(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-16
(45)【発行日】2023-10-24
(54)【発明の名称】ＴＲＥＭ２抗体およびそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20231017BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20231017BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20231017BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20231017BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20231017BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
A61K39/395 M
A61K39/395 N
A61P21/00
A61P25/28
C12N15/13
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022529507
(86)(22)【出願日】2020-11-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-24
(86)【国際出願番号】 US2020060663
(87)【国際公開番号】W WO2021101823
(87)【国際公開日】2021-05-27
【審査請求日】2022-05-24
(31)【優先権主張番号】62/939,097
(32)【優先日】2019-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】594197872
【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(74)【代理人】
【識別番号】100150500
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 靖
(74)【代理人】
【識別番号】100176474
【弁理士】
【氏名又は名称】秋山 信彦
(72)【発明者】
【氏名】アンドリューズ，フォレスト ホイット
(72)【発明者】
【氏名】フェローズ，ロス エドワード
(72)【発明者】
【氏名】タン，イン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ヤーミン
【審査官】山▲崎▼ 真奈
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５３７９５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／０５５８４１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１９－５３１３３２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１１８５１３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／０２８２９２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１７－５２３８１４（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含み、前記ＬＣＶＲが、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＶＲが、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１が、配列番号１によって示されるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２が、配列番号２によって示されるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３が、配列番号３によって示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１が、配列番号４によって示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２が、配列番号５によって示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が、配列番号６によって示されるアミノ酸配列を有する、ＴＲＥＭ２に結合する抗体。
【請求項2】
前記ＬＣＶＲが、配列番号７によって示されるアミノ酸配列を有し、前記ＨＣＶＲが、配列番号８によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体が、ＬＣおよびＨＣを含み、前記ＬＣが、配列番号９によって示されるアミノ酸配列を有し、前記ＨＣが、配列番号１０によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体と、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項5】
神経変性疾患の治療に使用するための、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、進行性脳性麻痺、多発性硬化症、ＡＬＳ、または前頭側頭型認知症である、請求項５に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項7】
外傷性脳損傷の治療に使用するための、請求項４に記載の使用のための医薬組成物。
【請求項8】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体を含む、神経変性疾患または外傷性脳損傷を有する患者を治療するための薬剤であって、有効量の前記抗体が、前記患者に投与されるように用いられることを特徴とする、薬剤。
【請求項9】
前記患者が、神経変性疾患を有する、請求項８に記載の薬剤。
【請求項10】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、進行性脳性麻痺、多発性硬化症、ＡＬＳ、または前頭側頭型認知症である、請求項９に記載の薬剤。
【請求項11】
前記患者が、外傷性脳損傷を有する、請求項８に記載の薬剤。
【請求項12】
神経変性疾患または外傷性脳損傷の治療のための薬剤の製造における、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項13】
神経変性疾患の治療のための薬剤の製造における、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、進行性脳性麻痺、多発性硬化症、ＡＬＳ、外傷性脳損傷、または前頭側頭型認知症である、請求項１３に記載の使用。
【請求項15】
