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特許7366160放射標識されたＭＯＥＭ型オリゴヌクレオチド及びその調製のための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-12
(45)【発行日】2023-10-20
(54)【発明の名称】放射標識されたＭＯＥＭ型オリゴヌクレオチド及びその調製のための方法
(51)【国際特許分類】
C07H 21/02 20060101AFI20231013BHJP
C07H 21/04 20060101ALI20231013BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20231013BHJP
A61K 51/04 20060101ALI20231013BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231013BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20231013BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20231013BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20231013BHJP
【ＦＩ】
C07H21/02
C07H21/04 Z CSP
A61K31/7125
A61K51/04 300
A61P43/00
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/68
C12Q1/6876 Z
【請求項の数】
12
(21)【出願番号】P 2021575227
(86)(22)【出願日】2020-06-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-25
(86)【国際出願番号】 EP2020067058
(87)【国際公開番号】W WO2020254548
(87)【国際公開日】2020-12-24
【審査請求日】2022-01-11
(31)【優先権主張番号】19181407.8
(32)【優先日】2019-06-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】エデルマン マーティン
(72)【発明者】
【氏名】ムサー ソルステン
【審査官】伊佐地 公美
(56)【参考文献】
【文献】米国特許第０５８４７１０４（ＵＳ，Ａ）
【文献】REACTIVE AND FUNCTIONAL POLYMERS，2007年10月16日，Vol.67, No.11，pp.1373 - 1380，http://dx.doi.org/10.1016/j.reactfunctpolym.2007.07.036
【文献】Nucleoside, Nucleotide & Nucleic Acids，1999年，Vol.18, No2，pp.277-289
【文献】Proceedings of the National Academy of Sciences，1991年，Vol. 88，pp. 7595-7599
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｈ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
Ｃ１２Ｑ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉの放射標識されたオリゴヌクレオチドｎは、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ２は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー１は、Ｃ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
リンカー２は、アミノ基保護されていてもよいアミノＣ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
Ｑ＊は、式ＩＩＩ
ｎ’は、１～４の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、ＣＦ３、Ｃ１－６－アルキルであるか、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合する炭素原子と一緒にＣ３－５－シクロアルカン環を形成し；
Ｚ＊は、 ３ Ｈ－又は １４ Ｃ－標識されたＣ１－Ｃ６アルキル基である）
の残基を表し；且つ
受容体標的化部分は、式ＩＶ
【請求項2】
ｎが１の整数である、請求項１に記載の放射標識されたオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
Ｒ１及びＲ２が、互いに独立して、水素、Ｃ１－２－アルキルであるか、又はＲ１及びＲ２が、それらが結合する炭素原子と一緒にシクロプロピル環を形成する、請求項１又は２に記載の放射標識されたオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
Ｚ＊が、放射標識されたメチル又はエチル基である、請求項１～３のいずれか一項に記載の放射標識されたオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
放射標識が、
３Ｈ－標識である、請求項１～４のいずれか一項に記載の放射標識されたオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
オリゴヌクレオチドが、修飾されていてもよいＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ若しくはＬＮＡヌクレオシドモノマー又はこれらの組み合わせからなる７～３０ヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の放射標識されたオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
式Ｉｂ【請求項8】
式Ｉｃ【請求項9】
０．０３７ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～３．７ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の比活性を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の放射標識されたオリゴヌクレオチド。
【請求項10】
請求項１に記載の式Ｉの放射標識されたオリゴヌクレオチドの調製のための方法であって、式Ｖ
ｎは、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ２は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー１は、Ｃ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
リンカー２は、アミノ基保護されていてもよいアミノＣ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
受容体標的化部分は、
式ＩＶ
のチオールを、式ＶＩ
ｎ’は、１～４の整数であり、
Ｒ １ 及びＲ ２ は、互いに独立して、水素、ＣＦ ３ 、Ｃ １－６ －アルキルであるか、又はＲ １ 及びＲ ２ は、それらが結合する炭素原子と一緒にＣ ３－５ －シクロアルカン環を形成し、
Ｚ ＊ は、 ３ Ｈ－又は １４ Ｃ－標識されたＣ １ －Ｃ ６ アルキル基である］の放射標識されたマレインイミド化合物とコンジュゲートさせること
を含む、方法。
【請求項11】
組織又は体液中のオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態の決定において使用するための、請求項１～９のいずれか一項に記載の放射標識されたオリゴヌクレオチドを含む薬剤。
【請求項12】
前記使用が、ａ）有効量の、請求項１～９のいずれか一項に記載の放射標識されたオリゴヌクレオチドを、試験対象である組織又は体液に投与することと、
ｂ）組織又は体液中の、請求項１～９のいずれか一項に記載の放射標識されたオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態を測定することと、
任意選択的に、
ｃ）試験対象である組織又は体液中の、請求項１～９のいずれか一項に記載の放射標識されたオリゴヌクレオチドを、オートラジオグラフィーによってイメージ化することと
を含む、請求項１１に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、式Ｉ
［式中、ｎ、Ｘ１及びＸ２，リンカー１及び２、Ｑ＊、並びに受容体標的化部分は後述される］の新規の放射標識されたＭＯＥＭ型オリゴヌクレオチド、その調製のための方法、及び組織又は体液中のオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態の決定のためのその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
アンチセンス治療手法が有効であるために、オリゴヌクレオチドは患者に導入されなければならず、且つ治療対象である特定の組織に到達しなければならない。治療薬物の体内分布及び薬物動態は、薬物による処置の準備工程として決定されなければならない。したがって、体液又は組織中のオリゴヌクレオチドの検出が可能である必要がある。Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ２８，７（１９９５）（非特許文献1）には、アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物動態の特定の態様が概説されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドといった薬理的化合物のインビボでの薬物動態研究において使用される別の十分に確立された手法は、化合物を放射標識して検出を可能にすることを伴う。動物モデルにおいて、放射標識されたオリゴヌクレオチドが動物に投与され、体液及び組織内でのその分布が、オリゴヌクレオチドの抽出により、続いてオートラジオグラフィーにより評価された（Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８，７５９５－７５９９（１９９１）（非特許文献2）参照。
【0003】
３５Ｓ－標識は、確立されて広く普及している技術である。生物学的研究のために、３５Ｓ－標識されたオリゴヌクレオチドホスホロチオエートが、Ｈ－ホスホネート化学を使用して調製された（Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ． Ｓｃｒ． ２５，２８０－２８２（１９８５）（非特許文献3）参照。
【0004】
１４Ｃ及び３Ｈによる合成オリゴヌクレオチドの放射性同位元素標識は、現在、十分に確立された固相自動化合成を使用することにより達成される。この手法では、１４Ｃ又は３Ｈヌクレオシドホスホラミダイトの組み立てには、米国特許第５，８４７，１０４号（特許文献1）の図１に示される二段階式方法が必要である。しかしながら、この方法には複数の不利益が伴っている。放射性同位体が最初の工程で導入されるために、（ａ）２つの工程の後の放射化学収率が限定される；（ｂ）この作業には時に希釈の問題が伴う、即ち、自然存在比の同位体は通常、管理可能な合成スケールを維持するために担体としてブレンドされ、その結果最終オリゴの比活性が低下する、（ｃ）ホスホラミダイト３は分解し易い反応種であり、最終的な放射性前駆体としてストリンジェントな貯蔵及び輸送要件をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】米国特許第５，８４７，１０４号
【非特許文献】
【0006】
【文献】Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ２８，７（１９９５）
【文献】Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８，７５９５－７５９９（１９９１）
【文献】Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ． Ｓｃｒ． ２５，２８０－２８２（１９８５）
【発明の概要】
【0007】
先行技術の方法の欠点を考慮し、高い比活性を有する放射標識されたオリゴヌクレオチドを得るための他の手法が望まれている。
【0008】
したがって本発明の目的は、オリゴヌクレオチドの放射標識のための新規の手法を提供することである。
【0009】
この目的は、式Ｉ
［式中、
ｎは、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ２は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー１は、Ｃ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式
（式中、ｍは、１～６の整数である）のグリセロールベースの架橋であり；
リンカー２は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；Ｑ＊は、式ＩＩＩ
（式中、
ｎは、１～４の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、ＣＦ３、Ｃ１－６アルキルであるか、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合する炭素原子と一緒にＣ３－５－シクロアルカン環を形成し；
Ｚ＊は、放射標識されたＣ１－Ｃ６アルキル基である）
の残基を表し；且つ
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチドに追加の機能性を加える部分である］
の新規に開発された放射標識されたオリゴヌクレオチドにより達成されることが分かった。
ｎは、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ２は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー１は、Ｃ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式
リンカー２は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；Ｑ＊は、式ＩＩＩ
ｎは、１～４の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、ＣＦ３、Ｃ１－６アルキルであるか、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合する炭素原子と一緒にＣ３－５－シクロアルカン環を形成し；
Ｚ＊は、放射標識されたＣ１－Ｃ６アルキル基である）
の残基を表し；且つ
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチドに追加の機能性を加える部分である］
の新規に開発された放射標識されたオリゴヌクレオチドにより達成されることが分かった。
【0010】
[本発明1001]
式Ｉの放射標識されたオリゴヌクレオチド
［式中、
ｎは、0又は1であり；
Ｘ 1 及びＸ 2 は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー1は、Ｃ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
（式中、ｍは、1～6の整数である）のグリセロールベースの架橋であり；
リンカー2は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
Ｑ ＊ は、式ＩＩＩ
（式中、
ｎは、1～4の整数であり、
Ｒ 1 及びＲ 2 は、互いに独立して、水素、ＣＦ 3 、Ｃ 1－6 －アルキルであるか、又はＲ 1 及びＲ 2 は、それらが結合する炭素原子と一緒にＣ 3－5 －シクロアルカン環を形成し；
Ｚ ＊ は、放射標識されたＣ 1 －Ｃ 6 アルキル基である）
の残基を表し；且つ
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチドに追加の機能性を加える部分である］。
[本発明1002]
ｎが1の整数である、本発明1001の放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1003]
