特許 7365902 治療用タンパク質を有するＥＶの負荷の改善

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-12

(45)【発行日】2023-10-20

(54)【発明の名称】治療用タンパク質を有するＥＶの負荷の改善

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20231013BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20231013BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231013BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231013BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231013BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231013BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20231013BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20231013BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20231013BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20231013BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C12N15/62 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K47/64

A61K47/69

C07K14/47

C12N15/12

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2019545783

(86)(22)【出願日】2018-01-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-03-19

(86)【国際出願番号】 EP2018051359

(87)【国際公開番号】W WO2018153581

(87)【国際公開日】2018-08-30

【審査請求日】2021-01-18

(31)【優先権主張番号】1702863.0

(32)【優先日】2017-02-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】518259431

【氏名又は名称】エヴォックス・セラピューティクス・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ノルディーン・ヨエル

(72)【発明者】

【氏名】グプタ・ダヌ

【審査官】坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５１６７６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５０８１４７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５３８９０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００３－５２６３２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５１３６５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００４－５３５７５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】Fang, Yi, et al.，PLoS biology，2007年，Vol. 5, No. 6, e158，pp. 1267-1283

【文献】NAMBIN YIM, et al.，NATURE COMMUNICATIONS，2016年07月22日，Vol. 7, Article No. 12277，pp. 1-9

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

Ｇｏｏｇｌｅ／Ｇｏｏｇｌｅ Ｓｃｈｏｌａｒ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの目的の治療用タンパク質（ＰＯＩ）、ポリペプチド構築物を細胞外小胞（ＥＶ）に輸送することができるエキソソームタンパク質、ならびに少なくとも１つのホモ多量体化ドメインを含む融合ポリペプチドであって、ＰＯＩ、エキソソームタンパク質及びホモ多量体化ドメインが、天然には同一のタンパク質中に存在しない、融合ポリペプチド。

【請求項2】

前記ホモ多量体化ドメインが、ホモ二量体化ドメイン、ホモ三量体化ドメイン、ホモ四量体化ドメイン、またはより高次のホモ多量体化ドメインであり、高次のホモ多量体化ドメインが、少なくとも２つのドメイン間の相互作用を促進することができる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項3】

前記エキソソームタンパク質が、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ５４、ＣＤ５０、ＦＬＯＴ１、ＦＬＯＴ２、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２３５ａ、トランスフェリン受容体、トランスフェリン受容体エンドソームドメイン、ＡＬＩＸ、シンテニン－１、シンテニン－２、Ｌａｍｐ２ｂ、ならびにそれらの領域、ドメイン、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載の融合ポリペプチド。

【請求項4】

前記ホモ多量体化ドメインが、ロイシンジッパー、フォールドオンドメイン、ヒトＲＳウイルスＡ由来のリン酸化タンパク質の断片Ｘホモ四量体化ドメイン、コラーゲンドメイン、２Ｇ１２ ＩｇＧホモ二量体、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質ＣＡＲＤフィラメント、心臓ホスホランバン膜貫通五量体、副甲状腺ホルモン二量体化ドメイン、グリコホリンＡ膜貫通、ＨＩＶ Ｇｐ４１三量体化ドメイン、ＨＰＶ４５癌タンパク質Ｅ７Ｃ末端二量体ドメイン、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項5】

前記ＰＯＩが、
ｉ．ｇｐ１３０、ＴＮＦＲ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ１βＲ、ＩＬ６Ｒ、ＣＤ５５、ＩＬ１２Ｒ、ＣＣＲ６、デコイ受容体またはデコイ結合剤（ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ６－ＩＬＲ複合体、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ２３、ＴＮＦα、ＭＣＰ－１、ＣＣＬ２０、補体タンパク質（複数可）、アクチビン、もしくはミオスタチンのいずれか１つに結合する）、
ｉｉ．標的化ペプチドもしくはタンパク質、
ｉｉｉ．リソソーム蓄積症の治療のためのタンパク質、の群のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項6】

標的化ペプチドもしくはタンパク質が、ＲＶＧペプチド、ＶＳＶペプチド、ｐ－セレクチン結合ペプチド、およびｅ－セレクチン結合ペプチドから選択される、請求項５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項7】

前記融合ポリペプチドが、配列番号４８～５８、６１、６２、６８および８７からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物。

【請求項9】

請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドおよび／または請求項８に記載のポリヌクレオチド構築物を含むＥＶ。

【請求項10】

前記ＥＶが、請求項１～７のいずれか一項に記載の複数の融合ポリペプチドを含む、請求項９に記載のＥＶ。

【請求項11】

請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、請求項８に記載のポリヌクレオチド構築物、および／または請求項９または１０に記載のＥＶ、を含む、細胞。

【請求項12】

請求項９または１０に記載の複数のＥＶ、および／または請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、および／または請求項８に記載のポリヌクレオチド構築物、を含む、組成物。

【請求項13】

請求項９または１０に記載の複数のＥＶ、および／または請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、および／または請求項８に記載のポリヌクレオチド構築物、ならびに薬学的に許容される賦形剤または希釈剤、を含む、薬学的組成物。

【請求項14】

治療用ＰＯＩをＥＶに負荷するための方法であって、
ｉ．請求項８に記載のポリヌクレオチド構築物を提供するステップと、
ｉｉ．ＥＶ産生細胞において前記融合構築物を発現させるステップと、を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、目的の様々な種類のタンパク質を細胞外小胞（ＥＶ）に負荷するための改善された方法に関する。より具体的には、本発明は、多量体化ドメイン（複数可）を含む融合構築物を用いたＥＶの負荷、ならびにとりわけ融合構築物それ自体およびそのような融合構築物を保有するＥＶに関する。

【背景技術】

【0002】

細胞外小胞（ＥＶ）は、小分子剤およびＲＮＡ治療薬から抗体および他のタンパク質の生物製剤に及ぶ様々な治療様式のための送達ビヒクルとしてのそれらの有用性についてますます注目を集めている。エキソソームの助けを借りたポリペプチドベースの薬剤の送達は、将来性のある特許出願ＷＯ２０１３／０８４０００に記載されており、外因性および内因性の両方の負荷技術を介してポリペプチドベースの治療薬をエキソソームにどのように負荷することができるかを記載している。ＷＯ２０１３／０８４０００において、エキソソームの外因性負荷は、親細胞から単離後に、目的のポリペプチドのエキソソームへのエレクトロポレーションまたはトランスフェクションを使用して行われ、一方、内因性負荷は、目的のポリペプチドをコードする構築物による親細胞のトランスフェクションと、それに続く構築物の過剰発現および生物療法用ポリペプチドを含むエキソソームの採取に基づいている。

【0003】

別の画期的な特許出願（ＷＯ２０１４／１６８５４８）は、少なくとも１つの治療用ポリペプチドに融合した少なくとも１つのキャリアポリペプチドを含むポリペプチド構築物をその膜に付着させたエキソソームなどの治療的送達小胞を開示し、それは少なくとも部分的に小胞の外側に存在するため、小胞環境に提示される。他の特許出願は、タンパク質生物製剤の送達のためにエキソソームを使用することを試みており、それは、例えば、ＷＯ２０１５／１３８８７８の場合では、ヘパリン結合上皮増殖因子（ＨＢ－ＥＧＦ）である。

【0004】

特に、ＷＯ２０１４／１６８５４８は、親ＥＶ産生細胞の遺伝子改変が、ＥＶの産生、典型的には、治療的に適切かつ高活性なタンパク質ポリペプチドベースの生物製剤を示すエキソソームの産生を有意な臨床的有用性によっていかに可能にするかの優れた例を表す。近年の２つの研究（Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，７：１２２７７，２０１６およびＬａｉｎｓｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，２０１７）において、著者らは、光遺伝的ヘテロ二量体化ドメインを用いてエキソソーム中で２つの別々のタンパク質構築物を二量体化できる方法を示している。これら２つの研究は、エキソソーム中の２つのタンパク質構築物を特異的に二量体化するために遺伝子工学をどのように適用できるかということの優れた例であるが、両研究は、タンパク質工学によって単一種類のポリペプチド構築物の負荷効率をいかに改善し得るかについては完全に沈黙している。したがって、親細胞の遺伝子改変後にＥＶ内またはＥＶ上で発現される目的のタンパク質の数をさらに最適化し、標的化と治療の両方の目的で、そのような目的の治療用タンパク質の効力および／または親和性ならびに結合力を増加させることには、当技術分野における大きな可能性が依然としてある。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】ＷＯ２０１３／０８４０００

【文献】ＷＯ２０１４／１６８５４８

【文献】ＷＯ２０１５／１３８８７８

【非特許文献】

【0006】

【文献】Ｙｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，７：１２２７７，２０１６

【文献】Ｌａｉｎｓｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，２０１７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

当技術分野における問題を克服し、異なる種類の目的のタンパク質を保有する非常に強力なＥＶ（典型的にはエキソソーム）の発生を可能にするために、本発明は、少なくとも１つの目的のタンパク質（ＰＯＩ）、少なくとも１つのエキソソーム選別ドメイン、および少なくとも１つの多量体化ドメインを含む、高度な融合ポリペプチド構築物を開示する。驚くべきことに、本発明の設計は、ＥＶにまたはＥＶ上に負荷することができる数桁高い密度の目的のタンパク質をもたらし、同様に驚くべきことに、それはまた、ＥＶ収率の増加およびその標的に対する目的のタンパク質の結合活性の増大（すなわち、標的分子に対する、例えば、デコイ受容体の総親和性、または標的細胞もしくは組織上の受容体に対する標的リガンドの総親和性）ももたらす。上述のように、ＥＶへの可溶性タンパク質の負荷戦略としての２つの別々の融合タンパク質構築物の二量体化は、ＹｉｍらおよびＬａｉｎｓｃｅｋらによって記載されている。しかし、本発明は、多量体化ドメイン、特にホモ多量体化ドメインを使って、単一種類の融合ポリペプチド構築物、すなわち、エキソソームタンパク質、単一のポリペプチド構築物中のＰＯＩおよび多量体化ドメインを含む１種類の融合タンパク質の複数コピーの負荷を増強する、まったく新規なアプローチを表す。重要なことに、したがって、本発明は、完全に異なる問題、すなわち可溶性タンパク質自体の負荷だけでなく、既に機能している負荷の改善および任意選択的に目的のタンパク質の表面提示の問題に取り組む。

【課題を解決するための手段】

【0008】

第１の態様において、本発明は、少なくとも１つのＰＯＩ、少なくとも１つのエキソソーム選別ドメイン、および少なくとも１つの多量体化ドメインを含む融合ポリペプチドに関する。好ましい実施形態では、本発明の多量体化ドメインは、単一種類の融合ポリペプチド構築物の、いくつかのそのようなポリペプチド構築物を含む多量体へのホモ多量体化を誘導する。種々の多量体化ドメインがインビトロおよびインビボで評価および試験されており、ポリヌクレオチド構築物および融合ポリペプチドをコードするベクターの賢明な遺伝子操作によって、この戦略が広く応用され得ることを示している。