外傷性脳損傷の治療のための薬剤の製造における、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬の分野に属する。より具体的には、本発明は、ＴＲＥＭ２に結合する抗体、そのようなＴＲＥＭ２抗体を含む組成物、およびアルツハイマー病などの神経変性疾患の治療のためにそのようなＴＲＥＭ２抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
骨髄細胞に発現するトリガー受容体２（ＴＲＥＭ２）は、樹状細胞、顆粒球などの骨髄細胞、ならびに破骨細胞、Ｋｕｐｐｆｅｒ細胞、および肺胞マクロファージなどの組織特異的マクロファージに発現する細胞表面膜貫通糖タンパク質である。ＴＲＥＭ２膜貫通領域は、アダプタータンパク質ＤＡＰ１２およびＤＡＰ１０と関連しており、アダプタータンパク質を介したＴＲＥＭ２シグナル伝達により、ｍＴＯＲおよびＭＡＰＫなどの下流標的が活性化される。したがって、ＴＲＥＭ２の活性化は、増殖、生存、食作用、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を伴う食作用酸化バースト、ならびに炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの発現の増加などの活性をもたらす。特定の状況下で骨髄細胞が活性化されると、膜結合型ＴＲＥＭ２が、プロテアーゼによって切断され、それによって可溶性ＴＲＥＭ２が放出され得る。
【0003】
ＴＲＥＭ２は、アルツハイマー病などの神経変性疾患に関係づけられてきた。ＴＲＥＭ２は、脳内のミクログリアによって発現され、ＴＲＥＭ２の発現の増加は、アルツハイマー病患者およびタウ病理マウスモデルで観察されている。さらに、ＴＲＥＭ２変異は、神経変性疾患に関連しており、ＴＲＥＭ２ノックアウトマウスは、加齢に伴う炎症性変化、酸化脂質の蓄積、および神経構造の喪失から保護されることが示されている（例えば、Ｇｅｒｌａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，ＴＲＥＭ２ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ａｇｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｌｏｓｓ．Ｇｌｉａ，６７（３）：５３９－５５０（２０１９）を参照されたい）。ＴＲＥＭ２欠損は、また、外傷性脳損傷後の海馬の体積損失の低減において神経保護的であり得る（Ｓａｂｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ ２ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ａｌｔｅｒｓ Ａｃｕｔｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ａｆｔｅｒ Ｔｒａｕｍａｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｊｕｒｙ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，３４：４２３－４３５（２０１７）を参照されたい）。
【0004】
ＴＲＥＭ２抗体は、当該技術分野で知られている。例えば、ＰＣＴ公開第２０１６／０２３０１９号およびＰＣＴ公開第２０１９／０２８２９２号は、ＴＲＥＭ２抗体を開示している。このような抗体は、インビボでＴＲＥＭ２をクラスター化して活性化し、かつ／またはナノモル親和性でヒトＴＲＥＭ２に結合し得る。
【0005】
したがって、１）最適な活性のために望ましい高い親和性と、結合および解離速度とでヒトＴＲＥＭ２に結合する、２）総ミクログリア数に影響を与えることなく（例えば、生存に影響を与えずに）、ミクログリア活性化状態を低減させる、および／もしくはミクログリア恒常性を促進する、３）ＴＲＥＭ２シグナル伝達を阻害する、４）インビボ有効性を達成する、５）低い免疫原性を示す、ならびに／または６）神経変性疾患の治療において、開発および／もしくは使用のために許容される安定性、溶解性、低い自己結合性、および薬物動態特性などの適切な開発可能性特性を示す、代替のＴＲＥＭ２抗体の必要性が依然として存在する
【発明の概要】
【0006】
したがって、本発明は、ヒトＴＲＥＭ２に高い親和性で結合する新規のＴＲＥＭ２抗体を提供する。本発明の抗体は、ミクログリア恒常性を促進する手段を提供すると考えられる。本発明の抗体はまた、総ミクログリア数に影響を与えることなく（例えば、生存に影響を与えずに）、ミクログリア活性化状態を低減させる、および／またはミクログリア恒常性を回復する、マクロファージの食作用を防止する、ＴＲＥＭ２シグナル伝達を阻害する、インビボ有効性を達成する、低い免疫原性を示す、および／または神経変性障害の治療において臨床開発および／または使用のために適切な開発可能性特性を示すという特性のうちの少なくとも１つを有する。
【0007】
このような抗体は、アルツハイマー病などの神経変性疾患の治療に有用であり得、低用量または低頻度の投与で治療的に有効であり得る。
【発明を実施するための形態】
【0008】
一実施形態では、本発明は、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含むＴＲＥＭ２に結合する抗体を提供し、ＬＣＶＲは、相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含み、ＨＣＶＲは、ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含み、ＬＣＤＲ１は、配列番号１によって示されるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ２は、配列番号２によって示されるアミノ酸配列を有し、ＬＣＤＲ３は、配列番号３によって示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１は、配列番号４によって示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ２は、配列番号５によって示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３は、配列番号６によって示されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＬＣＶＲは、配列番号７によって示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＶＲは、配列番号８によって示されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、抗体は、軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）を含み、ＬＣは、配列番号９によって示されるアミノ酸配列を有し、ＨＣは、配列番号１０によって示されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。
【0009】
