２３３０として入手可能である。すべての図は関連する生データを有し、本試験の結論を支持するデータは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手可能である。
【0169】
結果及び考察
本研究は、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ及びＦＯＸＡ２を含有する５－ＴＦカクテルが、アルブミン（ＡＬＢ）及びα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の陽性細胞の産生をもたらしたことを示し、ＨＥＦからの肝運命変換を示唆する（データーは図示せず）。
本研究は、ＨＨＥＸ、ＨＮＦ６Ａ、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４Ａ及びＦＯＸＡ２を含有する５－ＴＦカクテルが、アルブミン（ＡＬＢ）及びα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の陽性細胞の産生をもたらしたことを示し、ＨＥＦからの肝運命変換を示唆する（データーは図示せず）。
【0170】
肝前駆細胞の特性を有する細胞を取得し増殖させるために、５－ＴＦを過剰発現するＨＥＦが、１０の異なる培地（Ｍ１～１０；表２Ａ）を用いて、ＨＰＣを培養するために報告され、そしてＭ１０は、２．７％ ＡＬＢ＋細胞（図１Ｂ）の最高収率を与えた。Ｍ１０（表２Ｂ）の更なる補充の後には、上皮性コロニーの生成及び拡大を促進する、肝拡大培地（ＨＥＭ）が得られ、ＡＬＢ＋細胞は４０dpiで全細胞の約７５％を確実に占めた（データは図示せず及び図１Ｂ～Ｄ）。リプログラミングの間、ＨＰＣマーカーである、ＡＬＢ、ＡＦＰ及びＥｐＣＡＭは、大きくアップレギュレートされ、線維芽細胞マーカーである、ＣＯＬ１Ａ１及びＴＨＹ１はダウンレギュレートされた（図１Ｆ）。５－ＴＦ及びＨＥＭの組み合わせは、線維芽細胞から増殖性肝細胞を生成するための確実なシステムを確立する。
【0171】
重要なｈＨＰＣマーカーは、リプログラミングされた細胞において、有意に発現した（データは図示せず及び図１Ｅ）。全体的なトランスクリプトームプロファイリングは、リプログラミングされた細胞は、ｈＦＬＣに近いが、ＨＥＦ及び単離したばかりの初代ヒト肝細胞（Ｆ－ＰＨＨ）とは異なっていることを明らかにした（図１Ｇ；及びデータは図示せず）。更に、ｈＨＰＣの既知の役割を有する遺伝子を含む、ｈＨＰＣに豊富な遺伝子は、大幅にアップレギュレートされた（例えば、ＡＦＰ、ＡＬＢ、ＣＤＨ１、ＤＬＫ１、ＥＰＣＡＭ、ＨＥＳ１、ＨＮＦ１Ｂ、ＫＲＴ１８、ＫＲＴ８、ＭＥＴ、ＰＲＯＸ１、ＴＴＲ（データーは図示せず）。まとめると、これらの結果は、これらのリプログラミングされた細胞が、ｈＨＰＣ同一性を獲得したことを示しており、これら細胞はヒト肝前駆細胞様細胞（ｈＨＰＬＣ）と名付けられた。
【0172】
次に、ｈＨＰＣ様細胞（ｈＨＰＬＣ）を誘導して、ヒト誘導性肝細胞（ｈｉＨｅｐ）と命名した機能性肝細胞に、更に分化させた。第一に、更なる研究によりｃＡＭＰ活性化剤とＴＧＦβ阻害剤の組み合わせがＰＨＨの必須機能を維持できることが確認された（図２Ａ）。特に、ｈＨＰＬＣは、この培地で１０日間培養した場合、培養したＰＨＨに類似した典型的な肝細胞形態を示す分化した細胞を形成し、Ｅ－カドヘリン及び肝性ＴＦであるＨＮＦ４Ａ、ＨＮＦ１Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＥＢＰＢに対して免疫陽性であった（データは図示せず）。