【0009】

本発明は、ＥＶの表面およびＥＶの内部への目的のタンパク質の負荷に等しく適用可能であり、これによって、内腔に負荷したＥＶ治療薬の創製、ならびに標的化ＥＶおよび表面提示された治療用タンパク質（例えば、デコイ受容体、ＮＰＣ１タンパク質、ＬＡＭＰ２タンパク質、ＧＭ２活性化タンパク質、シスチノシン、ＣＬＮ３またはＣＬＮ６などの輸送タンパク質、ムコリピン－１、Ｇタンパク質共役受容体、抗体もしくは一本鎖抗体またはその断片、あるいは本質的に任意の目的の膜貫通タンパク質）を含むＥＶの開発の両方を提供する。重要なことに、ＥＶは、２つ以上のＰＯＩ、例えば、（ｉ）表面に提示された標的ペプチド／タンパク質（すなわち、標的ＰＯＩ）と、（ｉｉ）表面またはＥＶ内側に提示された治療用ＰＯＩとの組み合わせを含み得る。ＥＶ表面上に提示され得る治療用ＰＯＩの非限定的な例は、いわゆるデコイ受容体、すなわち、例えばサイトカインまたは他の因子に結合してこれを阻害するタンパク質である。内腔に（内部に）負荷されたＰＯＩの非限定的な例としては、例えば、酵素補充療法のための酵素、またはＤＮＡに結合してそれを調節するためのヌクレアーゼを挙げることができる。

【0010】

別の態様では、本発明は、融合ポリペプチド保有ＥＶそれ自体、すなわち本発明による融合ポリペプチドを含むＥＶに関する。上述のように、単一のＥＶは、１つ以上の異なる種類の融合ポリペプチド構築物、ならびに各種類の融合ポリペプチド構築物の複数のコピーを含み得る。好ましい実施形態では、単一のＥＶ（エキソソームなど）は、ＥＶあたり、５０コピーを超える所望の融合ポリペプチド（すなわち、ＰＯＩの性質にかかわらず、５０コピーを超えるＰＯＩ）、好ましくは７５コピーを超える融合ポリペプチド、さらにより好ましくは１００を超える、またはさらに３００を超える融合ポリペプチドを含み得る。さらに、本発明はまた、ＥＶ起源細胞、ならびにポリヌクレオチド構築物およびポリヌクレオチド構築物によってコードされる融合ポリペプチドを含む細胞の両方を含む細胞に関する。

【0011】

さらに他の態様では、本発明は、本発明による複数の融合ポリペプチド保有ＥＶを含む組成物に関する。典型的には、これらの組成物はインビボで使用するための薬学的組成物であるが、インビトロで使用するための組成物および製剤もまた本発明の範囲内にある。

【0012】

別の態様では、本発明は、ＰＯＩをＥＶに負荷するための方法に関する。そのような方法は、（ｉ）少なくとも１つの多量体化ドメイン、少なくとも１つのエキソソーム選別タンパク質、およびＰＯＩをコードする融合ポリヌクレオチド構築物を提供する工程、ならびに（ｉｉ）融合ポリペプチド、したがってＰＯＩでＥＶを負荷するために、ＥＶ産生細胞において上記融合ポリヌクレオチド構築物を発現する工程を含むことができる。ＥＶ産生のための細胞は、初代細胞または細胞株であり、ポリヌクレオチド構築物は、融合ポリペプチドの発現を実行できる、本質的に任意の適切な種類の構築物であり得る。

【0013】

さらなる態様では、本発明は、本発明によるＥＶの製造および精製方法に関する。また、本発明によるＥＶは、特に癌、炎症および自己免疫、神経炎症および神経変性障害、遺伝性疾患、リソソーム蓄積症、臓器損傷および臓器不全、ＤＭＤなどの筋ジストロフィー、感染症などの多数の疾患および病気の予防および／または治療に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】多量体化ドメインを含まない融合ポリペプチドを含むＥＶと比較して、多量体化ドメインの包含、フォールドオンが、用量依存的にＥＶの負荷および効果をどのように増加させるかを示す。

【図2】多量体化ドメイン挿入後のＧＰ１３０デコイ受容体エキソソームのインビトロでの活性の増加を示す。

【図3】多量体化ドメインを含む融合ポリペプチド（それぞれ薄灰色の丸および下向き三角形）を含むＥＶと、多量体化ドメインを含まない融合ポリペプチドを含むＥＶ（上向き三角形）とを比較した、ＧＰ１３０－ＧＣＮ４ロイシンジッパーシンテニンデコイＥＶおよびＴＮＦＲ１フォールドオンシンデカンデコイＥＶで処置したＬＰＳ誘導した全身性炎症の動物実験の結果を示す。

【図4】多量体化ドメインと共にエキソソーム選別ドメインを安定に発現する細胞からの粒子放出の増加を示すＮＴＡデータ。

【図5】ＩＬ６活性化のためのレポーターを安定に発現するＨｅＬａ細胞を、ハイパーＩＬ６で処置し、ＰＯＩとしてのｇｐ１３０デコイ受容体、多量体化ドメインとしての２Ｇ１２ ＩｇＧホモ二量体ドメイン、およびエキソソーム選別ドメインとしてのＡＬＩＸを含む融合タンパク質構築物を備えたＥＶ（骨髄由来間葉系間質細胞から得た）で処置した。２Ｇ１２ ＩｇＧホモ二量体ドメインを含む融合タンパク質は、ＩＬ６媒介シグナル伝達の阻害においてＧＰ１３０－ＡＬＩＸのみを備えたＥＶよりも明らかに優れており、融合タンパク質構築物のＥＶへの負荷の増大を促進する多量体化ドメインの重要性を示す。

【図6】４つの異なるガウシアレポーター構築物で安定に形質導入された脂肪組織ＭＳＣを示す。ガウシアは、多量体化ドメインの有無にかかわらずＣＤ６３およびＣＤ８１と融合した。ＥＶを馴化培地（４８時間インキュベートした）から採取し、接線流およびＣａｐｔｏ－ｃｏｒｅ液体クロマトグラフィーカラムで精製した。ガウシアルシフェラーゼシグナルは、ＣＤ６３／８１負荷の測定として、採取したＥＶについて測定した。図Ｘから明らかに分かるように、心臓ホスホランバン膜貫通五量体ドメインを有するＣＤ６３／８１構築物はより高いシグナルを有するので、ＥＶタンパク質の負荷が増大している。

【図7】ＩＬ６活性化のためのレポーターを安定に発現するＨｅＬａ細胞を、ハイパーＩＬ６で処置し、ＰＯＩとしてｇｐ１３０デコイ受容体、多量体化ドメインとしてのロイシンジッパーホモドメイン、および様々な異なるエキソソーム選別ドメインを含む融合タンパク質構築物を備えたＥＶ（骨髄由来間葉系間質細胞から得た）で処置したことを示す。ロイシンジッパードメインを含む融合タンパク質は、エキソソーム選別ドメインに融合されたＧＰ１３０のみを装備したＥＶよりも明らかにＩＬ６媒介シグナル伝達の阻害に優れており、多量体化ドメインの重要性および実質的に全種類のエキソソームポリペプチドにおけるその適用可能性を証明している。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、少なくとも３つのドメイン：（ｉ）少なくとも１つの目的のタンパク質（ＰＯＩ）、（ｉｉ）少なくとも１つの多量体化ドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１つのエキソソーム選別ドメイン、を含むポリペプチド構築物に関する。さらに、本発明はまた、そのようなトリドメインポリペプチド構築物を含むＥＶに関し、該ポリペプチド構築物は、外側または内側あるいはその両方で、本質的にＥＶの内腔中またはＥＶ膜との会合（例えばＥＶ膜内）のいずれかに存在する。さらに、本発明は、以下でより詳細に記載されるような種々の隣接する態様、例えば、そのようなポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物、そのようなポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド構築物を含むベクターおよび細胞、産生方法、複数のそのようなポリペプチド含有ＥＶを含む組成物、ならびにそのようなＥＶの医学的用途およびそのようなＥＶを含有する薬学的組成物に関する。

【0016】

利便性と明確さのために、本明細書で使用される特定の用語をまとめて以下に記載する。特に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的かつ科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0017】

本発明の特徴、態様、実施形態、または代替形態がマーカッシュグループとして記載される場合、当業者は、それによって本発明がマーカッシュグループの個々の任意のメンバーまたはメンバーのサブグループとても記載されることを認識するであろう。当業者はさらに、本発明が、マーカッシュグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの任意の組み合わせとしても記載されることを認識するであろう。さらに、本発明の態様および／または実施形態のうちの１つに関連して記載された実施形態および特徴はまた、本発明の他のすべての態様および／または実施形態に準用することに注意すべきである。例えば、ＥＶに関して記載された様々な少なくとも１つの目的のポリペプチド（ＰｏＩ）は、ポリペプチド構築物の文脈において、もしくはＥＶを含む薬学的組成物の文脈において、または本発明によるポリヌクレオチド構築物の発現産物として、開示されかつ関連すると理解されるべきである。さらに、特定の態様に関連して記載された特定の実施形態は、例えば、特定の医学的適応症の治療に関する態様に関して記述されたＥＶの投与経路はまた、本発明の薬学的組成物または細胞内送達方法に関する態様／実施形態などの、他の態様および／または実施形態に関連して、当然関連し得る。総説として、目的のタンパク質（ＰＯＩ）、エキソソーム選別ドメイン（例えば、「ＥＶ選別ドメイン」または「エキソソームポリペプチド」または「ＥＶタンパク質」または「ＥＶポリペプチド」同じ意味で呼ばれる）、多量体化ドメイン、および標的化部分、細胞源、ならびに本発明による他のすべての態様、実施形態、および代替形態は、本発明の範囲と要旨から逸脱することなく、ありとあらゆる可能な組み合わせで自由に組み合わせることができる。さらに、本発明の任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたは任意のポリペプチド配列もしくはポリヌクレオチド配列（それぞれアミノ酸配列またはヌクレオチド配列）は、所与の任意の分子がそれに関連する技術的効果を実行する能力を保持する限り、元のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および配列からかなり逸脱し得る。それらの生物学的特性が保持されている限り、本出願によるポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列は、できるだけ高い配列同一性であることが好ましいが、天然配列と比較して５０％も（例えばＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷを使用して計算）逸脱し得る。例えば、少なくとも１つのＰＯＩと、少なくとも１つの多量体化ドメインと、少なくとも１つのエキソソーム選別ドメインとの組み合わせ（融合）は、それぞれのポリペプチドの特定のセグメントが置換および／または修飾され得ることを意味し、重要な特性が保存されている限り、天然配列から著しく逸脱し得ることを意味する。したがって、同様の推論はそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にも当然当てはまる。

【0018】

「多量体化ドメイン」という用語は、本明細書に記載の融合ポリペプチド構築物の数コピーの多量体化（すなわち、生体分子複合体の形成）を可能にする任意のポリペプチドまたはタンパク質に関すると理解され得る。有利な好ましい実施形態では、そのような融合ポリペプチドをＥＶに負荷する効率を高めるために、その主な機能は同一の融合ポリペプチド構築物をまとめることであるので、多量体化ドメインはホモ多量体化ドメインである。他の実施形態では、このような多量体化ドメインは、ＦｏｓおよびＪｕｎロイシンジッパーヘテロ二量体などのヘテロ多量体化ドメインであり得る。本発明の好ましいホモ多量体化ドメインの一部は、以下の非限定的な例を含む：Ｓ．セレビシエ由来のＧＣＮ４のロイシンジッパーホモ二量体化ドメイン、Ｓ．セレビシエ由来のＧＣＮ４のレトロロイシンジッパーホモ二量体化ドメイン、（Ｔ４バクテリオファージ由来）フィブリチンのフォールドオンホモ三量体化ドメイン、ヒトＲＳウイルスＡ由来のリン酸化タンパク質の断片Ｘホモ四量体化ドメイン、コラーゲンスーパーファミリーのヒトαらせんコイルドコイルオリゴマー化ドメイン、心臓ホスホランバン（ヒト）の膜貫通ホモ五量体ドメイン、ヒト副甲状腺ホルモンのホモ二量体ドメイン、ヒトグリコホリンＡの膜貫通ホモ二量体ドメイン、（ＨＩＶ由来）Ｇｐ４１の三量体化ドメイン、癌タンパク質Ｅ７のＣ末端ホモ二量体ドメイン、血管拡張刺激リン酸化タンパク質のＥＶＨ２ホモ四量体ドメイン（ヒト）、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質ＣＡＲＤフィラメント、および／またはそれらの任意の組み合わせ。本明細書における多量体化ドメインは、ドメインが少なくとも２つのドメイン（およびそれらが部分を形成するポリペプチド）間の相互作用を促進することができる限り、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、四量体化ドメイン、または本質的により高次の任意の多量体化ドメインのいずれかであり得る。