一実施形態では、本発明は、抗体ＨＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、ＨＣは、配列番号１０によって示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明は、抗体ＬＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、ＬＣは、配列番号９によって示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明は、ＨＣおよびＬＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供し、ＨＣは、配列番号１０によって示されるアミノ酸配列を含み、ＬＣは、配列番号９によって示されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明は、抗体ＨＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子であって、ＨＣが配列番号１０によって示されるアミノ酸配列を含む、ＤＮＡ分子と、抗体ＬＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子であって、ＬＣが配列番号９によって示されるアミノ酸配列を含む、ＤＮＡ分子とを含む、哺乳動物細胞を提供する。一実施形態では、本発明は、ＨＣおよびＬＣをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供し、ＨＣは、配列番号１０によって示されるアミノ酸配列を含み、ＬＣは、配列番号９によって示されるアミノ酸配列を含む。
【0010】
一実施形態では、本発明はまた、本発明の抗体、および１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、神経変性疾患の治療に使用するための医薬組成物を提供する。一実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病、進行性脳性麻痺、多発性硬化症、ＡＬＳ、または前頭側頭型認知症である。一実施形態では、本発明は、外傷性脳損傷の治療に使用するための医薬組成物を提供する。
【0011】
一実施形態では、本発明は、神経変性疾患を有する患者を治療するための方法であって、患者に有効量の本発明の抗体を投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病、進行性脳性麻痺、多発性硬化症、ＡＬＳ、または前頭側頭型認知症である。一実施形態では、本発明は、外傷性脳損傷を有する患者を治療するための方法であって、患者に有効量の本発明の抗体を投与することを含む、方法を提供する。
【0012】
一実施形態では、療法において使用するための本発明の抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、神経変性疾患の治療において使用するための本発明の抗体を提供する。一実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病、進行性脳性麻痺、多発性硬化症、ＡＬＳ、または前頭側頭型認知症である。一実施形態では、本発明は、外傷性脳損傷の治療において使用するための本発明の抗体を提供する。
【0013】
一実施形態では、本発明は、神経変性疾患の治療のための薬剤の製造における本発明の抗体の使用を提供する。一実施形態では、神経変性疾患は、アルツハイマー病、進行性脳性麻痺、多発性硬化症、ＡＬＳ、または前頭側頭型認知症である。一実施形態では、本発明は、外傷性脳損傷の治療のための薬剤の製造における本発明の抗体の使用を提供する。
【0014】
「ＴＲＥＭ２抗体」は、ＴＲＥＭ２（Ｒ４７ＨバリアントなどのＴＲＥＭ２バリアントを含む）に結合し、インビトロまたはインビボで投与されると、活性化ミクログリアの低減などの少なくとも１つの所望の活性をもたらす、抗体を意味する。
【0015】
本発明に関して、本明細書で使用される「抗体」という用語は、重鎖および軽鎖がジスルフィド結合によって相互接続されるように、２つのＨＣおよび２つのＬＣを有する、操作された天然に存在しないポリペプチド複合体を指し、この抗体は、ＩｇＧアイソタイプ抗体である。各重鎖は、Ｎ末端ＨＣＶＲおよび重鎖定常領域から構成される。各軽鎖は、Ｎ末端ＬＣＶＲおよび軽鎖定常領域から構成される。特定の生物学的系において発現する場合、抗体は、Ｆｃ領域においてグリコシル化される。典型的には、グリコシル化は、高度に保存されたＮ－グリコシル化部位の抗体のＦｃ領域に生じる。Ｎ－グリカンは、典型的には、アスパラギンに結合する。抗体は、他の位置でもグリコシル化され得る。
【0016】
重鎖の定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ１は、ＨＣＶＲの後にあり、ＣＨ１およびＨＣＶＲは、抗原（複数可）に結合する抗体の一部である抗原結合（Ｆａｂ）フラグメントの重鎖部分を形成する。ＣＨ２は、ヒンジ領域の後にあり、ＣＨ３の前にある。ＣＨ３は、ＣＨ２の後にあり、重鎖のカルボキシ末端にある。軽鎖の定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＣＬは、ＬＣＶＲの後にあり、ＣＬおよびＬＣＶＲは、Ｆａｂの軽鎖部分を形成する。
【0017】
本発明の抗体のＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域は、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）と呼ばれる、超可変性の領域にさらに細分することができ、それには、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と呼ばれる、より保存されている領域が散在する。各ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲは、以下の順、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でのアミノ末端からカルボキシ末端へと配置している３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。本明細書では、重鎖の３つのＣＤＲを「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３」と称し、軽鎖の３つのＣＤＲを「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３」と称する。ＣＤＲは、抗原との特異的相互作用を形成する残基の大部分を含む。Ｋａｂａｔ ＣＤＲの定義（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９０：３８２－９３ （１９７１）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２ （１９９１））は、抗体配列可変性に基づく。