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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-16
(45)【発行日】2023-10-24
(54)【発明の名称】抗腫瘍抗原ナノボディ及びその核酸コード配列、並びにその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20231017BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20231017BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20231017BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231017BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20231017BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20231017BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20231017BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20231017BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20231017BHJP
C12Q 1/04 20060101ALN20231017BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
A61P35/00
A61K39/395 N
G01N33/53 D
G01N33/531 A
C12N15/62 Z
C07K16/46
C12P21/08
C12Q1/04
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2022046582
(22)【出願日】2022-03-23
(65)【公開番号】P2022151798
(43)【公開日】2022-10-07
【審査請求日】2022-03-23
(31)【優先権主張番号】63/165,266
(32)【優先日】2021-03-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】17/692,599
(32)【優先日】2022-03-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】516144245
【氏名又は名称】中國醫藥大學附設醫院
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
(74)【代理人】
【識別番号】110002066
【氏名又は名称】弁理士法人筒井国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】周 徳陽
(72)【発明者】
【氏名】邱 紹智
(72)【発明者】
【氏名】黄 士維
(72)【発明者】
【氏名】潘 志明
(72)【発明者】
【氏名】陳 美智
(72)【発明者】
【氏名】林 育全
(72)【発明者】
【氏名】陳 曄
【審査官】飯濱 翔太郎
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／０６９１３３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】MEDCHEM NEWS，2017年，27，35-41
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ｇ０１Ｎ ３３／５３
Ｇ０１Ｎ ３３／５３１
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
Ｃ１２Ｑ １／０４
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト白血球抗原－Ｇ（human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ）に特異的に結合する抗腫瘍抗原ナノボディであって、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３からなる群から選ばれるアミノ酸配列であることを特徴とする、
抗腫瘍抗原ナノボディ。
【請求項2】
前記ＨＬＡ－Ｇと前記ＨＬＡ－Ｇの受容体との相互作用及び／又は結合を遮断し、前記受容体は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体の２つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部４（killer cell immunoglobulin like receptor、two Ig domains and long cytoplasmic tail ４、ＫＩＲ２ＤＬ４）、又は白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1、ＬＩＬＲＢ１）であることを特徴とする、
請求項１に記載の抗腫瘍抗原ナノボディ。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の抗腫瘍抗原ナノボディのアミノ酸配列をコードする単離された核酸であって、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
単離された核酸。
【請求項4】
請求項１又は２に記載の抗腫瘍抗原ナノボディ、及び医薬上許容可能な担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項5】
がん及び免疫関連疾患を治療するための医薬品を製造するための請求項１又は２に記載の抗腫瘍抗原ナノボディの使用。
【請求項6】
サンプルに請求項１又は２に記載の抗腫瘍抗原ナノボディを添加することを含み、前記サンプルは、血液、尿液、痰液、唾液又は体液であることを特徴とする、
ＨＬＡ－Ｇの発現レベルを検出するための方法。
【請求項7】
請求項１に記載の抗腫瘍抗原ナノボディと、フラグメント結晶化可能領域（fragment crystallizable region、Fc region）とを含み、
前記抗腫瘍抗原ナノボディは、前記フラグメント結晶化可能領域と共役していることを特徴とする、
抗体共役物。
【請求項8】
請求項１に記載の抗腫瘍抗原ナノボディと、第２の抗体とを含み、
前記抗腫瘍抗原ナノボディと前記第２の抗体との共役により、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager、ＢｉＴＥ）、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（triple specific T-cell engager、ＴｒｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（bispecific killer cell enager、ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（triple specific killer cell engager、ＴｒｉＫＥ）、又は任意の二重特異性抗体を形成することを特徴とする、
抗体共役物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、抗腫瘍抗原ナノボディ及びその核酸コード配列、並びにその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
がんは、悪性腫瘍とも呼ばれ、細胞の分裂・増殖の制御機能不全による疾患であり、細胞が異常に増殖し、また、異常増殖した細胞が体の他の部分に侵入可能である。世界中でがん患者がどんどん増加しており、台湾でも死因トップ１０の１つであり、かつ、長年に死因トップ１０の１位を占めている。
【0003】
従来の腫瘍治療方法は、外科手術、放射線療法、化学療法及び標的療法等が挙げられる。腫瘍免疫治療は、上記の治療法以外の腫瘍を治療する方法であり、患者自身の免疫系を活性化させ、腫瘍細胞又は腫瘍抗原物質を利用して生体の特異的細胞性免疫及び体液性免疫反応を誘導し、生体の抗がん能力を高め、腫瘍の成長、拡散、再発を抑制することで、腫瘍の除去又は制御という目的を達成することができる。しかしながら、現在の腫瘍治療方法は、効果が低く、副作用が強いという問題があり、他の免疫関連疾患を引き起こすことさえ可能性がある。
【0004】
ヒト白血球抗原－Ｇ（human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ）は、様々な固形腫瘍において大量に発見され、免疫細胞を抑制する特性を持つため、腫瘍を特定する標的分子として用いられ、抗がん剤として利用する可能性が検討されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記の問題を解決するために、当業者は、がん及び免疫関連疾患をより効果的に治療することができる新規な医薬品を研究開発している。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記を鑑み、本発明は、ヒト白血球抗原－Ｇ（human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ）に特異的に結合する抗腫瘍抗原ナノボディを提供することを目的とする。前記抗腫瘍抗原ナノボディは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及びそれらの任意の組み合わせから選ばれるアミノ酸配列を含む。