【0019】

「細胞外小胞」または「ＥＶ」または「エキソソーム」という用語は、例えば、微小胞（例えば、細胞の原形質膜から脱落する任意の小胞）エキソソーム（例えば、エンドリソソーム経路に由来する任意の小胞）、アポトーシス体（例えば、アポトーシス細胞から得ることができる）、ミクロ粒子（例えば、血小板に由来し得る）、エクトソーム（例えば、血清中の好中球および単球から誘導できる）、プロスタトソーム（ｐｒｏｓｔａｔｏｓｏｍｅ）（例えば、前立腺癌細胞から得ることができる）、またはカルディオソーム（ｃａｒｄｉｏｓｏｍｅ）（例えば、心臓細胞から誘導できる）などの細胞から得ることができる任意の種類の小胞に関連すると理解されるべきである。さらに、上記用語は、細胞外小胞模倣物、細胞膜放出によって得られる細胞膜小胞、または他の技術と同様に、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＨＤＬおよびカイロミクロンなどのリポタンパク質粒子にも関連すると理解されるべきである。エキソソームは１つの有利な種類のＥＶを表すが、本明細書で言及されるすべてのＥＶは本発明の範囲内である。本質的に、本発明は、ＰＯＩ、多量体化ドメイン、およびエキソソーム選別ドメインを含むポリペプチド構築物のための送達または輸送ビヒクルとして作用することができる（小胞形態または他の任意の種類の適切な形態を有する）任意の種類の脂質系構造に関する。ＥＶの医学的かつ科学的な使用および応用を説明する場合、本発明は通常、複数のＥＶ、すなわち数千、数百万、数十億、さらには数兆のＥＶを含むことができるＥＶの集団に関することは当業者には明らかであろう。同じ意味で、例えば、特定の種類のＰＯＩを含むＥＶに関連し得る「集団」という用語は、そのような集団を構成する複数の実体を包含するものと理解されたい。言い換えれば、個々のＥＶは、複数存在する場合、ＥＶ集団を構成する。したがって、当然のことながら、本発明は、当業者には明らかなように、様々なＰＯＩを含む個々のＥＶ、および様々なＰＯＩを含むＥＶを含む集団の両方に関する。

【0020】

「エキソソーム選別ドメイン」、「ＥＶ選別ドメイン」、「ＥＶ選別タンパク質」、「ＥＶタンパク質」、「ＥＶポリペプチド」、「エキソソームポリペプチド」および「エキソソームタンパク質」などの用語は、本明細書では同じ意味で使用され、（エキソソーム選別タンパク質に加えて、少なくとも１つのＰＯＩおよび少なくとも１つのポリペプチドベースの多量体化ドメインを典型的に含む）ポリペプチド構築物を適切な小胞構造、すなわち適切な小胞ＥＶに輸送するために利用できる任意のポリペプチドに関すると理解されるべきである。より具体的には、「エキソソーム選別ドメイン」という用語は、エキソソームなどの小胞構造への（上述のとおり典型的には、少なくとも１つのＰＯＩおよび少なくとも１つの多量体化ドメインを含むが、他の種類のポリペプチドドメインも含むことができる）ポリペプチド構築物の運搬、輸送または往復を可能にする任意のポリペプチドを含むと理解されるべきである。典型的には、そのようなエキソソーム選別ドメインは、ＥＶに天然に存在するタンパク質、特にエキソソーム中に天然に存在するタンパク質および／またはエキソソームの形成に寄与するタンパク質である。そのようなエキソソーム選別ドメインの例は、例えば、ＣＤ９（配列番号１）、ＣＤ５３（配列番号２）、ＣＤ６３（配列番号３）、ＣＤ８１（配列番号４）、ＣＤ５４（配列番号５）、ＣＤ５０（配列番号６）、ＦＬＯＴ１（配列番号７）、ＦＬＯＴ２（配列番号８）、ＣＤ４９ｄ（配列番号９）、ＣＤ７１（配列番号１０）、ＣＤ１３３（配列番号１１）、ＣＤ１３８（配列番号１２）、ＣＤ２３５ａ（配列番号１３）、ＡＬＩＸ（配列番号１４）、シンテニン－１（配列番号１５）、シンテニン－２（配列番号１６）、Ｌａｍｐ２ｂ（配列番号１７）、シンデカン１～４（配列番号７２～７５）、ＴＳＧ１０１（配列番号８３）、ＨＩＶ Ｇａｇ ｐ６－１（配列番号８６）、およびポリペプチド構築物をＥＶに輸送することができる他の多数のポリペプチドは、本発明の範囲内に含まれる。特定の有利な実施形態では、エキソソーム選別ドメインは可溶性エキソソームポリペプチドである。このような可溶性ＥＶタンパク質は、ＰＯＩをＥＶに輸送するのに非常に有効であり、本発明の多量体化ドメインを付加することにより、種々のＰＯＩの小胞（ＥＶ）膜への非常に活性な輸送体となり得る。

【0021】

「目的のタンパク質」、「目的のポリペプチド」、「ＰＯＩ」、「目的の治療用ポリペプチド」、「生物療法的」、「生物学的」、および「タンパク質生物学的」という用語は、本明細書では同じ意味で使用され、例えば、標的を結合することによって、および／または相互作用パートナーと相互作用する、および／またはタンパク質を置換する、および／または既存の細胞内タンパク質を補完または捕捉する他の任意の方法で、治療目的のために利用できる任意のポリペプチドに関するものとして理解されるべきであり、それによってその治療効果を発揮する。上記用語は、以下の非限定的な、目的の治療用ポリペプチドの例：抗体、細胞内抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、アフィボディ、ｂｉ－ｏｃｈ多特異性抗体または結合剤、受容体、デコイ受容体、シグナル伝達物質、リガンド、例えば酵素補充療法または遺伝子編集のための酵素、腫瘍抑制剤、ウイルスまたは細菌阻害剤、細胞成分タンパク質、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ修復阻害剤、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、増殖因子、アポトーシス阻害剤および誘導剤、毒素（例えば、シュードモナス外毒素）、構造タンパク質、ＮＴ３／４などの神経栄養因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）ならびに２．５Ｓベータサブユニットなどのその個々のサブユニット、イオンチャネル、膜輸送体、タンパク質恒常性因子、細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質、翻訳および転写関連タンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、タンパク質結合タンパク質、脂質結合タンパク質、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）およびＧＡＧ結合タンパク質、代謝タンパク質、細胞ストレス調節タンパク質、炎症および免疫系調節タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、ならびに熱ショックタンパク質などを表すことができる。好ましい一実施形態では、ＰＯＩは、ＥＶによって送達された後、標的細胞においてＣａｓポリペプチドがそのヌクレアーゼ活性を実行させるＲＮＡ鎖に関連する（すなわち、それと共に運ばれる）無傷のヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ポリペプチドである。あるいは、Ｃａｓポリペプチドは、標的遺伝子工学を可能にするために触媒的に不活性であり得る。さらに別の方法は、単一のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼＣｐｆ１などの他の任意の種類のＣＲＩＳＰＲエフェクターであり得る。ＰｏＩとしてのＣｐｆ１の包含は、スタッガードな二本鎖切断を介して標的ＤＮＡを切断するので、本発明の特に好ましい実施形態であり、Ｃｐｆ１は、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅなどの種から得ることができる。さらに別の方法では、Ｃａｓポリペプチドはまた、遺伝子発現を特異的に誘導するために、転写活性化因子（Ｐ３３３０コアタンパク質など）に融合され得る。さらなる好ましい実施形態は、リソソーム蓄積症のための酵素、例えば、イミグルセラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロネート－２－スルファターゼおよびイズルファターゼ、などのグルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼ、ガルスルファーゼ、酸－αグルコシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、セラミダーゼ、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン－α－グルコサミニド－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ、ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ、ヒアルロニダーゼ、α－Ｎ－アセチルノイラミニダーゼ、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ、ムコリピン１、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ１、バテニン、リンクリン、α－Ｄ－マンノシダーゼ、β－マンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α－Ｌ－フコシダーゼ、シスチノシン、カテプシンＫ、シアリン、ＬＡＭＰ２、およびヘキソサミニダーゼ、を含む群から選択されるＰＯＩを含む。他の実施形態では、ＰＯＩは、例えば、炎症反応を修飾する細胞内タンパク質（例えば、メチラーゼおよびブロモドメインなどのエピジェネティックタンパク質）、または筋肉機能を修飾する細胞内タンパク質（例えば、ＭｙｏＤまたはＭｙｆ５などの転写因子）、筋肉収縮性を調節するタンパク質（例えば、ミオシン、アクチン、トロポニンなどのカルシウム／結合タンパク質）、または構造タンパク質（ジストロフィン、ウトロフィン、チチン、ネブリン）、ジストロフィン関連タンパク質（ジストロブレビン、シントロフィン、シンコイリン、デスミン、サルコグリカン、ジストログリカン、サルコスパン、アグリン、および／またはフクチンなど）であり得る。別の好ましい実施形態では、ＰＯＩはいわゆるデコイ受容体、すなわちその標的タンパク質を「デコイ」し、それによって標的タンパク質が特定の効果を発揮するのを遮断するタンパク質である。デコイ受容体の非限定的な例としては、ＴＮＦ受容体１および２、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ１７Ｒ、またはＩＬ１βＲなどのインターロイキン受容体、および場合によってはＩＬ６／ｓＩＬ６Ｒ複合体をデコイし、それによってＩＬ６媒介性シグナル伝達を阻害または減少させるｇｐ１３０などのインターロイキンシグナル伝達物質、好ましくはトランスシグナル伝達が含まれる。

【0022】

「起源細胞」または「ＥＶ起源細胞」または「親細胞」または「細胞源」または「ＥＶ産生細胞」または他の任意の類似の用語は、適切な細胞培養条件下で、ＥＶ、例えばエキソソーム、を産生することができる任意の種類の細胞に関連すると理解されるべきである。そのような条件は、懸濁細胞培養または付着培養または他の種類の培養系のいずれでもよい。中空繊維バイオリアクターおよび他の種類のバイオリアクターは、非常に適した細胞培養基盤を表す。本発明による起源細胞は、広範囲の細胞および細胞株、例えば、間葉系幹細胞もしくは間質細胞または線維芽細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、ホホウォートンゼリー、周産期組織、歯芽、臍帯血、皮膚組織などから得ることができる）、羊膜細胞、より具体的には様々な初期マーカーを任意選択的に発現する羊膜上皮細胞、骨髄抑制細胞から選択され得る。特に目的とする細胞株には、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、微小血管またはリンパ内皮細胞などの内皮細胞株、軟骨細胞、ＭＳＣ、気道または肺胞上皮細胞、および様々な他の非限定的な細胞源の例が含まれる。