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの定義（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９６，９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７））は、抗体の三次元構造およびＣＤＲループのトポロジーに基づく。Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲの定義は、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２を除いて、Ｋａｂａｔ ＣＤＲの定義と同一である。Ｎｏｒｔｈ ＣＤＲの定義（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８－２５６（２０１１））は、多数の結晶構造を有する親和性伝搬クラスター化（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づく。本発明の目的で、本発明の抗体のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、周知のＫａｂａｔ番号付け規則に基づく。
【0018】
本発明の抗体は、ヒト化またはヒト抗体である。好ましくは、抗体は、ヒト抗体である。モノクローナル抗体の文脈において、「ヒト」（または「完全ヒト」）および「ヒト化」という用語は、当業者によく知られている（Ｗｅｉｎｅｒ Ｌ．Ｊ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００６；２９：１－９；Ｍａｌｌｂｒｉｓ Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｅｓｔｈｅｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１６；９：１３－１５）。本発明の抗体は、ＩｇＧ４ＰＡＡ抗体であり得る。ＩｇＧ４ＰＡＡ抗体は、それぞれ２２８位、２３４位、２３５位（ＥＵ番号付けによる）にセリンからプロリンへの置換および２つのロイシンからアラニンへの置換（すなわち、Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有するＩｇＧ４抗体である。
【0019】
本発明のＤＮＡ分子は、本発明の抗体中のポリペプチド（例えば、重鎖、軽鎖、可変重鎖、または可変軽鎖）のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする天然に存在しないポリヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分子である。
【0020】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＨＣＶＲをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒトおよび他の哺乳動物の重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、例えば、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。
【0021】
ＬＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＬＣＶＲをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子に変換され得る。ヒトおよび他の哺乳動物の軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域でよい。好ましくは、本発明の抗体について、軽鎖定常領域は、カッパ定常領域である。
【0022】
本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現制御配列に作動可能に連結された後に宿主細胞において発現し得る。発現ベクターは、典型的には、エピソーム、または宿主染色体ＤＮＡの一体化した部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたそれらの細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを含む。
【0023】
本発明の抗体は、哺乳動物細胞において容易に産生することができ、この非限定的な例は、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３、またはＣＯＳ細胞を含む。宿主細胞は、当該技術分野において周知の技術を使用して培養される。
【0024】
目的のポリヌクレオチド配列（例えば、抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび発現制御配列）を含むベクターは、細胞宿主のタイプに応じて異なる周知の方法によって宿主細胞に導入され得る。
【0025】
タンパク質精製の様々な方法は、抗体を含むがこれらに限定されないタンパク質を精製するために使用されることができ、そのような方法は、当該技術分野で知られている。
【0026】
本発明の抗体、またはそれを含む医薬組成物は、非経口経路によって投与されることができ、この非限定的な例は皮下投与および静脈内投与である。本発明の抗体は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と一緒に単回用量または複数回用量で患者に投与され得る。本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知の方法によって調製することができ（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄ．（２０１２），Ｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ）、本明細書に開示される抗体、および１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
【0027】
「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」（または「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」）という用語は、既存の症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を遅延、妨害、抑制、緩和、停止、軽減、または反転させることを意味する。
【0028】
