特許 7368066 エンドツーエンド細胞療法の自動化

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-16

(45)【発行日】2023-10-24

(54)【発明の名称】エンドツーエンド細胞療法の自動化

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20231017BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20231017BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20231017BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

C12N5/0783

C12M1/00 A

【請求項の数】 27

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2022056204

(22)【出願日】2022-03-30

(62)【分割の表示】P 2020524207の分割

【原出願日】2018-08-31

(65)【公開番号】P2022104959

(43)【公開日】2022-07-12

【審査請求日】2022-05-02

(31)【優先権主張番号】62/553,214

(32)【優先日】2017-09-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/670,391

(32)【優先日】2018-05-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】512190365

【氏名又は名称】ロンザ ウォーカーズヴィル，インコーポレーテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】503147734

【氏名又は名称】ロンザ ケルン ゲーエムベーハー

(73)【特許権者】

【識別番号】520070448

【氏名又は名称】オクタン バイオテック インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＯＣＴＡＮＥ ＢＩＯＴＥＣＨ ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】シー， ヤーリン

(72)【発明者】

【氏名】マカフィー， エリカ

(72)【発明者】

【氏名】バンダパール， サマタ

(72)【発明者】

【氏名】シーホフ， アン

(72)【発明者】

【氏名】グレイッスナー， ティモ

(72)【発明者】

【氏名】オコナー， ジョセフ

(72)【発明者】

【氏名】アブラハム， エイタン

(72)【発明者】

【氏名】パープラ， ケリー

(72)【発明者】

【氏名】トレイナー， ヌアラ

(72)【発明者】

【氏名】スミス， ティモシー

【審査官】伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１７－５１３４９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５１４５１７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ５／００

Ｃ１２Ｍ １／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法であって、
（ａ）活性化試薬を用いて、Ｔ細胞培養物を活性化して、活性化された免疫細胞培養物を生成する工程、
（ｂ）ウイルスベクターを用いて、活性化されたＴ細胞培養物を形質導入して、形質導入されたＴ細胞培養物を生成する工程、
（ｃ）形質導入されたＴ細胞培養物を拡大する工程、
（ｄ）（ｃ）の拡大したＴ細胞培養物を濃縮する工程、及び、
（ｅ）（ｄ）の濃縮されたＴ細胞培養物を回収して、遺伝子修飾されたＴ細胞培養物を生成する工程
を含み、
（ａ）～（ｅ）は完全に密閉された細胞工学システムによって行われ、（ａ）～（ｅ）は遺伝子修飾されたＴ細胞培養物を生成するプロセスを介して最適化されており、
前記細胞工学システムが、前記方法を開始する前に、（ａ）のＴ細胞培養物、前記活性化試薬、及び細胞培養培地を含み、
前記細胞工学システムが
細胞培養チャンバーを含む高温チャンバーと、
温度センサー、ｐＨセンサー、グルコースセンサー、酸素センサー、二酸化炭素センサー、乳酸センサー／モニター、及び／又は光学密度センサーから選択される１つ以上のセンサーと、
細胞培養チャンバーに接続された１つ以上の流体経路と
を含み、
ここで、細胞培養チャンバーは、平坦で柔軟性がないチャンバーであり
前記流体経路は、ガス透過性チューブを有し、前記１つ以上のセンサーを介して、細胞培養チャンバー内の細胞を乱すことなく、再循環、老廃物の除去、均一なガス交換及び細胞培養チャンバーへの栄養の分配を提供し、
前記プロセスは自己調節プロセスであり、前記１つ以上のセンサーによるモニタリングと、前記モニタリングに基づいて、温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、及び前記形質導入されたＴ細胞培養物の光学濃度のうち１つ以上を調節することを含む、
方法。

【請求項2】

少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾されたＴ細胞を生成する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

少なくとも約２０億個の生存可能な遺伝子修飾されたＴ細胞を生成する、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

Ｔ細胞培養物がキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ウイルスベクターがキメラ抗原受容体をコードする、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記Ｔ細胞培養物が少なくとも１つのアクセサリー細胞を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記アクセサリー細胞が単球又は単球由来細胞を含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記アクセサリー細胞が、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含む、Ｔ細胞受容体に対する抗原を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記活性化試薬が抗体又は樹状細胞を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記抗体が表面に固定化されている、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記表面がビーズの表面である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記抗体が可溶性抗体である、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

前記抗体が、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の少なくとも１つを含む、請求項９～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記形質導入が、ウイルス感染、エレクトロポレーション、膜破壊、又はそれらの組み合わせによって行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記形質導入が、細胞培養培地中でウイルスベクターを混合し、及び培地中のウイルスベクターを活性化された免疫細胞培養物に均一に送達することを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記拡大が、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄及びモニタリングの少なくとも１つ又は複数を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが免疫細胞培養物に対して最適化される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネントを通じて細胞培養培地を再循環させる、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルがステップ（ｃ）の間に減少する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記細胞工学システムが、形質導入されたＴ細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択のうちの１つ又は複数の複数回のラウンドを行うように構成されている、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記濃縮が、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記プロセスが、遠心分離又は濾過のパラメータを調節することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われる、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記ステップ（ａ）の後に、活性化された免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記細胞工学システムが、前記方法を開始する前に、（ａ）の細胞培養物、活性化試薬、ウイルスベクター、及び細胞培養培地を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記細胞培養チャンバーに接続された前記１つ以上の流体経路に流体接続されたアクセスポートから前記ウイルスベクターを受けるステップをさらに含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[0001]本開示は、完全に密閉された細胞工学システムを利用して、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞を含む遺伝子修飾された免疫細胞を生成する自動化方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

[0002]先進的な細胞療法の臨床的採用の加速についての期待が高まるにつれて、これらの療法が世界中の患者に利益をもたらすことができる基礎となる製造戦略により多くの注目が集まっている。細胞療法は臨床的に大きな期待を抱いているが、償還に比べて高い製造コストは商業化への手強い障害となる。したがって、費用対効果、プロセス効率、及び製造物の一貫性の必要性は、多くの細胞療法分野、特にＴ細胞免疫療法の自動化の努力を推進している（例えば、Ｗａｎｇ、２０１６年を参照されたい）。

【0003】

[0003]キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を使用した免疫療法試験からの最近の成功した臨床結果は、以前に治療不可能な癌に苦しむ患者に新たな希望を提供する（例えば、Ｌｕ、２０１７年；Ｂｅｒｄｅｊａ、２０１７年；Ｋｅｂｒｉａｅｉ、２０１６年を参照されたい）。これらの新規な治療薬が臨床試験段階から商業規模へと移行するにつれて、細胞製造に関連するチャレンジが生じている（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ、２０１７年を参照されたい）。

【0004】

[0004]これらの細胞の生成は、患者特有の製造物のために、かなりの手動の関与を必要とする場合がある。ＣＡＲ Ｔ細胞培養の自動化は、細胞の活性化、形質導入、及び拡大などの複数の高感受性ユニット操作のために特に困難である。活性化は特に重要であり、これは、このプロセスの効率が形質導入及び拡大に影響を与える可能性があるためである。

【0005】

[0005]これらの重要な免疫療法を広範な患者集団に転換するには、細胞の活性化、形質導入、及び拡大の商業的製造プラットフォームへの統合が重要である。これらの救命治療を世界の患者集団に適用するには、個別化された医療をサポートするために製造技術のシフトを行う必要がある。自動化の利点は、以前に説明されている（例えば、Ｔｒａｉｎｏｒ、２０１４年；Ｍａｈｄａｖｉ、２０１５年を参照されたい）。これらの利点には、自動化の使用に関連する労働時間の節約、並びに製造物の一貫性の向上、部屋分類の削減、クリーンルームの設置面積の削減、トレーニングの複雑性の削減、及びスケールアップと追跡ロジスティクスの改善が含まれる。さらに、ソフトウェアを使用して、自動生成された電子バッチ記録を用いて、文書化プロセスを合理化し、すべての処理装置、試薬、患者識別、オペレーター識別、処理中のセンサーデータなどの履歴を提供することができる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

[0006]一部の実施形態では、本明細書において、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法が提供され、本方法は、活性化試薬を用いて、免疫細胞培養物を活性化して、活性化免疫細胞培養物を生成し；ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し；形質導入された免疫細胞培養物を拡大し；（ｃ）の拡大した免疫細胞培養物を濃縮し；及び（ｄ）の濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含み、さらに、拡大された免疫細胞培養物及び濃縮された免疫細胞培養物のいずれか又は両方を洗浄することをさらに含み、（ａ）～（ｅ）は完全に密閉された細胞工学システムによって行われ、（ａ）～（ｅ）は遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成するプロセスを介して最適化される。

【0007】

[0007]さらなる実施形態では、本明細書において、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の好ましい表現型を促進する方法が提供され、本方法は、活性化試薬を用いて、免疫細胞培養物を活性化して、活性化免疫細胞培養物を生成し、活性化試薬及び活性化条件は、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の表現型を促進し；ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し；形質導入された免疫細胞培養物を拡大し；（ｃ）の拡大した免疫細胞培養物を濃縮し；及び（ｄ）の濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含み、（ａ）～（ｅ）は完全に密閉された自動化細胞工学システムによって行われる。

【0008】

[0008]追加の実施形態では、本明細書において、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法が提供され、本方法は、活性化試薬を用いて、免疫細胞培養物を活性化して、活性化免疫細胞培養物を生成し；ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し；形質導入された免疫細胞培養物を拡大し；（ｃ）の拡大した免疫細胞培養物を濃縮し；及び（ｄ）の濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含み、（ａ）～（ｅ）は完全に密閉された自動化細胞工学システムによって行われ、（ａ）～（ｅ）の各々は、最適化された細胞密度（細胞／ｍＬ）及び最適化された細胞密集度（細胞／ｃｍ^２）を有する免疫細胞培養物を用いて行われる。

【0009】

[0009]追加の実施形態では、本明細書において、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法が提供され、本方法は、活性化試薬を用いて、免疫細胞培養物を活性化して、活性化免疫細胞培養物を生成し；ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し；形質導入された免疫細胞培養物を拡大し、形質導入された免疫細胞培養物は拡大中に振とうされず；（ｃ）の拡大した免疫細胞培養物を濃縮し；及び（ｄ）の濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含み、（ａ）～（ｅ）は、完全に密閉された自動化細胞工学システムによって行われる。

【0010】

[0010]なおさらなる実施形態では、本明細書において、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法が提供され、本方法は、細胞工学システムによって行われ、活性化試薬を用いて免疫細胞培養物を活性化して、細胞工学システムの第１のチャンバーで活性化された免疫細胞培養物を生成し；活性化された免疫細胞培養物を形質導入し、形質導入が、活性化された免疫細胞培養物を第１のチャンバーからエレクトロポレーションユニットに移し；活性化された免疫細胞培養物をベクターでエレクトロポレーションして、形質導入された免疫細胞培養物を生成し；形質導入された免疫細胞培養物を細胞工学システムの第２のチャンバーに移すことを含み；形質導入された免疫細胞培養物を拡大し；（ｃ）の拡大した免疫細胞培養物を濃縮し；及び（ｄ）の濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された細胞培養物を生成することを含む。

【0011】

[0011]追加の実施形態では、本明細書において、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットが提供され、細胞培養培地を保存するための低温チャンバー；免疫細胞培養物の活性化、形質導入及び拡大を行うための高温チャンバー、高温チャンバーは熱障壁によって低温チャンバーから分離されて、高温チャンバーは細胞培養チャンバーを含み；及び細胞培養チャンバーに接続された１つ又は複数の流動経路、該流動経路は、細胞培養チャンバー内の細胞を乱すことなく、再循環、老廃物の除去、均一なガス交換及び細胞培養チャンバーへの栄養の分配を提供する。

【0012】

[0012]なおさらなる実施形態では、本明細書において、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットが提供され、免疫細胞培養物を収容するように構成されたチャンバー体積を有する免疫細胞培養物の活性化、形質導入及び／又は拡大を行うための細胞培養チャンバー、免疫細胞培養物を収容せずに、培地及び他の作業流体に追加の体積を提供することにより、チャンバーの作業体積を増加させるためのサテライト体積、該サテライト体積は、免疫細胞培養物を乱すことなく、培地が培養チャンバーと交換されるように、１つ又は複数の流体経路を介して細胞培養チャンバーに流体接続される。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の一般化された製造プロセスを示す図である。

【図2】本明細書の実施形態で説明される例示的な細胞工学システムを含む実験室空間を示す図である。

【図3】本明細書の実施形態で説明される細胞工学システムで行われることができるＣＡＲ Ｔ細胞生成プロセスを示す図である。

【図4】コクーン（ＣＯＣＯＯＮ）システムとＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞の集団を維持するための制御方法との比較を示す図である。

【図5】コクーンシステムとＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞集団におけるＣＡＲ Ｔ細胞の量の制御方法との比較を示す図である。

【図6A】図６Ａ－６Ｃは、実施例１で使用されるコクーンシステムの概要を示す図である。図６Ａは、閉じた構成であるコクーンシステムを示す。

【図6B】図６Ａ－６Ｃは、実施例１で使用されるコクーンシステムの概要を示す図である。図６Ｂは、コクーンに挿入することができるカセットを示す。

【図6C】図６Ａ－６Ｃは、実施例１で使用されるコクーンシステムの概要を示す図である。図６Ｃは、オープン構成であるコクーンシステムを示す。

【図6DE】コクーンシステムで利用される細胞培養チャンバーの位置及び配向を示す図である。

【図6F】コクーンシステムで利用される細胞培養チャンバーのより詳細な図を示す。

【図6G】コクーンシステムのプロセスフローの凡例を示す図である。

【図6H】コクーンシステムを使用したガス移動データを示す図である。

【図7A】図７Ａ－７Ｃは実施例１に記載された実験の結果を示し、コクーンシステムにおけるＧＦＰ形質導入及び手動操作を比較する図である。図７Ａは、平均回収量の比較を示す。

【図7B】図７Ａ－７Ｃは実施例１に記載された実験の結果を示し、コクーンシステムにおけるＧＦＰ形質導入及び手動操作を比較する図である。図７Ｂは、平均回収生存率の比較を示す。

【図7C】図７Ａ－７Ｃは実施例１に記載された実験の結果を示し、コクーンシステムにおけるＧＦＰ形質導入及び手動操作を比較する図である。図７Ｃは、平均形質導入効率の比較を示す。

【図8A】図８Ａ－８Ｂは実施例１に記載された実験の結果を示し、コクーンシステム及びパーマライフ（ＰＥＲＭＡＬＩＦＥ）バッグにおけるＨＥＲ－２ ＣＡＲ Ｔ形質導入を比較する図である。図８Ａは、生細胞収量の比較を示す。

【図8B】図８Ａ－８Ｂは実施例１に記載された実験の結果を示し、コクーンシステム及びパーマライフ（ＰＥＲＭＡＬＩＦＥ）バッグにおけるＨＥＲ－２ ＣＡＲ Ｔ形質導入を比較する図である。図８Ｂは、生存率と形質導入効率の比較を示す。

【図9A】図９Ａ－９Ｄは実施例１に記載された実験の結果を示し、コクーンシステム及びパーマライフバッグを比較する図である。図９Ａは、相対的なＣＡＲ Ｔ純度の比較を示す。

【図9B】図９Ａ－９Ｄは実施例１に記載された実験の結果を示し、コクーンシステム及びパーマライフバッグを比較する図である。図９Ｂは、ＣＤ８＋細胞の割合の比較を示す。

【図9C】図９Ａ－９Ｄは実施例１に記載された実験の結果を示し、コクーンシステム及びパーマライフバッグを比較する図である。図９Ｃ及び９Ｄは、それぞれＴＮＦα及びＩＮＦγの産生を示す。

【図9D】図９Ａ－９Ｄは実施例１に記載された実験の結果を示し、コクーンシステム及びパーマライフバッグを比較する図である。図９Ｃ及び９Ｄは、それぞれＴＮＦα及びＩＮＦγの産生を示す。

【図10A】実施例１に記載された実験の結果を示し、コクーンシステム（図１０Ａ）及びパーマライフバッグ（図１０Ｂ）で培養したＣＡＲ Ｔ細胞による標的腫瘍細胞の殺傷を比較する図である。

【図10B】実施例１に記載された実験の結果を示し、コクーンシステム（図１０Ａ）及びパーマライフバッグ（図１０Ｂ）で培養したＣＡＲ Ｔ細胞による標的腫瘍細胞の殺傷を比較する図である。

【図11A】図１１Ａ－１１Ｅは本明細書の実施形態に記載されたコクーンシステムの別の構成を示す図である。図１１Ａは、コクーンシステムに充填することができる使い捨てのＴ細胞カセットを示す。

【図11B】図１１Ａ－１１Ｅは本明細書の実施形態に記載されたコクーンシステムの別の構成を示す図である。図１１Ｂは、オープン構成であるコクーンシステムを示す。

【図11C】図１１Ａ－１１Ｅは本明細書の実施形態に記載されたコクーンシステムの別の構成を示す図である。図１１Ｃは、コクーンに充填されたカセットを示す。

【図11D】図１１Ａ－１１Ｅは本明細書の実施形態に記載されたコクーンシステムの別の構成を示す図である。図１１Ｄは、閉じた構成であるコクーンを示す。

【図11E】図１１Ａ－１１Ｅは本明細書の実施形態に記載されたコクーンシステムの別の構成を示す図である。図１１Ｅは、コクーンとともに使用するためのカセットの詳細な図を示す。

【図11F】カセットからサンプリングするためのシリンジ及びバッグの使用を示す図である。

【図12A】図１２Ａは、ＣＡＲ Ｔ細胞生成プロセスのプロセス概要を示す図である。

【図12B】図１２Ｂは、進行中のＣＡＲ Ｔ細胞培養物を含むコクーンカセット細胞増殖チャンバーを示す図である。

【図12C】図１２Ｃは、インキュベーター内の細胞培養バッグを使用する手動で操作されるＣＡＲ Ｔ細胞生成プロセスを示す図である。

【図13A】図１３Ａ－１３Ｈは、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）又はＯＫＴ３によるＴ細胞活性化と同様に、パーマライフバッグ及びコクーンシステムを比較する、実施例２に記載された実験の結果を示す図である。図１３Ａは、生細胞収量を比較する図である。

【図13B】図１３Ａ－１３Ｈは、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）又はＯＫＴ３によるＴ細胞活性化と同様に、パーマライフバッグ及びコクーンシステムを比較する、実施例２に記載された実験の結果を示す図である。図１３Ｂは、集団倍加レベル（ＰＤＬ）を比較する図である。

【図13C】図１３Ａ－１３Ｈは、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）又はＯＫＴ３によるＴ細胞活性化と同様に、パーマライフバッグ及びコクーンシステムを比較する、実施例２に記載された実験の結果を示す図である。図１３Ｃは、生存したＣＤ３＋Ｔ細胞の収量を比較する図である。

【図13D】図１３Ａ－１３Ｈは、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）又はＯＫＴ３によるＴ細胞活性化と同様に、パーマライフバッグ及びコクーンシステムを比較する、実施例２に記載された実験の結果を示す図である。図１３Ｄは、ＣＤ３＋細胞ＰＤＬを比較する図である。

【図13E】図１３Ａ－１３Ｈは、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）又はＯＫＴ３によるＴ細胞活性化と同様に、パーマライフバッグ及びコクーンシステムを比較する、実施例２に記載された実験の結果を示す図である。図１３Ｅは、ＣＤ３＋サブセット（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）の割合を比較する図である。

【図13F】図１３Ａ－１３Ｈは、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）又はＯＫＴ３によるＴ細胞活性化と同様に、パーマライフバッグ及びコクーンシステムを比較する、実施例２に記載された実験の結果を示す図である。図１３Ｆは、抗ＰＤ－１で測定した細胞の消耗を比較する図である。

【図13G】図１３Ａ－１３Ｈは、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）又はＯＫＴ３によるＴ細胞活性化と同様に、パーマライフバッグ及びコクーンシステムを比較する、実施例２に記載された実験の結果を示す図である。図１３Ｇ及び１３Ｈは、それぞれダイナビーズ又はＯＫＴ３で活性化されたＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のサイトメトリープロットを示す図である。

【図13H】図１３Ａ－１３Ｈは、ダイナビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ）又はＯＫＴ３によるＴ細胞活性化と同様に、パーマライフバッグ及びコクーンシステムを比較する、実施例２に記載された実験の結果を示す図である。図１３Ｇ及び１３Ｈは、それぞれダイナビーズ又はＯＫＴ３で活性化されたＣＤ８＋ＣＤ３＋Ｔ細胞のサイトメトリープロットを示す図である。

【図14A】図１４Ａ－１４Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１４Ａは、ＣＤ３＋細胞の形質導入効率を比較する。

【図14B】図１４Ａ－１４Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１４Ｂは、生存したＣＡＲ Ｔ細胞の総数を比較する。

【図14C】図１４Ａ－１４Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１４Ｃは、Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）の形質導入効率を比較する。

【図14D】図１４Ａ－１４Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１４Ｄは、サブセットごとに総ＣＡＲ Ｔ細胞を比較する。

【図14E】図１４Ａ－１４Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１４Ｅ及び１４Ｆは、それぞれコクーン及びパーマライフバッグ内のＣＤ３＋ＯＫＴ３活性化細胞のサイトメトリープロットを示す。

【図14F】図１４Ａ－１４Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１４Ｅ及び１４Ｆは、それぞれコクーン及びパーマライフバッグ内のＣＤ３＋ＯＫＴ３活性化細胞のサイトメトリープロットを示す。

【図15A】図１５Ａ－１５Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１５Ａは、ＴＮＦαを産生する細胞の割合を比較する。

【図15B】図１５Ａ－１５Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１５Ｂは、ＩＦＮγを産生する細胞の割合を比較する。

【図15C】図１５Ａ－１５Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１５Ｃ及び１５Ｄは、それぞれＴＮＦα及びＩＦＮγを分泌するダイナビーズ活性化され、コクーン生成された細胞のサイトメトリープロットを示す。

【図15D】図１５Ａ－１５Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１５Ｃ及び１５Ｄは、それぞれＴＮＦα及びＩＦＮγを分泌するダイナビーズ活性化され、コクーン生成された細胞のサイトメトリープロットを示す。

【図15E】図１５Ａ－１５Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１５Ｅ及び１５Ｆは、それぞれパーマライフバッグ又はコクーンシステムから生成されたＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍殺傷効率を示す。

【図15F】図１５Ａ－１５Ｆは、実施例２に記載された実験の結果を示し、パーマライフバッグとコクーンシステムを比較する図である。図１５Ｅ及び１５Ｆは、それぞれパーマライフバッグ又はコクーンシステムから生成されたＣＡＲ Ｔ細胞の腫瘍殺傷効率を示す。

【図16】コクーンとパーマライフの比較、及びダイナビーズ又はＯＫＴ３による活性化の概要を示す図である。

【図17】本明細書の実施形態による、細胞工学システムとのエレクトロポレーションユニットの組み込みを示す図である。

【図18】細胞工学システムからエレクトロポレーションユニットへの免疫細胞培養物のフローを示す図である。

【図19】本明細書に記載されるヒト幹細胞実験の結果を示す図である。

【図20】本明細書に記載されるヒト幹細胞実験の結果を示す図である。

【図21】実施例４における分化した細胞表現型を図２１に示す。

【図22】図２２は、実施例４における単一コロニーが多系統分化を形成し得ることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

[0037]本開示は、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞を生成する自動化方法を提供する。ＣＡＲ Ｔ細胞の生成は、典型的には、患者固有の製造物のために手動での関与が必要である。ＣＡＲ Ｔ細胞培養の自動化は、細胞の活性化、形質導入、及び拡大などの複数の高感受性ユニット操作のために特に困難である。したがって、本明細書では、完全に密閉された細胞工学システムを利用するＣＡＲ Ｔ細胞生成の自動化方法が開示される。

【0015】

自動化細胞処理
[0038]Ｔ細胞療法などの自家細胞治療の場合、マイクロロット（ロットごとに１人の患者）を製造するバッチには同種（ロットごとに複数の患者）プロセスを活用できる規模の経済性が欠如しているため、費用対効果、プロセス効率、及び精製物の一貫性の必要性が特に重大である（例えば、Ｊｏｎｅｓ、２０１２年；Ｔｒａｉｎｏｒ、２０１４年を参照されたい）。マイクロロットに必要とされるより大規模であり、局在化された労働力と施設は、特にスタッフの空室状況とトレーニングに関して、ロジスティクス、手動生成のＧＭＰコンプライアンスにかなりの要求を課している。さらに、オペレーター間の技術のばらつきの潜在性は、放出基準を一貫して満たし、安全で信頼できる製造物を確保するという望ましくないリスクをもたらす場合がある。

【0016】

[0039]本明細書に記載されるように、自動化された製造の導入及び包括的な検証は、これらのロジスティクスであり、運用上のチャレンジに対する解決策を提供する。生成プロセスに自動化を導入するための重要なアプローチは、オペレーターが「ユニット操作」と呼ばれる物理的又は化学的な変更を生成材料に適用する主要なモジュール式ステップを識別することである。細胞製造の場合、これには、細胞分離、遺伝子操作、増殖、洗浄、濃縮、及び細胞回収などのステップが含まれる。製造業者は、多くの場合、自動化を導入するための直接的な機会として焦点プロセスのボトルネックを特定する。これは、市販のバイオリアクターの大部分の技術的操作範囲に反映され、個別のプロセスステップに焦点をあてる傾向がある。細胞製造におけるプロセスチャレンジ（無菌性の維持から試料の追跡まで）は、本明細書では、避けられないプロセスの変動を改善しながら、一貫性のあるセル出力を生成するエンドツーエンド自動化によって対処される。本明細書に記載される方法はまた簡素化を提供し、関連する電子記録はＧＭＰ規格への準拠を支援する（例えば、Ｔｒａｉｎｏｒ、２０１４年を参照されたい）。

【0017】

ユニット操作の自動化及び主要なプロセス感受性
[0040]癌免疫療法のための修飾された自己Ｔ細胞の臨床開発の最近の急速な進歩により、関連する転換及びスケールアップ／スケールアウトの意味合いの計画が導かれた。

【0018】

[0041]特定のプロトコールは、Ｔ細胞製造に関して変化し得るが、一般化されたキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ）プロセスが図１に示される。図１は、患者の血液試料の初期処理から自己Ｔ細胞療法用の出力細胞の処方まで、ＣＡＲ Ｔ細胞製造のユニット操作を記載する。

【0019】

[0042]本明細書に記載されるように、細胞製造の自動化を達成するために、本明細書に記載される方法は、各遷移点での細胞の状態、及び特定のユニット操作による影響の理解を提供する。患者固有の治療のためのマイクロロット生成は、自動化の実施可能性に影響を与える重要なプロセス感受性を尊重する必要がある。本明細書に記載される自動化には、様々なプロセスステップが包含される。

【0020】

[0043]以下の表１は、Ｔ細胞自動化のために特定されたいくつかのプロセスステップのチャレンジを強調し、自動化戦略に対する感受性の影響に留意する。すべてのユニット操作では、汚染のリスクがあるため、それぞれの機器間の細胞のオープン転送が重要な感受性であることに留意されたい。

【表1】

【0021】

[0044]表１に列挙された感受性を中心とする手動プロセスの自動化を調節することは、細胞療法の性能の転換、維持又は改善の成功を支持することができる。

【0022】

自動化ユニット操作の統合
[0045]ＧＭＰロジスティクス、経済性及び自動化の患者の安全への影響を考慮するとともに、ユニット操作は、ユニット操作あたりの典型的な労働時間（オペレーターと品質保証モニターの両方の労働時間を含む）との関連で評価され得る。表２は、ＣＡＲ Ｔ自動化の代表的なステップの名目上の手動処理タイムラインを示す。この表は、一般化されたＣＡＲ Ｔセルプロセスの各ユニット操作に必要なリソースコミットメントを強調する。各ステップについて、自動化プロセスの推定される残り労働時間が、削減の理由とともに特定される。

【表2】

【0023】

[0046]本明細書に記載される方法に基づいて、ユニット操作の自動化は、名目上の手動プロセスをほぼ４０時間、元の時間の約４分の１に削減することができる。

【0024】

個別対完全に統合された自動化
[0047]自動化の価値には説得力のある証拠があるが（例えば、Ｔｒａｉｎｏｒ ２０１４；Ｌｅｖｉｎｅ ２０１７参照）、末端間のシーケンスにあるこれらの自動化ステップを自動転送と統合するという価値及び実用性について、その後の分析が必要である。個別のプロセス自動化の利点対エンドツーエンド統合の利点には、異なる視点がある。

【0025】

[0048]個別の自動化の主な利点は柔軟性である。これは次の分野に関連する：
１）固有のプロセス操作のメンテナンス
２）個々のユニットの動作検証に基づいた転換活動の加速
３）ドナー間の変動に対応するために処理ステップを変更する能力