【0023】

第１の態様において、本発明は本質的にトリドメインポリペプチド構築物であるものに関する。典型的には、そのようなポリペプチド構築物は、（ｉ）少なくとも１つの目的のタンパク質（ＰＯＩ）、（ｉｉ）少なくとも１つの多量体化ドメイン、および（ｉｉｉ）少なくとも１つのエキソソーム選別ドメインを含む。トリドメインポリペプチド構築物の設計は、エキソソームなどのＥＶへのＰＯＩの高効率な負荷を可能にし、またＥＶ起源細胞からのＥＶ産生の増加を推進する。

【0024】

多量体化ポリペプチドドメインは、得られるＥＶのこの増大する負荷を達成するための重要な構成要素であり、このような多量体化ドメインは、興味深いことに多種多様な種から選択され、比較的異なる作用機序（例えば、それはヘテロ二量体化ドメインであってもよく、またはそれはホモ三量体化ドメイン、もしくはホモ五量体ドメインであってもよい、など）も呈し得る。しかしながら、好ましい実施形態では、多量体化ドメインはホモ多量体化ドメインである。なぜなら、これらは融合タンパク質の単純な設計を可能にし、（複数の融合構築物とは対照的に）単一種類の融合ポリペプチド構築物のＥＶへの制御負荷を重要に支持するからである。上記から明らかなように、多量体化ドメインは、ドメインが少なくとも２つのドメイン（およびそれらが部分を形成するポリペプチド）の相互作用を促進できる限り、二量体化ドメイン、三量体化ドメイン、四量体化ドメイン、または本質的により高次の任意の多量体化ドメインのいずれかであり得る。例えば、多量体化ドメインの非限定的なリストは、以下のドメインを含む：Ｓ．セレビシエ由来のＧＣＮ４のロイシンジッパーホモ二量体化ドメイン（配列番号１８）、Ｓ．セレビシエ由来のＧＣＮ４のレトロロイシンジッパーホモ二量体化ドメイン（配列番号１９）、フィブリチンのフォールドオンホモ三量体化ドメイン（Ｔ４バクテリオファージ由来）（配列番号２０）、リン酸化タンパク質の断片Ｘホモ四量体化ドメイン（ヒトＲＳウイルスＡ由来）（配列番号２１）、コラーゲンスーパーファミリーのヒトαらせんコイルドコイルオリゴマーオリゴマー化ドメイン（配列番号２２）、Ｆｏｓ（配列番号６９）およびＪｕｎ（ヒト）（配列番号２３）のロイシンジッパーヘテロ二量体化ドメイン、心臓ホスホランバン（ヒト）の膜貫通ホモ五量体ドメイン（配列番号２４）、副甲状腺ホルモン（ヒト）のホモ二量体化ドメイン（配列番号２５）、グリコホリンＡ（ヒト）の膜貫通ホモ二量体ドメイン（配列番号２６）、Ｇｐ４１の三量体化ドメイン（ＨＩＶ由来）（配列番号２７）、癌タンパク質Ｅ７のＣ末端ホモ二量体ドメイン（ＨＰＶ４５由来）（配列番号２８）、および血管拡張刺激リンタンパク質（ヒト）のＥＶＨ２ホモ四量体ドメイン（配列番号２９）、ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質ＣＡＲＤフィラメント（配列番号８５）、ならびに／またはそれらの任意の組み合わせ。

【0025】

多量体化ドメインは、ポリペプチド構築物中のいくつかの異なる位置に配置され得る。例えば、多量体化ドメインは、エキソソーム選別ドメイン配列内もしくはエキソソーム選別ドメイン配列に隣接して、および／またはＰＯＩ配列内もしくはＰＯＩ配列に隣接して、ＰＯＩ配列とエキソソーム選別ドメイン配列との間に配置され得る。全体として、（多量体化ドメインの選択および構築物中のその位置の両方に関して、ならびにエキソソーム選別ドメインの選択および構築物中のその位置の両方に関して）トリドメインポリペプチド構築物の設計は、ＥＶ起源細胞内での産生後にポリペプチドがＥＶ内のどこで終了するかを決める上で重要である。例えば、テトラスパニンエキソソーム選別タンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、もしくはＣＤ８１）または他の任意のＥＶ膜タンパク質（例えばＬａｍｐ２ｂ）を選択することによって、ＥＶ表面上のＰＯＩを濃縮することが可能である。逆に、ＡＬＩＸまたはシンテニンなどの、ＥＶ内腔に典型的に存在するエキソソーム選別タンパク質を選択することは、本質的にＥＶ内部のポリペプチド構築物（したがってＰＯＩ）を濃縮することを可能にする。当然のことながら、ポリペプチド構築物は、ＥＶの外側および内側に、ならびにＥＶ膜中に同時に存在してもよい。さらに、好ましい実施形態では、融合ポリペプチド構築物は、異なるドメイン間、すなわち少なくとも１つのＰＯＩ、少なくとも１つの多量体化ドメイン、および少なくとも１つのエキソソーム選別ドメインの間に様々な種類のリンカーを含み得る。リンカーは、例えば、ＧＳ（すなわちグリシン－セリン）リンカー、すなわちアミノ酸グリシンおよびセリンを含むリンカーであり、またはそれらが融合ポリペプチド構築物中に存在する場合、異なるドメインの活性が制限されないことを確実にする他の任意の種類の適切なリンカードメインであり得る。

【0026】

本発明による典型的なトリドメイン融合ポリペプチド構築物は、以下のように概略的に説明できる（以下の表記は、任意のＣおよび／またはＮ末端方向を説明するものとして解釈されるべきでなく、単に説明目的のために過ぎない）。
ＰＯＩ－多量体化ドメイン－エキソソーム選別ドメイン

【0027】

さらなる態様において、本発明は、本発明のトリドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物に関する。そのようなポリヌクレオチド構築物は、様々な種類のベクターおよび発現構築物、例えば、プラスミド、ミニサークル、アデノウイルスなどのウイルス（組み込み型または非組み込み型）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス等、直鎖状ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡストレッチ、またはｍＲＮＡもしくは修正ｍＲＮＡ等などの、直鎖状または環状核酸に存在し得る。重要なことに、そのようなベクターおよび発現構築物は、様々な場合にそれ自体で治療薬として使用することができる。これは、ＡＡＶ、アデノウイルス、レンチウイルス、ｍＲＮＡ、および修飾された合成ｍＲＮＡの文脈において特に関連があり、これらはすべて患者に直接投与することができる。これらのベクターおよび／または発現構築物は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンまたは他の任意の種類の誘導物質などの外部因子によって誘導可能であり制御され得る。さらに、本発明のポリペプチドを含むポリヌクレオチド構築物は、上記のように本質的に任意の種類のＥＶ起源細胞に存在し得る。起源細胞（典型的にはＥＶの産生のための適切なＥＶ産生細胞型を含む細胞培養物）への導入は、トランスフェクション、ウイルス媒介形質転換、エレクトロポレーション等などの様々な従来技術を用いて達成され得る。トランスフェクションは、リポソーム、ＣＰＰ、カチオン性脂質またはポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー等などの従来のトランスフェクション試薬を使用して実施することができる。ウイルス媒介形質導入も非常に適した方法であり、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクターなどの従来のウイルスベクターを使用して実施することができる。ウイルス媒介形質導入は、細胞バンクのための安定な細胞株、すなわちＥＶ産生細胞源のマスター細胞バンク（ＭＣＢ）および作業細胞バンク（ＷＣＢ）の作製に特に関連する。

【0028】

本発明のエキソソーム選別ドメインは、以下のタンパク質のうちのいずれか１つから選択され得る：ＣＤ９（配列番号１）、ＣＤ５３（配列番号２）、ＣＤ６３（配列番号３）、ＣＤ８１（配列番号４）、ＣＤ５４（配列番号５）、ＣＤ５０（配列番号６）、ＦＬＯＴ１（配列番号７）、ＦＬＯＴ２（配列番号８）、ＣＤ４９ｄ（配列番号９）、ＣＤ７１（配列番号１０）、ＣＤ１３３（配列番号１１）、ＣＤ１３８（配列番号１２）、ＣＤ２３５ａ（配列番号１３）、ＡＬＩＸ（配列番号１４）、シンテニン－１（配列番号１５）、シンテニン－２（配列番号１６）、Ｌａｍｐ２ｂ（配列番号１７）、ＴＳＰＡＮ８、ＴＳＰＡＮ１４、ＣＤ３７、ＣＤ８２（配列番号７７）、ＣＤ１５１、ＣＤ２３１、ＣＤ１０２、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、ＣＤ４９ｄ／ＩＴＧＡ４、ＩＴＧＢ５、ＩＴＧＢ６、ＩＴＧＢ７、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ４１、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、Ｆｃ受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、ＭＨＣ－ＩまたはＭＨＣ－ＩＩ成分、ＣＤ２、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ１３、ＣＤ１８、ＣＤ１９（配列番号７９）、ＣＤ３０（配列番号８０）、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４７、ＣＤ８６、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２５、ＣＤ１３５、ＣＤ１８４、ＣＤ２００、ＣＤ２７９、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ３６２、ＣＯＬ６Ａ１、ＡＧＲＮ、ＥＧＦＲ、ＧＡＰＤＨ、ＧＬＵＲ２、ＧＬＵＲ３、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＳＰＧ２、Ｌ１ＣＡＭ、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＣ１、ＬＦＡ－１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、Ｍａｃ－１アルファ、Ｍａｃ－１ベータ、ＭＦＧＥ８（配列番号７８）、ＳＬＩＴ２、ＳＴＸ３、ＴＣＲＡ、ＴＣＲＢ、ＴＣＲＤ、ＴＣＲＧ、ＶＴＩ１Ａ、ＶＴＩ１Ｂ、およびそれらの任意の組み合わせ。

【0029】

本発明によるＥＶおよびエキソソームの中および上に負荷される目的のタンパク質（ＰＯＩ）は、本質的にタンパク質および／またはペプチド任意の群から選択され得る。ＰＯＩは、例えば、以下の通りであり得る。
－疾患を引き起こす標的タンパク質に結合するためのデコイタンパク質（デコイ受容体と同じ意味で呼ばれる）。
－エンドソーム脱出を誘導するためのペプチドまたはタンパク質、例えばＨＡ２。
－ＥＶを目的の組織または器官または細胞型に標的化するためのペプチドまたはタンパク質。
－核酸標的への結合および／または切断および／または修飾のためのヌクレアーゼ。
－抗体および／または細胞内抗体。
－酵素補充療法用のアルファ－グルコシダーゼおよび／またはグルコセレブロシダーゼなどの酵素。
－ＮＰＣ１またはシスチノシンなどの輸送タンパク質。
－ＥＶのインビボ挙動（例えば、その循環時間または免疫系認識）を最適化するためのペプチドまたはタンパク質、例えば、ＣＤ４７および／もしくはＣＤ５５またはこれらのタンパク質の一部。