「有効量」とは、研究者、医師、または他の臨床医によって探索されている組織、系、動物、哺乳動物、またはヒトの生物学的もしくは医学的反応、または所望の治療効果を誘発する本発明のＴＲＥＭ２抗体、またはそのような抗体を含む医薬組成物の量を意味する。抗体の有効量は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を誘発する抗体の能力などの因子に応じて変動し得る。このような利点には、ミクログリアの活性化の低減、および脳萎縮または認知喪失を遅らせる可能性が含まれるが、これらに限定されない。有効量は、公知技法の使用によって、かつ同様の状況下で得られる結果を観察することによって、当業者によって容易に決定され得る。患者のための有効量を決定する際には、これらに限定されないが、患者のサイズ、年齢、および全体的な健康状態；関与する特定の疾患もしくは障害；疾患もしくは障害の程度、もしくは関与、もしくは重症度；個々の患者の反応；投与される特定の化合物；投与の様式；投与される調製物のバイオアベイラビリティ特性；選択される投与計画；併用医薬品の使用；ならびに他の関連する状況を含む、多数の要因が担当診断医によって考慮される。
【0029】
抗体操作
本発明の抗体を生成するために、抗体生殖系列、親和性成熟、脱免疫化、および創薬可能性の最適化を含む重要な操作が行われた。このような抗体は、ヒトＴＲＥＭ２に対する親和性が高く、免疫原性が低減し、ヒトの臨床試験に許容できる、または最適な開発可能性を備えたヒト抗体である。
本発明の抗体を生成するために、抗体生殖系列、親和性成熟、脱免疫化、および創薬可能性の最適化を含む重要な操作が行われた。このような抗体は、ヒトＴＲＥＭ２に対する親和性が高く、免疫原性が低減し、ヒトの臨床試験に許容できる、または最適な開発可能性を備えたヒト抗体である。
【0030】
例えば、Ｄ５４および／またはＤ５６での異性化を低減するために、重鎖ＤＳＤモチーフ（残基Ｄ５４、Ｓ５５、およびＤ５６）で操作を行った。５５位のセリンは、グルタミン（Ｓ５５Ｑ）またはヒスチジン（Ｓ５５Ｈ）のいずれかに変異した。いずれの変異も、抗体親和性に対して中性である。予想外なことに、Ｓ５５Ｑ変異は、異性化を５．１％から１％に大幅に低減させたが、Ｓ５５Ｈ変異は、異性化を６３％に増加させた。したがって、Ｓ５５Ｑ重鎖変異は、結合親和性を維持しながら異性化を低減する。
【実施例】
【0031】
実施例：抗体発現および精製
本発明のＴＲＥＭ２抗体は、基本的に次のように発現および精製することができる。ＨＥＫ２９３またはＣＨＯなどの適切な宿主細胞は、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比（１：３または１：２など）を使用して抗体を分泌するための発現系、またはＨＣおよびＬＣの両方をコードする単一のベクター系で、一過性でまたは安定的にトランスフェクトすることができる。抗体が分泌された公知組成培地は、多くの一般的に使用される技術のうちのいずれかを使用して精製されてもよい。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合した緩衝液で平衡化された、Ｆａｂフラグメント用のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用され得る。カラムは、非特異的結合成分を除去するために洗浄され得る。
本発明のＴＲＥＭ２抗体は、基本的に次のように発現および精製することができる。ＨＥＫ２９３またはＣＨＯなどの適切な宿主細胞は、最適な所定のＨＣ：ＬＣベクター比（１：３または１：２など）を使用して抗体を分泌するための発現系、またはＨＣおよびＬＣの両方をコードする単一のベクター系で、一過性でまたは安定的にトランスフェクトすることができる。抗体が分泌された公知組成培地は、多くの一般的に使用される技術のうちのいずれかを使用して精製されてもよい。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合した緩衝液で平衡化された、Ｆａｂフラグメント用のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（登録商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）またはＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用され得る。カラムは、非特異的結合成分を除去するために洗浄され得る。
【0032】
結合した抗体は、例えば、ｐＨ勾配（２０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ７．０～１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．０、またはリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４～１００ｍＭのグリシン緩衝液、ｐＨ３．０など）によって溶出され得る。抗体画分は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥなどによって検出され得、次いで、プールされてもよい。意図する使用に応じて、さらなる精製は任意選択的である。抗体は、一般的な技術を使用して濃縮およびまたは滅菌濾過され得る。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモーダル、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去され得る。これらのクロマトグラフィーステップ後の抗体の純度は、約９５％～約９９％である。
【0033】
産物は、冷蔵で保持され得るか、－７０℃で直ちに凍結させてもよく、または凍結乾燥させてもよい。本発明の例示的なヒト抗体のアミノ酸配列番号を以下の表１に示す。
【表1】
【0034】
実施例：ＴＲＥＭ２への抗体１の結合速度および親和性
３７℃での表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使用して、ＴＲＥＭ２抗体の抗体１、参照抗体Ａ、または参照抗体Ｂの抗原への結合速度および親和性を決定する。参照抗体Ａは、ＰＣＴ公開第２０１９／０２８２９２号において配列番号１１、１３、１５、１６、１３２、１３５、１２６によって示されるＨＣＶＲ、ならびに配列番号２０、２２、２３、２５、１４４、１３１、および１２９によって示されるＬＣＶＲを含む。参照抗体Ｂは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／０２３０１９においてそれぞれ配列番号４１２および４１３によって示されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。
３７℃での表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使用して、ＴＲＥＭ２抗体の抗体１、参照抗体Ａ、または参照抗体Ｂの抗原への結合速度および親和性を決定する。参照抗体Ａは、ＰＣＴ公開第２０１９／０２８２９２号において配列番号１１、１３、１５、１６、１３２、１３５、１２６によって示されるＨＣＶＲ、ならびに配列番号２０、２２、２３、２５、１４４、１３１、および１２９によって示されるＬＣＶＲを含む。参照抗体Ｂは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／０２３０１９においてそれぞれ配列番号４１２および４１３によって示されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲを含む。