Ｒ 1 及びＲ 2 が、互いに独立して、水素、Ｃ 1－2 －アルキルであるか、又はＲ 1 及びＲ 2 が、それらが結合する炭素原子と一緒にシクロプロピル環を形成する、本発明1001又は1002の放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1004]
Ｚ ＊ が、放射標識されたメチル又はエチル基である、本発明1001～1003のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1005]
放射標識が、 3 Ｈ－又は 14 Ｃ－標識、好ましくは 3 Ｈ－標識である、本発明1001～1004のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1006]
オリゴヌクレオチドが、修飾されていてもよいＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ若しくはＬＮＡヌクレオシドモノマー又はこれらの組み合わせからなる7～30ヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含む、本発明1001～1005のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1007]
式Ｉｂ
［式中、Ｒ
1
、Ｒ
2
、Ｘ
2
、ｎ、Ｚ
＊
及びリンカー1は上記の通りである］の、本発明1001～1006のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1008]
式Ｉｃ
［式中、Ｒ
1
及びＲ
2
、Ｘ
1
及びＸ
2
、ｎ、Ｚ
＊
、リンカー1並びにリンカー2は上記の通りである］の、本発明1001～1007のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1009]
受容体標的化部分が、非ヌクレオチド部分、好ましくはアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分、より好ましくは式ＩＶ
［式中、Ｒ
3
は水素又はヒドロキシ保護基であり、ｎは0～10の整数、好ましくは0～5の整数、より好ましくは1～3の整数であるが、最も好ましくは2である］のＧａｌＮＡｃ部分、その対応する塩、エナンチオマー及び／又は立体異性体である、本発明1001～1008のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1010]
0．037ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（1Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～3．7ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（100Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、好ましくは0．111ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（3Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～1．85ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（50Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、より好ましくは0．185ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（5Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～0．925ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（25Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の比活性を有する、本発明1001～1009のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1011]
式Ｉ［式中、Ｑ ＊ は式ＩＩＩの残基を表す］の放射標識されたオリゴヌクレオチドの調製のための方法であって、
式Ｖ
［式中、
ｎは、0又は1であり；
Ｘ 1 及びＸ 2 は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー1は、Ｃ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
（式中、ｍは、1～6の整数である）のグリセロールベースの架橋であり；
リンカー2は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチド、特にアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分、好ましくはＧａｌＮＡｃ部分に追加の機能性を加える非ヌクレオチド部分である］
のチオールを、式ＶＩ
［式中、Ｒ
1
及びＲ
2
、ｎ並びにＺ
＊
は、上記の通りである］の放射標識されたマレインイミド化合物とコンジュゲートさせること
を含む、方法。
[本発明1012]
組織又は体液中のオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態の決定のための、本発明1001～1010のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチドの使用。
[本発明1013]
組織又は体液中のオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態の決定のための方法であって、
ａ）有効量の、本発明1001～1009のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチドを、試験対象である組織又は体液に投与することと、
ｂ）組織又は体液中の、本発明1001～1010のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態を測定することと、
任意選択的に、
ｃ）試験対象である組織又は体液中の、本発明1001～1010のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチドを、オートラジオグラフィーによってイメージ化することと
を含む、方法。
[本発明1014]
式Ｘ
［式中、
ｎは、0又は1であり；
Ｘ 1 及びＸ 2 は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー1は、Ｃ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
（式中、ｍは、1～6の整数である）のグリセロールベースの架橋であり；
リンカー2は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
Ｑは、式ＩＩＩａ
（式中、
ｎは1～4の整数であり、
Ｒ 1 及びＲ 2 は、互いに独立して、水素、ＣＦ 3 、Ｃ 1－6 アルキルであるか、又はＲ 1 及びＲ 2 は、それらが結合する炭素原子と一緒にＣ 3－5 －シクロアルカン環を形成し；
Ｚは、Ｃ 1 －Ｃ 6 アルキル基である）
の残基を表し；且つ
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチドに追加の機能性を加える部分である］
のオリゴヌクレオチド。
[本発明1015]
Ｚが、メチル又はエチルである、本発明1014のオリゴヌクレオチド。
[本発明1016]
式Ｘｂ
［式中、Ｒ
1
、Ｒ
2
、ｎ、Ｚ、Ｘ
2
及びリンカー1は上記の通りである］の、本発明1014又は1015のオリゴヌクレオチド。
[本発明1017]
式Ｘｃ
［式中、Ｒ
1
、Ｒ
2
、ｎ、Ｚ、Ｘ
1
及びＸ
2
、リンカー1並びにリンカー2は上記の通りである］の、本発明1014又は1015のオリゴヌクレオチド。
[本発明1018]
受容体標的化部分が、非ヌクレオチド部分、好ましくはアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分、より好ましくは式ＶＩＩ
［式中、Ｒ
3
は水素又はヒドロキシ保護基であり、ｎは0～10の整数、好ましくは0～5の整数、より好ましくは1～3の整数であるが、最も好ましくは2である］のＧａｌＮＡｃ部分、その対応する塩、エナンチオマー及び／又は立体異性体である、本発明1014～1017のいずれかのオリゴヌクレオチド。
[本発明1019]
修飾されていてもよいＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ若しくはＬＮＡヌクレオシドモノマー又はこれらの組み合わせからなる7～30ヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含む、本発明1014～1018のいずれかのオリゴヌクレオチド。
以下の定義は、本発明を説明するために使用される種々の用語の意味及び範囲を説明及び定義するために示されている。
式Ｉの放射標識されたオリゴヌクレオチド
ｎは、0又は1であり；
Ｘ 1 及びＸ 2 は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー1は、Ｃ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
リンカー2は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
Ｑ ＊ は、式ＩＩＩ
ｎは、1～4の整数であり、
Ｒ 1 及びＲ 2 は、互いに独立して、水素、ＣＦ 3 、Ｃ 1－6 －アルキルであるか、又はＲ 1 及びＲ 2 は、それらが結合する炭素原子と一緒にＣ 3－5 －シクロアルカン環を形成し；
Ｚ ＊ は、放射標識されたＣ 1 －Ｃ 6 アルキル基である）
の残基を表し；且つ
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチドに追加の機能性を加える部分である］。
[本発明1002]
ｎが1の整数である、本発明1001の放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1003]
Ｒ 1 及びＲ 2 が、互いに独立して、水素、Ｃ 1－2 －アルキルであるか、又はＲ 1 及びＲ 2 が、それらが結合する炭素原子と一緒にシクロプロピル環を形成する、本発明1001又は1002の放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1004]
Ｚ ＊ が、放射標識されたメチル又はエチル基である、本発明1001～1003のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1005]
放射標識が、 3 Ｈ－又は 14 Ｃ－標識、好ましくは 3 Ｈ－標識である、本発明1001～1004のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1006]
オリゴヌクレオチドが、修飾されていてもよいＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ若しくはＬＮＡヌクレオシドモノマー又はこれらの組み合わせからなる7～30ヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含む、本発明1001～1005のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1007]
式Ｉｂ
[本発明1008]
式Ｉｃ
[本発明1009]
受容体標的化部分が、非ヌクレオチド部分、好ましくはアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分、より好ましくは式ＩＶ
[本発明1010]
0．037ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（1Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～3．7ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（100Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、好ましくは0．111ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（3Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～1．85ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（50Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、より好ましくは0．185ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（5Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～0．925ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（25Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の比活性を有する、本発明1001～1009のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチド。
[本発明1011]
式Ｉ［式中、Ｑ ＊ は式ＩＩＩの残基を表す］の放射標識されたオリゴヌクレオチドの調製のための方法であって、
式Ｖ
ｎは、0又は1であり；
Ｘ 1 及びＸ 2 は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー1は、Ｃ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
リンカー2は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチド、特にアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分、好ましくはＧａｌＮＡｃ部分に追加の機能性を加える非ヌクレオチド部分である］
のチオールを、式ＶＩ
を含む、方法。
[本発明1012]
組織又は体液中のオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態の決定のための、本発明1001～1010のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチドの使用。
[本発明1013]
組織又は体液中のオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態の決定のための方法であって、
ａ）有効量の、本発明1001～1009のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチドを、試験対象である組織又は体液に投与することと、
ｂ）組織又は体液中の、本発明1001～1010のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態を測定することと、
任意選択的に、
ｃ）試験対象である組織又は体液中の、本発明1001～1010のいずれかの放射標識されたオリゴヌクレオチドを、オートラジオグラフィーによってイメージ化することと
を含む、方法。
[本発明1014]
式Ｘ
ｎは、0又は1であり；
Ｘ 1 及びＸ 2 は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー1は、Ｃ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
リンカー2は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ 2－12 －アルキレン架橋、1～10のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
Ｑは、式ＩＩＩａ
ｎは1～4の整数であり、
Ｒ 1 及びＲ 2 は、互いに独立して、水素、ＣＦ 3 、Ｃ 1－6 アルキルであるか、又はＲ 1 及びＲ 2 は、それらが結合する炭素原子と一緒にＣ 3－5 －シクロアルカン環を形成し；
Ｚは、Ｃ 1 －Ｃ 6 アルキル基である）
の残基を表し；且つ
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチドに追加の機能性を加える部分である］
のオリゴヌクレオチド。
[本発明1015]
Ｚが、メチル又はエチルである、本発明1014のオリゴヌクレオチド。