【0030】

当業者には理解されるように、本発明は、本質的に任意の目的のタンパク質および／またはペプチドをＥＶ内および／またはＥＶ上に高効率に分類することを可能にする。明らかに、ＰＯＩはその全体に存在してもよく、あるいはそのようなＰＯＩのドメイン、領域、または誘導体が代わりに利用されてもよい。したがって、以下のリストは、本発明の範囲から逸脱することなく本明細書で採用され得るＰＯＩの非限定的な例示的実施形態を単に含むだけである：
－ｇｐ１３０（配列番号３０）、ＴＮＦＲ１（配列番号３１）、ＴＮＦＲ２（配列番号７１）、ＩＬ１７受容体Ａ（配列番号３２）、ＩＬ１７受容体Ｂ（配列番号３３）、ＩＬ１７受容体Ｃ（配列番号３４）、ＩＬ１７受容体Ｄ（配列番号３５）、ＩＬ１７受容体Ｅ（配列番号３６）、ＩＬ２２受容体サブユニットα－１（配列番号７０）、ＩＬ２３Ｒ（配列番号３７）、ＩＬ１受容体１型（配列番号３８）、ＩＬ１受容体２型（配列番号３９）、ＩＬ１２受容体サブユニットβ１（配列番号４０）、ＩＬ１２受容体サブユニットβ２（配列番号４１）、他の任意のデコイ受容体またはデコイ結合剤（ＩＬ１α、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ６－ＩＬＲ複合体、ＩＬ１２、ＩＬ１７、ＩＬ２３、ＴＮＦα、ＭＣＰ－１、ＣＣＬ２０、補体タンパク質（複数可）、アクチビン、またはミオスタチンのうちのいずれか１つに結合する）、
－ＲＶＧペプチド（配列番号８４）、ＶＳＶ－Ｇペプチド（配列番号４２）、ＶＳＶ－Ｇタンパク質（配列番号４３）、ｐ－セレクチン結合ペプチド（配列番号４４）、ｅ－セレクチン結合ペプチド（配列番号４５）などの標的化ペプチドもしくはタンパク質、および／または他の任意の標的化ペプチドもしくはタンパク質、
－細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）（例えば、Ｔａｔ（配列番号４６）、ペネトラチン、ＴＰ１０、ＣＡＤＹ）、エンドソーム脱出増強特性を有するペプチド（例えば、ＨＡ２タンパク質ＨＡ２サブユニット（配列番号４７）もしくはＨＡ２融合サブユニット（配列番号８２））、または核局在化シグナルＮＬＳペプチド（例えば、配列ＰＫＫＫＲＫＶ）、
－転写因子などの核酸結合タンパク質、またはＣａｓ、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼ、
－リソソーム蓄積症の治療のためのタンパク質、例えば、イミグルセラーゼ、α－ガラクトシダーゼ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロネート－２－スルファターゼおよびイズルファターゼ、などのグルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼ、ガルスルファーゼ、酸－αグルコシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、セラミダーゼ、α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、リソソーム酸リパーゼ、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ＮＰＣ１、ＮＰＣ２、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン－α－グルコサミニド－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ、ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ、ヒアルロニダーゼ、α－Ｎ－アセチルノイラミニダーゼ、ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ、ムコリピン１、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、パルミトイル－タンパク質チオエステラーゼ１、トリペプチジルペプチダーゼ１、バテニン、リンクリン、α－Ｄ－マンノシダーゼ、β－マンノシダーゼ、アスパルチルグルコサミニダーゼ、α－Ｌ－フコシダーゼ、シスチノシン、カテプシンＫ、シアリン、ＬＡＭＰ２、およびヘキソサミニダーゼ、
－抗体、細胞内抗体、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、アフィボディ、ｂｉ－ｏｃｈ多重特異性抗体、または結合剤、受容体など、
－ｐ５３、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、およびＳＴ１４などの腫瘍抑制因子、
－Ｆｃ結合ドメイン、Ｌｉｎｇｏ－１（配列番号８１）、ＮｇＲ１、ＦＣ５、カスパーゼ、Ｆｃ融合タンパク質、神経突起増殖抑制物質（Ｎｏｇｏ、ＯＭｇｐ、ＭＡＧ）、および神経突起増殖抑制物質受容体複合体などの様々なＰＯＩ（例：Ｎｏｇｏ－ＮｇＲ１複合体）

