特許 7368018 バクテリオファージ溶解素によるバイオフィルムの防止、破壊および処置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-16

(45)【発行日】2023-10-24

(54)【発明の名称】バクテリオファージ溶解素によるバイオフィルムの防止、破壊および処置

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/46 20060101AFI20231017BHJP

   A61K 31/431 20060101ALI20231017BHJP

   A61K 31/5377 20060101ALI20231017BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20231017BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20231017BHJP

   A61K 38/14 20060101ALI20231017BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231017BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20231017BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231017BHJP

【ＦＩ】

A61K38/46 ZNA

A61K31/431

A61K31/5377

A61K31/7048

A61K38/12

A61K38/14

A61K45/00

A61P31/04

A61P43/00 121

【請求項の数】 36

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022130371

(22)【出願日】2022-08-18

(62)【分割の表示】P 2020134278の分割

【原出願日】2013-05-09

(65)【公開番号】P2022163214

(43)【公開日】2022-10-25

【審査請求日】2022-09-16

(31)【優先権主張番号】61/644,799

(32)【優先日】2012-05-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/736,813

(32)【優先日】2012-12-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514284475

【氏名又は名称】コントラフェクト コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】レイモンド シューフ

(72)【発明者】

【氏名】ロバート シー． ノウィンスキー

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ウィッテキンド

(72)【発明者】

【氏名】ババル カーン

(72)【発明者】

【氏名】ジミー ロトロ

【審査官】深草 亜子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１１－５２６９２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５３６３５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５１８５４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】SCHMITZ J，Expanding The Horizons Of Enzybiotic Identification，Graduate School Student Theses，The Rockefeller University，Paper138，2011年，p.49-51,217-220,251,252,264,375

【文献】Applied and Environmental Microbiology，2011年，Vol.77，p.8272-8279

【文献】Gilmer D.B.et al.，Abstracts of the General Meeting of the American Society for Microbiology，2011年，Vol. 111，Presentation Number 1514

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ブドウ球菌および／または連鎖球菌を含むグラム陽性菌のバイオフィルムの防止、破壊、または根絶に使用するための組成物であって、
溶解酵素を含み、
前記溶解酵素が、
配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、前記バイオフィルム内のブドウ球菌および／または連鎖球菌に結合するのに有効なそのバリアントを含むＰｌｙＳｓ２結合ドメインと、
触媒ドメインと
を含み、
前記防止、破壊、または根絶が、前記バイオフィルム内のブドウ球菌および／または連鎖球菌の殺滅、増殖阻害、および／または菌数の減少を含む、組成物。

【請求項2】

被験体におけるグラム陽性菌のバイオフィルム感染症の処置または予防に使用するための薬学的組成物であって、
前記バイオフィルムが、ブドウ球菌および／または連鎖球菌を含み、
前記薬学的組成物が、溶解酵素を含み、
前記溶解酵素が、
配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、前記バイオフィルム内のブドウ球菌および／または連鎖球菌に結合するのに有効なそのバリアントを含むＰｌｙＳｓ２結合ドメインと、
触媒ドメインと
を含み、
前記処置または予防が、前記バイオフィルム内のブドウ球菌および／または連鎖球菌の殺滅、増殖阻害、および／または菌数の減少を含む、薬学的組成物。

【請求項3】

前記溶解酵素が、キメラ溶解酵素である、請求項１または２に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項4】

前記グラム陽性菌のバイオフィルム感染症が、心内膜炎、骨髄炎、または置換関節の感染症を含む、請求項２または３に記載の薬学的組成物。

【請求項5】

前記グラム陽性菌のバイオフィルム感染症が、骨髄炎を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項6】

前記グラム陽性菌のバイオフィルム感染症が、置換関節の感染症を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項7】

前記グラム陽性菌のバイオフィルム感染症が、心内膜炎を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項8】

前記バイオフィルムが組織および／または医療用デバイス上にある、請求項２～７のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項9】

前記医療用デバイスが、カテーテル、バルブ、補綴デバイス、薬物のポンプ、ステント、または整形材料である、請求項８に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項10】

前記医療用デバイスが、心臓または心臓血管に埋め込まれる、請求項８または９に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項11】

前記医療用デバイスがステントである、請求項８～１０のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項12】

前記バイオフィルムが、損傷組織または心臓血管内にある、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項13】

１または複数の抗生物質をさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項14】

１または複数の抗生物質が、前記薬学的組成物の前、後、又は同時に前記被験体に投与される、請求項２～１２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項15】

前記１または複数の抗生物質が、グリコペプチド類、セファロスポリン類、マクロライド類、および／またはペニシリン類を含む、請求項１３または１４に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項16】

前記１または複数の抗生物質がペニシリン類を含み、該ペニシリン類が、オキサシリン、アンピシリン、および／またはクロキサシリンを含む、請求項１３または１４に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項17】

前記１または複数の抗生物質がグリコペプチド類を含み、該グリコペプチド類が、バンコマイシンおよび／またはテイコプラニンを含む、請求項１３または１４に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項18】

前記１または複数の抗生物質がダプトマイシン、バンコマイシン、および／またはリネゾリドを含む、請求項１３または１４に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項19】

前記１または複数の抗生物質がマクロライド類を含み、該マクロライド類が、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、および／またはロキシスロマイシンを含む、請求項１３または１４に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項20】

前記溶解酵素の触媒ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項21】

前記溶解酵素の触媒ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項22】

前記バイオフィルムが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・シムランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・エクイ・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サンギニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｇ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｅ群ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびストレプトコッカス・ニューモニア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）から選択される１または複数のブドウ球菌および／または連鎖球菌を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項23】

前記ブドウ球菌および／または連鎖球菌が、抗生物質耐性菌、および／または抗生物質に対する感性が変更された菌を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項24】

前記抗生物質耐性菌が、メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＶＲＳＡ）、ダプトマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＤＲＳＡ）、および／または、リネゾリド耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＬＲＳＡ）を含み、前記抗生物質に対する感性が変更された菌が、バンコマイシン中間感性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＶＩＳＡ）を含む、請求項２３に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項25】

前記使用がバイオフィルムの形成の防止を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項26】

前記使用がバイオフィルムの破壊または根絶を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項27】

前記触媒ドメインがＣＨＡＰドメインを含む、請求項３～２６のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項28】

前記キメラ溶解酵素のＣＨＡＰドメインが、ブドウ球菌および／または連鎖球菌を標的とする溶解素からのＣＨＡＰドメインを含む、請求項２７に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項29】

静脈内投与に適合されている、請求項１～２８のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項30】

複数回用量での投与用に製剤化されている、請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項31】

単回用量での投与用に製剤化されている、請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項32】

前記使用がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる、請求項１、３、８～１３、および１５～２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

前記溶解酵素が、配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有し、ブドウ球菌および／または連鎖球菌を殺滅するのに有効なそのバリアントを含む、請求項１、２、４～２６、および２９～３２のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項34】

前記溶解酵素が、配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９．５％の同一性を有し、ブドウ球菌および／または連鎖球菌を殺滅するのに有効なそのバリアントを含む溶解素ポリペプチドである、請求項１、２、４～２６、および２９～３３のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項35】

前記溶解酵素が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、１個のアミノ酸残基が、前記溶解酵素配列のＮ末端またはＣ末端で付加または欠失しており、ブドウ球菌および／または連鎖球菌を殺滅するのに有効である、請求項１、２、４～２６、および２９～３４のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【請求項36】

前記溶解酵素が、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、１個のアミノ酸残基が、前記溶解酵素配列のＮ末端で欠失しており、ブドウ球菌および／または連鎖球菌を殺滅するのに有効である、請求項１、２、４～２６、および２９～３４のいずれか一項に記載の組成物または薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、概して、溶解素、特に、薬物耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含むブドウ球菌を殺滅する能力を有する溶解素、特に、溶解素ＰｌｙＳｓ２を用いた、細菌バイオフィルムの防止、制御、破壊および処置に関する。本発明は、細菌バイオフィルム（複数可）およびバイオフィルム形成を調整するための組成物および方法にも関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
多種多様の疾病および他の状態に対して使用する抗生物質が増えるにつれ、薬物耐性菌が発生することが、医療における大きな問題である。より多くの抗生物質を使用することおよび耐性を示す細菌の数のせいで、処置時間が長くなる。さらに、広域の非特異的抗生物質が、現在、頻繁に使用されているが、そのうちのいくつかは、患者に有害作用を及ぼす。この使用の増加に関連する問題は、多くの抗生物質が、粘液内層（ｍｕｃｕｓ ｌｉｎｉｎｇ）を容易に透過しないということである。

【0003】

グラム陽性菌は、ポリペプチドおよび多糖を含む細胞壁に囲まれている。グラム陽性菌としては、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属が挙げられるがこれらに限定されない。医学的に関連性のある種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ種は、胞子形成性であり、炭疽および胃腸炎の原因となる。胞子形成性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種は、ボツリヌス、破傷風、ガス壊疽および偽膜性大腸炎に関与する。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種は、ジフテリアの原因となり、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種は、髄膜炎の原因となる。

【0004】

新規抗菌療法アプローチには、酵素ベースの抗生物質（「エンザイバイオティクス（ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃｓ）」）、例えば、バクテリオファージ溶解素が含まれる。ファージは、これらの溶解素を使用して、それらの細菌宿主の細胞壁を消化し、低浸透圧性溶解によってウイルス子孫を放出する。精製された組換え溶解素を外部からグラム陽性菌に加えたときも、同様の結果を生じる。溶解素がグラム陽性病原体に対して高致死活性であることにより、それらは治療薬として開発するための魅力的な候補になる（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｖ．Ａ．（２００８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １１：３９３－４００；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｌ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４１０７－４１１２）。バクテリオファージ溶解素は、当初、病原性連鎖球菌の鼻咽頭保因を根絶するために提案された（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４：２１７０－２１７２；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４１０７－４１１２）。溶解素は、宿主溶解をウイルス構築の完成と連携させるために二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ファージが使用する溶解機構の一部である（Ｗａｎｇ，Ｉ．Ｎ．ら（２０００）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５４：７９９－８２５）。溶解素は、細菌細胞壁（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｗａｌｌ）内の結合を壊し、ペプチドグリカンの完全性に不可欠な共有結合を迅速に加水分解し、細菌の溶解およびそれに伴う子孫ファージの放出を引き起こ
す、ペプチドグリカン加水分解酵素である。

【0005】

溶解素ファミリーのメンバーは、触媒ドメインが特異性ドメインまたは結合ドメインに融合されているモジュール構造を示す（Ｌｏｐｅｚ，Ｒ．ら（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔ ３：１９９－２１１）。溶解素は、細菌ゲノム内のウイルスプロファージ配列からクローニングされ得、処置のために使用され得る（Ｂｅｒｅｓ，Ｓ．Ｂ．ら（２００７）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２（８）：１－１４）。溶解素は、外部から加えられると、グラム陽性細胞壁の結合に到達することができる（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，Ｖ．Ａ．（２００８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １１：３９３－４００）。バクテリオファージ溶解酵素は、被験体における様々なタイプの感染の評価および様々な投与経路による特異的処置において有用と立証された。例えば、米国特許第５，６０４，１０９号（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら）は、半精製されたＣ群連鎖球菌ファージ関連溶解素酵素による酵素消化を介した臨床検体中のＡ群連鎖球菌の迅速な検出に関する。この酵素の働きは、さらなる研究の基礎となり、疾患を処置する方法に至った。ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓの特許（米国特許第５，９８５，２７１号、同第６，０１７，５２８号および同第６，０５６，９５５号）には、Ｃ１バクテリオファージに感染したＣ群連鎖球菌によって産生される溶解素酵素の使用が開示されている。米国特許第６，２４８，３２４号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）には、皮膚組織への局所的適用に適したキャリア中での溶解酵素の使用による皮膚科学的感染症に対する組成物が開示されている。米国特許第６，２５４，８６６号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）には、感染している細菌に特異的な溶解酵素を投与する工程を含む、消化管の細菌感染症を処置するための方法が開示されている。その消化管に少なくとも１つの溶解酵素を送達するためのキャリアは、坐剤浣腸、シロップ剤または腸溶性丸剤からなる群より選択される。米国特許第６，２６４，９４５号（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）には、その細菌に特異的なバクテリオファージに感染した細菌によって産生される少なくとも１つの溶解酵素および患者にその溶解酵素を送達するための適切なキャリアの非経口導入（筋肉内、皮下または静脈内）による、細菌感染症を処置するための方法および組成物が開示されている。

【0006】

ファージ関連溶解酵素は、様々なバクテリオファージから同定され、クローニングされており、それらの各々が、特定の菌株の殺滅において有効であると示されている。米国特許第７，４０２，３０９号、同第７，６３８，６００号および公開ＰＣＴ出願ＷＯ２００８／０１８８５４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ感染症の処置または減少のための抗菌剤として有用な別々のファージ関連溶解酵素を提供している。米国特許第７，５６９，２２３号には、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する溶解酵素が記載されている。米国特許第７，５８２２９１号には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（バンコマイシン耐性菌株を含む、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥ．ｆａｅｃｉｕｍ）に対して有用な溶解素が記載されている。ＵＳ２００８／０２２１０３５には、Ｂ群連鎖球菌の殺滅において非常に有効な変異体Ｐｌｙ ＧＢＳの溶解素が記載されている。ＷＯ２０１０／００２９５９には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含むブドウ球菌に対する活性を有するＣｌｙＳと表示されるキメラ溶解素が詳述されている。ＣｌｙＳは、ブドウ球菌に特異的であり、連鎖球菌および他のグラム陽性菌には不活性である。

【0007】

溶解素は、その迅速、強力かつ特異的な細胞壁分解特性および殺菌特性に基づいて、露出したペプチドグリカン細胞壁を細胞の外側から攻撃することによってグラム陽性病原体と闘う抗微生物治療法として提案されている（Ｆｅｎｔｏｎ，Ｍら（２０１０）Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｂｕｇｓ １：９－１６；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄら（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４１０７－４１１２）。単剤としての様々な溶解素の効能は、咽頭炎（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄら（２００１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４１０７－４１１２）、肺炎（Ｗｉｔｚｅｎｒａｔｈ，Ｍら（２００９）Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ３７：６４２－６４９）、中耳炎（ＭｃＣｕｌｌｅｒｓ，Ｊ．Ａ．ら（２００７）ＰＬＯＳ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ３：０００１－０００３）、膿瘍（Ｐａｓｔａｇｉａ，Ｍら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ５５：７３８－７４４）、菌血症（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら（２００３）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７１：６１９９－６２０４）、心内膜炎（Ｅｎｔｅｎｚａ，Ｊ．Ｍ．ら（２００５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４９：４７８９－４７９２）および髄膜炎（Ｇｒａｎｄｇｉｒａｒｄ，Ｄら（２００８）Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９７：１５１９－１５２２）のげっ歯類モデルにおいて実証されている。さらに、溶解素は、一般に、その細菌宿主種に特異的であって、胃腸管ホメオスタシスにとって有益であり得るヒト共生細菌を含む非標的生物を溶解しない（Ｂｌａｓｅｒ，Ｍ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７６：３９３－３９４；Ｗｉｌｌｉｎｇ，Ｂ．Ｐ．ら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：２３３－２４３）。

【0008】

微生物は、種々の環境における重要な生存戦略として、表面に付着したバイオフィルムコミュニティーを形成する傾向がある。バイオフィルムは、微生物細胞、ならびに多糖類、核酸およびタンパク質を含む広範囲の自己産生した細胞外の重合体物質からなる（Ｆｌｅｍｍｉｎｇ ＨＣら（２００７）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８９：７９４５－７９４７）。バイオフィルムは、天然の環境および産業の水環境、組織、ならびに医療用の材料およびデバイスに見出される（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ ＪＷら（１９９４）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７６：２１３７－２１４２）。バイオフィルムは、単一の菌株によって形成され得るが、ほとんどの天然のバイオフィルムは、複数の細菌種によって形成されている（Ｙａｎｇ Ｌら（２０１１）Ｉｎｔ Ｊ Ｏｒａｌ Ｓｃｉ ３：７４－８１）。バイオフィルム集団に抗生物質を適用しても、その独特の生理機能および物理的なマトリックスバリアに起因して、無効であることが多い。

【0009】

ブドウ球菌は、生物医学的埋め込み物（ｉｍｐｌａｎｔ）または損傷組織および健常組織に接着する、細胞外マトリックスに包まれた固着性のコミュニティーであるバイオフィルムを形成することが多い。バイオフィルムに関連する感染症は、処置しにくく、バイオフィルム内の固着性の細菌は、その浮遊している対応物よりも１，０００～１，５００倍、抗生物質に対して耐性であると推定されている。このバイオフィルムの抗生物質耐性のせいで、しばしば、従来の抗生物質治療は失敗し、感染したデバイスを取り出す必要が生じる。リゾスタフィンは、バイオフィルム内のＳ．ａｕｒｅｕｓを殺滅することが示されており、また、インビトロにおいて、プラスチック表面上およびガラス表面上のＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムの細胞外マトリックスを破壊した（Ｗｕ，ＪＡら（２００３）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈ ４７（１１）：３４０７－３４１４）。このＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムの破壊は、リゾスタフィン感性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特異的であり、リゾスタフィン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓのバイオフィルムは、影響されなかった。高濃度のオキサシリン（４００μｇ／ｍｌ）、バンコマイシン（８００μｇ／ｍｌ）およびクリンダマイシン（８００μｇ／ｍｌ）は、２４時間後でさえも、確立されたＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムに対して影響を及ぼさなかった。リゾスタフィンは、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓバイオフィルムも破壊したが、しかしながら、より高い濃度が必要だった。ブドウ球菌のバイオフィルムを除去するためのファージ溶解素の適用が、種々雑多な結果とともに報告されている。バクテリオファージ溶解素ＳＡＬ－２は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを除去すると報告された（Ｓｏｎ ＪＳら（２０１０）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８６（５）：１４３９－１４４９）が、２つの類似のファージ溶解素ｐｈｉ１１およびｐｈｉ１２の場合、ｐｈｉ１１は、ブドウ球菌のバイオフィルムを加水分解したが、ｐｈｉ
１２は、不活性だった（Ｓａｓｓ Ｐ ａｎｄ Ｂｉｅｒｂａｕｍ Ｇ（２００７）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７３（１）：３４７－３５２）。様々な酵素の組み合わせが、細菌バイオフィルムの除去および消毒のために様々な系において研究されている（Ｊｏｈａｎｓｅｎ Ｃら（１９９７）Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６３：３７２４－３７２８）。しかしながら、このプロセスは、最低２つの酵素または作用物質を必要とし、１つの酵素または作用物質は、バイオフィルムの接着性細菌の除去用であり、第２の酵素または作用物質は、殺菌活性を有するものである。

【0010】

現行の従来の抗菌剤に関連する不十分な点および問題から、さらなる特異的な細菌用の薬剤（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｇｅｎｔ）および治療様式、ならびに細菌バイオフィルムの有効なおよび効率的な処置、制御および防止のための、特に、耐性獲得のリスクなしで、より広域性の薬剤に対するニーズがなおも当該分野に存在することは明らかである。現在までに、複数の異なる種の病原性のグラム陽性菌および臨床的に関与性のグラム陽性菌に対して溶解活性を明らかに示す、容易に製造可能であり、安定であり、かつ耐性のリスクが全くないかまたは限られている溶解素が、バイオフィルムに対して有効であると示されていないことは、注目すべきことである。したがって、新しい抗菌アプローチ、特に、新しい様式を介して働くか、またはバイオフィルム内の病原菌を殺滅する新しい手段を提供する新しい抗菌アプローチに対する商業的ニーズが存在する。
本明細書中の参考文献の引用は、それらが本発明に対する先行技術であることを認めるものとして解釈されるものではない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【文献】米国特許第５，９８５，２７１号明細書

【文献】米国特許第６，０１７，５２８号明細書

【文献】米国特許第６，０５６，９５５号明細書

【文献】米国特許第６，２４８，３２４号明細書

【文献】米国特許第６，２５４，８６６号明細書

【文献】米国特許第６，２６４，９４５号明細書

【文献】米国特許第７，４０２，３０９号明細書

【文献】米国特許第７，６３８，６００号明細書

【文献】国際公開第２００８／０１８８５４号

【文献】米国特許第７，５６９，２２３号明細書

【文献】米国特許第７，５８２２９１号明細書

【文献】米国特許出願公開第２００８／０２２１０３５号明細書

【文献】国際公開第２０１０／００２９５９号

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

発明の要旨
本発明によると、細菌バイオフィルムの防止、破壊および処置のための組成物および方法が提供される。その最も広範な態様において、本発明は、バイオフィルムの防止、破壊および処置における、複数の細菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）の菌株を含む、特にグラム陽性菌に対して広範な殺滅活性を有する溶解素の使用および適用を提供する。本発明の溶解素および組成物は、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａの菌株ならびにそれらの適用可能なバイオフィルムの殺滅において有用かつ適用可能である。本発明は、バイオフィルム内の細菌を効果的かつ効率的に殺滅することができるバクテリオファージ溶解素を利用して細菌バイオフィルムを除菌するため、分散させるため
および除去するための方法を提供する。したがって、本発明は、細菌バイオフィルムの処置、除菌および／または除染、ならびにバイオフィルム（複数可）の分散後の感染症の防止を企図し、ここで、１つまたは複数のグラム陽性菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ菌のうちの１つまたは複数が、存在すると疑われるかまたは存在する。