【0007】
本発明の１つの実施例において、前記アミノ酸配列は、前記抗腫瘍抗原ナノボディの重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）のアミノ酸配列である。
【0008】
本発明の１つの実施例において、前記抗腫瘍抗原ナノボディは、フラグメント結晶化可能領域（fragment crystallizable region、Fc region）に共役される。
【0009】
本発明の１つの実施例において、前記抗腫瘍抗原ナノボディは、第２の抗体に共役されることにより、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager、ＢｉＴＥ）、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（triple specific T-cell engager、ＴｒｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（bispecific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（triple specific killer cell engager、ＴｒｉＫＥ）、又は任意の二重特異性抗体を形成する。
【0010】
本発明の１つの実施例において、前記抗腫瘍抗原ナノボディは、前記ＨＬＡ－Ｇと前記ＨＬＡ－Ｇの受容体との相互作用及び／又は結合を遮断する。
【0011】
本発明の１つの実施例において、前記受容体は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体の２つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部４（killer cell immunoglobulin like receptor、two Ig domains and long cytoplasmic tail 4、ＫＩＲ２ＤＬ４）、又は白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1、ＬＩＬＲＢ１）である。
【0012】
また、本発明のもう１つの目的は、前記抗腫瘍抗原ナノボディのアミノ酸配列をコードする単離された核酸を提供することである。前記単離された核酸は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む。
【0013】
また、本発明のもう１つの目的は、前記抗腫瘍抗原ナノボディ及び医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物を提供することである。
【0014】
また、本発明のもう１つの目的は、がん及び免疫関連疾患を治療するための医薬品を製造するための前記抗腫瘍抗原ナノボディの使用を提供することである。
【0015】
また、本発明のもう１つの目的は、サンプルに前記抗腫瘍抗原ナノボディを投与することを含む、ＨＬＡ－Ｇの発現レベルを検出するための方法を提供することである。
【0016】
本発明の１つの実施例において、前記サンプルは、血液、尿液、痰液、唾液又は体液である。
【発明の効果】
【0017】
上記をまとめると、本発明の抗腫瘍抗原ナノボディの効果は、以下の通りである。
【0018】
競合酵素結合免疫吸着アッセイ（competitive enzyme linked immunosorbent assay、competitive ＥＬＩＳＡ）により、ＨＬＡ－ＧナノボディがＩＣ５０である５０％阻害濃度において、ＨＬＡ－Ｇとその受容体であるキラー細胞免疫グロブリン様受容体の２つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部４（killer cell immunoglobulin like receptor、two Ig domains and long cytoplasmic tail 4、ＫＩＲ２ＤＬ４）並びに白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1、ＬＩＬＲＢ１）との相互作用を遮断すること、及び、ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対するナチュラルキラー細胞（natural killer cell、ＮＫ cell）の細胞溶解（cytolysis）作用及び細胞毒性を向上させることを証明し、
ウエスタンブロッティング（Western blotting）により、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディがヒトがん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ５４９の細胞溶解物中のＨＬＡ－Ｇタンパク質を特定できることを証明し、
フローサイトメトリー（flow cytometric analysis）及び免疫細胞化学の分析により、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディが細胞膜上のＨＬＡ－Ｇタンパク質を特定できること、ＨＬＡ－Ｇの発現及び細胞膜マーカーであるＰａｎ－カドヘリン（Pan-Cadherin）がＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ５４９細胞に共局在していることを証明し、及び、
免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、ＩＨＣ staining）により、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体がＨＬＡ－Ｇの発現を検出するために用いられることを証明する。
ウエスタンブロッティング（Western blotting）により、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディがヒトがん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ５４９の細胞溶解物中のＨＬＡ－Ｇタンパク質を特定できることを証明し、
フローサイトメトリー（flow cytometric analysis）及び免疫細胞化学の分析により、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディが細胞膜上のＨＬＡ－Ｇタンパク質を特定できること、ＨＬＡ－Ｇの発現及び細胞膜マーカーであるＰａｎ－カドヘリン（Pan-Cadherin）がＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ５４９細胞に共局在していることを証明し、及び、
免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、ＩＨＣ staining）により、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体がＨＬＡ－Ｇの発現を検出するために用いられることを証明する。
【0019】
上記効果によれば、がん及び免疫関連疾患を治療する効果を達成する。特に、従来の抗体は、遺伝子をベクターによって細胞にトランスフェクトしてから抗体の機能を発揮することができるため、収率が低くて効果が低いという欠点がある。本発明の抗腫瘍抗原ナノボディは、インビトロで大量に製造してそのまま投与すべき個体に投与して治療を行うことができる。なお、本発明によれば、ＨＬＡ－Ｇの発現レベルを検出できる効果も達成することができる。
【0020】
以下、本発明の実施形態についてさらに説明する。下記の実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、改良や変更することができる。よって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲を基準とすべきである。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】図１Ａ～図１Ｈは、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（competitive enzyme linked immunosorbent assay、competitive ＥＬＩＳＡ）によって抗ＨＬＡ－ＧナノボディのＨＬＡ－Ｇ／キラー細胞免疫グロブリン様受容体の２つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部４（killer cell immunoglobulin like receptor、two Ig domains and long cytoplasmic tail 4、ＫＩＲ２ＤＬ４）又は白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1、ＬＩＬＲＢ１）の軸遮断を測定する結果を示す。ＬＩＬＲＢ１は、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1）を示し、ＫＩＲ２ＤＬ４は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体の２つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部４（killer cell immunoglobulin like receptor、two Ig domains and long cytoplasmic tail 4）を示し、ｎｂは、ナノボディ（nanobody）を示し、８７Ｇは、市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体を示す。