[本発明1016]
式Ｘｂ
[本発明1017]
式Ｘｃ
[本発明1018]
受容体標的化部分が、非ヌクレオチド部分、好ましくはアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分、より好ましくは式ＶＩＩ
[本発明1019]
修飾されていてもよいＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ若しくはＬＮＡヌクレオシドモノマー又はこれらの組み合わせからなる7～30ヌクレオチドの連続したヌクレオチド配列を含む、本発明1014～1018のいずれかのオリゴヌクレオチド。
以下の定義は、本発明を説明するために使用される種々の用語の意味及び範囲を説明及び定義するために示されている。
【0011】
「Ｃ１－６－アルキル」という用語は、１～６個の炭素原子、詳細な実施形態では１～４個の炭素原子を有する一価の直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素基を示す。Ｃ１－６－アルキルの例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｉ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル又はｔ－ブチル、好ましくはメチル又はエチル、より好ましくはメチルを含む。
【0012】
「Ｃ２－１２－アルキル」という用語は、２～１２個の炭素原子、詳細な実施形態では４～８個の炭素原子、より詳細な実施形態では６個の炭素原子を有する一価の直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素基を示す。特定の例は、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル又はオクチル、及びその異性体であるが、好ましくはｎ－ヘキシルである。
【0013】
用語Ｃ３－５－シクロアルカン環は、３～５個の炭素原子を有する炭素環を表し、シクロプロパン－、シクロブタン－又はシクロペンタン－環を含む。
【0014】
「Ｃ２－１２－アルキレン」という用語は、２～１２個の炭素原子、詳細な実施形態では４～８個の炭素原子、より詳細な実施形態では６個の炭素原子を有する二価の直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素基を表す。特定の例は、ブチレン、ペンチレン、へキシレン、へプチレン又はオクチレン、及びその異性体であるが、好ましくはｎ－へキシレンである。
【0015】
「アミノＣ２－１２－アルキレン架橋」という用語は、２～１２個の炭素原子、詳細な実施形態では４～８個の炭素原子、より詳細な実施形態では６個の炭素原子を有する分岐鎖の飽和炭化水素基に結合したアミノ基を含む二価の基を表す。特定の例は、アミノブチレン、アミノペンチレン、アミノへキシレン、アミノへプチレン又はアミノオクチレン、及びその異性体であるが、好ましくはアミノｎ－へキシレン（－ＮＨ－（ＣＨ２）６－）である。
【0016】
「エチレングリコール単位」という用語は、架橋単位として１～１０のエチレングリコール単位、好ましくは２～６のエチレングリコール単位を含むことのできる式－（ＣＨ２）２－Ｏ－の単位を表す。
【0017】
「グリセロール単位グリセロールベースの架橋」という用語は、式
［式中、ｍは、１～６の整数、好ましくは１～３の整数、より好ましくは１の整数である］により特徴づけられる。
【0018】
「アミノ保護基」という用語は、アミノ基を保護することを意図した基を示し、ベンゾイル、ベンシルオキシカルボニル、カルボンベンジルオキシ（ＣＢＺ又はＺ）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ｐ－メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ－ニトロベンジルオキシカルボニル、ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、及びトリフルオロアセチルを含む。これらの基のさらなる例は、Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，２ｎｄ ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９１、ｃｈａｐｔｅｒ ７；Ｅ． Ｈａｓｌａｍ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｊ． Ｇ． Ｗ． ＭｃＯｍｉｅ、Ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９７３，Ｃｈａｐｔｅｒ ５，ａｎｄ Ｔ．Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８１に見られる。
【0019】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオチドを含む分子として当業者に一般に理解されるように定義される。治療的に価値のあるオリゴヌクレオチドとしての使用のために、オリゴヌクレオチドは、典型的には、７～３０ヌクレオチド長として合成される。
【0020】
オリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよいＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ又はＬＮＡヌクレオシドモノマー又はそれらの組み合わせからなりうる。
【0021】
ＬＮＡヌクレオシドモノマーは、ヌクレオチドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間に架橋と呼ばれるリンカー基を含む修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献において、架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。
【0022】
本明細書で使用される場合、修飾されていてもよいとは、糖部分又は核酸塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって、等価なＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡ又はＬＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含み、例えば、１つ以上の２’置換ヌクレオシド及び／又は１つ以上のＬＮＡヌクレオシドを含みうる。修飾ヌクレオシドという用語は、本明細書では、「ヌクレオシドアナログ」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」という用語と互換的に使用することもできる。
【0023】
ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＬＮＡヌクレオチドは、通例、２つのヌクレオシドをまとめて共有結合するホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）及び／又はホスホロチエート（Ｐ＝Ｓ）ヌクレオチド間結合により結合される。
【0024】
したがって、いくつかのオリゴヌクレオチドでは、すべてのヌクレオチド間結合がホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）からなっていてもよく、他のオリゴヌクレオチドでは、すべてのヌクレオチド間結合がホスホロチエート（Ｐ＝Ｓ）からなっていてもよく、又はさらに他のオリゴヌクレオチドでは、ヌクレオチド間結合の配列が異なっており、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）とホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）の両方を含む。
【0025】
ＰＮＡは、古典的な核酸塩基部分から構成されるが、ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）又はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）ヌクレオチド間結合の代わりに、ペプチド結合によって結合された反復Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位を含むペプチド核酸を表す。
【0026】
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵで示すことができ、ここで各文字は、場合によっては、同等の機能の修飾核酸塩基を含みうる。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、ＬＮＡヌクレオシドについては大文字のＡ、Ｔ、Ｇ及びＭｅＣ（５－メチルシトシン）で、ＤＮＡヌクレオシドについては小文字のａ、ｔ、ｇ、ｃ及びＭｅｃで記載される。修飾された核酸塩基としては、保護基を有する核酸塩基、例えば、ｔ－ブチルフェノキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル、アセチル、ｉ－ブチリル又はジメチルホルムアミジノ（Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔ－Ｓｙｎｔｈｅｓｅ，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｅ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔ－Ｓｙｎｔｈｅｓｅ ｏｆ Ｍａｒｃｈ ２４，２０１６参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0027】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよいＤＮＡ又はＬＮＡヌクレオシドモノマー又はそれらの組み合わせからなり、１０～２５ヌクレオチド長である。
【0028】
オリゴヌクレオチド合成の原理は、当技術分野において周知であり、文献に十分に記載されており、Ｗｉｋｉｐｅｄｉａなどに公開されている（例えばＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｗｉｋｉｐｅｄｉａ，ｔｈｅ ｆｒｅｅ ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ；ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＿ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｏｆ Ｍａｒｃｈ １５，２０１６参照）。
【0029】
今日では大規模オリゴヌクレオチド合成は、コンピューター制御シンセサイザーを使用して自動的に実行される。
【0030】
通例、オリゴヌクレオチド合成は固相合成であり、ここで、組み立てられるオリゴヌクレオチドは、その３’末端ヒドロキシ基を介して固体支持体材料に共有結合し、鎖組み立ての全過程にわたってそこに結合したままである。適切な支持体は、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＰｒｉｍｅｒ支持体５Ｇ又はＫｉｎｏｖａｔｅのＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ支持体のような市販のマクロ多孔質ポリスチレン支持体である。
【0031】
オリゴヌクレオチド合成は、原則として、所望の配列が組み立てられるまで、伸長中の鎖の５’末端にヌクレオチド残基を段階的に付加することである。
【0032】
通例、各付加は合成サイクルと呼ばれ、原則として以下の化学反応からなる：
ａ１）固体支持体上の保護されたヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ２）第１のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして固体支持体上の遊離ヒドロキシル基とカップリングさせること、
ａ３）それぞれのＰ結合ヌクレオシドを酸化又は硫化して、それぞれのホスホトリエステル（Ｐ＝Ｏ）又はそれぞれのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成すること、
ａ４）任意選択的に、固体支持体上のいずれかの未反応ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ５）固体支持体に結合した第１のヌクレオシドの５’ヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ６）第２のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとしてカップリングして、それぞれのＰ結合二量体を形成すること、
ａ７）それぞれのＰ結合ジヌクレオチドを酸化又は硫化して、それぞれのホスホトリエステル（Ｐ＝Ｏ）又はそれぞれのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成すること、
ａ８）任意選択的に、いずれかの未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ９）所望の配列が組み立てられるまで、前述のステップａ５～ａ８を繰り返すこと。
ａ１）固体支持体上の保護されたヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ２）第１のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとして固体支持体上の遊離ヒドロキシル基とカップリングさせること、
ａ３）それぞれのＰ結合ヌクレオシドを酸化又は硫化して、それぞれのホスホトリエステル（Ｐ＝Ｏ）又はそれぞれのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成すること、
ａ４）任意選択的に、固体支持体上のいずれかの未反応ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ５）固体支持体に結合した第１のヌクレオシドの５’ヒドロキシル基を脱ブロックすること、
ａ６）第２のヌクレオシドを活性化ホスホラミダイトとしてカップリングして、それぞれのＰ結合二量体を形成すること、
ａ７）それぞれのＰ結合ジヌクレオチドを酸化又は硫化して、それぞれのホスホトリエステル（Ｐ＝Ｏ）又はそれぞれのホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を形成すること、
ａ８）任意選択的に、いずれかの未反応の５’ヒドロキシル基をキャッピングすること、
ａ９）所望の配列が組み立てられるまで、前述のステップａ５～ａ８を繰り返すこと。
【0033】
本発明の文脈において「放射標識」という用語は、残基Ｑ＊、特に放射標識されたＣ１－６－アルキル基を表す置換基Ｚ＊、好ましくは放射標識されたＣ１－４－アルキル基、より好ましくは放射標識されたメチル又はエチル基、それよりもさらに好ましくは放射標識されたメチル基について使用される。
【0034】
したがって、これら基の適切な放射標識は、天然の水素又は炭素原子の、その対応する放射性同位体１４Ｃ又は３Ｈによる置き換えを意味するが、好ましくは水素原子の３Ｈによる置き換えを意味する。
【0035】
「受容体標的化部分」という用語は、オリゴヌクレオチドに追加の機能性を加える部分を表す。
【0036】
このような部分は、オリゴヌクレオチドの機能性を強化する能力を有するいずれかのタンパク質受容体標的部分から選択することができる。それらには、限定されないが、アプタマーのような特定の分子を標的とする抗体又は機能性ペプチド若しくはオリゴヌクレオチド、又は体組織若しくは体液へのオリゴヌクレオチドの送達を強化する能力を有する非ヌクレオチドタンパク質受容体標的部分が含まれる。
【0037】
好ましい実施形態では、受容体標的化部分は、アシアロ糖タンパク質（ａｓｉａｌｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体標的化部分、より好ましくはＧａｌＮＡｃ部分である。
ＧａｌＮＡｃ部分は、式ＶＩＩ
［式中、Ｒ３は水素又はヒドロキシ保護基であり、ｎは０～１０の整数、好ましくは０～５の整数、より好ましくは１～３の整数であるが、最も好ましくは２である］、その対応する塩、エナンチオマー及び／又は立体異性体を有する。
ＧａｌＮＡｃ部分は、式ＶＩＩ
【0038】
適切なヒドロキシ保護基は、アシル、特にＣ１－１２－アルキルカルボニル基、より詳細にはＣ１－６－アルキル又はフェニルによって置換されていてもよいＣ１－６－アルキルカルボニル基である。より好ましいのは、アセチル、ピバロイル又はベンゾイルであり、アセチルが最も好ましいヒドロキシ保護基である。