【0013】

本発明によると、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ菌に由来するバクテリオファージ溶解素が、本発明の方法および適用において利用される。本発明において有用な溶解素ポリペプチド（複数可）、特に、本明細書中および図５（配列番号１）に提供されるようなＰｌｙＳｓ２溶解素は、複数の細菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ菌株を含むグラム陽性菌に対して広範な殺滅活性を明らかに示すという点において独特である。１つのそのような態様において、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、本明細書中で実証されるように、バイオフィルム内のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌株および菌を殺滅することができる。ＰｌｙＳｓ２は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（例えば、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）、ダプトマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＤＲＳＡ）およびリネゾリド耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＬＲＳＡ））を含む抗生物質耐性菌に対して有効である。ＰｌｙＳｓ２は、バンコマイシン中間感性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）などの抗生物質に対する感性が変更されている細菌に対して有効である。

【0014】

本発明のある態様において、バイオフィルム内のグラム陽性菌を殺滅する方法が提供され、その方法は、バイオフィルム内のＳ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を殺滅するのに有効な量の単離された溶解素ポリペプチドを含む組成物とそのバイオフィルムとを接触させる工程を含み、その単離された溶解素ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドまたはグラム陽性菌を殺滅するのに有効なそのバリアントを含む。したがって、バイオフィルム内のグラム陽性菌を殺滅する方法が提供され、その方法は、バイオフィルム内のグラム陽性菌を殺滅するのに有効な量の単離された溶解素ポリペプチドを含む組成物とバイオフィルムとを接触させる工程を含み、その単離された溶解素ポリペプチドは、図５もしくは配列番号１に提供されているアミノ酸配列、または図５もしくは配列番号１のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性または９９％の同一性を有し、バイオフィルム内のグラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む。

【0015】

本発明のある態様において、細菌を除染してかつ放出して、次に、抗生物質に感受性にするするためにバイオフィルム内のグラム陽性菌を分散させる方法が提供され、その方法は、バイオフィルム内のＳ．ａｕｒｅｕｓを含むグラム陽性菌を分散させるのに有効な量の単離された溶解素ポリペプチドを含む組成物とバイオフィルムとを接触させる工程を含み、その単離された溶解素ポリペプチドは、図５もしくは配列番号１に示されているようなもの、またはグラム陽性菌を殺滅するのに有効なそのバリアントを含むＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドを含む。

【0016】

上記方法のある態様において、それらの方法は、特に、ヒトによるまたはヒトにおける使用が意図された、溶液、材料またはデバイスを滅菌するためまたは除染するために、インビトロまたはエキソビボで行われる。

【0017】

本発明は、バイオフィルム内のグラム陽性菌の集団を減少させる方法を提供し、その方法は、バイオフィルム内のグラム陽性菌の少なくとも一部を殺滅するかまたは放出するの
に有効な量の単離されたポリペプチドを含む組成物とバイオフィルムとを接触させる工程を含み、単離されたポリペプチドは、図５のアミノ酸配列（配列番号１）、または図５のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、それらのグラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む。

【0018】

本発明はさらに、ヒトにおいてバイオフィルムが関わるかまたはバイオフィルムを含む抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ感染を分散させるためまたは処置するための方法を提供し、その方法は、抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓのバイオフィルム感染を有するヒトに、図５のアミノ酸配列（配列番号１）、または図５のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性もしくは９５％の同一性を有し、そのバイオフィルムを分散させるのに有効であり、かつその中のおよび／もしくはそこから放出されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む単離されたポリペプチドを含む有効量の組成物を投与する工程を含み、それによって、そのヒトにおけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの数は減少し、バイオフィルムおよび付随の感染は、制御される。

【0019】

本発明の方法は、ヒトにおいて１種もしくは複数種のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの細菌を含むグラム陽性菌のバイオフィルムを防止するため、分散させるため、または処置するための方法も含み、その方法は、細菌バイオフィルムを有するかまたは有すると疑われるかまたはそのリスクがある被験体に、図５のアミノ酸配列（配列番号１）、または図５のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性もしくは９５％の同一性を有し、グラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む単離されたポリペプチドを含む有効量の組成物を投与する工程を含み、それによって、そのヒトにおけるグラム陽性菌の数が減少し、そのバイオフィルムの汚染または感染が制御される。その方法のある態様において、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓまたはＬｉｓｔｅｒｉａの細菌の１つまたは複数を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）または含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）バイオフィルムが、効率的に防止されるか、分散されるか、または処置される。この方法の特定の態様において、被験体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（特に、Ａ群連鎖球菌またはＢ群連鎖球菌、例えば、それぞれＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）の細菌の１つまたは１つもしくは複数に曝されているか、またはそのリスクがある。Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）またはＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）などの代替の細菌もまた関わり得、本発明の方法および組成物によって対処され得るか、防止され得るか、分散され得るか、または処置され得る。被験体は、ヒトであり得る。被験体は、成人、小児、乳児または胎児であり得る。

【0020】

そのような上記の１つの方法または複数の方法のいずれかにおいて、感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ）であるか、殺滅されるか、分散されるか、または処置されるバイオフィルム細菌は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｚｏｏ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（ＧＢＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＧＡＳ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｇ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａから選択され得る。

【0021】

本発明のいずれかの方法によると、感受性細菌またはバイオフィルム細菌は、抗生物質耐性菌であり得る。細菌は、抗生物質耐性であり得る（メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）、ダプトマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ（ＤＲＳＡ）またはリネゾリド耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＬＲＳＡ）を含む）。その細菌は、変更された抗生物質感性を有し得る（例えば、バンコマイシン中間感性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＩＳＡ）など）。感受性細菌は、特に、ヒトに対して臨床的に関与性の細菌または病原菌であり得る。その方法（複数可）の態様において、溶解素ポリペプチド（複数可）は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ菌株を殺滅するのに有効である。

【0022】

抗微生物薬で医療用埋め込み物をコーティングすることにより、その埋め込み物にブドウ球菌のバイオフィルムが初めて接着するのが効率的に防止され得ることが示されている。生物医学的材料を溶解素でコーティングすることによってもまた、ブドウ球菌を含む細菌が早い段階でその埋め込み物に接着するのが防止され、ゆえにバイオフィルム形成の回避に成功することが証明され得る。ゆえに、本発明は、ＰｌｙＳｓ２溶解素を含む本発明の溶解素を投与するかまたはそれでコーティングすることによって、デバイス、埋め込み物、分離膜（例えば、パーベーパレーション膜、透析膜、逆浸透膜、限外濾過膜および精密濾過膜）の表面上のバイオフィルムの増殖を減少させるためまたは防止するための方法も提供する。

【0023】

有用な溶解素（複数可）および／または１つもしくは複数のさらなる有効かつ有用な溶解素などを含む活性で好適な代替の溶解素（複数可）が、本発明の方法および組成物に従って利用され得る。本明細書中に提供される方法および使用のさらなる態様または実施形態において、ブドウ球菌特異的溶解素ＣｌｙＳは、本明細書中において、単独でまたは本明細書中に提供されるおよび記載されるようなＰｌｙＳｓ２溶解素と併用して使用される。

【0024】

本発明は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
グラム陽性菌のバイオフィルムの防止、破壊または処置のための方法であって、該方法は、ブドウ球菌を殺滅することができる溶解素ポリペプチドを含む組成物とバイオフィルムとを接触させる工程を含み、ここで、該バイオフィルムは、効果的に防止されるか、分散されるか、または処置される、方法。
（項目２）
前記溶解素ポリペプチドが、ＰｌｙＳｓ２である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記溶解素ポリペプチドが、図５に示されているようなアミノ酸配列（配列番号１）、または図５のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記バイオフィルム内の前記グラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記組成物が、１つまたは複数の抗生物質をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記抗生物質が、ダプトマイシン、バンコマイシンおよびリネゾリドから選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記バイオフィルムを１つまたは複数の抗生物質と接触させる工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
グラム陽性菌のバイオフィルム形成を防止するまたは減少させる方法であって、該方法は、ブドウ球菌を殺滅することができる溶解素ポリペプチドを含む組成物と医療用デバイス、カテーテルまたは埋め込み物を接触させる工程を含み、ここで、該溶解素は、ＰｌｙＳｓ２である、方法。
（項目８）
前記溶解素ポリペプチドが、図５に示されているようなアミノ酸配列（配列番号１）、または図５のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、前記医療用デバイス、カテーテルもしくは埋め込み物における細菌バイオフィルムの形成もしくは細菌の付着および増殖を防止するかまたは減少させるのに有効である、そのバリアントを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記組成物が、抗生物質をさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記抗生物質が、ダプトマイシン、バンコマイシンおよびリネゾリドまたは関連化合物から選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
図５に示されているようなアミノ酸配列（配列番号１）、または図５のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、グラム陽性菌のバイオフィルム内のグラム陽性菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む溶解素ポリペプチドを含む、該バイオフィルムの防止、破壊または処置において使用するための組成物。
（項目１２）
１つまたは複数の抗生物質をさらに含む、項目１１に記載の組成物。
（項目１３）
前記抗生物質が、ダプトマイシン、バンコマイシンおよびリネゾリドまたは関連化合物から選択される、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
図５に示されているようなアミノ酸配列（配列番号１）、または図５のポリペプチド（配列番号１）に対して少なくとも８０％の同一性を有し、ブドウ球菌もしくは連鎖球菌を殺滅するのに有効である、そのバリアントを含む溶解素ポリペプチドを含む、該連鎖球菌またはブドウ球菌のバイオフィルムの防止、破壊または処置のための組成物。
（項目１５）
１つまたは複数の抗生物質をさらに含む、項目１４に記載の組成物。
他の目的および利点は、以下の例証的な図面を参照して進められる以下の記載の精査から当業者に明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、４時間までの示されている時間にわたって、示されている量のダプトマイシン、バンコマイシン、ＰｌｙＳｓ２溶解素またはリネゾリドで処理されたＢＡＡ－４２ ＭＲＳＡのバイオフィルムを示している。各抗生物質について１０００×ＭＩＣの抗生物質ダプトマイシン、バンコマイシンおよびリネゾリドを加えた。１×ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２を加えた。処理後、バイオフィルムをクリスタルバイオレットで可視化する。

【0026】

【図2】図２は、６時間までの示されている時間にわたって、示されている量のダプトマイシン、バンコマイシン、ＰｌｙＳｓ２溶解素またはリネゾリドで処理されたＢＡＡ－４２ ＭＲＳＡのバイオフィルムを示している。処理後、バイオフィルムをクリスタルバイオレットで可視化する。

【0027】

【図3】図３は、２４時間までの示されている時間にわたって、示されている量のダプトマイシン、バンコマイシン、ＰｌｙＳｓ２溶解素またはリネゾリドで処理されたＢＡＡ－４２ ＭＲＳＡのバイオフィルムを示している。処理後、バイオフィルムをクリスタルバイオレットで可視化する。

【0028】

【図4】図４は、示されている投与量のＰｌｙＳｓ２溶解素またはダプトマイシンで０．５時間、１時間、４時間および２４時間処理された、２４ウェルディッシュ内のＢＡＡ－４２ ＭＲＳＡのバイオフィルムを示している。処理後、バイオフィルムをクリスタルバイオレットで可視化する。

【0029】

【図5】図５は、溶解素ＰｌｙＳｓ２のアミノ酸配列（配列番号１）およびコード核酸配列（配列番号２）を提供している。ＰｌｙＳｓ２溶解素のＮ末端のＣＨＡＰドメインおよびＣ末端のＳＨ－３ドメインは網掛けされており、ＣＨＡＰドメインは、ＬＮＮ．．．から始まり、．．．ＹＩＴで終わり（配列番号３）、ＳＨ－３ドメインは、ＲＳＹ．．．から始まり、．．．ＶＡＴで終わる（配列番号４）。ＰＤＢ ２Ｋ３Ａ（Ｒｏｓｓｉ Ｐら（２００９）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７４：５１５－５１９）に対する相同性によって同定されたＣＨＡＰドメインの活性部位残基（Ｃｙｓ_２６、Ｈｉｓ_１０２、Ｇｌｕ_１１８およびＡｓｎ_１２０）に下線が引かれている。

【0030】

【図6】図６は、クリスタルバイオレット染色によって評価された、ＭＲＳＡバイオフィルムに対するＰｌｙＳｓ２および抗生物質の活性の２４時間の経時的解析を提供している。抗生物質ダプトマイシン（ＤＡＰ）、バンコマイシン（ＶＡＮ）およびリネゾリド（ＬＺＤ）を各抗生物質について１０００×ＭＩＣで加えた。１×ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２を加えた。

【0031】

【図7】図７は、ＭＲＳＡバイオフィルムに対するＰｌｙＳｓ２および抗生物質の活性の２４時間の経時的解析において保持されていたバイオフィルムの指標として保持されていた色素の定量を示している。各抗生物質について１０００×ＭＩＣの抗生物質ダプトマイシン（ＤＡＰ）、バンコマイシン（ＶＡＮ）およびリネゾリド（ＬＺＤ）を加えた。１×ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２を加えた。

【0032】

【図8】図８は、クリスタルバイオレット染色によって評価された、ＭＲＳＡバイオフィルムに対するＭＩＣ未満の濃度のＰｌｙＳｓ２の２４時間の時間経過を培地のみと比べて示している。ＰｌｙＳｓ２を０．１×ＭＩＣおよび０．０１×ＭＩＣレベルでＭＲＳＡ菌株ＢＡＡ－４２バイオフィルムに加えた。

【0033】

【図9】図９Ａおよび９Ｂは、ＤＥＰＣカテーテル上に成長したＭＲＳＡに対するバイオフィルム根絶研究を示している。Ａ：カテーテルバイオフィルムを、培地のみ、１×ＭＩＣ ダプトマイシン、１０００×ＭＩＣ ダプトマイシンおよび１×ＭＩＣ ＰｌｙＳｓ２で２４時間処理した後、フラッシングし（ｆｌｕｓｈｉｎｇ）、メチレンブルーで染色し、写真撮影した。Ｂ：処理の２４時間後、２つ組のカテーテルサンプルを、溶解緩衝液で処理して残留バイオフィルムを除去し、細菌のＣＦＵを、ルシフェラーゼ試薬を使用し、既知濃度の細菌に対して較正した相対発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ）に基づいて推定した。

【0034】

【図10】図１０は、緩衝液、または１×ＭＩＣ、０．１×ＭＩＣ、０．０１×ＭＩＣ、０．００１×ＭＩＣ、０．０００１×ＭＩＣおよび０．００００１×ＭＩＣ ＰｌｙＳｓ２の滴定したＭＩＣのＰｌｙＳｓ２で４時間処理した後にメチレンブルーで染色するＤＥＰＣカテーテルのＭＲＳＡバイオフィルムの滴定解析を示している。

【0035】

【図11】図１１は、緩衝液、または５０００×ＭＩＣ、１０００×ＭＩＣ、１００×ＭＩＣ、１０×ＭＩＣおよび１×ＭＩＣの滴定したダプトマイシン（ＤＡＰ）で４時間処理した後にメチレンブルーで染色するＤＥＰＣカテーテルのＭＲＳＡバイオフィルムの滴定解析を示している。

【0036】

【図12】図１２ＡおよびＢは、ＤＥＰＣカテーテル内のＭＲＳＡバイオフィルムに対するＰｌｙＳｓ２活性の経時的解析を示している。Ａ：カテーテルを、１×ＭＩＣ ＰｌｙＳｓ２（３２μｇ／ｍｌ）で５分間、１５分間、３０分間、６０分間、９０分間、２時間、３時間、４時間および５時間処理した後、フラッシングし、メチレンブルーで処理し、写真撮影した。Ｂ：各時間の処理の後、２つ組のカテーテルサンプルを、溶解緩衝液で処理して残留バイオフィルムを取り出し、細菌のＣＦＵを、ルシフェラーゼ試薬を使用し、既知濃度の細菌に対して較正した相対発光量に基づいて推定した。

【0037】

【図13】図１３は、図１１および１２に示された研究に従って、ＤＥＰＣカテーテルのＭＲＳＡバイオフィルムを示されている薬物濃度で４時間処理した後の、そのカテーテル（ｃａｔｈｅｔｈｅｒ）のバイオフィルムのＣＦＵ数の滴定解析を示している。薬物処理後に残存している細菌のＣＦＵを、ルシフェラーゼ試薬を使用し、既知濃度の細菌に対して較正した相対発光量に基づいて推定した。ジ（２－エチルヘキシル）フタレート（ＤＥＨＰ）カテーテルの管腔上にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２によって形成されたバイオフィルムを、示されている濃度のＰｌｙＳｓ２またはダプトマイシン（ＤＡＰ）で４時間処理した。乳酸加リンガー溶液のみをコントロールとして含めた。処理後、そのカテーテルから排出して洗浄し、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）放出に基づく方法（ＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^ＴＭ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙキット）を使用して測定した。赤色の線は、処理されたカテーテルチューブにおいてバイオフィルムのおおよそ等価な減少をもたらした、５０００×最小阻止濃度（ＭＩＣ）のＤＡＰの濃度および０．０１×ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２を示している。略語一覧：^＊＝検出閾値未満。

【0038】

【図14】図１４は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムに対する溶解素ＣｌｙＳの活性を示している。ＢＡＡ－４２ ＭＲＳＡのバイオフィルムを、示されている濃度のＣｌｙＳ溶解素（１×ＭＩＣ ３２μｇ／ｍｌ、０．１×ＭＩＣ ３．２μｇ／ｍｌ、０．０１×ＭＩＣ ０．３２μｇ／ｍｌおよび０．００１×ＭＩＣ ０．０３２μｇ／ｍｌ）または培地のみで２４時間処理した。各ウェルを洗浄し、２％クリスタルバイオレットで染色した。

【0039】

【図15】図１５は、様々な投与様式によってＰｌｙＳｓ２溶解素で処置した、皮下カテーテル埋め込み物を有するマウスにおけるインビボでのバイオフィルム研究の結果を提供している。バイオフィルムをカテーテル上で増殖させ、そのカテーテルをマウスに埋め込み、そのマウスを処置する。カテーテルを取り出し、メチレンブルーで染色し、その染色を６００ｎｍにおける吸光度によって定量した。ネガティブコントロール（細菌なし）、ＰｌｙＳｓ２コントロール（細菌なしのモック（ｍｏｃｋ）処置）、ビヒクル処置、ＰｌｙＳｓ２腹腔内投与（ＩＰ）、ＰｌｙＳｓ２静脈内投与（ＩＶ）およびＰｌｙＳｓ２皮下投与（ＳＣ）の各々に対するカテーテルの６００ｎｍ／ｇのＯＤをグラフで表している。

【0040】

【図16】図１６は、ＰｌｙＳＳ２溶解素またはダプトマイシンで処置した、ＭＲＳＡカテーテルバイオフィルムの管腔の内容物を評価し、ＰｌｙＳｓ２または抗生物質ダプトマイシンの処置による経時的な細菌生存能および管腔の滅菌について評価する、経時的研究を示している。

【0041】

【図17】図１７は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ菌株ＣＦＳ３１３（ＮＲＳ３４，ＶＩＳＥ菌株）の細菌バイオフィルムを用いたカテーテル研究の滴定解析を示している。緩衝液、または１０×ＭＩＣ、１×ＭＩＣ（８μｇ／ｍｌ）、０．１×ＭＩＣ、０．０１×ＭＩＣ、０．００１×ＭＩＣおよび０．０００１×ＭＩＣ ＰｌｙＳｓ２という滴定ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２で４時間処理した後のメチレンブルーによるバイオフィルムの染色を示している。

【0042】

【図18】図１８は、２４ウェルプレートに接種され、直ちに緩衝液もしくは１×ＭＩＣ（３２μｇ／ｍｌ）のＰｌｙＳｓ２、または０．０００１×ＭＩＣまでの記述されている希釈物と混和された、ＢＡＡ－４２ ＭＲＳＡ細菌のバイオフィルム防止アッセイを示している。そのプレートを６時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレットで染色することにより、バイオフィルムの生成を調べ、写真撮影した。

【0043】

【図19】図１９は、緩衝液、または１０×ＭＩＣ、１×ＭＩＣ（１６μｇ／ｍｌ）、０．１×ＭＩＣ、０．０１×ＭＩＣおよび０．００１×ＭＩＣ ＰｌｙＳｓ２という滴定ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２で４時間処理した後にメチレンブルーで染色するカテーテルのＭＲＳＡ菌株ＣＦＳ５５３（ＡＴＣＣ４３３００）バイオフィルムの滴定解析を示している。

【0044】

【図20】図２０は、緩衝液、または１０×ＭＩＣ、１×ＭＩＣ（３２μｇ／ｍｌ）、０．１×ＭＩＣ、０．０１×ＭＩＣおよび ０．００１×ＭＩＣ ＰｌｙＳｓ２という滴定ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２で４時間処理した後にメチレンブルーで染色するカテーテルのＭＲＳＡ菌株ＣＦＳ９９２（ＪＭＩ５３８１）バイオフィルムの滴定解析を示している。

【0045】

【図21】図２１は、ＰｌｙＳｓ２で処理し、洗浄し、固定し、走査した、３日経過したカテーテルＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムの走査型電子顕微鏡像（ＳＥＭ）を示している。０分間、３０秒間および１５分間のＰｌｙＳｓ２処理が示されている。５０００×倍率。

【発明を実施するための形態】

【0046】

詳細な説明
本発明によると、当該分野の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの技法が使用されることがある。そのような技法は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］；“Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４））］；“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）を参照のこと。