【0026】

[0049]柔軟性の向上に関連する第１の点は、プロセスのより多くの制御をオペレーターに提供する。これは、プロセスに最終製造物に影響を与える可能性のある非常に感受性のステップがある状況において重要である。オールインワンシステムに切り替えると、製造物の結果に影響を与える制約が課される場合がある。個別のアプローチは、各ステップを行う方法を選択するための柔軟性を提供し、これは、高感受性のユニット操作では特に重要であり得る。また、個別のアプローチは、手動処理から自動化への段階的な転換を可能にし、これは、各ユニット操作が個別に試験され得る場合に同等性を実証するのに役立つ。さらに、特定のユニット操作を自動化することにより、細胞性能に基づいてなされる決定に柔軟性を提供する。例えば、細胞が急速に増殖している場合、１つの細胞培養バッグから２つに拡大する必要があり得る。最後に、個別のシステムを使用した自動化へのアプローチはまた、グループが、各ユニット操作に使用するためにどの機器を精選し得るようにする。

【0027】

[0050]機器の利用は、個別の自動化のための別の議論である。他のユニット操作よりも有意に時間がかかるユニット操作があり得る。エンドツーエンド処理システムでは、複数のユニット操作をすべて単一のシステムで実行する必要があり、したがって、培養プロセスの間、機器を占有する。

【0028】

[0051]個別の自動化には利点はある一方で、エンドツーエンドアプローチは、それほど魅力的な利益ではないが、異なるものを提供する。第１に、完全に統合されたシステムにより、汚染のリスクが大幅に削減される。個別のアプローチで必要とされる取り扱いが増加するため、オペレーターの介入により製造物が変動する可能性が大きい。第２に、前述したように、これは、必然的に人件費の増加をもたらす。

【0029】

[0052]個別アプローチにより提供される柔軟性は重要である。製造物を画定する上でプロセスが重要である状況では、エンドツーエンドシステムに独自の感受性を統合する柔軟性をもたせるべきである。これには、特定の供給戦略、酸素レベル、表面処理などが含まれ得る。このようなアプローチには、ソフトウェアと使い捨てコンポーネントの両方において柔軟性が必要である。システムは、特定のユニット操作が製造物仕様チェックポイントを満たしていることを確認するために、プロセスの様々なポイントで細胞及び培養試料を引き出すオプションを提供するべきである。変更が必要な場合、ソフトウェアは、これらの変更を実装して、理想的な条件を提供できるようにすべきである。使い易く柔軟性のあるソフトウェアは転換目的には非常に有益であるが、臨床標準（ＦＤＡ ２１ ＣＦＲ Ｐａｒｔ １１）に準拠するためにソフトウェアを簡単にロックダウンできることが重要である。一度ロックダウンされると、オペレーターがプロトコールを変更する何らかの能力があれば制限されるべきである。しかしながら、固有のドナー変動性の問題に対処するためには、細胞増殖率に基づいて検証済みのプロトコールの範囲から選択するオプションが存在する必要がある。例えば、細胞が急速に増殖している場合、システムは、これに応答し、それに応じて食餌又は回収の時点を調節し得るべきである。

【0030】

[0053]エンドツーエンド統合対個別の自動化の選択はまた、臨床プロセスの長期的なビジョンに依存する。単一のオールインワンシステムにより、スペース効率が有意に向上し、高価なＧＭＰクリーンルームで必要な設置面積を最小限にすえることができる。例えば、図２に示されるように、完全に統合された自動化システムは、必要な設置面積を最大化して、高価なＧＭＰクリーンルームスペースを削減するように設計される。図２は、標準的なラボスペースで実行されている９６人の患者固有のエンドツーエンドユニットを示す。

【0031】

[0054]単一のシステムはまた、データ追跡をより容易にするが、個別のシステムは、すべての電子データファイルを一緒にリンクする準拠ソフトウェアを提供しない場合がある。ＶＩＮＥＴＩ（Ｖｉｎｅｔｉ Ｌｔｄ）及びＴＲＡＫＣＥＬ（ＴｒａｋＣｅｌ Ｌｔｄ）などのソフトウェアプラットフォームを使用すると、サプライチェーンのロジスティクスを電子的にモニタリング及び編成することができる。しかしながら、単一のオールインワン培養システムは、処理イベントと各ユニット操作に関連する培養条件のバイオモニタリングの両方の履歴をバッチ記録に組み込むことにより、さらに進化することができる。したがって、エンドツーエンド統合の利点は、有意な競争上の利点をもたらす。

【0032】

ユニット操作の統合のための商用プラットフォーム
[0055]多数の自己細胞療法、特に血液系の癌の免疫療法における臨床試験の成功は、予測される臨床需要を満たすために、新しい臨床プロトコールを堅牢な生成プラットフォームに転換することができることに重要性を強調している（例えば、Ｌｅｖｉｎｅ、２０１７年；Ｌｏｃｋｅ、２０１７年を参照されたい）。自己療法の場合、患者固有の各細胞治療の処理は、包括的な製造活動及び操作管理を適切に利用する。本明細書の方法は、プロセスの最適化、セキュリティ及び経済性を達成するために、ターンキー自動化システムのユニット操作を連結する。

【0033】

[0056]自己プロセスを設計する際のチャレンジは２要素である。第１に、物理的に分離され、最適化された機器の一部で個別の処理ステップが生じる可能性がある同種とは異なり、スケールアウトされた自己プラットフォームは、単一の閉じた自己完結型自動化環境で必要なすべてのステップを適切に行う。第２に、理論的にはすべての実行が、公知の品質及び予測可能なプロセス動作とともに、細胞バンクの高品質バイアルから始まる同種異系プロセスとは異なり、自己プロセスの出発原料は非常に多様であり、一般的に健康が損なわれた個人から来る。

【0034】

[0057]したがって、本明細書では、物理的撹拌、ｐＨ、供給、及びガス処理などの要因を制御することにより、培養条件を感知し、それに応じて洗練されたバイオリアクターとして応答することができる方法が提供される。さらに、同種異系治療と比較して自己治療に関連する技術移転には、有意に異なるチャレンジがある。自己製造物は、製造プロセスと患者の治療の間の安定性により大きな制限がある場合がある。サイトは、単一のセンターというよりはむしろグローバルに配置することができる。ロックダウン（例えば、完全に密閉された）オールインワンシステムを使用すると、サイト間の技術移転プロセスが有意に改善される。

【0035】

[0058]供給源の変動性を排除することはできないが、自動化は、標準化及び再現性を通じて最終自己製造物の変動性を除去するのに役立つ。この手法は、活性な細胞培養の状態をモニタリングするバイオセンサーを介して細胞性能の基準点を取得するために、主要な細胞システムプロバイダーによって採用される。エンドツーエンド統合では、プロセスの特定の段階からの出力は、プロセスの進行のために許容可能なパラメータ内に収まる必要がある。

【0036】

[0059]本明細書に記載されるように、実施形態では、提供される方法は、単一のターンキープラットフォームに複数のユニット操作を統合するコクーンプラットフォーム（Ｏｃｔａｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、ＯＮ））を利用する。非常に特定の細胞処理目的で複数の細胞プロトコールが提供される。効率的であり、効果的な自動化転換を提供するために、記載されている本方法は、複数のユニット操作を組み合わせたアプリケーション固有／スポンサー固有の使い捨てカセットの概念を利用する－最終的な細胞治療製造物のコア要件にすべて焦点をあてている。

【0037】

[0060]本明細書に記載される方法は、完全に統合された、閉鎖された自動化システムにおいてＣＡＲ Ｔ細胞（活性化、ウイルス形質導入及び拡大、濃縮及び洗浄を含む）を拡大するために使用されている（図３）。

【0038】

[0061]実施された実験において、１０～１４日間の培養物におけるＣＡＲ Ｔ細胞の倍数拡大は、約４０～６０に達した。ＣＤ４＋とＣＤ８＋の両方のＴ細胞サブセットは、ＣＡＲ Ｔ治療の成功に必要である。したがって、両方のＴ細胞サブセットの培養を維持する能力について、実行及び関連する対照をフローサイトメトリーで評価した。図４は、すべての実行、並びにすべての対照が両方のＴ細胞サブセットを維持し得たことを示す。存在するＣＡＲ Ｔ細胞の割合はまた、Ｔ細胞サブセットの各集団で評価された（図５）。すべての試料において、ＣＤ８＋画分と比較してＣＤ４＋画分でＮＧＦＲ（ＣＡＲ構築物を示す）の検出が高かったが、すべての試料において、ＣＤ８＋部分のＮＧＦＲ＋画分は、対のＣＤ４＋集団で見つかった画分の５０％を超えていた。要約すると、本明細書に記載される方法を使用した自動化ＣＡＲ Ｔプロセスは、Ｔ細胞サブセットの健康な集団をもたらす。

【0039】

自動化の利点
[0062]細胞療法の生成における単位操作の自動化は、同種及び自己の細胞療法の用途にわたって普遍的な利益の機会を提供する。患者固有の自己細胞製造物の固有のシナリオでは、これらの療法の最近の臨床的成功によりさらにより強調されているが、自動化の利点は、小ロットのＧＭＰコンプライアンス、経済、患者の追跡可能性及びプロセスの逸脱の早期識別という非常に複雑なマイクロロットにより、特に魅力的である。関連する複雑な製造プロトコールの出現は、マイクロロット細胞生成における自動化されたユニット操作のエンドツーエンド統合の価値が重要な研究のポイントになっていないという事実に注目を集めている。しかしながら、差し迫った承認に続いてこれらの療法に期待される需要は、完全に閉鎖されたエンドツーエンドシステムの実装が、ハンズオンタイム及びフットプリントなどの製造ボトルネックに非常に必要な解決策を提供し得ることを示している。

【0040】

[0063]先進療法の開発者は、臨床翻訳の展開の初期に自動化を検討し、臨床試験プロトコールをスケールアップすることが推奨される。初期の自動化は、プロトコール開発に影響を与え、後の段階で手動プロセスから自動化プロセスに切り替える場合の比較可能性研究の必要性を回避し、長期的な商業化ルートの理解を深めることができる。

【0041】

ＣＡＲ Ｔ細胞を含む遺伝子修飾された免疫細胞を生成する方法
[0064]実施形態では、本明細書では、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成法が提供される。本明細書で使用するとき、「遺伝子修飾された免疫細胞培養物」（又は遺伝子修飾された免疫細胞）とは、（例えば、抗原提示細胞との共培養を通じて）修飾又はプライムされた免疫系の細胞を指し、ヒトを含む動物の１つ又は複数の疾患の治療、予防、又は改善に有用な所望の表現型を有する細胞をもたらす。本明細書で使用するとき、「免疫細胞培養物」は、本明細書に記載される方法によって調製された細胞集合を指し、調査又は臨床試験で使用するため、並びに医学療法のためにヒト患者を含む哺乳動物に投与するための細胞集団を含むことができる。本明細書に記載させる方法を使用して生成することができる遺伝子修飾された免疫細胞培養物には、マスト細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞などが含まれ得る。

【0042】

[0065]本明細書に記載される様々な方法はまた、例えば、造血幹細胞を含む遺伝子修飾されたヒト幹細胞培養物の生成を含む、他の遺伝子修飾された細胞培養物に拡大することができる。

【0043】

[0066]例示的な実施形態では、本方法は、活性化試薬を用いて免疫細胞培養物を活性化して、活性化免疫細胞培養物を生成し、ベクターで活性化免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、形質導入された免疫細胞を拡大し、拡大された免疫細胞培養物を濃縮し、濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含む。適切には、本方法は、拡大された免疫細胞培養物若しくは濃縮された免疫細胞培養物のいずれか又は両方をさらに含む。実施形態では、本方法の様々なステップは、完全に密閉された細胞工学システムによって行われ、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成するプロセスを介して最適化される。

【0044】

[0067]遺伝子修飾された免疫細胞を生成するためのプロセスを最適化する方法には、自動化された方法を開始する前の細胞培養条件の最適化、並びに増殖条件（例えば、ガス濃度、培地条件、温度、ｐＨ、老廃物及び栄養素濃度など）に対するリアルタイムの修飾を支援するための様々なセンサーなどからのフィードバックの使用が含まれる。

【0045】

[0068]実施形態では、最適化プロセスは自己調節プロセスであり、これは外部（ヒト）ユーザーからの入力を必要とせず、様々なコンピュータープログラム及び条件を介して、細胞培養に必要な修飾を決定することができるか、又は自動化プロセスを最適化する他の特性を決定することができるプロセスである。実施形態では、自己調節プロセスは、温度センサー、ｐＨセンサー、グルコースセンサー、酸素センサー、二酸化炭素センサー、及び光学密度センサーのうちの１つ又は複数でモニタリングすることを含む。本明細書に記載されるように、完全に密閉された細胞工学システムにおけるこれらの様々なセンサーの使用は、システム内の様々な時間及び場所で生じ、協調して最適化を提供するように働く。例えば、自己調節プロセスは、モニタリングに基づいて、温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、及び形質導入されたＴ細胞培養物の光学密度のうちの１つ又は複数を調節（例えば、上昇又は低下）させることができる。

【0046】

[0069]最適化プロセスはまた、例えば、総細胞数、細胞の供給源、細胞の密度、細胞の年齢などを含む、開始細胞集団の固有の特徴に基づくことができる。自動化方法を開始する前に、開始細胞集団の特徴をコンピューター制御システムに入力することができる。この場合、システムは、例えば、酸素及び二酸化炭素の濃度、流量、インキュベーション時間、ｐＨなど、本方法を最適化するための様々な初期変更を行う。あるいは、細胞プロセスのモニタリングにより、開始集団からの細胞培養シーケンスの進行の自動化された特徴付けが可能になり、最適化された最終細胞培養特性の条件をケースバイケースで調節することができる。

【0047】

[0070]例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも約５千万個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する。適切な実施形態では、記載される方法は、少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞、又は少なくとも約２億個の細胞、少なくとも約３億個の細胞、少なくとも約４億個の細胞、少なくとも約５億個の細胞、少なくとも約６億個の細胞、少なくとも約７億個の細胞、少なくとも約８億個の細胞、少なくとも約１０億個の細胞、少なくとも約１１億個の細胞、少なくとも約１２億個の細胞、少なくとも約１３億個の細胞、少なくとも約１４億個の細胞、少なくとも約１５億個の細胞、少なくとも約１６億個の細胞、少なくとも約１７億個の細胞、少なくとも約１８億個の細胞、少なくとも約１９億個の細胞、少なくとも約２０億個の細胞、少なくとも約２１億、少なくとも約２２億個、少なくとも約２３億個、少なくとも約２４億個、少なくとも約２５億個、少なくとも約２６億個、少なくとも約２７億個、少なくとも約２８億個、少なくとも約２９億個、又は少なくとも約３０億個の遺伝子修飾された免疫細胞を生成する。

【0048】

[0071]本明細書に記載されるように、本方法により生成される遺伝子修飾された免疫細胞培養物は、適切には、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物を含むＴ細胞培養物である。このような実施形態では、このようなＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために利用されるベクターは、キメラ抗原受容体をコードするベクターである。適切には、免疫細胞培養物は、末梢血単核細胞及び／又は精製Ｔ細胞を含む。実施形態では、免疫細胞培養物は、少なくとも１つのアクセサリー細胞、適切には単球又は単球由来細胞を含む。本明細書に記載されるように、実施形態では、アクセサリー細胞は、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含むＴ細胞受容体に対する抗原を含む。

【0049】

[0072]適切には、活性化試薬は抗体又は樹状細胞を含む。実施形態では、抗体は、ポリスチレンプラスチック、シリコーン、又は例えばビーズの表面を含む他の表面を含むことができる表面に固定化される。

【0050】

[0073]他の実施形態では、活性化試薬は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の少なくとも１つを含む可溶性抗体である抗体を含む。例示的な抗体にはＯＫＴ３が含まれる。

【0051】

[0074]細胞を形質導入するための様々な方法は、例えば、ウイルス感染、エレクトロポレーション、膜破壊、又はそれらの組み合わせを含む自動化方法で利用することができる。

【0052】

[0075]例示的な実施形態では、本方法で利用されるベクターは、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスである。適切には、形質導入は、細胞培養培地でベクターを混合し、培地中のベクターを活性化された免疫細胞培養物に均一に送達させることを含む。本明細書に記載されるように、細胞への均一な様式でのベクターの均一な送達は、所望の遺伝子修飾された免疫細胞の高出力の様々な細胞特性の最適化を提供する。

【0053】

[0076]本明細書に記載されるように、細胞を拡大する方法は、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択のうちの少なくとも１つ又は複数を適切に含む。

【0054】

[0077]本明細書に記載される様々な方法は、形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが免疫細胞培養物に対して最適化されるような方法で実施される。この最適化は、本明細書に記載されるように、所望の細胞表現型の促進を含む、所望の表現型特性を有する多数の生存細胞の生成を可能にする。実施形態では、酸素レベル又は濃度は、ステップ（ａ）から（ｅ）のうちの１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネント（oxygenation component；酸素供給構成要素）を通じて細胞培養培地を再循環する細胞工学システムによって最適化される。本明細書に記載されるように、酸素化（oxygenation；酸素供給）は、シリコーンベースのチューブコンポーネントを含む１つ又は複数の流体経路を通じて適切に生じる。

【0055】

[0078]さらなる実施形態では、細胞工学システムは、様々な方法プロセスの間に栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる。この再循環は、所望の表現型（複数可）を有する多数の生存細胞の生成を支援する。適切には、細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルは、細胞増殖などを最適化するように、拡大ステップの間に減少する。他の実施形態では、例えば、完全な培地交換が利用される場合、ＣＯ２レベルを上げることができる。

【0056】

[0079]細胞の増殖条件を最適化するための他のメカニズムには、細胞に提供される培地の流量を修飾及び制御することが含まれる。細胞が増殖し始めると、提供される培地の循環速度が増加し、これによりガス交換が改善され、細胞の状態とその時点の要件に応じて、酸素及び二酸化炭素が細胞培養物に投入又は取り出され得る。

【0057】

[0080]実施形態では、細胞工学システムは、供給、洗浄及びモニタリングのうちの１つ又は複数の複数回のラウンドを行うように構成され、実施形態では、形質導入された免疫細胞培養物の選択を行うように構成されている。これらの様々な活動は任意の順序で行うことができ、単独で又は別の活動と組み合わせて行うことができる。実施形態では、細胞の濃縮は、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む。適切には、最適化プロセスは、適切には自己調節プロセスにおいて、遠心分離又は濾過のパラメータを調節することをさらに含む。形質導入された細胞の選択は、例えば、磁気分離、濾過、プラスチック又は他の基質への付着などによって実施され得る。

【0058】

[0081]本明細書に記載される実施形態では、細胞工学システムは複数のチャンバーを含み、本方法の各ステップは細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーで行われる。

【0059】

[0082]適切には、本方法は、ステップ（ａ）の後に活性化免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含み、形質導入ステップに続いてベクターを除去することを含むことができる。活性化試薬は、細胞又は活性化試薬を洗浄、排出又は物理的に除去することにより、免疫細胞培養物から適切に除去される。ベクターは、洗浄することにより、又はベクターを表面（例えば、レトロネクチン又はフィブロネクチンでコーティングされた表面）に結合させ、次に細胞を別のチャンバーに移すことにより除去することができる。

【0060】

[0083]例示的な実施形態では、細胞工学システムは、本方法を開始する前に、細胞培養物、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地を含む。他の実施形態では、活性化試薬及び／又はベクターは、生成方法の開始後、又はプロセス中の任意の適切な時間に別々に添加することができる。

【0061】

[0084]さらなる実施形態では、本明細書では、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の好ましい表現型を促進する方法が提供され、本方法は、活性化試薬で免疫細胞培養物を活性化して、活性化免疫細胞培養物を生成し、活性化試薬及び活性化条件は、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の表現型を促進し、活性化免疫細胞培養物をベクターで形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、形質導入された免疫細胞培養物を拡大し、拡大された免疫細胞培養物を濃縮し、及び（ｄ）の濃縮された免疫細胞物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含む。本明細書に記載されるように、本方法は、完全に密閉された自動化細胞工学システムによって適切に行われる。

【0062】

[0085]本明細書に記載されるように、適切な活性化試薬及び適切な活性化条件の選択は、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の所望の表現型の促進を提供する。すなわち、免疫細胞培養物の表現型を特異的に選択及び促進することができ、その結果、本方法により生成される細胞の適切な大部分は、所望の好ましい表現型を有する。他の実施形態では、１つの細胞表現型対別の表現型の所望の比を制御及び促進して、所望の好ましい表現型バランスを提供することができる。

【0063】

[0086]本明細書に記載されるように、抗体、特に可溶性抗体である活性化試薬の使用により、遺伝子修飾された免疫細胞の所望の表現型を促進し得ることが見出された。適切には、利用される抗体は、可溶性抗体ＯＫＴ３を含む、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ＣＤ２抗体の少なくとも１つである。

【0064】

[0087]実施形態では、活性化条件は、活性化試薬と免疫細胞培養物の間の安定した接触を可能にする実質的に妨害されていない免疫細胞培養物を提供する。本明細書に記載されるように、実質的に妨害されない条件下で、及び平らで実質的に柔軟性のない細胞培養チャンバーの使用を介して、細胞を活性化し得ることが見出された。これにより、細胞を活性化試薬と均一に接触させ、必要な栄養素、溶存ガスなどと相互作用して、所望の促進された表現型を達成することができる環境が提供される。

【0065】

[0088]本明細書に記載される方法は、好ましい表現型を提供するために適切な活性化方法を選択することにより、最終の免疫細胞培養生成物の特性に影響を及ぼし得る。例えば、本明細書に記載されるビーズベースのプロセスを利用する活性化は、よりバランスのとれたＣＤ４：ＣＤ８比を促進し、一方、可溶性抗ＣＤ３の使用はＣＤ４よりも高いＣＤ８集団を促進する。本明細書に記載される方法を使用して、他のレベルのＣＤ８及びＣＤ４もまた提供することができる。例示的な実施形態では、本明細書に記載されるように、本方法を利用して、ＣＡＲ Ｔ細胞を調製することができる。適切には、本方法を利用して、ＣＤ８＋細胞対ＣＤ４＋細胞の比が、約０．５：１～約５：１、約０．８～約３：１、又は約１：１、約２：１を含む、約０．１：１～約１０：１のＣＤ８＋細胞対ＣＤ４＋比を有するＣＡＲ Ｔ細胞の表現型を促進することができる。

【0066】

[0089]さらなる実施形態では、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成法が提供され、本方法は、活性化試薬で免疫細胞培養物を活性化して、活性化免疫細胞培養物を生成し、活性化免疫細胞培養物をベクターで形質転換して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、形質導入された免疫細胞培養物を拡大し、（ｃ）の拡大された免疫細胞培養物を濃縮し、及び（ｄ）の濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含む。本明細書に記載されるように、本方法は、完全に密閉された自動化細胞工学システムによって適切に行われる。実施形態では、本方法の各ステップは、最適化された細胞密度（細胞／ｍＬ）及び最適化された細胞密集度（細胞／ｃｍ^２）を有する免疫細胞培養物で行われる。

【0067】

[0090]本明細書に記載されるように、最適化された細胞密度（細胞培地１ｍＬあたりの細胞）及び／又は細胞密集度（細胞が作用し、増殖する細胞培養チャンバーの面積（ｃｍ^２）あたりの細胞）を利用することにより、生細胞の増加した生成、並びに細胞表現型のより良い制御などを提供し得ることが決定されている。

【0068】

[0091]実施形態では、最適化された細胞密度は、約０．０５×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬ、約０．０５×１０^６細胞／ｍＬ～約４０×１０^６細胞／ｍＬ、又は約０．０５×１０^６細胞／ｍＬ～約２０×１０^６細胞／ｍＬである。最適化された細胞密度は、生成の方法の過程全体で変化し得、そのため、本方法の各段階（すなわち、活性化、形質導入、拡大、濃縮）で、細胞密度は、本方法の特定のステップに最良の細胞密度を提供するために制御又は操作される。細胞密度は、例えば、最適な開始細胞密度の選択、酸素及び／又は二酸化炭素濃度の増加若しくは減少、ｐＨ、温度、栄養素の調節、老廃物の除去などにより最適化することができる。例示的な細胞密度には、約０．０５×１０^６細胞／ｍＬ、約０．０８×１０^６細胞／ｍＬ、約１×１０^６細胞／ｍＬ、約５×１０^６細胞／ｍＬ、約１０×１０^６細胞／ｍＬ、約２０×１０^６細胞／ｍＬ、約３０×１０^６細胞／ｍＬ、約４０×１０^６細胞／ｍＬ、約５０×１０^６細胞／ｍＬ、又は約６０×１０^６細胞／ｍＬなどが含まれる。

【0069】

[0092]実施形態では、最適化された細胞密集度は、約０．１×１０^６細胞／ｃｍ^２～約６０×１０^６細胞／ｃｍ^２、又は約０．１×１０^６細胞／ｃｍ^２～約４０×１０^６細胞／ｃｍ^２、又は約０．１×１０^６細胞／ｃｍ^２～約２０×１０^６細胞／ｃｍ^２である。
最適化された細胞密集度は、生成方法の過程全体で変化し得、本方法の各段階（すなわち、活性化、形質導入、拡大、濃縮）で、細胞密集度を制御又は操作して、本方法の特定のステップに最良の細胞密集度を提供する。細胞密集度は、最適な開始細胞密集度の選択、細胞培養チャンバーの材料の選択、酸素及び／又は二酸化炭素濃度の増加若しくは減少、ｐＨ、温度、栄養素の調節、老廃物の除去などによって最適化することができる。例示的な細胞密集度には、約０．１×１０^６細胞／ｃｍ^２、約０．５×１０^６細胞／ｃｍ^２、約１×１０^６細胞／ｃｍ^２、約０．５×１０^６細胞／ｃｍ^２、約１０×１０^６細胞／ｃｍ^２、約２０×１０^６細胞／ｃｍ^２、約３０×１０^６細胞／ｃｍ^２、約４０×１０^６細胞／ｃｍ^２、約５０×１０^６細胞／ｃｍ^２、又は約６０×１０^６細胞／ｃｍ^２などが含まれる。

【0070】

[0093]実施形態では、本方法は、栄養素、老廃物、放出サイトカイン、及び／又は溶解ガスの再循環が、約０．０５×１０^６細胞／ｍＬ～約２０×１０^６細胞／ｍＬの密度、及び約０．１×１０^６細胞／ｃｍ^２～約２０×１０^６細胞／ｃｍ^２の密集度を有する細胞に均一に提供されことを含む。

【0071】

[0094]さらなる実施形態では、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成法が提供され、本方法は、活性化試薬で免疫細胞培養物を活性化して、活性化免疫細胞培養物を生成し、活性化免疫細胞培養物をベクターで形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、形質導入された免疫細胞培養物を拡大し、形質導入された細胞培養物は、拡大中に振とうされず、拡大された免疫細胞培養物を濃縮し、濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含む。本明細書に記載されるように、適切には、本方法は、完全に密閉された自動化細胞工学システムによって行われる。

【0072】

[0095]本明細書に記載されるように、驚くべきことに、細胞が振とうされない（すなわち、細胞が互いの上部に流れるようにするために回転又は振とうされない）条件下で細胞を拡大させることが見出された。本方法は、高い生細胞収量及び所望の表現型を含む最適な細胞特性と提供する。大きく、振とうされない細胞培養チャンバーは、細胞を振とうするか又は妨害する必要はなく、細胞老廃物を除去しながら、必要な試薬、栄養素、ガス交換などへの細胞の均一なアクセスを提供して、所望の結果を達成することができると判断された。実際、本明細書に記載されるように、遺伝子修飾された免疫細胞を自動化生成するこのような方法は、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉら、「Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、米国特許第８，７２７，１３２号に記載される細胞振とうを利用する方法と比較して、より多数の生存細胞、より多くの数／比の所望の細胞タイプ、及びより堅牢な細胞特性を生じさせることが見出された。

【0073】

[0096]適切には、本方法の拡大ステップは、免疫細胞培養物を振とうすることなく、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択のうちの少なくとも１つ又は複数を含む。

【0074】

[0097]また、本明細書では、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動生成法が提供され、本方法は、細胞工学システムによって行われ、活性化試薬で免疫細胞培養物を活性化して、細胞工学システムの第１のチャンバーで活性化免疫細胞培養物を生成し、活性化免疫細胞培養物を形質導入することを含む。例示的な方法では、形質導入は、活性化免疫細胞培養物を第一チャンバーからエレクトロポレーションユニットに移し、活性化免疫細胞培養物をベクターでエレクトロポレーションして、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、形質導入された免疫細胞培養物を細胞工学システムの第２のチャンバーに移すことを含む。本方法は、形質導入された免疫細胞培養物を拡大し、拡大された免疫細胞培養物を濃縮し、及び（ｄ）の濃縮免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された細胞培養物を生成することをさらに含む。