【0039】
好ましい実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、式ＶＩＩ［式中、Ｒ３は水素であり、ｎは２である］を有する。
【0040】
ＧａｌＮＡｃ部分は、ペプチド結合－ＣＯ－ＮＨ－を介してリンカー２と接続する。
【0041】
ＧａｌＮＡｃクラスター化合物は、国際公開第２０１７０２１３８５号に従って調製することができる。
【0042】
好ましい実施形態では、Ｑ＊は、式ＩＩＩ
［式中、
ｎは、１又は２の整数であり、より好ましくは１であり、
Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１－２－アルキル、好ましくはメチルであるか、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合する炭素原子と一緒にシクロプロピル環を形成する］
の残基を表す。
ｎは、１又は２の整数であり、より好ましくは１であり、
Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、Ｃ１－２－アルキル、好ましくはメチルであるか、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合する炭素原子と一緒にシクロプロピル環を形成する］
の残基を表す。
【0043】
さらに好ましい実施形態では、ｎは１であり、
Ｒ１及びＲ２は水素であるか、又は
Ｒ１がメチルであり、且つＲ２が水素であるか、又は
Ｒ１及びＲ２は、一緒に、シクロプロピル環を形成する。
Ｒ１及びＲ２は水素であるか、又は
Ｒ１がメチルであり、且つＲ２が水素であるか、又は
Ｒ１及びＲ２は、一緒に、シクロプロピル環を形成する。
【0044】
Ｚ＊は、放射標識されたＣ１－４－アルキル基、より好ましくは放射標識されたメチル又はエチル基、それよりもさらに好ましくは放射標識されたメチル基である。
【0045】
一実施形態では、Ｘ１はＯであり、Ｘ２はＳである。別の実施形態では、Ｘ１はＳであり、Ｘ２はＯであり、また別の実施形態では、Ｘ１及びＸ２の両方がＯ又はＳである。
【0046】
リンカー１は、上記に要約したように、Ｃ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式
（式中、ｍは、１～６の整数である）のグリセロールベースの架橋である。
【0047】
リンカー１は、より好ましくは、Ｃ４－８－アルキレン架橋、それよりもさらに好ましくはＣ６－アルキレン架橋である。
【0048】
リンカー２は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ２－１２－アルキレン架橋、又は１～１０のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
リンカー２は、より好ましくはアミノＣ４－８－アルキレン架橋、それよりもさらに好ましくはアミノ－Ｃ６－アルキレン架橋である。
別の実施形態では、放射標識されたオリゴヌクレオチドは、式Ｉｂ
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ２、ｎ、Ｚ＊及びリンカー１は上記の通りであり、上記に要約した好ましい選択肢が同様に適用される］を有する。
リンカー２は、より好ましくはアミノＣ４－８－アルキレン架橋、それよりもさらに好ましくはアミノ－Ｃ６－アルキレン架橋である。
別の実施形態では、放射標識されたオリゴヌクレオチドは、式Ｉｂ
【0049】
好ましい実施形態では、Ｘ２はＳである。
【0050】
別の実施形態では、放射標識されたオリゴヌクレオチドは、式Ｉｃ
［式中、Ｒ１及びＲ２、Ｘ１及びＸ２、ｎ、Ｚ＊、リンカー１並びにリンカー２は上記の通りであり、上記に要約した好ましい選択肢が同様に適用される］を有する。
【0051】
最も好ましい実施形態は、式Ｉｂ及びＩｃの放射標識されたオリゴヌクレオチドである。
【0052】
式Ｉｂ及びＩｃの放射標識されたオリゴヌクレオチドは、以下の化合物によって説明することができる。
５’－ＧＮ２－Ｃ６－ｃａＧ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ
Ｇ＊Ｃ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｇ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ
５’－ＭＯＥＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ
ここで、Ｃ６ＳＨはＣ６（へキシレン）チオールリンカーを意味し；ＭＯＥＭは３Ｈ標識Ｎ－メトキシエチレンマレイミドであり；＊はホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）架橋を表し；Ａ，Ｃ，Ｇ，ＴはＬＮＡヌクレオシドモノマーであり、ａ，ｔ，ｃ，ｇはＤＮＡヌクレオシドモノマーである。
５’－ＧＮ２－Ｃ６－ｃａＧ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ
Ｇ＊Ｃ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｇ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ
５’－ＭＯＥＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ
ここで、Ｃ６ＳＨはＣ６（へキシレン）チオールリンカーを意味し；ＭＯＥＭは３Ｈ標識Ｎ－メトキシエチレンマレイミドであり；＊はホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅ）架橋を表し；Ａ，Ｃ，Ｇ，ＴはＬＮＡヌクレオシドモノマーであり、ａ，ｔ，ｃ，ｇはＤＮＡヌクレオシドモノマーである。
【0053】
本明細書に開示される化合物は、以下の核酸塩基配列を有する。
配列番号１：ｃａｇａｇｔｔａｃｔｔｇｃｃａａｃｔ
配列番号２：ｇｃａｔｔｇｇｔａｔｔｃａ
配列番号３：ｇａｇｔｔａｃｔｔｇｃｃａａｃｔ
配列番号４：ｔｔａｃａｃｔｔａａｔｔａｔａｃｔｔｃｃ
配列番号１：ｃａｇａｇｔｔａｃｔｔｇｃｃａａｃｔ
配列番号２：ｇｃａｔｔｇｇｔａｔｔｃａ
配列番号３：ｇａｇｔｔａｃｔｔｇｃｃａａｃｔ
配列番号４：ｔｔａｃａｃｔｔａａｔｔａｔａｃｔｔｃｃ
【0054】
本発明の放射標識されたオリゴヌクレオチドは、０．０３７ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～３．７ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、好ましくは０．１１１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（３Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～１．８５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、より好ましくは０．１８５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～０．９２５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の比活性を有する。
【0055】
本発明はまた、式Ｉの放射標識されたオリゴヌクレオチドの調製のための方法を含み、この方法は、式Ｖ
［式中、
ｎは、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ２は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー１は、Ｃ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
（式中、ｍは、１～６の整数である）のグリセロールベースの架橋であり；
リンカー２は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチド、特にアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分、好ましくはＧａｌＮＡｃ部分に追加の機能性を加える非ヌクレオチド部分である］
のチオールの、式ＶＩ
（式中、Ｒ１及びＲ２、ｎ並びにＺ＊は、上記の通りである）の放射標識されたマレインイミド化合物とのコンジュゲーションを含む。
ｎは、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ２は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー１は、Ｃ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
リンカー２は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチド、特にアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分、好ましくはＧａｌＮＡｃ部分に追加の機能性を加える非ヌクレオチド部分である］
のチオールの、式ＶＩ
【0056】
コンジュゲーション反応は、有機塩基及び有機溶媒の存在下で又は水性緩衝系中で、０℃～５０℃の反応温度で実施することができる。
【0057】
適切な有機塩基は、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ヒューニッヒ塩基）といった三級アミンである。
【0058】
適切な水性緩衝液は、例えば、６～９のｐＨ範囲を有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）である。
【0059】
適切な溶媒は、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド又はジメチルスルホキシドといった極性非プロトン溶媒である。
【0060】
結果として得られた放射標識されたオリゴヌクレオチドを含む反応混合物は、溶媒から取り除くことができ、さらなる精製のために粗生成物を適切な緩衝水溶液に溶解させることができる。
【0061】
精製は、本質的に、当業者に周知の、段階的なクロマトグラフィー、濃縮及び単離適用技術を含む。
【0062】
クロマトグラフィーは、水性及び有機溶媒を移動相として使用するＣ－１８逆相カラムを典型的に用いる分取ＨＰＬＣである。
【0063】
クロマトグラフィーから得られる画分の濃縮は、タンジェント流濾過、特に適切な膜でのダイアフィルトレーションを介して行うことができる。
【0064】
最後に、溶出剤からの放射標識されたオリゴヌクレオチドの単離を、典型的には凍結乾燥により行うことができるか、又は溶液中において貯蔵することができる。
【0065】
式ＶＩの放射標識されたマレインイミド化合物の合成は、以下に概要を示す反応スキームに従って行うことができる。
Ｒ１及びＲ２、ｎ並びにＺ＊は上記の通りであり、Ｙ１及びＹ２は、互いに独立して、水素又はＣ１－６アルキルである。上記に概要を示す設定が同様に適用される。
【0066】
マレイミド誘導体の合成のための複数の方法が、文献（Ｎ． Ｂ． Ｍｅｔｈａ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． １９６０：２５１０１２）に報告されている。上記スキームに示される共通の手順には、置換されたアミン及び無水マレイン酸の濃縮と、それに続くマレアミド酸中間体の脱水が含まれる。
【0067】
本発明は、組織又は体液中のオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態の決定のための放射標識されたオリゴヌクレオチドの使用をさらに含む。加えて、トリチウム標識オリゴヌクレオチドは、定量全身オートラジオグラフィー（ＱＷＢＡ）、標的結合、及びトランスポーターの排出と取り込みの研究を含む生物科学に適用することができる。
【0068】
本発明はまた、組織又は体液中のオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態の決定のための方法を含み、この方法は、
ａ）有効量の放射標識されたオリゴヌクレオチドを、試験対象である組織又は体液に投与すること、及び
ｂ）組織又は体液中の放射標識されたオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態を測定すること、並びに任意選択的に
ｃ）試験対象である組織又は体液中の放射標識されたオリゴヌクレオチドを、オートラジオグラフィーによってイメージ化すること
を含む。
ａ）有効量の放射標識されたオリゴヌクレオチドを、試験対象である組織又は体液に投与すること、及び
ｂ）組織又は体液中の放射標識されたオリゴヌクレオチドの体内分布及び薬物動態を測定すること、並びに任意選択的に
ｃ）試験対象である組織又は体液中の放射標識されたオリゴヌクレオチドを、オートラジオグラフィーによってイメージ化すること
を含む。
【0069】
本発明は、式Ｘ
［式中、
ｎは、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ２は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー１は、Ｃ２－１２－アルキレン架橋、１～９のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
（式中、ｍは、１～６の整数である）のグリセロールベースの架橋であり；
リンカー２は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ２－１２－アルキレン架橋、１～９のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
Ｑは、式ＩＩＩａ
（式中、
ｎは１～４の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、ＣＦ３、Ｃ１－６アルキルであるか、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合する炭素原子と一緒にＣ３－５－シクロアルカン環を形成し；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ６アルキル基である）
の残基を表し；且つ
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチドに追加の機能性を加える部分である］
のオリゴヌクレオチドをさらに含む。
ｎは、０又は１であり；
Ｘ１及びＸ２は、互いに独立して、Ｓ又はＯであり；
リンカー１は、Ｃ２－１２－アルキレン架橋、１～９のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式ＩＩ
リンカー２は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ２－１２－アルキレン架橋、１～９のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
Ｑは、式ＩＩＩａ
ｎは１～４の整数であり、
Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素、ＣＦ３、Ｃ１－６アルキルであるか、又はＲ１及びＲ２は、それらが結合する炭素原子と一緒にＣ３－５－シクロアルカン環を形成し；
Ｚは、Ｃ１－Ｃ６アルキル基である）
の残基を表し；且つ
受容体標的化部分は、オリゴヌクレオチドに追加の機能性を加える部分である］
のオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【0070】
式Ｉの放射標識されたオリゴヌクレオチドについて記載される好ましい実施形態が、式Ｘの非放射標識されたオリゴヌクレオチドに同様に適用される。
【0071】
したがって、Ｑは、式ＩＩＩａ
［式中、
ｎは、１又は２の整数であり、より好ましくは１であり，
Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素又はＣ１－６アルキルであり、より好ましくは水素であり；
Ｚは、Ｃ１－４－アルキル基、より好ましくはメチル又はエチル、それよりもさらに好ましくはメチルである］
の残基を表す。
ｎは、１又は２の整数であり、より好ましくは１であり，
Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素又はＣ１－６アルキルであり、より好ましくは水素であり；
Ｚは、Ｃ１－４－アルキル基、より好ましくはメチル又はエチル、それよりもさらに好ましくはメチルである］
の残基を表す。
【0072】
一実施形態では、Ｘ１はＯであり、Ｘ２はＳである。別の実施形態では、Ｘ１はＳであり、Ｘ２はＯであり、また別の実施形態では、Ｘ１及びＸ２の両方がＯ又はＳである。