【0031】

上記の包括的でないリストから分かるように、ＰＯＩは非常に幅広い群のペプチドおよび／またはタンパク物質から選択することができる。以下は、様々な疾患モデルにおいてかなりの治療活性を示す、特に興味深い一部の融合ポリペプチドの非限定的なリストを表す。
－配列番号４８（ｈＴＮＦＲ１－フォールドオン－Ｎ末端シンテニン）：フォールドオン三量体化ドメインに融合したヒトＴＮＦＲ１受容体細胞外部分、膜貫通および細胞質尾部の部分断片（シグナル伝達能力のある細胞質尾部部分は除去されている）。ＴＮＦ受容体は三量体としてそのリガンド（すなわちＴＮＦα）と結合し、それゆえ、三量体形態で存在する場合には、受容体はフォールドオン多量体化ドメインの存在を通じて、リガンドと結合するように既にプライミングされている。フォールドオン多量体化ドメインは、シンテニンのＮ末端ドメインとさらに融合し、またシンデカンとは別のポリペプチド構築物中で融合している。シンテニンのＮ末端ドメインは、重要なＥＳＣＲＴおよびＡＬＩＸなどのＥＳＣＲＴアクセサリータンパク質に対する結合および相互作用部位を有する。これは、ＰＯＩのＥＶへの選別を向上させ、また遺伝子操作されたＥＶ起源細胞における小胞産生を増加させる中心としても機能し得る。この融合ポリペプチド、およびシンデカン系ポリペプチド構築物を含むＥＶは、ＴＮＦαを効率的に隔離し、それによって炎症を減少させる。
－配列番号４９（ｈＧＰ１３０－ＬＺ－Ｎ末端シンテニン）：ヒトＧＰ１３０細胞外－膜貫通、およびその細胞質尾部の一部（シグナル伝達ドメインを除く）は、ロイシンジッパー（ＬＺ）二量体化ドメインに融合している。ＧＰ１３０は細胞表面上に二量体として存在し、２分子のＩＬ６／ｓＩＬ－６Ｒヘテロ二量体複合体と六量体複合体を形成し、それゆえ、この強制的な二量体化はリガンド結合親和性の増加を促進するだろう。二量体化ドメインはシンテニンのＮ末端ドメインに融合している。この融合ポリペプチドを含むＥＶは、ＩＬ６／ＩＬ６Ｒ複合体を効率的に隔離し、炎症を軽減する。同一の融合ポリペプチドもまた設計および試験したが、その構築物においてエキソソームドメインのシンテニンをＡｌｉｘと交換交換した。これはまたエキソソーム表面にｇｐ１３０デコイ受容体を表面提示するのに高効率な構築物であることを証明し、ＩＬ６シグナル伝達の低減をもたらした。
－配列番号５０（ｈＧＰ１３０－断片Ｘ－Ｎ末端シンテニン）：負荷を増大させ、そのリガンド（すなわち、ＩＬ６とＩＬ６Ｒとの間の複合体）に対して受容体親和性を向上するために、断片Ｘの四量体化ドメインに融合した、ヒトＧＰ１３０細胞外膜貫通およびその細胞質尾部の一部（シグナル伝達ドメインを除く）。四量体化ドメインはシンテニンのＮ末端ドメインに融合している。ポリペプチド保有ＥＶがＩＬ６媒介炎症を阻害することを可能にするための融合ポリペプチド構築物の別の例。
－配列番号５１（ｈＧＰ１３０－ＬＺ－トランスフェリン受容体エンドソームドメイン）：ＬＺ二量体化ドメインに融合した、ヒトＧＰ１３０細胞外－膜貫通およびその細胞質尾部の部分（シグナル伝達ドメインを除く）。ＬＺドメインは、それをエンドソームに向けるドメインを有するトランスフェリン受容体の細胞質尾部の一部（すなわち、配列番号７６、トランスフェリン受容体の一部を形成し、ＣＤ７１（配列番号１０）としても知られる）に融合する。これは、エンドソームへの、およびその後に放出されるＥＶ（エキソソーム）への構築物の選別を増強するであろう。ポリペプチド保有ＥＶがＩＬ６媒介炎症を阻害することを可能にするための融合ポリペプチド構築物の別の例。
－配列番号５２（Ｐ－セレクチン結合ペプチド－ｈＧＰ１３０－断片Ｘ－Ｎ末端シンテニン）：断片Ｘの四量体化ドメイン（四量体化ドメインは負荷を増大させ、そのリガンドに対する受容体親和性を向上させるために選ばれた）に融合した、ヒトＧＰ１３０細胞外－膜貫通およびその細胞質尾部の部分（シグナル伝達ドメインを除く）に融合した、（炎症部位への標的化、ならびに炎症の影響を受ける組織へのリンパ球浸潤を減少させる方法の両方に使用できる）Ｐ－セレクチン結合ペプチド。四量体化ドメインはシンテニンのＮ末端ドメインに融合し、やはりエキソソーム選別を増加させてエキソソーム産生の増大を刺激する。そのような融合ポリペプチドを保有するＥＶは、炎症部位を標的とし、リンパ球浸潤を減少させ、インビボで全体的に炎症を減少させることが示された。ＣＤ９もエキソソーム選別ドメインとして評価され、同じ融合ポリペプチドを用いて試験した場合（すなわち、シンテニンを置換した場合）中程度の有効性を示した。
－配列番号５３（断片Ｘ－トランスフェリン受容体－ｐ－セレクチン結合ペプチド）：断片Ｘの四量体化ドメイン（四量体化ドメインは負荷を増大させ、そのリガンドに対する受容体親和性を向上するために選択された）に融合した、ヒトトランスフェリン受容体－膜貫通およびその細胞質尾部の部分に融合した、（炎症部位への標的化ならびに炎症に冒された組織へのリンパ球浸潤を減少させる方法の両方のための）Ｐ－セレクチン結合ペプチド。
－配列番号５４（Ｐ－セレクチン結合ペプチド－ｈＧｐ１３０－ＬＺ－Ｎ末端シンテニン）：ＬＺ二量化ドメインに融合した、ヒトＧＰ１３０細胞外－膜貫通およびその細胞質尾部の部分（シグナル伝達部分を除く）に融合した、（炎症部位への標的化ならびに炎症に冒された組織へのリンパ球浸潤の減少の両方のための）Ｐ－セレクチン結合ペプチド。やはり、Ｐセレクチン融合ポリペプチドを保有するＥＶは、マウスの炎症部位への標的化および全体的な炎症の減少を示した。
－配列番号５５（ｈＴＮＦＲ－Ｚドメイン－ＴＮＦＲ膜貫通ドメイン－フォールドオン－Ｎ末端シンテニン）：ヒトＴＮＦＲ１受容体細胞外部分（細胞外部分にはＺ－ドメインもまた導入されている）。Ｚドメインは抗体のＦＣ部分に結合し、それゆえオプソニン化の過程を利用することによりＥＶの循環時間を増加させるだろう。膜貫通部分および細胞質尾部の部分断片（細胞質尾部のシグナル伝達能力のある部分は除去されている）は、フォールドオン三量体（ＴＮＦ受容体が三量体としてリガンドに結合し、それゆえ受容体はリガンドに結合するように既にプライミングされているので、フォールドオン三量体化ドメインが選択された）に融合される。フォールドオンドメインは、シンテニンのＮ末端ドメインとさらに融合している（シンテニンのＮ末端ドメインは、一部のＥＳＣＲＴおよびＡＬＩＸなどのＥＳＣＲＴアクセサリータンパク質に対する結合および相互作用部位を有する。これはＥＶへの選別を増加させ、ＴＮＦαへの結合を介して治療効果を発揮して、それにより炎症過程を減少させることに加えて、遺伝子操作された細胞における小胞生産を増加させる中心としても機能し得る。ＡＬＩＸは、いくつかの実験において、シンテニンの代わりに使用されており、すなわち、以下の融合タンパク質構築物：ｈＴＮＦＲ－Ｚドメイン－ＴＮＦＲ膜貫通ドメイン－フォールドオン－ＡＬＩＸを生成した。
－配列番号５６（シグナル伝達ドメインを含まないＩＬ２３受容体－Ｆｏｓ ＬＺ－シンテニン）：ロイシンジッパーＦｏｓに融合した、シグナル伝達ドメインを含まないヒトＩＬ２３受容体。ＦｏｓはそのパートナーであるＪｕｎと二量体化してヘテロ二量体複合体を形成する。ＩＬ２３受容体は、ＩＬ１２受容体サブユニットベータ１とヘテロ二量体複合体を自然に形成するので、以下のＩＬ１２受容体はＪｕｎを備えている。ＩＬ２３－Ｆｏｓタンパク質はさらにシンテニンに、そして別の融合ポリペプチド中でシンデカンに融合される。両方の融合ポリペプチドは、ＬＰＳ誘導した炎症モデルにおいてインビボでＩＬ２３の用量依存的な減少を達成した。
－配列番号５７（インターロイキン－１２受容体サブユニットβ－１－ＪｕｎＬＺ－シンテニン）：ロイシンジッパーＪｕｎを融合させた、シグナル伝達ドメインを含まないヒトＩＬ－１２受容体サブユニットβ－１受容体。ＪｕｎはそのパートナーＦｏｓと二量体化してヘテロ二量体複合体を形成する。ＩＬ１２受容体は、ＩＬ２３受容体とヘテロ二量体複合体を自然に形成するので、ＩＬ２３受容体はＦｏｓを備えている。ＩＬ１２－Ｊｕｎタンパク質はさらにＮ末端シンテニンに融合される。
－配列番号５８（ＩＬ１７Ｃ受容体－ＬＺ－Ｎ末端シンテニン）：ＬＺ二量体化ドメインに融合した、ヒトＩＬ１７Ｃ受容体細胞外－膜貫通およびその細胞質尾部の部分（シグナル伝達部分を除く）。二量体化ドメインはシンテニンのＮ末端ドメインに融合している。シンデカンは多くの実験においてシンテニンの代わりに使用されてきた、すなわち以下の融合タンパク質構築物：ＩＬ１７Ｃ受容体－ＬＺ－シンデカンを生成した。
－配列番号５９（ＣＤ６３－ＢＢＫ３２ ＦＢＮ ＢＲ ２Ｌ）：第２のループに挿入されたＰＯＩとしてＢＢＫ３２を有するヒトＣＤ６３。ＢＢＫ３２はＢｏｒｒｅｌｉａ菌に由来し、内皮細胞に結合し、これが血中のＢＢＫ３２被覆エキソソームの半減期を増加させる。
－配列番号６０（ＤＧＰＳＧＦＰ）：ＤＧＰＳはホスファチジルセリン（ＰＳ）結合ペプチドであり、これはＥＶをＰＯＩ、この場合はモデルＰＯＩとしてのＧＦＰで被覆するために使用される。
－配列番号６１（ＶＰ１ ＡＡＶ ＰＨＰ．Ａ－ＧＰ１３０膜貫通－ＬＺ－Ｎ末端シンテニンにおけるアミノ酸５２０～６１０）：ＬＺ二量体化ドメインに融合した、ヒトＧＰ１３０細胞外－膜貫通におよびその細胞質尾部の部分（シグナル部分を除く）に融合した、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドのＶＰ１のアミノ酸５２０～６１０（挿入されたものは、ＡＡＶウイルスの肝臓への取り込みを減少させるアミノ酸の７－ｍｅｒストレッチである）（ＧＰ１３０は細胞表面上に二量体として存在し、２分子のＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒヘテロ二量体複合体を有する六量体複合体を形成するので、したがってこの強制的二量体化はリガンド結合親和性の増加を促進するであろう）。二量体化ドメインは、シンテニンのＮ末端ドメインに、またＣＤ６３およびＣＤ８１にも融合され、すべての構築物は活性を示し、肝臓への取り込み減少を示した。
－配列番号６２（ＶＰ１ ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ－ＧＰ１３０膜貫通－ＬＺ－Ｎ末端シンテニンにおけるアミノ酸５２０～６１０）：ＬＺ二量体化ドメインに融合した、ヒトＧＰ１３０細胞外－膜貫通およびその細胞質尾部の部分（シグナル伝達部分を除く）に融合した、ＡＡＶウイルスキャプシドのＶＰ１のアミノ酸５２０～６１０（挿入されたものは、ＡＡＶウイルスの脳への取り込みを増加させることを示す７ｍｅｒであり、これによって、この構築物を含むＥＶの脳への取り込みは増加されるだろう）（ＧＰ１３０は細胞表面上に二量体として存在し、２分子のＩＬ－６／ｓＩＬ－６Ｒヘテロ二量体複合体を有する六量体複合体を形成するので、したがってこの強制的二量体化はリガンド結合親和性の増加を促進するであろう）。二量体化ドメインは、シンテニンのＮ末端ドメインに融合されたが、別の実験ではＦＬＯＴ１にも融合して、融合ポリペプチドの他の成分の一般的な適用性を検証した。
－配列番号６３（脳標的化ペプチドＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂを有するＣＤ６３）：ＣＤ６３の第２のループに挿入されたＡＡＶ脳標的化ペプチド、この融合ポリペプチドを含むＥＶの脳内への取り込みの増加をもたらす。
－配列番号６４（脳標的化ペプチドＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａを有するＣＤ６３）：肝臓の取り込みを減少させるＡＡＶペプチドがＣＤ６３の第２のループに挿入され、肝臓への取り込みの減少をもたらす。
－配列番号６５（トランスフェリン受容体－ＶＰ１ ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ中のアミノ酸５２０～６１０）：ＡＡＶ脳標的化ペプチドに融合したヒトトランスフェリン受容体は、上記融合ポリペプチドを保有するＥＶの脳内への取り込みを増加させる。
－配列番号１５に融合した配列番号６６（ロイシンジッパー、フォールドオン、および断片Ｘなどの様々な異なるホモ多量体化ドメインを使用してシンテニンに融合したＣＤ４７）：Ｎ末端シンテニンに融合したＣＤ４７。ＥＶの表面上の複数コピーのＣＤ４７、あるいは複数コピーのＣＤ５５（配列番号６７）の提示は、そのようなＥＶの循環時間の増加をもたらし、ＥＶがそれらの治療効果を発揮するためのより長い時間枠を可能にする。この融合ポリペプチドは、他の融合ポリペプチドを含むコンビナトリアルＥＶにうまく組み合わされ、この融合ポリペプチドの循環促進効果を他のＰＯＩ、例えば、デコイ受容体の治療効果と組み合わせた。
－配列番号６８（ＩＬ１７Ａ受容体－ＬＺ－Ｎ末端シンテニン）：ＬＺ二量体化ドメインに融合した、ヒトＩＬ１７Ａ受容体細胞外－膜貫通およびその細胞質尾部の部分（シグナル伝達部分を除く）。二量体化ドメインは、シンテニンまたはシンデカンのＮ末端ドメインに融合している。
－配列番号８７（ｈＴＮＦＲ－Ｚドメイン－ＴＮＦＲ膜貫通ドメイン－フォールドオン－ＨＩＶ Ｇａｇ ｐ６）：Ｚドメインに融合され、ＨＩＶ Ｇａｇ ｐ６エキソソーム選別ドメインに融合されたフォールドオンドメインと組み合わされたヒトＴＮＦＲ受容体、および別の融合ポリペプチド構築物においてもエキソソーム選別ドメインＣＤ８１に融合されたヒトＴＮＦＲ受容体。ＴＮＦＲのＥＶ表面への輸送においてＣＤ８１はＨＩＶ Ｇａｇ ｐ６ほど効率的ではなかったが、それでもなお抗ＴＮＦα活性が両方の融合ポリペプチドで見られた。
－配列番号８８（インターロイキン－１受容体１型－ＨＩＶ Ｇａｇ ｐ６）：ヒトＩＬ１受容体１型はＨＩＶ Ｇａｇ ｐ６エキソソーム選別ドメインに融合されており、別の融合ポリペプチド構築物においてもエキソソーム選別ドメインシンデカンに融合されている。ＨＩＶ Ｇａｇ ｐ６およびシンデカンはどちらも、ＩＬ１Ｒ ＰＯＩをエキソソームの表面に輸送するのに非常に効率的であり、インビトロでかなりの抗ＩＬ１シグナル伝達効果を発揮した。

【0032】

好ましい実施形態では、融合ポリペプチドのいかなるタンパク質分解的切断も回避するために、ＰＯＩのアミノ酸配列、エキソソーム選別ドメイン、および／または多量体化ドメイン（すなわち、融合ポリペプチドの本質的にどこでも）中の任意のプロテアーゼ切断部位が突然変異または除去される（部分的または完全に）。（除去または突然変異によって）マスクすることが重要である１つの特定のタイプのプロテアーゼ切断部位は、ＰＭＮエラスターゼなどのプロテアーゼ、ＭＭＰ－２などのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、およびＭＭＰ－１３、ＡＤＡＭ１７、ＡＤＡＭ１０、および他のエンドペプチダーゼによって認識される切断部位である。したがって、本発明の例示的実施形態では、融合ポリペプチドは変異プロテアーゼ切断部位を含むか、あるいは融合ポリペプチドはプロテアーゼ切断部位を完全に欠いている。例えば、ヒトＴＮＦＲ１のＩＥＮＶＫストレッチ（残基１９８～２０３）の除去または突然変異は、ＡＤＡＭ１７切断に対する耐性を提供し、それによってＥＶへの負荷効率および結果として生じる治療効果を増強する。プロテアーゼ切断部位の除去または突然変異は、インビトロおよびインビボで少なくとも２倍、場合によっては５倍または１０倍もの量で治療活性を増加させることができることが示され、この戦略は一貫して融合ポリペプチドを安定化するために適用された。

【0033】

別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの多量体化ドメインと組み合わされたエキソソーム選別ドメインは、ＥＶ細胞源からのＥＶの放出を増加させるのに寄与し得る。いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、親細胞によるＥＶ産生におけるこの増加は、エキソソーム選別ドメインとＥＳＣＲＴ選別システムとの相互作用に起因すると推定される。多量体化ドメインは、ＥＳＣＲＴ複合体との相互作用点を増加させる可能性があるので、ＥＶ起源細胞における小胞（例えば、エキソソーム）産生をさらに増加させる。エキソソーム選別ドメインは、ＥＳＣＲＴ成分と相互作用し、小胞形成を誘導し、それゆえ小胞放出を増加させるだろう。多量体化ドメインは、いくつかのエキソソーム選別ドメイン（例えば、シンテニン、シンデカン、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１３３など）を互いに非常に接近させるので、小胞形成の誘導をさらに促進するＡＬＩＸなどのＥＳＣＲＴ成分との相互作用を増大させる。このアプローチを利用して、エキソソーム選別ドメインおよび目的のタンパク質のみを含む対応する構築物を含むように遺伝子改変された細胞からのＥＶの産生と比較した場合、小胞放出は１０倍も増加し得る。したがって、やはり特定の理論に縛られることを望むものではないが、少なくとも１つのエキソソーム選別ドメイン、少なくとも１つの多量体化ドメイン、および少なくとも１つの目的のタンパク質の新規の組み合わせを含むポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物を含むＥＶ起源細胞の遺伝子操作は、治療効果の高いＥＶだけでなく、ＥＶ収量の大幅な増加ももたらす。