【0075】

[0098]例えば、図１７に示されるように、活性化免疫細胞培養物は、例えば、接続チューブ１７０４を介して、細胞工学システム６００のカセット６０２からエレクトロポレーションユニット１７０６に移される。エレクトロポレーションユニット１７０６は、エレクトロポレーションプロセス中に細胞培養物を保持するエレクトロポレーションカートリッジ１７０８を適切に含む。エレクトロポレーションプロセス後、形質導入された免疫細胞培養物は、接続チューブ１７０４を介して細胞工学システム６００に戻される。図１７はまた、エレクトロポレーションの前後に細胞培養物を保持するために使用される２つのオプションのリザーバー１７１０及び１７１２の使用を示し、異なるポンプ速度、必要とする圧力と流量の結果として、細胞工学システムとエレクトロポレーションユニット間の移動を支援する。しかしながら、このようなリザーバーを除去し、細胞培養物を細胞工学システム１７０２からエレクトロポレーションユニット１７０６に直接移すことができる。

【0076】

[0099]図１８は、１）細胞工学システムから第１のリザーバー、２）エレクトロポレーションユニット、３）第２リザーバー、最後に４）細胞工学システムへの細胞培養物のフロー図を示す。

【0077】

[00100]例示的な実施形態では、図１７及び図１８に示されるように、エレクトロポレーションユニット１７０６は、細胞工学システム１７０２の外側に配置される。このような実施形態では、形質導入は、第１の無菌の閉じた接続部（例えば、接続チューブ１７０４）を介して、活性化免疫細胞培養物を第１のチャンバーからエレクトロポレーションユニットに移し、活性化免疫細胞培養物をベクターでエレクトロポレーションして、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、第２の無菌の閉じた接続部（例えば、接続チューブ１７０４）を介して、細胞工学システムの第２のチャンバーに形質導入された免疫細胞培養物を移す。

【0078】

[00101]また、複数の別個の細胞工学システム６００（例えば、図２を参照されたい）を単一のエレクトロポレーションユニットに接続し、細胞培養物が細胞工学システムからエレクトロポレーションユニットに移され、次に適切な細胞工学システムに戻されるように、適切な順序で実行することができることを理解されるべきである。

【0079】

[00102]他の実施形態では、エレクトロポレーションユニット１７０６は、システム全体が閉じた自己完結型システムであるように、細胞工学システム６００内に配置することができる。細胞工学システム６００の内部にエレクトロポレーションユニット１７０６を含める方法は、当業者に公知であり、様々な小型化戦略などを利用する。

【0080】

[00103]本明細書に記載される様々な方法は、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の生成を可能にし、本方法の形質導入効率は、細胞培養用の柔軟なガス透過性バッグを利用する方法の形質導入効率より少なくとも２０％高い。本明細書に記載され、実施例に示されるように、本明細書に記載される細胞工学システムを利用する方法は、細胞培養を実施するための柔軟なガス透過性バッグの使用に依存する従来の方法よりも優れている。さらなる実施形態では、本方法の形質導入効率は、細胞培養用の柔軟なガス透過性バッグを利用する方法の形質導入効率よりも少なくとも１０％高く、より適切には少なくとも２０％高く、少なくとも２５％高く、少なくとも３０％高く、少なくとも３５％高く、又は実施形態では、少なくとも４０％高い。

【0081】

[00104]適切には、本明細書に記載される方法は、柔軟なガス透過性バッグを用いた手動細胞培養物を利用する方法よりも少なくとも２０％多い遺伝子修飾された免疫細胞を生成する。より適切には、本方法は、柔軟なガス透過性バッグを用いた手動細胞培養物を利用する方法よりも、遺伝子修飾された免疫細胞を少なくとも２５％多く、遺伝子修飾された免疫細胞を少なくとも３０％多く、遺伝子修飾された免疫細胞を少なくとも３５％多く、遺伝子修飾された免疫細胞を少なくとも４０％多く生成する。

【0082】

[00105]例示的な実施形態では、本明細書に記載される細胞工学システムは複数のチャンバーを含み、本明細書に記載される様々な方法の各ステップは、細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーで行われ、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地の各々は、本方法を開始する前に複数のチャンバーの異なるチャンバーに含まれ、複数のチャンバーの少なくとも１つは、細胞を増殖させるための温度（例えば、約３７℃）に維持され、複数のチャンバーの少なくとも１つは冷蔵温度（例えば、約４～８℃）に維持される。

【0083】

[00106]一部の実施形態では、本開示は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞を生成する方法を提供し、本方法は、（ａ）抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の少なくとも１つを含む培養培地で適切に末梢血単核細胞培養物を活性化して、活性化されたＴ細胞培養物を生成し；（ｂ）キメラ抗原受容体をコードするベクターであるレンチウイルスベクターで活性化Ｔ細胞培養物を形質導入して、形質導入されたＴ細胞培養物を生成し；（ｃ）形質導入されたＴ細胞培養物を事前に定義された培養サイズに拡大し；（ｄ）（ｃ）の拡大されたＴ細胞培養物を約２０ｍＬから約５００ｍＬ、適切には約５０ｍＬから約２００ｍＬの体積に濃縮し；及び（ｅ）（ｄ）の濃縮されたＴ細胞培養物を回収して、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物を生成することを含み、活性化Ｔ細胞培養物は、ステップ（ａ）から（ｂ）の間で実質的に乱されず、本方法は、ステップ（ａ）から（ｅ）を行うための指示を適切に有する、完全に密閉された細胞工学システムによって行われる。適切には、ステップ（ａ）から（ｅ）は、細胞工学システムの１つ又は複数のチャンバー内で行われる。本明細書に記載されるように、実施形態では、本方法は、細胞培養のために柔軟なガス透過性バッグを利用する方法よりも少なくとも２０％多いＣＡＲ Ｔ細胞を生成する。例示的な実施形態では、本方法は、少なくとも２０億個の生存可能なＣＡＲ Ｔ細胞を生成する。

【0084】

[00107]キメラ抗原受容体Ｔ細胞、又は「ＣＡＲ Ｔ細胞」は、癌細胞をより特異的に標的とするためにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で修飾されているＴ細胞である。一般的に、ＣＡＲには３つの部分：エクトドメイン、膜貫通ドメイン、及びエンドドメインが含まれる。エクトドメインは、細胞外液に曝露される受容体の領域であり、３つの部分：シグナル伝達ペプチド、抗原認識領域、及びスペーサーを含む。シグナル伝達ペプチドは、新生タンパク質を小胞体に誘導する。ＣＡＲでは、シグナル伝達ペプチドは一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、短いリンカーペプチドで連結された免疫グロブリンの軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、リンカーはグリシン及びセリンを含む。一部の実施形態では、リンカーはグルタミン酸及びリジンを含む。

【0085】

[00108]ＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜にまたがる疎水性αヘリックスである。一部の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ２８膜貫通ドメインは、高度に発現されたＣＡＲをもたらす。一部の実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインはＣＤ３－ζ膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、ＣＤ３－ζ膜貫通ドメインは、ネイティブＴ細胞受容体に組み込まれるＣＡＲをもたらす。

【0086】

[00109]ＣＡＲのエンドドメインは、一般的に、受容体の「機能的」末端と考えられている。エクトドメインの抗原認識領域、ＣＡＲクラスターによる抗原認識の後、シグナルが細胞に伝達される。一部の実施形態では、エンドドメインはＣＤ３－ζエンドドメインであり、３つの免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。この場合、ＩＴＡＭは、抗原結合後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達し、Ｔ細胞免疫応答を引き起こす。

【0087】

[00110]ＣＡＲ Ｔ細胞の生成中に、Ｔ細胞はヒト対象から取り出され、遺伝的に改変され、癌細胞を攻撃するために患者に再導入される。ＣＡＲ Ｔ細胞は、患者自身の血液（自己由来）又は別の健康なドナー（同種異系）に由来し得る。一般的に、ＣＡＲ Ｔ細胞は、健康な細胞では発現しない腫瘍において発現する抗原に特異的になるように発生される。

【0088】

[00111]Ｔ細胞の活性化。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成される免疫細胞培養物はＣＡＲ Ｔ細胞培養物である。ＣＡＲ Ｔ細胞を活性化して、活性化Ｔ細胞培養物を形成することができる。インビボでは、樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）とＡＰＣ主要ヒストン適合性複合体（ＭＨＣ）との相互作用により、Ｔ細胞活性化の刺激として作用する。ＴＣＲは、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞）とヘルパーＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞）の両方の活性化に役立つＴ細胞共受容体であるＣＤ３と会合する。一般的に、Ｔ細胞の活性化は、２シグナルモデルに従い、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体、並びに共刺激受容体の刺激が必要である。Ｔ細胞の活性化については、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ２０１５；カロス２０１１にさらに記載されている。

【0089】

[00112]共刺激シグナルがないと、細胞はアネルギーの影響を受けやすくなり、反応しなくなる。したがって、Ｔ細胞の共刺激は、Ｔ細胞の増殖、分化、及び生存に重要である可能性がある。Ｔ細胞の共刺激分子の非限定的な例には、ＡＰＣの膜のＣＤ８０及びＣＤ８６の受容体であるＣＤ２８；及びＩＣＯＳ－Ｌと相互作用する活性化Ｔ細胞に発現するＣＤ２８スーパーファミリー分子であるＣＤ２７８又はＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激因子）が含まれる。したがって、一部の実施形態では、共刺激分子はＣＤ２８である。他の実施形態では、共刺激分子はＩＣＯＳである。インビボでは、共刺激シグナルは、ＡＰＣのＢ７分子によって提示され、Ｔ細胞のＣＤ２８受容体に結合する。Ｂ７は、Ｔ細上のＣＤ２８又はＣＤ１５２表面タンパク質と相互作用して、共刺激シグナルを生成できる、活性化ＡＰＣに見られる末梢膜貫通タンパク質である。したがって、一部の実施形態では、共刺激分子はＢ７である。共刺激受容体は、例えば、Ｌａｆｆｅｒｔｙ、１９７５年；Ｈａｒｄｉｎｇ、１９９２年；Ｃｌａｖｒｅｕｌ、２０００年；Ｃｈａｒｒｏｎ、２０１５年；Ｆａｔｈｍａｎ、２００７年；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ、２００５年にさらに記載されている。共刺激は、例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、２０００年；Ａｎｄｒｉｓ、２００４年にさらに記載されている。Ｂ７分子は、例えば、Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ、１９９６年；Ｓｃｈｗａｒｔｚ、２００３年にさらに記載されている。

【0090】

[00113]活性化の様々な方法は、Ｔ細胞活性化をシミュレートするためにインビトロで利用される。実施形態では、Ｔ細胞培養物は、活性化試薬で活性化される。さらなる実施形態では、活性化試薬は抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。なおさらなる実施形態では、活性化試薬は樹状細胞である。樹状細胞は、抗原を処理し、それを細胞表面でＴ細胞に提示するＡＰＣである。一部の実施形態では、活性化試薬はＴ細胞培養物と共培養される。共培養では、第２の細胞型の別々の精製及び培養を必要し得、労働要件及び変動源が増加する可能性がある。したがって、一部の実施形態では、代替の活性化方法が使用される。

【0091】

[00114]実施形態では、細胞は、活性化ステップ中に活性化試薬と安定した接触を維持する。細胞と活性化試薬の間の安定した接触を維持する１つの方法は、細胞の不必要な又は過度の運動を防ぐことによる。したがって、実施形態では、細胞培養は、活性化ステップ中に実質的に妨害されない。「実質的に妨害されていない」とは、細胞培養培地が交換されている間、細胞が、一般的には、細胞培養チャンバーの同じ領域、例えば、チャンバーの底部に残ることを意味する。細胞が異なる容器間を移動する場合、例えば、ある培養フラスコから別の培養フラスコに移される場合、細胞は乱され得、又は容器が柔軟性である場合に、細胞は乱され得る。例えば、培養バッグなどの柔軟な容器は、バッグを取り扱う場合に細胞を動かし得る。本明細書に記載されるように、本方法は、実質的に平らであり、低い細胞培養チャンバーを適切に利用して、様々な栄養素及びガスへの細胞の均一なアクセスを可能にし、また老廃物の除去及び培地の移動も容易にする。実質的に平らな細胞培養チャンバーはまた、細胞の増殖及び所望の細胞表現型（複数可）の生成を高めることができる方法の様々な段階の間に、細胞が互いに接触することを可能にする。

【0092】

[00115]一部の実施形態では、活性化試薬は抗体である。一部の実施形態では、細胞培養は、ビーズを含む、ポリマー表面などの表面に結合した抗体で活性化される。さらなる実施形態では、１つ又は複数の抗体は、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体である。
例えば、ビーズは、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８でコーティングされた、例えば、ダイナビーズなどの磁気ビーズであり得る。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８ビーズは、Ｔ細胞の活性化をサポートする刺激シグナルを適切に提供することができる。例えば、Ｒｉｄｄｅｌｌ、１９９０年；Ｔｒｉｃｋｅｔｔ、２００３年を参照されたい。

【0093】

[00116]他の実施形態では、細胞培養物は可溶性抗体で活性化される。さらなる実施形態では、可溶性抗体は可溶性抗ＣＤ３抗体である。ＯＫＴ３は、免疫グロブリンＩｇＧ２ａアイソタイプのマウスモノクローナル抗体であり、ＣＤ３を標的とする。したがって、一部の実施形態では、可溶性抗ＣＤ３抗体はＯＫＴ３である。ＯＫＴ３については、例えば、Ｄｕｄｌｅｙ、２００３年；Ｍａｎｇｅｒ、１９８５年；Ｃｅｕｐｐｅｎｓ、１９８５年；Ｖａｎ Ｗａｕｗｅ、１９８０年；Ｎｏｒｍａｎ、１９９５年にさらに記載されている。

【0094】

[00117]一部の実施形態では、Ｔ細胞活性化の共刺激シグナルは、アクセサリー細胞によって提供される。アクセサリー細胞には、例えば、Ｔ細胞のＴＣＲ／ＣＤ３複合体とＣＤ３抗体の架橋を可能にするＦｃ受容体が含まれ得る。一部の実施形態では、細胞培養物は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の混合集団である。ＰＢＭＣには、Ｔ細胞の活性化をサポートすることができるアクセサリー細胞が含まれ得る。例えば、ＣＤ２８共刺激シグナルは、ＰＢＭＣの単球に存在するＢ７分子によって提供され得る。したがって、一部の実施形態では、アクセサリー細胞には、単球又は単球由来細胞（例えば、樹状細胞）が含まれる。追加の実施形態では、アクセサリー細胞は、Ｂ７、ＣＤ２８、及び／又はＩＣＯＳを含む。アクセサリー細胞については、例えば、Ｗｏｌｆ、１９９４年；Ｃｈａｉ、１９９７年；Ｖｅｒｗｉｌｇｈｅｎ、１９９１年；Ｓｃｈｗａｒｔｚ、１９９０年；Ｊｕ、２００３年；Ｂａｒｏｊａ、１９８９年；Ａｕｓｔｙｎ、１９８７年；Ｔａｘ、１９８３年にさらに記載されている。

【0095】

[00118]本明細書に記載されるように、活性化試薬は、生成されるＣＡＲ Ｔ細胞の表現型を決定し得、所望の表現型の促進を可能にする。一部の実施形態では、活性化試薬は、Ｔ細胞サブセット、すなわち、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞とＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の比率を決定する。細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、典型的には、癌細胞（すなわち、抗腫瘍反応）、（例えば、ウイルスで）感染した細胞、又は他の方法で損傷した細胞の殺傷に関与する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、典型的には、サイトカインを産生し、免疫応答の調節を支援し、場合によっては、細胞溶解をサポートし得る。ＣＤ４＋細胞はＡＰＣを活性化し、次に、ＡＰＣは抗腫瘍反応のためにナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する。したがって、実施形態では、本開示の方法は、所定の表現型のＣＡＲ Ｔ細胞を生成すること（すなわち、所望の表現型の細胞を促進すること）をさらに含む。所定の表現型は、例えば、ＣＤ８＋細胞対ＣＤ４＋細胞の所定の比であり得る。一部の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団におけるＣＤ８＋細胞対ＣＤ４＋細胞の比は、約１：１、約０．２５：１、又は約０．５：１である。他の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞の集団におけるＣＤ８＋細胞対ＣＤ４＋細胞の比は、約２：１、約３：１、約４：１、又は約５：１である。

【0096】

[00119]実施形態では、活性化試薬は、活性化ステップ後に活性化Ｔ細胞培養物から除去される。活性化試薬、例えば、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体は、細胞培養培地に存在し得る。したがって、一部の実施形態では、活性化試薬、例えば抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体を含む細胞培養培地は、活性化ステップ後に活性化Ｔ細胞培養物から除去される。一部の実施形態では、活性化試薬の除去には、可溶性抗体の除去が含まれる。例えば、可溶性抗体は、細胞培養培地を交換することによって除去することができる。可溶性抗体はまた、可溶性抗体に特異的な親和性方法によって除去することもできる。他の実施形態では、活性化試薬の除去には、抗体を含むビーズを除去することが含まれる。ビーズの除去には、例えば、ビーズの濾過又は磁石による除去が含まれ得る。

【0097】

[00120]活性化Ｔ細胞の形質導入。一部の実施形態では、遺伝子修飾された免疫細胞培養物は、キメラ抗原受容体をコードするベクターで形質導入されて、形質導入されたＴ細胞培養物を生成する活性化Ｔ細胞培養物である。一部の実施形態では、形質導入には、ウイルス感染、トランスポゾン、ｍＲＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーション、又はそれらの組み合わせが含まれる。一部の実施形態では、形質導入には、エレクトロポレーションが含まれる。したがって、実施形態では、細胞工学システムは、本明細書に記載されるように、エレクトロポレーションシステム又はエレクトロポレーションユニットを含む。追加の実施形態では、形質導入にはウイルス感染が含まれる。ベクターは、例えば、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又はアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターであり得る。実施形態では、形質導入は、細胞培養物の活性化Ｔ細胞にウイルスベクターを導入することを含む。追加の実施形態では、ベクターは、ウイルス粒子として送達される。

【0098】

[00121]一部の実施形態では、形質導入ステップは、活性化Ｔ細胞にレンチウイルスベクターを形質導入することを含み、レンチウイルスベクターは、約０．５～約５０、約０．５～約３０、又は約０．５～約２０の感染多重度（ＭＯＩ）で導入される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約０．５～約８のＭＯＩで導入される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約０．５～約６のＭＯＩで導入される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約０．５～約４のＭＯＩで導入される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約０．５～約２のＭＯＩで導入される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約０．６～約１．５のＭＯＩで導入される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約０．７～約１．３のＭＯＩで導入される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約０．８～約１．１のＭＯＩで導入される。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、又は約２のＭＯＩで導入される。

【0099】

[00122]一部の実施形態では、活性化ステップの後、Ｔ細胞培養物から細胞培養培地が除去され、次に、培地がベクター（例えば、レンチウイルスベクター）と混合され、細胞に均一に分配される。一部の実施形態では、除去された細胞培養培地は、希釈するために使用され、活性化されたＴ細胞培養物にベクターを均一に送達するために使用される。Ｔ細胞培養物におけるベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の均一な分布及びその結果としての均一な曝露は、形質導入効率を改善する。一部の実施形態では、細胞培養物の体積は、活性化後、ベクターの添加前に減少する。体積の減少は、より高度な細胞－ベクターの接触を可能にすることができる。一部の実施形態では、活性化Ｔ細胞培養物は、形質導入中に実質的に妨害されない。一部の実施形態では、細胞培養物は、活性化及び形質導入ステップ中に実質的に妨害されず、すなわち、活性化試薬又はベクターが細胞に提供されている間、細胞は、一般的、チャンバーの同じ領域（例えば、細胞培養チャンバーの底部）にとどまる。これは、細胞への活性化試薬及び／又はベクターの均一な分布及び均一な曝露を促進し、したがって、活性化及び／又は形質導入効率を改善し得る。

【0100】

[00123]したがって、一部の実施形態では、細胞工学システムを使用する方法の形質導入効率は、細胞培養のための柔軟なガス透過性バッグを使用する方法の形質導入効率よりも高い。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ Ｔ細胞の自動化生成法の形質導入効率は、柔軟なガス透過性バッグを利用する方法の形質導入効率より、少なくとも１０％大きく、少なくとも１５％大きく、少なくとも２０％大きく、少なくとも２５％大きく、少なくとも３０％大きく、少なくとも３５％大きく、少なくとも４０％大きく、少なくとも４５％大きく、少なくとも５０％大きく、少なくとも５５％大きく、少なくとも６０％大きく、少なくとも６５％大きく、少なくとも７０％大きく、少なくとも７５％大きく、少なくとも８０％大きく、少なくとも８５％大きく、少なくとも９０％大きく、少なくとも９５％大きく、又は少なくとも１００％大きい。

【0101】

[00124]形質導入されたＴ細胞の拡大。一部の実施形態では、形質導入されたＴ細胞培養物（又は他の免疫細胞培養物）は、所定の培養サイズ（すなわち、細胞の数）まで拡大される。所定の培養サイズは、臨床使用、すなわち、患者への輸血、研究開発作業などに適した十分な数の細胞を含み得る。一部の実施形態では、患者への投与のためのＣＡＲ Ｔ細胞の臨床用量又は治療用量は、約１０^５個の細胞、約１０^６個の細胞、約１０^７個の細胞、約１０^８個の細胞、約１０^９個の細胞、又は約１０^１０個の細胞である。一部の実施形態では、本方法は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、又は少なくとも１００個の臨床用量のＣＡＲ Ｔ細胞を生成する。一部の実施形態では、形質導入されたＴ細胞培養物は、約０．１Ｌから約５Ｌ、約０．１Ｌから約２Ｌ、又は約０．２Ｌから約２Ｌの総体積まで拡大される。一部の実施形態では、形質導入されたＴ細胞培養物は、約０．１Ｌ、約０．２Ｌ、約０．３Ｌ、約０．４Ｌ、約０．５Ｌ、約０．６Ｌ、約０．７Ｌ、約０．８Ｌ、約０．９Ｌ又は約１．０Ｌの総体積に拡大される。また、細胞生成プロセスの段階に応じて、必要に応じて、プロセスを通じて体積を変えることができる。一部の実施形態では、所定の培養サイズは、細胞工学システムのユーザーによって入力される。ユーザーは、生成される所望の細胞数（例えば、１０^１０個のＣＡＲ Ｔ細胞）として事前に所定の培養サイズを入力するか、又は生成される臨床用量又は治療用量の所望の数（例えば、１０回の臨床用量又は治療用量のＣＡＲ Ｔ細胞）として所定の培養サイズを入力することができる。実施形態では、本明細書に記載される方法により生成されるＣＡＲ Ｔ細胞の数は、少なくとも約１億（すなわち、１×１０^６）個の細胞、又は少なくとも約３億個、少なくとも約５億個、少なくとも約６億個、少なくとも約７億個、少なくとも約８億個、少なくとも約９億個、少なくとも約１０億（すなわち１×１０^９）個、少なくとも約１１億個、少なくとも約１２億個、少なくとも約１３億個、少なくとも約１４億個、少なくとも約１５億個、少なくとも約１６億個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８億個、少なくとも約１９億個、少なくとも約２０億（すなわち２×１０^９）個の細胞であり、例えば、少なくとも約２１億個、少なくとも約２２億個、少なくとも約２３億個、少なくとも約２４億個、少なくとも約２５億個、少なくとも約２６億個、少なくとも約２７億個、少なくとも約２８億個、少なくとも約２９億個、又は少なくとも約３０億個のＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0102】

[00125]一部の実施形態では、形質導入されたＴ細胞培養物の拡大は、形質導入されたＴ細胞培養物の少なくとも１回のラウンドの供給、洗浄、モニタリング、及び選択を含む。細胞培養物の供給は、細胞培養物に培地及び／又は追加の栄養素を補足することを含み得る。細胞培養物の洗浄には、使用済みの培地（すなわち、栄養素が枯渇している、及び／又は細胞老廃物を含む培地）を除去し、細胞培養物に新鮮な培地を補充することが含まれる。細胞培養物のモニタリングには、細胞培養物の温度、ｐＨ、グルコース、酸素レベル、二酸化炭素レベル、及び／又は光学密度のモニタリングが含まれる。細胞培養物の選択は、例えば、生存率、種類、及び／又は形態などの所望の特性を有する細胞の選択、及び所望の特性を持たない細胞の除去を含み得る。一部の実施形態では、細胞工学システムは、所定の培養サイズを達成するために、形質導入されたＴ細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び／又は選択の複数回のラウンドを行うように構成される。一部の実施形態では、細胞工学システムは、所定の培養サイズを達成するために、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、又は少なくとも１００ラウンドの、形質導入されたＴ細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び／又は選択を行う。

【0103】

[00126]実施形態では、所望の細胞表現型又は細胞の数などに応じて、供給、洗浄及びモニタリングのうちの１つ又は複数を取り除くことができ、又はイベントの順序を変更することができる。

【0104】

[00127]実施形態では、モニタリングは、温度センサー、ｐＨセンサー、グルコースセンサー、酸素センサー、二酸化炭素センサー、及び／又は光学密度センサーによるモニタリングを含む。したがって、一部の実施形態では、細胞工学システムは、温度センサー、ｐＨセンサー、グルコースセンサー、酸素センサー、二酸化炭素センサー、及び／又は光学密度センサーのうちの１つ又は複数を含む。追加の実施形態では、細胞工学システムは、所定の培養サイズに基づいて、細胞培養物の温度、ｐＨ、グルコース、酸素レベル、二酸化炭素レベル、及び／又は光学密度を調節するように構成される。例えば、細胞工学システムが、細胞培養物の現在の酸素レベルが低すぎて所望の細胞培養サイズに必要な増殖を達成できないと検出した場合、細胞工学システムは、例えば、酸素化細胞培養培地を導入することによって、細胞培養培地を酸素化細胞培養培地で置き換えることによって、又は細胞培養培地を酸素供給コンポーネント（すなわち、シリコーンチューブ）に流すことによって、細胞培養物の酸素レベルを自動的に増加させる。別の実施例では、細胞工学システムが、細胞培養物の現在の温度が高すぎること、及び細胞が急速に増殖しすぎている（例えば、細胞の過密の可能性が望ましくない特性につながる可能性がある）ことを検出した場合、細胞工学システムは、細胞の安定した増殖速度（又は必要に応じて指数関数的な増殖速度）を維持するために、細胞培養物の温度を自動的に下げる。なおさらなる実施形態では、細胞工学システムは、細胞増殖速度及び／若しくは細胞数、又はｐＨ、酸素、グルコースなどの他のモニタリング因子に基づいて、細胞供給のスケジュール（すなわち、新鮮な培地及び／又は栄養素を細胞培養物に提供すること）を自動的に調節する。細胞工学システムは、培地（及び洗浄液などの他の試薬）を低温チャンバー（例えば、４℃又は－２０℃）に保存するように構成され、細胞培養物に加温された培地を導入する前に、室温チャンバー又は高温チャンバー（例えば、それぞれ２５℃又は３７℃）で培地を温めるように構成され得る。

【0105】

[00128]実施形態では、洗浄は、濾過又は沈降によって細胞を洗浄することを含む。一部の実施形態では、洗浄ステップは、細胞培養容器又はフラスコを動かすことを必要としない、すなわち、細胞は、同じ細胞培養容器又はフラスコ内で洗浄され得る。さらなる実施形態では、細胞は、洗浄ステップの間、実質的に妨害されないままである。実施形態では、選択は、細胞培養物を１つ又は複数の選択試薬と混合することを含む。選択試薬は、所望の細胞型に特異的なビーズ、例えば磁気ビーズであり得、次に、ビーズに結合した細胞は、例えば、磁性チャンバーを通過することにより、非結合細胞から分離される。例えば、選択ビーズは、所望の細胞型に特異的な抗体、例えば、抗ＣＤ８抗体又は抗ＣＤ４抗体を含む。選択はまた、サイズに基づいて特定の細胞型を削除するか又は選択するために、濾過によって行うことができる。プラスチック接着による細胞の選択（すなわち、細胞が１つのチャンバーで開始し、不要な細胞が表面に付着し、次に、懸濁液中にまだある所望の細胞が別のチャンバーに移される）もまた利用することができる。

【0106】

[00129]適切には、拡大段階の間、細胞は、振とう及び回転されない。拡大中に細胞を比較的静止した位置に維持することは、全体的な細胞生成を助け、並びに所望の細胞表現型を提供するのに役立つと判断された。