【0073】
リンカー１は、上記に要約したように、Ｃ２－１２－アルキレン架橋、１～１０のエチレングリコール単位を含むエチレングリコール架橋、又は式
［式中、ｍは１～６の整数である］ のグリセロールベースの架橋である。
【0074】
リンカー１は、より好ましくはＣ２－８－アルキレン架橋であり、それよりもさらに好ましくはＣ６－アルキレン架橋である。
【0075】
リンカー２は、任意選択的に、アミノ基保護アミノＣ２－１２－アルキレン架橋、又は１～１０のエチレングリコール単位を含むアミノエチレングリコール架橋であり；
リンカー２は、より好ましくはアミノＣ２－８－アルキレン架橋、それよりもさらに好ましくはアミノ－Ｃ６－アルキレン架橋である。
リンカー２は、より好ましくはアミノＣ２－８－アルキレン架橋、それよりもさらに好ましくはアミノ－Ｃ６－アルキレン架橋である。
【0076】
別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式Ｉｂ’
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ２、ｎ、Ｚ及びリンカー１は上記の通りであり、上記に要約した好ましい選択肢が同様に適用される］ を有する。
【0077】
好ましい実施形態では、Ｘ２はＳである。
【0078】
別の実施形態では、放射標識されたオリゴヌクレオチドは、式Ｉｃ’
［式中、Ｒ１及びＲ２、Ｘ１及びＸ２、ｎ、Ｚ、リンカー１並びにリンカー２は上記の通りであり、上記に要約した好ましい選択肢が同様に適用される］
を有する。
を有する。
【実施例】
【0079】
略語：
【0080】
一般的な方法
出発物質として使用されるすべてのオリゴヌクレオチドは、Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａの研究及び早期開発から合成された。トリチウム標識［３Ｈ］ノシル酸メチル（トリトリチオメチル ４－ニトロベンゼンスルホネート；モル活性：３ＴＢｑ／ｍｍｏｌ＝８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）が、トルエン中溶液としてＲＣ Ｔｒｉｔｅｃ（Ｔｅｕｆｅｎ，ＣＨ）から得られた。ＰＢＳバッファーは、１倍（１ｘ）及び１０倍（１０ｘ）の濃度でＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。他のすべての試薬及び溶媒は、標準的な市販源から得られ、それ以上精製することなく使用した。トリチウム化合物の液体シンチレーション計数は、ＨＩＤＥＸ ３００ ＳＬ及びＵＬＴＩＭＡＴＥ ＧＯＬＤカクテル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して遂行された。マレイミド誘導体の合成に関する分析は、ＨＰＬＣ Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、４０℃３．５μｍカラムにより波長２２０ｎｍで、溶出液［Ａ］＝水＋５％ ＭｅＣＮ＋０．０５％ ＴＦＡ及び［Ｂ］＝ＭｅＣＮ＋０．０５％ ＴＦＡにより、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで、溶出液の勾配を：１０ｍｉｎで０％［Ｂ］～５０％［Ｂ］、１２分後に８０％として実行した。オリゴ１－４を、ＵＰＬＣ Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０により波長２６０ｎｍで、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、８０℃の１．７μｍカラム（［Ａ］＝水／メタノール／ヘキサフルオロｉ－プロパノール／ＴＥＡ：９５０／２５／２１／２．３ｍＬ；［Ｂ］＝水／メタノール／ヘキサフルオロｉ－プロパノール／ＴＥＡ：１７５／８００／２１／２．３ｍＬ）により、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで、溶出液の勾配を：１３ｍｉｎで１０％［Ｂ］～２５％［Ｂ］として決定した。大規模精製を、ＴＥＬＥＤＹＮＥ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）Ｉｓｃｏ ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）の順相Ｓｉｌｉｃａ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎｓ（４ｇ）を使用して実施した。溶媒［Ａ］はヘプタンであり、溶媒［Ｂ］はメチルｔ－ブチルエーテルであった。カラムは、流速１８ｍＬ／ｍｉｎを使用して最初に２０％［Ｂ］で均衡させ、吸収度２１４ｎｍでモニタリングした。溶出勾配は、４分間の２０％［Ｂ］の均一濃度条件、続いて１４分で１００％［Ｂ］までの直線勾配、最後に５分間の１００％［Ｂ］の均一濃度条件からなっていた。質量分析は、Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｌｅ（ＳＱ）及びＥＳＩ Ｍａｓｓ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－ｃｌａｓｓ Ｓｙｓｔｅｍにより実施した。放射化学的純度は、固体シンチレーターを内蔵するβ－放射能ＨＰＬＣ検出器ＲＡＭＯＮＡ Ｑｕａｔｔｒｏ（Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。ＭＯＥＭ＊の分取ＨＰＬＣは、Ｇｉｌｓｏｎ ＰＬＣ ２０２０ ｗｉｔｈ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム、５μｍ、１０ｍｍ×２５０ｍｍにより、水＋５％ ＭｅＣＮ＋０．０５％ ＴＦＡを移動相［Ａ］として、及びＭｅＣＮ＋０．０５％ ＴＦＡを移動相［Ｂ］として使用し、勾配を１８ｍｉｎで０％［Ｂ］～７０％［Ｂ］として実施した。１Ｈ ＮＭＲ測定は、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ６００ＭＨｚ分光計で実行した。使用した重水素溶媒は、生成物の溶解度に依存しており、各事例で詳述されている。ケミカルシフトはｐｐｍで示し、シングレットにはｓを、ダブレットにはｄを、ダブルダブレットにはｄｄを、マルチプレットにはｍを、間接双極子－双極子相互作用にはＪを付した。濃度は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＳｐｒｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ｂａｓｉｃにより波長２６０ｎｍで決定し、対応するモル吸光係数を計算した。
出発物質として使用されるすべてのオリゴヌクレオチドは、Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａの研究及び早期開発から合成された。トリチウム標識［３Ｈ］ノシル酸メチル（トリトリチオメチル ４－ニトロベンゼンスルホネート；モル活性：３ＴＢｑ／ｍｍｏｌ＝８０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）が、トルエン中溶液としてＲＣ Ｔｒｉｔｅｃ（Ｔｅｕｆｅｎ，ＣＨ）から得られた。ＰＢＳバッファーは、１倍（１ｘ）及び１０倍（１０ｘ）の濃度でＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）から購入した。他のすべての試薬及び溶媒は、標準的な市販源から得られ、それ以上精製することなく使用した。トリチウム化合物の液体シンチレーション計数は、ＨＩＤＥＸ ３００ ＳＬ及びＵＬＴＩＭＡＴＥ ＧＯＬＤカクテル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して遂行された。マレイミド誘導体の合成に関する分析は、ＨＰＬＣ Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８、４．６×１５０ｍｍ、４０℃３．５μｍカラムにより波長２２０ｎｍで、溶出液［Ａ］＝水＋５％ ＭｅＣＮ＋０．０５％ ＴＦＡ及び［Ｂ］＝ＭｅＣＮ＋０．０５％ ＴＦＡにより、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで、溶出液の勾配を：１０ｍｉｎで０％［Ｂ］～５０％［Ｂ］、１２分後に８０％として実行した。オリゴ１－４を、ＵＰＬＣ Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０により波長２６０ｎｍで、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８、２．１×５０ｍｍ、８０℃の１．７μｍカラム（［Ａ］＝水／メタノール／ヘキサフルオロｉ－プロパノール／ＴＥＡ：９５０／２５／２１／２．３ｍＬ；［Ｂ］＝水／メタノール／ヘキサフルオロｉ－プロパノール／ＴＥＡ：１７５／８００／２１／２．３ｍＬ）により、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで、溶出液の勾配を：１３ｍｉｎで１０％［Ｂ］～２５％［Ｂ］として決定した。大規模精製を、ＴＥＬＥＤＹＮＥ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，ＵＳＡ）Ｉｓｃｏ ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈにより、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）の順相Ｓｉｌｉｃａ Ｆｌａｓｈ Ｃｏｌｕｍｎｓ（４ｇ）を使用して実施した。溶媒［Ａ］はヘプタンであり、溶媒［Ｂ］はメチルｔ－ブチルエーテルであった。カラムは、流速１８ｍＬ／ｍｉｎを使用して最初に２０％［Ｂ］で均衡させ、吸収度２１４ｎｍでモニタリングした。溶出勾配は、４分間の２０％［Ｂ］の均一濃度条件、続いて１４分で１００％［Ｂ］までの直線勾配、最後に５分間の１００％［Ｂ］の均一濃度条件からなっていた。質量分析は、Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｌｅ（ＳＱ）及びＥＳＩ Ｍａｓｓ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを備えるＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－ｃｌａｓｓ Ｓｙｓｔｅｍにより実施した。放射化学的純度は、固体シンチレーターを内蔵するβ－放射能ＨＰＬＣ検出器ＲＡＭＯＮＡ Ｑｕａｔｔｒｏ（Ｒａｙｔｅｓｔ，Ｓｔｒａｕｂｅｎｈａｒｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。ＭＯＥＭ＊の分取ＨＰＬＣは、Ｇｉｌｓｏｎ ＰＬＣ ２０２０ ｗｉｔｈ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム、５μｍ、１０ｍｍ×２５０ｍｍにより、水＋５％ ＭｅＣＮ＋０．０５％ ＴＦＡを移動相［Ａ］として、及びＭｅＣＮ＋０．０５％ ＴＦＡを移動相［Ｂ］として使用し、勾配を１８ｍｉｎで０％［Ｂ］～７０％［Ｂ］として実施した。１Ｈ ＮＭＲ測定は、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ６００ＭＨｚ分光計で実行した。使用した重水素溶媒は、生成物の溶解度に依存しており、各事例で詳述されている。ケミカルシフトはｐｐｍで示し、シングレットにはｓを、ダブレットにはｄを、ダブルダブレットにはｄｄを、マルチプレットにはｍを、間接双極子－双極子相互作用にはＪを付した。濃度は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢｉｏＳｐｒｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（登録商標）ｂａｓｉｃにより波長２６０ｎｍで決定し、対応するモル吸光係数を計算した。
【0081】
実施例１
［３Ｈ－メチル］Ｎ－メトキシエチレンマレイミド（ＭＯＥＭ＊）の合成
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１及びＲ２＝Ｈである）
スキーム：
［３Ｈ－メチル］Ｎ－メトキシエチレンマレイミド（ＭＯＥＭ＊）の合成
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１及びＲ２＝Ｈである）
スキーム：
【0082】
ａ）エキソ－４－（２－ヒドロキシエチル）－１，７－ジメチル－１０－オキサ－４－アザ－三環［５．２．１．０２，６］デカ－８－エン－３，５－ジオン（Ｍ３）の合成
市販のＮ－（２－ヒドロキシエチル）マレイミドＭ１（２００ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２．０ｍＬ）中溶液に対し、ｒｔで２，５－ジメチルフランＭ２（７２２ｍｇ、８０２μＬ、７．５１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、密閉したガラス管中で６５℃で２０時間撹拌した。真空中での溶媒の除去及びＨＶでの乾燥により、粗Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ付加物Ｍ３が、４：１の比のエキソ／エンド混合物として明黄色のオイルとして得られた。エンド／エキソ混合物をＩｓｃｏフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、高純度のエキソ誘導体を分離した。収率（エキソ）：１８５ｍｇ（５５％）。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝２３８．１［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ ６．３６（ｓ，２Ｈ）、４．６９（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、３．４１（ｓ，４Ｈ）、２．８８（ｓ，２Ｈ）、１．５３（ｓ，６Ｈ）．
【0083】
ｂ）［３Ｈ－メトキシ］－エキソ－４－（２－メトキシエチル）－１，７－ジメチル－１０－オキサ－４－アザ－三環［５．２．１．０２，６］デカ－８－エン－３，５－ジオン（Ｍ５＊）の合成
トルエン中溶液としての１．６７ＧＢｑ（４５ｍＣｉ）の［３Ｈ］‐ノシル酸メチルＭ４＊（１２５μｇ、０．５６１μｍｏｌ）を、冷たい（非放射性）メチル ４－ニトロベンゼンスルホネートＭ４（１２２μｇ、０．５６１μｍｏｌ）で１：１の比に希釈し、概ね４０Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性を達成した。溶液を、エバポレートし、シールド管に移し、アルゴン流下で濃縮乾固した。固体残基（Ｍ４＊＋Ｍ４）に対し、ｒｔでＤｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒ付加物Ｍ３（６６６μｇ、２．８１μｍｏｌ）の８０μＬのトルエン中溶液を加え、続いて２Ｍのナトリウムｔ－ブトキシドのＴＨＦ中溶液（１．７μＬ、３．３７μｍｏｌ）を加えた。混合物をシールド管中でｒｔで２．５時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、放射化学的純度５０％の所望の中間生成物Ｍ５＊が示された。反応混合物を、ＤＣＭ（１ｍＬ）で希釈し、ＳＣＸ－２／ＳＡＸカートリッジ（Ｓｉｌｙｃｙｃｌｅ、５００ｍｇ、ＤＣＭで事前調節）を通した濾過により直接精製し、塩基性及び酸性化合物を除去した。カートリッジをＤＣＭ（５ｍＬ）で洗浄し、その結果得られた溶液をエバポレーションにより容積１００μＬまで濃縮し、放射標識された中間体Ｍ５＊を得た。
Ｍ５＊の粗溶液を、それ以上精製することなく次工程のために使用した。
Ｍ５＊の粗溶液を、それ以上精製することなく次工程のために使用した。
【0084】
ｃ）［３Ｈ－メチル］Ｎ－メトキシエチレンマレイミド（ＭＯＥＭ＊）の合成
得られたＭ５＊の粗溶液を、シールド管に移し、トルエン（７０μＬ）で希釈し、９０℃で２時間加熱した。
ＨＰＬＣ分析により、脱保護された生成物ＭＯＥＭ＊への完全な変換及び残りの未反応［３Ｈ］ノシル酸メチルＭ４＊が示された。反応混合物をｒｔに冷まし、溶媒をアルゴン流下で濃縮乾固した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物［３Ｈ－メチル］メトキシエチレンマレイミド（ＭＯＥＭ＊）を溶出剤混合物中溶液として得た。溶出剤混合物中にＭＯＥＭ＊を含む対応する分取ＨＰＬＣの画分を、オリゴ１、２、３及び４とのコンジュゲーションのために直接使用した。放射線収率：２５３．５ＭＢｑ（６．８５ｍＣｉ）＝１５．２％。放射線濃度：３４．８ＭＢｑ／ｍＬ（０．９４ｍＣｉ／ｍＬ）、放射化学的純度：９９％。比活性は、低イオン化に起因してＭＳにより決定することができなかった。比活性は、４０Ｃｉ／ｍｍｏｌと推定された。