【0035】
ヒト（配列番号１１）、マウス（配列番号１２）、ラット（配列番号１４）、ウサギ（配列番号１３）、またはカニクイザル（配列番号１５）のＣ末端Ｈｉｓタグに融合したＴＲＥＭ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）へのＴＲＥＭ２抗体の結合速度および親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００、またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）８Ｋ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ）などの表面プラズモン共鳴バイオセンサーを使用して決定される。
【0036】
サンプルを１×ＨＢＳ－ＥＰ＋泳動用緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ）に溶解し、プロテインＡ結合ＣＭ５シリーズＳセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して抗体を捕捉する。結合は、複数の分析サイクルを使用して評価する。各サイクルは、抗体捕捉について５０μｌ／分、ならびにリガンドの結合および解離について３０μｌ／分の流速で、３７℃で行う。各サイクルは、以下からなる：１５０～２５０反応単位の捕捉を目的とした７μｌの抗体の１μｇ／ｍｌでの注入、ヒト、カニクイザル、ウサギ、ラット、またはマウスのＴＲＥＭ２－Ｈｉｓ ＥＣＤの注入（２０ｎＭで開始し、各サイクルで２倍段階希釈を使用）、続いて２００秒の結合、続いて８００秒の解離位相、１０ｍＭ塩酸グリシン（ｐＨ１．５）を使用した３０秒にわたる接触時間での再生。各サイクルの結合速度（すなわち、ｋｏｎ）および解離速度（すなわち、ｋｏｆｆ）は、標準的な二重参照を使用して評価し、パラレルキネティクスバッチモードでのＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価において「１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合」モデルに適合する。ＫＤ＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの関係による結合速度から親和性（ＫＤ）を算出する。参照抗体Ａの二相性結合データのため、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価で見つかった不均一リガンド２：１結合モデリングを使用して、ＫＤを算出した。不均一リガンド２：１は、ＫＤ値を算出するために２つのｋｏｎ値および２つのｋｏｆｆ値を報告する。抗体１および参照抗体Ａの場合は、Ｎ＝３、参照抗体Ｂの場合は、ｎ＝１。
【0037】
基本的に上記のように行った実験において、以下のデータを取得した。
＃２００ｎＭのＴＲＥＭ２で、バックグラウンドを超える結合は検出されなかった
【表2】
【0038】
これらのデータは、抗体１がヒトＴＲＥＭ２およびカニクイザルＴＲＥＭ２に高い（ｐＭ）親和性で結合したことを示している。抗体１も、ｎＭ親和性でマウスＴＲＥＭ２に結合し、ラットＴＲＥＭ２には結合しなかった。抗体１は、参照抗体Ａおよび参照抗体Ｂと比較して高い親和性でヒトＴＲＥＭ２に結合し、また抗体１は、参照抗体Ａと比較して高い親和性でカニクイザルＴＲＥＭ２にも結合した。試験した抗体について、ウサギＴＲＥＭ２には結合が検出されなかった。
【0039】
同様の実験を２５℃で行い、以下のデータを取得した。抗体１は、ヒト、マウス、およびカニクイザルのＴＲＥＭ、およびヒトＲ４７Ｈ ＴＲＥＭ変異体に結合し、結合親和性はそれぞれ１５０ｐＭ、３．９ｎＭ、４３ｐＭ、および２９０ｐＭであった。Ｒ４７Ｈ変異体は、アルツハイマー病の発症に関連している。これらのデータは、抗体１がＲ４７Ｈ ＴＲＥＭに結合できることを示している。
【0040】
実施例：ＴＲＥＭ２発現細胞への抗体１の結合
抗体１がＴＲＥＭ２発現細胞に結合するかどうかを調べるために、結合実験を行う。ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４細胞株は、ヒトＴＲＥＭ２およびそのアダプターＤＮＡＺアダプタータンパク質１２（ＤＡＰ１２）を発現するように形質導入されている。結合を評価するために、抗体１の存在下で５００，０００個の細胞を、３倍、１２点滴定を３０μｇ／ｍｌで開始し、３７℃で３０分間インキュベートする。抗体結合を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を使用して検出する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定する。
抗体１がＴＲＥＭ２発現細胞に結合するかどうかを調べるために、結合実験を行う。ＢＷ５１４７．Ｇ．１．４細胞株は、ヒトＴＲＥＭ２およびそのアダプターＤＮＡＺアダプタータンパク質１２（ＤＡＰ１２）を発現するように形質導入されている。結合を評価するために、抗体１の存在下で５００，０００個の細胞を、３倍、１２点滴定を３０μｇ／ｍｌで開始し、３７℃で３０分間インキュベートする。抗体結合を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を使用して検出する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定する。
【0041】
基本的に上記の手順に従って、抗体１は、ＴＲＥＭ２に結合し、０．０８μｇ／ｍｌのＥＣ５０でＢＷ５１４７．Ｇ．１．４細胞を発現した。これらのデータは、抗体１が細胞膜に結合したＴＲＥＭ２に結合することを示した。
【0042】
実施例：ＴＲＥＭ２シグナル伝達の阻害
リガンドの存在下でのＴＲＥＭ２抗体媒介性ＮＦＡＴ活性化の影響を調べるために、ホスファチジルセリン（ＰＳ、Ａｖａｎｔｉ脂質）をＴＲＥＭ２リガンドとして使用する。ウェルあたり１．５ｍＭのＰＳを含有する９６ウェルプレートを、室温で３時間乾燥させる。ＴＲＥＭ２ ＮＦＡＴルシフェラーゼＢＷ５１４７．Ｇ．１４レポーター細胞（ウェルあたり４００，０００細胞）を、アイソタイプ対照抗体または抗体１の存在下でＰＳコーティングプレートにプレーティングし、５倍、８点滴定を３０μｇ／ｍｌで開始する。３７℃で１８時間インキュベートした後、Ｐｉｅｒｃｅ Ｆｉｒｅｆｌｙ ルシフェラーゼフラッシュアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１０５プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して発光を検出する。