【0034】

本発明による起源細胞は、広範囲の細胞、例えば、間葉系幹細胞もしくは間質細胞または線維芽細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、ウォートンゼリー、周産期組織、歯芽、臍帯血、皮膚組織等から得られる）、羊膜細胞、より具体的には羊膜上皮細胞、骨髄抑制細胞から選択され得る。一般に、初代細胞および細胞株の両方がエキソソームおよびＥＶの適切な供給源である。非限定的な例としては、例えば、以下のものが挙げられる：ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞、周皮細胞、内皮細胞、リンパ球、内皮細胞、および気管、肺、消化管、尿路などの異なる臓器由来の上皮細胞、樹状細胞（ＤＣ）または造血系由来の他の細胞、例えば、マクロファージ、単球、Ｂ細胞もしくはＴ細胞、ＮＫ細胞、好中球、好酸球、マスト細胞もしくは好塩基球、赤血球もしくは赤血球前駆細胞、血小板および巨核球など、胎盤由来細胞（例えば、脱落膜胎盤細胞）、合胞体栄養細胞および羊膜上皮細胞などのような異なる起源由来の細胞、ならびにミクログリア、星状細胞、オリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞などのＣＮＳおよびＰＮＳ由来の細胞、上衣細胞および神経細胞など、褐色または白色脂肪由来の脂肪細胞、平滑筋および骨格筋起源の両方の筋細胞、ならびに心筋細胞、など。一般に、ＥＶおよびエキソソームは、それが初代細胞源または細胞株であれば、本質的に任意の細胞源に由来し得る。ＥＶ起源細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および任意の方法によって誘導された他の幹細胞または前駆細胞を含む、任意の胚、胎児、および成体の体性幹細胞型であり得る。神経学的疾患を治療する場合、起源細胞、例えば、一次ニューロン、星状細胞、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、および神経前駆細胞を利用することを企図し得る。起源細胞は、治療される患者にとって同種異系、自己、またはさらに異種の性質のいずれであってもよく、すなわち、細胞は患者自身からのものでも、または無関係の、適合の、もしくは不適合のドナーからのものでもよい。特定の状況において、同種異系細胞は、特定の適応症を患っている患者の自己由来細胞からは得られないかもしれない免疫調節効果を提供する可能性があるので、医学的観点から好ましいとすることができる。

【0035】

さらに別の態様では、本発明は、本発明によるＥＶを含む薬学的組成物に関する。典型的には、本発明による薬学的組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化された少なくとも１種類の治療用ＥＶ（すなわち、少なくとも１つの所望のＰＯＩを含むポリペプチド構築物を含むＥＶの集団）を含む。少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤は、任意の薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、固体もしくは液体充填剤、希釈剤、賦形剤、担体、溶媒、またはカプセル化材料を含む群から選択され得る。それらは、例えば、ある臓器もしくは体の一部から、別の臓器もしくは体の一部へと（例えば、血液から任意の目的の組織および／または臓器および／または体へと）治療用送達小胞の活性を停止、維持、または治療的送達小胞を運搬もしくは輸送することに関与し得る。１つの特に好適な薬学的に許容され潜在的に活性な賦形剤は、ヘパリンまたはその任意の類似体および／または誘導体である。ヘパリンは、部分的にはＥＶの肝臓への取り込みを減少させることによって、本発明によるＥＶの半減期および有効性を増加させるために使用され得る。本明細書に記載されるようにインビボ実験に使用されるＥＶ集団は、通常、液体形態で製剤化され、それは主に適切な添加剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液に基づく。他の塩および／または糖含有溶液もまた、本発明によるＥＶを含む薬学的組成物として使用されてきた。

【0036】

本発明はまた、ＰＯＩを含むＥＶの美容応用に関する。したがって、本発明はまた、乾燥肌、しわ、ひだ、隆起、および／または肌のしわなどの症状および問題を改善および／または軽減するために、適切なＥＶを含むクリーム、ローション、ゲル、エマルジョン、軟膏、ペースト、粉末、リニメント剤、日焼け止め剤、シャンプーなどのスキンケア製品にも関する。美容的性質および治療的性質の両方の一実施形態において、本発明によるＥＶは、ＰｏＩとしてボツリヌス毒素（例えば、ボトックス、例えばボツリヌス毒素Ａ～Ｇ型）を含むことができる（ボツリヌス毒素は必ずしも美容用途のみに使用されるわけではなく、例えば、片頭痛やジストニアの治療にも適用可能である）。好ましい実施形態では、再生特性を有する適切なエキソソーム産生細胞（間葉系幹細胞または羊膜上皮細胞など）から入手可能なＥＶ（少なくとも１種類のＰＯＩを含む）は、しわ、線、ひだ、隆起および／または皮膚のしわの美容的緩和または治療的緩和に使用するための美容クリーム、ローション、またはゲルに含まれる。

【0037】

さらに別の態様では、本発明は、医学における使用のための本発明によるＥＶに関する。当然のことながら、ＥＶが医薬に使用される場合、実際には通常、典型的には、ＥＶ集団および何らかの形態の薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物の形態で使用されるＥＶの集団である。患者に投与されるＥＶの用量は、ＥＶに負荷されたＰＯＩの量、治療または軽減されるべき疾患または症状、投与経路、ＰＯＩ自体の薬理学的作用、ならびに様々な関連性のある他のパラメータに依存するであろう。本発明のＥＶは、予防および／または治療目的、例えば、様々な疾患および障害の予防および／または治療および／または軽減における使用のために使用することができる。本発明によるＥＶが適用され得る疾患の非限定的な例としては、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、リウマチ様関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、インターロイキン－１受容体拮抗薬（ＤＩＲＡ）の欠乏、子宮内膜症、自己免疫肝炎、強皮症、筋炎、脳卒中、急性脊髄損傷、血管炎、ギランバレー症候群、急性心筋梗塞、ＡＲＤＳ、敗血症、髄膜炎、脳炎、肝不全、腎不全、移植片対宿主病、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーおよびその他の筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症（α－マンノシド症、β－マンノシド症、アスパルチルグルコサミン尿、コレステリルエステル蓄積症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコイドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病Ｉ型、ゴーシェ病ＩＩ型、ゴーシェ病ＩＩＩ型、ＧＭ１ガングリオシド症Ｉ型、ＧＭ１ガングリオシド症ＩＩ型、ＧＭ１ガングリオシド症ＩＩＩ型、ＧＭ２－サンドホフ病、ＧＭ２－テイ－サックス病、ＧＭ２－ガングリオシド症、ＡＢ変異型、ムクリピドーシスＩＩ、クラッベ病、リソソーム酸リパーゼ欠乏症、変色性白質ジストロフィー、ＭＰＳＩハーラー症候群、ＭＰＳＩシャイエ症候群、ＭＰＳＩハーラーシャイエ症候群、ＭＰＳＩＩハンター症候群、ＭＰＳＩＩＩＡサンフィリッポ症候群タイプＡ、ＭＰＳＩＩＩＢサンフィリッポ症候群タイプＢ、ＭＰＳＩＩＩＢサンフィリッポ症候群タイプＣ、ＭＰＳＩＩＩＢサンフィリッポ症候群タイプＤ、ＭＰＳＩＶモルキオＡ型、ＭＰＳＩＶモルキオＢ型、ＭＰＳＩＸヒアルロニダーゼ欠損症、ＭＰＳＶＩマロトーラミー、ＭＰＳＶＩＩスライ症候群、ムコリピドー症Ｉ－シアリドーシス、ムコリピドーシスＩＩＩＣ、ムコリピドーシスＩＶ型、多発性スルファターゼ欠損症、神経セロイドリポフスチン症Ｔ１、神経セロイドリポフスチン症Ｔ２、神経セロイドリポフスチン症Ｔ３、神経セロイドリポフスチン症Ｔ４、神経セロイドリポフスチン症Ｔ５、神経セロイドリポフスチン症Ｔ６、神経セロイドリポフスチン症Ｔ７、神経セロイドリポフスチン症Ｔ８、神経セロイドリポフスチン症Ｔ９、神経セロイド性リポフスチン症Ｔ１０、ニーマンピック病Ａ型、ニーマンピック病Ｂ型、ニーマンピック病Ｃ型、ポンペ病、濃化異骨症、サラ病、シンドラー病、およびウォルマン病など）、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および他のトリヌクレオチド反復関連疾患を含む神経変性疾患、認知症、ＡＬＳ、癌性悪液質、拒食症、２型糖尿病、および様々な癌が含まれる。

【0038】

実質的にすべての種類の癌、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、小脳基底細胞癌、または大脳基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、脳腫瘍（小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽細胞腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、神経路および視床下部神経膠腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（小児期、消化管）、原発不明癌、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、大腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌（眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）、胆嚢癌、胃癌、消化管（カルチノイド）腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ））、胚細胞腫瘍（頭蓋外、性腺外、または卵巣）、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫（脳幹の神経膠腫、大脳星細胞腫、視経路および視床下部神経膠腫）、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌（腎細胞癌）、喉頭癌、白血病（急性リンパ芽球性（急性リンパ性白血病とも呼ばれる））、急性骨髄性（急性骨髄性白血病とも呼ばれる）、慢性リンパ性（慢性リンパ性白血病とも呼ばれる）、慢性骨髄性（慢性慢性骨髄性白血病とも呼ばれる）、有毛細胞白血病）、口唇癌および口腔癌、脂肪肉腫、肝癌（原発）、肺癌（非小細胞、小細胞）、リンパ腫（（ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキン（ホジキンリンパ腫を除くすべてのリンパ腫の古い分類）リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫髄芽腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性頸部扁平上皮癌、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病（急性、慢性）、骨髄腫、鼻腔癌および副鼻腔癌、上咽頭癌、神経芽細胞腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌（表面上皮間質性腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵島細胞癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、腎臓癌、腎細胞癌（腎臓癌）、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫（ユーイング腫瘍肉腫、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫）、セザリー症候群、皮膚癌（非黒色腫、メラノーマ）、小腸癌、扁平上皮細胞癌、扁平上皮頸部癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盂および尿管の移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、および／またはウィルムス腫瘍は、本発明の関連標的である。

【0039】

本発明によるＥＶは、様々な異なる投与経路、例えば、耳介（耳）、口腔内、結膜、皮膚、歯科、電気浸透、子宮頸管内、類洞外、気管内、経腸、硬膜外、羊水外、体外、血液透析、浸潤、間質、腹腔内、羊膜内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、骨内、心臓内、軟骨内、耳内、海綿体内、腔内、脳内、嚢内、角膜内、歯冠内（歯）、冠状内、陰核海綿体内、皮内、椎間板内、管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、腔内、リンパ管内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼球内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、脊髄内、滑液嚢内、腱内、精巣内、くも膜下腔内、胸腔内、管内、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、静脈内点滴、脳室内、膀胱内、硝子体内、イオン導入、洗浄、喉頭、鼻、経鼻胃、密封包帯法、眼、経口、口咽頭、その他、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸（吸入）、眼球後方、軟組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所的、経皮、経粘膜、経胎盤性、経気管、経鼓膜（ｔｒａｎｓｔｙｍｐａｎｉｃ）、尿管、尿道、および／もしくは膣投与、ならびに／または上記投与経路の任意の組み合わせを介して、ヒト対象または動物対象に投与され得る。