ＨＰＬＣ分析により、脱保護された生成物ＭＯＥＭ＊への完全な変換及び残りの未反応［３Ｈ］ノシル酸メチルＭ４＊が示された。反応混合物をｒｔに冷まし、溶媒をアルゴン流下で濃縮乾固した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物［３Ｈ－メチル］メトキシエチレンマレイミド（ＭＯＥＭ＊）を溶出剤混合物中溶液として得た。溶出剤混合物中にＭＯＥＭ＊を含む対応する分取ＨＰＬＣの画分を、オリゴ１、２、３及び４とのコンジュゲーションのために直接使用した。放射線収率：２５３．５ＭＢｑ（６．８５ｍＣｉ）＝１５．２％。放射線濃度：３４．８ＭＢｑ／ｍＬ（０．９４ｍＣｉ／ｍＬ）、放射化学的純度：９９％。比活性は、低イオン化に起因してＭＳにより決定することができなかった。比活性は、４０Ｃｉ／ｍｍｏｌと推定された。
【0085】
実施例２（非放射性コンジュゲーション）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１及びＲ２＝Ｈである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
５’－ＧＮ２－Ｃ６－ｃａＧ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：７７０９．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ１）
Ｇ＊Ｃ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｇ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：４５３７．６ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ２）
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１及びＲ２＝Ｈである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
５’－ＧＮ２－Ｃ６－ｃａＧ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：７７０９．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ１）
Ｇ＊Ｃ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｇ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：４５３７．６ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ２）
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
【0086】
一般的な手順：
５’又は３’末端スルフヒドリルリンカーを有する１当量のオリゴヌクレオチドをＰＢＳ（容積因子：２５０ｍＬ／ｇ）に溶解した。ＴＨＦ（容積因子：２００ｍＬ／ｇ）に溶解した１．３当量の市販のメトキシエチレンマレイミド（ＭＯＥＭ）を水溶液に加え、室温で１時間撹拌した。ＵＰＬＣ分析により、オリゴヌクレオチドへのマレイミドの完全な付加が示された。バッファーを水へと交換するために、反応混合物をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｒｏ精製システム（ＭＷＣＯ：３．０００Ｄａ）に移し、４０００ｒｐｍで遠心分離した。ＤＩ水を加え、方法をさらに４回繰り返して交換を完了させた。その結果得られた水溶液を乾燥凍結させて、オリゴヌクレオチドを無色の粉末として、７０％～９５％の範囲の収率及び９０％～９９％の純度で単離した。
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド（オリゴ１～４）がＭＯＥＭとコンジュゲートした。
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド（オリゴ１～４）がＭＯＥＭとコンジュゲートした。
【0087】
ａ）オリゴ１からのコンジュゲート１の合成
５’－ＧＮ２－Ｃ６－ｃａＧ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ；収率：７０％、純度：９０％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：７８５９．４［Ｍ－（Ｈ）］－
ｂ）オリゴ２からのコンジュゲート２の合成
Ｇ＊Ｃ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｇ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ；収率：９３％、純度：９７％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６８９．５［Ｍ－（Ｈ）］－
ｃ）オリゴ３からのコンジュゲート３の合成
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ；収率：８３％、純度：９５％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：５６４２．６［Ｍ－（Ｈ）］－
ｄ）オリゴ４からのコンジュゲート４の合成
５’－ＭＯＥＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率：９２％、純度：９９％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：６８９２．７［Ｍ－（Ｈ）］－
５’－ＧＮ２－Ｃ６－ｃａＧ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ；収率：７０％、純度：９０％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：７８５９．４［Ｍ－（Ｈ）］－
ｂ）オリゴ２からのコンジュゲート２の合成
Ｇ＊Ｃ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｇ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ；収率：９３％、純度：９７％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：４６８９．５［Ｍ－（Ｈ）］－
ｃ）オリゴ３からのコンジュゲート３の合成
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＥＭ；収率：８３％、純度：９５％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：５６４２．６［Ｍ－（Ｈ）］－
ｄ）オリゴ４からのコンジュゲート４の合成
５’－ＭＯＥＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率：９２％、純度：９９％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：６８９２．７［Ｍ－（Ｈ）］－
【0088】
実施例３（放射性コンジュゲーション）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、Ｒ１及びＲ２＝Ｈである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
５’－ＧＮ２－Ｃ６－ｃａＧ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：７７０９．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ１）
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、Ｒ１及びＲ２＝Ｈである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
５’－ＧＮ２－Ｃ６－ｃａＧ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：７７０９．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ１）
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
【0089】
一般的な手順：
５’又は３’末端スルフヒドリルリンカーを有する２当量のオリゴヌクレオチドをＰＢＳ（１０ｘ）（容積因子：２５０ｍＬ／ｇ）に溶解した。放射線濃度３５ＭＢｑ／ｍＬの分取ＨＰＬＣ溶出剤（０．９４ｍＣｉ／ｍＬ）に直接使用した１当量のＭＯＥＭ＊を、オリゴヌクレオチド水溶液に加え、室温で１．５時間撹拌した。ＵＰＬＣ分析により、ＭＯＥＭ＊のオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションが３０％～４５％の範囲で示された。ＴＨＦ（容積因子：７００ｍＬ／ｇ）に溶解した１０当量の冷たい（非放射性）ＭＯＥＭを加え、ｒｔで１時間撹拌した。ＵＰＬＣにより、完全なコンジュゲーションが示された。反応混合物をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｒｏ精製システム（ＭＷＣＯ：３．０００Ｄａ）に移し、４０００ｒｐｍで遠心分離した。ＰＢＳ（１ｘ）を加え、方法を４回繰り返して溶媒交換を完了させ、精製された生成物を得た。その結果得られた緩衝液の濃度及び活性を決定した。放射化学的収率は６９％～７２％の範囲に計算され、特定のモル活性は０．６１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１６．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～０．７４ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（２０．１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に到達することができた。放射化学的純度は９６．０％～９８．４％の範囲であった。
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド、オリゴ１、３及び４がコンジュゲートした。
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド、オリゴ１、３及び４がコンジュゲートした。
【0090】
ａ）オリゴ１からのコンジュゲート１＊［３Ｈ］－の合成
５’－ＧＮ２－Ｃ６－ｃａＧ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－［３Ｈ］－ＭＯＥＭ＊；収率７２％、放射化学的純度：９６．１％、活性：１４．１ＭＢｑ（０．３８ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．７４ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（２０．１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
ｂ）オリゴ３からのコンジュゲート３＊［３Ｈ］－の合成
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－［３Ｈ］－ＭＯＥＭ；収率６９％、放射化学的純度：９６．０％、活性：２８．１ＭＢｑ（０．７６ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．６１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１６．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
ｃ）オリゴ４からのコンジュゲート４＊［３Ｈ］－の合成
５’－［３Ｈ］－ＭＯＥＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率７２％、放射化学的純度：９８．４％、活性：２９．２ＭＢｑ（０．７９ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．６８ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１８．３Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
５’－ＧＮ２－Ｃ６－ｃａＧ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－［３Ｈ］－ＭＯＥＭ＊；収率７２％、放射化学的純度：９６．１％、活性：１４．１ＭＢｑ（０．３８ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．７４ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（２０．１Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
ｂ）オリゴ３からのコンジュゲート３＊［３Ｈ］－の合成
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－［３Ｈ］－ＭＯＥＭ；収率６９％、放射化学的純度：９６．０％、活性：２８．１ＭＢｑ（０．７６ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．６１ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１６．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
ｃ）オリゴ４からのコンジュゲート４＊［３Ｈ］－の合成
５’－［３Ｈ］－ＭＯＥＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率７２％、放射化学的純度：９８．４％、活性：２９．２ＭＢｑ（０．７９ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．６８ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１８．３Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
【0091】
実施例４
［１Ｈ／３Ｈ－メチル］－１－（メトキシメチル）シクロプロピルマレイミド（ＭＯＭＣＰＭ＊）（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、Ｒ１及びＲ２は合せてシクロプロピルである）の合成
一般スキーム：
［１Ｈ／３Ｈ－メチル］－１－（メトキシメチル）シクロプロピルマレイミド（ＭＯＭＣＰＭ＊）（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、Ｒ１及びＲ２は合せてシクロプロピルである）の合成
一般スキーム：
【0092】
ａ）エキソ－２－［１－（ヒドロキシメチル）シクロプロピル］－４，７－ジメチル－３ａ，７ａ－ジヒドロ－４，７－エポキシイソインドール－１，３－ジオン（Ｍ１３）の合成
市販の１－［１－（ヒドロキシメチル）シクロプロピル］マレイミドＭ１１（２０９ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２．０ｍＬ）中溶液に対し、ｒｔで２，５－ジメチルフランＭ２（６４３ｍｇ、７１３μＬ、６．６３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、密閉したガラス管中で６５℃で２２時間撹拌した。真空中での溶媒の除去及びＨＶでの乾燥により、粗Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ付加物Ｍ１３が、４：１の比のエキソ／エンド混合物として明黄色のオイルとして得られた。エンド／エキソ混合物をＩｓｃｏフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、高純度のエキソ誘導体を分離した。収率（エキソ）：２１１ｍｇ（６４％）。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝２６４．１［Ｍ＋Ｈ］＋．１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ ６．３５（ｓ，２Ｈ）、４．７０（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、３．３８（ｓ，２Ｈ）、２．７８（ｓ，２Ｈ）、１．５０（ｓ，６Ｈ）、０．８９－０．９３（ｍ，２Ｈ）、０．６３－０．６７（ｍ，２Ｈ）．