リガンドの存在下でのＴＲＥＭ２抗体媒介性ＮＦＡＴ活性化の影響を調べるために、ホスファチジルセリン（ＰＳ、Ａｖａｎｔｉ脂質）をＴＲＥＭ２リガンドとして使用する。ウェルあたり１．５ｍＭのＰＳを含有する９６ウェルプレートを、室温で３時間乾燥させる。ＴＲＥＭ２ ＮＦＡＴルシフェラーゼＢＷ５１４７．Ｇ．１４レポーター細胞（ウェルあたり４００，０００細胞）を、アイソタイプ対照抗体または抗体１の存在下でＰＳコーティングプレートにプレーティングし、５倍、８点滴定を３０μｇ／ｍｌで開始する。３７℃で１８時間インキュベートした後、Ｐｉｅｒｃｅ Ｆｉｒｅｆｌｙ ルシフェラーゼフラッシュアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＥｎｖｉｓｉｏｎ ２１０５プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して発光を検出する。
【0043】
基本的に上記のように行った実験において、抗体１は、０．４０μｇ／ｍｌのＩＣ５０で、濃度依存的にＰＳ媒介性ＮＦＡＴ活性化を阻害した。対照抗体は、ＰＳ媒介性ＮＦＡＴ活性化を阻害しなかった。これらのデータは、抗体１がリガンドによって引き起こされるＴＲＥＭ２シグナル伝達を阻害できることを示している。
【0044】
実施例：マクロファージにおけるＴＲＥＭ２活性化の阻害
マクロファージにおけるＴＲＥＭ２活性化に対する抗体１の影響を調べるために、
マクロファージを、抗体１またはアイソタイプ対照抗体の存在下または非存在下で、ＰＤＡＰＰ脳組織切片（ＴＲＥＭ２の生理学的内因性リガンドを含む）上で培養する。
マクロファージにおけるＴＲＥＭ２活性化に対する抗体１の影響を調べるために、
マクロファージを、抗体１またはアイソタイプ対照抗体の存在下または非存在下で、ＰＤＡＰＰ脳組織切片（ＴＲＥＭ２の生理学的内因性リガンドを含む）上で培養する。
【0045】
骨髄由来マクロファージを、５０ｎｇ／ｍｌ ＣＳＦ－１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）の存在下で骨髄細胞を５日間培養することによって生成する。ＴＲＥＭ２の活性化を誘導するために、３μｇ／ｍｌまたは１２μｇ／ｍｌの対照抗体または抗体１の存在下で、ＰＤＡＰＰアミロイド前駆体トランスジェニックマウスの脳組織切片上に４００，０００個のマクロファージを３日間プレーティングする。ＴＲＥＭ２活性化の直接生成物であるオステオポンチンのレベルを、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して上清で測定する。
【0046】
基本的に上記の手順に従って、次のデータを取得した。
【0047】
【表3】
【0048】
実施例：インビボでのタウ媒介性神経変性中のミクログリア活性化状態に対する抗体１の影響
インビボでのタウ媒介性神経変性中のミクログリア活性化状態に対する抗体１の影響を評価するために、抗体１を７ヵ月齢の雌ｒＴｇ４５１０Ｐ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスにゼロ日目に投与し、３倍、６点滴定を体重１グラムあたりの３００ｍｇで開始した。７日目に、マウスを犠牲にし、ＲＮＡ分析のために脳組織を採取する。ＴＲＥＭ２依存性遺伝子であるＣｌｅｃ７ａは、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイを使用して海馬で測定し、相対的発現をハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔに対して正規化する。
インビボでのタウ媒介性神経変性中のミクログリア活性化状態に対する抗体１の影響を評価するために、抗体１を７ヵ月齢の雌ｒＴｇ４５１０Ｐ３０１Ｌタウトランスジェニックマウスにゼロ日目に投与し、３倍、６点滴定を体重１グラムあたりの３００ｍｇで開始した。７日目に、マウスを犠牲にし、ＲＮＡ分析のために脳組織を採取する。ＴＲＥＭ２依存性遺伝子であるＣｌｅｃ７ａは、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲアッセイを使用して海馬で測定し、相対的発現をハウスキーピング遺伝子Ｈｐｒｔに対して正規化する。
【0049】
基本的に上記の手順に従って、次のデータを取得した。
【表4】
【0050】
実施例：主要組織適合遺伝子複合体関連ペプチドプロテオミクス
抗体１の免疫原性の可能性を調べるために、主要組織適合遺伝子複合体関連ペプチドプロテオミクス（ＭＡＰＰ）アッセイを行う。１０人の正常なヒトドナーからの初代ヒト樹状細胞を、抗ＣＤ１４ビーズおよび磁気分離器でＣＤ１４陽性細胞を分離することにより、バフィーコートから調製する。ＣＤ１４陽性細胞を１ウェルあたり５×１０６細胞でプレーティングし、１０％ウシ胎仔血清を含有する完全ＲＰＭＩ培地で、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４および４０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦとともに３７℃、かつ５％ＣＯ２で３日間インキュベートすることにより、未成熟樹状細胞に分化させた。４日後（４日目）に培地を交換し、３μＭの抗体を含有する新鮮な培地を細胞に添加する。５日目に、５μｇ／ｍｌのＬＰＳを添加して、細胞を成熟樹状細胞に形質転換する。６日目に、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む１ｍＬのＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、溶解物を－８０℃で凍結する。
抗体１の免疫原性の可能性を調べるために、主要組織適合遺伝子複合体関連ペプチドプロテオミクス（ＭＡＰＰ）アッセイを行う。１０人の正常なヒトドナーからの初代ヒト樹状細胞を、抗ＣＤ１４ビーズおよび磁気分離器でＣＤ１４陽性細胞を分離することにより、バフィーコートから調製する。ＣＤ１４陽性細胞を１ウェルあたり５×１０６細胞でプレーティングし、１０％ウシ胎仔血清を含有する完全ＲＰＭＩ培地で、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－４および４０ｎｇ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦとともに３７℃、かつ５％ＣＯ２で３日間インキュベートすることにより、未成熟樹状細胞に分化させた。４日後（４日目）に培地を交換し、３μＭの抗体を含有する新鮮な培地を細胞に添加する。５日目に、５μｇ／ｍｌのＬＰＳを添加して、細胞を成熟樹状細胞に形質転換する。６日目に、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む１ｍＬのＲＩＰＡ緩衝液に溶解し、溶解物を－８０℃で凍結する。
【0051】
凍結した溶解物を解凍し、５～１０秒間ホモジナイズすることにより、ＭＨＣ－ＩＩ分離用のサンプルを調製する。ホモジナイズした溶解物を遠心分離により清澄化する。ＭＨＣ－ＩＩ複合体の免疫沈降は、ストレプトアビジンビーズに結合したビオチン化抗ＭＨＣ－ＩＩ抗体を使用して行う。結合した複合体は、５％酢酸、０．１％ＴＦＡで溶出する。ＭＨＣ－ＩＩペプチドは、溶出液を事前に洗浄した１０ｋ ＭＷＣＯフィルターに通すことにより、共溶出する受容体タンパク質から分離させる。分離したＭＨＣ－ＩＩペプチドを、Ｔｈｅｒｍｏ ＱＥ－ＨＦＸ質量分析計を使用したナノＬＣ／ＭＳによって分析する。ペプチドの同定は、酵素を使用しない検索アルゴリズムと、試験される抗体の相補性決定領域からＭＨＣ－ＩＩペプチドを表示するドナーの割合を決定するために、試験抗体配列が追加されたウシ／ヒトデータベースとを使用してプロテオミクスパイプラインによって生成さる。