【0107】

[00130]拡大された培養物の濃度。一部の実施形態では、拡大されたＴ細胞培養物（又は他の免疫細胞培養物）は、所定の濃度に濃縮される。所定の濃度は、患者に適切に注入することができる体積である。例えば、拡大されたＴ細胞培養物は、約１ｍｌ、約２ｍｌ、約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約３５ｍｌ、約４０ｍｌ、約４５ｍｌ、約５０ｍｌ、約５５ｍｌ、約６０ｍｌ、約６５ｍｌ、約７０ｍｌ、約７５ｍｌ、約８０ｍｌ、約８５ｍｌ、約９０ｍｌ、約９５ｍｌ、又は約１００ｍｌに濃縮され得る。一部の実施形態では、濃縮は、遠心分離によって行われる。一部の実施形態では、濃縮は、濾過により実施される。一部の実施形態では、濾過は、限外濾過及び／又は透析濾過である。一部の実施形態では、所定の濃度は、細胞工学システムのユーザーによって入力される。他の実施形態では、所定の濃度は、ユーザーによって入力された異なるパラメータ、例えば、生成される臨床用量若しくは治療用量の回数又は体積；あるいは生成される細胞の数に基づいて、細胞工学システムによって決定される。一部の実施形態では、細胞工学システムは、入力パラメータに基づいて、生成される臨床用量又は治療用量の体積又は回数を自動的に調節する。一部の実施形態では、細胞工学システムは、所定の濃度に基づいて、遠心分離（例えば、速度、遠心分離の持続時間）又は濾過（例えば、フィルターサイズ、体積、持続時間）のパラメータを自動的に調節する。

【0108】

[00131]ポート位置及びチャンバーの設計に基づく沈降もまた利用することができる。すなわち、細胞を除去することなく、チャンバー内の液体量を約０．５ｍＬに減らすことができる。

【0109】

[00132]ＣＡＲ Ｔ細胞培養回収。一部の実施形態では、濃縮されたＴ細胞培養物（又は他の免疫細胞培養物）は、適切にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞培養物を生成するために回収される。一部の実施形態では、回収には、撹拌、流体の流れ、及びＣＡＲ Ｔ細胞の洗浄が含まれる。一部の実施形態では、回収は、例えば、細胞老廃物、ビーズ（例えば、抗体を含むビーズ及び／又は細胞の分離のために使用されるビーズ）などの選択試薬、又は過剰なウイルスベクターを含む望ましくない生成物からの細胞の分離を含む。一部の実施形態では、回収は、ＣＡＲ Ｔ細胞の１つ又は複数のフラスコ、バイアル又は容器への均一な分布を含む。一部の実施形態では、回収には、ＣＡＲ Ｔ細胞を製剤化試薬、例えば、長期保存のためにＣＡＲ Ｔ細胞を安定化させる溶液に再懸濁することが含まれる。一部の実施形態では、回収には、ＣＡＲ Ｔ細胞の凍結保存が含まれる。

【0110】

[00133]さらなる下流プロセス。一部の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、患者での治療的使用の前にさらに下流の処理を受ける。例えば、凍結保存されたＣＡＲ Ｔ細胞は、潜在的なウイルス粒子の残留物を除去するために、滅菌濾過により濾過され得る。滅菌濾過後、ＣＡＲ Ｔ細胞は、１つ又は複数のバイアル、フラスコ、容器（vessel）、又は容器（container）にパッケージされる前に、少なくとも１つ以上の濃縮ステップを行うことができる。パッケージされたＣＡＲ Ｔ細胞は、品質評価及び／又は品質管理試験に供される場合がある。一部の実施形態では、ＣＡＲＴ細胞は、患者への投与前に最小限の下流処理を受ける。例えば、一部の実施形態では、回収されたＣＡＲ Ｔ細胞は凍結保存されないが、回収後の短時間内に患者に移される。凍結保存ステップを回避すると、細胞の生存率が向上する場合がある。

【0111】

[00134]細胞工学システム。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、完全に密閉された細胞工学システム６００（図６Ａ、６Ｂを参照されたい）によって行われ、適切に、活性化、形質導入、拡大、濃縮、及び改修ステップを行うための指示書を有する。ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、遺伝子修飾された免疫細胞の自動化生成のための細胞工学システムが本明細書に記載され、全体で自動化細胞工学システム、コクーン、又はコクーンシステムとも呼ばれる。例えば、ユーザーは、細胞培養物及び試薬（例えば、活性化試薬、ベクター、細胞培養培地、栄養素、選択試薬など）及び細胞生成のパラメータ（例えば、開始細胞数、培地の種類、活性化試薬の種類、ベクターの種類、細胞の数又は生成される用量など）が事前に充填された細胞工学システムを提供することができる。細胞工学システムは、ユーザーからのさらなる入力なしに、ＣＡＲ Ｔ細胞を含む、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成する方法を実行することができる。自動化生成プロセスの終わりに、細胞工学システムは、生成された細胞を収集するために（例えば、警告メッセージを再生するか、又はモバイルアプリ警告を送信することにより）ユーザーに警告することができる。一部の実施形態では、完全に密閉された細胞工学システムは、滅菌細胞培養チャンバーを含む。一部の実施形態では、完全に密閉された細胞工学システムは、細胞培養物の非無菌環境への曝露を減らすことにより、細胞培養物の汚染を最小限に抑える。追加の実施形態では、完全に密閉された細胞工学システムは、ユーザーによる細胞の取り扱いを減らすことにより、細胞培養物の汚染を最小限に抑える。

【0112】

[00135]本明細書に記載されるように、細胞工学システムは、カセット６０２を適切に含む。したがって、実施形態では、本明細書に提供されるのは、自動化細胞工学システムで使用するためのカセットである。本明細書で使用するとき、「カセット」とは、本明細書に記載される方法の様々な要素を実施するための１つ又は複数のチャンバーを含み、適切には、細胞培地、活性化試薬、ベクターなどのうちの１つ又は複数も含む、細胞工学システムの大部分が自給式、取り外し可能及び交換可能な要素を指す。

【0113】

[00136]図６Ｂは、本明細書の実施形態によるカセット６０２の実施形態を示す。実施形態では、カセット６０２は、細胞培養培地の保存に適した低温チャンバー６０４、並びに免疫細胞培養物の活性化、形質導入及び／又は拡大を適切に実行するための高温チャンバー６０６を含む。適切には、高温チャンバー６０６は、熱障壁１１０２によって低温チャンバー６０６から分離されている（図１１Ｂを参照されたい）。本明細書で使用するとき、「低温チャンバー」とは、冷蔵温度で細胞培地などを維持するために、室温未満、より適切には約４℃～約８℃に適切に維持されるチャンバーを指す。低温チャンバーは、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、又は約５Ｌの流体を含む、培地用のバッグ又は他のホルダーを含むことができる。追加の培地バッグ又は他の流体供給源をカセットの外部に接続し、アクセスポートを介してカセットに接続することができる。

【0114】

[00137]本明細書で使用するとき、「高温チャンバー」とは、室温より上に適切に維持され、細胞の増殖（proliferation）及び成長（growth）を可能にする温度、すなわち，約３５～４０℃、より適切には約３７℃により適切に維持されるチャンバーを指す。

【0115】

[00138]実施形態では、図６Ｄ及び図６Ｅに示されるように、高温チャンバー６０６は、細胞培養チャンバー６１０（増殖チャンバー又は細胞増殖チャンバー全体とも呼ばれる）を適切に含む。

【0116】

[00139]カセットは、細胞培養チャンバーに接続された１つ又は複数の流体経路をさらに含み、流体経路は、細胞培養チャンバー内の細胞を乱すことなく、再循環、老廃物の除去及び均質なガス交換及び細胞培養チャンバーへの栄養素の分配を提供する。カセット６０２はまた、本明細書に記載されるように、カセットを通じて流体を駆動するためのペリスタポンプを含む１つ又は複数のポンプ６０５、並びに様々な流体経路を通る流れを制御するための１つ又は複数のバルブ６０７をさらに含む。

【0117】

[00140]例示的な実施形態では、図６Ｄに示されるように、細胞培養チャンバー６１０は、容易に撓んだり又は曲がったりしない平らな柔軟性でないチャンバー（すなわち、プラスチックなどの実質的に非柔軟性の材料で作られている）である。柔軟性でないチャンバーを使用することにより、細胞を実質的に邪魔されない状態に維持することができる。図６Ｅに示されるように、細胞培養チャンバー６１０は、免疫細胞培養物が細胞培養チャンバーの底部６１２にわたって広がることを可能にするように配向される。図６Ｅに示されるように、細胞培養チャンバー６１０は、床又はテーブルと平行な位置に適切に維持され、細胞培養物を妨害されない状態に維持し、細胞培養チャンバーの底部６１２の広い領域にわたって細胞培養物を広げることができる。実施形態では、細胞培養チャンバー６１０の全体の厚さ（すなわち、チャンバーの高さ６４２）は薄く、約０．５ｃｍ～約５ｃｍのオーダーである。適切には、細胞培養チャンバーは、約０．５０ｍｌ～約３００ｍｌ、より適切には約５０ｍｌ～約２００ｍｌの体積を有するか、又は細胞培養チャンバー、は約１８０ｍｌの体積を有する。低いチャンバー高さ６４２（５ｃｍ未満、適切には４ｃｍ未満、３ｃｍ未満、又は２ｃｍ未満）を使用すると、細胞に近接した効果的な培地及びガス交換が可能になる。ポートは、細胞を乱すことなく、流体の再循環を介して混合できるように構成されている。より高い高さの静的な容器は、濃度勾配を生成する場合があり、細胞近傍の領域は酸素及び新鮮な栄養素において制限される。制御された流体力学により、細胞の乱れなしに培地交換を行うことができる。細胞を喪失するリスクなしに、培地を追加のチャンバーから取り出すことができる（細胞が存在しない）。

【0118】

[00141]本明細書に記載されるように、例示的な実施形態では、カセットは、下記の任意の組み合わせを含む、細胞培養物、培養培地、活性化試薬、及び／又はベクターのうちの１つ又は複数で事前に充填される。さらなる実施形態では、これらの様々な要素は、適切な注入ポートなどを介して後に追加することができる。

【0119】

[00142]本明細書に記載されるように、実施形態では、カセットは、ｐＨセンサー、グルコースセンサー、酸素センサー、二酸化炭素センサー、乳酸センサー／モニター、及び／又は光学密度センサーのうちの１つ又は複数を適切にさらに含む。カセットはまた、１つ又は複数のサンプリングポート及び／又は注入ポートを含むことができる。このようなサンプリングポート及び注入ポート（１１０４）の実施例を図１１に示す。これは、カートリッジを、エレクトロポレーションユニット又は追加の培地源などの外部装置に接続するためのアクセスポートを含むことができる。図１１Ａはまた、細胞入力１１０５、細胞培地などを温めるために使用し得る試薬加温バッグ１１０６、並びに、例えば、細胞培地、ベクター、栄養素及び老廃物などを含む、培養培地において使用するための様々なコンポーネントを保持する培養ゾーン１１０７の配置を示す。

【0120】

[00143]図１１Ｂは、カセット６０２が取り外されたコクーン細胞工学システムを示す。図１１Ｂにおいて、ガス制御シール１１２０、加温ゾーン１１２１、アクチュエータ１１２２、所望に応じて細胞工学システムを揺動又は傾斜させるためのピボット１１２３、並びに低温チャンバー６０６を保持するための低温ゾーン１１２４を含む細胞工学システムのコンポーネントを見ることができる。また、バーコードリーダーを含むことができる例示的なユーザーインターフェース１１３０、及びタッチパッド又は他の同様の装置による入力を使用して受信する機能が示される。図１１Ｅは、カセット６０２の追加の詳細図を示し、追加の細胞培養体積が必要な場合に使用することができる二次チャンバー１１５０、並びに本明細書で生成される最終細胞培養物を回復するために使用することができる回収チャンバー１１５２の配置を含む。

【0121】

[00144]例示的な実施形態では、図６Ｆに示されるように、細胞培養チャンバー６１０は、以下のうちの少なくとも１つをさらに含む：細胞培養チャンバーから気泡の除去を可能にするようにし及び／又は再循環ポートとして構成される遠位ポート６２０；再循環入口ポートとして機能するように構成された中間ポート６２２；及び細胞除去のための排出ポートとして機能するように構成された近位ポート６２４。

【0122】

[00145]なおさらなる実施形態では、本明細書において、自動化細胞工学システム６００において使用するためのカセット６０２が提供され、免疫細胞培養物を収容するように構成されたチャンバー体積を有する免疫細胞培養物の活性化、形質導入及び／又は拡大を実施するための細胞培養チャンバー６１０、並びに免疫細胞培養物を収容せずに培地及び他の作動流体に追加の体積を提供することにより細胞培養チャンバーの作業体積を増加させるためのサテライト体積６３０（すなわち、サテライト体積はいずれもの細胞を含まない）を含む。適切には、サテライト体積は、細胞培養チャンバーに流体接続され、その結果、免疫細胞培養物を乱すことなく培地が培養チャンバーと交換される。例示的な実施形態では、サテライト体積はバッグであり、他の実施形態では、サテライト体積は非収量のチャンバーである。実施形態では、サテライト体積は約０．５０ｍｌ～約３００ｍｌの間、より適切には約５０ｍｌ～約２００ｍｌの間である。図６Ｄ～６Ｅは、カセット６０２のサテライト体積６３０の位置を示す。

【0123】

[00146]図６Ｇは、細胞培養チャンバー６１０とサテライト体積６３０の間の接続を示している概略図を示す。また図６Ｇには、様々なセンサー（例えば、ｐＨセンサー６５０、溶存酸素センサー６５１）、並びにサンプリング／試料ポート６５２、及び様々なバルブ（制御バルブ６５３、バイパスチェックバルブ６５４）、並びに１つ又は複数の流体経路６４０の配置が示され、コンポーネントを接続するシリコーンベースのチューブコンポーネントを適切に含む。本明細書に記載されるように、シリコーンベースのチューブコンポーネントの使用により、チューブコンポーネントを通じた酸素供給が可能になり、細胞培養のためのガス移動及び最適な酸素供給が促進される。また図６Ｇには、ポンプチューブ６５７及びバッグ／バルブモジュール６５８とともに、カセットの流路における１つ又は複数の疎水性フィルター６５５又は親水性フィルター６５６の使用が示される。

【0124】

[00147]図６Ｈは、コクーンシステムを使用したガス交換データを、従来のバッグと比較して示す。

【0125】

[00148]実施形態では、サテライト体積６３０は、免疫細胞培養物の細胞を喪失することなく、培地を除去することができるようにさらに構成される。すなわち、サテライト体積と細胞培養チャンバーの間の培地交換は、細胞が乱されず、細胞培養チャンバーから除去されないような方法で行われる。

【0126】

[00149]追加の実施形態では、図６Ｇに示されるように、カセット６０２は、必要に応じて、追加の培地を保持するためのクロスフローリザーバー６３２などを適切にさらに含む。適切には、クロスフローリザーバーは、約０．５０ｍｌ～約３００ｍｌの間、より適切には約１００ｍｌ～約１５０ｍｌの間の体積を有する。

【0127】

[00150]本明細書に記載される細胞工学システムは、３つの関連する体積である細胞培養チャンバー体積、作業体積、及び総体積を適切に有する。適切には、カセットで使用される作業体積は、プロセスステップに基づいて１８０ｍＬ～４６０ｍＬの範囲であり、最大約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ又は約１Ｌまで増加させることができる。実施形態では、カセットは、４×１０^９細胞～１０×１０^９細胞を容易に達成することができる。プロセス中の細胞濃度は、０．３×１０^６細胞／ｍｌ～約１０×１０^６細胞／ｍｌまで変化する。本明細書に記載されるように、細胞は、細胞培養チャンバーに配置されているが、培地は、追加のチャンバー（例えば、クロスフローリザーバー及びサテライト体積）を介して継続的に再循環され、作業体積を増加させる。

【0128】

[00151]本明細書に記載されるように、液体で満たされた場合（例えば、細胞培養物）及びピックアップ又は移動された場合に形状を変える柔軟性のあるバッグとは異なり、「実質的に非収量のチャンバー」（例えば、例示的な細胞培養チャンバー６１０）は、典型的な取り扱い条件で液体を満たし、拾い上げ、又は移動した場合、形状は変化しない（例えば、曲げ、湾曲、変形など）。したがって、一部の実施形態では、実質的に非収量のチャンバーは、チャンバーが取り上げられ又は移動された場合でさえ、細胞がチャンバーの同じ領域に実質的にとどまることを可能にする。実質的に非収量のチャンバーはまた、バッグに関連する湾曲を有しない。したがって、一部の実施形態では、細胞は、バッグと比較して、実質的に非収量のチャンバー内でより均一に分布する。一部の実施形態では、活性化試薬及び／又はベクターは、バッグと比較して、実質的に非収量のチャンバー内でより均一に分布する。

【0129】

[00152]一部の実施形態では、細胞工学システムは複数のチャンバーを含む。さらなる実施形態では、本明細書に記載される細胞のための方法の活性化、形質導入、拡大、濃縮、及び回収の各ステップは、細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーで行われる。一部の実施形態では、細胞は、あるチャンバーから別のチャンバーへの移動中に実質的に乱されない。他の実施形態では、本方法のステップは、細胞工学システムの同じチャンバー内で行われ、細胞工学システムは、本方法の各ステップに必要なチャンバー環境を自動的に調節する。したがって、様々なステップ中に細胞が乱されないようにすることができる。

【0130】

[00153]一部の実施形態では、細胞工学システムは、細胞培養用の柔軟性のあるガス透過性バッグと比較して、改善されたガス交換を有する。一部の実施形態では、細胞工学システムはガス交換ラインを含む。ガス交換ラインは、例えば、シリコーンなどのガス透過性材料から作製され得る。一部の実施形態では、ガス交換ラインのガス透過係数は、柔軟性のあるガス透過バッグで使用される材料の透過係数よりも高い。一部の実施形態では、細胞工学システムは、細胞生成方法の間に実質的に非収量チャンバー全体に酸素を再循環させる。したがって、一部の実施形態では、細胞工学システムにおける細胞培養物の酸素レベルは、柔軟性のあるガス透過性バッグ内の細胞培養物の酸素レベルよりも高い。酸素レベルの増加は、細胞の成長及び増殖の増加をサポートする場合があるため、細胞培養の拡大ステップでは酸素レベルを高くすることが重要であり得る。

【0131】

[00154]一部の実施形態では、細胞工学システムは、細胞を乱すことなく、チャンバー全体にわたって培地を連続的に再循環させる。例えば、細胞工学システムは、細胞がチャンバーの同じ領域に残ったまま、栄養素を補充し、老廃物を除去し、放出されたサイトカインと溶解ガスをチャンバー内で継続的に循環させることができる。連続循環により、陽性因子の均一な分布と陰性因子の均一な除去が改善され、細胞を乱すことなく、不均一な分布によって引き起こされる局所的な影響が低減される。

【0132】

[00155]一部の実施形態では、細胞工学システムは、細胞生成方法（ＣＡＲ Ｔ生成を含む）の間、チャンバー全体に二酸化炭素を提供する。ＣＯ_２は、細胞培養の標的ｐＨを維持するのに役立ち、これは、細胞の成長（ｇｒｏｗｔｈ）と増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）に重要である。一部の実施形態では、細胞工学システムは、細胞培養のＣＯ_２レベルをモニタリングし、測定されたＣＯ_２レベルに基づいて提供されるＣＯ_２の量を調節する。例えば、細胞培養が増加するにつれて、細胞によって生成されるＣＯ２の量に対応する増加があり、細胞工学システムは提供されるＣＯ_２の量を減らす。細胞培養の所望のＣＯ_２レベルは、例えば、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％のＣＯ_２であり、ユーザーによって定義され得る。細胞工学システムは、測定された細胞培養のＣＯ_２レベルに基づいて、提供されるＣＯ_２の量を絶えず調節しているため、細胞工学システムは、生成プロセス全体にわたって所望のＣＯ_２レベルを維持することができる。溶存ＣＯ_２は、一般的に、溶液を酸性化するため（水と反応して炭酸を形成するため）、細胞培養のＣＯ_２量はまた培養物のｐＨに影響を与える可能性がある。したがって、細胞培養で安定したＣＯ_２レベルを維持すると、より安定したｐＨが得られる場合がある。よって、実施形態では、細胞培養物のｐＨレベルは、生成プロセスの間、実質的に一定のままである。さらなる実施形態では、形質導入された細胞培養物のｐＨレベルは、拡大ステップの間、実質的に一定のままである。

【0133】

[00156]ＣＡＲ Ｔ細胞生成を含む遺伝子修飾された免疫細胞産生からの収量は、活性化及び形質導入効率、並びに細胞の増殖条件によって影響を受ける場合がある。活性化効率は、細胞と活性化試薬のより安定した接触により改善することができる。培養容器全体での細胞の運動は、細胞の不均一な分布につながり、したがって、活性化試薬が細胞培養チャンバーに添加された場合、局所的な効果を生み出す可能性がある。柔軟性のある培養バッグとは対照的に、非収量チャンバーで増殖させた細胞は、活性化プロセス中に影響を受けないままであり、これは、より高い活性化効率に寄与する可能性がある。

【0134】

[00157]活性化効率の改善はまた、より大きなベクター形質導入効率をもたらし得る。細胞が活性化され、活発に分裂している場合、ベクター（例えば、レンチウイルスベクター）はより効果的に細胞に組み込まれ得る。細胞培養チャンバー６１０内の細胞の均一な分布は、細胞へのベクターの均一な曝露を促進し得、一方、細胞は不均一に分布し、したがって、柔軟性のある細胞培養バッグ内で異なるベクター曝露を受ける場合がある。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲ Ｔ細胞を含む遺伝子修飾された免疫細胞の自動化生成のための方法の形質導入効率は、柔軟性のあるガス透過性バッグを利用する方法の形質導入効率より、少なくとも１０％大きい、少なくとも１５％大きい、少なくとも２０％大きい、少なくとも２５％大きい、少なくとも３０％大きい、少なくとも３５％大きい、少なくとも４０％大きい、少なくとも４５％大きい、少なくとも５０％大きい、少なくとも５５％大きい、少なくとも６０％大きい、少なくとも６５％大きい、少なくとも７０％大きい、少なくとも７５％大きい、少なくとも８０％大きい、少なくとも８５％大きい、少なくとも９０％大きい、少なくとも９５％大きい、又は少なくとも１００％大きい。

【0135】

[00158]細胞培養物の増殖条件はまた、細胞収量を改善し得る。例えば、高いガス透過性チューブ及び細胞培養チャンバー内の連続的な酸素の再循環によって促進される、細胞工学システムのより高い酸素レベルは、細胞増殖を増加させる可能性がある。細胞培養の状態を絶えずモニタリングし、それに応じて調節を行う細胞工学システムの能力はまた有利であり得る。例えば、細胞工学システムは、細胞培養物のＣＯ_２、Ｏ_２、Ｎ_２、及び／又はｐＨレベルをモニタリングし、ＣＯ_２、Ｏ_２、又はＮ_２のレベルを調節することができる。栄養素はまた、タイムリーで一貫した方法で提供され、細胞培養物に均一に分配される。したがって、本明細書に記載されるＣＡＲ Ｔ細胞を含む遺伝子修飾された免疫細胞を生成する自動化方法は、有利には、手動方法、又は柔軟性のある培養バッグを利用する方法と比較して、より高い細胞収量をもたらす。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される細胞工学システムを利用するＣＡＲ Ｔ細胞を含む遺伝子修飾された免疫細胞の自動化生成のための方法は、細胞培養用の柔軟性のあるガス透過性バッグを利用する方法よりも、少なくとも１０％多い、少なくとも１５％多い、少なくとも２０％多い、少なくとも２５％多い、少なくとも３０％多い、少なくとも３５％多い、少なくとも４０％多い、少なくとも４５％多い、少なくとも５０％多い、少なくとも５５％多い、少なくとも６０％多い、少なくとも６５％多い、少なくとも７０％多い、少なくとも７５％多い、少なくとも８０％多い、少なくとも８５％多い、少なくとも９０％多い、少なくとも９５％多い、又は少なくとも１００％多い細胞を生成する。実施形態では、本明細書に記載される方法によって生成される細胞の数は、少なくとも約２１億、少なくとも約２２億、少なくとも約２３億、少なくとも約２４億、少なくとも約２５億、少なくとも約２６億、少なくとも約２７億、少なくとも約２８億、少なくとも約２９億、又は少なくとも約３０億の細胞を含む、少なくとも約２０億（すなわち、２×１０^９）細胞である。

【0136】

追加の例示的な実施形態
[00159]実施形態１は、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法であり、本方法は、活性化試薬を用いて免疫細胞培養物を活性化して、活性化された免疫細胞培養物を生成し、ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、形質導入された免疫細胞培養物を拡大し、拡大された免疫細胞培養物を濃縮し、及び濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含み、拡大された免疫細胞培養物及び濃縮された免疫細胞培養物のいずれか又は両方を洗浄することをさらに含み、ステップは、完全に密閉された細胞工学システムによって行われ、ステップは、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成するプロセスを介して最適化される。

【0137】

[00160]実施形態２は、プロセスが自己調節プロセスであり、温度センサー、ｐＨセンサー、グルコースセンサー、酸素センサー、二酸化炭素センサー、及び光学密度センサーのうちの１つ又は複数を用いてモニタリングし；並びにモニタリングに基づいて、形質導入されたＴ細胞培養物の温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、及び光学密度のうちの１つ又は複数を調節することを含む、実施形態１の方法を含む。

【0138】

[00161]実施形態３は、少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１～２の方法を含む。

【0139】

[00162]実施形態４は、少なくとも約２０億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１～３の方法を含む。

【0140】

[00163]実施形態５は、免疫細胞培養物がＴ細胞培養物である、実施形態１～４の方法を含む。

【0141】

[00164]実施形態６は、Ｔ細胞培養物がキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物である、実施形態５の方法を含む。

【0142】

[00165]実施形態７は、ベクターがキメラ抗原受容体をコードする、実施形態６の方法を含む。

【0143】

[00166]実施形態８は、免疫細胞培養物が末梢血単核細胞及び／又は精製Ｔ細胞を含む、実施形態１～７の方法を含む。

【0144】

[00167]実施形態９は、免疫細胞培養物が少なくとも１つのアクセサリー細胞を含む、実施形態１～８の方法を含む。

【0145】

[00168]実施形態１０は、アクセサリー細胞が単球又は単球由来細胞を含む、実施形態９の方法を含む。

【0146】

[00169]実施形態１１は、アクセサリー細胞が、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含む、Ｔ細胞受容体に対する抗原を含む、実施形態９の方法を含む。

【0147】

[00170]実施形態１２は、活性化試薬が抗体又は樹状細胞を含む、実施形態１～１１の方法を含む。

【0148】

[00171]実施形態１３は、抗体が表面に固定化されている、実施形態１２の方法を含む。

【0149】

[00172]実施形態１４は、表面がビーズの表面である、実施形態１３の方法を含む。

【0150】

[00173]実施形態１５は、抗体が可溶性抗体である、実施形態１２の方法を含む。

【0151】

[00174]実施形態１６は、抗体が、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の少なくとも１つを含む、実施形態１２～１５の方法を含む。

【0152】

[00175]実施形態１７は、形質導入が、ウイルス感染、エレクトロポレーション、膜破壊、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態１～１６の方法を含む。

【0153】

[00176]実施形態１８は、ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスである、実施形態１～１７の方法を含む。

【0154】

[00177]実施形態１９は、形質導入が、細胞培養培地中でベクターを混合し、及び培地中のベクターを活性化された免疫細胞培養物に均一に送達することを含む、実施形態１～１８の方法を含む。

【0155】

[00178]実施形態２０は、拡大が、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄及びモニタリングのうちの少なくとも１つ又は複数を含む、実施形態１～１９の方法を含む。

【0156】

[00179]実施形態２１は、形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが免疫細胞培養物に対して最適化される、実施形態２～２０の方法を含む。

【0157】

[00180]実施形態２２は、細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネントを通じて細胞培養培地を再循環させる、実施形態１～２１の方法を含む。

【0158】

[00181]実施形態２３は、細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）の間に、栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる、実施形態１～２２の方法を含む。

【0159】

[00182]実施形態２４は、細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルがステップ（ｃ）の間に減少する、実施形態２～２３の方法を含む。

【0160】

[00183]実施形態２５は、細胞工学システムが、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択のうちの１つ又は複数の複数回のラウンドを行うように構成されている、実施形態１～２４の方法を含む。

【0161】

[00184]実施形態２６は、濃縮が、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む、実施形態１～２５の方法を含む。

【0162】

[00185]実施形態２７は、プロセスが、遠心分離又は濾過のパラメータを調節することをさらに含む、実施形態２６の方法を含む。

【0163】

[00186]実施形態２８は、細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われる、実施形態１～２７の方法を含む。