【0040】

さらなる態様では、本発明は、上述のように、（ａ）本発明による少なくとも１つのポリペプチド（すなわち、少なくとも１つのエキソソーム選別ドメイン、少なくとも１つの多量体化ドメイン、および少なくとも１つのＰＯＩを含むポリペプチド、すなわち本明細書に開示のトリドメインポリペプチド）をコードする、１つ以上のポリヌクレオチド構築物（複数可）を細胞源（典型的には細胞株）に導入する工程と、（ｂ）ポリヌクレオチド構築物（複数可）からそれによってコードされるポリペプチド構築物（複数可）を発現する工程と、（ｃ）細胞によって産生されたＥＶを採取する工程と、を含む、ＥＶを産生する（またはより広くＥＶ集団を産生する）方法に関する。ＥＶの採取および精製は、種々の適切な方法を用いて行われ得る。例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、ビーズ溶出クロマトグラフィー、または本質的にそれらの任意の適切な組み合わせ、例えば、限外濾過とビーズ溶出クロマトグラフィーとの逐次的組み合わせ。

【0041】

本発明の範囲から逸脱することなく、上記の例示的な態様、実施形態、代替形態、および変形形態を修正することができることを理解されたい。本発明は、以降、添付の実施例を用いてさらに例示されるが、当然のことながら、本発明の範囲および要旨から逸脱することなく大きく変更することもできる。

【実施例】

【0042】

実施例１：ＴＮＦＲ１デコイ受容体エキソソームの効率の向上
ＮｆＫｂ活性化のためのルシフェラーゼレポーターを安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＴＮＦ－αで誘導した。羊膜由来ＥＶ起源細胞を、異なるＴＮＦＲ１－デコイ受容体（すなわち、目的のタンパク質、ＰＯＩ）を有する異なる融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物で安定にトランスフェクトし、それによってＴＮＦαに結合してＴＮＦαを「デコイ」する。異なる融合ポリペプチドを含むＥＶをＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物に添加して、ＴＮＦα媒介シグナル伝達の遮断においてその活性を評価した。

【0043】

ルシフェラーゼシグナル（ＴＮＦα活性化の測定値）を処置の２４時間後に測定した。図１は、多量体化ドメイン、フォールドオン（配列番号２０）が、（エキソソーム選別ドメインおよびＰＯＩからなる融合ポリペプチドのみを含むＥＶと比較して）ＥＶの効果を用量依存的に増大させることを明確に示す。図１において、灰色枠線付きの黒色バーは疑似ＥＶを表し、黒色バーはＴＮＦＲ－シンテニンＥＶを表し、薄灰色バーはＴＮＦＲ－フォールドオン細胞外－シンテニンＥＶであり、濃灰色はＴＮＦＲ－フォールドオン細胞内－シンテニンＥＶである。図１から分かるように、細胞外フォールドオン多量体化ドメインは、ＴＮＦα媒介シグナル伝達のほぼ完全な無効化をもたらしている。

【0044】

実施例２：融合ポリペプチドに多量体化ドメインを挿入した後のｇｐ１３０デコイ受容体ＥＶの効率の向上
ＩＬ６活性化のためのレポーターを安定に発現するＨｅＬａ細胞をハイパーＩＬ６で処置し、ＥＶの外表面上にｇｐ１３０デコイ受容体（すなわちＰＯＩ（配列番号３０））を備えたＥＶ（骨髄由来間葉系間質細胞から得た）を添加した。誘導の２４時間後にＩＬ６活性化を測定した。ＧＰ１３０－ＬＺ－Ｎ末端シンテニン構築物を備えたＥＶは、ＩＬ６媒介シグナル伝達の阻害において、ＧＰ１３０－Ｎ末端シンテニンのみを備えたＥＶより明らかに優れている。これは、多量体化ドメインが挿入されているデコイ受容体融合ポリペプチドを含むＥＶの活性の増加を強調している。

【0045】

図２の黒色バーは疑似ＥＶを表し、濃灰色のバーは規則的なシンテニン－ｇｐ１３０融合ポリペプチドを含むＥＶを表し、薄灰色のバーはロイシンジッパーの形態で多量体化ドメインを含む融合ポリペプチドを含むＥＶを表す（完全融合ポリペプチドはｇｐ１３０ロイシンジッパー－シンテニン（配列番号５０）である）。

【0046】

実施例３：ｇｐ１３０デコイＥＶで効率的に処置されたＬＰＳ誘導した全身性炎症
マウスにＬＰＳを与えて敗血症様状態を誘導し、誘導後、動物に、（ｉ）エキソソーム選別ドメインおよびＰＯＩのみ、すなわちＧＰ１３０－Ｎ末端シンテニン構築物、または（ｉｉ）エキソソーム選別ドメイン、多量体化ドメイン断片Ｘ（配列番号２１）、およびＰＯＩがＧＰ１３０（ＩＬ６／ｓＩＬＲ複合体をデコイし、それによってＩＬ６媒介シグナル伝達を阻害するため）またはＴＮＦＲ（ＴＮＦαをデコイして下流のシグナル伝達を遮断するため）のいずれかであるもの、のいずれかを含む融合ポリペプチドを含むＭＳＣ由来ＥＶを注射した。両方のデコイＥＶは偽処置されたマウスよりも高い活性を示したが、多量体化ドメインを備えたデコイＥＶは、ＧＰ１３０－Ｎ末端シンテニンＥＶ（すなわち多量体化ドメインを含まない融合ポリペプチドを含むＥＶ）と比較して優れており、デコイ受容体エキソソームによる処置は、７２時間の試験の終わりに１００％の生存率をもたらした。

【0047】

実施例４：エキソソーム選別ドメインと組み合わせた多量体化ドメインを安定に発現する細胞からの粒子放出の増加を示すＮＴＡデータ
ＨＵＶＥＣは、ＴＮＦＲ１－フォールドオン－Ｎ末端シンテニン融合ポリペプチド構築物をコードするウイルスによって安定に形質導入された。ＴＮＦＲ１－フォールドオン－Ｎ末端シンテニン融合ポリペプチドを含む対照細胞およびＥＶを産生する細胞を１５ｃｍプレートに播種し、全血清培地中で２４時間増殖させた。２４時間後、培地を無血清ＯｐｔｉＭＥＭ培地に交換し、細胞を４８時間ＯｐｔｉＭＥＭとインキュベートした。培地を回収し、培地からＥＶを精製し、その後、精製したＥＶをＮＴＡによって分析した。

【0048】

図４は、対照細胞によって産生されたエキソソームを示す薄い線と比較して、エキソソーム（濃い線）に存在するＴＮＦＲ１－フォールドオン－シンテニン融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞からのエキソソーム産生の３０倍の増加によって明示されるように、多量体化ドメインが対照細胞よりかなり高いレベルでＥＶ放出を誘導することを示す。

【0049】

実施例５：２Ｇ１２ ＩｇＧホモ二量体ドメインは、ｇｐ１３０デコイ受容体エキソソームの抗ＩＬ－６トランスシグナル伝達遮断活性を増加させる。
ＩＬ６活性化のためのレポーターを安定に発現するＨｅＬａ細胞を、ハイパーＩＬ６およびｇｐ１３０デコイ受容体を備えたＥＶ（骨髄由来ＭＳＣから得た）で処置した。誘導の２４時間後にＩＬ６活性化を測定した。ＧＰ１３０－２Ｇ１２ ＩｇＧホモ二量体ドメイン－ＡＬＩＸ構築物を含むエキソソームは、ＧＰ１３０－ＡＬＩＸのみを備えたエキソソームよりも強い抗ＩＬ－６トランスシグナル伝達活性を示した。これは、多量体化ドメインが挿入されているデコイ受容体融合ポリペプチドを含むＥＶの活性の増加を強調している。

【0050】

図５の黒色のバーは疑似ＥＶを表し、灰色のバーは通常のＡＬＩＸ－ｇｐ１３０融合ポリペプチドを含むＥＶを表し、黒枠線付きの白いバーは２Ｇ１２ ＩｇＧホモ二量体ドメインの形態で多量体化ドメインを含む融合ポリペプチドを含むＥＶを表す（完全融合ポリペプチドは、ｇｐ１３０－２Ｇ１２ ＩｇＧホモ二量体ドメイン－ＡＬＩＸである）。

【0051】

実施例６：心臓ホスホランバン膜貫通五量体は、テトラスパニンＣＤ６３とＣＤ８１とを組み合わせた場合にガウシアルシフェラーゼの発現を増加させる。
脂肪組織由来ＭＳＣは、４つの異なるガウシアレポーター構築物で安定に形質導入された。ガウシアは、多量体化ドメインの有無にかかわらずＣＤ６３およびＣＤ８１と融合した。ＥＶを馴化培地（４８時間インキュベートした）から採取し、接線流およびＣａｐｔｏ－ｃｏｒｅ液体クロマトグラフィーカラムで精製した。ガウシアルシフェラーゼシグナルは、ＣＤ６３／８１負荷の測定として、採取したＥＶについて測定した。図６から明らかに分かるように、心臓ホスホランバン膜貫通五量体ドメインを有するＣＤ６３／８１構築物はより高いシグナルを有するので、ＥＶタンパク質の負荷を増大させた。図７の黒色のバーはＣＤ６３－ガウシアＥＶを表し、黒枠線付きの点模様のバーはＣＤ８１－ガウシア融合ポリペプチドＥＶを表し、灰色のバーはＣＤ６３、ガウシア、および心臓ホスホランバン膜貫通五量体多量体化ドメインの形態で多量体化ドメイン（完全融合ポリペプチドはＣＤ６３－心臓ホスホランバン膜貫通五量体多量体化ドメイン－ガウシア）を含む融合ポリペプチドを含むＥＶを表し、黒枠線付きの白色バーはＣＤ８１－心臓ホスホランバン膜貫通五量体多量体化ドメイン－ガウシアＥＶを表す。

【0052】

実施例７：ロイシンジッパーホモ二量体ドメインは、ｇｐ１３０提示デコイ受容体エキソソームの抗ＩＬ６トランスシグナル伝達遮断活性を増加させる。
ＩＬ６活性化のためのレポーターを安定に発現するＨｅＬａ細胞を、ハイパーＩＬ６で処置し、ＰＯＩとしてのｇｐ１３０デコイ受容体、多量体化ドメインとしてのロイシンジッパーホモドメイン、および様々なエキソソーム選別ドメインを含む融合タンパク質構築物を備えたＥＶ（骨髄由来間葉系間質細胞から得た）で処置した。図７の黒色のバーは疑似ＥＶを表し、黒枠線付きのバーは通常のシンテニン－ｇｐ１３０融合ポリペプチドを含むＥＶを表し、黒枠線付きの点模様のバーはロイシンジッパーの形態で多量体化ドメインを含む融合ポリペプチドを含むＥＶ（完全融合ポリペプチドはｇｐ１３０－ロイシンジッパー－シンテニンである）を表し、濃灰色のバーはＧｐ１３０－ロイシンジッパー－ＣＤ６３を表し、薄灰色のバーはＧｐ１３０－ロイシンジッパー－ＣＤ８１を表し、黒枠線付きの白色のバーはＧｐ１３０－ロイシンジッパー－トランスフェリン受容体エンドソーム選別ドメインを表す。ロイシンジッパードメインを含む融合タンパク質は、ＩＬ６媒介シグナル伝達の阻害においてＧＰ１３０－シンデカンのみを備えたＥＶより明らかに優れており、これは評価したエキソソーム選別ドメイン全体に適用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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