【図2】抗ＨＬＡ－Ｇナノボディによるヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対するナチュラルキラー細胞（natural killer cell、ＮＫ cell）の細胞溶解（cytolysis）作用の向上効果を示すチャートである。ＨＬＡ－ＧｍＡＢ（８７Ｇ）は、市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体（８７Ｇ）を示す。
【図3A】抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのウエスタンブロッティングの結果を示す。使用される細胞株は、ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１であり、市販の抗体（commercial antibody）は、HLA-G(E8N9C)XP(R)Rabbit mAb#79769であり、上段の数字は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株の細胞溶解物（cell lysate）の量（μg）を示し、一次抗体（primary antibody）の濃度は、１ng/mlであり、市販の抗体パネルの二次抗体は、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（anti-rabbit-horseradish peroxidase、ａｎｔｉ－Ｒａｂ－ＨＲＰ）（１:１０００）であり、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディは、重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）ナノボディ（１ng/ml）であり、実験群（＃９、＃２０）の二次抗体は、抗ＶＨＨ－ＨＲＰ（１:１０００）である。
【図3B】抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのウエスタンブロッティングの結果を示す。使用される細胞株は、ヒト非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９であり、市販の抗体は、HLA-G(E8N9C)XP(R) Rabbit mAb#79769であり、上段の数字は、Ａ５４９細胞株の細胞溶解物の量（μg）を示し、一次抗体の濃度は、１ng/mlであり、市販の抗体パネルの二次抗体は、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（１:１０００）であり、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディは、重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）ナノボディ（１ng/ml）であり、実験群（＃９、＃２０）の二次抗体は、抗ＶＨＨ－ＨＲＰ（１:１０００）である。
【図4】抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのフローサイトメトリーの結果を示す。ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びヒト非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９の量は、１×１０6であり、市販の抗体（commercial Ab）は、ＰＥ（#12-9957-42）（抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体、１００μlのＰＢＳ溶液に０.２５μg添加した）及び８７Ｇであり、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディは、重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）ナノボディ（１００μlのＰＢＳ溶液に０.２５μg添加した）であり、二次抗体は、ウサギ抗ラクダＶＨＨ、ｉＦｌｕｏｒ５５５（rabbit anti-camelid VHH、ｉＦｌｕｏｒ５５５）（１００μlのＰＢＳ溶液に０.５μg添加した）であり、ＭＦＩは、平均蛍光強度（mean fluorescence intensity）を示し、unstainedは、未染色を示し、cloneは、クローン株を示す。
【図5】図５Ａ及び図５Ｂは、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの免疫細胞化学の分析結果を示す。図５Ａに使用される細胞株は、ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１である。図５Ｂに使用される細胞株は、ヒト非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９である。市販の抗体４Ｈ８４は、抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体であり、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの濃度は、１ng/mlであり、二次抗体は、抗ＶＨＨ－フルオレセイン（fluorescein、ＦＩＴＣ）（１:５０００）である。
【図6】抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの免疫組織化学的染色の結果を示す。使用されるサンプルは、ヒトの胎盤であり、市販の抗体は、４Ｈ８４（抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体）（#sc-21799）であり、濃度が２００μg/mlであり、作用濃度が４μg/mlである。市販の抗体パネルの二次抗体は、ヤギ抗ウサギＨＲＰであり、ＤＡＢは、ジアミノベンジジン（diaminobenzidine）（西洋ワサビペルオキシダーゼの最も感度が高く、最も使用される発色反応物である）を示し、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディは、重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）ナノボディ（作用濃度が４μg/mlである）であり、実験群（＃９）の抗体は、ウサギ抗ラクダＶＨＨ抗体（rabbit anti-camelid VHH antibody）と、ビオチン（biotin）（１００μlのＰＢＳ溶液に０.５μg添加した）と、ヤギ抗ウサギＨＲＰと、を含む。
【発明を実施するための形態】
【0022】
定義
本明細書に記載の数値は、概算値である。全ての実験データは、その数値の±２０％、好ましいは±１０％、より好ましくは±５％の範囲を示す。
本明細書に記載の数値は、概算値である。全ての実験データは、その数値の±２０％、好ましいは±１０％、より好ましくは±５％の範囲を示す。
【0023】
本明細書において、「抗ヒト白血球抗原－Ｇ（human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ）ナノボディ（nanobody、ＮＢ）」及び「抗腫瘍抗原ナノボディ」という用語は、相互交換可能に使用される。
【0024】
本明細書において、「第２の抗体」という用語は、ナノボディに共役されることにより、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（bispecific T-cell engager、ＢｉＴＥ）、三重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（triple specific T-cell engager、ＴｒｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（bispecific killer cell engager、ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー（triple specific killer cell engager、ＴｒｉＫＥ）、又は任意の二重特異性抗体を形成することができる抗体を意味する。
【0025】