フローサイトメトリー分析により、ＡＬＢ＋細胞はｈｉＨｅｐの９０％以上を数えた（図２Ｃ）。第二に、主要な成熟肝細胞機能遺伝子の発現レベルは、ｈＨＰＬＣと比較してｈｉＨｅｐにおいて劇的にアップレギュレートされることが見出され、そしてそれはＦ－ＰＨＨ及び成体肝組織（ＡＬ）の発現レベルと同等であった（図２Ｄ及び２Ｂ）。第三に、機能遺伝子である、ＡＬＢ及びＣＹＰ４５０の発現は少なくとも３５日間安定して維持され、その間胎児マーカーＡＦＰは消失した（データは図示せず；図２Ｅ及び２Ｆ）。更に、ＤＬＫ１及びＥＰＣＡＭを含む他の胎児肝細胞マーカーも、ｈｉＨｅｐにおいてダウンレギュレートされた（データは図示せず）。第四に、ｈｉＨｅｐは、ＣＹＰ４５０、ＵＧＴ１Ａ１及びＰＯＲの重要な薬物代謝酵素に対して免疫陽性であった（データは図示せず）。第五に、ｈｉＨｅｐは低密度リポタンンパク質（ＬＤＬ）取り込み、脂肪滴合成及びグリコーゲン合成の能力がある（データは図示せず）。最後に、ｈｉＨｅｐのＡＬＢ分泌は、ＰＨＨのＡＬＢ分泌とと同程度のレベルで少なくとも３５日間維持された（図２Ｇ及び２Ｈ）。これらのデータは、ｈＨＰＬＣが機能性肝細胞を生じさせることを示した。
【0173】
全体的な遺伝子発現分析では、階層的クラスタリングは、ｈｉＨｅｐがＦ－ＰＨＨ及びＡＬと密接にクラスター化することを明らかにした（図２Ｉ）。重要なことに、肝の重要なＴＦ及び肝代謝に関与する遺伝子は、アップレギュレートされたが、一方で線維芽細胞シグネチャー遺伝子発現は、ｈｉＨｅｐにおいて検出できなかった（データは図示せず）。全体的なＤＮＡメチロームのレベルでは、ｈｉＨｅｐはＦ－ＰＨＨと密接にクラスター化され、ＨＥＦから分離された（データは図示せず、図３Ｅ）。また、特定の遺伝子領域におけるメチル化の変化も生じた（データは図示せず）。更に、マイクロＲＮＡプロファイリングは、ｈｉＨｅｐがＦ－ＰＨＨと密接にクラスター化し（データーは図示せず）、そしてｈｉＨｅｐにおけるｍｉＲ１２２を含む主要な肝細胞関連のマイクロＲＮＡの発現がＦ－ＰＨＨと同等であることを示した（図３Ｆ）。全体として、肝細胞遺伝子調節ネットワークの活性化及びＤＮＡメチル化パターンは、ｈｉＨｅｐにおける肝細胞の同一性の確立を明確に反映した。
【0174】
リプログラミングの方法のドナー変動性を排除するために、３つの異なるドナーの線維芽細胞及び１つの市販のヒト線維芽細胞株ＨＦＦ－ＣＲＬ－２０９７からリプログラミングされた更なる４つのｈｉＨｅｐ細胞株を確立した。すべてのｈｉＨｅｐは、類似した全体的な遺伝子発現プロファイル（図３Ｇ及び３Ｈ）を示した。ＣＲＬ－２０９７由来のｈｉＨｅｐは、典型的な肝細胞形態、肝遺伝子発現及び肝細胞機能分析により示される機能的表現型を獲得した（データは図示せず；図３Ｉ；４Ａ～４Ｂ）。ｈｉＨｅｐｓは、薬物代謝、毒性予測、肝疾患モデリングを含むいくつかのインビトロの用途において機能的にＰＨＨに置き換わることができた。薬物代謝については、ＣＹＰ４５０及びｈｉＨｅｐにおける７つの主要な薬物代謝ＣＹＰ４５０の機能を、質量分析により測定した（図３Ａ）。重要なことに、ｈｉＨｅｐにおけるこれらのＣＹＰ４５０の代謝活性は、ＰＨＨにおける代謝活性と同等であった（図３Ａ）。更に、ｈｉＨｅｐはまた、薬物クリアランス予測の可能性も示し、スケール化したｈｉＨｅｐのインビボ肝クリアランス（ＣＬｈ）は、以前の報告で観察されたインビボＣＬｈと同等であった（表８）(Lilja et al., Transplantation 64:1240-1248 (1997))。
【0175】
【表8】
【0176】