【0047】

ゆえに、以下の用語が本明細書中に現れた場合、それらは、以下に示される定義を有するものとする。

【0048】

用語「ＰｌｙＳｓ溶解素（複数可」、「ＰｌｙＳｓ２溶解素」、「ＰｌｙＳｓ２」および具体的に列挙されない任意の変化形は、本明細書中で交換可能に使用されてもよく、本願全体および特許請求の範囲全体で使用されるとき、単一または複数のタンパク質を含むタンパク質性材料のことを指し、本明細書中に記載され、図５および配列番号１に提示されるアミノ酸配列データ、ならびに本明細書中および特許請求の範囲に示される活性のプロファイルを有するタンパク質にまで及ぶ。したがって、実質的に等価な活性または変更された活性を示すタンパク質が、同様に企図される。これらの改変は、例えば、部位特異的変異誘発によって得られる改変などの計画的なものであり得るか、または複合体もしくはその指定されたサブユニットの産生者である宿主内での変異によって得られる改変などの偶発的なものであり得る。また、用語「ＰｌｙＳｓ溶解素（複数可）」、「ＰｌｙＳｓ２溶解素」、「ＰｌｙＳｓ２」は、本明細書中に具体的に列挙されるタンパク質、ならびに実質的に相同なアナログ、フラグメントまたは短縮化物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）および対立遺伝子バリエーションのすべてをそれらの範囲内に含むと意図される。ＰｌｙＳｓ２溶解素は、米国特許出願６１／４７７，８３６およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／３４４５６に記載されている。より最近の論文でＧｉｌｍｅｒらは、ＰｌｙＳｓ２溶解素を記載している（Ｇｉｌｍｅｒ ＤＢら（２０１３）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｐｒｉｌ ９［ＰＭＩＤ ２３５７１５３４］）。

【0049】

用語「ＣｌｙＳ」、「ＣｌｙＳ溶解素」とは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含むブドウ球菌に対する活性を有するキメラ溶解素ＣｌｙＳのことを指し、それは、ＷＯ２０１０／００２９５９に詳述されており、Ｄａｎｉｅｌら（Ｄａｎｉｅｌ，Ａら（２０１０）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５４（４）：１６０３－１６１２）にも記載されている。例示的なＣｌｙＳアミノ酸配列は、配列番号５に提供されている。そのようなＣｌｙＳの例示的なアミノ酸配列は、配列番号５に提供されている。

【0050】

「溶解酵素」は、好適な条件下で、適切な期間の間に、１つまたは複数の細菌を殺滅する任意の細菌細胞壁溶解酵素を含む。溶解酵素の例としては、様々なアミダーゼ細胞壁溶解酵素が挙げられるがこれに限定されない。

【0051】

「バクテリオファージ溶解酵素」とは、バクテリオファージから抽出されるかもしくは単離される溶解酵素、または溶解酵素の機能を維持する類似のタンパク質構造を有する合成された溶解酵素のことを指す。

【0052】

溶解酵素は、細菌細胞のペプチドグリカンに存在する結合を特異的に切断して、細菌細胞壁を破壊することができる。細菌細胞壁ペプチドグリカンがほとんどの細菌の間で高度に保存されていること、およびほんのいくつかの結合の切断だけで細菌細胞壁が破壊され得ることも現在、自明のこととみなされている。バクテリオファージ溶解酵素は、アミダーゼであり得るが、他のタイプの酵素でもあり得る。これらの結合を切断する溶解酵素の例は、ムラミダーゼ、グルコサミニダーゼ、エンドペプチダーゼまたはＮ－アセチル－ムラモイル－Ｌ－アラニンアミダーゼである。Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら（１９７４）は、Ｃ１連鎖球菌ファージ溶解素酵素がアミダーゼであることを報告した。Ｇａｒｃｉａら（１９８７，１９９０）は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＣｐ－１ファージ由来のＣｐｌ溶解素がリゾチームであることを報告した。ＣａｌｄｅｎｔｅｙおよびＢａｍｆｏｒｄ（１９９２）は、ｐｈｉ６ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓファージ由来の溶解酵素が、メソ－ジアミノピメリン酸（ｍｅｌｏ－diaminopemilic ａｃｉｄ）およびＤ－アラニンによって形成さ
れたペプチド架橋を開裂するエンドペプチダーゼであることを報告した。大腸菌Ｔ１およびＴ６ファージの溶解酵素は、リステリアファージ由来の溶解酵素（ｐｌｙ）と同様のアミダーゼである（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、１９９６）。細菌細胞壁を切断することができる当該分野で公知の他の溶解酵素も存在する。

【0053】

「バクテリオファージによって遺伝的にコードされる溶解酵素」は、例えば、宿主細菌に対する少なくともいくらかの細胞壁溶解活性を有することによって、宿主細菌を殺滅することができるポリペプチドを含む。そのポリペプチドは、天然配列の溶解酵素およびそのバリアントを包含する配列を有し得る。そのポリペプチドは、バクテリオファージ（「ファージ」）などの種々の起源から単離され得るか、または組換え法もしくは合成法によって調製され得る。そのポリペプチドは、カルボキシル末端側にコリン結合部分を含み得、アミノ末端側における、細胞壁ペプチドグリカンを切断することができる酵素活性（例えば、ペプチドグリカン中のアミド結合に対して作用するアミダーゼ活性）を特徴とし得る。複数の酵素活性、例えば、２つの酵素ドメインを含む溶解酵素、例えば、ＰｌｙＧＢＳ溶解素が報告されている。

【0054】

「天然配列のファージ関連溶解酵素」は、細菌に由来する酵素と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列の酵素は、単離され得るか、または組換え手段もしくは合成手段によって作製され得る。

【0055】

用語「天然配列の酵素」は、その酵素の天然に存在する形態（例えば、選択的スプライシングされた形態または変更された形態）および天然に存在するバリアントを包含する。本発明の１つの実施形態において、天然配列の酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージ由来の遺伝子によって遺伝的にコードされる、成熟ポリペプチドまたは完全長ポリペプチドである。当然のことながら、Ｌｏｐｅｚら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ３：１９９－２１１（１９９７）；Ｇａｒｃｉａら、Ｇｅｎｅ ８６：８１－８８（１９９０）；Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：９１４－９１８（１９８８）；Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：９１４－９１８（１９８８）；Ｇａｒｃｉａら、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｊ．Ｊ．Ｆｅｒｒｅｔｔｉ ａｎｄ Ｃｕｒｔｉｓ ｅｄｓ．，１９８７）；Ｌｏｐｅｚら、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１００：４３９－４４８（１９９２）；Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：５０６４－５０７０（１９９０）；Ｒｏｎｄａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４：６２１－６２４（１９８７）およびＳａｎｃｈｅｚら、Ｇｅｎｅ ６１：１３－１９（１９８７）などの刊行物において認められているように、いくつかのバリアントが存在し得、公知である。これらの参考文献の各々の内容、特に、配列表、および配列相同性に関する記載を含むそれらの配列を比較する付属のテキストは、それらの全体が明確に参照により援用される。

【0056】

「バリアント配列の溶解酵素」は、溶解酵素のポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を特徴とするが機能活性を保持している溶解酵素を含む。その溶解酵素は、いくつかの実施形態において、図５および配列番号１に提供されるようなその溶解酵素配列（複数可）と特定のアミノ酸配列同一性を有するＰｌｙＳｓ２の場合のように、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージによって遺伝的にコードされ得る。例えば、いくつかの実施形態において、機能的に活性な溶解酵素は、細菌の細胞壁を破壊することによって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ菌、ならびに表１、２および３に示されているような細菌を含む本明細書中に提供されるような他の感受性細菌を殺滅し得る。活性な溶解酵素は、図５および配列番号１に提供されるような本明細書の溶解酵素配列（複数可）と６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９または９９．５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。そのようなファージ関連溶解酵
素バリアントは、例えば、図５および配列番号１に提供されるような本明細書の溶解酵素配列（複数可）の配列のＮまたはＣ末端において１つまたは複数のアミノ酸残基が付加されているかまたは欠失されている溶解酵素ポリペプチドを含む。

【0057】

特定の態様において、ファージ関連溶解酵素は、天然のファージ関連溶解酵素配列と少なくとも約８０％または８５％のアミノ酸配列同一性、特に、少なくとも約９０％（例えば、９０％）のアミノ酸配列同一性を有する。最も詳細には、ファージ関連溶解酵素バリアントは、ＰｌｙＳｓ２溶解素について図５および配列番号１に提供されるような、またはＣｌｙＳについて以前に記載されたような（ＷＯ２０１０／００２９５９およびＤａｎｉｅｌら（Ｄａｎｉｅｌ，Ａら（２０１０）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ
ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５４（４）：１６０３－１６１２）ならびに配列番号５に記載されているようなものを含む）、本明細書の天然のファージ関連溶解酵素の配列（複数可）と少なくとも約９５％（例えば、９５％）のアミノ酸配列同一性を有し得る。

【0058】

同定されたファージ関連溶解酵素配列に関する「パーセントアミノ酸配列同一性」は、該配列を同じ読み枠でアラインメントし、必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を得た後、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、ファージ関連溶解酵素配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書中で定義される。

【0059】

本明細書中で同定されたファージ関連溶解酵素配列に関する「パーセント核酸配列同一性」は、該配列をアラインメントし、必要であればギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を得た後の、ファージ関連溶解酵素配列中のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセンテージと定義される。

【0060】

２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性パーセントを決定するために、それらの配列を最適な比較目的でアラインメントする（例えば、第１のヌクレオチド配列の配列にギャップが導入され得る）。次いで、対応するヌクレオチドまたはアミノ酸の位置におけるヌクレオチドまたはアミノ酸を比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸によって占められているとき、それらの分子は、その位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝（同一の位置の数／位置の総数）×１００）。

【0061】

２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。２つの配列を比較するために利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、本発明のヌクレオチド配列と所望の同一性を有する配列を同定するために使用され得るＮＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている、Ｋａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３－５８７７（１９９３）のアルゴリズムである。比較目的でギャップが導入されたアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されているようなＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータが使用され得る。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって提供されるプログラムを参照のこと。

【0062】

「ポリペプチド」は、直鎖状の様式でつながった複数のアミノ酸からなるポリマー分子を含む。ポリペプチドは、いくつかの実施形態において、天然に存在するポリヌクレオチ
ド配列によってコードされる分子に対応し得る。そのポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸が類似の特性を有するもので置き換えられた保存的置換を含み得、ここで、そのような保存的置換は、そのポリペプチドの機能を変化させない。

【0063】

用語「変更された溶解酵素」は、シャフリングした（ｓｈｕｆｆｌｅｄ）および／またはキメラの溶解酵素を含む。

【0064】

特定のファージが感染する細菌に特異的なファージ溶解酵素は、問題の細菌の細胞壁を効果的および効率的に壊すことが見出されている。その溶解酵素は、タンパク分解性の酵素活性を欠いていると考えられ、ゆえに、細菌細胞壁の消化中に存在しても、哺乳動物のタンパク質および組織に対して非破壊性である。さらに、ファージ溶解酵素の作用は、抗生物質とは異なって、標的病原体（複数可）に特異的であることが見出されているので、正常な細菌叢は、本質的にインタクトなままである（参照により本明細書中に援用されるＭ．Ｊ．Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，Ｇ．Ｗｅｎｄｌｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １６，１２３１－４１．（１９９５））。実際に、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、独特の広範な細菌種および菌株の殺滅を示しつつ、本明細書中に記載されるような、大腸菌を含む正常な細菌叢を構成する細菌に対して比較的および特に不活性である。

【0065】

本発明において有用な溶解酵素またはポリペプチドは、感染の徴候を有する他の者に曝された者が病気になることを妨げるための予防的処置として、またはその感染によってすでに病気になった者に対する治療的処置として、特定のバクテリオファージに感染した後の細菌生物によって産生され得るか、または組換え的にもしくは合成的に産生され得るかもしくは調製され得る。溶解素ポリペプチド配列およびその溶解素ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書中に記載され、言及されている限り、その溶解酵素（複数可）／ポリペプチドは、好ましくは、本明細書中に例証されるような方法を含む当該分野の標準的な方法を用いて、ファージゲノム由来の溶解酵素に対する遺伝子を単離し、その遺伝子をトランスファーベクターに入れ、上記トランスファーベクターを発現系にクローニングすることを介して、生成され得る。その溶解酵素またはポリペプチドは、短縮化された、キメラ、シャフリングした、または「天然」のものであり得、組み合わせであり得る。関連性のある米国特許第５，６０４，１０９号は、その全体が参照により本明細書に援用される。「変更された」溶解酵素は、いくつかの方法で生成され得る。好ましい実施形態において、ファージゲノム由来の、変更された溶解酵素用の遺伝子は、トランスファーベクターまたは移動可能なベクター、好ましくは、プラスミドに入れられ、そのプラスミドは、発現ベクターまたは発現系にクローニングされる。本発明の溶解素ポリペプチドまたは溶解素酵素を生成するための発現ベクターは、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓまたは他のいくつかの好適な細菌に好適なものであり得る。そのベクター系は、無細胞発現系でもあり得る。遺伝子または遺伝子セットを発現させるこれらの方法のすべてが、当該分野で公知である。溶解酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓをＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｓｕｉｓに特異的なバクテリオファージに感染させることによっても作製され得、ここで、上記少なくとも１つの溶解酵素は、上記Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓの細胞壁をもっぱら溶解し、他のもの、例えば、存在する天然または共生の細菌叢に対して多くとも最小効果しか有しない。（様々な共生ヒト腸細菌に対する溶解活性研究の結果を提供している表５を参照のこと）。

【0066】

「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチドに作動可能に連結された、本発明において有用なポリペプチドの全部または（好ましくは、生物学的に活性な）一部を含む。キメラタンパク質またはキメラペプチドは、例えば、２つ以上の活性部位を有する２つ以上のタンパク質を組み合わせることによって、生成される。キメラタンパク質およびキメラペプチドは、同じ分子または異なる分子に対して独立して作用し得るがゆえに、２つ以上の異なる細菌感染症を同時に処置する潜在能力を有する。キメラタ
ンパク質およびキメラペプチドは、細胞壁を２つ以上の位置において切断することによって、細菌感染症を処置するためにも使用され得、単一の溶解素分子またはキメラペプチドから潜在的により迅速または効果的な（または相乗的な）殺滅を提供する。

【0067】

ＤＮＡ構築物またはペプチド構築物の「異種」領域は、より大きなＤＮＡ分子内のＤＮＡまたはより大きなペプチド分子内のペプチドの同定可能なセグメントであって、天然には、そのより大きな分子と会合した状態で見出されない、セグメントである。したがって、異種領域が、哺乳動物遺伝子をコードするとき、その遺伝子は、通常、起源の生物のゲノムではその哺乳動物ゲノムＤＮＡと隣接しないＤＮＡに隣接している。異種コード配列の別の例は、そのコード配列自体が天然では見出されない構築物（例えば、ゲノムコード配列がイントロンを含むｃＤＮＡ、または天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子バリエーションまたは天然に存在する変異イベントは、本明細書中で定義されるようなＤＮＡまたはペプチドの異種領域を生じさせない。

【0068】

用語「作動可能に連結された」は、本開示のポリペプチドと異種ポリペプチドとがインフレームで融合されていることを意味する。異種ポリペプチドは、本開示のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。キメラタンパク質は、化学合成または組換えＤＮＡ技術によって、酵素的に生成される。いくつかのキメラ溶解酵素が、生成されており、研究されている。有用な融合タンパク質の１つの例は、本開示のポリペプチドがＧＳＴ配列のＣ末端に融合されたＧＳＴ融合タンパク質である。そのようなキメラタンパク質は、本開示の組換えポリペプチドの精製を促進し得る。

【0069】

別の実施形態において、キメラタンパク質またはキメラペプチドは、そのＮ末端に異種のシグナル配列を含む。例えば、本開示のポリペプチドの天然のシグナル配列が、除去されて、別の公知のタンパク質由来のシグナル配列で置き換えられ得る。

【0070】

融合タンパク質は、異なる能力を有するかまたは追加の能力を提供するかまたは溶解素ポリペプチドに特色を付加するタンパク質またはポリペプチドと、溶解素ポリペプチドを組み合わせ得る。融合タンパク質は、本開示のポリペプチドの全部または一部が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーに由来する配列に融合されている、免疫グロブリン融合タンパク質であり得る。その免疫グロブリンは、抗体、例えば、感受性細菌または標的細菌の表面タンパク質またはエピトープに向けられた抗体であり得る。その免疫グロブリン融合タンパク質は、本開示のポリペプチドの同族リガンドのバイオアベイラビリティを変化させ得る。リガンド／レセプター相互作用の阻害は、細菌に関連する疾患および障害の処置と、細胞生存の調整（すなわち、促進または阻害）との両方にとって、治療的に有用であり得る。融合タンパク質は、特定の組織もしくは器官または表面（例えば、デバイス、プラスチック、膜）に対して溶解素を方向づけるまたは標的化する手段を含み得る。本開示のキメラタンパク質および融合タンパク質ならびにキメラペプチドおよび融合ペプチドは、標準的な組換えＤＮＡ法によって生成され得る。

【0071】

本明細書中に開示されるようなタンパク質またはペプチドおよびペプチドフラグメントの改変された形態または変更された形態は、化学的に合成されたもしくは組換えＤＮＡ法によって調製されたまたはその両方のタンパク質またはペプチドおよびペプチドフラグメントを含む。これらの技法としては、例えば、キメラ化およびシャフリングが挙げられる。本明細書中で使用されるとき、２つ以上の関係するファージタンパク質またはタンパク質ペプチドフラグメントに対するシャフリングしたタンパク質もしくはペプチド、遺伝子産物またはペプチドは、ランダムに切断され、より活性または特異的なタンパク質に再構成される。シャフリングしたオリゴヌクレオチド、ペプチドまたはペプチドフラグメント分子を選択するかまたはスクリーニングすることにより、所望の機能特性を有する分子が同定される。シャフリングを用いることにより、鋳型タンパク質よりも活性な、例えば、
最大１０～１００倍活性なタンパク質を作製することができる。鋳型タンパク質は、種々の様々な溶解素タンパク質の中から選択される。シャフリングしたタンパク質またはペプチドは、例えば、１つまたは複数の結合ドメインおよび１つまたは複数の触媒ドメインを構成する。そのタンパク質またはペプチドが、化学合成によって生成されるとき、それは、好ましくは、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、それは、そのタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離される。したがって、タンパク質のそのような調製物は、目的のポリペプチド以外の化学前駆体または化合物を約３０％、２０％、１０％、５％未満（乾燥重量基準）しか有しない。

【0072】

本発明は、本発明において有用なポリペプチドの他のバリアントにも関する。そのようなバリアントは、アゴニスト（模倣物）またはアンタゴニストとして機能し得る変更されたアミノ酸配列を有し得る。バリアントは、変異誘発、すなわち、不連続な点変異または短縮化によって、作製され得る。アゴニストは、そのタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性の実質的に同じ生物学的活性またはサブセットを保持し得る。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的のタンパク質を含む細胞シグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーと競合的に結合することによって、そのタンパク質の天然に存在する形態の活性の１つまたは複数を阻害し得る。したがって、特異的な生物学的効果は、限られた機能のバリアントで処理することによって誘導され得る。そのタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有するバリアントによる被験体の処置は、そのタンパク質の天然に存在する形態による処置と比べて少ない副作用を被験体にもたらし得る。アゴニスト（模倣物）またはアンタゴニストとして機能する本開示において有用なタンパク質のバリアントは、本開示のタンパク質の短縮化変異体などの変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定され得る。１つの実施形態において、変化に富んだバリアントライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって作製され、それは、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされる。本開示のポリペプチドの潜在的なバリアントのライブラリーを縮重オリゴヌクレオチド配列から作製するために使用され得る種々の方法が存在する。本開示のポリペプチドのコード配列のフラグメントのライブラリーは、バリアント、活性なフラグメントまたは短縮化物をスクリーニングし、その後に選択するための、変化に富んだポリペプチド集団を作製するために使用され得る。点変異または短縮化によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法が、当該分野で公知である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット解析に適用できる最も広く使用されている技法は、代表的には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリーのクローニング、得られたベクターのライブラリーによる適切な細胞の形質転換、およびある条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現を含み、その条件は、所望の活性の検出によって、遺伝子（その産物が検出される）をコードしているベクターの単離が促進される条件である。この文脈において、実施形態によるタンパク質（またはそのタンパク質をコードする核酸）の最も小さい部分は、溶解素タンパク質を生成するファージに特異的なものとして認識可能なエピトープである。したがって、標的またはレセプターに結合すると予想され得、いくつかの実施形態にとって有用な最小のポリペプチド、例えば、抗体（およびそのポリペプチドをコードする関連核酸）は、８、９、１０、１１、１２、１３、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８５または１００アミノ酸長であり得る。８、９、１０、１１、１２または１５アミノ酸長もの短い小さい配列は、標的またはエピトープとして作用するのに十分な構造を確かに含むが、５、６または７アミノ酸長のより短い配列が、いくつかの条件において標的またはエピトープの構造を示し得、ある実施形態では価値があり得る。したがって、図５および配列番号１に示されているものならびに配列番号３および４のドメイン配列を含む本明細書中に提供されるタンパク質（複数可）または溶解素ポリペプチドの最も小さい部分は、５、６、７、８、９、１０、１２、１４または１６アミノ酸長も
の小さいポリペプチドを含む。

【0073】

本明細書中に記載されるように、実施形態のタンパク質またはペプチドフラグメントの生物学的に活性な部分は、本開示の溶解素タンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるかまたはそれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、それは、溶解素タンパク質の完全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、対応する完全長タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。代表的には、生物学的に活性な部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。本開示のタンパク質またはタンパク質フラグメントの生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００程度の（ｌｅｓｓ ｏｒ ｍｏｒｅ）アミノ酸長であるポリペプチドであり得る。さらに、タンパク質の他の領域が欠失されているかまたは付加されている他の生物学的に活性な部分は、組換え法によって調製され得、実施形態のポリペプチドの天然の形態の機能活性の１つまたは複数について評価され得る。

