7368809 抗ＳＩＲＰα抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-17

(45)【発行日】2023-10-25

(54)【発明の名称】抗ＳＩＲＰα抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20231018BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20231018BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20231018BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20231018BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20231018BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20231018BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20231018BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20231018BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20231018BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20231018BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20231018BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20231018BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P35/00

A61P35/02

A61K45/00

A61K39/395 N

【請求項の数】 26

(21)【出願番号】P 2020530192

(86)(22)【出願日】2019-07-09

(86)【国際出願番号】 JP2019027114

(87)【国際公開番号】W WO2020013170

(87)【国際公開日】2020-01-16

【審査請求日】2022-02-14

(31)【優先権主張番号】P 2018131116

(32)【優先日】2018-07-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504150450

【氏名又は名称】国立大学法人神戸大学

(73)【特許権者】

【識別番号】307010166

【氏名又は名称】第一三共株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】的崎 尚

(72)【発明者】

【氏名】須江 真由美

(72)【発明者】

【氏名】中村 健介

(72)【発明者】

【氏名】吉村 千草

【審査官】市島 洋介

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／１７８６５３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２０１４－５２５９４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－１６９２２０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１７－５１０２５１（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３３７０５３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】がん分子標的治療，2017年，Vol.15, No.4，pp.414-419

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（a）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
（c）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
（d）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（e）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
（f）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３
を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。

【請求項2】

重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、請求項１記載の抗体。

【請求項3】

重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、請求項１又は２に記載の抗体。

【請求項4】

重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、請求項３記載の抗体。

【請求項5】

(ai)配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域若しくは
(aii)配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖可変領域、並びに
(bi)配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域若しくは
(bii)配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖可変領域
を含み、
（a）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
（c）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
（d）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（e）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
（f）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３を含み、
重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、請求項１記載のヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。

【請求項6】

重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、請求項５記載の抗体。

【請求項7】

重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、請求項６記載の抗体。

【請求項8】

以下の（１）～（８）のいずれかの、
（a）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
（c）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
（d）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（e）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
（f）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３を含む、
請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体：
（１）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（２）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（３）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３９の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（４）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３９の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（５）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３５の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（６）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３５の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（７）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；及び
（８）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。

【請求項9】

ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性が低減されている、請求項８記載の抗体。

【請求項10】

マクロファージの貪食作用を増強する請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗体であって、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合性断片。

【請求項13】

Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１２に記載の抗体の抗原結合性断片。

【請求項14】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１２若しくは１３に記載の抗体の抗原結合性断片を有効成分として含む医薬組成物。

【請求項15】

抗腫瘍剤である、請求項１４記載の医薬組成物。

【請求項16】

抗腫瘍剤の有効成分として、さらに免疫チェックポイント阻害剤及び／又はがん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬を含む、請求項１５記載の医薬組成物。

【請求項17】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体又は請求項１２若しくは１３に記載の抗体の抗原結合性断片を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はがん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬と併用される抗腫瘍剤である医薬組成物。

【請求項18】

免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤である、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

がん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＧＦＲ抗体からなる群から選択される、請求項１６又は１７に記載の医薬組成物。

【請求項20】

腫瘍が、がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、胚細胞腫、脳腫瘍、カルチノイド、神経芽腫、網膜芽細胞腫及び腎芽腫からなる群から選択される一種又は複数種の腫瘍である、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項21】

腫瘍が、腎がん、メラノーマ、有棘細胞がん、基底細胞がん、結膜がん、口腔がん、喉頭がん、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、虫垂がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん、膣がん、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、未分化多型肉腫、粘液型線維肉腫、悪性末梢性神経鞘腫、後腹膜肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、類上皮肉腫、B細胞リンパ腫、Ｔ・ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、精巣がん、卵巣がん、神経膠腫及び髄膜腫からなる群から選択される一種又は複数種の腫瘍である、請求項２０記載の医薬組成物。

【請求項22】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。

【請求項23】

請求項２２記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

【請求項24】

請求項２２記載のポリヌクレオチド又は請求項２３記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項25】

請求項２４に記載の宿主細胞を培養し、培養物から抗体を精製することを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体の製造方法。

【請求項26】

請求項２５記載の方法によって製造された抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腫瘍の治療に有用な抗ＳＩＲＰα抗体、及び該抗体を含む抗腫瘍剤に関する。