次に、データは、ｈｉＨｅｐが核内受容体活性化を介してＣＹＰ４５０の活性を調節することを示す。ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ２Ｂ６をそれぞれ誘導するために、ｈｉＨｅｐをＰＸＲアゴニスト（リファンピン）、ＡｈＲアゴニスト（β－ナフトフラボン及びランソプラゾール）及びＣＡＲアゴニスト（フェノバルビタール）に曝露した場合、これらのＣＹＰ４５０は、それらに対応する誘導剤により誘導することができ、ＰＨＨにおける結果とすべて同等であった（図３Ｂ）。ｈｉＨｅｐはまた、構造的に異なるＣＹＰ３Ａ４誘導剤にも反応した（図４Ｃ）。これらのデータは、ｈｉＨｅｐのＰＨＨに対して同等な元来のＣＹＰ４５０代謝活性、及びインビトロの薬物代謝研究のためのｈｉＨｅｐの適合性を示唆した。データはまた、ｈｉＨｅｐが、ＰＨＨとして肝薬物毒性を予測するための優れたインビトロ系を提供することを示した。第一に、２５個の肝毒性物質をｈｉＨｅｐで試験した（表７）(Seglen, et. Al., Methods in Cell Biology 13, 29-83 (1976))。化合物の毒性は、細胞生存率の５０％減少を引き起こす濃度であるＴＣ５０により特徴付けられた（図４Ｄ）。注目すべきことに、これらの化合物についてのｈｉＨｅｐのＴＣ５０プロファイルは、ＰＨＨのＴＣ５０プロファイルと区別されなかった（図３Ｃ）。興味深いことに、生体内活性化化合物は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＴＣ５０プロファイルよりも、ｈｉＨｅｐｓ及びＰＨＨにおけるＴＣ５０プロファイルのほうがより低いことを示し、ｈｉＨｅｐの強い薬物代謝活性と一致した（図３Ｃ）。慢性肝毒性物質のトログリタゾンは、以前のＰＨＨ研究(Hou et al., Science 341, 651-654 (2013))に則して、非致死濃度で、延長された９日間の薬物曝露後に広範な細胞死を引き起こした（図３Ｄ）。第二に、薬物誘発性の病理学的効果をｈｉＨｅｐを用いて再現できた。重篤な及び用量依存性の脂肪症及びリン脂質症が、病理学的原因となる肝毒性物質への曝露下のｈｉＨｅｐにおいて検出された（データは図示されず、及び、図４Ｅ及び４Ｆ）。最後に、ｈｉＨｅｐは、薬物－薬物相互作用（ＤＤＩ）に起因する毒性を評価することができた。２種類の生体内活性化薬物、アフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）及びフルタミドの毒性は、ｈｉＨｅｐにおいてリファンピンによる誘導後に増加し、そして更にｈｉＨｅｐはＣＹＰ３Ａ４阻害剤ケトコナゾールにより救済された（図４Ｇ）。
【0177】
次に、前記研究は、ｈｉＨｅｐが、ＨＢＶ感染を再現するインビトロモデルとして役立つかどうかを検証した。第一に、ｈｉＨｅｐにおけるＨＢＶ受容体ＮＴＣＰの発現を確認した（図２Ｄ及び５Ａ）。特に、ＨＢＶに感染したｈｉＨｅｐは、ＨＢｃＡｇに対して免疫陽性であった（データは図示せず）。ｈｉＨｅｐにおけるＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌、及びＨＢＶ－ＤＮＡ、－ＲＮＡ、－ｃｃｃＤＮＡの発現も解析した。ｈｉＨｅｐにおけるこれらのＨＢＶマーカーは、ＰＨＨ及びＨｅｐＧ２－ＮＴＣＰ細胞におけるそれらと同等であった（図５Ｂ）。重要なことに、ｃｃｃＤＮＡの存在は、サザンブロットによって確認された（図５Ｃ）。動的分析は、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの分泌が、徐々に増加し、２０dpiでピークに達し、ＨＢＶ－ＲＮＡ発現の動態と相関することを明らかにした（図５Ｄ～Ｅ）。この上清及び細胞内ＨＢＶ－ＤＮＡは、３６日間それらの発現を保持した（図５Ｆ～Ｇ）。これらの結果は、ｈｉＨｅｐが、インビトロでの長期間のＨＢＶ感染に対して確実に許容的であることを示した。