【0052】
基本的に上記の手順に従って、抗体１は、重鎖ＣＤＲ３内に非生殖細胞クラスターを示した０％のドナーによって示されるように、免疫原性のリスクが低いことを示した。
【0053】
配列
抗体１ＬＣＤＲ１（配列番号１）
ＲＡＳＱＡＩＲＤＤＬＧ
抗体１ＬＣＤＲ２（配列番号２）
ＹＡＡＳＳＬＱＳ
抗体１ＬＣＤＲ３（配列番号３）
ＬＱＮＹＮＹＰＨＴ
抗体１ＨＣＤＲ１（配列番号４）
ＧＦＳＦＮＴＹＷＩＧ
抗体１ＣＤＲ２（配列番号５）
ＩＩＹＰＧＤＱＤＩＲＹＳＰＳＦＱＧ
抗体１ＨＣＤＲ３（配列番号６）
ＡＲＹＧＲＹＩＹＧＹＧＧＹＨＧＭＤＶ
抗体１ＬＣＶＲ（配列番号７）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＡＩＲＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＮＹＮＹＰＨＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
抗体１ＨＣＶＲ（配列番号８）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＦＳＦＮＴＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＤＱＤＩＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＹＧＲＹＩＹＧＹＧＧＹＨＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
抗体１ＬＣ（配列番号９）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＡＩＲＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＮＹＮＹＰＨＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
抗体１ＨＣ（配列番号１０）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＦＳＦＮＴＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＤＱＤＩＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＹＧＲＹＩＹＧＹＧＧＹＨＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ
ヒトＥＣＤ ＴＲＥＭ２－Ｈｉｓ（配列番号１１）
ＨＮＴＴＶＦＱＧＶＡＧＱＳＬＱＶＳＣＰＹＤＳＭＫＨＷＧＲＲＫＡＷＣＲＱＬＧＥＫＧＰＣＱＲＶＶＳＴＨＮＬＷＬＬＳＦＬＲＲＷＮＧＳＴＡＩＴＤＤＴＬＧＧＴＬＴＩＴＬＲＮＬＱＰＨＤＡＧＬＹＱＣＱＳＬＨＧＳＥＡＤＴＬＲＫＶＬＶＥＶＬＡＤＰＬＤＨＲＤＡＧＤＬＷＦＰＧＥＳＥＳＦＥＤＡＨＶＥＨＳＩＳＲＳＬＬＥＧＥＩＰＦＰＰＴＳＨＨＨＨＨＨ
マウスＥＣＤ ＴＲＥＭ２－Ｈｉｓ（配列番号１２）
ＬＮＴＴＶＬＱＧＭＡＧＱＳＬＲＶＳＣＴＹＤＡＬＫＨＷＧＲＲＫＡＷＣＲＱＬＧＥＥＧＰＣＱＲＶＶＳＴＨＧＶＷＬＬＡＦＬＫＫＲＮＧＳＴＶＩＡＤＤＴＬＡＧＴＶＴＩＴＬＫＮＬＱＡＧＤＡＧＬＹＱＣＱＳＬＲＧＲＥＡＥＶＬＱＫＶＬＶＥＶＬＥＤＰＬＤＤＱＤＡＧＤＬＷＶＰＥＥＳＳＳＦＥＧＡＱＶＥＨＳＴＳＲＮＱＥＴＳＦＰＰＴＳＨＨＨＨＨＨ
ウサギＥＣＤ ＴＲＥＭ２－ＨＩＳ（配列番号１３）
ＮＴＴＶＦＱＧＶＡＧＱＳＬＲＶＳＣＰＹＤＳＡＴＨＷＧＲＲＫＡＷＣＲＱＬＧＥＥＧＰＣＥＲＶＶＳＴＨＳＷＷＬＬＳＦＬＫＲＲＮＧＳＴＡＩＴＤＤＡＬＧＧＴＬＴＶＴＬＲＤＬＱＡＱＤＡＧＶＹＱＣＱＳＬＱＧＲＥＡＳＴＬＱＫＩＬＶＥＶＬＴＥＰＬＥＨＥＨＡＧＤＦＷＶＰＥＥＳＧＳＦＥＤＰＰＶＥＲＳＳＳＲＳＰＳＥＧＥＰＳＦＰＰＡＳＧＧＧＧＱＨＨＨＨＨＨ
ラットＥＣＤ ＴＲＥＭ２－Ｈｉｓ（配列番号１４）
ＮＴＴＶＬＱＧＶＡＧＱＳＬＲＶＳＣＴＹＤＡＬＲＨＷＧＲＲＫＡＷＣＲＱＬＡＥＥＧＰＣＱＲＶＶＳＴＨＧＶＷＬＬＡＦＬＲＫＱＮＧＳＴＶＩＴＤＤＴＬＡＧＴＶＴＩＴＬＲＮＬＱＡＧＤＡＧＬＹＱＣＱＳＬＲＧＲＥＡＥＶＬＱＫＶＶＶＥＶＬＥＤＰＬＤＤＱＤＡＧＤＬＷＶＰＥＥＳＥＳＦＥＧＡＱＶＥＨＳＴＳＲＳＱＳＧＧＧＧＱＨＨＨＨＨＨ
カニクイザルＥＣＤ ＴＲＥＭ２－Ｈｉｓ（配列番号１５）
ＨＮＴＴＶＦＱＧＶＥＧＱＳＬＱＶＳＣＰＹＤＳＭＫＨＷＧＲＲＫＡＷＣＲＱＬＧＥＫＧＰＣＱＲＶＶＳＴＨＮＬＷＬＬＳＦＬＲＲＲＮＧＳＴＡＩＴＤＤＴＬＧＧＴＬＴＩＴＬＲＮＬＱＰＨＤＡＧＦＹＱＣＱＳＬＨＧＳＥＡＤＴＬＲＫＶＬＶＥＶＬＡＤＰＬＤＨＲＤＡＧＤＬＷＶＰＧＥＳＥＳＦＥＤＡＨＶＥＨＳＩＳＲＰＳＱＧＳＨＬＰＳＣＬＳＫＥＧＧＧＧＱＨＨＨＨＨＨ
抗体１ＬＣＤＲ１（配列番号１）
ＲＡＳＱＡＩＲＤＤＬＧ
抗体１ＬＣＤＲ２（配列番号２）
ＹＡＡＳＳＬＱＳ
抗体１ＬＣＤＲ３（配列番号３）
ＬＱＮＹＮＹＰＨＴ
抗体１ＨＣＤＲ１（配列番号４）
ＧＦＳＦＮＴＹＷＩＧ
抗体１ＣＤＲ２（配列番号５）
ＩＩＹＰＧＤＱＤＩＲＹＳＰＳＦＱＧ
抗体１ＨＣＤＲ３（配列番号６）
ＡＲＹＧＲＹＩＹＧＹＧＧＹＨＧＭＤＶ
抗体１ＬＣＶＲ（配列番号７）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＡＩＲＤＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＮＹＮＹＰＨＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
抗体１ＨＣＶＲ（配列番号８）
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抗体１ＬＣ（配列番号９）
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抗体１ＨＣ（配列番号１０）
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ヒトＥＣＤ ＴＲＥＭ２－Ｈｉｓ（配列番号１１）
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マウスＥＣＤ ＴＲＥＭ２－Ｈｉｓ（配列番号１２）
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ウサギＥＣＤ ＴＲＥＭ２－ＨＩＳ（配列番号１３）
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ラットＥＣＤ ＴＲＥＭ２－Ｈｉｓ（配列番号１４）
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カニクイザルＥＣＤ ＴＲＥＭ２－Ｈｉｓ（配列番号１５）
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【配列表】