好ましくは、前記第２の抗体は、抗ＣＤ３ε、ＣＤ３、プログラム細胞死リガンド１（programmed cell death ligand 1、ＰＤ－Ｌ１）、プログラム細胞死リガンド２（programmed cell death ligand 2、ＰＤ－Ｌ２）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3、Ｔｉｍ３）、表皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor、ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ヒト表皮成長因子受容体２（human epidermal growth factor receptor 2、Ｈｅｒ２）、Ｂ細胞成熟抗原（B-cell maturation antigen、ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３４、ＣＤ１６、Ｆｃ、上皮細胞接着分子（epithelial cell adhesion molecule、ＥｐＣＡＭ）、メソテリン（mesothelin）、ニューヨーク食道扁平上皮細胞がん－１（New York esophageal squamous cell carcinoma-1、ＮＹ－ＥＳＯ－１）、糖タンパク質１００（glycoprotein 100、ｇｐ１００）、及びムチン１（Ｍｕｃ１）抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0026】
本明細書において、「治療（treating又はtreatment）」という用語は、疾患（disease）又は障害（disorder）の１つ又は複数の臨床徴候（clinical sign）を緩和（alleviating）、減少（reducing）、改善（ameliorating）、軽減（relieving）、又は制御（controlling）すること、及び治療中の病態（condition）又は症状（symptom）の重症度（severity）の進展（progression）を低下（lowering）、停止（stopping）又は逆転（reversing）させることを意味する。
【0027】
本発明に係る医薬品は、通常の知識に基づいて、非経口（parenterally）投与の剤形（dosage form）に製造されてもよい。前記非経口投与の剤形は、例えば、注射剤（injection）（例えば、滅菌水溶液（sterile aqueous solution）又は分散液（dispersion）、滅菌粉末（sterile powder）、錠剤（tablet）、トローチ剤（troche）、ロゼンジ剤（lozenge）、丸薬（pill）、カプセル（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）又は顆粒（granule）、溶液、懸濁液（suspension）、乳剤（emulsion）、シロップ（syrup）、エリキシル剤（elixir）、スラリー剤（slurry）及び類似のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【0028】
本発明に係る医薬品は、非経口経路（parenteral routes）で投与してもよい。前記非経口経路は、腹腔内注射（intraperitoneal injection）、皮下注射（subcutaneous injection）、表皮内注射（intraepidermal injection）、皮内注射（intradermal injection）、筋肉内注射（intramuscular injection）、静脈内注射（intravenous injection）及び病巣内注射（intralesional injection）からなる群から選ばれる。
【0029】
本発明に係る医薬品は、医薬上許容可能な担体を含んでもよい。前記医薬上許容可能な担体は、例えば、溶剤（solvent）、乳化剤（emulsifier）、懸濁化剤（suspending agent）、分解剤（decomposer）、結合剤（binding agent）、賦形剤（excipient）、安定剤（stabilizing agent）、キレート剤（chelating agent）、希釈剤（diluent）、ゲル化剤（gelling agent）、防腐剤（preservative）、滑剤（lubricant）、吸収遅延剤（absorption delaying agent）、リポソーム（liposome）及び類似のものからなる群から選ばれる１つ又は複数の試薬を含んでもよい。前記試薬の選用及び数量は、当業者の専門知識及び技術的範囲に属する。
【0030】
本発明に係る前記医薬上許容可能な担体は、溶剤を含んでもよい。前記溶剤は、水、生理食塩水（normal saline）、リン酸塩緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）、糖含有溶液、アルコール含有水溶液（aqueous solution containing alcohol）、及びそれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【0031】
本明細書において、「核酸」、「核酸配列」又は「核酸フラグメント」等の用語は、一本鎖又は二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド配列又はリボヌクレオチド配列を意味し、かつ、既知の天然に存在するヌクレオチド（naturally occurring nucleotides）又は人工の化学的模倣物を含む。本明細書において、「核酸」という用語は、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」と相互交換可能に使用される。
【実施例】
【0032】
実施例１．抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの製造
本実施例において、抗ヒト白血球抗原－Ｇ（human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ）ナノボディ（nanobody、ＮＢ）の製造プロセスは、以下の通りである。重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）の生成プロセスは、以下の通りである。
本実施例において、抗ヒト白血球抗原－Ｇ（human leukocyte antigen-G、ＨＬＡ－Ｇ）ナノボディ（nanobody、ＮＢ）の製造プロセスは、以下の通りである。重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）の生成プロセスは、以下の通りである。
【0033】
ＶＨＨ遺伝子は、発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（Ａｍｐ耐性）又はｐＳＢ－ｉｎｉｔ（ＣｍＲ耐性）に構築され、プラスミドは、制限エンドヌクレアーゼ消化及び配列決定によって同定される。１μLの同定されたプラスミド（約５０ng）をＢＬ２１（ＤＥ３）に添加し、３７℃で一晩作用させる。耐性含有ＬＢ培地に単一コロニーを接種し、３７℃、２２０r/minで一晩培養する。一晩培養したものを１:１００の比例で新鮮な耐性含有ＬＢ培地（１０Ｌ～２０Ｌ）に接種し、３７℃、２２０r/minで培養する。ＯＤ600が０.８に達すと、室温まで冷却する。
【0034】
最終濃度が０.１mMであるイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside、ＩＰＴＧ）を添加し、２０℃、２２０r/minで一晩誘導する。遠心分離（２０mM Tris ｐＨ８.０、１５０mM NaCl）によって細胞を破壊した後、細胞及び上清が得られる。フロースルー（flow-through）によって上清をＮｉ－ＮＴＡビーズ（１mL）に結合させる。
【0035】
適切な濃度勾配を有するイミダゾール（imidazole）（１０mM、２０mM、５０mM、１００mM、２５０mM、及び５００mM）を含有する緩衝液によってＮｉ－ＮＴＡビーズを溶出する。溶出部分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析する。タンパク質の純度と収量（イオン交換クロマトグラフィー又はゲル濾過クロマトグラフィー）に基づいて後の精製方法を決める。要件を満たすタンパク質をゲル濾過クロマトグラフィーで単離精製し、緩衝液をＰＢＳ緩衝液に置換する。ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の成分を分析し、要件を満たす成分を合併濃縮し、０.２２μmのフィルターで濾過して容器に詰める。その後、タンパク質を－２０℃以下で保存する。
【0036】
ナノボディは、大腸菌（E.coli）から生産及び精製される。ナノボディを生成するための大腸菌の生成方法として、文献Microb Cell Fact. 2019 Mar 11、18(1):47を参照することができる。要するに、大腸菌株ＨＢ２１５１を利用する。
【0037】
アンピシリン（ampicillin）耐性をコードするプラスミドｐＥＴ（Creative Biolab）は、細胞質タンパク質の生成に用いられる。ｐＥＴ－ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｇ多重特異性ナノボディのプラスミドで新たに形質転換された大腸菌ＨＢ２１５１を５０μg/mLのアンピシリンを含有する培地５mLに接種し、３７℃で一晩培養する。
【0038】
その後、１mLの前記培養物を１００mLの培地に接種し、３７℃で成長させる。一晩培養した後、１００ｍＬの培養物ごとにEnPresso Booster錠剤２枚及び追加のグルコース放出酵素（０.６U/L）を添加すると共に、１mMのＩＰＴＧを添加し、組換えナノボディのタンパク質を２４時間誘導発見させる。
【0039】