【0164】

[00187]実施形態２９は、ステップ（ａ）の後に、活性化された免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含む、実施形態１～２８の方法を含む。

【0165】

[00188]実施形態３０は、細胞工学システムが、方法を開始する前に、（ａ）の細胞培養物、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地を含む、実施形態１～２９の方法を含む。

【0166】

[00189]実施形態３１は、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の好ましい表現型を促進する方法であって、本方法は、活性化試薬を用いて免疫細胞培養物を活性化して、活性化された免疫細胞培養物を生成し、活性化試薬及び活性化条件は、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の表現型を促進し、ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、形質導入された免疫細胞培養物を拡大し；拡大された免疫細胞培養物を濃縮し；及び濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含む、ステップは、完全に密閉された自動化細胞工学システムによって行われる。

【0167】

[00190]実施形態３２は、活性化試薬が抗体又は樹状細胞を含む、実施形態３１の方法を含む。

【0168】

[00191]実施形態３３は、抗体が表面に固定化されている、実施形態３２の方法を含む。

【0169】

[00192]実施形態３４は、表面がビーズの表面である、実施形態３３の方法を含む。

【0170】

[00193]実施形態３５は、抗体が可溶性抗体である、実施形態３２の方法を含む。

【0171】

[00194]実施形態３６は、抗体が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及び抗ＣＤ２抗体の少なくとも１つを含む、実施形態３２～３５の方法を含む。

【0172】

[00195]実施形態３７は、可溶性抗体がＯＫＴ３である、実施形態３６の方法を含む。

【0173】

[00196]実施形態３８は、活性化条件が、活性化試薬と免疫細胞培養物との間の安定した接触を可能にする実質的に妨害されていない免疫細胞培養物を提供する、実施形態３１～３７の方法を含む。

【0174】

[00197]実施形態３９は、少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態３１～３８の方法を含む。

【0175】

[00198]実施形態４０は、少なくとも約２０億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態３９の方法を含む。

【0176】

[00199]実施形態４１は、免疫細胞培養物がＴ細胞培養物である、実施形態３１～４０の方法を含む。

【0177】

[00200]実施形態４２は、Ｔ細胞培養物がキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物である、実施形態４１の方法を含む。

【0178】

[00201]実施形態４３は、ベクターがキメラ抗原受容体をコードする、実施形態４２の方法を含む。

【0179】

[00202]実施形態４４は、免疫細胞培養物が末梢血単核細胞及び／又は精製Ｔ細胞を含む、実施形態３１～４３の方法を含む。

【0180】

[00203]実施形態４５は、細胞培養物が少なくとも１つのアクセサリー細胞を含む、実施形態３１～４４の方法を含む。

【0181】

[00204]実施形態４６は、アクセサリー細胞が単球又は単球由来細胞を含む、実施形態４５の方法を含む。

【0182】

[00205]実施形態４７は、アクセサリー細胞が、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含む、Ｔ細胞受容体に対する抗原を含む、実施形態４５の方法を含む。

【0183】

[00206]実施形態４８は、Ｔ細胞培養物の表現型が、約０．１：１～約１０：１のＣＤ８＋細胞：ＣＤ４＋比を有する、実施形態４１～４７の方法を含む。

【0184】

[00207]実施形態４９は、形質導入が、ウイルス感染、エレクトロポレーション、膜破壊、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態３１～４８の方法を含む。

【0185】

[00208]実施形態５０は、ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスである、実施形態３１～４９の方法を含む。

【0186】

[00209]実施形態５１は、形質導入が、細胞培養培地中でベクターを混合し、及び培地中のベクターを活性化された免疫細胞培養物に均一に送達することを含む、実施形態３１～５０の方法を含む。

【0187】

[00210]実施形態５２は、拡大が、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄及びモニタリングのうちの少なくとも１つ又は複数を含む、実施形態３１～５１の方法を含む。

【0188】

[00211]実施形態５３は、形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが、促進された表現型に対して最適化されている、実施形態３１～５２の方法を含む。

【0189】

[00212]実施形態５４は、細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネントを通じて細胞培養培地を再循環させる、実施形態３１～５３の方法を含む。

【0190】

[00213]実施形態５５は、細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）の間に、栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる、実施形態３１～５４の方法を含む。

【0191】

[00214]実施形態５６は、細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルがステップ（ｃ）の間に減少する、実施形態３１～５５の方法を含む。

【0192】

[00215]実施形態５７は、細胞工学システムが、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択の複数回のラウンドを行うように構成されている、実施形態３１～５６の方法を含む。

【0193】

[00216]実施形態５８は、濃縮が、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む、実施形態３１～５７の方法を含む。

【0194】

[00217]実施形態５９は、細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われる、実施形態３１～５８の方法を含む。

【0195】

[00218]実施形態６０は、ステップ（ａ）の後に、活性化された免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含む、実施形態３１～５９の方法を含む。

【0196】

[00219]実施形態６１は、（ｂ）における形質導入後にベクターを除去することをさらに含む、実施形態３１～６０の方法を含む。

【0197】

[00220]実施形態６２は、細胞工学システムが、方法を開始する前に、（ａ）の細胞培養物、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地を含む、実施形態３１～６１の方法を含む。

【0198】

[00221]実施形態６３は、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法であって、方法は、活性化試薬を用いて免疫細胞培養物を活性化して、活性化された免疫細胞培養物を生成し、ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、形質導入された免疫細胞培養物を拡大し、拡大された免疫細胞培養物を濃縮し、及び濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含み、ステップは、完全に密閉された自動化細胞工学システムによって行われ、及びステップの各々は、最適化された細胞密度（細胞／ｍＬ）及び最適化された細胞密集度（細胞／ｃｍ^２）を有する免疫細胞培養物を用いて行われる。

【0199】

[00222]実施形態６４は、（ａ）の最適化された細胞密度が約０．０５×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬである、実施形態６３の方法を含む。

【0200】

[00223]実施形態６５は、（ａ）の最適化された細胞密集度が約０．１×１０^６細胞／ｃｍ^２～約６０×１０^６細胞／ｃｍ^２である、実施形態６３又は６４の方法を含む。

【0201】

[00224]実施形態６６は、活性化試薬が抗体又は樹状細胞を含む、実施形態６３～６５の方法を含む。

【0202】

[00225]実施形態６７は、抗体が表面に固定化されている、実施形態６６の方法を含む。

【0203】

[00226]実施形態６８は、表面がビーズの表面である、実施形態６７の方法を含む。

【0204】

[00227]実施形態６９は、抗体が可溶性抗体である、実施形態６６の方法を含む。

【0205】

[00228]実施形態７０は、抗体が、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の少なくとも１つを含む、実施形態６６～６９の方法を含む。

【0206】

[00229]実施形態７１は、少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態６３～７０の方法を含む。

【0207】

[00230]実施形態７２は、少なくとも約２０億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態６３～７１の方法を含む。

【0208】

[00231]実施形態７３は、免疫細胞培養物がＴ細胞培養物である、実施形態６３～７２の方法を含む。

【0209】

[00232]実施形態７４は、Ｔ細胞培養物がキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物である、実施形態７３の方法を含む。

【0210】

[00233]実施形態７５は、ベクターがキメラ抗原受容体をコードする、実施形態７４の方法を含む。

【0211】

[00234]実施形態７６は、免疫細胞培養物が末梢血単核細胞及び／又は精製Ｔ細胞を含む、実施形態６４～７５の方法を含む。

【0212】

[00235]実施形態７７は、細胞培養物が少なくとも１つのアクセサリー細胞を含む、実施形態６４～７６の方法を含む。

【0213】

[00236]実施形態７８は、アクセサリー細胞が単球を含む、実施形態７７の方法を含む。

【0214】

[00237]実施形態７９は、アクセサリー細胞が、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含む、Ｔ細胞受容体に対する抗原を含む、実施形態７７の方法を含む。

【0215】

[00238]実施形態８０は、形質導入が、ウイルス感染、エレクトロポレーション、膜破壊、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態６３～７９の方法を含む。

【0216】

[00239]実施形態８１は、ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスである、実施形態６３～８０の方法を含む。

【0217】

[00240]実施形態８２は、形質導入が、細胞培養培地中でベクターを混合し、及び培地中のベクターを活性化された免疫細胞培養物に均一に送達することを含む、実施形態６３～８１の方法を含む。

【0218】

[00241]実施形態８３は、拡大が、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択のうちの少なくとも１つ又は複数を含む、実施形態６３～８２の方法を含む。

【0219】

[00242]実施形態８４は、形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが、細胞密度及び細胞密集度に対して最適化されている、実施形態６３～８３の方法を含む。

【0220】

[00243]実施形態８５は、細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネントを通じて細胞培養培地を再循環させる、実施形態６３～８４の方法を含む。

【0221】

[00244]実施形態８６は、酸素再循環が、ステップ（ａ）～（ｃ）の間にシリコーンチューブによって提供される、実施形態８５の方法を含む。

【0222】

[00245]実施形態８７は、細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）の間に栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる、実施形態６３～８６の方法を含む。

【0223】

[00246]実施形態８８は、細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルがステップ（ｃ）の間に減少する、実施形態６３～８７の方法を含む。

【0224】

[00247]実施形態８９は、栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスの再循環が、約０．０５×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬの密度、及び約０．１×１０^６細胞／ｃｍ^２～約６０×１０^６細胞／ｃｍ^２の密集度を有する細胞を用いて均一に提供される、実施形態６３～８８の方法を含む。

【0225】

[00248]実施形態９０は、細胞工学システムが、形質導入された免疫細胞培養物の複数回のラウンドの供給、洗浄、モニタリング、及び選択を行うように構成されている、実施形態６３～８９の方法を含む。

【0226】

[00249]実施形態９１は、濃縮が、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む、実施形態６３～９０の方法を含む。

【0227】

[00250]実施形態９２は、細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われる、実施形態６３～９１の方法を含む。

【0228】

[00251]実施形態９３は、ステップ（ａ）の後に、活性化された免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含む、実施形態６３～９２の方法を含む。

【0229】

[00252]実施形態９４は、（ｂ）における形質導入後にベクターを除去することをさらに含む、実施形態６３～９３の方法を含む。

【0230】

[00253]実施形態９５は、細胞工学システムが、方法を開始する前に、（ａ）の細胞培養物、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地を含む、実施形態６３～９４の方法を含む。

【0231】

[00254]実施形態９６は、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法であって、本方法は、活性化試薬を用いて免疫細胞培養物を活性化して、活性化された免疫細胞培養物を生成し、ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、形質導入された免疫細胞培養物を拡大し、形質導入された細胞培養物は拡大中に振とうされず、拡大された免疫細胞培養物を濃縮し、及び濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成することを含み、ステップは、完全に密閉された自動化細胞工学システムによって行われる。

【0232】

[00255]実施形態９７は、活性化試薬が抗体又は樹状細胞を含む、実施形態９６の方法を含む。

【0233】

[00256]実施形態９８は、抗体が表面に固定化されている、実施形態９７の方法を含む。

【0234】

[00257]実施形態９９は、表面がビーズの表面である、実施形態９８の方法を含む。

【0235】

[00258]実施形態１００は、抗体が可溶性抗体である、実施形態９７の方法を含む。

【0236】

[00259]実施形態１０１は、抗体が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及び抗ＣＤ２抗体の少なくとも１つを含む、実施形態９６～１００の方法を含む。

【0237】

[00260]実施形態１０２は、少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態９６～１０１の方法を含む。

【0238】

[00261]実施形態１０３は、少なくとも約２０億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１０２の方法を含む。

【0239】

[00262]実施形態１０４は、免疫細胞培養物がＴ細胞培養物である、実施形態９６～１０３の方法を含む。

【0240】

[00263]実施形態１０５は、Ｔ細胞培養物がキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物である、実施形態１０４の方法を含む。

【0241】

[00264]実施形態１０６は、ベクターがキメラ抗原受容体をコードする、実施形態１０５の方法を含む。

【0242】

[00265]実施形態１０７は、免疫細胞培養物が末梢血単核細胞及び／又は精製Ｔ細胞を含む、実施形態９６～１０６の方法を含む。

【0243】

[00266]実施形態１０８は、細胞培養物が少なくとも１つのアクセサリー細胞を含む、実施形態９６～１０７の方法を含む。

【0244】

[00267]実施形態１０９は、アクセサリー細胞が単球又は単球由来細胞を含む、実施形態１０８の方法を含む。

【0245】

[00268]実施形態１１０は、アクセサリー細胞が、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含む、Ｔ細胞受容体に対する抗原を含む、実施形態１０９の方法を含む。

【0246】

[00269]実施形態１１１は、形質導入が、ウイルス感染、エレクトロポレーション、膜破壊、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態９６～１１０の方法を含む。

【0247】

[00270]実施形態１１２は、ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスである、実施形態９６～１１１の方法を含む。

【0248】

[00271]実施形態１１３は、形質導入が、細胞培養培地中でベクターを混合し、及び培地中のベクターを活性化された免疫細胞培養物に均一に送達することを含む、実施形態９６～１１２の方法を含む。

【0249】

[00272]実施形態１１４は、拡大が、免疫細胞培養物を振とうすることなしに、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択のうちの少なくとも１つ又は複数を含む、実施形態９６～１１３の方法を含む。

【0250】

[00273]実施形態１１５は、形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが免疫細胞培養物に対して最適化されている、実施形態９６～１１４の方法を含む。

【0251】

[00274]実施形態１１６は、細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネントを通じて細胞培養培地を再循環させる、実施形態９６～１１５の方法を含む。

【0252】

[00275]実施形態１１７は、細胞工学システムが、栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる、実施形態９６～１１６の方法を含む。

【0253】

[00276]実施形態１１８は、細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルがステップ（ｃ）の間に減少する、実施形態９６～１１７の方法を含む。

【0254】

[00277]実施形態１１９は、細胞工学システムが、形質導入された免疫細胞培養物の複数回のラウンドの供給、洗浄、モニタリング、及び選択を行うように構成されている、実施形態９６～１１８の方法を含む。

【0255】

[00278]実施形態１２０は、濃縮が、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む、実施形態９６～１１９の方法を含む。

【0256】

[00279]実施形態１２１は、細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われる、実施形態９６～１２０の方法を含む。

【0257】

[00280]実施形態１２２は、ステップ（ａ）の後に、活性化された免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含む、実施形態９６～１２１の方法を含む。

【0258】

[00281]実施形態１２３は、（ｂ）における形質導入後にベクターを除去することをさらに含む、実施形態９６～１２２の方法を含む。

【0259】

[00282]実施形態１２４は、細胞工学システムが、方法を開始する前に、（ａ）の細胞培養物、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地を含む、実施形態９６～１２３の方法を含む。

【0260】

[00283]実施形態１２５は、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法であって、細胞工学システムによって行われる本方法は、活性化試薬を用いて免疫細胞培養物を活性化して、細胞工学システムの第１のチャンバーで活性化された免疫細胞培養物を生成し；活性化された免疫細胞培養物を形質導入し、形質導入が、活性化された免疫細胞培養物を第１のチャンバーからエレクトロポレーションユニットに移し、活性化された免疫細胞培養物をベクターでエレクトロポレーションして、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、形質導入された免疫細胞培養物を細胞工学システムの第２のチャンバーに移すことを含み、形質導入された免疫細胞培養物を拡大し、拡大した免疫細胞培養物を濃縮し、及び濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された細胞培養物を生成することを含む。

【0261】

[00284]実施形態１２６は、形質導入が、第１の無菌の閉じた接続部を介して、活性化された免疫細胞培養物を第１のチャンバーからエレクトロポレーションユニットに移し、活性化された免疫細胞培養物をベクターでエレクトロポレーションを行い、形質導入された免疫細胞培養物を生成し、第２の無菌の閉じた接続部を介して、形質導入された免疫細胞培養物を細胞工学システムの第２のチャンバーに移すことを含む、実施形態１２５の方法を含む。

【0262】

[00285]実施形態１２７は、エレクトロポレーションユニットが細胞工学システムの外部に位置されている、実施形態１２６の方法を含む。

【0263】

[00286]実施形態１２８は、少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１２５～１２７の方法を含む。

【0264】

[00287]実施形態１２９は、少なくとも約２０億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１２８の方法を含む。

【0265】

[00288]実施形態１３０は、免疫細胞培養物がＴ細胞培養物である、実施形態１２５～１２９の方法を含む。

【0266】

[00289]実施形態１３１は、Ｔ細胞培養物がキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物である、実施形態１３０の方法を含む。

【0267】

[00290]実施形態１３２は、ベクターがキメラ抗原受容体をコードする、実施形態１３１の方法を含む。

【0268】

[00291]実施形態１３３は、免疫細胞培養物が末梢血単核細胞及び／又は精製Ｔ細胞を含む、実施形態１２５～１３２の方法を含む。

【0269】

[00292]実施形態１３４は、細胞培養物が少なくとも１つのアクセサリー細胞を含む、実施形態１２５～１３２の方法を含む。

【0270】

[00293]実施形態１３５は、アクセサリー細胞が単球又は単球由来細胞を含む、実施形態１３４の方法を含む。

【0271】

[00294]実施形態１３６は、アクセサリー細胞が、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含む、Ｔ細胞受容体に対する抗原を含む、実施形態１３４の方法を含む。

【0272】

[00295]実施形態１３７は、活性化試薬が抗体又は樹状細胞を含む、実施形態１２５～１３６の方法を含む。

【0273】

[00296]実施形態１３８は、抗体が表面に固定化されている、実施形態１３７の方法を含む。

【0274】

[00297]実施形態１３９は、表面がビーズの表面である、実施形態１３８の方法を含む。

【0275】

[00298]実施形態１４０は、抗体が可溶性抗体である、実施形態１３７の方法を含む。

【0276】

[00299]実施形態１４１は、抗体が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及び抗ＣＤ２抗体の少なくとも１つを含む、実施形態１３８～１４０の方法を含む。

【0277】

[00300]実施形態１４２は、ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスである、実施形態１２５～１４１の方法を含む。

【0278】

[00301]実施形態１４３は、拡大が、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択のうちの少なくとも１つ又は複数を含む、実施形態１２５～１４２の方法を含む。

【0279】

[00302]実施形態１４４は、形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが免疫細胞培養物に対して最適化されている、実施形態１２５～１４３の方法を含む。

【0280】

[00303]実施形態１４５は、細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネントを通じて細胞培養培地を再循環させる、実施形態１２５～１４４の方法を含む。

【0281】

[00303]実施形態１４６は、細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）の間に、栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる、実施形態１２５～１４５の方法を含む。

【0282】

[00305]実施形態１４７は、細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルがステップ（ｃ）の間に減少する、実施形態１２５～１４６の方法を含む。

【0283】

[00306]実施形態１４８は、細胞工学システムが、形質導入された免疫細胞培養物の複数回のラウンドの供給、洗浄、モニタリング、及び選択を行うように構成されている、実施形態１２５～１４７の方法を含む。

【0284】

[00307]実施形態１４９は、濃縮が、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む、実施形態１２５～１４８の方法を含む。

【0285】

[00308]実施形態１５０は、細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われる、実施形態１２５～１４９の方法を含む。

【0286】

[00309]実施形態１５１は、ステップ（ａ）の後に、活性化された免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含む、実施形態１２５～１５０の方法を含む。

【0287】

[00310]実施形態１５２は、（ｂ）における形質導入後にベクターを除去することをさらに含む、実施形態１２５～１５１の方法を含む。

【0288】

[00311]実施形態１５３は、細胞工学システムが、方法を開始する前に、（ａ）の細胞培養物、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地を含む、実施形態１２５～１５２の方法を含む。

【0289】

[00312]実施形態１５４は、方法のステップ（ｃ）における形質導入効率が、細胞培養に柔軟性であり、ガス透過性のバッグを利用する方法の形質導入効率よりも少なくとも２０％高い、実施形態１～１５３の方法を含む。

【0290】

[00313]実施形態１５５は、柔軟性であり、ガス透過性のバッグを用いた手動の細胞培養を利用する方法よりも少なくとも２０％多く、遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１～１５４の方法を含む。

【0291】

[00314]実施形態１５６は、細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われ、（ａ）の各々、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地は、前記方法を開始する前に複数のチャンバーの異なるチャンバーに含まれ、複数のチャンバーの少なくとも１つが細胞を増殖させる温度で維持され、複数のチャンバーの少なくとも１つが冷蔵温度に維持されている、実施形態１～１５５の方法を含む。

【0292】

[00315]実施形態１５７は、細胞培養培地を保存するための低温チャンバー、免疫細胞培養物の活性化、形質導入及び拡大を行うための高温チャンバーを含む、自動化細胞工学システムにおいて使用するカセットであって、高温チャンバーは熱障壁によって低温チャンバーから分離されて、高温チャンバーは細胞培養チャンバーを含み；及び細胞培養チャンバーに接続された１つ又は複数の流動経路、前記流動経路は、細胞培養チャンバー内の細胞を乱すことなしに、再循環、老廃物の除去、均一なガス交換及び細胞培養チャンバーへの栄養の分配を提供する。

【0293】

[00316]実施形態１５８は、細胞培養チャンバーが、低いチャンバー高を有する平坦であり、柔軟性がないチャンバーである、実施形態１５７のカセットを含む。

【0294】

[00317]実施形態１５９は、免疫細胞培養物が細胞培養チャンバーの底部全体に広がることを可能にするように、細胞培養チャンバーが配向されている、実施形態１５７又は実施形態１５８のカセットを含む。

【0295】

[00318]実施形態１６０は、細胞培養物、培養培地、活性化試薬、及びベクターで予め充填されている、実施形態１５７～１５９のカセットを含む。

【0296】

[00319]実施形態１６１は、ｐＨセンサー、グルコースセンサー、酸素センサー、二酸化炭素センサー、及び／又は光学密度センサーのうちの１つ又は複数をさらに含む、実施形態１５７～１６０のカセットを含む。

【0297】

[00320]実施形態１６２は、１つ又は複数のサンプリングポート及び／又は注入ポートをさらに含む、実施形態１５７～１６１のカセットを含む。

【0298】

[00321]実施形態１６３は、細胞培養チャンバーが、細胞培養チャンバーからの気泡の除去を可能にするように構成された、及び／又は再循環ポートとしての遠位ポート、再循環入口ポートとして機能するように構成された中間ポート、並びに細胞除去のための排出ポートとして機能するように構成された近位ポートの少なくとも１つをさらに含む、実施形態１５７～１６２のカセットを含む。

【0299】

[00322]実施形態１６４は、カートリッジを外部デバイスに接続するためのアクセスポートをさらに含む、実施形態１５７～１６３のカセットを含む。

【0300】

[00323]実施形態１６５は、外部デバイスがエレクトロポレーションユニット又は追加の培地源を含む、実施形態１６４のカセットを含む。

【0301】

[00324]実施形態１６６は、免疫細胞培養物を収容するように構成されたチャンバー体積を有する免疫細胞培養物の活性化、形質導入及び／又は拡大を行うための細胞培養チャンバー、免疫細胞培養物を収容せずに、培地及び他の作業流体に追加の体積を提供することにより、チャンバーの作業体積を増加させるためのサテライト体積を含む、自動化細胞工学システムにおいて使用するカセットであって、サテライト体積は、免疫細胞培養物を乱すことなく、培地が培養チャンバーと交換されるように、１つ又は複数の流体経路を介して細胞培養チャンバーに流体接続されている。

【0302】

[00325]実施形態１６７は、サテライト体積がバッグである、実施形態１６６のカセットを含む。

【0303】

[00326]実施形態１６８は、サテライト体積が非変形性チャンバーである、実施形態１６６のカセットを含む。

【0304】

[00327]実施形態１６９は、サテライト体積が、免疫細胞培養物の細胞を失うことなく、培地除去を可能にするようにさらに構成されている、実施形態１６６～１６８のカセットを含む。

【0305】

[00328]実施形態１７０は、クロスフローリザーバーをさらに含む、実施形態１６６～１６９のカセットを含む。

【0306】

[00329]実施形態１７１は、細胞培養チャンバーが約０．５０ｍｌ～約３００ｍｌの間の体積を有する、実施形態１６６～１７０のカセットを含む。

【0307】

[00330]実施形態１７２は、細胞培養チャンバーが約５０ｍｌ～約２００ｍｌの間の体積を有する、実施形態１７１のカセットを含む。

【0308】

[00331]実施形態１７３は、細胞培養チャンバーが約１８０ｍｌの体積を有する、実施形態１７２のカセットを含む。

【0309】

[00332]実施形態１７４は、サテライト体積が約０．５０ｍｌ～約３００ｍｌの間である、実施形態１６６～１７３のカセットを含む。

【0310】

[00333]実施形態１７５は、サテライト体積が約１５０ｍｌ～約２００ｍｌの間である、実施形態１７４のカセットを含む。

【0311】

[00334]実施形態１７６は、クロスフローリザーバーが約０．５０ｍｌ～約３００ｍｌの間の体積を有する、実施形態１６６～１７５のカセットを含む。

【0312】

[00335]実施形態１７７は、クロスフローリザーバーが約１００ｍｌ～約１５０ｍｌの間の体積を有する、実施形態１７６のカセットを含む。

【0313】

[00336]実施形態１７８は、作業体積が約１８０ｍＬ～約１Ｌである、実施形態１６６～１７７のカセットを含む。

【0314】

[00337]実施形態１７９は、作業体積が約１８０ｍＬ～約４６０ｍＬである、実施形態１７８のカセットを含む。

【0315】

[00338]実施形態１８０は、１つ又は複数の流体経路が、チューブ構成要素を通じて酸素供給を可能にするシリコーンベースのチューブ構成要素を含む、実施形態１５７～１７９のカセットを含む。

【実施例】

【0316】

実施例１－コクーンシステムを使用したＣＡＲ Ｔ細胞の自動化生成
[00339]この実施例では、ＧＦＰ及びＨＥＲ－２レンチウイルスを使用して、以下のプロセスパラメータを用いてＴ細胞を形質導入した：６０００万の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の接種の開始、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化、ＩＬ－２及びＩＬ－７を培養拡大のためにＴ細胞増殖培地に補充した。使い捨てカセットの１回使用のセンサーを用いて、温度、ｐＨ、及び光学密度（ＯＤ）をリアルタイムでモニタリングした。流体チャネルを介して接続された複数のカセットチャンバーにより、プロセスコンポーネントの自動供給と追加が可能にした。一部のチャンバーは、培地及び試薬保存のために４℃に温度制御されるが、一方、他のチャンバーには、細胞の加温、混合、洗浄、及び濃縮のための要素が含まれ、完全に密閉されたプロセスが可能である。処理中の試料は、細胞数及び生存率のために作製された。回収プロセスの終わりに、以下のパネル：ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＧＦＲ、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－αなどを用いてＦＡＣＳ分析を行った。この実施例において使用されたコクーンシステムの概要を図６に示す。図６Ａは、パラメータを調節するか又は細胞培養をモニタリングするために使用することができる外部ユーザーの制御ディスプレイとともに、閉じた構成のコクーンシステムを示す。無菌の１回使用の細胞培養「カセット」をコクーンに充填することができる（図６Ｃ）。カセットの詳細図（図６Ｂ）に示されるように、各カセットには、細胞増殖のために３７℃に維持される上部チャンバー、並びに培地、ウイルスベクター、及び他の温度応答性試薬を保存するために４℃に維持される下部チャンバーが含まれる。カセットは、流体が、内部の流体経路を介して交換され、またポンプでカセット内に送り込まれるか又はカセットから吸い出され得るように構成されている。カセットに取り付けられたセンサーは、細胞培養物のｐＨ及び光学密度などをモニタリングすることができる。

【0317】

[00340]結果を図７～１０に示す。図７Ａ、７Ｂ、及び７Ｃは、それぞれ、対照としてＧ－ＲＥＸ（ＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆ）細胞培養プレートを使用した細胞の手動操作及び拡大と比較した、自動化コクーンシステムを用いたＧＦＰ形質導入の平均回収量、平均回収生存率、及び平均形質導入効率を示す。Ｇ－ＲＥＸプレートにはガス透過性の底があり、典型的には、ユーザーはＧ－ＲＥＸを使用する場合に４～５日ごとに培地交換を行う。

【0318】

[00341]図８Ａ及び８Ｂは、それぞれ、生存細胞、並びにＨＥＲ－２ ＣＡＲ－Ｔ形質導入の生存率及び形質導入効率を示す。１０日間の培養では、ＨＥＲ－２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は約２２億個に達し、コクーンシステムにおいて９７％の生存率及び６５％の形質導入（ｎ＝４）であった。