【0074】

当業者によって認識されているように、そのような低分子タンパク質および／または核酸（またはより大きな分子のタンパク質領域および／もしくは核酸領域）と機能を共有する相同タンパク質および相同核酸が調製され得る。特に相同であり得る、より大きな分子のそのような小分子および短い領域が、実施形態として意図されている。好ましくは、そのような有益な領域の相同性は、図５および配列番号１に示されているものならびに配列番号３および４のドメイン配列を含む本明細書中に提供される溶解素ポリペプチドと比べて、少なくとも５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または少なくとも９９％である。これらのパーセント相同性の値は、保存的アミノ酸置換に起因する変更を含まない。

【0075】

２つのアミノ酸配列は、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、好ましくは、少なくとも約９０または９５％）が同一であるかまたは保存的置換を示すとき、「実質的に相同」である。比較可能な溶解素（例えば、比較可能なＰｌｙＳｓ２溶解素または比較可能なＣｌｙＳ溶解素）の配列は、溶解素ポリペプチドのアミノ酸の１つまたは複数またはいくつかまたは最大１０％または最大１５％または最大２０％が、類似のまたは保存的なアミノ酸置換で置換されるとき、実質的に相同であり、ここで、それらの比較可能な溶解素は、本明細書中に開示される溶解素（例えば、ＰｌｙＳｓ２溶解素および／またはＣｌｙＳ溶解素）の活性、抗菌効果および／または細菌特異性のプロファイルを有する。

【0076】

本明細書中に記載されるアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体であることが好ましい。しかしながら、免疫グロブリン結合に関する所望の機能（ｆｕｃｔｉｏｎａｌ）特性がそのポリペプチドによって保持される限り、「Ｄ」異性体である残基も、任意のＬ－アミノ酸残基の代わりに用いることができる。ＮＨ_２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基のことを指す。ＣＯＯＨとは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基のことを指す。標準的なポリペプチド命名法であるＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２－５９（１９６９）に一致して、アミノ酸残基に対する省略形を以下の対応表に示す：
対応表
記号 アミノ酸
１文字 ３文字
Ｙ Ｔｙｒ チロシン
Ｇ Ｇｌｙ グリシン
Ｆ Ｐｈｅ フェニルアラニン
Ｍ Ｍｅｔ メチオニン
Ａ Ａｌａ アラニン
Ｓ Ｓｅｒ セリン
Ｉ Ｉｌｅ イソロイシン
Ｌ Ｌｅｕ ロイシン
Ｔ Ｔｈｒ トレオニン
Ｖ Ｖａｌ バリン
Ｐ Ｐｒｏ プロリン
Ｋ Ｌｙｓ リジン
Ｈ Ｈｉｓ ヒスチジン
Ｑ Ｇｌｎ グルタミン
Ｅ Ｇｌｕ グルタミン酸
Ｗ Ｔｒｐ トリプトファン
Ｒ Ａｒｇ アルギニン
Ｄ Ａｓｐ アスパラギン酸
Ｎ Ａｓｎ アスパラギン
Ｃ Ｃｙｓ システイン

【0077】

特定のコドンが、異なるアミノ酸をコードするコドンに変更されるか、あるアミノ酸が別のアミノ酸の代わりに用いられるか、または１つもしくは複数のアミノ酸が欠失されるように、アミノ酸配列において、または本明細書中のポリペプチドおよび溶解素をコードする核酸配列において（図５および配列番号１に示される溶解素配列において、または配列番号３もしくは４のドメイン配列において、あるいはそれらの活性なフラグメントまたは切断物において、を含む）変異が作製され得る。そのような変異は、通常、最も少ないアミノ酸またはヌクレオチドの変更を可能にすることによって、作製される。この種の置換変異は、非保存的様式で（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から別の分類に属するアミノ酸にコドンを変更することによって）または保存的様式で（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から同じ分類に属するアミノ酸にコドンを変更することによって）、生じるタンパク質においてアミノ酸を変化させることができる。そのような保存的変更は、通常、生じるタンパク質の構造および機能をそれほど変化させない。非保存的変更は、生じるタンパク質の構造、活性または機能を変化させる可能性が高い。本発明は、生じるタンパク質の活性または結合特性を有意に変化させない保存的変更を含む配列を含むと考えられるべきである。

【0078】

以下は、アミノ酸の様々な分類の一例である：
非極性のＲ基を有するアミノ酸
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
無電荷極性のＲ基を有するアミノ酸
グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸（Ｐｈ６．０において負に帯電）
アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸（ｐＨ６．０において正に帯電）
リジン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０において）

【0079】

別の分類は、フェニル基を有するアミノ酸であり得る：
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン

【0080】

別の分類は、分子量（すなわち、Ｒ基のサイズ）に従った分類であり得る：
グリシン ７５ アラニン ８９
セリン １０５ プロリン １１５
バリン １１７ トレオニン １１９
システイン １２１ ロイシン １３１
イソロイシン １３１ アスパラギン １３２
アスパラギン酸 １３３ グルタミン １４６
リジン １４６ グルタミン酸 １４７
メチオニン １４９ ヒスチジン（ｐＨ６．０において） １５５
フェニルアラニン １６５ アルギニン １７４
チロシン １８１ トリプトファン ２０４

【0081】

特に好ましい置換は、以下である：
正電荷が維持され得るような、Ａｒｇの代わりのＬｙｓおよびその逆；
負電荷が維持され得るような、Ａｓｐの代わりのＧｌｕおよびその逆；
遊離－ＯＨが維持され得るような、Ｔｈｒの代わりのＳｅｒ；および
遊離ＮＨ_２が維持され得るような、Ａｓｎの代わりのＧｌｎ。

【0082】

例示的なおよび好ましい保存的アミノ酸置換としては、グルタミン酸（Ｅ）の代わりのグルタミン（Ｑ）およびその逆；バリン（Ｖ）の代わりのロイシン（Ｌ）およびその逆；トレオニン（Ｔ）の代わりのセリン（Ｓ）およびその逆；バリン（Ｖ）の代わりのイソロイシン（Ｉ）およびその逆；グルタミン（Ｑ）の代わりのリジン（Ｋ）およびその逆；メチオニン（Ｍ）の代わりのイソロイシン（Ｉ）およびその逆；アスパラギン（Ｎ）の代わりのセリン（Ｓ）およびその逆；メチオニン（Ｍ）の代わりのロイシン（Ｌ）およびその逆；グルタミン酸（Ｅ）の代わりのリジン（Ｌ）およびその逆；セリン（Ｓ）の代わりのアラニン（Ａ）およびその逆；フェニルアラニン（Ｆ）の代わりのチロシン（Ｙ）およびその逆；アスパラギン酸（Ｄ）の代わりのグルタミン酸（Ｅ）およびその逆；イソロイシン（Ｉ）の代わりのロイシン（Ｌ）およびその逆；アルギニン（Ｒ）の代わりのリジン（Ｋ）およびその逆のいずれかが挙げられる。

【0083】

アミノ酸の置換は、特定の好ましい特性を有するアミノ酸を置換するためにも導入され得る。例えば、Ｃｙｓは、別のＣｙｓとのジスルフィド架橋のための潜在的な部位として導入され得る。Ｈｉｓは、特定の「触媒」部位として導入され得る（すなわち、Ｈｉｓは、酸または塩基として作用することができ、生化学的な触媒における最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、タンパク質の構造内にβ－ターンを誘導するその特定の平面構造を理由に、導入され得る。

【0084】

したがって、当業者は、本明細書中に提供されるＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドの配列の精査ならびに他の溶解素ポリペプチドについての当業者の知識および入手可能な公的な情報に基づいて、溶解素ポリペプチド配列においてアミノ酸の変更または置換を行うことができる。アミノ酸の変更を行って、本明細書中に提供される溶解素（複数可）の配列中の１個または複数個、１個または数個、１個またはいくつか、１～５個、１～１０個またはそのような他の数のアミノ酸を置き換えるかまたは置換することにより、それらの変異体またはバリアントが作製され得る。そのようなそれらの変異体またはバリアントは、ブドウ球菌、連鎖球菌、リステリア菌もしくは腸球菌を含む細菌を殺滅するための、および／または本明細書中に記載されるような、特に本明細書中に提供されるような溶解素（複数可）に匹敵する活性を有するための機能について予測され得るか、または機能もしくは能力について試験され得る。したがって、変更は、溶解素の配列に対して行われ得、配列中に変更を有する変異体またはバリアントは、本明細書中に記載されるおよび例証されるアッセイおよび方法（実施例中のものを含む）を用いて試験され得る。当業者は、本明細書の溶解素（複数可）のドメイン構造に基づいて、合理的な保存的置換もしくは非保存的置換を含む、置換もしくは置き換えに適した、１個または複数個のアミノ酸、１個もしくはいくつかのアミノ酸、および／または置換や置き換えに適さない１つまたは複数のア
ミノ酸を予測し得る。

【0085】

この点において、例示としてＰｌｙＳｓ２溶解素に関して、ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド溶解素は、多岐にわたるクラスのプロファージ溶解酵素であるが、その溶解素は、図５に示されているように、Ｎ末端のＣＨＡＰドメイン（システイン－ヒスチジンアミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ）（配列番号３）およびＣ末端のＳＨ３－タイプ５ドメイン（配列番号４）を含むことに注目する。それらのドメインは、別々の色の網掛け領域のアミノ酸配列中に示されており、ここで、ＣＨＡＰドメインは、ＬＮＮ．．．から始まる最初の網掛けアミノ酸配列領域に対応し、ＳＨ３－タイプ５ドメインは、ＲＳＹ．．．から始まる２番目の網掛け領域に対応する。ＣＨＡＰドメインは、以前に特徴付けられたいくつかの連鎖球菌およびブドウ球菌のファージ溶解素に含まれている。したがって、当業者は、ＰｌｙＳｓ２のＣＨＡＰドメインおよび／またはＳＨ－３ドメインについての置換または置き換えを合理的に作製し得、試験し得る。Ｇｅｎｂａｎｋデータベースとの配列の比較は、例えば、置換のためのアミノ酸を同定するために、ＣＨＡＰおよび／もしくはＳＨ－３ドメイン配列のいずれかもしくは両方、またはＰｌｙＳｓ２溶解素の完全アミノ酸配列でなされ得る。

【0086】

ＰｌｙＳｓ２溶解素は、ブドウ球菌、連鎖球菌、リステリア菌または腸球菌を含むグラム陽性菌の数多くの異なる菌株および種を殺滅する活性および能力を示す。特におよび有意なことに、ＰｌｙＳｓ２は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、特に、抗生物質感性菌株および異なる抗生物質耐性菌株の両方を含むブドウ球菌の菌株の殺滅において活性である。ＰｌｙＳｓ２は、連鎖球菌の菌株の殺滅においても活性であり、Ａ群およびＢ群連鎖球菌株に対して特に有効な殺滅を示す。細菌に対するＰｌｙＳｓ２溶解素の能力は、単離された菌株をインビトロで使用する対数殺滅評価（ｌｏｇ ｋｉｌｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ）に基づいて下記の表１に示される。様々なグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌ならびに抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌株に対するＰｌｙＳｓ２の活性を、下記の表２および３に作表する。相対的な殺滅活性を提供する、それらの細菌に対するＰｌｙＳｓ２のＭＩＣ範囲が記述されている。
表１
ＰｌｙＳｓ２による種々の細菌の増殖の低減（部分的な列挙）

【表1】

表２
感受性菌株および非感受性菌株

【表2】

表３
抗生物質耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対するＰｌｙＳｓ２の活性

【表3】

【0087】

様々な文法上の形態での句「モノクローナル抗体」とは、特定の抗原と免疫反応することができるただ１つの種の抗体結合部位を有する抗体のことを指す。したがって、モノクローナル抗体は、代表的には、それと免疫反応する任意の抗原に対して単一の結合親和性を示す。ゆえに、モノクローナル抗体は、その各部位が異なる抗原に免疫特異的である、複数の抗体結合部位を有する抗体分子；例えば、二重特異性（キメラ）モノクローナル抗体を含んでもよい。

【0088】

用語「特異的」は、特異的結合対の１つのメンバーが、その特異的結合パートナー（複数可）以外の分子に対して有意な結合を示さない状況のことを指すために使用され得る。その用語は、例えば、抗原結合ドメインが、いくつかの抗原によって保持される特定のエピトープに特異的である場合にも当てはまり、その場合、その抗原結合ドメインを保持する特異的結合メンバーは、そのエピトープを保持する様々な抗原に結合することができる。

【0089】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）の意味において広く使用され、換言すると、１つまたは複数の特長または成分の存在を可能にするものである。

【0090】

用語「～から本質的になる」とは、より大きな生成物に共有結合していない生成物、特に、定義された数の残基のペプチド配列のことを指す。しかしながら、本明細書の本発明のペプチドの場合、当業者は、ペプチドのＮまたはＣ末端に対する軽微な改変（例えば、保護基などを付加する末端の化学修飾、例えば、Ｃ末端のアミド化）が、企図され得ることを認識する。

【0091】

用語「単離された」とは、本発明によれば、本発明の溶解素ポリペプチド（複数可）またはそのようなポリペプチドをコードする核酸が存在する状況のことを指す。ポリペプチドおよび核酸は、それらが天然に会合する材料（例えば、それらの天然の環境またはそれらが調製される環境（例えば、細胞培養）（そのような調製がインビトロまたはインビボにおいて実施される組換えＤＮＡ技術によるとき）においてそれらとともに見出される他のポリペプチドまたは核酸）を含まないかまたは実質的に含まない。ポリペプチドおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントとともに製剤化され得、なおも実際的な目的のために単離され得、例えば、ポリペプチドは、通常、ポリマーもしくは粘膜接着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅｓ）もしくは他のキャリアと混合されるか、または診断もしくは治療において使用されるとき、薬学的に許容され得るキャリアもしくは希釈剤と混合される。

【0092】

本発明において有用かつ適用可能なＳ．ｓｕｉｓ ＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチド（複数可）をコードすることができる核酸が、本明細書中に提供される。この文脈における代表的な核酸配列は、図５または配列番号１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、特に、配列番号１のポリペプチドをコードすることができる配列番号２のポリヌクレオチド配列、ならびに配列番号２および／または図５のＤＮＡ配列の相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列である。これらの配列および図に示される配列とハイブリダイズする核酸配列のさらなるバリアントもまた、本開示による溶解酵素の生成において使用するために企図される（得られる可能性がある天然のバリアントを含む）。ファージ関連溶解酵素をコードする多種多様の単離された核酸配列またはｃＤＮＡ配列、およびそのような遺伝子配列とハイブリダイズする部分配列は、本発明の溶解素酵素（複数可）または溶解素ポリペプチド（複数可）の組換え生成にとって有用である。

【0093】

「レプリコン」は、インビボにおけるＤＮＡ複製の自律的単位として機能する；すなわち、それ自体の制御下において複製することができる、任意の遺伝的エレメント（例えば
、プラスミド、染色体、ウイルス）である。

【0094】

「ベクター」は、結合したセグメントの複製をもたらすように別のＤＮＡセグメントが結合し得るレプリコン（例えば、プラスミド、ファージまたはコスミド）である。

【0095】

「ＤＮＡ分子」とは、その一本鎖の形態または二本鎖のへリックスのいずれかでの、デオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）の重合体のことを指す。この用語は、その分子の一次構造および二次構造のことだけを指し、それをいかなる特定の三次の形態にも限定しない。したがって、この用語は、とりわけ、線形のＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミドおよび染色体に見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を記述する際、配列は、転写されないＤＮＡ鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿って５’から３’への方向で１つの配列だけを与えるという通常の慣習に従って本明細書中に記載され得る。

【0096】

「複製起点」とは、ＤＮＡ合成に関与するＤＮＡ配列のことを指す。

【0097】

ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、インビボにおいて転写され、ポリペプチドに翻訳される、二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界線は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）のＤＮＡのゲノムＤＮＡ配列、および合成のＤＮＡ配列までもが含まれ得るが、これらに限定されない。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’に配置される。

【0098】

転写制御配列および翻訳制御配列は、宿主細胞においてコード配列の発現を提供するＤＮＡ調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなど）である。

【0099】

「プロモーター配列」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流の（３’方向の）コード配列の転写を開始することができる、ＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的のため、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位と境界を接し、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列の中には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって慣習的に定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核生物のプロモーターは、常にではないがしばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物のプロモーターは、－１０および－３５のコンセンサス配列に加えてシャイン・ダルガノ配列を含む。

【0100】

「発現制御配列」は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御し、調節するＤＮＡ配列である。ＲＮＡポリメラーゼが、コード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでそれが、そのコード配列によってコードされるタンパク質に翻訳されるとき、そのコード配列は、細胞において転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」にある。

【0101】

「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれ得る。この配列は、ポリペプチドを細胞表面に方向づけるようにまたはポリペプチドを培地中に分泌するように宿主細胞に伝える、そのポリペプチドに対してＮ末端のシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドは、そのタンパク質が細胞を離れる前に宿主細胞によって削り取られる。シグナル配列は、原核生物および真核生物を起源とする種々のタンパク質と会合した状態で見出され得る。

【0102】

用語「オリゴヌクレオチド」は、本発明のプローブについて言及する際に本明細書中で使用されるとき、２つ以上、好ましくは、３つより多いリボヌクレオチドからなる分子として定義される。その正確なサイズは、多くの因子に依存し、言い換えればその因子は、そのオリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途に依存する。

【0103】

本明細書中で使用されるとき、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、細菌の酵素のことを指し、その各々は、特定のヌクレオチド配列において、または特定のヌクレオチド配列付近で、二本鎖ＤＮＡを切断する。

【0104】

外来性または異種ＤＮＡが、細胞の内部に導入されているとき、その細胞は、そのようなＤＮＡによって「形質転換されている」。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成している染色体ＤＮＡに組み込まれて（共有結合的に連結されて）いてもよいし、そうでなくてもよい。原核生物、酵母および哺乳動物の細胞において、例えば、形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソームエレメント上に維持され得る。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが、染色体複製を介して娘細胞に受け継がれるように染色体に組み込まれた細胞である。この安定性は、その真核細胞が、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞系またはクローンを確立する能力によって実証される。「クローン」は、有糸分裂による単一の細胞または共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞系」は、多くの世代にわたってインビトロで安定して成長することができる初代細胞のクローンである。

【0105】

ヌクレオチドの少なくとも約７５％（好ましくは、少なくとも約８０％、最も好ましくは、少なくとも約９０または９５％）が、そのＤＮＡ配列の定義された長さにわたってマッチするとき、それらの２つのＤＮＡ配列は、「実質的に相同」である。実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを使用して、または例えば、特定の系について定義されるようなストリンジェントな条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において、それらの配列を比較することによって同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当該分野の技術範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、上掲；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ＆ ＩＩ，上掲；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，上掲を参照のこと。

【0106】

本明細書中に具体的に開示されるものの誘導体であり、溶解素ポリペプチド（複数可）の機能特性を有するタンパク質をなおもコードするがヌクレオチドの欠失、付加または置換によって開示されているものと異なる、ＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列が、本開示によって企図される。開示されるＤＮＡ分子に由来する小さいＤＮＡ分子も含まれる。そのような小さいＤＮＡ分子には、ハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての使用に適したオリゴヌクレオチドが含まれる。したがって、これらの小さいＤＮＡ分子は、少なくとも、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓのバクテリオファージによって遺伝的にコードされる溶解酵素のセグメントを含み、ＰＣＲの目的のために、その遺伝子の少なくとも１０～１５ヌクレオチド配列、より好ましくは、１５～３０ヌクレオチド配列を含む。上に記載されたような開示されるＤＮＡ分子に由来するＤＮＡ分子およびヌクレオチド配列は、開示されるＤＮＡ配列またはそのフラグメントとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列としても定義され得る。

【0107】

本開示の好ましい実施形態において、ストリンジェントな条件は、２５％超の配列バリエーション（「ミスマッチ」とも呼ばれる）を有するＤＮＡ分子がハイブリダイズしない条件として定義され得る。より好ましい実施形態において、ストリンジェントな条件は、１５％超のミスマッチを有するＤＮＡ分子がハイブリダイズしない条件であり、より好ま
しくはなおも、ストリンジェントな条件は、１０％超のミスマッチを有するＤＮＡ配列がハイブリダイズしない条件である。好ましくは、ストリンジェントな条件は、６％超のミスマッチを有するＤＮＡ配列がハイブリダイズしない条件である。

【0108】

遺伝暗号の縮重は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を維持する一方、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列中の主要なバリエーションを可能にするので、その縮重は、実施形態の範囲をさらに広げる。したがって、遺伝子のヌクレオチド配列は、コードされるタンパク質のアミノ酸組成またはタンパク質の特徴に影響せずに、この位置において、これらの３つのコドンのうちのいずれかに変更され得る。特定のアミノ酸についての遺伝暗号およびヌクレオチドコドンにおけるバリエーションは、当業者に周知である。遺伝暗号の縮重に基づくと、バリアントＤＮＡ分子は、上に記載されたような標準的なＤＮＡ変異誘発法を使用して、またはＤＮＡ配列の合成によって、本明細書中に開示されるｃＤＮＡ分子から得られ得る。遺伝暗号の縮重に基づく配列バリエーションのせいで、開示されるｃＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズしないＤＮＡ配列は、本明細書中において、本開示によって包含される。