そして、培養物を回収して氷上で５分間冷却した後に、６,０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離する。上清を除去した後に、大容量Ｍｙｃ－ｔａｇ結合樹脂を用いて、細胞ペレットを固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（immobilized metal affinity chromatography、ＩＭＡＣ）によって精製する。メーカー（Clontech Laboratories）の操作手順に従って、自然条件下でグラビティーフロー式クロマトグラフィー（gravity-flow-based chromatography）を行う。
【0040】
２００mgの細菌細胞ペレットごとに１mLのxTractor細胞溶解緩衝液（Clontech Laboratories）を添加し、ＥＤＴＡを含有しないプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostics）、及び２５Ｕのエンドヌクレアーゼ（Thermo Scientific Pierce）を追加することで、細胞溶解を有効に行うことができる。
【0041】
氷上で１５分間作用させ、１０,０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離して細胞破片を除去した後、上清を１mLの樹脂を充填したグラビティフローカラムに添加し、室温で３０分間作用させる。３００mMのイミダゾールを含有する溶出緩衝液を添加することによってナノボディを溶出する前に、カラムを２０及び４０mMのイミダゾールで２回洗浄する。分子量カットオフが３．５～５kDaであるセルロースエステル膜（cellulose ester membrane）（Spectrum(R)Laboratories）を用いて、ＰＢＳに対して透析を行うことにより、イミダゾールを除去して緩衝液を置換する。
【0042】
抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの各クローン株の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）のアライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）及びアミノ酸配列は、表１に示されている。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃９のアミノ酸配列は、配列番号１である。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃２０のアミノ酸配列は、配列番号２である。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃３３のアミノ酸配列は、配列番号３である。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４である。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃２０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５である。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃３３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６である。
【0043】
【表1】
【0044】
実施例２．競合酵素結合免疫吸着アッセイ（competitive enzyme linked immunosorbent assay、ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ）による抗ＨＬＡ－ＧナノボディのＨＬＡ－Ｇ／キラー細胞免疫グロブリン様受容体の２つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部４（killer cell immunoglobulin like receptor、two Ig domains and long cytoplasmic tail 4、ＫＩＲ２ＤＬ４）又は白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1、ＬＩＬＲＢ１）の軸遮断（axis blockade）の測定
本実施例において、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（competitive enzyme linked immunosorbent assay、competitive ＥＬＩＳＡ）による抗ＨＬＡ－ＧナノボディのＨＬＡ－Ｇ／キラー細胞免疫グロブリン様受容体の２つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部４（killer cell immunoglobulin like receptor、two Ig domains and long cytoplasmic tail 4、ＫＩＲ２ＤＬ４）の軸遮断の測定の操作手順は、以下の通りである。
本実施例において、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（competitive enzyme linked immunosorbent assay、competitive ＥＬＩＳＡ）による抗ＨＬＡ－ＧナノボディのＨＬＡ－Ｇ／キラー細胞免疫グロブリン様受容体の２つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部４（killer cell immunoglobulin like receptor、two Ig domains and long cytoplasmic tail 4、ＫＩＲ２ＤＬ４）の軸遮断の測定の操作手順は、以下の通りである。
【0045】
まず、ＨＬＡ－Ｇ組換え蛋白（CAT#:TP305216、Origene）（０.２μg/ml、１ウェルあたり１００μl）を９６ウェルプレートに添加し、４℃で一晩コーティングする。翌日、コーティングバッファーを除去し、室温で３％のスキムミルクで２時間ブロッキングする。そして、ＰＢＳＴ（０.０５％のＴｗｅｅｎをＰＢＳに溶解した）で５回洗浄する。
【0046】
異なる濃度を有する抗ＨＬＡ－Ｇナノボディ（クローン株＃９、＃２０又は＃３３）又は市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体（８７Ｇ）を添加し、４℃で一晩静置する。５回洗浄した後、室温でビオチン化ＫＩＲ２ＤＬ４（biotinylated ＫＩＲ２ＤＬ４）（Sino Biological、Cat:13052-H02S）（０.２mg/ml、１ウェルあたり１００μl）を添加して２時間静置する。９回洗浄した後、各ウェルにおいて、１００μｌのストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ共役物（streptavidin-HRP conjugates）（ThermoFisher、CatNo:N100、希釈力価：５０００:１）を含有するＰＢＳＴで、室温で２時間作用させる。
【0047】
ＰＢＳＴで９回洗浄した後、５０μlのＴＭＢ基質（ＨＲＰの活性を検出するため）（ThermoFisher、Cat No:N301）を添加する。その後、５０μlの停止液（ThermoFisher、Cat No:N600）を添加して反応を停止させる。そして、４５０nmの波長のＥＬＩＳＡリーダーを使用して測定を行う。市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体（８７Ｇ）の最高濃度を、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＨＬＡ－Ｇの相互作用を１００％遮断するように設定し、他の反応を計算する。
【0048】
また、競合酵素結合免疫吸着アッセイ（competitive ELISA）によって抗ＨＬＡ－ＧナノボディのＨＬＡ－Ｇ／白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1、ＬＩＬＲＢ１）の軸遮断の測定の操作手順は、大体上記の操作手順と同じであるが、ビオチン化ＫＩＲ２ＤＬ４をビオチン化ＬＩＬＲＢ１（Sino Biological、Cat:16014-H08H）に置換し、かつ、市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体（８７Ｇ）の最高濃度を、ＬＩＬＲＢ１／ＨＬＡ－Ｇの相互作用を１００％遮断するように設定し、他の反応を計算する。
【0049】
図１Ａ～図１Ｈには、本実施例の結果を示している。ＬＩＬＲＢ１は、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1）を示し、ＫＩＲ２ＤＬ４は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体の２つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部４（killer cell immunoglobulin like receptor、two Ig domains and long cytoplasmic tail 4）を示し、ｎｂは、ナノボディ（nanobody）を示し、８７Ｇは、市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体を示す。
【0050】