【0319】

[00342]また、自動化コクーンシステムの性能は、対照としてパーマライフ細胞培養バッグ（ＯｒｉＧｅｎ）を使用して、細胞の手動操作及び増殖と比較された。パーマライフバッグは、不活性なフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）で作られた密封可能であり、ガス透過性の細胞培養バッグであって、ユーザーによる細胞の供給及び回収を容易にするバルブを備える。図９Ａは、ＣＤ３＋細胞の割合で評価した、パーマライフバッグと比較したコクーンシステムを使用した相対的なＴ細胞純度レベルを示す。図９Ｂは、パーマライフ Ｂａｇ対照と比較して、コクーンシステムで培養されたＣＤ８＋細胞の割合が高いことを示す。図９Ｃ及び９Ｄは、トランスフェクト細胞がそれぞれＴＮＦ－α及びＩＮＦ－γを産生することを示す。

【0320】

[00343]図１０Ａ及び１０Ｂは、それぞれコクーンシステム及びパーマライフバッグで培養されたＣＡＲ Ｔ細胞による標的腫瘍細胞の効果的であり、特異的な殺傷を示す。

【0321】

[00344]結論として、コクーンシステムは、完全に密閉された細胞工学システムであり、労働集約的なＣＡＲ Ｔプロセスを完全に自動化され、高度に制御されたシステムに変換する実施可能な解決策であり、したがって、スケーラビリティ、高収量、製造コストの削減、プロセス制御を改善して高品質のＣＡＲ－Ｔセルを生成することを可能にする。

【0322】

実施例２－コクーンシステムにおける活性化方法の比較
[00345]この実施例は、コクーン自動化製造システム及びパーマライフバッグにおけるＣＡＲ Ｔ細胞の臨床規模生成における異なる活性化方法を使用して細胞培養性能を比較する。

【0323】

[00346]磁性抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ダイナビーズ活性化因子ビーズを使用して、Ｔ細胞を活性化することができる。これらのビーズは、効果的なＴ細胞の活性化をサポートするために必要な２つの刺激シグナルを提供する。ナイーブＴ細胞を活性化する別の方法では、可溶性抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を利用することができる。ＯＫＴ３は、元々、免疫抑制剤として使用されていたモノクローナルＩｇＧ２ａ抗体である。共刺激シグナルは、アクセサリー細胞によって提供され得る。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の混合集団からＴ細胞培養を開始すると、ＯＫＴ３を使用した場合、Ｔ細胞の活性化をサポートするために必要なアクセサリー細胞を提供することができる。

【0324】

[00347]ＯＫＴ３及びダイナビーズは、別個の活性化メカニズムを利用するため、一方の方法の他方に対する選択は、最終製造物の特性に影響を与える可能性がある；具体的には、Ｔ細胞サブセット、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の比率。細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞は、抗腫瘍応答に関与する。ＣＤ４細胞はサイトカインを産生し、免疫応答の調節を助ける。殺傷はＣＤ８細胞と比較して遅延するが、ＣＤ４細胞もまた細胞溶解をサポートすることが実証されている。ＣＤ４細胞はＡＰＣにシグナルを送り、したがって、ＡＰＣを活性化し、続いてナイーブＣＤ８ Ｔ細胞をプライムする。臨床データが限られているため、ＣＤ８細胞とＣＤ４細胞の理想的な標的比率は十分に理解されていない。研究は、ＣＤ８細胞とＣＤ４細胞の組み合わせが、ＣＤ８細胞単独の送達よりも好ましいことを示している（例えば、Ｃｈｕｒｃｈ、２０１４年；Ｆｅｌｄｍａｎｎ、２０１２年；Ｒｅｕｓｃｈ、２０１５年を参照されたい）。

【0325】

[00348]インビトロ活性化の両方の方法には利点及び欠点がある。抗体結合したビーズは一貫性を提供し、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とＣＤ２８共刺激経路の安定した同時活性化を確実にする。ビーズアプローチの主な欠点は、この製造物に関連する高コストである。ビーズはまた、移植前に培養から効果的に除去する必要があり得る。ＯＫＴ３は、Ｔ細胞を活性化するための低コストオプションを提供する。可溶性抗ＣＤ３アプローチに関連する主な欠点は、アクセサリー細胞への依存性、及び培養環境への感受性である。患者の試料には、前の刺激後にＴ細胞を機能的に不活性化する可能性のある、非常に多様なアクセサリー細胞及び負の相互作用を有する場合がある。細胞の増殖、表現型及び機能における各々の活性化方法の影響を理解するために、ダイナビーズ及びＯＫＴ３によって活性化されたＴ細胞を臨床規模の自動化プラットフォームで培養した。

【0326】

[00349]コクーンは、ガス及び温度の環境制御を提供する。これには、リンクされた冷蔵ゾーンだけでなく、３７℃ゾーンも含まれる。コクーンとカセットの間に流体が接触しないため、実行間に必要なクリーニングが最小限に抑えられる。播種の日にすべての試薬をカセットに充填し、必要になるまでコクーンの冷蔵ゾーンおいて保管することができる。細胞に送達する前に、流体を３７℃に温める。レンチウイルスの安定性により、これは形質導入の日に解凍され、滅菌コネクターを介してカセットに送達される。ガス交換（酸素供給とＣＯ_２緩衝化）は、ガス透過性チューブを介した培養液の再循環を介して達成される。埋め込まれたバイオセンサーは、溶存酸素及びｐＨに関するリアルタイムのデータを提供した。Ｔ細胞は、他の細胞又は活性化試薬との安定した接触を必要とするため、ガス交換のための培地交換、洗浄及び再循環は、細胞を乱すことなく灌流を介して行うことができる。ロッキングは、効率的な回収を促進するために使用することができる。

【0327】

方法
[00350]細胞培養。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｌｏｎｚａ）をＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）で解凍し、３７℃で＜２×１０^６細胞／ｍＬの密度で一晩回復させた。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １７（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を含む、Ｂｌｏｏｄ Ａｓｓａｙプロトコールを備えたＮＵＣＬＥＯＣＯＵＮＴＥＲ ２００を使用して、細胞のカウントを行った。形質導入のマーカーとして低親和性の神経増殖因子受容体（ＮＧＦＲ）でコードされた第三世代のレンチウイルスベクターを使用して、細胞を形質導入した。このレンチウイルスは、ＭｃＭａｓｔｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｃａｎａｄａ）のＢｒａｍｓｏｎ Ｌａｂ由来のプロトコール及びプライマーに基づいて、ＬｏｎｚａのｃＧＭＰウイルス製造施設（Ｈｏｕｓｔｏｎ、Ｔｅｘａｓ）で製造された。１の感染多重度（ＭＯＩ）がすべての条件で使用された。ウイルス力価は、ＨＥＫ２９３ＴＭ細胞を使用し、フローサイトメトリーを用いてＮＧＦＲを検出することにより決定された。活性化培地は、２２ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補足したＸ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ）からなった。可溶性抗ＣＤ３で活性化した条件では、ＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を最終濃度５０ｎｇ／ｍＬの活性化培地に添加された。ダイナビーズで活性化した条件では、１：１の比のビーズと細胞を活性化培地に添加した。拡大培地は、２９ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）、男性ＡＢ血漿由来の５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ）、１％ＧＬＵＴＡＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補足したＸ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ）からなった。

【0328】

[00351]自動化されたＣＡＲ Ｔ細胞生成。０日目に、６０×１０^６のＰＢＭＣをカセットの投入バッグに入れた。また、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを使用して活性化された条件では、６０×１０^６の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ ダイナビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を細胞と１：１のビーズ：細胞比で投入バッグに加えた。投入バッグをカセットに接続し、コクーン（Ｏｃｔａｎｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）に持ち込んだ。オペレーターのサインインに続いて、カセットをコクーンに充填した。１日目に、ウイルス（Ｌｏｎｚａ Ｈｏｕｓｔｏｎ）を解凍し、次に、１のＭＯＩでカセットアクセスポートを介して細胞培養チャンバーに移した。ウイルスを細胞に送達させる前に、活性化培地を使用して培地を希釈した。活性化培地を培養チャンバーから取り出し、細胞を乱すことなくウイルスとともに戻した。４日目には、拡大培地が追加され、総作業体積が増加した。６日目と８日目に部分的な培地交換を拡大培地で行った。拡大ステップの後、コクーンは、細胞を除去する前に最終体積を１００ｍＬ未満に減らした。培養を通じて、データは、コクーンにより継続的に回収された。これには、ドアを開閉するたびなどに、すべてのポンプ及びアクチュエータのステップが含まれる。熱値、ガス濃度、流体ｐＨ、及び溶存酸素などの包括的なセンサーデータが回収された。オペレーターは、電話又は外部コンピューターを使用して、培養の状態をリモートでモニタリングすることができた。

【0329】

[00352]手動ＣＡＲ Ｔ細胞生成。パーマライフ細胞培養バッグでコクーンと並行してＣＡＲ Ｔ細胞の手動生成を行った。０日目に、６０×１０^６のＰＢＭＣを活性化培地に０．２７×１０^６細胞／ｍＬで０日目に播種した。これらの培養は、自動化培養と同じドナー細胞と活性化及び拡大用の同じ培地を利用した。培養は、パーマライフバッグ（ＰＬ２４０、Ｏｒｉｇｅｎ）で開始し、６日目に細胞が拡大するにつれて、より大きなパーマライフバッグ（ＰＬ３２５、Ｏｒｉｇｅｎ）に移した。体積が増加するにつれて、８日目に細胞をＰＬ２４０及びＰＬ３２５バッグに拡大した。１日目に、１のＭＯＩでレンチウイルスをバッグに加えた。コクーン培養と同等の体積で細胞に供給した。しかしながら、コクーン条件とは異なり、廃棄に送られた培地はなかった。使用した体積は、培養物を２×１０^６細胞／ｍＬ未満に維持した。１０日目に、培養体積を質量で取得し、全細胞の試料をカウント及び分析のためにバッグから取り出した。機能アッセイにおいて使用する前に、細胞を遠心分離して、残留物及び体積を減らした。

【0330】

[00353]非形質導入及び非活性化条件。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析に使用される非形質導入及び非活性化の陰性対照は、以前に記載されたプロトコールに従って小規模で培養された。簡単に説明すると、５％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ）及び２２ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を補足したＸ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ）を含む９６ウェルプレートに１×１０^５個の細胞を播種した。活性化されたが、形質導入されていない対照は、同様のプロトコールを使用してセットアップされた。細胞を播種した後、等量の培地を加えた。可溶性抗ＣＤ３で活性化した条件には、最終濃度５０ｎｇ／ｍＬの１００ｎｇ／ｍＬ ＯＫＴ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を補足した。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで活性化された条件には、ダイナビーズが１：１の比率で添加された。活性化された培養物を４日目に９６ウェルプレートから２４ウェルに拡大し、それらの増殖に基づいてＴ２５及びＴ７５フラスコに移し、４日目から２日ごとに供給した。

【0331】

[00354]フローサイトメトリー。開始集団の表現型を調べるために、細胞を次の一次抗体で染色した：パシフィックブルーＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥ ＣＤ１４（クローン６１Ｄ３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＡＰＣｅＦｌｕｏｒ７８０ ＣＤ４（クローンＯＫＴ４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５ ＣＤ８ａ（クローンＲＰＡ－Ｔ８、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＢＶ６０５ ＣＤ２７９（ＰＤ－１、クローンＥＨ１２．２Ｈ７ ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ定着性バイオレット死細胞染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。ＨＥＲ２形質導入の効率を評価するため、単球（ＣＤ１４）の染色の代わり以外に細胞を上記のように染色し、細胞をＢＶ４２１ ＣＤ２７１（Ｃ４０－１４５７ ＮＧＦＲ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ定着性グリーン死細胞染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した。次に、細胞を固定して洗浄した。ＳＡ３８００ Ｓｏｎｙ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒで条件ごとに２０，０００を超えるイベントが取得された。ＦｌｏｗＪｏ １０．４．２を使用してＦＡＣＳ分析を行った。非形質導入条件及び非活性化条件を使用して、蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照とともにゲートを設定した。

【0332】

[00355]腫瘍細胞株。ＨＥＲ２陰性腫瘍細胞であるＬＯＸ－ＩＭＶＩ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、転移性メラノーマ黒色腫に由来し、前述のように１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ）で拡大された。ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞であるＳＫＯＶ－３（ＡＴＣＣ）細胞は、卵巣漿液性嚢胞腺癌に由来し、前述のように１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ（改変）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で拡大された。０．２５％トリプシンを５～１０分間使用して、コンフルエンス前に細胞を継代した。低い継代数を凍結保存し、ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ又はＩＣＳアッセイで使用する前に腫瘍株を２～３回継代した。

【0333】

[00356]サイトカイン分泌アッセイ。前述のように（例えば、Ａｔｋｕｒｉ、２００５年；Ａｖｇｏｕｓｔｉｎｉａｔｏｓ、２００８年）、５０，０００個のＬＯＸ ＩＭＶＩ又はＳＫＯＶ－３腫瘍細胞を各培養条件で３重にして丸底９６ウェルプレートに播種した。翌日、Ｔ細胞は、３７℃で４時間、タンパク質輸送阻害剤ブレフェルジンＡ（Golgi Plug, BD Biosciences）とともに腫瘍株のウェルあたり８：１で播種された。細胞を４℃で一晩保存した。次に、細胞を染色及び分析のためにプールした。上記のように、細胞は、表面表現型ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＮＧＦＲ、及びＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ定着性グリーン死細胞染色で染色された。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）は、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ固定化／透過化溶液キット（５５４７１４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による固定及び透過処理後に完了した。試験した活性化サイトカインには、ＡＰＣ ＩＦＮγ（クローンＢ２７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＰＥＴＮＦα（クローンＭＡｂ１１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が含まれる。Ｓｏｎｙ ＳＡ３８００では、ＩＣＳ分析のために２３０，０００を超える事象（最大５００，０００）が回収された。ＳＫＯＶ－３とＬＯＸ－ＩＭＶＩ腫瘍株のサイトカイン産生の違いは、ＴＮＦα又はＩＦＮγを分泌する集団の割合として報告された。ＦＭＯ制御とともにゲートを設定するために、非形質導入及び非活性化条件が使用された。

【0334】

[00357]細胞毒性アッセイ。細胞毒性は、前述のように試験された（例えば、Ａｔｋｕｒｉ、２００５年；Ａｖｇｏｕｓｔｉｎｉａｔｏｓ、２００８年）。接着性腫瘍細胞株を９６ウェルの平底組織培養処理プレートに２×１０^４細胞／ウェル（ＳＫＯＶ－３又はＬＯＸ－ＩＭＶＩ）で一晩プレートした。コクーン及び対照条件からのＣＡＲ Ｔ細胞は、様々なエフェクター（Ｅ）Ｔ細胞対腫瘍（Ｔ）のＥ：Ｔ比（０．２５：１～８：１）で腫瘍細胞のウェルに添加され、３７℃で一晩、同時インキュベートされた。ウェルは、温められたＰＢＳ又はＲＰＭＩ培地で３回洗浄され、いずれもの非接着細胞を除去した。ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ細胞生存率試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の１０％溶液を１００μＬ添加し、ウェルを３７℃で３時間インキュベートした。ミトコンドリアの還元時に蛍光を発する生細胞の代謝指標であるＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥは、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｅｎｎｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で蛍光（励起５３０ｎｍ、発光５９５ｎｍ）によって測定された。腫瘍細胞の生存率は、未処理の標的細胞と比較した実験ウェルでの蛍光の損失として計算された。各条件は３重にして試験された。

【0335】

結果
[00358]自動化プラットフォームであるコクーンを利用して、２つの異なる活性化方法を用いてＣＡＲ Ｔ細胞の臨床規模の生成を達成する実施可能性を実証した。プラットフォームは、１回使用の使い捨てのコクーンカセット（図１１Ａ、１１Ｅ）とコクーン制御システム（図１１Ｂ）からなる。図１１Ｆは、シリンジ１１７０又はバッグ１１７２をカセット６０２サンプリングに使用する方法を示す。カセットは、プロセスに必要なすべての試薬をカセットの冷蔵ゾーンに事前に充填して保存し、培養ゾーンで細胞処理を行うことができるように、複数の試薬バッグで設計される。カセットは、細胞の活性化、形質導入、拡大、リアルタイムの溶存酸素とｐＨモニタリング、洗浄、及び細胞濃度など、閉じたシステムとしてリンクされた複数のユニット操作をサポートする。カセットの下部には、培養に必要な様々な試薬及び老廃物を保持するための複数のバッグが含まれる。コクーンは、カセットの制御システムを提供する。これには、流体及び細胞の移動の制御、並びに制御センサーの揺動、撹拌、及びリモートモニタリングが含まれる。アクチュエータは、流体に接触することなく自動化バルブ制御を可能にする。アクチュエータの相互作用がなければ、バルブは閉じたままになり、制御されていない流体運動を防ぎながら、カセットを部屋間又は顕微鏡に移動させることができる。必要な試薬をカセットの流体リザーバーに充填した後、様々なユニット操作が行われるカセットの培養ゾーンにスナップする。ウイルスの滅菌試料の除去又は注入では、ＩＣＵスピロス（Ｓｐｉｒｏｓ）コネクターを利用する。試料の除去又はウイルスの添加の前に、事前にプログラムされたプロトコールで定義されているように、特定の時間にオペレーターが進める。オペレーターのサインインと通知の確認後、コクーンが自動的に開き、試料の除去又はウイルスの添加が可能になる。オペレーターは、ドアが自動的に閉じて環境制御が再開される前に、アクションが完了したことを認識する。カセットがコクーンに充填され（図１１Ｃ）、外殻が閉じられると（図１１Ｄ）、カセットの下部は熱障壁によって上部から分離される。下部は冷蔵温度に維持され、上部は３７℃に維持される。閉じたコクーンにより、ガスと熱の制御が可能になる。細胞は３７℃に維持され、試薬はコールドゾーンに維持されて安定性が延長される。不透明な殻は、培地成分の分解に関連する光誘発毒性を防ぐ。細胞に移す前に、培地を温めるために、３７℃のゾーンに予熱チャンバーが位置される。すべての培養ステップは、ＰＢＭＣ充填から最終濃度及び細胞回収まで自動化され得る。図１１Ａに示されるように、カセットには、アクティベーション後にウイルスを充填するために使用することができる一連のアクセスポートがある。リアルタイム溶存酸素及びｐＨセンサーがカセットに組み込まれ、コクーンソフトウェアにフィードバックを提供する。リアルタイムのデータ及び履歴グラフをモニタリングして、これらの要因が標的範囲内に維持されていることを確認することができる。

【0336】

[00359]コクーンプロセスステップの概要は、図１２Ａに示される。ガス透過性パーマライフバッグは、並行対照培養及びＣＡＲ Ｔ細胞の拡大に使用された（例えば、Ｌｕ、２０１６年）。図１２Ｂ（コクーン）及び１２Ｃ（パーマライフバッグ）は、カセットの上部チャンバーで培養されたコクーン内の細胞を含む２つの形式の細胞分布を実証する。両方のシステムで同等体積の培地を使用した。パーマライフ細胞培養バッグは、一般的に行われているように、総体積が増加するにつれて面積が拡大する、流加培養プロセスを利用した。コクーンカセットは固定領域を利用し、最初の流加培養の供給戦略を採用し、培養６日目と８日目に部分的な培地交換を使用した。

【0337】

[00360]活性化方法の影響及び自動化プラットフォームの性能を評価するために、以下の基準を使用した：生存率、細胞数、表現型、消耗、形質導入効率、機能性細胞内サイトカイン分泌、及び細胞毒性。結果を図１６に要約し、本明細書において検討する。

【0338】

[00361]ドナー２として別段の指示がない限り、すべての条件について同じドナー細胞を使用した。すべての条件は、６０×１０^６のＰＢＭＣを播種し、同じ培地体積及び組成物を与えた。開始細胞集団には、６６．６％のＣＤ３＋Ｔ細胞及び１２．０％のＣＤ１４＋細胞が含まれていた。ＣＤ３＋細胞のうち、７１．２％がＣＤ４＋であり、２８．１％がＣＤ８＋細胞であった。２番目のドナーを使用して、ドナー間の変動の影響を決定した。このＰＢＭＣの２番目の集団には、元々、７５．０％のＣＤ３＋Ｔ細胞及び４．５％のＣＤ１４＋細胞が含まれていた。ＣＤ３＋細胞のうち、６５．０％はＣＤ４＋であり、３２．９％はＣＤ８＋細胞であった。

【0339】

[00362]ＯＫＴ３及びダイナビーズで活性化されたコクーン培養物からの１０日目の生細胞収量は、それぞれ２．５５×１０^９±０．１×１０^９及び２．１５×１０^９±０．１×１０^９であった。ＯＫＴ３及びダイナビーズで活性化されたパーマライフバッグ培養物からの生細胞収量は、それぞれ２．０８×１０^９±０．１×１０^９及び１．５３×１０^９±０．１×１０^９であった（図１３Ａ）。すべての条件での生存率は９５％を超えていた（図１３Ａ）。集団倍加レベル（ＰＤＬ）は、コクーンでは５．２～５．４（３６～４３倍）、パーマライフバッグでは４．７～５．１（２５～３５倍）であった（図１３Ｂ）。

【0340】

[00363]すべての条件は、Ｔ細胞の高レベルの純度を示し、生存細胞の８８％超がＣＤ３を発現した。パーマライフバッグで増殖したビーズ活性化ＰＢＭＣを除き、１０日間で生成された総生存Ｔ細胞は２０億を超えていた（図１３Ｃ）。活性化法に関係なく、コクーン条件ではバッグに比べて総Ｔ細胞収量が多くなった。１０日目のコクーンカセットＴ細胞の収量は、２．０～２．４×１０^９であった。パーマライフバッグは、１．５～２．０×１０^９のＴ細胞を生成した（図１３Ｃ）。同じドナー細胞を使用すると、ＣＤ３＋細胞のＰＤＬは、それぞれダイナビーズ又はＯＫＴ３を使用して活性化されたコクーンで５．７及び５．９（５１及び６０倍）であった（図１３Ｄ）。ダイナビーズとＯＫＴ３をそれぞれ使用して活性化したパーマライフバッグでは、ＣＤ３＋細胞のＰＤＬは５．２及び５．６（３８及び４９倍）であった。

【0341】

[00364]ヘルパーＴ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞をそれぞれ示すＣＤ４及びＣＤ８の糖タンパク質を発現するＣＤ３＋Ｔ細胞の割合を図１３Ｅに示す。Ｔ細胞亜集団に関連する最も重要な結果は、ダイナビーズ活性化した細胞と比較してＯＫＴ３で活性化された条件でのＣＤ８細胞の数の増加であった。ＯＫＴ３活性化は、８３～８６％のＣＤ８＋及び６～１１％のＣＤ４＋細胞をもたらし、一方、ダイナビーズ活性化条件は、４８～５６％のＣＤ８＋及び４１～４８％のＣＤ４＋細胞の亜集団をもたらした。同じドナーによるすべての培養物では、消耗関連マーカーであるＰＤ－１は１０％未満であり、これは、低レベルの細胞消耗を示した（図１３Ｆ）。２番目のドナーは、ダイナビーズを含むコクーンで培養すると、細胞の２１％でＰＤ－１を発現した。図１３Ｇ及び１３Ｈは、ＯＫＴ３活性化条件と比較して、ダイナビーズ活性化条件におけるＣＤ８＋細胞の有意差を強調する代表的な等高線図を示す。

【0342】

[00365]高い形質導入効率は、コクーン中のＣＤ３＋細胞の６２～７８％、及びＮＧＦＲを発現するパーマライフバッグ中のＣＤ３＋細胞の４２～６０％を有するＴ細胞ＨＥＲ２特異性の代理表面マーカーＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）発現により決定された（図１４Ａ）。形質導入効率は、バッグ培養に比べてコクーンの方が大きかった。高い形質導入及び拡大により、生存可能なＣＡＲ Ｔ細胞の総数は、コクーンでは１．２６～１．６６×１０^９、パーマライフバッグでは０．６２～１．２０×１０^９の範囲であった（図１４Ｂ）。ＣＤ４及びＣＤ８亜集団におけるＣＡＲ Ｔ細胞の割合及び総数をそれぞれ図１４Ｃ及び１４Ｄに示す。形質導入されたＣＤ４細胞の割合は、ＮＧＦＲが発現しているコクーンにおいて、ＣＤ４細胞の７５．４～８０．９％及びＣＤ８細胞の６４～７３．２％であり、ＣＤ８細胞よりも大きかった。パーマライフバッグでは、５４．７～７９．９％のＣＤ４細胞及び３６．１～５８．９％のＣＤ８細胞がＮＧＦＲを発現した。ＣＤ８細胞の拡大はＣＤ４細胞よりも有意に大きかったため、ＣＤ８＋形質導入細胞の総数は、ダイナビーズ活性化したバッグ培養を除くすべての条件でＣＤ４＋形質導入細胞よりも有意に大きかった（図１４Ｄ）。コクーンでは、０．２５～０．６４×１０^９の形質導入ＣＤ４細胞及び０．６６～１．４３×１０^９の形質導入ＣＤ８細胞が存在した。パーマライフバッグ条件では、０．０９～０．４１×１０^９の形質導入ＣＤ４細胞及び０．２５～１．０６×１０^９の形質導入ＣＤ８細胞が存在した。コクーン条件及びパーマライフバッグ条件での形質導入効率の代表的な等高線図をそれぞれ図１４Ｅ及び１４Ｆに示す。

【0343】

[00366]細胞の機能性試験は、細胞内サイトカイン放出アッセイ及びＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ殺傷アッセイを使用して行われた（Ｎｏｃｉａｒｉ、１９９８年を参照されたい）（図１５）。すべての場合において、細胞は、１型ＴヘルパーＣＤ４＋細胞及び細胞傷害性ＣＤ８＋細胞に特徴的なＴＮＦα及びＩＦＮγの産生を実証した（図１５Ａ及び１５Ｂ）（例えば、Ｒｏｍａｇｎａｎｉ、１９９１年を参照されたい）。より高い割合のＣＤ４＋細胞がＴＮＦαを分泌した。ＴＮＦα分泌細胞の生成は、同じドナー細胞のバッグ培養と比較して、コクーン条件で大きかった。ダイナビーズ活性化条件は、ＯＫＴ３活性化条件よりも高い割合でＴＮＦα及びＩＦＮγ分泌形質導入細胞を生成した。ＡＬＡＭＡＲＢＬＵＥ殺傷アッセイは、ＣＡＲ Ｔ細胞による卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ－３ ＨＥＲ２＋腫瘍細胞の効果的な殺傷を実証した（図１５Ｃ及び１５Ｄ）。殺傷効果の傾向は、エフェクターＴ細胞の連続希釈に続き、パーマライフとコクーンの生成細胞の両方からの強い応答を示した。ＨＥＲ２腫瘍細胞であるＬＯＸ ＩＭＶＩはまたＴ細胞に曝露されて、ＨＥＲ２特異性を実証した。ＣＡＲ Ｔ細胞に応答したＨＥＲ２陰性培養では、殺傷傾向は確認されなかった。

【0344】

検討
[00367]活性化方法。ＣＡＲ Ｔ細胞産生の評価には、可溶性抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、並びにビーズ結合した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ ダイナビーズを使用した活性化が含まれた。ＯＫＴ３で活性化された培養物は、ダイナビーズで活性化された培養物と比較して１９～３６％の改善された増殖を実証した（図１３Ａ）。活性化の方法はまた、最終的な表現型に有意差を生じさせた（図１３Ｅ）。ダイナビーズ活性化条件では、ＣＤ３＋ＣＤ８＋が８４．５％であったＯＫＴ３活性化条件と比較して、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞が平均５２．７％であった。これは、ダイナビーズで活性化された条件の場合、ＯＫＴ３で活性化された場合の９．８：１と比較して、ＣＤ８＋とＣＤ４＋の比率が約１．２：１であることを表す。ＣＤ８＋細胞数の増加は、細胞がバッグ又はコクーン条件で培養されたかどうかに関係なく見出された。

【0345】

[00368]ＯＫＴ３活性化による改善された収量は、予想外の結果であった。ダイナビーズは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体及びＣＤ２８共刺激受容体に結合することによりＴ細胞を活性化する。共刺激用の抗ＣＤ２８抗体を有するダイナビーズとは異なり、可溶性抗ＣＤ３による活性化は単球に依存して、ＣＤ２８に対するリガンドであるＢ７受容体、ＣＤ８０及びＣＤ８６を提示する（例えば、Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ、１９９６年を参照されたい）。しかしながら、Ｂ７受容体はまたＣＴＬＡ－４に結合し、この阻害経路を刺激するため、したがって、Ｔ細胞の増殖を阻害することができる。活性化法に基づいた、改善された総細胞収量は、細胞がバッグ又はコクーン条件で培養されたかどうかに関係なく見出された。ビーズ結合した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）の拡大を促進し、ＯＫＴ３は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）の拡大を促進し得る（例えば、Ｆｌｅｉｓｃｈｅｒ、１９９６年；Ｌａｕｘ、２０００年；Ｌｉ、２０１０年；Ｚｈｕ、２００７年を参照されたい）。