【0109】

したがって、ＰｌｙＳｓ２およびＰｌｙＳｓ１を含む本発明の溶解素をコードするＤＮＡ配列もまた、本発明の範囲内であると認識されるべきであり、その配列は、図５または配列番号１に提供されるものと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが、それに対して縮重であるか、または図５および配列番号２に提供される例示的な核酸配列に対して縮重である。「～に対して縮重」とは、異なる３文字コドンを使用することにより、特定のアミノ酸が特定されることを意味する。特定の各アミノ酸をコードするために交換可能に使用され得るコドンは、当該分野で周知である。

【0110】

当業者は、本明細書に記載されるおよび当該分野で公知であるＤＮＡ変異誘発法が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓのバクテリオファージ溶解素をコードするが、本明細書中に記載され、提供される溶解ポリペプチドの不可欠な特徴を維持する、多種多様のＤＮＡ分子を生成し得ることを認識する。新しく得られるタンパク質はまた、下記でさらに十分に記載されるように、溶解ポリペプチド（複数可）の特徴についてバリエーションを得るために選択され得る。そのような誘導体は、アミノ酸配列中に軽微な欠失、付加および置換を含むバリエーションを有する誘導体を含む。

【0111】

アミノ酸配列のバリエーションを導入するための部位は、予め決定され得る一方で、変異自体が予め決定される必要はない。アミノ酸置換は、代表的には、単一残基に由来するか、または１個または複数個、１個もしくは数個、１、２、３、４、５、６もしくは７個の残基に由来し得；挿入は、通常、およそ約１～１０アミノ酸残基であり得；欠失は、約１～３０残基の範囲であり得る。欠失または挿入は、単一の形態で存在し得るが、好ましくは、隣接した対で行われる（すなわち、２残基の欠失または２残基の挿入）。置換、欠失、挿入またはそれらの任意の組み合わせが組み合わされて、最終的な構築物に到達し得る。置換バリアントは、アミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたバリアントである。そのような置換は、タンパク質の特徴に対して有意な影響をもたらさないように、またはタンパク質の特徴の細かい調整が望まれるとき、行われ得る。タンパク質中の元のアミノ酸の代わりに用いられてもよく、かつ、保存的置換とみなされるアミノ酸は、上に記載されており、当業者によって認識される。

【0112】

当該分野で周知であるように、ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター内の発現制御配列にそれらを作動可能に連結し、その発現ベクターを使用して、適切な単細胞宿主を形質転換することによって、発現され得る。当然のことながら、発現制御配列への本発明のＤＮＡ配列のそのような作動可能な連結は、すでにそのＤＮＡ配列の一部でない場合、そのＤＮＡ配列の上流への正確な読み枠での開始コドンＡＴＧの提供を含む。多種多様の宿主／発
現ベクターの組み合わせが、本発明のＤＮＡ配列を発現させる際に使用され得る。例えば、有用な発現ベクターは、染色体の、非染色体の、および合成のＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。任意の多種多様の発現制御配列、すなわち、それに作動可能に連結されるＤＮＡ配列の発現を制御する配列が、これらのベクター内で使用されることにより、本発明のＤＮＡ配列が発現し得る。多種多様の単細胞宿主細胞もまた、本発明のＤＮＡ配列を発現させる際に有用である。これらの宿主には、周知の真核生物宿主および原核生物宿主（例えば、大腸菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、酵母などの真菌の菌株、ならびに組織培養中の動物細胞、ヒト細胞および植物細胞）が含まれ得る。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく所望の発現を達成するために、過度の実験を行うことなく、適切なベクター、発現制御配列および宿主を選択することができる。

【0113】

本明細書中で使用され、当該分野において言及されるとき、バイオフィルムは、明確な構造を有する微生物の凝集塊である。バイオフィルムの形成には、自由に浮遊する微生物が表面に接着することが必要である。バイオフィルムは本質的に、各々がほんの１または２マイクロメートル長である微生物細胞が、数百マイクロメートルの高さであり得る塔状物などの入り組んだ構造を形成している集合体である。バイオフィルム内のチャネルは、生存可能なバイオフィルムコミュニティーを維持するために必要な栄養分、酸素、老廃物などを循環させる流体で満たされた導管として作用する。そのバイオフィルムまたは微生物（細菌、真菌または藻類）コミュニティーは、代表的には、微生物細胞によって産生される細胞外の生体高分子によって囲まれており、液体と表面との界面に接着する。バイオフィルムの被包特性は、その中の微生物を標準的な抗菌治療薬に対して高度に耐性にするいくつかの特性の１つである。バイオフィルム内で増殖する細菌は、例えば、抗生物質に対して高度に耐性であり、場合によっては、バイオフィルムの上部構造なしで同じ細菌が増殖するときよりも最大１，０００倍耐性である。

【0114】

バイオフィルムで汚染された埋め込み物が検出される場合には、標準的な抗生物質治療は、無駄であり得、そのような状況下での唯一の頼みの綱は、汚染された埋め込み物を除去することであり得る。さらに、バイオフィルムは、数多くの慢性疾患に関わっている。例えば、嚢胞性線維症の患者は、抗生物質耐性バイオフィルムを生じることが多いＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ感染症に悩まされる。自由に浮遊する微生物がそれ自体表面に接着すると、バイオフィルムの形成が起きる。バイオフィルムは、それらの細菌を保護するので、それらの細菌は、従来の抗菌処置に対してより耐性になることが多く、それらは重大な健康上のリスクになり、これは、毎年１００万を超えるカテーテル関連尿路感染症（ＣＡＵＴＩ）の症例が報告されることによって証明されており、これらの多くの原因は、バイオフィルム関連細菌であり得る（Ｄｏｎｌａｎ，ＲＭ（２００１）Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ７（２）：２７７－２８１；Ｍａｋｉ Ｄ ａｎｄ Ｔａｍｂｙａｈ Ｐ（２００１）Ｅｍｅｒｇ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ７（２）：３４２－３４７）。

【0115】

バイオフィルム形成を防止するために様々なアプローチが試みられており、そのアプローチは、化学的および力学的手段を使用して、タンパク質の吸着またはバイオフィルムの接着を阻害することを含む。化学的アプローチには、留置デバイスの抗微生物コーティングおよびポリマー改変が含まれる。抗生物質、殺生物剤およびイオンのコーティングは、バイオフィルム防止の化学的方法の例であり、未成熟なバイオフィルムの付着および拡大を干渉し得る。しかしながら、これらのコーティングは、短期間（約１週間）だけしか有効でなく、その後は、抗微生物剤の浸出によって、コーティングの有効性が低下する（Ｄｒｏｒ Ｎら（２００９）Ｓｅｎｓｏｒｓ ９（４）：２５３８－２５５４）。いくつかのインビトロ研究から、感染の防止において、銀が、コーティングの形態と、ポリマーマトリックスに分散されたナノ粒子の両方の形態で有効であることが確認された。しかしながら、ヒト組織に対して潜在的な毒性作用がある銀をインビボで使用することに対する懸
念が残っており、銀のコーティングの使用は限られている。このことにもかかわらず、銀のコーティングは、カテーテルなどのデバイスに使用されている（Ｖａｓｉｌｅｖ Ｋら（２００９）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｄｅｖｉｃｅｓ ６（５）：５５３－５６７）。抗菌剤は、ポリマー改変を介して、長い可撓性の重合鎖を使用して、デバイス表面に固定化され得る。これらの鎖は、共有結合によってデバイス表面上に固定され、非浸出性の接触殺滅表面をもたらす。インビトロ研究から、抗微生物剤であるＮ－アルキルピリジニウムブロミドが、ポリ（４－ビニル－Ｎ－ヘキシルピリジン）に付着すると、そのポリマーは、９９％超のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、大腸菌およびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ菌を不活性化できることが見出された（Ｊａｎｓｅｎ Ｂ ａｎｄ Ｋｏｈｎｅｎ Ｗ（１９９５）Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １５（４）：３９１－３９６）。

【0116】

バイオフィルムを防止する力学的アプローチは、カテーテルなどのデバイスの表面を変化させること（デバイス表面の疎水性を改変することを含む）、表面が滑らかな材料を使用してその物理的性質を変化させること、および表面電荷を変化させることを含む。重合鎖の疎水性および電荷は、いくつかの骨格化合物、および正に帯電したポリカチオンを含む抗微生物剤を使用することによって、制御され得る。別のアプローチでは、表面、この場合、カテーテルに広がる周期的な矩形パルスおよび矩形波を送達する畜電池式デバイスから低エネルギー表面弾性波を発生させ、表面への細菌の接着を防止する水平波をもたらす。この技法は、白色ウサギおよびモルモットにおいて試験され、バイオフィルム増殖を減少させた（Ｈａｚａｎ，Ｚら（２００６）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５０（１２）：４１４４－１５２）。

【0117】

本発明によると、細菌バイオフィルムの防止、分散および処置のための方法および組成物が提供される。ブドウ球菌を含むバイオフィルムの防止、分散および処置のための方法および組成物が、特に提供される。特に、抗生物質耐性および／または抗生物質感性Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含むバイオフィルムの防止、分散および処置のための方法および組成物は、本発明の一態様である。本発明のある態様において、本発明の方法および組成物は、抗生物質耐性菌を含むブドウ球菌および連鎖球菌を殺滅することができる溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素を含む。

【0118】

特にＰｌｙＳｓ２溶解素を含む本発明の方法および組成物は、バイオフィルムの防止または分散のために、化学的または力学的な手段、組成物またはアプローチと併用され得るか、またはそれらに組み込まれ得る。したがって、本明細書中の組成物は、特に、留置デバイスまたは留置カテーテルの中またはそれらの上でのバイオフィルムの増殖または確立を最小にする際に、抗生物質、殺生物剤およびイオンのコーティングと併用され得るか、またはそれに組み込まれ得る。例として、これらに限定されないが、留置デバイスまたはカテーテルを事前に滅菌するか、またはそれらを、バイオフィルムを含まない状態もしくは細菌の接着が減少した状態もしくはバイオフィルム形成のリスクが低下した状態で維持する際に、ＰｌｙＳｓ２を含む組成物が投与され得るか、あるいは別の方法で提供され得る。したがって、ＰｌｙＳｓ２を含む組成物は、留置デバイス、カテーテルなどを、フラッシングするか、または定期的に清浄して、バイオフィルムを含まない状態もしくは細菌の接着が減少した状態もしくはバイオフィルム形成のリスクが低下した状態で維持するために、溶液の形態で利用され得る。バイオフィルムが、疑われるか、明らかであるか、または実証されている場合、ＰｌｙＳｓ２を含む組成物は、バイオフィルムの分散、軽減、除去または処置を促進するか、惹起するか、またはもたらすために、投与することができるか、または別の方法で、バイオフィルムもしくはデバイス、領域、位置、部位と接触させ得る。したがって、例えば、患者が、体温上昇、またはデバイスもしくはカテーテルの周辺に関連する不快感、発赤、腫脹を示す場合、ＰｌｙＳｓ２を含む組成物を、その患者に投与するかまたはそのデバイスもしくはカテーテルと接触させることにより、形成中の
または形成された任意のバイオフィルムを分散させるか、防止するか、または処置することによって、関連する体温、不快感、発赤、腫脹を軽減、消散または処置し得る。

【0119】

本発明によると、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素またはその活性なバリアントを含む組成物は、単回の用量もしくは投与で、または複数回の用量もしくは投与で、確立されたもしくは疑わしいバイオフィルム、またはバイオフィルムを有するデバイス、領域、位置、部位に、投与され得るかまたは別の方法で接触させ得る。溶解素は、１つまたは複数の抗生物質とともに、その前に、またはその後に、投与され得る。溶解素は、例えば、初回量で投与された後に（ｆｏｌｌｏｗｉｅｄ ｂｙ）抗生物質が投与され得るか、または抗生物質とともに初回量で投与され得、その初回量の溶解素に、その次の用量の溶解素が続き得る。１つのそのような状況において、初回量の溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２は、バイオフィルムを分散させるのに役立ち得、そして、バイオフィルム内の細菌またはバイオフィルムの細菌またはバイオフィルム由来の細菌をさらに分散させるか、もしくはさらに殺滅するか、もしくは除菌するのに役立ち得るその次の用量の（バイオフィルムの最初の応答および分散に部分的に依存し得る、より少ないか、同じか、またはより多い量の）溶解素が続き得る。引き続いてまたは加えて、バイオフィルム内の細菌またはバイオフィルムの細菌またはバイオフィルム由来の細菌を分散させるか、またはさらに殺滅するか、または除菌するのにさらに役立つ用量の抗生物質も、投与され得る。

【0120】

本発明に提供される方法および適用において有用な溶解酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を含む治療用組成物または薬学的組成物、ならびに関連する使用方法が、本明細書中に提供される。治療用組成物または薬学的組成物は、１つまたは複数の溶解ポリペプチド（複数可）を含み得、他の成分（例えば、キャリア、ビヒクル、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ホリンタンパク質（複数可）、１つまたは複数の抗生物質、または好適な賦形剤、キャリアもしくはビヒクル）と必要に応じて組み合わされる、天然、トランケート型、キメラまたはシャフリングした溶解酵素を必要に応じて含み得る。本発明は、バイオフィルム内のグラム陽性菌の殺滅、軽減、除菌、予防または処置において使用するため、特に、バイオフィルムを分散させるため、防止するため、または処置するための、ＰｌｙＳｓ２を含む本発明の溶解素の治療用組成物または薬学的組成物を提供する。

【0121】

本発明の方法において使用される治療用組成物中に含められる酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）は、変更されていないファージ関連溶解酵素（複数可）、トランケート型の溶解ポリペプチド、バリアント溶解ポリペプチド（複数可）ならびにキメラおよび／またはシャフリングした溶解酵素のうちの１つまたは複数または任意の組み合わせであり得る。さらに、同じ細菌の処置のために、異なるファージによって遺伝的にコードされる異なる溶解ポリペプチド（複数可）が使用され得る。これらの溶解酵素は、「変更されていない」溶解酵素またはポリペプチド、トランケート型の溶解ポリペプチド（複数可）、バリアント溶解ポリペプチド（複数可）、ならびにキメラおよびシャフリングした溶解酵素の任意の組み合わせでもあり得る。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａを含むグラム陽性菌用の治療用組成物または薬学的組成物中の溶解酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）は、単独で、または抗生物質と併用して、または処置されるべき他の侵襲性細菌生物が存在する場合、標的化されている他の細菌に特異的な他のファージ関連溶解酵素と併用して、使用され得る。その溶解酵素、トランケート型酵素、バリアント酵素、キメラ酵素および／またはシャフリングした溶解酵素は、ホリンタンパク質（ｈｏｌｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）とともに使用され得る。そのホリンタンパク質の量も変動し得る。様々な抗生物質が、酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）とともに、およびリゾスタフィンありまたはなしで、治療用組成物中に必要に応じて含められ得る。２つ以上の溶解酵素またはポリペプチドが、治療用組成物中に含められ得る。

【0122】

本発明の方法において使用される薬学的組成物は、化学合成またはＤＮＡ組換え法によって生成される１つまたは複数の変更された溶解酵素（そのアイソザイム、アナログまたはバリアントを含む）も含み得る。特に、変更された溶解タンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、短縮化、キメラ化、シャフリングまたはそれらの組み合わせによって生成され得る。薬学的組成物は、１つまたは複数の天然の溶解タンパク質と１つまたは複数のトランケート型、バリアント、キメラまたはシャフリングした溶解タンパク質との組み合わせを含み得る。薬学的組成物は、１つまたは複数の補完的な作用物質および薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤の任意選択の添加と組み合わせた、同じまたは異なる細菌種に由来する少なくとも１つの溶解タンパク質のペプチドまたはペプチドフラグメントも含み得る。

【0123】

本方法において有用な薬学的組成物は、１つもしくは複数の抗微生物剤および／または１つもしくは複数の従来の抗生物質、特に、本明細書中に提供されるようなものを含む補完的な作用物質を含み得る。細菌バイオフィルムの感染の処置または分散を加速させるために、治療薬は、溶解酵素の殺菌活性を増強し得る少なくとも１つの補完的な作用物質をさらに含み得る。抗微生物薬は、細胞壁合成の阻害、細胞膜の機能の阻害、ならびに／またはタンパク質およびＤＮＡの合成を含む代謝機能の阻害によって、細菌細胞の構造または機能を干渉することによって、広く作用する。抗生物質は、細胞壁ペプチドグリカン生合成に影響するものおよびグラム陽性菌におけるＤＮＡ合成またはタンパク質合成に影響するものに広く下位分類され得る。ペニシリンおよびそのような抗生物質を含む細胞壁合成阻害剤は、堅い外側の細胞壁を破壊し、その結果、相対的に支えられていない細胞は膨張し、最終的には破裂する。補完的な作用物質は、溶解酵素の治療効果を相乗的に増強するのに有効である量の、抗生物質（例えば、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシン、マクロライドファミリーの他のメンバー、ペニシリン類、セファロスポリン類およびそれらの任意の組み合わせ）であり得る。実質的に他の任意の抗生物質が、変更されたおよび／または変更されていない溶解酵素とともに使用され得る。細胞壁ペプチドグリカン生合成に影響する抗生物質には：Ｎ－アセチルムラミン酸（ＮＡＭ）およびＮ－アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）ペプチドサブユニットをペプチドグリカンマトリックスに組み込むことを妨げることによってペプチドグリカン合成を阻害するグリコペプチド類が含まれる。利用可能なグリコペプチド類としては、バンコマイシンおよびテイコプラニン；ペプチドグリカン架橋の形成を阻害することによって作用するペニシリン類が挙げられる。ペニシリン類の官能基であるβ－ラクタム部分は、細菌中でペプチドグリカン分子を連結するＤＤ－トランスペプチダーゼに結合して、それを阻害する。加水分解酵素は、細胞壁を壊し続け、浸透圧に起因して、細胞溶解または細胞死をもたらす。一般的なペニシリン類には、オキサシリン、アンピシリンおよびクロキサシリン；ならびに原形質膜の外側にペプチドグリカン基本要素を有する分子であるＣ_５５－イソプレニルピロホスフェートの脱リン酸化に干渉するポリペプチドが含まれる。細胞壁に悪影響を及ぼすポリペプチドは、バシトラシンである。他の有用なおよび関与性の抗生物質としては、バンコマイシン、リネゾリドおよびダプトマイシンが挙げられる。

【0124】

同様に、他の溶解酵素が、他の細菌または細菌感染症を処置するためまたは分散させるためにキャリア中に含められ得る。薬学的組成物は、１つまたは複数の補完的な作用物質（複数可）および好適なキャリアまたは希釈剤の任意選択の添加と組み合わせた、少なくとも１つの溶解タンパク質、１つのホリンタンパク質、または少なくとも１つのホリンタンパク質および１つの溶解タンパク質のペプチドまたはペプチドフラグメント（その溶解タンパク質およびホリンタンパク質の各々は、同じまたは異なる細菌種に由来する）も含み得る。

【0125】

有効量の溶解ポリペプチド（複数可）または溶解ポリペプチド（複数可）のペプチドフラグメントをインビボで発現することができる核酸分子を、単独でまたは他の核酸分子と
組み合わせて含む組成物もまた、本方法において有用である。これらの核酸分子、ポリヌクレオチド、およびこれらの分子を有し、インビトロまたはインビボで発現するベクターを含む細胞培養物もまた提供される。

【0126】

本方法は、細菌を分散させるためもしくは除菌するため、または感受性グラム陽性菌が原因の疾病を処置するために、種々のキャリアと組み合わせる溶解ポリペプチド（複数可）を含む治療用組成物または薬学的組成物を利用し得る。そのキャリアは、少量の添加物（例えば、等張性および化学安定性を高める物質）を適切に含む。そのような材料は、使用される投与量および濃度ではレシピエントにとって無毒性であり、それらとしては、バッファ（例えば、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；グリシン；アミノ酸（例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンまたはアルギニン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロースまたはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；非イオン性界面活性物質（例えば、ポリソルベート、ポロキサマーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））；および／または中性の塩が挙げられる。グリセリンまたはグリセロール（１，２，３－プロパントリオール）は、薬学的使用のために商業的に入手可能である。ＤＭＳＯは、局所的に適用される多くの薬物の透過を高める注目すべき能力を有する非プロトン性溶媒である。特に、静脈内溶液が調製されるとき、キャリアビヒクルには、リンガー溶液、緩衝液およびデキストロース溶液も含まれ得る。

【0127】

溶解ポリペプチド（複数可）は、液体の形態で、または唾液などの体液と接すると可溶化される凍結乾燥状態で、これらの物質に加えられてもよい。そのポリペプチド（複数可）／酵素は、また、ミセルまたはリポソーム中に存在してよい。

【0128】

本発明において有用なおよび本発明において使用するための変更されたまたは変更されていない溶解酵素／ポリペプチド（複数可）の有効な投与速度または投与量は、その溶解酵素／ポリペプチド（複数可）が治療的に使用されるのかまたは予防的に使用されるのか、感染性細菌にレシピエントを曝す期間、個体のサイズおよび体重などに部分的に依存する。酵素／ポリペプチド（複数可）を含む組成物を使用するための期間もまた、その使用が予防目的であるか（ここで、その使用は、短期間にわたる、１時間ごとに、毎日または１週間ごとであり得る）、またはその使用が治療目的であるか（ここで、使用が、数時間、数日間もしくは数週間続けられ得、かつ／または毎日もしくはその日のうちに間隔を空けて続けられ得るような、組成物を使用するより集中的なレジメンが、必要であり得る）にも依存する。使用されるいずれの剤形も、最短時間にわたって最小数の単位を提供すべきである。「長期」放出キャリアまたは「緩徐」放出キャリア（例えば、ある特定の鼻スプレーまたは舐剤など）として分類されるキャリアは、より長い期間にわたるが、１ｍｌあたりより低い濃度の活性な（酵素）単位を有し得るかまたは提供し得るのに対し、「短期」放出キャリアまたは「速」放性キャリア（例えば、含嗽剤など）は、より短い期間にわたるが、１ｍｌあたりより高い濃度の活性な（酵素）単位を有し得るかまたは提供し得る。１ｍｌあたりの活性な単位の量およびそれに曝す期間は、感染の性質、処置が予防的であるべきかまたは治療的であるべきか、および他の可変事項に依存する。上記よりもかなり高い単位／ｍｌの投与量または低い単位／ｍｌの投与量を有する必要があり得る状況も存在する。