本実施例の結果から分かるように、市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体（８７Ｇ）は、４１.４ng/ml（ＩＣ５０）である５０％阻害濃度において、ＨＬＡ－Ｇとその受容体の１つであるＫＩＲ２ＤＬ４との相互作用を遮断する。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃９は、６.１４ng/ml（ＩＣ５０）である５０％阻害濃度において、ＨＬＡ－Ｇとその受容体の１つであるＫＩＲ２ＤＬ４との相互作用を遮断し、阻害濃度は、８７Ｇで正規化される。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃２０は、８１４ng/ml（ＩＣ５０）である５０％阻害濃度においてＨＬＡ－Ｇとその受容体の１つであるＫＩＲ２ＤＬ４との相互作用を遮断し、阻害濃度は、８７Ｇで正規化される。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃３３は、５３.３ng/ml（ＩＣ５０）である５０％阻害濃度において、ＨＬＡ－Ｇとその受容体の１つであるＫＩＲ２ＤＬ４との相互作用を遮断し、阻害濃度は、８７Ｇで正規化される。
【0051】
市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体（８７Ｇ）は、１００.９ng/ml（ＩＣ５０）である５０％阻害濃度において、ＨＬＡ－Ｇとそのもう１つの受容体であるＬＩＬＲＢ１との相互作用を遮断する。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃９は、０.８２５ng/ml（ＩＣ５０）である５０％阻害濃度において、ＨＬＡ－Ｇとそのもう１つの受容体であるＬＩＬＲＢ１との相互作用を遮断し、阻害濃度は、８７Ｇで正規化される。
【0052】
抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃２０は、０.１７４ng/ml（ＩＣ５０）である５０％阻害濃度において、ＨＬＡ－Ｇとそのもう１つの受容体であるＬＩＬＲＢ１との相互作用を遮断し、阻害濃度は、８７Ｇで正規化される。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃３３は、０.０７４ng/ml（ＩＣ５０）である５０％阻害濃度において、ＨＬＡ－Ｇとそのもう１つの受容体であるＬＩＬＲＢ１との相互作用を遮断し、阻害濃度は、８７Ｇで正規化される。
【0053】
実施例３．抗ＨＬＡ－Ｇナノボディによるヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対するナチュラルキラー細胞（natural killer cell、ＮＫ cell）の細胞溶解（cytolysis）作用の向上効果の評価
本実施例において、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディによるヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から購入）に対するナチュラルキラー細胞（natural killer cell、ＮＫ cell）の細胞溶解（cytolysis）作用の向上効用を評価する実験プロセスは、以下の通りである。１×１０5のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２ウェルプレートに接種し、一晩静置する。
本実施例において、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディによるヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から購入）に対するナチュラルキラー細胞（natural killer cell、ＮＫ cell）の細胞溶解（cytolysis）作用の向上効用を評価する実験プロセスは、以下の通りである。１×１０5のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１２ウェルプレートに接種し、一晩静置する。
【0054】
翌日、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を含有するウェルに５×１０5の一次ナチュラルキラー細胞を添加する。そして、１μg/mlの抗ＨＬＡ－Ｇナノボディ（クローン株＃９、＃２０又は＃３３）又は１０μg/mlの市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体（８７Ｇ）（87g、tHERMOfISHER、cAT nO:14-9957-82）を添加する。４８時間後、生／死細胞が媒介する細胞毒性分析により、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞に対する一次ナチュラルキラー細胞の特異的溶解をフローサイトメトリーによって確定する。
【0055】
図２には、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディによるヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対するナチュラルキラー細胞の細胞溶解作用の向上の結果を示している。本実施例から分かるように、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃９、＃２０及び＃３３は、ナチュラルキラー細胞で誘導された腫瘍細胞（MDA-MB-231）に対する細胞毒性を向上させる。
【0056】
実施例４．抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）の結果
本実施例において、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのウエスタンブロッティング（Western blotting）の操作手順は、以下の通りである。プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＰＲＯ－ＰＲＥＰタンパク質抽出溶液（ｉＮｔＲＯＮ、台北、台湾）から細胞を取り、４℃で１５分間激しく振とうした後、遠心分離をする。上清を回収し、Bio-Rad BCA試薬（Bio-Rad Hercules、CA、ＵＳＡ）を使用してタンパク質の濃度を測定する。３０μgの各サンプルのライセートをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そして、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングする。
本実施例において、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのウエスタンブロッティング（Western blotting）の操作手順は、以下の通りである。プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するＰＲＯ－ＰＲＥＰタンパク質抽出溶液（ｉＮｔＲＯＮ、台北、台湾）から細胞を取り、４℃で１５分間激しく振とうした後、遠心分離をする。上清を回収し、Bio-Rad BCA試薬（Bio-Rad Hercules、CA、ＵＳＡ）を使用してタンパク質の濃度を測定する。３０μgの各サンプルのライセートをＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、そして、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロッティングする。
【0057】
ＴＢＳＴブロッキング剤に５％のＢＳＡを添加し、メンブレン及び一次抗体（ＴＢＳＴに溶解された）を４℃下で一晩作用させる。そして、４回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase、ＨＲＰ）共役ヤギ抗マウス又はウサギＩｇＧ（Upstate、Billerica、MA、ＵＳＡ）にて２時間作用させる。ＴＢＳＴで４回洗浄した後、転写物とSuperSignal West Pico ECL試薬（Pierce Biotechnology、Rockford、IL、ＵＳＡ）とを一緒に１分間作用させ、そして、Kodak-X-Omatフィルムへの曝露によって化学発光を検出する。
【0058】
図３Ａ～図３Ｂには、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのウエスタンブロッティングの分析結果を示している。図３Ａに使用される細胞株は、ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１であり、市販の抗体（commercial antibody）は、HLA-G(E8N9C)XP(R)Rabbit mAb#79769であり、上段の数字は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株の細胞溶解物（cell lysate）の量（μg）を示し、一次抗体（primary antibody）の濃度は、１ng/mlであり、市販の抗体パネルの二次抗体は、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（anti-rabbit-horseradish peroxidase、ａｎｔｉ－Ｒａｂ－ＨＲＰ）（１:１０００）であり、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディは、重鎖可変ドメイン（heavy chain variable domain、ＶＨＨ）ナノボディ（１ng/ml）であり、実験群（＃９、＃２０）の二次抗体は、抗ＶＨＨ－ＨＲＰ（１:１０００）である。