【0178】
次の研究では、抗ＨＢＶ化合物に対するｈｉＨｅｐの反応を評価した。ウイルス侵入阻害剤であるＮ末端ミリストイル化ペプチド（ＭＹＲ）は、ＨＢＶ－ＲＮＡの低発現と一致した、ＨＢＶタンパク質に対する有意な阻害を示した（図５Ｉ）。核酸類似体であるエンテカビル（ＥＴＶ）及びラミブジン（ＬＡＭ）は、特に長期処理中に、ＨＢＶ－ＤＮＡを大きく阻害した（図５Ｄ～Ｇ）。更に、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）は、多くのＩＦＮ刺激遺伝子、特に抗ウイルスエフェクターのアップレギュレーションと関連して、上記のすべての主要なＨＢＶマーカーに対して阻害作用を示した（図５Ｈ）。これはＩＦＮ－α処理下でのｈｉＨｅｐにおける元来の抗ウイルス免疫応答を示唆した。これらの結果は、ｈｉＨｅｐが、抗ＨＢＶ薬物スクリーニングのための価値あるモデル及び肝疾患モデリングのための潜在的プラットフォームとして役立つことができることを示した。
【0179】
最終的に、大規模な肝細胞の用途ための細胞量の要求を満たすために、ｈＨＰＬＣから大量の機能性ｈｉＨｅｐを生成することができた。集団倍加時間は、１：５の比でｈＨＰＬＣを連続的に継代した後、Ｐ１０とＰ３０の間で類似しており（図１Ｈ）、Ｐ４０までの１０継代毎のｈＨＰＬＣの全体的遺伝子発現プロファイルは、ｈＦＬＣと共にクラスター化され、インビトロ増殖中でのトランスクリプトームの安定性を示唆した（図１Ｇ、データは図示せず）。これらの結果は、ｈＨＰＬＣが、４０回の継代において９×１０２７倍に安定して拡張増殖できることを示した。注目すべきことに、機能性ｈｉＨｅｐは、ｈＨＰＬＣの早期及び後期継代の両方から安定的に生成され、類似の遺伝子発現プロファイル及び肝細胞機能を示した（データは図示せず）。
【0180】
更に、凍結保存したｈＨＰＬＣもまた、安定した遺伝子発現及び分化能力を示した（図６Ａ）。
【0181】
要約すると、インビトロの毒性試験、創薬及びＨＢＶの宿主であることに関して、高度に適用可能な、機能的能力を有するヒト肝細胞を大量に産生することができる、新しいツーステップの系統リプログラミング戦略が記載される。本発明者らのツーステップ戦略の基礎となる方法論的進歩は、自然の細胞運命変化経路を模倣する、高度な機能的誘導のための増殖性で可塑的な前駆細胞を第一に生成する、導入された中間工程である。興味深いことに、このデータは、サイレントであり、従来のリプログラミング戦略によって活性化することが困難であった、線維芽細胞のＨ３Ｋ９ｍｅ３ヘテロクロマチン領域における約５０％の肝遺伝子が、本発明者らのｈｉＨｅｐにおいて、確実に発現したことを示している（図６Ｂ）。これは、本発明者らの戦略が、標的細胞型の遺伝子調節ネットワークに対するエピジェネティックな障壁を効果的に除去できたことを示す。このツーステップ戦略の別１つの利点は、基礎的及び臨床的用途のための大量の能力のある細胞の生成を可能にすることである。本明細書に開示される細胞運命変換戦略は、インビトロでの用途及び再生医療に影響を及ぼし得る、複数の細胞型の細胞運命変換に適用することができる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【図6A】
【図6B】