【0346】

[00369]より高い細胞収量、及び具体的には、ＣＤ８＋細胞優位性は、ＯＫＴ３及び単球を使用して活性化された場合、追加の受容体の刺激に起因し得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞の９５％がＣＤ２８を発現し、一方、ＣＤ８細胞の５０％のみがＣＤ２８を発現することが以前に報告されている（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、１９９０年を参照されたい）。その結果、ダイナビーズは、ＣＤ８＋細胞の最大５０％のみを活性化することができる。ＯＫＴ３で活性化された培養物は、ビーズではなく、単球に存在する他の共刺激リガンドの恩恵を受ける可能性がある。

【0347】

[00370]例えば、単球は、ＣＤ５８（ＬＦＡ－３）及びＣＤ４０受容体を発現し、これらはＣＤ２及びＣＤ４０Ｌのリガンドである。これらの受容体の刺激は、Ｔ細胞の増殖を促進することが公知である。これらのアクセサリー細胞はまた、ＣＤ１３７と相互作用し、ＣＤ８＋細胞の拡大を刺激し得るＣＤ１３７Ｌを発現する場合がある。これらの他の受容体との相互作用は、ダイナビーズ活性化と比較して、より生理学的な抗原提示を代表する可能性がある。

【0348】

[00371]ＯＫＴ３活性化は他の細胞に依存するため、ドナー変動性の影響は、ダイナビーズによる活性化よりも重要である可能性がある。この研究の開始細胞集団は、０日目に１２．０％のＣＤ１４＋細胞及び６６．６％のＣＤ３＋細胞で構成された。単球感受性が最終収量及び表現型に与える影響を調べるために用量研究を行うことができた。

【0349】

[00372]自動化。コクーンは、ＯＫＴ３又はダイナビーズのいずれかで活性化した場合、手動条件と比較して、生存可能なＣＡＲ Ｔ細胞のより大きな収量を生じさせた。ダイナビーズで活性化した場合、ＣＯＣＯＯ培養は、バッグ培養よりも４０％多い増殖を生じさせた。ＯＫＴ３培養では、コクーンはバッグ培養よりも２３％多く細胞を生じさせた。コクーン条件はまた、形質導入効率がより高く、その結果、ＣＡＲ Ｔ細胞の総収量がより高いことを実証した（図１４）。ダイナビーズ活性化条件では、コクーンの総ＣＡＲ Ｔ細胞収量はバッグの２倍超であった。ＯＫＴ３活性化条件では、ＣＡＲ Ｔ細胞の収量はコクーンでバッグよりも約４０％多くなった。

【0350】

[00373]パーマライフバッグと比較してコクーンの改善された収量は、活性化の増加であり得る。これは培養領域全体の分布に起因している可能性がある。コクーンは、バッグが柔軟であるのに対し、固体の非降伏チャンバーを利用する。細胞の沈降後、バッグの湾曲が細胞の不均一な分布を引き起こすことが観察された。これは、活性化剤及び／又は細胞の不均一な分布を引き起こした可能性がある。別の考えられる原因は、活性化期中の撹拌量に関係している可能性がある。活性化の翌日に細胞が形質導入されたため、活性化がまだ進行中であるか、又は活性化剤が細胞に取り込まれなかった可能性がある。形質導入ステップ中に、バッグ培養物をインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移動して、滅菌技術を使用して細胞を送達する。バッグの運動は、バッグ内のウイルス分布を促進する；しかしながら、インキュベーターからインキュベーターへのバッグの移動中にも細胞が乱される。安定した接触は、細胞の活性化に重要である可能性があるため、この運動は細胞に負の影響を与えた可能性がある。コクーン培養物の細胞は、活性化又は形質導入のステップ間で妨げられない。コクーンでは、活性化に使用される培地は、形質導入前に培養から除去される。少量の培地がチャンバー内に残っているため、細胞はチャンバーの底にとどまり、体積の移動中に邪魔されない。チャンバーから取り出された培地は、ウイルスを希釈及び混合するために使用され、次に、細胞集団に移動して戻される。このプロセスの間、細胞は影響を受けないままである。

【0351】

[00374]効率的な活性化は、より効率的な形質導入と相関し得る。つまり、細胞が活性化されて活発に分裂している場合、レンチウイルスはより効果的に統合される可能性がある。これを評価するために、形質導入前に試料を採取して、活性化効率を決定することができる。改善された形質導入効率はまた、細胞へのウイルスの均一な分布に関係している可能性がある。コクーン培養では、ウイルスは培地と混合され、細胞に均一に分布する。平らであり、柔軟性のない容器を使用すると、均一な分布を改善し、その結果、細胞集団間でウイルスの均一な曝露に役立つ。

【0352】

[00375]改善された性能の別の理由は、ガス交換に関係している可能性がある。酸素レベルの増加は、増殖の増加をサポートする可能性がある。シリコーンガス交換ラインを介した培養上清の再循環を使用することにより、自動化プラットフォームで高い酸素レベルが維持された。ガス交換は、バッグの材料であるフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）を介した拡散により、バッグの状態で達成される。シリコーンの透過係数は、ＦＥＰの透過係数よりも有意に大きい（例えば、Ａｖｇｏｕｓｔｉｎｉａｔｏｓ、２００８年を参照されたい）。コクーンプロトコールは、十分な酸素濃度を確保するために作成された。これは、培養期間を通じて生成されたバイオセンサーのデータによって確認された。

【0353】

[00376]シリコーンチューブを介したガス交換はまた、ｐＨレベルをサポートする。つまり、培養の開始時に、培地はＣＯ_２が豊富な環境とのガス交換によって標的ｐＨを維持する。培養中の細胞数が増加すると、細胞は乳酸及びＣＯ_２を生成し、ＣＯ_２環境の必要性を取り除く。コクーン環境のＣＯ_２は、培養期間中に減少し、ｐＨの維持に役立った。パーマライフバッグは、培養プロセス全体を通じて５％ＣＯ_２環境で保存される従来のプロトコールに従った。

【0354】

[00377]細胞を乱すことのない連続再循環のさらなる利点は、正及び負の因子のより均一な分布である。これには、栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び溶存ガスが含まれる。継続的な再循環は、因子を均等に分散させることにより、局所的な影響を減らし、培地の効率を改善するのに役立つ。

【0355】

[00378]自動化転換。この実施例では、閉じた自動化生成システムであるコクーンを使用して、ビーズ結合した抗体又は可溶性ＯＫＴ３のいずれかによって活性化されたＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。結果は、低濃度のウイルスを使用して、高い形質導入効率でコクーンから臨床的に関連する収量を生成し得ることを実証している。さらに、細胞の表現型は、活性化法によって駆動することができる。

【0356】

[00379]結果は、活性化法の影響を比較するために、主に単一のドナーから生成された。条件間の変動性は非常に低かった。異なるドナーを用いて試験を繰り返した場合、同じ活性化法を使用した場合にドナー間で結果は同様であった。この研究は、臨床的に関連性があり、スケーラブルで使いやすい方法でＣＡＲ Ｔ細胞の生成を効果的に自動化する効率的な方法を実証する。

【0357】

実施例３－細胞工学システムを用いたエレクトロポレーションによる形質導入
背景
[00380]オクタンコクーン（商標）システムは、細胞治療製造物を製造するための自動化された、閉じたエンドツーエンドバイオリアクターシステムである。オクタンの自動化細胞及び組織工学システム（ＡＣＴＥＳ）は、３つの主なコンポーネント：基本機器、ソフトウェア、及びカスタマイズ可能な使い捨てカセットで構成されている。コクーン（商標）システムは、上流と下流の細胞培養プロセスの両方で、自動化された単離、拡大、濃縮、及びバッファー交換が可能である。

【0358】

[00381]エレクトロポレーションユニットは、初代細胞、幹細胞、ニューロン、及び静止期又は非増殖細胞を含む、エレクトロポレーション及び他の非ウイルス法を介して低いトランスフェクション効率を有することが従来公知である細胞のトランスフェクションを可能にする。本システムには、エレクトロポレーションユニット、エレクトロポレーション溶液、エレクトロポレーションカートリッジ、及び最適化されたエレクトロポレーションプロトコールが含まれる。エレクトロポレーションユニットは、コアユニット、及び様々なニーズに対応する１～３個の追加機能アドオンユニットで構成される。例えば、エレクトロポレーションユニットを使用して、２０μＬ～１００μＬの様々な細胞数、及び１ｍＬ～２０ｍＬの体積で１×１０^７～１×１０^９のトランスフェクションを行うことができる。

【0359】

[00382]本明細書には、エレクトロポレーションユニット及びオクタンコクーン（商標）システムを使用する、自動化された、完全に閉じられた、無菌であり、堅牢なトランスフェクション及び細胞拡大手順が記載される。概念実証（ＰｏＣ）の評価では、それぞれのエレクトロポレーションソフトウェア及びオクタンコクーン（商標）ＡＣＴＥＳソフトウェアは、互いに独立して動作する。他の実施形態では、ソフトウェアはシステム間で完全に統合されている。
方法
[00383]エレクトロポレーションユニット及びコクーン（商標）システムを使用した末梢血単球細胞（ＰＢＭＣ）トランスフェクション及び拡大の評価は、３つの主要な焦点領域に分割された。

【0360】

[00384]コクーン（商標）カセットの細胞濃度、オクタンコクーン（商標）とエレクトロポレーションユニット間の細胞移動、コクーン（商標）とエレクトロポレーションユニット間で移動した、トランスフェクトされた細胞の拡大、及びコクーン（商標）カセット内の細胞濃度。

【0361】

[00385]コクーン（商標）ＡＣＴＥＳカセットは、その培養チャンバー内で約４５０ｍＬの培養培地を再循環する。細胞増殖チャンバーは、典型的には、２６０ｃｍ^２の領域内に最大１８０ ｍＬの培地を一定量保持する。２６０ｃｍ^２の増殖チャンバーの１８０ｍＬ容量を超える追加の培地体積は、コクーン（商標）カセットの様々なサテライトリザーバー及びチャンバーから提供される。これらのサテライトリザーバーからの追加の培地は、使い捨てのコクーン（商標）の培養物分内で再循環して、新鮮な栄養素を提供し、２６０ｃｍ^２の増殖チャンバー内の細胞から老廃物を除去することができる。

【0362】

[00386]エレクトロポレーションユニットがトランスフェクトすることができる例示的な体積は２０ｍＬである。２０ｍＬの体積は、適切なエレクトロポレーション溶液の少なくとも９０％で適切に構成される必要がある。したがって、ＰｏＣ研究では、元の培養体積を１０ｍＬに減らし、次に、追加の９０ｍＬの補足されたＰ３初代細胞エレクトロポレーション溶液で希釈し、最終体積１０ｍＬ～１８ｍＬに濃縮した。

【0363】

[00387]記載された概念実証の研究は、以下を利用した：
[00388]透過ラインの端部に追加された、Ｎｏｒｄｓｏｎ ＥＦＤの２０ゲージ、内径０．０２４インチ／内径０．０３６インチの流量制限器。

【0364】

[00389]１×１０^８のＰＢＭＣを１×１０^８のＣＤ３＋：ＣＤ２８＋ダイナビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で刺激し、最大１０日間、複数のＧＲＥＸ １００（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）培養容器を使用して、５％ヒト血清Ａ／Ｂ（Ｓｉｇｍａ）及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補足したＸ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）で構成される完全なＴ細胞培地で拡大した。細胞の試験濃度を２５０ｍＬのコニカルバイアルに移し、空気を加湿した５％ＣＯ２の３７℃のインキュベーター内で２～４時間馴染ませた。馴染ませた細胞懸濁液の上清を１０ｍＬに減らし、過剰な上清を廃棄した。９０ｍＬの補足Ｐ３の初代細胞エレクトロポレーション溶液（Ｌｏｎｚａ）を、濃縮された細胞懸濁液に加えて、最終体積を１００ｍＬにした。次に、１００ｍＬの細胞懸濁液を１０ｍＬの体積に濃縮した。細胞の対照試料を３７℃でインキュベートした。

【0365】

[00390]希釈前の細胞培養物、希釈培養物、及び最終濃縮の細胞懸濁液に対してＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用して、二重でカウントを行った。体積は、血清ピペット及びＫｒｏｓＦｌｏスケールを使用して測定された。残留試験試料は、初期の培養前希釈、上清、及び最終濃縮の細胞懸濁液から得られた。ヒト血清ＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、希釈及び濃縮後に残った血清の割合を決定した。ＦＡＣＳ分析は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋発現について対照細胞及び濃縮された細胞懸濁液で行われた。

【0366】

[00391]コクーン（商標）トランスフェクションプロトコールの体積減少の首尾よい実証は、以下記のように定義された：細胞の≧８５％の回復、細胞生存率の≦１０％の減少、及び初期濃度の≦１０％の残留ヒト血清。

【0367】

[00392]オクタンコクーン（商標）とエレクトロポレーションユニット間の細胞移動
[00393]コクーン（商標）とエレクトロポレーションユニット間の細胞の移動には、いくつかの使い捨て消耗品が必要である：コクーン（商標）カセット、エレクトロポレーションカートリッジ、２つの修飾エレクトロポレーションリザーバー、及び２つの接続チューブセット（図１７参照）。

【0368】

[00394]修飾エレクトロポレーションリザーバーは、ルアーロック接続端部を有する入口及び出口溶接可能チューブ、リザーバーへの無菌細胞移動のための外部入口リザーバーチューブに接続されたリザーバーハウジング内の細胞投入ポート、ＬＶリザーバーの投入チューブのルアーロック基質付加ポート、及び体積の移動中に空気を逃がすためのキャップのベントフィルターを含む。培養物の無菌性又は細胞の健康を損なうことなく、制御された方法でコクーン（商標）外への流体及び細胞懸濁液の移動を自動化し得るポートを備えたコクーン（商標）カセットが設計される。

【0369】

[00395]コクーン（商標）とエレクトロポレーションユニット間の細胞の無菌移動の首尾よい実証は以下を実証した：移動され、トランスフェクトされた細胞の上清は無菌試験と通過した、トランスフェクション前後の培養試料においてマイコプラズマは検出されなかった、トランスフェクション後であって、コクーン（商標）カセット増殖チャンバーへの送達後にコクーン（商標）カセットにおいて、トランスフェクションまでの細胞／体積の９０％以上の回復、コクーン（商標）とエレクトロポレーションユニット細胞の移動運動の間のトランスフェクトされていない細胞の生存率の５％以下の変化、並びにコクーン（商標）とエレクトロポレーションユニット間の自動化移動の有無にかかわらずにトランスフェクトされた細胞と比較した場合、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋細胞の２０％以下の変化。

【0370】

[00396]コクーン（商標）ＡＣＴＥＳカセットは、ＢＤ Ｑ－Ｓｙｔｅメスルアーロックエンドを備えた２つのサンプリングポート、並びにこれらの場所に無菌的に接続された、コクーン（商標）カセットからの接続チューブセットを介した細胞懸濁液の自動化移動を可能にするカニューレを備えた入口及び出口ポートを有する。ＰｏＣの研究中、コクーン（商標）カセット、エレクトロポレーションリザーバー、エレクトロポレーションカートリッジ、及び接続チューブセット間のコネクション（接続部；ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）は無菌的に接続され、コクーン（商標）とエレクトロポレーションシステム間の滅菌ループを次のように作製した。

【0371】

[00397]ＩＣＵ Ｍｅｄｉｃａｌのスピロス（登録商標）オスルアーロック終端コネクターを備えた接続チューブセットを、コクーン（商標）の２つのＢＤ Ｑ－Ｓｙｔｅメスルアーロックサンプリングポートに接続した。コクーン（商標）カセットからエレクトロポレーションリザーバーへの滅菌経路を作製するために、接続チューブセットの他のスピロス（登録商標）オスルアーロックコネクション（ＩＣＵ Ｍｅｄｉｃａｌ）をエレクトロポレーションリザーバーのメスルアーロック入口チューブに接続した。修飾エレクトロポレーションリザーバーをエレクトロポレーションカートリッジに接続するために、修飾エレクトロポレーションリザーバードレーンラインのメスルアーロック端部をエレクトロポレーションカートリッジ入口のスピロス（登録商標）オスルアーロックコネクション（ＩＣＵ Ｍｅｄｉｃａｌ）に取り付けた。トランスフェクトされた細胞を回収するために、エレクトロポレーションカートリッジのスピロス（登録商標）オスルアーロック出力コネクションは、２番目のエレクトロポレーションリザーバーのメスルアーロックコネクター入口に接続された。２番目のエレクトロポレーションリザーバードレインラインのメスルアーロック端部は、コクーン（商標）カセットの２番目の自動化サンプリングポートにある接続チューブセットのスピロス（登録商標）オスルアーロックコネクターに接続された。

【0372】

[00398]実施形態において、コクーン（商標）ポンプは、トランスフェクトされた細胞をコクーン（商標）増殖チャンバーに移し、細胞の無菌移動が可能な第２のエレクトロポレーションリザーバー又は他の回収容器を利用して、コクーン（商標）カセットの増殖チャンバーへの送達前に新たにトランスフェクトされた細胞を回収する。修飾エレクトロポレーションリザーバーの入口及び出口のＰＶＣチューブライン間の無菌ルアーロックコネクションの代わりに、無菌溶接技術を使用することができ、ＰＶＣチューブを備えた接続チューブセットが可能である。

【0373】

[00399]本明細書に記載される細胞工学システム（コクーン）はまた、コクーン（商標）機器の中空シャフトを通じて内部コクーン（商標）環境から誘導されるチューブを介して、コクーン（商標）カセットとエレクトロポレーションユニット間の無菌の閉じた接続部を可能にする。「トランペットアーム」と呼ばれるこの中空シャフトは、主要なプロセスパラメータの制御を失うことなく、外部環境からコクーン（商標）培養チャンバーの内部環境へのアクセスを提供する。コクーン（商標）とエレクトロポレーションユニット間の細胞運動は、ペリスタポンプ及び２つの独立した制御システムのソフトウェアを使用したが、複合システムのソフトウェアも利用して、独立したポンプシステムを制御することができる。

【0374】

[00400]トランスフェクション前に、細胞／流体を手動で滅菌エレクトロポレーションリザーバーに移して、拡大前（０日）トランスフェクション手順を模倣するか、又はコクーン（商標）ポンプ、ソフトウェア、及び接続チューブセット（前述）を用いて、コクーン（商標）カセット増殖チャンバーから移して、拡大後トランスフェクション手順を滅菌エレクトロポレーションリザーバーに模倣した。次に、コクーン（商標）ポンプ及びソフトウェアは、コクーン（商標）カセットからエレクトロポレーションリザーバーの入口への細胞／流体の移動を自動化した。エレクトロポレーションシステムは、エレクトロポレーションリザーバーから、エレクトロポレーションカートリッジを経由して、２番目のエレクトロポレーションリザーバーまで、最大２０ｍＬの事前にプログラムされたポンプ運動を実行した。その後、コクーン（商標）ポンプは、回収された、トランスフェクトされた細胞／緩衝液を２番目のエレクトロポレーションリザーバーからコクーン（商標）カセットの増殖チャンバーに移した。

【0375】

[00401]第２のエレクトロポレーションリザーバーを組み込んで、トランスフェクトされた細胞を回収し、コクーン（商標）ポンプによってコクーン（商標）増殖チャンバーに移す準備ができるまでそれらを保持した。エレクトロポレーションユニットポンプのみを使用して、トランスフェクトされた細胞をエレクトロポレーションユニットからコクーン（商標）増殖チャンバーに移動させるには、「接続チューブセットクリアリング」プログラムを利用することができる。さらに、接続チューブセットの長さは一貫している必要がある。

【0376】

[00402]前述のコクーン（商標）カセット、接続チューブセット、及び修飾エレクトロポレーションリザーバーコネクションを使用して（図１７）、１１ｍＬのリン酸緩衝液（Ｌｏｎｚａ）は、コクーン（商標）ポンプを使用してコクーン（商標）カセットから修飾エレクトロポレーションリザーバーに移された。エレクトロポレーションプログラムを使用して、ＰＢＳ溶液の模擬トランスフェクションを行い、１１ｍＬ体積を２番目の修飾エレクトロポレーションリザーバーに移動した。次に、コクーン（商標）ポンプ及びソフトウェアを使用して、１１ｍＬ体積を２番目の修飾エレクトロポレーションリザーバーからコクーン（商標）カセットの出力バッグに移した。コクーン（商標）リザーバーからサテライトバッグに移動される量は、１回の実行で１１ｍＬと推定された。実際の体積は、最初の修飾エレクトロポレーションリザーバー、２番目の修飾エレクトロポレーションリザーバー、及びコクーン（商標）出力バッグに移した後、血清ピペットを使用して測定された。通過基準は、最初の修飾エレクトロポレーションリザーバーからコクーン（商標）出力バッグへの≧９０％の流体回収率で確立された。
細胞懸濁液試験
[00403]１×１０^８及び５×１０^８の総生存可能なＰＢＭＣは、滅菌コクーン（商標）ＡＣＴＥＳカセットの５％ヒト血清Ａ／Ｂ（Ｓｉｇｍａ）及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が補足されたＸ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）で構成される４５０ｍＬの完全Ｔ細胞培地で拡大される。３日目に、４４０ｍＬの培養上清を取り出し、無菌性及びマイコプラズマ試験のために保持する。細胞は、９０ｍＬの補足Ｐ３エレクトロポレーション溶液（Ｌｏｎｚａ）で希釈される。次に、細胞をコクーン（商標）カセットで約１０ｍＬの細胞懸濁液に濃縮し、コクーン（商標）サテライトバッグに移す。追加１０ｍＬの補足Ｐ３エレクトロポレーション溶液で増殖チャンバーを洗浄し、コクーン（商標）サテライトバッグの細胞懸濁液に添加するオプションが評価される。Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）、マイコプラズマを使用して重複した細胞数を測定するために、サテライトバッグ内の濃縮細胞から試料を取り出し、無菌状態を保持する。次に、前述のように、コクーン（商標）ポンプ及び接続チューブセットを介して、細胞を修飾エレクトロポレーションリザーバーに移す。エレクトロポレーションユニットポンプ及びＥＯ－２１０プログラムを使用して、Ｔ細胞にｐｍａｘ ＧＦＰベクター（Ｌｏｎｚａ）をトランスフェクトし、トランスフェクトされた細胞を２番目の修飾エレクトロポレーションリザーバーに移す。次に、コクーン（商標）ポンプは、修飾エレクトロポレーションリザーバーからコクーン（商標）ＡＣＴＥＳカセットの増殖チャンバーに細胞を移す。重複細胞数、マイコプラズマ、及び無菌性試験のために、ＡＣＴＥＳカセット増殖チャンバーから細胞の試料を取り出す。この手順は、細胞がトランスフェクトされないが、代わりに模擬エレクトロポレーションプログラムＣＡ－１００を使用してエレクトロポレーションユニットを通過する対照培養物で繰り返される。この手順は、３人の異なるドナーを使用して評価される；新たに単離されたものと凍結保存されたＰＢＭＣロットの両方である。

【0377】

[00404]細胞生存率の変化は、トランスフェクトされていない細胞培養物で測定される。細胞の回復、無菌性、及びマイコプラズマ負荷は、すべての培養物で評価される。フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及び追加のマーカー発現を評価する。

【0378】

[00405]コクーン（商標）とエレクトロポレーションユニット間の細胞懸濁液の無菌的移動は、運動前及び運動後の無菌であり、マイコプラズマを含まない上清を提供し、トランスフェクション後であり、コクーン（商標）カセット増殖チャンバーへの送達後のコクーン（商標）カセットのトランスフェクション前の細胞の≧９０回復、非トランスフェクション細胞の生存率の≦５％の変化、トランスフェクション後のＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋細胞比の≦２０％の変化をもたらす。

【0379】

コクーン（商標）とエレクトロポレーションユニット間で移動されたトランスフェクトされた細胞の拡大
[00406]１×１０^８及び５×１０^８の総生存可能なＰＢＭＣをコクーン（商標）カセットで拡大及び濃縮し、エレクトロポレーションＬＶユニットの滅菌コネクションを介してトランスフェクトし、「オクタンコクーン（商標）とエレクトロポレーションＬＶユニット間の細胞間の移動、細胞懸濁液テスト」に関する方法セクションで前述したように、コクーン（商標）に滅菌的に移す。トランスフェクトされた細胞は、最も関連性の高い、最適化された自動化コクーン（商標）プロトコールを使用して、コクーン（商標）カセット増殖チャンバーで最大１５日間培養される。対照は、Ｔ－２２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）又はＧＲＥＸ １００（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ）培養容器で３日間拡大される。３日目に、対照培養を無菌的及び手動で濃縮し、エレクトロポレーションＬＶユニットＥＯ－２１０プログラムを介してトランスフェクトし、最大１５日間の継続的な拡大のために元の容器に戻す。この手順は、新たに単離され又は凍結保存されたＰＢＭＣロットからの３人の異なるドナーを使用して評価される。

【0380】

[00407]コクーン（商標）とエレクトロポレーションユニットとの間で移入された、トランスフェクトされた細胞の拡大は、ＦＡＣＳを介して決定した場合、トランスフェクションの２４時間後及び回収日の対照培養物と比較した場合、トランスフェクション効率の±１０％の変動、対照培養物の≧８０％の最終細胞濃度、対照培養と比較した場合、最終細胞生存率の±５％の変動、ＧＦＰ＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋発現における対照培養物と比較した場合、±１０％の変動をもたらし、移入されたトランスフェクトされた細胞の上清は無菌試験に通過し、トランスフェクション前後の培養試料においてマイコプラズマは検出されなかった。

【0381】

結果
[00408]コクーン（商標）カセットの細胞濃度
[00409]２人のドナー由来の細胞を濃縮して、４．４×１０^８及び４．２×１０^８の総生細胞で１０ｍＬの体積に沈降させた。次に、これら２つの細胞懸濁液を９０ｍＬの補足されたエレクトロポレーション溶液（ＮＦＳ）で希釈し、濃縮した。濃縮後の細胞回収率は９２％及び８７％であった。トランスフェクション前の細胞生存率は９２％及び７４％であり、５％未満減少した。両方の実行では、最初の培養上清の６％及び８％が最終の濃縮された細胞懸濁液において検出された。

【表3】

【0382】

[00410]濃縮されなかった対照培養と比較して、濃縮後のＣＤ４＋：ＣＤ８＋プロファイルに差はなかった。

【0383】

[00411]結果は、コクーン（商標）サテライトバッグからコクーン（商標）出力バッグへの流体の回収を実証した。トランスフェクトされた細胞の拡大は、コクーン（商標）とエレクトロポレーションユニットの間で移された。エレクトロポレーションユニットで首尾よくエレクトロポレーションが行われて、形質導入細胞がもたらされる。

【0384】

[00412]本明細書では、エレクトロポレーションユニットとコクーン（商標）システムとの間の閉ループを使用した自動化された、完全に閉じたトランスフェクションが提供される。コクーン（商標）システムで細胞を濃縮する方法を使用することができる。

【0385】

実施例４－造血幹細胞の拡大
[00413]ＣＤ３４＋は、臍帯血の拡大に焦点を置かれた。この特定の用途は、単一の十分に一致した臍帯を成人の治療に使用するために、低いＣＤ３４＋数を含む臍帯血試料由来のＣＤ３４＋の拡大であった。したがって、他の一部のプロトコールと比較して、開始の細胞数及び濃度は非常に低かった。開始の数及び濃度が大きくなると、細胞の拡大が小さくなることと予想される。

【0386】

[00414]選択され及び拡大されたＣＤ３４＋細胞
[00415]経時的に追跡される全有核細胞（ＴＮＣ）
[00416]開始の細胞濃度は、他の多くのプロトコールよりも低かった（０．１Ｍ細胞／ｍｌ）
[00417]細胞拡大は、回収プロトコールに基づいて変化することがわかった（図１９）。

【0387】

[00418]細胞表現型の変化は、培養期間中に追跡される
[00419]ＴＮＣの２５．３％は、１２日間の拡大後、ＣＤ３４＋である（図２０）。

【0388】

[00420]分化した細胞表現型を図２１に示す。図２２は、単一コロニーが多系統分化を形成し得ることを示す。

【0389】

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【0390】

[00421]本明細書に記載の方法及び用途に対する他の適切な修飾及び適応が、実施形態の範囲から逸脱することなく行われ得ることは、関連分野の当業者には容易に明らかである。