【0059】
図３Ｂに使用される細胞株は、ヒト非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から購入）であり、市販の抗体は、HLA-G(E8N9C)XP(R) Rabbit mAb#79769であり、上段の数字は、Ａ５４９細胞株の細胞溶解物の量（μg）を示し、一次抗体の濃度は、１ng/mlであり、市販の抗体パネルの二次抗体は、抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（１:１０００）であり、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディは、重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）ナノボディ（１ng/ml）であり、実験群（＃９、＃２０）の二次抗体は、抗ＶＨＨ－ＨＲＰ（１:１０００）である。
【0060】
本実施例の結果から分かるように、ウエスタンブロッティングにより、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃９及び＃２０は、ヒトがん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ５４９細胞の細胞溶解物中のＨＬＡ－Ｇタンパク質を特定することができる。
【0061】
実施例５．抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのフローサイトメトリー（flow cytometric analysis）の結果
本実施例において、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのフローサイトメトリー（flow cytometric analysis）の操作手順は、以下の通りである。まず、ＨＬＡ－Ｇ組換え蛋白（CAT#:TP305216、Origene）（０.２μg/ml、１ウェルあたり１００μl）を９６ウェルプレートに添加し、４℃で一晩コーティングする。翌日、コーティングバッファーを除去し、室温で３％のスキムミルクで２時間ブロッキングする。そして、ＰＢＳＴ（０.０５％のＴｗｅｅｎをＰＢＳに溶解した）で５回洗浄する。
本実施例において、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのフローサイトメトリー（flow cytometric analysis）の操作手順は、以下の通りである。まず、ＨＬＡ－Ｇ組換え蛋白（CAT#:TP305216、Origene）（０.２μg/ml、１ウェルあたり１００μl）を９６ウェルプレートに添加し、４℃で一晩コーティングする。翌日、コーティングバッファーを除去し、室温で３％のスキムミルクで２時間ブロッキングする。そして、ＰＢＳＴ（０.０５％のＴｗｅｅｎをＰＢＳに溶解した）で５回洗浄する。
【0062】
異なる濃度を有する抗ＨＬＡ－Ｇナノボディ（クローン株＃９、＃２０又は＃３３）又は市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体（８７Ｇ）を添加し、４℃で一晩静置する。５回洗浄した後、室温でビオチン化ＫＩＲ２ＤＬ４（biotinylated ＫＩＲ２ＤＬ４）（Sino Biological、Cat:13052-H02S）（０.２mg/ml、１ウェルあたり１００μl）を添加して２時間静置する。９回洗浄した後、各ウェルにおいて、１００μlのストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ共役物（streptavidin-HRP conjugates）（ThermoFisher、CatNo:N100、希釈力価:５０００:１）を含有するＰＢＳＴで、室温で２時間作用させる。
【0063】
ＰＢＳＴで９回洗浄した後、５０μlのＴＭＢ基質（ＨＲＰの活性を検出するため）（ThermoFisher、Cat No:N301）を添加する。その後、５０μlの停止液（ThermoFisher、Cat No:N600）を添加して反応を停止させる。そして、４５０nmの波長のＥＬＩＳＡリーダーを使用して測定をする。市販の抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体（８７Ｇ）の最高濃度を、ＫＩＲ２ＤＬ４／ＨＬＡ－Ｇの相互作用を１００％遮断するように設定し、他の反応を計算する。
【0064】
図４には、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディのフローサイトメトリーの分析結果を示している。ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びヒト非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９の量は、１×１０6であり、市販の抗体（commercial Ab）は、ＰＥ（#12-9957-42）（抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体、１００μlのＰＢＳ溶液に０.２５μg添加した）及び市販のモノクローナル抗体８７Ｇであり、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディは、重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）ナノボディ（１００μlのＰＢＳ溶液に０.２５μg添加した）であり、二次抗体は、ウサギ抗ラクダＶＨＨ、ｉＦｌｕｏｒ５５５（rabbit anti-camelid VHH、ｉＦｌｕｏｒ５５５）（１００μlのＰＢＳ溶液に０.５μg添加した）であり、ＭＦＩは、平均蛍光強度（mean fluorescence intensity）を示し、unstainedは、未染色を示し、cloneは、クローン株を示す。
【0065】
実施例６．抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの免疫細胞化学（immunocytochemistry）の分析結果
本実施例において、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの免疫細胞化学的分析（immunocytochemistry)の操作手順は、以下の通りである。腫瘍細胞（１×１０5）を６ウェルプレートのスライドガラスに接種し、一晩培養する。特定の処理を行った後、細胞を１％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）に固定し、ＰＢＳで洗浄し、０.５％のＢＳＡを含有するＰＢＳに０.１％ Triton X-100を使用して３０分間透過化させ、２％のＢＳＡでブロッキングし、特異的抗体（２％のＢＳＡ／０.０５％のTween-20を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で混合された）と作用させる。洗浄した後、細胞とフルオレセイン共役二次抗体とを一緒に作用させる。ＰＢＳＴで洗浄し、退色剤及び４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（４’，６－diamidino-2-phenylindole、ＤＡＰＩ）を含有する水溶性の封入剤で封入する。Leica TCS SP8 X共焦点顕微鏡（Leica）によって画像を分析する。
本実施例において、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの免疫細胞化学的分析（immunocytochemistry)の操作手順は、以下の通りである。腫瘍細胞（１×１０5）を６ウェルプレートのスライドガラスに接種し、一晩培養する。特定の処理を行った後、細胞を１％のパラホルムアルデヒド（paraformaldehyde）に固定し、ＰＢＳで洗浄し、０.５％のＢＳＡを含有するＰＢＳに０.１％ Triton X-100を使用して３０分間透過化させ、２％のＢＳＡでブロッキングし、特異的抗体（２％のＢＳＡ／０.０５％のTween-20を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で混合された）と作用させる。洗浄した後、細胞とフルオレセイン共役二次抗体とを一緒に作用させる。ＰＢＳＴで洗浄し、退色剤及び４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（４’，６－diamidino-2-phenylindole、ＤＡＰＩ）を含有する水溶性の封入剤で封入する。Leica TCS SP8 X共焦点顕微鏡（Leica）によって画像を分析する。
【0066】
図５Ａ及び図５Ｂには、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの免疫細胞化学の分析結果を示している。図５Ａに使用される細胞株は、ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１である。図５Ｂに使用される細胞株は、ヒト非小細胞肺がん細胞株Ａ５４９である。市販の抗体４Ｈ８４は、抗ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体であり、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの濃度は、１ng/mlであり、二次抗体は、抗ＶＨＨ－フルオレセイン（fluorescein、ＦＩＴＣ）（１:５０００）である。