【0093】
ｂ）エキソ－２－［１－（メトキシメチル）シクロプロピル］－４，７－ジメチル－３ａ，７ａ－ジヒドロ－４，７－エポキシイソインドール－１，３－ジオン（Ｍ１５）の合成
シールド管中において、ノシル酸メチルＭ４（５０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）及びＭ１３（７２．７ｍｇ、０．２７６ｍｍｏｌ）をトルエン（２．５ｍＬ）に溶解した。溶液を０℃に冷却した。この温度で、ナトリウムｔ－ブトキシド溶液（ＴＨＦ中２Ｍ、４０３μＬ、８０６μｍｏｌ）をゆっくりと反応溶液に滴下した。色が直ちに無色から暗褐色に変化した。氷浴を除去し、混合物をｒｔで一晩撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、所望の中間生成物Ｍ１５が示された。反応混合物を、ｔ－ブチルメチルエーテル（３０ｍＬ）で希釈し、２Ｍの炭酸ナトリウム（１０ｍＬ）及び飽和塩化ナトリウム溶液（１０ｍＬ）で抽出した。有機相を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、エバポレートして乾燥させ、明黄色の液体を得た。ＨＰＬＣ分析により、所望の中間体Ｍ１５が純度９０％で示された。その粗生成物を、それ以上精製することなく次工程のために使用した。
【0094】
ｂ＊）［３Ｈ－メトキシ］－エキソ－２－［１－（メトキシメチル）シクロプロピル］－４，７－ジメチル－３ａ，７ａ－ジヒドロ－４，７－エポキシイソインドール－１，３－ジオン（Ｍ１５＊）の合成
トルエン中溶液としての０．９３ＧＢｑ（２５ｍＣｉ）の［３Ｈ］‐ノシル酸メチルＭ４＊（７０μｇ、０．３１３μｍｏｌ）を、冷たい（非放射性）メチル ４－ニトロベンゼンスルホネートＭ４（６８μｇ、０．３１３μｍｏｌ）で１：１の比に希釈し、概ね４０Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性を達成した。溶液を、エバポレートし、シールド管に移し、アルゴン流下で濃縮乾固した。固体残基（Ｍ４＊＋Ｍ４）に対し、ｒｔでＤｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒ付加物Ｍ１３（４１１μｇ、１．５６μｍｏｌ）の８０μＬトルエン中溶液を加え、続いてナトリウムｔ－ブトキシド溶液（ＴＨＦ中２Ｍ、１．０μＬ、１．８８μｍｏｌ）を加えた。混合物をシールド管中でｒｔで５．５時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、放射化学的純度６６％の所望の中間生成物Ｍ１５＊が示された。反応混合物を、ＤＣＭ（１ｍＬ）で希釈し、ＳＣＸ－２／ＳＡＸカートリッジ（Ｓｉｌｙｃｙｃｌｅ、５００ｍｇ、ＤＣＭで事前調節）を通した濾過により直接精製し、塩基性及び酸性化合物を除去した。カートリッジをＤＣＭ（５ｍＬ）で洗浄し、その結果得られた溶液をエバポレーションにより容積１００μＬまで濃縮し、放射標識された中間体Ｍ１５＊を得た。
Ｍ１５＊の粗溶液を、それ以上精製することなく次工程のために使用した。
Ｍ１５＊の粗溶液を、それ以上精製することなく次工程のために使用した。
【0095】
ｃ）１－［（１－メトキシメチル）－シクロプロピル］マレイミド（ＭＯＭＣＰＭ）の合成
粗生成物Ｍ１５（３０ｍｇ、１０８μｍｏｌ）を、シールド管に移し、トルエン（４．４ｍＬ）に溶解し、１１０℃で２時間加熱した。ＨＰＬＣ分析により、脱保護された生成物ＭＯＭＣＰＭへの完全な変換が示された。反応混合物をｒｔに冷まし、溶媒をアルゴン流下で濃縮乾固した。残基を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物ＭＯＭＣＰＭを溶出剤混合物中溶液として得た。溶出剤混合物中にＭＯＭＣＰＭを含む対応する分取ＨＰＬＣ画分を、酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、塩化ナトリウム（各３０ｍＬ）で３回抽出した。有機相を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、エバポレートして乾燥させ、１６ｍｇ（収率８２％）を純度９８％で得た。
【0096】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ ｐｐｍ ６．６４（ｓ，２Ｈ）、３．４１（ｓ，２Ｈ）、３．３６（ｓ，３Ｈ）、１．０３－１．０５（ｍ，１Ｈ）、０．９８－１．００（ｍ，２Ｈ）、０．９２－１．０８（ｍ，１Ｈ）
【0097】
ｃ＊）１－［（１－メトキシ－［３Ｈ］－メチル）－シクロプロピル］マレイミド（ＭＯＭＣＰＭ＊）の合成
得られたＭ１５＊の粗溶液を、シールド管に移し、トルエン（１００μＬ）で希釈し、１１０℃で２時間加熱した。
ＨＰＬＣ分析により、脱保護された生成物ＭＯＭＣＯＭ＊への完全な変換及び残りの未反応［３Ｈ］ノシル酸メチルＭ４＊が示された。反応混合物をｒｔに冷まし、溶媒をアルゴン流下で濃縮乾固した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物１－［（１－メトキシ－［３Ｈ］－メチル）－シクロプロピル］マレイミド（ＭＯＭＣＰＭ＊）を溶出剤混合物中溶液として得た。溶出剤混合物中にＭＯＭＣＰＭ＊を含む対応する分取ＨＰＬＣの画分を、オリゴ３及び４とのコンジュゲーションのために直接使用した。放射線収率：１４０．６ＭＢｑ（３．８０ｍＣｉ）＝１５．２％。放射線濃度：３０．３ＭＢｑ／ｍＬ（０．８２ｍＣｉ／ｍＬ）、放射化学的純度：９９％。比活性は、低イオン化に起因してＭＳにより決定することができなかった。比活性は、４０Ｃｉ／ｍｍｏｌと推定された。
ＨＰＬＣ分析により、脱保護された生成物ＭＯＭＣＯＭ＊への完全な変換及び残りの未反応［３Ｈ］ノシル酸メチルＭ４＊が示された。反応混合物をｒｔに冷まし、溶媒をアルゴン流下で濃縮乾固した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物１－［（１－メトキシ－［３Ｈ］－メチル）－シクロプロピル］マレイミド（ＭＯＭＣＰＭ＊）を溶出剤混合物中溶液として得た。溶出剤混合物中にＭＯＭＣＰＭ＊を含む対応する分取ＨＰＬＣの画分を、オリゴ３及び４とのコンジュゲーションのために直接使用した。放射線収率：１４０．６ＭＢｑ（３．８０ｍＣｉ）＝１５．２％。放射線濃度：３０．３ＭＢｑ／ｍＬ（０．８２ｍＣｉ／ｍＬ）、放射化学的純度：９９％。比活性は、低イオン化に起因してＭＳにより決定することができなかった。比活性は、４０Ｃｉ／ｍｍｏｌと推定された。
【0098】
実施例５（非放射性コンジュゲーション）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１及びＲ２はシクロプロピルである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１及びＲ２はシクロプロピルである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
【0099】
一般的な手順：
５’又は３’末端スルフヒドリルリンカーを有する１当量のオリゴヌクレオチドをＰＢＳ（容積因子：２５０ｍＬ／ｇ）に溶解した。ＴＨＦ（容積因子：２００ｍＬ／ｇ）に溶解した１．３当量の１－［１－メトキシメチル）－シクロプロピル］マレイミド（ＭＯＭＣＰＭ）を水溶液に加え、室温で１時間撹拌した。ＵＰＬＣ分析により、オリゴヌクレオチドへのマレイミドの完全な付加が示された。バッファーを水へと交換するために、反応混合物をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｒｏ精製システム（ＭＷＣＯ：３．０００Ｄａ）に移し、４０００ｒｐｍで遠心分離した。ＤＩ水を加え、方法をさらに４回繰り返して交換を完了させた。その結果得られた水溶液を乾燥凍結させて、オリゴヌクレオチドを無色の粉末として、８６％～９５％の範囲の収率及び９５％～９８％の純度で単離した。
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド（オリゴ３、４）はＭＯＭＣＰＭとコンジュゲートした。
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド（オリゴ３、４）はＭＯＭＣＰＭとコンジュゲートした。
【0100】
ａ）オリゴ３からのコンジュゲート１３の合成
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＭＣＰＭ；収率：８５％、純度：９５％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：５６６８．６［Ｍ－（Ｈ）］－
ｂ）オリゴ４からのコンジュゲート１４の合成
５’－ＭＯＭＣＰＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率：９８％、純度：９８％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：６８１８．７［Ｍ－（Ｈ）］－
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＭＣＰＭ；収率：８５％、純度：９５％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：５６６８．６［Ｍ－（Ｈ）］－
ｂ）オリゴ４からのコンジュゲート１４の合成
５’－ＭＯＭＣＰＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率：９８％、純度：９８％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：６８１８．７［Ｍ－（Ｈ）］－
【0101】
実施例５（放射性コンジュゲーション）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１及びＲ２はシクロプロピルである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１及びＲ２はシクロプロピルである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
【0102】
一般的な手順：
５’又は３’末端スルフヒドリルリンカーを有する１．２当量のオリゴヌクレオチドをＰＢＳ（１０ｘ）（容積因子：２５０ｍＬ／ｇ）に溶解した。放射線濃度３０．３ＭＢｑ／ｍＬの分取ＨＰＬＣ溶出剤（０．８２ｍＣｉ／ｍＬ）に直接使用した１当量のＭＯＭＣＰＭ＊を、オリゴヌクレオチド水溶液に加え、室温で２時間撹拌した。ＵＰＬＣ分析により、ＭＯＭＣＰＭ＊のオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションが２６％～４４％の範囲で示された。アセトニトリル（容積因子：７００ｍＬ／ｇ）に溶解した１０当量の冷たい（非放射性）ＭＯＭＣＰＭを加え、ｒｔで２時間撹拌した。ＵＰＬＣにより、完全なコンジュゲーションが示された。反応混合物をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｒｏ精製システム（ＭＷＣＯ：３．０００Ｄａ）に移し、４０００ｒｐｍで遠心分離した。ＰＢＳ（１ｘ）を加え、方法を４回繰り返して溶媒交換を完了させ、精製された生成物を得た。その結果得られた緩衝液の濃度及び活性を決定した。放射化学的収率は９０％～７９９％の範囲に計算され、特定のモル活性は０．６３ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１７．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～０．７７ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（２０．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に到達しえた。放射化学的純度は９７．３％～９８．１％の範囲であった。
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド、オリゴ３及び４はＭＯＭＣＰＭとコンジュゲートした＊
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド、オリゴ３及び４はＭＯＭＣＰＭとコンジュゲートした＊
【0103】
ａ）オリゴ３からのコンジュゲート１３＊［３Ｈ］－の合成
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－［３Ｈ］－ＭＯＭＣＰＭ；収率９０％、放射化学的純度：９８．１％、活性：２６．２ＭＢｑ（０．７１ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．６３ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１７．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
ｂ）オリゴ４からのコンジュゲート１４＊［３Ｈ］－の合成
５’－［３Ｈ］－ＭＯＭＣＰＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率９９％、放射化学的純度：９７．３％、活性：３４．８ＭＢｑ（０．９４ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．７７ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（２０．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－［３Ｈ］－ＭＯＭＣＰＭ；収率９０％、放射化学的純度：９８．１％、活性：２６．２ＭＢｑ（０．７１ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．６３ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１７．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
ｂ）オリゴ４からのコンジュゲート１４＊［３Ｈ］－の合成
５’－［３Ｈ］－ＭＯＭＣＰＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率９９％、放射化学的純度：９７．３％、活性：３４．８ＭＢｑ（０．９４ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．７７ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（２０．８Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
【0104】
実施例６
［１Ｈ／３Ｈ－メチル］－１－（２－メトキシ－１－メチル－エチル）マレイミド（ＭＯＭＥＭ（＊））（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１＝メチル、及びＲ２＝Ｈである）の合成
一般スキーム：
［１Ｈ／３Ｈ－メチル］－１－（２－メトキシ－１－メチル－エチル）マレイミド（ＭＯＭＥＭ（＊））（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１＝メチル、及びＲ２＝Ｈである）の合成
一般スキーム：
【0105】
ａ）エキソ－４－（２－ヒドロキシ－１－１メチル－エチル）－４，７－ジメチル－３ａ，７ａ－ジヒドロ－４，７－エポキシイソインドール－１，３－ジオン（Ｍ２３）の合成
市販の１－（２－ヒドロキシ－１－メチル－エチル）マレイミドＭ２１（１３２ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２．０ｍＬ）中溶液に対し、ｒｔで２，５－ジメチルフランＭ２（４５０ｍｇ、５００μＬ、４．６８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、密閉したガラス管中で６５℃で２０時間撹拌した。真空中での溶媒の除去及びＨＶでの乾燥により、粗Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ付加物Ｍ２３が、４：１の比のエキソ／エンド混合物として明黄色のオイルとして純度９８％で得られた。エンド／エキソ混合物をＩｓｃｏフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、高純度のエキソ誘導体を分離した。収率（エキソ）：１２３ｍｇ（５８％）。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝２６９．２［Ｍ＋ＮＨ４］＋．１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ ６．３６（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，２Ｈ）、４．５４－５．０９（ｍ，１Ｈ）、３．９０－４．１５（ｍ，１Ｈ）、３．６７（ｄｄ，Ｊ＝１０．８、８．１Ｈｚ，１Ｈ）、３．４９（ｄｄ，Ｊ＝１０．８、６．４Ｈｚ，１Ｈ）、２．８２－２．８７（ｍ，１Ｈ）、２．７７－２．８１（ｍ，１Ｈ）、１．５３（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，６Ｈ）、１．１７（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）．