【0129】

使用のための溶解酵素／ポリペプチド（複数可）は、その溶解酵素／ポリペプチド（複数可）の活性を可能にさせるｐＨを有する環境に存在するべきである。安定化バッファが
、溶解素酵素／ポリペプチド（複数可）の最適な活性を可能にさせ得る。そのバッファは、還元試薬（例えば、ジチオトレイトールまたはベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ））を含み得る。その安定化バッファはまた、金属キレート試薬（例えば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）であり得るかもしくはそれを含み得るか、あるいはリン酸バッファもしくはクエン酸－リン酸バッファまたは他の任意のバッファも含み得る。

【0130】

弱い界面活性物質が、溶解酵素／ポリペプチド（複数可）の治療効果を増強するのに有効な量で、本方法において使用するための治療用組成物または薬学的組成物に含められ得、組成物中で使用され得る。。好適な弱い界面活性物質としては、とりわけ、ポリオキシエチレンソルビタンと脂肪酸とのエステル（Ｔｗｅｅｎシリーズ）、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘシリーズ）、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコピラノシド、ｎ－デシル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－グルコピラノシド、および生物学的に存在する界面活性物質、例えば、脂肪酸、グリセリド、モノグリセリド、デオキシコレートおよびデオキシコレートのエステルが挙げられる。

【0131】

保存剤もまた、本発明において使用され得、好ましくは、全組成物の約０．０５重量％～０．５重量％を構成し得る。保存剤の使用は、生成物が微生物で汚染された場合、その製剤が微生物の増殖を防止するかまたは減少させることを確実にする。本発明において有用ないくつかの保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、クロロキシレノール、安息香酸ナトリウム、ＤＭＤＭヒダントイン、３－ヨード－２－プロピルブチルカルバメート、ソルビン酸カリウム、クロルヘキシジンジグルコネートまたはそれらの組み合わせが挙げられる。

【0132】

本発明の方法および適用において使用される治療用組成物は、感受性グラム陽性菌とともに存在する任意のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ菌を処置するための酵素リゾスタフィンなどの他の酵素をさらに含み得る。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｉｍｕｌａｎｓの遺伝子産物であるリゾスタフィンは、細胞壁のポリグリシン架橋を酵素的に分解することによって、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して静菌効果および殺菌効果を発揮する（Ｂｒｏｗｄｅｒら、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９：３９３－４００（１９６５））。その後、リゾスタフィンに対する遺伝子は、クローニングされ、配列決定された（Ｒｅｃｓｅｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：１１２７－１１３１（１９８７）。治療用組成物は、ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）およびリゾチームも含み得る。

【0133】

本発明の方法にしたがう溶解酵素／ポリペプチド（複数可）を含む治療用組成物を適用する手段としては、直接的、間接的、キャリアおよび特別な手段または任意の組み合わせの手段が挙げられるが、これらに限定されない。溶解酵素／ポリペプチド（複数可）の直接的な適用は、ポリペプチドをバイオフィルム、感染または細菌集落形成の部位に直接接触させる任意の好適な手段による適用であり得る（例えば、鼻腔領域への適用（例えば、鼻スプレー）、皮膚（ｄｅｒｍａｌ）または皮膚（ｓｋｉｎ）への適用（例えば、局所的軟膏または製剤）、坐剤、タンポン適用など）。鼻への適用としては、例えば、鼻スプレー、点鼻剤、鼻用軟膏、鼻洗浄剤、鼻注射、鼻パッキング（ｎａｓａｌ ｐａｃｋｉｎｇｓ）、気管支スプレーおよび吸入器、あるいは咽頭用舐剤、うがい薬もしくは含嗽薬の使用によるか、または外鼻孔もしくは顔面に適用される軟膏の使用による間接的なもの、またはこれらおよび類似の適用方法の任意の組み合わせが挙げられる。溶解酵素が投与され得る形態としては、舐剤、トローチ剤、キャンディ、注入物質、チューインガム、錠剤、散剤、スプレー、液体、軟膏およびエアロゾルが挙げられるがこれらに限定されない。

【0134】

溶解酵素の適用様式は、いくつかの異なるタイプおよびキャリアの組み合わせを含み、
それらとしては、水性液体、アルコールベースの液体、水溶性ゲル、ローション、軟膏、非水性液体基剤、鉱油基剤、鉱油とワセリンとの混和物、ラノリン、リポソーム、タンパク質キャリア（例えば、血清アルブミンまたはゼラチン）、粉末セルロースカーメル（ｃａｒｍｅｌ）およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。治療薬を含むキャリアの送達様式としては、塗抹、噴霧、時間放出（ｔｉｍｅ－ｒｅｌｅａｓｅ）パッチ、液体を吸収した布状物（ｗｉｐｅ）およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。溶解酵素は、そのまま、または他のキャリアのうちの１つの中に入った状態で、包帯に適用され得る。その包帯は、湿った状態または乾燥した状態（ここで、その酵素は、凍結乾燥された形態でその包帯に存在する）で販売されていてよい。この適用方法は、感染した皮膚を処置するために最も有効である。局所用組成物のキャリアは、ポリマー増粘剤、水、保存剤、活性な界面活性剤または乳化剤、酸化防止剤、日焼け止め剤、および溶媒または混合溶媒系を含む、半固体およびゲル様のビヒクルを含み得る。使用され得るポリマー増粘剤には、当業者に公知のもの、例えば、化粧品業界および製薬業界において頻繁に使用される親水性およびハイドロアルコール（ｈｙｄｒｏａｌｃｏｈｏｌｉｃ）のゲル化剤が含まれる。他の好ましいゲル化ポリマーとしては、ヒドロキシエチルセルロース、セルロースガム、ＭＶＥ／ＭＡデカジエンクロスポリマー、ＰＶＭ／ＭＡ共重合体またはそれらの組み合わせが挙げられる。

【0135】

１つまたは複数のファージ酵素および他の補完的な作用物質とともにある期間にわたって投与されるためには、粘膜組織への接着を示す材料を有することが有益である場合がある。放出調節能力を有する材料が特に望ましく、徐放性粘膜接着剤の使用が、かなりの程度の注目を集めている。親水性材料と疎水性材料との組み合わせである粘膜接着剤に関する他のアプローチが公知である。ミセルおよび多重膜（ｍｕｌｔｉｌａｍｉｌｌａｒ）ミセルもまた、酵素の放出を調節するために使用され得る。例えば、カテーテル、バルブ、補綴デバイス、薬物または化合物のポンプ、ステント、整形材料などの、特に、身体内に留置され、細菌が接着しやすいかまたはバイオフィルムが発生しやすい任意の材料または構成要素を含む、表面、例えば、臨床行為において利用されるプラスチック、膜、デバイスを標的化するかまたはそれに接着する能力を有する材料が、本発明において有用な溶解素（複数可）と併用されるか、混合されるか、または融合され得る。

【0136】

本発明の方法において使用される治療用組成物または薬学的組成物は、生物学的に活性な作用物質を調節放出するための、親水性の主鎖および疎水性のグラフト鎖を含むグラフト共重合体を含む重合体粘膜接着剤も含み得る。本願の組成物は、必要に応じて、他の重合体材料（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリ－（ビニルピロリドン）およびカルボキシメチルセルロースナトリウム可塑剤）および他の薬学的に許容され得る賦形剤を、その組成物の粘膜接着性（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｉｔｙ）に悪影響を及ぼさない量で含み得る。

【0137】

本発明の溶解酵素／ポリペプチド（複数可）は、局所的、経口的または非経口的を含む任意の薬学的に適用され得るまたは許容され得る手段によって、本発明に従って使用するために投与され得る。例えば、溶解酵素／ポリペプチド（複数可）は、グラム陽性菌による感染症を処置するために筋肉内に、髄腔内に、真皮下に（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）、皮下にまたは静脈内に投与され得る。非経口注射が、選択される投与様式である場合、好ましくは、等張製剤が使用される。通常、等張性のための添加物としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースが挙げられ得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。製剤に、血管収縮剤が加えられ得る。本願による薬学的調製物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）は、滅菌された状態かつ発熱物質を含まない状態で、提供される。

【0138】

いずれの化合物の場合も、治療的に有効な用量は、最初に、細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常、マウス、ウサギ、イヌもしくはブタにおいて、推定され得る。動物モデルは、望ましい濃度範囲および投与経路を得るためにも使用される。次いで、そのような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために使用され得る。正確な投与量は、処置される患者を考慮して、個別の医師によって選択される。投与量および投与は、十分なレベルの活性な部分を提供するように、または所望の効果を維持するように、調整される。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重症度、患者の年齢、体重および性別；食事、所望の処置期間、投与方法、投与時間および投与頻度、薬物の組み合わせ（複数可）、反応感度、ならびに治療に対する寛容／応答が挙げられる。長時間作用性の薬学的組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、３～４日間ごとに、１週間ごとに、または２週間ごとに１回、投与され得る。

【0139】

投与される溶解酵素／ポリペプチド（複数可）の有効な投与速度または量および処置期間は、感染の深刻さ、患者、特に、ヒトの体重、感染性細菌にレシピエントが曝された期間、感染している皮膚または組織または表面の平方センチメートル数、感染の深さ、感染の深刻さ、および種々のいくつかの他の可変事項に部分的に依存する。組成物は、１日ま１週間、または１ヶ月に１回から数回、いずれかの場所に適用され得、数日間または数週間までなどの短期間にわたって、または何週間ももしくは数ヶ月間までなどの長期間にわたって、適用され得る。使用は、数日間または数週間または数か月にわたって続き得る。使用されるいずれの剤形も、最短時間にわたって最小数の単位を提供するべきである。有効量または有効な投与量の酵素を提供すると考えられる活性な単位の酵素の濃度は、適切に選択され得る。

【0140】

溶解素は、単回用量または複数回用量で、個々に、または１つもしくは複数の抗生物質などの別の作用物質との併用で、投与され得る。その溶解素は、必要に応じて、抗生物質などの別の作用物質とともに、同じ投与様式または異なる投与様式によって投与され得る。その溶解素は、併用でまたは個別に、１回、２回または複数回、１回以上、投与され得る。したがって、溶解素は、特に、応答および細菌の殺滅もしくは除菌、またはバイオフィルムの分散もしくはバイオフィルム内の細菌の殺滅に応じて、初回量に続いて、その次の単一用量もしくは複数用量で投与され得、抗生物質の投与（複数可）と併用または交替され得る。本発明の特定の態様において、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２、または抗生物質と溶解素との組み合わせが、より長い期間にわたって投与され得、投与は、耐性のリスクなく、延長され得る。

【0141】

用語「作用物質」は、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、化学的化合物および小分子を含む任意の分子を意味する。特に、作用物質という用語は、被験化合物、添加されるさらなる化合物（複数可）または溶解素酵素化合物などの化合物を含む。

【0142】

用語「アゴニスト」とは、最も広い意味において、リガンドが結合するレセプターを刺激するリガンドのことを指す。

【0143】

用語「アッセイ」は、化合物の特定の特性を測定するために使用される任意のプロセスのことを意味する。「スクリーニングアッセイ」は、化合物のコレクションからその活性に基づいて化合物を特徴付けるかまたは選択するために使用されるプロセスのことを意味する。

【0144】

用語「防止する」または「防止」とは、疾患の発生の前に、疾患を引き起こす病原体に曝される可能性があるかまたはその疾患にかかりやすい可能性がある被験体における、疾患または障害を獲得するかまたは発症する（すなわち、発症すべきでない疾患の臨床徴候の少なくとも１つを引き起こす）リスクの低下のことを指す。

【0145】

用語「予防」は、用語「防止」に関係し、その中に包含され、その目的が疾患の処置または治癒ではなく防止である措置または手技のことを指す。予防的な措置の非限定的な例としては、ワクチンの投与；例えば、動かないことに起因して血栓症のリスクがある、入院患者への低分子量ヘパリンの投与；およびマラリアが蔓延しているかまたはマラリアにかかるリスクが高い地理的領域への訪問に先だったクロロキンなどの抗マラリア剤の投与が挙げられ得る。

【0146】

「治療有効量」は、医師または他の臨床医が探索している被験体の生物学的または医学的応答を誘発する、薬物、化合物、抗微生物薬、抗体、ポリペプチドまたは医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｇｅｎｔ）の量を意味する。特に、グラム陽性菌の感染症およびグラム陽性菌の増殖に関して、用語「有効量」は、殺菌効果および／または静菌効果を有することを含む、グラム陽性菌の感染の量または程度の生物学的に重要な減少をもたらす化合物または作用物質の有効量を含むと意図される。句「治療有効量」は、感染性細菌の増殖もしくは量または病態の他の特性の臨床的に有意な変化（例えば、その存在および活性に伴い得るような、発熱または白血球数の増加）を、少なくとも約３０パーセント、より好ましくは、少なくとも５０パーセント、最も好ましくは、少なくとも９０パーセント妨げる、好ましくは、減少させるのに十分な量を意味するために本明細書中で使用される。

【0147】

任意の疾患または感染症を「処置する」またはそれらの「処置」という用語は、１つの実施形態において、その疾患または感染症を回復させること（すなわち、その疾患または感染性病原体もしくは感染性細菌の増殖を停止すること、またはそれらの臨床徴候の少なくとも１つの発現、程度もしくは重症度を減少させること）を指す。別の実施形態において、「処置する」または「処置」とは、被験体が識別できないかもしれない少なくとも１つの身体的パラメータの回復のことを指す。なおも別の実施形態において、「処置する」または「処置」とは、疾患または感染症を身体的に（例えば、可能な徴候の安定化）、生理的に（例えば、身体的パラメータの安定化）またはその両方で調整することを指す。さらなる実施形態において、「処置する」または「処置」は、疾患の進行の遅延または感染症の減少に関する。

【0148】

句「薬学的に許容され得る」とは、ヒトに投与されたとき、生理的に耐えられ、通常、アレルギー性反応または類似の有害反応（例えば、胃の不調、眩暈など）をもたらさない、分子実体および組成物のことを指す。

【0149】

本願および特許請求の範囲による、インビボで行われる処置方法または医学的および臨床的処置方法の文脈において、被験体、患者または個体という用語は、ヒトのことを指すと意図されていることに注意されたい。

【0150】

用語「グラム陽性菌（ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）」、「グラム陽性菌（Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）」、「グラム陽性」および具体的に列挙されてない任意の変化形は、本明細書中で交換可能に使用され得、本願全体および請求項全体にわたって使用されるとき、公知であり、かつ／あるいはある特定の細胞壁および／もしくは細胞膜の特徴の存在によって、ならびに／またはグラム染色による染色によって同定され得るグラム陽性菌のことを指す。グラム陽性菌は、公知であり、容易に同定され得、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属から選択され得るがこれらに限定されず、認識されているまたは認識されていない任意およびすべてのその種または菌株を含む。本発明のある態様において、ＰｌｙＳ溶解素感性グラム陽性菌には、Ｌｉｓ
ｔｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓおよびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓのうちの１つまたは複数から選択される細菌が含まれる。

【0151】

用語「殺菌性」とは、細菌細胞を殺滅できることを指す。

【0152】

用語「静菌性」とは、細菌細胞の増殖の阻害を含む、細菌の増殖を阻害できることを指す。

【0153】

句「薬学的に許容され得る」とは、ヒトに投与されたとき、生理的に耐えられ、通常、アレルギー性反応や類似の有害反応（例えば、胃の不調、眩暈など）をもたらさない、分子実体および組成物のことを指す。

【0154】

句「治療有効量」は、標的細胞塊のＳ期の活性または他の病態特性の臨床的に重要な変化（例えば、その存在および活性に伴い得るような、血圧上昇、発熱または白血球数の増加）を、少なくとも約３０パーセント、より好ましくは、少なくとも５０パーセント、最も好ましくは、少なくとも９０パーセント防止する、好ましくは、減少させるのに十分な量を意味するために本明細書中で使用される。

【0155】

本発明は、細菌バイオフィルムの防止、分散、処置および／または除菌のため、ならびにバイオフィルム（複数可）の分散後の感染症の防止のための方法を提供し、ここで、１つまたは複数のグラム陽性菌、特に、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ菌のうちの１つまたは複数が、疑われるかまたは存在し、その方法は、ＭＲＳＡを含むＳ．ａｕｒｅｕｓ菌を殺滅する能力を有する溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素を投与する工程を含む。本発明は、デバイス、埋め込み物、分離膜（例えば、パーベーパレーション膜、透析膜、逆浸透膜、限外濾過膜および精密濾過膜）の表面上のバイオフィルムの増殖を減少させるためまたは防止するための方法を提供し、その方法は、ＭＲＳＡを含むＳ．ａｕｒｅｕｓ菌を殺滅する能力を有する溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素を投与するかまたは利用する工程を含む。

【0156】

本発明は、ＰｌｙＳｓ２溶解素を含む組成物を投与することによる、カテーテル関連尿路感染症（ＣＡＵＴＩ）を処置するための方法を提供し、ここで、その感染症の原因は、バイオフィルム関連細菌にある。本発明は、カテーテル関連尿路感染症（ＣＡＵＴＩ）の処置において使用するためのＰｌｙＳｓ２溶解素を含む組成物を提供し、ここで、その感染症の原因は、バイオフィルム関連細菌にある。それらの方法または組成物は、図５もしくは配列番号１に提供されているようなポリペプチド、またはＳ．ａｕｒｅｕｓを含むブドウ球菌および連鎖球菌を殺滅することができるそのバリアントを含むＰｌｙＳｓ２溶解素を含む。それらの方法または組成物は、１つまたは複数の抗生物質をさらに含み得る。

【0157】

心臓における（例えば、大動脈弁もしくは他の弁または心臓もしくはその血管に埋め込まれたステントもしくはデバイスにおける）ブドウ球菌性心内膜炎を含む心内膜炎は、多くの心臓病患者にとって重大な臨床上の懸念であり、リスクであり、現実である。本発明は、ブドウ球菌性心内膜炎を含む心内膜炎を減少させるため、防止するため、分散させるためまたは処置するため、および心臓弁または血管ステントにおけるバイオフィルム（複数可）の防止または処置のための方法を提供する。これらの方法において、溶解素、特に、ＰｌｙＳｓ２溶解素または本明細書中に提供されるようなその活性なバリアントが、ブドウ球菌性心内膜炎または心臓弁もしくは血管ステントにおけるバイオフィルム（複数可）を防止するためまたは処置するために投与される。

【0158】

本発明は、本発明の例示として提供される以下の非限定的な実施例を参照することによ
り、よりよく理解され得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に例証するために提示されるが、しかしながら、決して、本発明の広い範囲を限定すると解釈されるべきでない。

【実施例】

【0159】

実施例１
ＰｌｙＳｓ２溶解素は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのメチシリンおよびバンコマイシン耐性および感性の菌株（ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＶＲＳＡおよびＶＩＳＡ）を含む臨床的に重要なグラム陽性菌の様々な菌株を殺滅する能力を明らかに示す。ＰｌｙＳｓ２は、広範な種殺滅活性を有する点において独特の溶解素であり、複数の種の細菌、特に、グラム陽性菌、極めて様々な抗生物質感性および抗生物質耐性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ならびにまたＡ群およびＢ群連鎖球菌を含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓを殺滅し得る。他のＰｌｙＳｓ２感性細菌としては、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａの菌株が挙げられる。ＰｌｙＳｓ２溶解素に対する、ブドウ球菌および連鎖球菌を含む様々な細菌の感性の作表を、表２および３を含む上記に提供する。

【0160】

さらなるＭＩＣ研究の作表を下記の表４に示す。
表４
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株に対するＰｌｙＳｓ２および抗生物質の活性^＊

【表4】

^＊ＭＩＣは、ブロス微量希釈法を使用し、ＣＬＳＩ法（Ｍ０７－Ａ９）に従って８０％増殖阻害を評価して、決定した。
^＊赤色／太字＝薬物失敗（ＭＩＣ値が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおいて、示されている薬物についてのＥＵＣＡＳＴブレイクポイントより高い）

【0161】

著しいことにおよび独特なことに、上記の表に示されているような試験された数多くのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの菌株ならびにその他のものを含む数多くの臨床的に重要な細菌に対して活性を示すにもかかわらず、ＰｌｙＳｓ２は、他の細菌、特に、天然または共生細菌叢に対しては、多くとも最小効果しか示さ
ない。下記の表５は、様々な共生ヒト腸細菌に対してＰｌｙＳｓ２がほとんど溶解活性を示さないことを明らかに示している。
表５
ＰｌｙＳｓ２に対する腸細菌の感性