【0067】
図５Ａ及び図５Ｂから分かるように、免疫細胞化学の分析により、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃９及び＃２０は、細胞膜上のＨＬＡ－Ｇタンパク質を特定することができる。抗ＨＬＡ－Ｇナノボディクローン株＃９及び＃２０、並びに市販の抗体４Ｈ８４及び市販のＰａｎ－カドヘリン（Ｐａｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ）抗体を使用することにより、ＨＬＡ－Ｇの発現及び細胞膜マーカーであるＰａｎ－カドヘリン（Pan-Cadherin）がＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ５４９細胞に共局在する。
【0068】
実施例７．抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、ＩＨＣ staining）の結果
本実施例において、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、IHC staining）の操作手順は、以下の通りである。ヒトの胎盤サンプルを１０％のホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋する。切片（厚さ＝３μm）をヘマトキシリン及びエオジンによって染色する。免疫組織化学について、９９℃のマイクロ波によって抗原賦活化（antigen retrieval）を行う。切片をＨ2Ｏ2で洗浄して２０分間作用させることにより、内因性ペルオキシダーゼを遮断する、そして、５％のＢＳＡに３０分間浸漬し、切片及び一次抗体を４℃で一晩作用させる。
本実施例において、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、IHC staining）の操作手順は、以下の通りである。ヒトの胎盤サンプルを１０％のホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋する。切片（厚さ＝３μm）をヘマトキシリン及びエオジンによって染色する。免疫組織化学について、９９℃のマイクロ波によって抗原賦活化（antigen retrieval）を行う。切片をＨ2Ｏ2で洗浄して２０分間作用させることにより、内因性ペルオキシダーゼを遮断する、そして、５％のＢＳＡに３０分間浸漬し、切片及び一次抗体を４℃で一晩作用させる。
【0069】
洗浄した後、切片を希釈したビオチン共役二次抗体で、室温で２時間又は４℃で一晩作用させる。最後に、切片と重合物とを一緒に室温で１０分間作用させ、ジアミノベンジジン（diaminobenzidine、ＤＡＢ）（西洋ワサビペルオキシダーゼの最も感度が高く、最も使用される発色反応物）によって染色し、さらに、ヘマトキシリン及びエオジンによって染色し、中性ゴムで固定する。染色の定量化は、光学顕微鏡（Nikon、日本）によって４０倍及び４００倍の倍率でそれぞれ行う。
【0070】
図６には、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディの免疫組織化学的染色の結果を示している。使用されるサンプルは、ヒトの胎盤である、市販の抗体は、４Ｈ８４（ＨＬＡ－Ｇモノクローナル抗体）（#sc-21799）であり、濃度が２００μg/mlであり、作用濃度が４μg/mlである。
【0071】
市販の抗体パネルの二次抗体は、ヤギ抗ウサギＨＲＰであり、ＤＡＢは、ジアミノベンジジン（diaminobenzidine）（西洋ワサビペルオキシダーゼの最も感度が高く、最も使用される発色反応物）を示し、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディは、重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）ナノボディ（作用濃度が４μg/mlである）であり、実験群（＃９）の抗体は、ウサギ抗ラクダＶＨＨ抗体（rabbit anti-camelid VHH antibody）と、ビオチン（biotin）（１００μlのＰＢＳ溶液に０.５μg添加した）と、ヤギ抗ウサギＨＲＰと、を含む。本実施例の結果から分かるように、抗腫瘍抗原ナノボディ（即ち、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体）は、免疫組織化学的染色によってＨＬＡ－Ｇの発現を検出するために用いられる。
【0072】
上記をまとめると、本発明の抗腫瘍抗原ナノボディ（即ち、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体）の効果は、以下の通りである。
【0073】
競合酵素結合免疫吸着アッセイ（competitive enzyme linked immunosorbent assay、competitive ELISA）により、ＨＬＡ－ＧナノボディがＩＣ５０である５０％阻害濃度において、ＨＬＡ－Ｇとその受容体であるキラー細胞免疫グロブリン様受容体の２つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部４（killer cell immunoglobulin like receptor、two Ig domains and long cytoplasmic tail 4、ＫＩＲ２ＤＬ４）並びに白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（leukocyte immunoglobulin-like receptor subfamily B member 1、ＬＩＬＲＢ１）との相互作用を遮断すること、及び、ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対するナチュラルキラー細胞（natural killer cell、ＮＫ ｃｅｌｌ）の細胞溶解（cytolysis）作用及び細胞毒性を向上させることを証明し、
ウエスタンブロッティング（Western blotting）により、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディがヒトがん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ５４９の細胞溶解物中のＨＬＡ－Ｇタンパク質を特定できることを証明し、
フローサイトメトリー（flow cytometric analysis）及び免疫細胞化学の分析により、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディが細胞膜上のＨＬＡ－Ｇタンパク質を特定できること、ＨＬＡ－Ｇの発現及び細胞膜マーカーであるＰａｎ－カドヘリン（Pan-Cadherin）がＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ５４９細胞に共局在していることを証明し、及び、
免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、ＩＨＣ staining）により、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体がＨＬＡ－Ｇの発現を検出するために用いられることを証明する。
ウエスタンブロッティング（Western blotting）により、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディがヒトがん細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ５４９の細胞溶解物中のＨＬＡ－Ｇタンパク質を特定できることを証明し、
フローサイトメトリー（flow cytometric analysis）及び免疫細胞化学の分析により、抗ＨＬＡ－Ｇナノボディが細胞膜上のＨＬＡ－Ｇタンパク質を特定できること、ＨＬＡ－Ｇの発現及び細胞膜マーカーであるＰａｎ－カドヘリン（Pan-Cadherin）がＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＡ５４９細胞に共局在していることを証明し、及び、
免疫組織化学的染色（immunohistochemistry staining、ＩＨＣ staining）により、抗ＨＬＡ－Ｇ抗体がＨＬＡ－Ｇの発現を検出するために用いられることを証明する。
【0074】
上記効果によれば、がん及び免疫関連疾患を治療する効果を達成する。特に、従来の抗体は、遺伝子をベクターによって細胞にトランスフェクトしてから抗体の機能を発揮することができるため、収率が低くて効果が低いという欠点がある。本発明の抗腫瘍抗原ナノボディは、インビトロで大量に製造してそのまま投与すべき個体に投与して治療を行うことができる。なお、本発明によれば、ＨＬＡ－Ｇの発現レベルを検出できる効果も達成することができる。
【0075】
上記の内容は、例示的なものであり、本発明を限定するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱しない改良や変更は、いずれも添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【配列表】