【0106】
ｂ）エキソ－２－（２－メトキシ－１－メチル－エチル）－４，７－ジメチル－３ａ，７ａ－ジヒドロ－４，７－エポキシイソインドール－１，３－ジオン（Ｍ２５）の合成
シールド管において、トルエン（２ｍＬ）に溶解したノシル酸メチルＭ４（４９．８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）及びＭ２３（５７．６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を０℃に冷却した。ナトリウムｔ－ブトキシド溶液（ＴＨＦ中２Ｍ、１３８μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を滴下した。色が無色から褐色に変化した。混合物を室温で３時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、所望の中間生成物への変換が示された。反応混合物を、２つのＳＡＸ－ＳＣＸカートリッジ（Ｓｉｌｌｉｃｙｃｌｅ、５００ｍｇ、トルエンで事前調節）を通した濾過により直接精製した。カートリッジをトルエン（各５ｍＬ）で洗浄し、結果として得られた溶液をエバポレーションにより濃縮乾固し、無色のオイルを得た。粗生成物を、１５分で０％～６０％のＭＴＢＥのヘプタンとＭＴＢＥの勾配により、Ｉｓｃｏフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。収率：５９ｍｇ（９７％）。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝２６６．１［Ｍ＋Ｈ］＋．
【0107】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ ６．３６（ｓ，２Ｈ）、４．１７－４．２７（ｍ，１Ｈ）、３．６９（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，８．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．６９（ｄｄ，Ｊ＝１０．０，８．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．４２（ｄｄ，Ｊ＝９．９，５．９，１Ｈ）、３．１９（ｓ，３Ｈ）、２．８２－２．８７（ｍ，２Ｈ）、１．５３（ｄ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，６Ｈ）、１．１９（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．
【0108】
ｂ＊）［３Ｈ－メトキシ］－エキソ－２－（２－メトキシ－１－メチル－エチル）－４，７－ジメチル－３ａ，７ａ－ジヒドロ－４，７－エポキシイソインドール－１，３－ジオン（Ｍ２５＊）の合成
トルエン中溶液としての０．９３ＧＢｑ（２５ｍＣｉ）の［３Ｈ］‐ノシル酸メチルＭ４＊（７０μｇ、０．３１３μｍｏｌ）を、冷たい（非放射性）メチル ４－ニトロベンゼンスルホネートＭ４（６８μｇ、０．３１３μｍｏｌ）で１：１の比に希釈し、概ね４０Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性を達成した。溶液を、エバポレートし、シールド管に移し、アルゴン流下で濃縮乾固した。固体残基（Ｍ４＊＋Ｍ４）に対し、ｒｔでエキソＤｉｅｌｓ Ａｌｄｅｒ付加物Ｍ２３（３９３μｇ、１．５６μｍｏｌ）の８０μＬトルエン中溶液を加え、続いてナトリウムｔ－ブトキシドの溶液（ＴＨＦ中２Ｍ、１．０μＬ、１．８８μｍｏｌ）を加えた。混合物をシールド管中でｒｔで２．５時間撹拌した。ＨＰＬＣ分析により、放射化学的純度６３％の所望の中間生成物Ｍ２５＊が示された。反応混合物を、ＤＣＭ（１ｍＬ）で希釈し、ＳＣＸ－２／ＳＡＸカートリッジ（Ｓｉｌｙｃｙｃｌｅ、５００ｍｇ、ＤＣＭで事前調節）を通した濾過により直接精製し、塩基性及び酸性化合物を除去した。カートリッジをＤＣＭ（５ｍＬ）で洗浄し、その結果得られた溶液をエバポレーションにより容積１００μＬまで濃縮し、放射標識された中間体Ｍ２５＊を得た。
Ｍ２５＊の粗溶液を、それ以上精製することなく次工程のために使用した。
Ｍ２５＊の粗溶液を、それ以上精製することなく次工程のために使用した。
【0109】
ｃ）１－（１－メトキシ－１－メチル－エチル）マレイミド（ＭＯＭＥＭ）の合成
５５ｍｇ（０．２０７ｍｍｏｌ）のＭ２５を、シールド管に移し、トルエン（５００μＬ）に溶解し、９０℃で１６時間加熱した。ＨＰＬＣ分析により、脱保護された生成物ＭＯＭＥＭへの変換が示された。反応混合物をｒｔに冷まし、溶媒を濃縮乾固した。残基をフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物メトキシエチレンマレイミド（ＭＯＭＥＭ）を純度＞９６％で得た。１９ｍｇ（５４％）を無色のオイルとして単離することができた。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ＝１７０．０８［Ｍ＋Ｈ］＋．
【0110】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６）δ ｐｐｍ ６．９８（ｓ，２Ｈ）、４．２３（ｄｄｄ，Ｊ＝９．５，７．１，５．４Ｈｚ，１Ｈ）、３．６７（ｔ、Ｊ＝９．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．３９（ｄｄ，Ｊ＝１０．０、５．３Ｈｚ，１Ｈ）、３．１９（ｓ，３Ｈ）、１．２４（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．
【0111】
ｃ＊）［３Ｈ－メチル］－１－（１－メトキシ－１－メチル－エチル）マレイミド（ＭＯＭＥＭ＊）の合成
得られたＭ２５＊の粗溶液を、シールド管に移し、トルエン（１００μＬ）で希釈し、１１０℃で２時間加熱した。
ＨＰＬＣ分析により、脱保護された生成物ＭＯＭＥＭ＊への完全な変換及び残りの未反応［３Ｈ］ノシル酸メチルＭ４＊が示された。反応混合物をｒｔに冷まし、溶媒をアルゴン流下で濃縮乾固した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物［３Ｈ－メチル］メトキシエチレンマレイミド（ＭＯＭＥＭ＊）を溶出剤混合物中溶液として得た。溶出剤混合物中にＭＯＭＥＭ＊を含む対応する分取ＨＰＬＣの画分を、オリゴ３及び４とのコンジュゲーションのために直接使用した。放射線収率：１２２．１ＭＢｑ（３．３ｍＣｉ）＝１３．２％。放射線濃度：３０．０ＭＢｑ／ｍＬ（０．８１ｍＣｉ／ｍＬ）、放射化学的純度：９９％。比活性は、低イオン化に起因してＭＳにより決定することができなかった。比活性は、４０Ｃｉ／ｍｍｏｌと推定された。
ＨＰＬＣ分析により、脱保護された生成物ＭＯＭＥＭ＊への完全な変換及び残りの未反応［３Ｈ］ノシル酸メチルＭ４＊が示された。反応混合物をｒｔに冷まし、溶媒をアルゴン流下で濃縮乾固した。残留物を分取ＨＰＬＣにより精製し、所望の生成物［３Ｈ－メチル］メトキシエチレンマレイミド（ＭＯＭＥＭ＊）を溶出剤混合物中溶液として得た。溶出剤混合物中にＭＯＭＥＭ＊を含む対応する分取ＨＰＬＣの画分を、オリゴ３及び４とのコンジュゲーションのために直接使用した。放射線収率：１２２．１ＭＢｑ（３．３ｍＣｉ）＝１３．２％。放射線濃度：３０．０ＭＢｑ／ｍＬ（０．８１ｍＣｉ／ｍＬ）、放射化学的純度：９９％。比活性は、低イオン化に起因してＭＳにより決定することができなかった。比活性は、４０Ｃｉ／ｍｍｏｌと推定された。
【0112】
実施例７（非放射性コンジュゲーション）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１＝メチル、及びＲ２＝Ｈである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１＝メチル、及びＲ２＝Ｈである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
【0113】
一般的な手順：
５’又は３’末端スルフヒドリルリンカーを有する１当量のオリゴヌクレオチドをＰＢＳ（容積因子：２５０ｍＬ／ｇ）に溶解した。ＴＨＦ（容積因子：２００ｍＬ／ｇ）に溶解した１．３当量の１－（１－メトキシ－１－メチル－１－エチル）マレイミド（ＭＯＭＥＭ）を水溶液に加え、室温で１時間撹拌した。ＵＰＬＣ分析により、オリゴヌクレオチドへのマレイミドの完全な付加が示された。バッファーを水へと交換するために、反応混合物をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｒｏ精製システム（ＭＷＣＯ：３．０００Ｄａ）に移し、４０００ｒｐｍで遠心分離した。ＤＩ水を加え、方法をさらに４回繰り返して交換を完了させた。その結果得られた水溶液を乾燥凍結させて、オリゴヌクレオチドを無色の粉末として、８３％～９８％の範囲の収率及び９３％～９８％の純度で単離した。
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド、オリゴ３及び４はＭＯＭＥＭとコンジュゲートした。
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド、オリゴ３及び４はＭＯＭＥＭとコンジュゲートした。
【0114】
ａ）オリゴ３からのコンジュゲート２３の合成
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＭＥＭ；収率：８３％、純度：９８％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：５６５６．６［Ｍ－（Ｈ）］－
ｂ）オリゴ４からのコンジュゲート２４の合成
５’－ＭＯＭＥＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率：９３％、純度：９８％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：６９０６．７［Ｍ－（Ｈ）］－
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－ＭＯＭＥＭ；収率：８３％、純度：９８％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：５６５６．６［Ｍ－（Ｈ）］－
ｂ）オリゴ４からのコンジュゲート２４の合成
５’－ＭＯＭＥＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率：９３％、純度：９８％、ＭＳ（ｍ／ｚ）：６９０６．７［Ｍ－（Ｈ）］－
【0115】
実施例８（放射性コンジュゲーション）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１＝メチル、及びＲ２＝Ｈである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
（式ＶＩのマレイミド化合物、式中、ｎ＝１、Ｒ１＝メチル、及びＲ２＝Ｈである）
実施例で使用されたオリゴヌクレオチド
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ；ＭＷ：５４９１．５ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ３）
５’－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；ＭＷ：６７４２．３ｇ／ｍｏｌ；（オリゴ４）
【0116】
一般的な手順：
５’又は３’末端スルフヒドリルリンカーを有する１．２当量のオリゴヌクレオチドをＰＢＳ（１０ｘ）（容積因子：２５０ｍＬ／ｇ）に溶解した。放射線濃度３０．０ＭＢｑ／ｍＬの分取ＨＰＬＣ溶出剤（０．８１ｍＣｉ／ｍＬ）に直接使用した１当量のＭＯＭＥＭ＊を、オリゴヌクレオチド水溶液に加え、室温で２時間撹拌した。ＵＰＬＣ分析により、ＭＯＭＥＭ＊のオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションが６２％～６６％の範囲で示された。ＴＨＦ（容積因子：７００ｍＬ／ｇ）に溶解した１０当量の冷たい（非放射性）ＭＯＭＥＭを加え、ｒｔで２時間撹拌した。ＵＰＬＣにより、完全なコンジュゲーションが示された。反応混合物をＡｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｒｏ精製システム（ＭＷＣＯ：３．０００Ｄａ）に移し、４０００ｒｐｍで遠心分離した。ＰＢＳ（１ｘ）を加え、方法を４回繰り返して溶媒交換を完了させ、精製された生成物を得た。その結果得られた緩衝液の濃度及び活性を決定した。放射化学的収率は８７％～８９％の範囲に計算され、特定のモル活性は０．３９ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１０．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）～０．４８ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１２．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）に到達することができた。放射化学的純度は９３．４％～９４．３％の範囲であった。
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド、オリゴ３及び４はＭＯＭＥＭとコンジュゲートした。
一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチド、オリゴ３及び４はＭＯＭＥＭとコンジュゲートした。
【0117】
ａ）オリゴ３からのコンジュゲート２３＊［３Ｈ］－の合成
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－［３Ｈ］－ＭＯＭＥＭ；収率８７％、放射化学的純度：９４．３％、活性：１６．７ＭＢｑ（０．４５ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．４８ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１２．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
ｂ）オリゴ４からのコンジュゲート２４＊［３Ｈ］－の合成
５’－［３Ｈ］－ＭＯＭＥＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率８９％、放射化学的純度：９３．４％、活性：１４．８ＭＢｑ（０．４０ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．３９ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１０．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
Ｇ＊Ａ＊Ｇ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ｇ＊ｃ＊ｃ＊ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊－Ｃ６ＳＨ－［３Ｈ］－ＭＯＭＥＭ；収率８７％、放射化学的純度：９４．３％、活性：１６．７ＭＢｑ（０．４５ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．４８ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１２．０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
ｂ）オリゴ４からのコンジュゲート２４＊［３Ｈ］－の合成
５’－［３Ｈ］－ＭＯＭＥＭ－ＳＨ－Ｃ６＊Ｔ＊Ｔ＊Ａ＊ｃ＊Ａ＊ｃ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ａ＊ｔ＊ｔ＊ａ＊ｔ＊ａ＊ｃ＊ｔ＊Ｔ＊Ｃ＊Ｃ；収率８９％、放射化学的純度：９３．４％、活性：１４．８ＭＢｑ（０．４０ｍＣｉ）、特定のモル活性：０．３９ＴＢｑ／ｍｍｏｌ（１０．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。
【配列表】