【表5】

【0162】

バイオフィルムの形成は、多くの細菌感染症の病原において鍵となる特徴である（３１）。感染した組織（すなわち、心内膜炎における心臓弁または骨髄炎における骨）内または埋め込み物（すなわち、置換関節およびカテーテル）上には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓなどの細菌の病原体が、抗生物質および免疫系の作用から保護される、増殖および持続にとって好ましい環境を提供するバイオフィルムの中に存在する（３２）。本明細書中に提供される研究は、１０００×ＭＩＣ濃度で使用された抗生物質が完全に不活性であることと比較して、たった１×ＭＩＣ濃度のＰｌｙＳｓ２溶解素の強力な抗バイオフィルム活性を実証する。この強力な溶解素の抗バイオフィルム活性は、バイオフィルムに対して有効な手段および組成物を提供し、溶解素が破壊したバイオフィルムへの抗生物質の接近を可能にすることによって抗生物質の作用を独特に補完し得る。

【0163】

ＰｌｙＳｓ２が迅速に細菌を殺滅すること、ならびに数多くの臨床的に重要な菌株および種に対する効果を考慮して、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓバイオフィルムに対するＰｌｙＳｓ２溶解素の効能を、バイオフィルムアッセイを用いてインビトロにおいて試験した。

【0164】

メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２に対するＰｌｙＳｓ２溶解素の最小阻止濃度は、１６μｇ／ｍｌと決定された。この値は、ＭＩＣアッセイにおいて還元剤（例えば、ＤＴＴまたはＢＭＳ）の存在下で決定されたＭＩＣである。還元剤は、ＭＩＣ値を決定する際のアッセイ間の（ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｄ ａｍｏｎｇ ａｓｓａｙｓ）再現性を改善する目的で加えられる。バイオフィルム研究は、還元剤を加えずに行う。還元剤の非存在下のＢＡＡ－４２に対するＭＩＣ値は、３２μｇ／ｍｌである。このＭＩＣ値は、上記に提供された表において記述されているような他のＭＲＳＡ菌株の平均と一致する（表２および４を参照のこと）。ＭＩＣは、複数の標準に従って、およびＣｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ０７－Ａ９（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｇｒｏｗ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ．Ｖｏｌｕｍｅ ３２（Ｗａｙｎｅ［ＰＡ］：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＵＳ］，２０１２）に記載されているように、ブロス微量希釈法を使用して決定した。

【0165】

Ｗｕらによって記載された方法（Ｗｕ ＪＡら（２００３）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａ
ｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４７（１１）：３４０７－３４１４）の変法を用いて、バイオフィルムを生成した。簡潔には、１×１０^６個のメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２の定常期細胞を、１％グルコースが補充された２ｍｌのトリプシン－ダイズブロスに接種し、通気せずに３７℃の２４ウェル組織培養ディッシュにおいて１８時間増殖させた。浮遊細胞（非接着性細菌）を１×ＰＢＳで洗浄することによって除去し、次いで、残存している細菌（固着性の細菌、すなわちバイオフィルム細菌）をＰｌｙＳｓ２溶解素または様々な濃度の抗生物質（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手したダプトマイシン、リネゾリドまたはバンコマイシン）で最大２４時間処理した。様々な時点（０時間、２時間、４時間、最大２４時間）において、ウェルを１×ＰＢＳで洗浄し、３７℃で１５分間風乾することによって固定し、１ｍｌの１％クリスタルバイオレット溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色することにより、残存しているバイオフィルムを可視化した。クリスタルバイオレットで染色されたバイオフィルムの光学濃度も決定して、より定量的な比較を行った。例示的な密度の研究を図７に提供する。

【0166】

最初の研究では、ＢＡＡ－４２ ＭＲＳＡのバイオフィルムを、ダプトマイシン、リネゾリドおよびバンコマイシンの各々について１０００×ＭＩＣ濃度（１０００μｇ／ｍｌ）、およびＰｌｙＳｓ２溶解素について１×ＭＩＣ（３２μｇ／ｍｌ）で処理した（還元剤を加えずに）。すべてのＭＩＣ値を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）文書Ｍ０７－Ａ９（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｄｉｌｕｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｇｒｏｗ ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ．Ｖｏｌｕｍｅ ３２．Ｗａｙｎｅ［ＰＡ］：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ［ＵＳ］，２０１２）に記載されているブロス微量希釈法を使用して決定した。４時間まで処理されたＭＲＳＡバイオフィルムを図１に示し、６時間まで処理されたＭＲＳＡバイオフィルムを図２に示し、２４時間まで処理されたＭＲＳＡバイオフィルムを図３に示す。１×ＭＩＣ ３２μｇ／ｍｌのＰｌｙＳｓ２溶解素単独で処理したときは、そのバイオフィルムは２時間以内に取り除かれる（図１、２および３）。１０００μｇ／ｍｌ（１０００×ＭＩＣ）のダプトマイシン、バンコマイシンまたはリネゾリドで処理されたとき、バイオフィルムの変化は、４時間または６時間では視覚的には明らかでない（図１および２）。これは、非常に高い用量（１００００μｇ／ｍｌ）のバンコマイシンに対して最小感性のバイオフィルムを示した以前の報告（Ｗｅｉｇｅｌ ＬＭら（２００７）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５１（１）：２３１－２３８）と一致する。

【0167】

より低い濃度のＰｌｙＳｓ２溶解素およびダプトマイシンによる処理を、ＭＲＳＡ菌株
ＢＡＡ－４２のバイオフィルムに対して評価した。バイオフィルムを、より低いＭＩＣ未満の用量のＰｌｙＳｓ２で、０．５時間、１時間、４時間および２４時間処理した。上に記載されたように、ＢＡＡ－４２バイオフィルムを２４ウェルディッシュに生成し、そのウェルをＰｌｙＳｓ２溶解素またはダプトマイシン抗生物質で処理した（適切な培地コントロールとともに）。ＰｌｙＳｓ２の場合、ＭＩＣ未満の用量の３．２μｇ／ｍＬ（１／１０×ＭＩＣ値）または０．３２μｇ／ｍＬ（１／１００×ＭＩＣ値）のいずれかを使用した。ダプトマイシンの場合、１μｇ／ｍＬ（１×ＭＩＣ値）または１０μｇ／ｍＬ（１０×ＭＩＣ値）のいずれかを使用した。それらのウェルを、最長２４時間までインキュベートし、洗浄し、固定し、染色した。結果を図４に示す。１／１００ ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２溶解素でさえも、バイオフィルムの溶解が観察される。ＰｌｙＳｓ２溶解素３．２μｇ／ｍｌ（１／１０×ＭＩＣ）を用いた４時間後に有意な溶解が実証され、０．３２μｇ／ｍｌ（１／１００×ＭＩＣ）を用いた４時間後でさえ、一部の溶解が観察される。最大１０×ＭＩＣのダプトマイシン濃度をを用いても、溶解は認められない。

【0168】

代替のブドウ球菌の溶解素、特に、ＣｌｙＳ溶解素をＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２ ＭＲＳＡバイオフィルムに対して使用して、同等のＭＩＣ研究を完了させた。このＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株に対するＣｌｙＳ溶解素のＭＩＣは、３２μｇ／ｍｌである。ポリスチレン組織培養プレートに、１ウェル（０．２％グルコースを含むトリプシンダイズブロスが入っている）あたり５×１０^５ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２を接種し、３５℃で２４時間インキュベートして、バイオフィルムを形成させた。得られたバイオフィルムを３回洗浄して、浮遊細胞を除去し、３５℃において２４時間、３２μｇ／ｍｌ、３．２μｇ／ｍｌ、０．３２μｇ／ｍｌおよび０．０３２μｇ／ｍｌの濃度のＣｌｙＳ溶解素（または培地のみ）で処理した。各ウェルを洗浄し、２％クリスタルバイオレットで染色した。クリスタルバイオレットは、接着性のバイオフィルム材料を染色する。様々な濃度のＣｌｙＳを使用した結果を図１４に示す。ＣｌｙＳは、３２μｇ／ｍｌ（１×ＭＩＣ）および３．２μｇ／ｍｌ（０．１×ＭＩＣ）において、バイオフィルムを効果的に分散させる。染色されたバイオフィルムの減少が、０．３２μｇ／ｍｌでも観察され、０．０３２μｇ／ｍｌではいくらか観察される。ブドウ球菌の溶解素ＣｌｙＳは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを分散させることおよび減少させることができる。
実施例２

【0169】

ＭＩＣ未満の用量でのダプトマイシン＋溶解素の組み合わせを、バイオフィルムにおいて評価する。ＰｌｙＳｓ２溶解素およびダプトマイシンは、浮遊性のＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞に対して相乗的な致死効果を発揮することが見出されている（米国仮出願番号６１／６４４，９４４および同第６１／７３７，２３９）。一連の実験を行うことにより、この相乗効果がバイオフィルム内の細菌も標的化し得るかを調査した。ブロス微量希釈チェッカーボード法（Ｓｏｐｉｒａｌａ ＭＭら（２０１０）Ａｎｔｉｍｉｃｏｂ Ａｇｅｎｔｓ
ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ５４（１１）：４６７８－４６８３）を適用して、９６ウェルマイクロタイターディッシュにおいて増殖させたＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを成熟させる。細胞を０．２ｍｌの懸濁液中で増殖させることを除いては上に記載された様式で増殖させたＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２の１８時間のバイオフィルムに対して、溶解素とダプトマイシンとのＭＩＣ未満の組み合わせの活性を調査する。バイオフィルムの形成後に、ウェルを１×ＰＢＳで洗浄し、ＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンの単独または一連の組み合わせで、通気せずに２４時間処理する。次いで、そのバイオフィルムを、上記のとおり洗浄し、固定し、染色することにより、バイオフィルム形成を評価する。このようにして、ＭＩＣ未満の薬物の組み合わせの効果は、同じＭＩＣ未満の濃度のいずれかの薬物単独の効果との比較によって評価する。
実施例３
インビトロでの混合バイオフィルム研究

【0170】

複数種のバイオフィルムを標的とするために、ＰｌｙＳｓ２溶解素をダプトマイシンとも組み合わせて使用する。バイオフィルムは、２種以上の細菌種を含むことが多い（Ｙａｎｇ Ｌら（２０１１）ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ ａｎｄ Ｍｅｄ ６２（３）：３３９－３４７）。ＰｌｙＳｓ２溶解素およびダプトマイシンを使用して、ＰｌｙＳｓ２感性およびダプトマイシン感性のＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２、ならびにＰｌｙＳｓ２耐性でダプトマイシン感性のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ菌株からなるバイオフィルムを標的とする。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ菌株は、浮遊性の形態ではダプトマイシンに感性であるが、それにもかかわらず、バイオフィルムの固着性のメンバーとしては、ダプトマイシンに耐性である。その腸球菌は、バイオフィルムから放出されるときだけ、ダプトマイシンに耐性になり得る。ＰｌｙＳｓ２がこの放出を媒介する（ひいては、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓをダプトマイシンに対して感性にする）能力を試験するために、以下の実験を行う。

【0171】

１×１０^６個のブドウ球菌および１×１０^６個の腸球菌という開始接種材料を使用して
（各々、単独でおよび一緒に）、上に記載されたように２４ウェルディッシュにおいてバイオフィルムを生成する。バイオフィルムをＰＢＳで洗浄し、ＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンの単独および併用で（一連のＭＩＣ未満の組み合わせを使用して）２４時間処理する。処理後、バイオフィルムのウェルを、非接着性（生きている細菌と死んだ細菌の両方を含む）および接着性（バイオフィルムの形態）を含む２つの画分に分ける。非接着性の画分を、生存能を調べるためにプレーティングして、ブドウ球菌および腸球菌についての相対的なＣＦＵ数を決定する。得られたＣＦＵ数を、緩衝液コントロールで処理されたバイオフィルムについてのＣＦＵ数と比較する。同時に、残存しているバイオフィルムを、超音波処理によって破壊し、生存能を調べるためにプレーティングする。この様式では、ＰｌｙＳｓ２がバイオフィルムからのＥ．ｆａｅｃａｌｉｓの放出を媒介し、ここで、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓがダプトマイシンによって殺滅され得るかを決定することができる。

【0172】

溶解素^Ｓ抗生物質^Ｓ、溶解素^Ｓ抗生物質^Ｒ、溶解素^Ｒ抗生物質^Ｓの組み合わせを有するバイオフィルムもまた、下記で述べられるように評価する。
Ｉ．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ／Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ混合バイオフィルム－上に記載されたように溶解素＋抗生物質で処理。
ＩＩ．Ｓ．ａｕｒｅｕｓ／Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ混合バイオフィルム、またはＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓのみのバイオフィルムを生成し、評価する。Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ菌から形成されたバイオフィルムを使用して、上記のように実験を行う。
ＩＩＩ．Ｓｔａｐｈ＋Ｓｔｒｅｐ菌バイオフィルムの組み合わせ、ＰｌｙＳｓ２およびダプトマイシンまたは他の抗生物質で処理。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（またはＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）の両方から形成されるバイオフィルムを使用して、上記のように実験を行う。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌属）とＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）の両方が、ＰｌｙＳｓ２に感性であるので、これらの実験は、ダプトマイシンを使用しない。むしろ、ブドウ球菌および連鎖球菌からなる混合バイオフィルム内の細菌を破壊するおよび殺滅するＰｌｙＳｓ２溶解素を単独で評価する。
実施例４
インビボのカテーテルベースのバイオフィルムモデル

【0173】

留置デバイスに関連するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ感染症は、細菌バイオフィルムが従来の抗生物質に対して不応性である性質に起因して、処置が非常に困難であり得、通常、カテーテルなどの感染したデバイスの除去を必要とする。一連の抗生物質を投与することができ、それにより、デバイスに付随する細菌のほとんどが排除されるように見えるかもしれないが、結局、数日以内に感染が再発する。これは、成長して、バイオフィルムを再生息させ（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）、その感染をデバイス部位または他の箇所に再播種する（ｒｅｓｅｅｄｉｎｇ）、バイオフィルム内の残留存続生物であるブドウ球菌に起因すると考えられている（Ｄａｒｏｕｉｃｈｅ ＲＯ（２００４）Ｎ
Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０：１４２２－１４２９）。ゆえに、バイオフィルム内のブドウ球菌を迅速に殺滅し、浮遊性の細菌に対して有効である処置は、非常に有益である。ＰｌｙＳｓ２溶解素は、上記の実施例において、インビトロで迅速かつ効果的にＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを取り除くと実証されている。この研究は、ＰｌｙＳｓ２溶解素が、マウスに埋め込まれたカテーテルに確立されたＳ．ａｕｒｅｕｓバイオフィルムを根絶する能力をインビボで評価する。

【0174】

カテーテルベースのモデルを、側腹部の皮下、腹腔内、または大腿の筋肉内へと置いたカテーテルを使用して評価した（Ｚｈｕ Ｙら（２００７）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７５（９）：４２１９－４２２６のから改変）。このカテーテルベースのマウスモデ
ルを用いることにより、バイオフィルムの生存能に対するＰｌｙＳｓ２の影響をインビボで評価する。埋め込む前に、カテーテルチューブ（可塑剤としてＤＥＨＰ［ジ（２－エチルヘキシル）フタレート］を含有する、ＰＶＣ［ポリ塩化ビニル］；ＣａｒｅＦｕｓｉｏｎ ＳｍａｒｔＳｉｔｅ輸液セット，＃７２０２３）のセグメント上にバイオフィルムをインビトロで成長させる。各２インチのカテーテルの管腔に、２×１０^７ＣＦＵのＳ．ａｕｒｅｕｓを含む０．２５％グルコースが補充された２００μｌのＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）を接種し、バイオフィルムを３７℃で７２時間成長させる。あるいは、カテーテルを２ｍｍのセグメントに切断し、０．２５％グルコースが補充された１．０ｍｌの接種ＴＳＢ中に入れ、カテーテルセグメントを、３日間にわたって毎日、新鮮培地に継代した後、埋め込む。０．１５ｍｌの１００ｍｇ／ｋｇケタミンおよび１０ｍｇ／ｋｇキシラジン（Ｂｕｔｌｅｒ－Ｓｃｈｅｉｎ）の腹腔内注射によって、６～８週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスに麻酔を誘導する。カテーテルのセグメントを、マウスの各側腹部の皮下、あるいは腹腔内の空間もしくは大腿筋に埋め込む。５～１０匹のマウスの群にバイオフィルムを埋め込んだ。埋め込みの１～２４時間後に、マウスを適切な量のＰｌｙＳｓ２、抗生物質もしくはビヒクル、またはＰｌｙＳｓ２＋抗生物質の組み合わせで処置する。各群からのすべてのマウスを、感染の１～４日後に人道的に屠殺した。バイオフィルム形成を定量するために、屠殺の直後に、感染したカテーテルを取り出し、滅菌ＰＢＳ中で３回静かに洗浄して、非接着性細菌を除去し、続いて、５ｍｌの滅菌ＰＢＳの中に入れる。そのカテーテルから超音波処理によって、接着性の細菌を取り出す。次いで、回収された細菌の数を、適切な選択培地での段階希釈およびプレートカウント法によって定量する。あるいは、洗浄したカテーテルを、メチレンブルー中で１５分間インキュベーションすることによって染色し、５ｍｌの滅菌ＰＢＳ中で２回洗浄し、可視化した。次いで、室温の０．２ｍｌの３０％酢酸中で脱染し、６００ｎｍで読み取られた吸光度によって、メチレンブルー染色を定量し得る。残留バイオフィルムの塊の程度は、６００ｎｍの吸光度読み取り値をカテーテルセグメントの重量で除算した値（ＯＤ_６００／ｇｍ）として表現される。

【0175】

図１５は、そのようなカテーテル研究の結果を提供しており、ここで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２）バイオフィルムを３日間成長させたカテーテルを、マウスの皮下の空間に埋め込み、次いで、埋め込みの２４時間後に処置した。各マウスに２つのカテーテルを埋め込み、以下の各条件について２匹のマウスを評価した：ネガティブコントロール（バイオフィルムなし、作用物質なし）、ＰｌｙＳｓ２コントロール（ＰｌｙＳｓ２剤で処理されたバイオフィルムなしのモック）、ビヒクルのみ、ＰｌｙＳｓ２腹腔内投与（ＩＰ）、ＰｌｙＳｓ２静脈内投与（ＩＶ）およびＰｌｙＳｓ２皮下投与（ＳＣ）。ＰｌｙＳｓ２は、１００μｇの単回ボーラス（マウスにおける５ｍｇ／ｋｇおよび約５０μｇ／ｍｌ用量に対応する）として投与した。カテーテルを処置の６時間後に取り出し、メチレンブルーで染色した。各条件下の染色（６００ｎｍにおいて可視化された）の相対量を図１５に示す。ＩＰ、ＩＶおよびＳＣ投与の各々が、染色を減少させ、皮下ボーラスは、カテーテル内の染色を、コントロールレベルの近くまで除去した。
実施例５

【0176】

別の実験セットにおいて、マウスに埋め込まれた頚静脈カテーテルは、ＰｌｙＳｓ２溶解素で事前に滴注して、この前処理による、バイオフィルム感染からのマウスの保護を評価する。上に記載された頚静脈カテーテル動物モデルを使用して、頚静脈カテーテル処置されたマウスのカテーテルを、ＰＢＳ中のＰｌｙＳｓ２溶解素の滴注で２４時間前処理し、その後にＳ．ａｕｒｅｕｓをチャレンジする。コントロール動物には、ＰＢＳだけで前処理したカテーテルを与える。チャレンジの当日、チャレンジの２時間前に、すべてのカテーテルにＰＢＳを流して、未結合の過剰の溶解素を除去し、次いで、上に記載されたように、尾静脈を介してマウスにＳ．ａｕｒｅｕｓをチャレンジする。チャレンジされた動物を、細菌チャレンジ後の様々な日に屠殺し、カテーテルおよび器官を回収し、上に記載
されたように細菌を定量する。
実施例６

【0177】

ブドウ球菌性心内膜炎は、ラットの大動脈弁において実験的に誘発され得る、バイオフィルムに基づく感染症である（Ｅｎｔｅｎｚａ ＪＭら（２００５）ＩＡＩ ７３：９９０－９９８）。簡潔には、無菌の大動脈疣贅形成をラットにおいて生じさせ、溶解素を送達する注入ポンプを、記載されているように（Ｅｎｔｅｎｚａら）設置する。２４時間後に１０^５～１０^７個のブドウ球菌をｉ．ｖ．チャレンジすることによって心内膜炎を誘発させる。感染の２４または４８時間後のいずれかに、溶解素および／または抗生物質（例えば、ダプトマイシン、バンコマイシンまたはリネゾリド）を静脈内投与する。コントロールラットには、緩衝液だけを与える。７２時間後までの感染後の様々な時点において、動物を屠殺し、血液および疣贅形成物の定量的な培養を行った。細菌の密度は、それぞれ組織の１ｍＬまたは１グラムあたりのｌｏｇ_１０ＣＦＵとして表現される。
実施例７

【0178】

ＰｌｙＳｓ２および標準的治療の抗生物質の相対的なバイオフィルム根絶活性を比較するために、ＰｌｙＳｓ２および抗生物質の活性の２４時間の経時的解析をＭＲＳＡバイオフィルムにおいて行った。１０^５個の細菌（ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２）を、１ウェルあたり０．２％グルコースを含む０．５ｍｌのトリプシン－ダイズブロス（ＴＳＢ＋）中に接種し、３７℃で２４時間インキュベートすることによって、バイオフィルムを２４ウェルポリスチレンプレートにおいて生成した。評価される各処置の時点（０、０．５、１、２、４、６および２４時間）に対して１枚のプレートを作製した。２４時間後、培地を吸引し、ウェルを１×ＰＢＳで２回洗浄し、薬物処置を加え、処置時間を開始した。１ｍｌのＭＨＢ２（または１ｍｌあたり５０μｇ ＣａＣｌ_２が補充されたＭＨＢ２）中の示されている薬物濃度（ダプトマイシン、バンコマイシンまたはリネゾリドについては１０００×ＭＩＣ；ＰｌｙＳｓ２溶解素については１×ＭＩＣ）を各ウェルに加え、示されている期間にわたってインキュベートした後、吸引し、１×ＰＢＳで２回洗浄し、１５分間風乾した。ウェルを、１ｍｌ中の３％クリスタルバイオレット溶液で５分間染色し、次いで、吸引し、１×ＰＢＳで３回洗浄し、１５分間風乾し、写真撮影した。すべての実験を２つ組で行った。結果を図６および７に示す。ウェルのクリスタルバイオレット染色を図６に示し、プレートのウェルに保持されている色素の定量を図７に示す。１×ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２は、２時間までにバイオフィルムを完全に取り除いたが、１０００×ＭＩＣ濃度のダプトマイシン、バンコマイシンおよびリネゾリドは、２４時間にバイオフィルムのクリアランスを示さなかった。