【0391】

[00422]特定の実施形態について本明細書において例示し及び説明したが、特許請求の範囲は、説明し及び図示した特定の形態又は部分の配置に限定されないことを理解されたい。本明細書において、例示的な実施形態が開示され、特定の用語が使用されているが、それらは一般的であり、説明的な意味でのみ使用され、限定の目的ではない。上記の教示に照らして、実施形態の修飾及び変形は可能である。したがって、実施形態は、具体的に説明したものとは他に実施し得ることを理解されたい。

【0392】

[00423]本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、又は特許出願の各々が参照により組み込まれることが具体的であり、個別に示されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

【0393】

好適な実施形態
本願発明の好適な実施形態は、以下の１～２６である。
１. （ａ）活性化試薬を用いて、免疫細胞培養物を活性化して、活性化免疫細胞培養物を生成し；
（ｂ）ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し；
（ｃ）形質導入された免疫細胞培養物を拡大し；
（ｄ）（ｃ）の拡大した免疫細胞培養物を濃縮し；及び
（ｅ）（ｄ）の濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成する
ことを含む、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法であって、拡大された免疫細胞培養物及び濃縮された免疫細胞培養物のいずれか又は両方を洗浄することをさらに含み、
（ａ）～（ｅ）は完全に密閉された細胞工学システムによって行われ、（ａ）～（ｅ）は遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成するプロセスを介して最適化される、自動化生成のための方法。
２. プロセスが自己調節プロセスであり、
（ａ）温度センサー、ｐＨセンサー、グルコースセンサー、酸素センサー、二酸化炭素センサー、及び光学密度センサーの１つ又は複数を用いてモニタリングし；並びに
（ｂ）モニタリングに基づいて、形質導入されたＴ細胞培養物の温度、ｐＨレベル、グルコースレベル、酸素レベル、二酸化炭素レベル、及び光学密度の１つ又は複数を調節する
ことを含む、実施形態１に記載の方法。
３. 少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１又は実施形態２に記載の方法。
４. 少なくとも約２０億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
５. 免疫細胞培養物がＴ細胞培養物である、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
６. Ｔ細胞培養物がキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物である、実施形態５に記載の方法。
７. ベクターがキメラ抗原受容体をコードする、実施形態６に記載の方法。
８. 免疫細胞培養物が末梢血単核細胞及び／又は精製Ｔ細胞を含む、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
９. 免疫細胞培養物が少なくとも１つのアクセサリー細胞を含む、実施形態１～８のいずれか一項に記載の方法。
１０. アクセサリー細胞が単球又は単球由来細胞を含む、実施形態９に記載の方法。
１１. アクセサリー細胞が、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含む、Ｔ細胞受容体に対する抗原を含む、実施形態９に記載の方法。
１２. 活性化試薬が抗体又は樹状細胞を含む、実施形態１～１１のいずれか一項に記載の方法。
１３. 抗体が表面に固定化されている、実施形態１２に記載の方法。
１４. 表面がビーズの表面である、実施形態１３に記載の方法。
１５. 抗体が可溶性抗体である、実施形態１２に記載の方法。
１６. 抗体が、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の少なくとも１つを含む、実施形態１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
１７. 形質導入が、ウイルス感染、エレクトロポレーション、膜破壊、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１８. ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスである、実施形態１～１７のいずれか一項に記載の方法。
１９. 形質導入が、細胞培養培地中でベクターを混合し、及び培地中のベクターを活性化された免疫細胞培養物に均一に送達することを含む、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。
２０. 拡大が、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄及びモニタリングの少なくとも１つ又は複数を含む、実施形態１～１９のいずれか一項に記載の方法。
２１. 形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが免疫細胞培養物に対して最適化される、実施形態２～２０のいずれか一項に記載の方法。
２２. 細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネントを通じて細胞培養培地を再循環させる、実施形態１～２１のいずれか一項に記載の方法。
２３. 細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）の間に、栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる、実施形態１～２２のいずれか一項に記載の方法。
２４. 細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルがステップ（ｃ）の間に減少する、実施形態２～２３のいずれか一項に記載の方法。
２５. 細胞工学システムが、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択のうちの１つ又は複数の複数回のラウンドを行うように構成されている、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。
２６. 濃縮が、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の方法。
２７. プロセスが、遠心分離又は濾過のパラメータを調節することをさらに含む、実施形態２６に記載の方法。
２８. 細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われる、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。
２９. ステップ（ａ）の後に、活性化された免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含む、実施形態１～２８のいずれか一項に記載の方法。
３０. 細胞工学システムが、前記方法を開始する前に、（ａ）の細胞培養物、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地を含む、実施形態１～２９のいずれか一項に記載の方法。
３１. （ａ）活性化試薬を用いて免疫細胞培養物を活性化して、活性化された免疫細胞培養物を生成し、活性化試薬及び活性化条件は、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の表現型を促進し；
（ｂ）ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し；
（ｃ）形質導入された免疫細胞培養物を拡大し；
（ｄ）（ｃ）の拡大された免疫細胞培養物を濃縮し；及び
（ｅ）（ｄ）の濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成する
ことを含む、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の好ましい表現型を促進する方法であって、（ａ）～（ｅ）は、完全に密閉された自動化細胞工学システムによって行われる、方法。
３２. 活性化試薬が抗体又は樹状細胞を含む、実施形態３１に記載の方法。
３３. 抗体が表面に固定化されている、実施形態３２に記載の方法。
３４. 表面がビーズの表面である、実施形態３３に記載の方法。
３５. 抗体が可溶性抗体である、実施形態３２に記載の方法。
３６. 抗体が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及び抗ＣＤ２抗体の少なくとも１つを含む、実施形態３２～３５のいずれか一項に記載の方法。
３７. 可溶性抗体がＯＫＴ３である、実施形態３６に記載の方法。
３８. 活性化条件が、活性化試薬と免疫細胞培養物との間の安定した接触を可能にする実質的に妨害されていない免疫細胞培養物を提供する、実施形態３１～３７のいずれか一項に記載の方法。
３９. 少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態３１～３８のいずれか一項に記載の方法。
４０. 少なくとも約２０億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態３９に記載の方法。
４１. 免疫細胞培養物がＴ細胞培養物である、実施形態３１～４０のいずれか一項に記載の方法。
４２. Ｔ細胞培養物がキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物である、実施形態４１に記載の方法。
４３. ベクターがキメラ抗原受容体をコードする、実施形態４２に記載の方法。
４４. 免疫細胞培養物が末梢血単核細胞及び／又は精製Ｔ細胞を含む、実施形態３１～４３のいずれか一項に記載の方法。
４５. 細胞培養物が少なくとも１つのアクセサリー細胞を含む、実施形態３１～４４のいずれか一項に記載の方法。
４６. アクセサリー細胞が単球又は単球由来細胞を含む、実施形態４５に記載の方法。
４７. アクセサリー細胞が、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含む、Ｔ細胞受容体に対する抗原を含む、実施形態４５に記載の方法。
４８. Ｔ細胞培養物の表現型が、約０．１：１～約１０：１のＣＤ８＋細胞：ＣＤ４＋比を有する、実施形態４１～４７のいずれか一項に記載の方法。
４９. 形質導入が、ウイルス感染、エレクトロポレーション、膜破壊、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態３１～４８のいずれか一項に記載の方法。
５０. ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスである、実施形態３１～４９のいずれか一項に記載の方法。
５１. 形質導入が、細胞培養培地中でベクターを混合し、及び培地中のベクターを活性化された免疫細胞培養物に均一に送達することを含む、実施形態３１～５０のいずれか一項に記載の方法。
５２. 拡大が、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄及びモニタリングの少なくとも１つ又は複数を含む、実施形態３１～５１のいずれか一項に記載の方法。
５３. 形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが、促進された表現型に対して最適化される、実施形態３１～５２のいずれか一項に記載の方法。
５４. 細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネントを通じて細胞培養培地を再循環させる、実施形態３１～５３のいずれか一項に記載の方法。
５５. 細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）の間に、栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる、実施形態３１～５４のいずれか一項に記載の方法。
５６. 細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルがステップ（ｃ）の間に減少する、実施形態３１～５５のいずれか一項に記載の方法。
５７. 細胞工学システムが、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択の複数回のラウンドを行うように構成されている、実施形態３１～５６のいずれか一項に記載の方法。
５８. 濃縮が、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む、実施形態３１～５７のいずれか一項に記載の方法。
５９. 細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われる、実施形態３１～５８のいずれか一項に記載の方法。
６０. ステップ（ａ）の後に、活性化された免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含む、実施形態３１～５９のいずれか一項に記載の方法。
６１. （ｂ）における形質導入後にベクターを除去することをさらに含む、実施形態３１～６０のいずれか一項に記載の方法。
６２. 細胞工学システムが、前記方法を開始する前に、（ａ）の細胞培養物、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地を含む、実施形態３１～６１のいずれか一項に記載の方法。
６３. （ａ）活性化試薬を用いて免疫細胞培養物を活性化して、活性化された免疫細胞培養物を生成し；
（ｂ）ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し；
（ｃ）形質導入された免疫細胞培養物を拡大し；
（ｄ）（ｃ）の拡大された免疫細胞培養を濃縮し；及び
（ｅ）（ｄ）の濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成する
ことを含む、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法であって、
（ａ）～（ｅ）は、完全に密閉された自動化細胞工学システムによって行われ、及び
（ａ）～（ｅ）の各々は、最適化された細胞密度（細胞／ｍＬ）及び最適化された細胞密集度（細胞／ｃｍ^２）を有する免疫細胞培養物を用いて行われる、自動化生成のための方法。
６４. （ａ）の最適化された細胞密度が約０．０５×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬである、実施形態６３に記載の方法。
６５. （ａ）の最適化された細胞密集度が約０．１×１０^６細胞／ｃｍ^２～約６０×１０^６細胞／ｃｍ^２である、実施形態６３又は実施形態６４に記載の方法。
６６. 活性化試薬が抗体又は樹状細胞を含む、実施形態６３～６５のいずれか一項に記載の方法。
６７. 抗体が表面に固定化されている、実施形態６６に記載の方法。
６８. 表面がビーズの表面である、実施形態６７に記載の方法。
６９. 抗体が可溶性抗体である、実施形態６６に記載の方法。
７０. 抗体が、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の少なくとも１つを含む、実施形態６６～６９のいずれか一項に記載の方法。
７１. 少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態６３～７０のいずれか一項に記載の方法。
７２. 少なくとも約２０億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態６３～７１のいずれか一項に記載の方法。
７３. 免疫細胞培養物がＴ細胞培養物である、実施形態６３～７２のいずれか一項に記載の方法。
７４. Ｔ細胞培養物がキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物である、実施形態７３に記載の方法。
７５. ベクターがキメラ抗原受容体をコードする、実施形態７４に記載の方法。
７６. 免疫細胞培養物が末梢血単核細胞及び／又は精製Ｔ細胞を含む、実施形態６４～７５のいずれか一項に記載の方法。
７７. 細胞培養物が少なくとも１つのアクセサリー細胞を含む、実施形態６４～７６のいずれか一項に記載の方法。
７８. アクセサリー細胞が単球を含む、実施形態７７に記載の方法。
７９. アクセサリー細胞が、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含む、Ｔ細胞受容体に対する抗原を含む、実施形態７７に記載の方法。
８０. 形質導入が、ウイルス感染、エレクトロポレーション、膜破壊、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態６３～７９のいずれか一項に記載の方法。
８１. ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスである、実施形態６３～８０のいずれか一項に記載の方法。
８２. 形質導入が、細胞培養培地中でベクターを混合し、及び培地中のベクターを活性化された免疫細胞培養物に均一に送達することを含む、実施形態６３～８１のいずれか一項に記載の方法。
８３. 拡大が、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択の少なくとも１つ又は複数を含む、実施形態６３～８２のいずれか一項に記載の方法。
８４. 形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが、細胞密度及び細胞密集度に対して最適化される、実施形態６３～８３のいずれか一項に記載の方法。
８５. 細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）の１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネントを通じて細胞培養培地を再循環させる、実施形態６３～８４のいずれか一項に記載の方法。
８６. 酸素再循環が、ステップ（ａ）～（ｃ）の間にシリコーンチューブによって提供される、実施形態８５に記載の方法。
８７. 細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）の間に栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる、実施形態６３～８６のいずれか一項に記載の方法。
８８. 細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルがステップ（ｃ）の間に減少する、実施形態６３～８７のいずれか一項に記載の方法。
８９. 栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスの再循環が、約０．０５×１０^６細胞／ｍＬ～約６０×１０^６細胞／ｍＬの密度、及び約０．１×１０^６細胞／ｃｍ^２～約６０×１０^６細胞／ｃｍ^２の密集度を有する細胞を用いて均一に提供される、実施形態６３～８８のいずれか一項に記載の方法。
９０. 細胞工学システムが、形質導入された免疫細胞培養物の複数回のラウンドの供給、洗浄、モニタリング、及び選択を行うように構成されている、実施形態６３～８９のいずれか一項に記載の方法。
９１. 濃縮が、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む、実施形態６３～９０のいずれか一項に記載の方法。
９２. 細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われる、実施形態６３～９１のいずれか一項に記載の方法。
９３. ステップ（ａ）の後に、活性化された免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含む、実施形態６３～９２のいずれか一項に記載の方法。
９４. （ｂ）における形質導入後にベクターを除去することをさらに含む、実施形態６３～９３のいずれか一項に記載の方法。
９５. 細胞工学システムが、前記方法を開始する前に、（ａ）の細胞培養物、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地を含む、実施形態６３～９４のいずれか一項に記載の方法。
９６. （ａ）活性化試薬を用いて免疫細胞培養物を活性化して、活性化された免疫細胞培養物を生成し；
（ｂ）ベクターを用いて、活性化された免疫細胞培養物を形質導入して、形質導入された免疫細胞培養物を生成し；
（ｃ）形質導入された免疫細胞培養物を拡大し、形質導入された細胞培養物は拡大中に振とうされない。
（ｄ）（ｃ）の拡大された免疫細胞培養物を濃縮し；及び
（ｅ）（ｄ）の濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された免疫細胞培養物を生成する
ことを含む、遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法であって、（ａ）～（ｅ）は、完全に密閉された自動化細胞工学システムによって行われる、自動化生成のための方法。
９７. 活性化試薬が抗体又は樹状細胞を含む、実施形態９６に記載の方法。
９８. 抗体が表面に固定化されている、実施形態９７に記載の方法。
９９. 表面がビーズの表面である、実施形態９８に記載の方法。
１００. 抗体が可溶性抗体である、実施形態９７に記載の方法。
１０１. 抗体が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及び抗ＣＤ２抗体の少なくとも１つを含む、実施形態９６～１００のいずれか一項に記載の方法。
１０２. 少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態９６～１０１のいずれか一項に記載の方法。
１０３. 少なくとも約２０億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１０２に記載の方法。
１０４. 免疫細胞培養物がＴ細胞培養物である、実施形態９６～１０３のいずれか一項に記載の方法。
１０５. Ｔ細胞培養物がキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物である、実施形態１０４に記載の方法。
１０６. ベクターがキメラ抗原受容体をコードする、実施形態１０５に記載の方法。
１０７. 免疫細胞培養物が末梢血単核細胞及び／又は精製Ｔ細胞を含む、実施形態９６～１０６のいずれか一項に記載の方法。
１０８. 細胞培養物が少なくとも１つのアクセサリー細胞を含む、実施形態９６～１０７のいずれか一項に記載の方法。
１０９. アクセサリー細胞が単球又は単球由来細胞を含む、実施形態１０８に記載の方法。
１１０. アクセサリー細胞が、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ２、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含む、Ｔ細胞受容体に対する抗原を含む、実施形態１０９に記載の方法。
１１１. 形質導入が、ウイルス感染、エレクトロポレーション、膜破壊、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態９６～１１０のいずれか一項に記載の方法。
１１２. ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスである、実施形態９６～１１１のいずれか一項に記載の方法。
１１３. 形質導入が、細胞培養培地中でベクターを混合し、及び培地中のベクターを活性化された免疫細胞培養物に均一に送達することを含む、実施形態９６～１１２のいずれか一項に記載の方法。
１１４. 拡大が、免疫細胞培養物を振とうすることなしに、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択の少なくとも１つ又は複数を含む、実施形態９６～１１３のいずれか一項に記載の方法。
１１５. 形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが免疫細胞培養物に対して最適化される、実施形態９６～１１４のいずれか一項に記載の方法。
１１６. 細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネントを通じて細胞培養培地を再循環させる、実施形態９６～１１５のいずれか一項に記載の方法。
１１７. 細胞工学システムが、栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる、実施形態９６～１１６のいずれか一項に記載の方法。
１１８. 細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルがステップ（ｃ）の間に減少する、実施形態９６～１１７のいずれか一項に記載の方法。
１１９. 細胞工学システムが、形質導入された免疫細胞培養物の複数回のラウンドの供給、洗浄、モニタリング、及び選択を行うように構成されている、実施形態９６～１１８のいずれか一項に記載の方法。
１２０. 濃縮が、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む、実施形態９６～１１９のいずれか一項に記載の方法。
１２１. 細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われる、実施形態９６～１２０のいずれか一項に記載の方法。
１２２. ステップ（ａ）の後に、活性化された免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含む、実施形態９６～１２１のいずれか一項に記載の方法。
１２３. （ｂ）における形質導入後にベクターを除去することをさらに含む、実施形態９６～１２２のいずれか一項に記載の方法。
１２４. 細胞工学システムが、前記方法を開始する前に、（ａ）の細胞培養物、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地を含む、実施形態９６～１２３のいずれか一項に記載の方法。
１２５. 遺伝子修飾された免疫細胞培養物の自動化生成のための方法であって、細胞工学システムによって行われる前記方法は、
（ａ）活性化試薬を用いて免疫細胞培養物を活性化して、細胞工学システムの第１のチャンバーで活性化された免疫細胞培養物を生成し；
（ｂ）活性化された免疫細胞培養物を形質導入し、形質導入が、
ｉ．活性化された免疫細胞培養物を第１のチャンバーからエレクトロポレーションユニットに移し；
ｉｉ．活性化された免疫細胞培養物をベクターでエレクトロポレーションして、形質導入された免疫細胞培養物を生成し；
ｉｉｉ．形質導入された免疫細胞培養物を細胞工学システムの第２のチャンバーに移す
ことを含み；
（ｃ）形質導入された免疫細胞培養物を拡大し；
（ｄ）（ｃ）の拡大した免疫細胞培養物を濃縮し；及び
（ｅ）（ｄ）の濃縮された免疫細胞培養物を回収して、遺伝子修飾された細胞培養物を生成する
ことを含む、自動化生成のための方法。
１２６. 形質導入が、
ｉ．第１の無菌の閉じた接続部を介して、活性化された免疫細胞培養物を第１のチャンバーからエレクトロポレーションユニットに移し；
ｉｉ．活性化された免疫細胞培養物をベクターでエレクトロポレーションして、形質導入された免疫細胞培養物を生成し；
ｉｉｉ．第２の無菌の閉じた接続部を介して、形質導入された免疫細胞培養物を細胞工学システムの第２のチャンバーに移す
ことを含む、実施形態１２５に記載の方法。
１２７. エレクトロポレーションユニットが細胞工学システムの外部に位置される、実施形態１２６に記載の方法。
１２８. 少なくとも約１億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１２５～１２７のいずれか一項に記載の方法。
１２９. 少なくとも約２０億個の生存可能な遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１２８に記載の方法。
１３０. 免疫細胞培養物がＴ細胞培養物である、実施形態１２５～１２９のいずれか一項に記載の方法。
１３１. Ｔ細胞培養物がキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ Ｔ）細胞培養物である、実施形態１３０に記載の方法。
１３２. ベクターがキメラ抗原受容体をコードする、実施形態１３１に記載の方法。
１３３. 免疫細胞培養物が末梢血単核細胞及び／又は精製Ｔ細胞を含む、実施形態１２５～１３２のいずれか一項に記載の方法。
１３４. 細胞培養物が少なくとも１つのアクセサリー細胞を含む、実施形態１２５～１３２のいずれか一項に記載の方法。
１３５. アクセサリー細胞が単球又は単球由来細胞を含む、実施形態１３４に記載の方法。
１３６. アクセサリー細胞が、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ及び／又はＩＣＯＳを含む、Ｔ細胞受容体に対する抗原を含む、実施形態１３４に記載の方法。
１３７. 活性化試薬が抗体又は樹状細胞を含む、実施形態１２５～１３６のいずれか一項に記載の方法。
１３８. 抗体が表面に固定化されている、実施形態１３７に記載の方法。
１３９. 表面がビーズの表面である、実施形態１３８に記載の方法。
１４０. 抗体が可溶性抗体である、実施形態１３７に記載の方法。
１４１. 抗体が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体及び抗ＣＤ２抗体の少なくとも１つを含む、実施形態１３８～１４０のいずれか一項に記載の方法。
１４２. ベクターがレンチウイルスベクター又はレトロウイルスである、実施形態１２５～１４１のいずれか一項に記載の方法。
１４３. 拡大が、形質導入された免疫細胞培養物の供給、洗浄、モニタリング、及び選択のうちの少なくとも１つ又は複数を含む、実施形態１２５～１４２のいずれか一項に記載の方法。
１４４. 形質導入された免疫細胞培養物の酸素レベルが免疫細胞培養物に対して最適化される、実施形態１２５～１４３のいずれか一項に記載の方法。
１４５. 細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）のうちの１つ又は複数の間に酸素供給コンポーネントを通じて細胞培養培地を再循環させる、実施形態１２５～１４４のいずれか一項に記載の方法。
１４６. 細胞工学システムが、ステップ（ａ）～（ｅ）の間に、栄養素、老廃物、放出されたサイトカイン、及び／又は溶解ガスを再循環させる、実施形態１２５～１４５のいずれか一項に記載の方法。
１４７. 細胞工学システムによって提供される二酸化炭素レベルがステップ（ｃ）の間に減少する、実施形態１２５～１４６のいずれか一項に記載の方法。
１４８. 細胞工学システムが、形質導入された免疫細胞培養物の複数回のラウンドの供給、洗浄、モニタリング、及び選択を行うように構成されている、実施形態１２５～１４７のいずれか一項に記載の方法。
１４９. 濃縮が、遠心分離、沈降後の上清除去、又は濾過を含む、実施形態１２５～１４８のいずれか一項に記載の方法。
１５０. 細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われる、実施形態１２５～１４９のいずれか一項に記載の方法。
１５１. ステップ（ａ）の後に、活性化された免疫細胞培養物から活性化試薬を除去することをさらに含む、実施形態１２５～１５０のいずれか一項に記載の方法。
１５２. （ｂ）における形質導入後にベクターを除去することをさらに含む、実施形態１２５～１５１のいずれか一項に記載の方法。
１５３. 細胞工学システムが、前記方法を開始する前に、（ａ）の細胞培養物、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地を含む、実施形態１２５～１５２のいずれか一項に記載の方法。
１５４. 前記方法のステップ（ｃ）における形質導入効率が、細胞培養に柔軟性であり、ガス透過性のバッグを利用する方法の形質導入効率よりも少なくとも２０％高い、実施形態１～１５３のいずれか一項に記載の方法。
１５５. 柔軟性であり、ガス透過性のバッグを用いた手動の細胞培養を利用する方法よりも少なくとも２０％多く、遺伝子修飾された免疫細胞を生成する、実施形態１～１５４のいずれか一項に記載の方法。
１５６. 細胞工学システムが複数のチャンバーを含み、ステップ（ａ）～（ｅ）の各々が細胞工学システムの複数のチャンバーの異なるチャンバーにおいて行われ、（ａ）の各々、活性化試薬、ベクター、及び細胞培養培地は、前記方法を開始する前に複数のチャンバーの異なるチャンバーに含まれ、複数のチャンバーの少なくとも１つが細胞を増殖させる温度で維持され、複数のチャンバーの少なくとも１つが冷蔵温度に維持される、実施形態１～１５５のいずれか一項に記載の方法。
１５７. （ａ）細胞培養培地を保存するための低温チャンバー；
（ｂ）免疫細胞培養物の活性化、形質導入及び拡大を行うための高温チャンバー、
高温チャンバーは熱障壁によって低温チャンバーから分離されて、
高温チャンバーは細胞培養チャンバーを含み；及び
（ｃ）細胞培養チャンバーに接続された１つ又は複数の流動経路、前記流動経路は、細胞培養チャンバー内の細胞を乱すことなしに、再循環、老廃物の除去、均一なガス交換及び細胞培養チャンバーへの栄養の分配を提供する
を含む、自動化細胞工学システムにおいて使用するカセット。
１５８. 細胞培養チャンバーが、低いチャンバー高を有する平坦であり、柔軟性がないチャンバーである、実施形態１５７に記載のカセット。
１５９. 免疫細胞培養物が細胞培養チャンバーの底部全体に広がることを可能にするように、細胞培養チャンバーが配向されている、実施形態１５７又は実施形態１５８に記載のカセット。
１６０. 細胞培養物、培養培地、活性化試薬、及びベクターで予め充填されている、実施形態１５７～１５９のいずれか一項に記載のカセット。
１６１. ｐＨセンサー、グルコースセンサー、酸素センサー、二酸化炭素センサー、及び／又は光学密度センサーのうちの１つ又は複数をさらに含む、実施形態１５７～１６０のいずれか一項に記載のカセット。
１６２. １つ又は複数のサンプリングポート及び／又は注入ポートをさらに含む、実施形態１５７～１６１のいずれか一項に記載のカセット。
１６３. 細胞培養チャンバーが
細胞培養チャンバーからの気泡の除去を可能にするように構成された、及び／又は再循環ポートとしての遠位ポート；
再循環入口ポートとして機能するように構成された中間ポート；並びに
細胞除去のための排出ポートとして機能するように構成された近位ポート
の少なくとも１つをさらに含む、実施形態１５７～１６２のいずれか一項に記載のカセット。
１６４. カートリッジを外部デバイスに接続するためのアクセスポートをさらに含む、実施形態１５７～１６３のいずれか一項に記載のカセット。
１６５. 外部デバイスがエレクトロポレーションユニット又は追加の培地源を含む、実施形態１６４に記載のカセット。
１６６. （ａ）免疫細胞培養物を収容するように構成されたチャンバー体積を有する免疫細胞培養物の活性化、形質導入及び／又は拡大を行うための細胞培養チャンバー、
（ｂ）免疫細胞培養物を収容せずに、培地及び他の作業流体に追加の体積を提供することにより、チャンバーの作業体積を増加させるためのサテライト体積
を含む、自動化細胞工学システムにおいて使用するカセットであって、サテライト体積は、免疫細胞培養物を乱すことなく、培地が培養チャンバーと交換されるように、１つ又は複数の流体経路を介して細胞培養チャンバーに流体接続される、カセット。
１６７. サテライト体積がバッグである、実施形態１６６に記載のカセット。
１６８. サテライト体積が非変形性チャンバーである、実施形態１６６に記載のカセット。
１６９. サテライト体積が、免疫細胞培養物の細胞を失うことなく、培地除去を可能にするようにさらに構成されている、実施形態１６６～１６８のいずれか一項に記載のカセット。
１７０. クロスフローリザーバーをさらに含む、実施形態１６６～１６９のいずれか一項に記載のカセット。
１７１. 細胞培養チャンバーが約０．５０ｍｌ～約３００ｍｌの体積を有する、実施形態１６６～１７０のいずれか一項に記載のカセット。
１７２. 細胞培養チャンバーが約５０ｍｌ～約２００ｍｌの間の体積を有する、実施形態１７１に記載のカセット。
１７３. 細胞培養チャンバーが約１８０ｍｌの体積を有する、実施形態１７２に記載のカセット。
１７４. サテライト体積が約０．５０ｍｌ～約３００ｍｌの間である、実施形態１６６～１７３のいずれか一項に記載のカセット。
１７５. サテライト体積が約１５０ｍｌ～約２００ｍｌの間である、実施形態１７４に記載のカセット。
１７６. クロスフローリザーバーが約０．５０ｍｌ～約３００ｍｌの間の体積を有する、実施形態１６６～１７５のいずれか一項に記載のカセット。
１７７. クロスフローリザーバーが約１００ｍｌ～約１５０ｍｌの間の体積を有する、実施形態１７６に記載のカセット。
１７８. 作業体積が約１８０ｍＬ～約１Ｌである、実施形態１６６～１７７のいずれか一項に記載のカセット。
１７９. 作業体積が約１８０ｍＬ～約４６０ｍＬである、実施形態１７８に記載のカセット。
１８０. １つ又は複数の流体経路が、チューブ構成要素を通じて酸素供給を可能にするシリコーンベースのチューブ構成要素を含む、実施形態１５７～１７９のいずれか一項に記載のカセット。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6DE】

【図6F】

【図6G】

【図6H】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図13E】

【図13F】

【図13G】

【図13H】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図14E】

【図14F】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図15D】

【図15E】

【図15F】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】