【0179】

ＭＩＣ未満の濃度のＰｌｙＳｓ２がバイオフィルムを処置する能力を決定するために、２４時間の経時的解析を行った。１０^５個の細菌（ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２）を、１ウェルあたり０．２％グルコースを含む０．５ｍｌのトリプシン－ダイズブロス（ＴＳＢ＋）中に接種し、３７℃で２４時間インキュベートすることによって、バイオフィルムを２４ウェルポリスチレンプレートにおいて生成した。評価される各処置の時点（３０分、１時間、４時間、２４時間）に対して１枚のプレートを作製した。２４時間後、培地を吸引し、ウェルを１×ＰＢＳで２回洗浄し、ＰｌｙＳｓ２を加え、処置時間を開始した。１ｍｌのＭＨＢ２中の示されているＰｌｙＳｓ２濃度（０．１×ＭＩＣおよび０．０１×ＭＩＣ）または培地のみを各ウェルに加え、示されている期間にわたってインキュベートした後、吸引し、１×ＰＢＳで２回洗浄し、１５分間風乾した。ウェルを、１ｍｌ中の３％クリスタルバイオレット溶液で５分間染色し、次いで、吸引し、１×ＰＢＳで３回洗浄し、１５分間風乾し、写真撮影した。すべての実験を２つ組で行った。結果を図８に示す。０．１×ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２は、４時間までにバイオフィルムを取り除いた。０．０１×ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２は、４時間で部分的なクリアランスをもたらし、完全なクリアランスは、２４時間の時点までに観察された。
実施例８

【0180】

カテーテル上に成長したＭＲＳＡバイオフィルムに対するＰｌｙＳｓ２とダプトマイシンの両方について、バイオフィルム根絶活性を評価した。１０^５個の細菌（ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２）を、１セグメントあたり０．２％グルコースを含む０．２ｍｌのトリプシン－ダイズブロス（ＴＳＢ＋）中に接種し、３７℃で７２時間インキュベートすることによって、バイオフィルムをカテーテルチューブの２インチセグメント（可塑剤としてＤＥＨＰ［ジ（２－エチルヘキシル）フタレート］を含有する、ＰＶＣ［ポリ塩化ビニル］；（ＣａｒｅＦｕｓｉｏｎ ＳｍａｒｔＳｉｔｅ輸液セット，＃７２０２３）において生成した。メチレンブルーでの染色またはＣＦＵの定量のためすべてのサンプルを２つ組用意した。７２時間後、培地を流し出し、セグメントを１ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄し、処理を加えた。０．２ｍｌの乳酸加リンガー溶液中の示されている薬物濃度（ダプトマイシンについては１×ＭＩＣおよび１０００×ＭＩＣ、ＰｌｙＳｓ２については１×ＭＩＣ）を各セグメントに加え、２４時間インキュベートした後、フラッシングし、１ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄した。次いで、２つ組のサンプルを以下のとおり調査した：バイオフィルムの根絶を評価するために、セグメントを、０．２２ｍｌ中の０．０２％メチレンブルー（水中）溶液で１５分間染色した。次いで、セグメントをフラッシングし、ｄＨ_２Ｏで３回洗浄し、１５分間風乾し、写真撮影した。残留バイオフィルム内に保持されている生細胞の量を定量するために、２つ組のセグメントを０．２２ｍｌの溶解緩衝液（乳酸加リンガー溶液中の１００μｇ／ｍｌリゾスタフィン）で８分間処理した。次に、０．１ｍｌのサンプルを取り出し、９６ウェル一枚板（ｓｏｌｉｄ）白色ポリスチレンプレートに加え、０．１ｍｌのＰｒｏｍｅｇａ ＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ／Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬と混合し、直ちに相対発光量（ＲＬＵ）を測定し（キットの製造者の指示によって指定されるように）、予め作成しておいた、ＲＬＵ値を既知濃度の細菌と相関させた検量線と比較した。この様式で、各バイオフィルムにおける細菌のＣＦＵの推定値を決定した。

【0181】

結果を図９に示す。相対的なバイオフィルム染色を図９Ａに示す。ＰｌｙＳｓ２は、１×ＭＩＣにおいてカテーテルからバイオフィルムを完全に取り除いたが、ダプトマイシンは、１０００×ＭＩＣでさえも有意なバイオフィルムの除去をしなかった。図９Ｂに認められるように、１×ＭＩＣのＰｌｙＳｓ２は、ＣＦＵを検出限界である１００ＣＦＵ／ｍｌにまで下げたが、１×ＭＩＣのダプトマイシンではＣＦＵの減少は認められず、１０００×ＭＩＣダプトマイシンでは、１億ＣＦＵ／ｍｌから１００万ＣＦＵ／ｍｌへの２ｌｏｇ減少が観察された。

【0182】

カテーテルからバイオフィルムを根絶するために必要なＰｌｙＳｓ２の最低量を決定するために、滴定実験を行った（図１０）。１０^５個の細菌（ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２）を、１セグメントあたり０．２％グルコースを含む０．２ｍｌのトリプシン－ダイズブロス（ＴＳＢ＋）中に接種し、３７℃で７２時間インキュベートすることによって、バイオフィルムをＤＥＨＰカテーテルチューブの２ｃｍセグメントに生成した。７２時間後、培地を流し出し、セグメントを１ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄し、薬物処理を加えた。０．２ｍｌの乳酸加リンガー溶液中の示されている薬物濃度（１×、０．１×、０．０１×、０．００１×、０．０００１×および０．００００１×ＭＩＣの量のＰｌｙＳｓ２）を各セグメントに加え、２４時間インキュベートした後、フラッシングし、１ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄した。セグメントを、０．２２ｍｌ中の０．０２％メチレンブルー（水中）溶液で１５分間染色した後、フラッシングし、ｄＨ２Ｏで３回洗浄し、１５分間風乾し、写真撮影した。染色によって決定されたとおり、バイオフィルムを完全に根絶するために必要なＰｌｙＳｓ２の量は、０．０１×ＭＩＣ（０．３２μｇ／ｍｌ）だった（図１０）。ダプトマイシン（１×、１０×、１００×、１０００×、５０００×ＭＩＣダプトマイシン）を用いて行われた同様の滴定解析は、５０００×ＭＩＣ（５ｍｇ／ｍｌ）もの高
いダプトマイシンの濃度でも、バイオフィルムは除去されないことを示した（図１１）。

【0183】

溶解素または抗生物質でバイオフィルム（ｂｉｏｆｉｏｌｍ）を処理した後に残存しているＣＦＵを定量するために、図１０および１１において評価したとおり、２つ組のセグメントを０．２２ｍｌの溶解緩衝液（乳酸加リンガー溶液中の１００μｇ／ｍｌリゾスタフィン）で８分間処理した。次に、０．１ｍｌのサンプルを取り出し、９６ウェル一枚板白色ポリスチレンプレートに加え、０．１ｍｌのＰｒｏｍｅｇａ ＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ／Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬と混合し、直ちに相対発光量（ＲＬＵ）を測定し（キットの製造者の指示によって指定されるように）、予め作成しておいた、ＲＬＵ値を既知濃度の細菌と相関させた検量線と比較した。この様式で、各バイオフィルムにおける細菌のＣＦＵの推定値を決定した。この滴定解析から、メチレンブルー染色の結果が確かめられ、それを図１３に提供する。ＰｌｙＳｓ２は、バイオフィルム細菌を除去する点において、０．０１×ＭＩＣ濃度まで活性であるが、ダプトマイシンは、５０００×ＭＩＣの濃度まで完全に無効である。

【0184】

次いで、ＭＲＳＡカテーテルバイオフィルムに対するＰｌｙＳｓ２活性の経時的解析を行った（図１２）。１０^５個の細菌（ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２）を、１セグメントあたり０．２％グルコースを含む０．２ｍｌのトリプシン－ダイズブロス（ＴＳＢ＋）中に接種し、３７℃で７２時間インキュベートすることによって、バイオフィルムをＤＥＨＰカテーテルチューブの２インチセグメントにおいて生成した。メチレンブルー染色およびＣＦＵ定量を適応させるために、示されている各時点（０分、５分、１５分、３０分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間）に対して２つのサンプルを用意した。７２時間後、培地を流し出し、セグメントを１ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄し、処理を加えた。０．２ｍｌの乳酸加リンガー溶液中のＰｌｙＳｓ２（１×ＭＩＣ濃度、すなわち３２μｇ／ｍＬ）を各セグメントに加え、示されている時点にわたってインキュベートした後、フラッシングし、１ｍｌの１×ＰＢＳで洗浄した。次いで、２つ組のサンプルを各時点において以下のとおり調査した：セグメントを、０．２２ｍｌ中の０．０２％メチレンブルー（水中）溶液で１５分間染色した。次いで、セグメントをフラッシングし、ｄＨ２Ｏで３回洗浄し、１５分間風乾し、写真撮影した。２つ組のセグメントを０．２２ｍｌの溶解緩衝液（乳酸加リンガー溶液中の１００μｇ／ｍｌリゾスタフィン）で８分間処理した。次に、０．１ｍｌのサンプルを取り出し、９６ウェル一枚板白色ポリスチレンプレートに加え、０．１ｍｌのＰｒｏｍｅｇａ ＢａｃＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ／Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ試薬と混合し、直ちに相対発光量（ＲＬＵ）を測定し（キットの製造者の指示によって指定されるように）、予め作成しておいた、ＲＬＵ値を既知濃度の細菌と相関させた検量線と比較した。この様式で、各バイオフィルムにおける細菌のＣＦＵの推定値を決定した。この経時的解析から、１×ＭＩＣ ＰｌｙＳｓ２において、染色可能なバイオフィルムがカテーテルから経時的に漸進的除去されることが明らかになり、６０分までに完全に除去された（図１２Ａ）。ＣＦＵ解析から、同様の漸進的な時間経過が明らかになり、ＣＦＵ値は、６０分までに検出限界（１００ＣＦＵ／ｍｌ）に達した（図１２Ｂ）。
実施例９

【0185】

シミュレートされたカテーテルの状況におけるＰｌｙＳｓ２の安定性を決定するために、様々な濃度のＰｌｙＳｓ２を３７℃の乳酸加リンガー溶液中でインキュベートした。７日後に、１×１０^５個のブドウ球菌を加え、４時間インキュベートし、次いで、プロテイナーゼＫで処理して、残留ＰｌｙＳｓ２を取り出し、生存能を調べるために段階希釈およびプレーティングすることによって、ＰｌｙＳｓ２の溶解活性を評価した。各条件に対して得られたＣＦＵ値を１×１０^５で除算することにより、％活性喪失を決定した。

【0186】

結果を下記の表６に作表する。３７℃の乳酸加リンガー溶液中での７日間のインキュベ
ーションの後、１０×および１００×ＭＩＣ濃度のＰｌｙＳｓ２については、検出不可能な活性喪失が観察されたが、１×ＭＩＣサンプルについては、５８．３％喪失が決定された。
表６
乳酸加リンガー溶液中の３７℃におけるＰｌｙＳｓ２の安定性

【表6】

【0187】

上記のことは、ＰｌｙＳｓ２が、シミュレートされたカテーテルの状況において、少なくとも７日までは活性かつ安定であり、ブドウ球菌を効果的に殺滅し、それにより、例示的な標準ケアＩＶおよびフラッシュ溶液である乳酸加リンガー中で長期間にわたってインキュベートした後でさえ、細菌集落形成を防止し得ることを示している。
実施例１０

【0188】

溶解素処理の後または溶解素処理すると、バイオフィルムから追い出され、カテーテルの管腔の液相に懸濁される細菌の生存能を評価するためにその管腔の無菌化を評価する経時的研究を行った。上に記載された図１２において、バイオフィルム（壁に対して接着性）が、失われ、１時間までに完全に分散されることが実証された。本研究において、生細胞を検出するＣＦＵ解析によって評価される、管腔内の細菌の無菌化（完全な殺滅）は、およそ６～２４時間の間に生じる。バイオフィルムを、菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２を用いて３７℃で３日間形成した。バイオフィルムを１×ＰＢＳで洗浄し（浮遊細胞を除去するため）、乳酸加リンガー溶液（緩衝液コントロール）またはＰｌｙＳｓ２溶解素（１×ＭＩＣ濃度で）またはダプトマイシン（１×ＭＩＣ濃度で）を含む乳酸加リンガー溶液のいずれかで、およびＰｌｙＳｓ２溶解素（１０×ＭＩＣ濃度で）で処理した。バイオフィルムを最大２４時間処理し、ＣＦＵを２分、１５分、３０分、１時間、２時間、６時間および２４時間に評価した。各時点において、カテーテルの管腔の内容物を取り出し、生存能を調べるためにプレーティングした。図１６は、緩衝液のみに対する１×ＭＩＣ（３２μｇ／ｍｌ）、Ｉ×ＭＩＣダプトマイシンおよび１０×ＭＩＣ（３２０μｇ／ｍｌ）のレベルの処理の結果を提供している。
実施例１１

【0189】

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓバイオフィルムに対する有効性について溶解素を評価した。様々なＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ菌株のバイオフィルムを、ポリスチレン２４ウェルマイクロタイタープレートにおいて生成し、ＰｌｙＳＳ２溶解素で処理することにより、各菌株に対するＰｌｙＳｓ２の最小阻止濃度（ＭＩＣ）およびバイオフィルム根絶濃度（ＢＥＣ）を決定した。２０個を超える異なるＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ菌株に対する結果を下記の表７に作表する。上記の実施例に記載され、言及されているように、ブロス微量希釈法について標準的なＣＬＳＩ法を使用して、ＭＩＣ（単位はマイクログラム／ｍｌ）を決定し、計算した。ＰｌｙＳｓ２のバイオフィルム根絶濃度（ＢＥＣ）（単位はマイクログラム／ｍｌ）は、示されている菌株の２４時間のバイオフィルムを完全に破壊する希釈範囲の最低濃度である。

【0190】

ＢＥＣを決定するために、２４時間のバイオフィルムを、２４ウェルプレートにおいて成長させ、ＰＢＳで２回洗浄し、乳酸加リンガー溶液で調製したＰｌｙＳｓ２（希釈範囲
）ありまたはなしで処理した。処理したプレートを３７℃（周囲空気）で２４時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット（ＣＶ）で１５分間染色した。次に、そのＣＶ染色を、各ウェルにおいて１ｍＬの３３％酢酸で可溶化し、２００μＬの可溶化したＣＶを使用して、吸光度（ＯＤ_{６００ｎｍ}）を読み出した。ウェルの吸光度を溶解素なしのウェル（バイオフィルムコントロール）の吸光度で除算することによって、パーセントバイオフィルムを決定した。ＢＥＣは、＞７５％のバイオフィルムの排除を示した値として決定された。
表７

【表7】

ＭＩＣ＝ブロス微量希釈法について標準的なＣＬＳＩ法を使用して計算されたＰｌｙＳｓ２の最小阻止濃度（単位はμｇ／ｍｌ）。ｎａは、データが入手できないことを示す。
ＢＥＣ＝ＰｌｙＳｓ２のバイオフィルム根絶濃度（単位はμｇ／ｍｌ）は、示されている菌株の２４時間のバイオフィルムを完全に破壊する希釈範囲の最低濃度である。

【0191】

これらの結果は、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓバイオフィルムに対するＰｌｙＳｓ２溶解素の強力な活性を実証している；著しいことに、強力な活性は、ＰｌｙＳｓ２のＭＩＣが高い菌株のｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓバイオフィルムにまで及び；著しいことに、強力な活性は、ＰｌｙＳｓ２のＭＩＣレベルが高い菌株にまで及ぶ。これらのデータは、Ｐｌｙ
Ｓｓ２が、広範囲のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓバイオフィルムに対して活性であることを示している。

【0192】

カテーテル内のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓバイオフィルムをＰｌｙＳｓ２で処理し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの研究について上に記載されたような方法を用いて同様に評価した。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、前に記載したＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株と同程度の頑強さでカテーテル上にバイオフィルムを生成することはないが、しかしながら、バイオフィルムの成長は生じたので、それは評価することができた。

【0193】

１０×ＭＩＣおよびそれ未満のＰｌｙＳｓ２で処理されたカテーテル上のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（バンコマイシン中間感性Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＶＩＳＥ）菌株である菌株ＣＦＳ３１３ ＮＲＳ３４）のバイオフィルム研究の結果を図１７に示す。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓバイオフィルムは、０．１×ＭＩＣまで下げたＰｌｙＳｓ２濃度において破壊される。ここでのＭＩＣは、８μｇ／ｍｌである。同様の結果および同等の活性レベルが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ菌株ＣＦＳ２１８（ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２）を用いたとき観察された。
実施例１２

【0194】

バイオフィルム防止アッセイの結果を図１８に示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＭＲＳＡ菌株ＢＡＡ－４２（５×１０^５細菌／ｍｌ）を、２４ウェルプレートの行の各ウェル中の２ｍｌのＴＳＢ＋０．２％グルコースに接種した。直ちに溶解素ＰｌｙＳｓ２（濃度１×ＭＩＣ（３２μｇ／ｍｌ）、０．１×ＭＩＣ、０．０１×ＭＩＣ、０．００１×ＭＩＣおよび０．０００１×ＭＩＣで）を加え、次いで、周囲空気において３７℃で６時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレットで染色し、写真撮影することにより、各条件下のバイオフィルムの発生を評価した。緩衝液コントロールも同時に評価した。この研究では、細菌および溶解素ＰｌｙＳｓ２（種々の濃度）を同時に加え、バイオフィルム形成を６時間進める。図１８において実証されるように、１×および０．１×ＭＩＣ ＰｌｙＳｓ２とのプレインキュベーションによって、その後のバイオフィルム形成が効果的かつ完全に防止され得る。したがって、ＰｌｙＳｓ２は、成熟したバイオフィルムを根絶し得るだけでなく、新規のバイオフィルム形成も同様に防止し得る。
実施例１３

【0195】

上に記載されたようなＢＡＡ－４２ ＭＲＳＡによって生成されるバイオフィルムに加えて、さらなるＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株のバイオフィルムを、ＰｌｙＳｓ２溶解素に対する感受性について評価した。ＭＲＳＡ菌株ＣＦＳ５５３（ＡＴＣＣ４３３００）（図１９）およびＣＦＳ９９２（ＪＭＩ５３８１）の各々を、上に記載されたような方法を使用するカテーテル研究において評価した。各場合において、３日経過したバイオフィルムを洗浄し、示されているＰｌｙＳＳ２濃度で４時間処理した。菌株ＡＴＣＣ４３３０に対する１×ＭＩＣは、１６μｇ／ｍｌであり、菌株ＪＭＩ５３８１に対する１×ＭＩＣは、３２μｇ／ｍｌである。図１９および２０に示されているように、これらの代替のＭＲＳＡ菌株のバイオフィルムは、ＰｌｙＳｓ２に感受性であり、Ｐｌｙｓｓ２は、１０×ＭＩＣ、１×ＭＩＣおよび０．１×ＭＩＣのレベルにおいて、カテーテルバイオフィルムを根絶させ、完全に分散させた。それらのバイオフィルムは、０．０１×ＭＩＣ ＰｌｙＳｓ２を使用したとき、各菌株において有意に減少した。
実施例１４
バイオフィルムを、上記のようにカテーテルチューブ（可塑剤としてＤＥＨＰを含むＰＶＣ）上に生成し、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によってＰｌｙＳｓ２感性について評価した。カテーテル表面上のＭＲＳＡ菌株ＣＦＳ２１８（ＭＲＳＡ菌株ＡＴＣＣ ＢＡＡ－４２）の３日経過したバイオフィルムを、乳酸加リンガー溶液中の１×ＭＩＣ濃度（すなわち、３２μｇ／ｍｌ）のＰｌｙＳｓ２で３０秒間または１５分間のいずれかで処理し
た後、その処理物を洗浄し、残存しているバイオフィルムをグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定した。カテーテル表面上での固定の後、サンプルをさらに処理し、５０００×倍率の走査型電子顕微鏡法によって解析した（図２１）。緩衝液のみ（すなわち、乳酸加リンガー溶液のみ）による処理をコントロールとして含める。図２１に示されているように、ＰｌｙＳｓ２処理は、ＭＲＳＡバイオフィルムを迅速に減少させ（３０秒以内）、１５分までに、バイオフィルムをほぼ完全に除去する。

【0196】

参考文献

【数1】

【数2】

【数3】

【数4】

【0197】

本発明は、その精神または必須の特徴から逸脱することなく、他の形態で具体化されてもよいし、他の方法で行われてもよい。ゆえに、本開示は、すべての態様において、例証するものであって、限定するものではないと見なされるべきであり、本発明の範囲は、添付の請求項によって示され、等価な意味および範囲に入るすべての変更が、その中に包含されると意図される。

【0198】

様々な参考文献が、本明細書全体にわたって引用されてきたが、それらの各々は、その全体が参照により本明細書中に援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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