【背景技術】

【0002】

ＳＩＲＰα（ＳＨＰＳ－１）は、マクロファージ、樹状細胞、好中球などのミエロイド細胞、及びグリア細胞に存在するＩｇスーパーファミリーの１回膜貫通型分子である（非特許文献１）。細胞外領域は１つのＩｇＶドメインと２つのＩｇＣドメインからなり、ＣＤ４７との結合部位であるＩｇＶドメインについては、ヒトでは１０種類のバリアントが報告されている（非特許文献２）。一方、細胞内領域はｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ（ＩＴＩＭ）を含み、ＣＤ４７との結合によりチロシン脱リン酸化酵素であるＳＨＰ－１、及びＳＨＰ－２への結合が誘導され抑制性のシグナルが伝えられる。

【0003】

ＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用による生理現象としては、マクロファージ上のＳＩＲＰαに赤血球上のＣＤ４７が結合し“Ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ”シグナルを伝えることで、赤血球の不必要な貪食を回避することが示されている（非特許文献３）。一方、腫瘍微小環境下においても、マクロファージや樹状細胞上のＳＩＲＰαに腫瘍細胞に高発現するＣＤ４７が結合することで、腫瘍細胞に対する貪食能を抑制することが示唆されている。貪食能の抑制は、その後のＴ細胞への腫瘍抗原提示の抑制、更には腫瘍免疫応答の抑制に繋がることが予想される。よって、腫瘍細胞の貪食という免疫現象は、腫瘍抗原の取り込み（エントリー）に対するチェックポイントに当たると考えられる。

【0004】

これまでに、ＳＩＲＰαのリガンドであるＣＤ４７に対する抗体でＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用を阻害することにより、腫瘍細胞に対する貪食能を増強することが報告されており（非特許文献４）、これは抗ＳＩＲＰα抗体を用いた場合でも、腫瘍細胞を免疫細胞に引き寄せるエフェクター活性を持つような抗癌抗体併用条件下では同様の現象が示されている（非特許文献５及び６）。また、抗ＣＤ４７抗体を用いた同種マウス担癌モデルでは、抗腫瘍効果だけでなく、腫瘍免疫を誘導することが示唆されており（非特許文献７）、抗ＳＩＲＰα抗体についても、抗癌抗体併用条件下では同様の効果が期待できる。

【0005】

一方で、免疫チェックポイント阻害剤として、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１などＴ細胞上の免疫抑制性分子に対する抗体が複数開発されており、臨床でもその効果が実証されている（非特許文献８及び９）。ＳＩＲＰα－ＣＤ４７は現在証明されている唯一の貪食抑制分子であり、この分子に対する阻害抗体は、Ｔ細胞以外の標的に対する新たなチェックポイント阻害剤としての可能性が予想され、従来の免疫チェックポイント阻害剤に抵抗性の患者に対しても、広く効果を示す可能性も持ち合わせている。

【0006】

これまでに、抗マウスＳＩＲＰα抗体（ＭＹ－１）を用いたヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ皮下移植モデルでの検討により、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂとの併用で抗腫瘍効果が示されている。また、マウス大腸がんモデルではＰＤ－１抗体との併用で抗腫瘍効果が認められている（非特許文献５）。加えて、クローンの異なる抗ｍＳＩＲＰα抗体（Ｐ８４）を用いた検討では、マウス肝臓がんモデルで抗ＰＤ－Ｌ１抗体や抗４－１ＢＢ抗体との併用でも抗腫瘍効果及び延命効果が認められている。延命効果を示したマウスに同じ腫瘍細胞を再移植した際も、更なる抗腫瘍効果、延命効果が得られていることから、異なる免疫チェックポイントを阻害することで、強い腫瘍免疫応答を誘導できる可能性を示している（特許文献１）。これらの結果は、従来から予想されたエフェクター活性を持つ抗癌抗体との併用のみならず、Ｔ細胞を標的とした免疫チェックポイント阻害剤との併用においても併用効果を示した例であり、抗ヒトＳＩＲＰα抗体においても、同様の効果が期待できる。
近年、各社から抗ＳＩＲＰα抗体に関する特許の報告が相次いでいる（特許文献１、２及び３）。例えば、ＯＳＥ－１７２はＩｇＧ４Ｐｒｏ型の抗体であり、ＳＩＲＰαのＶ１タイプとＳＩＲＰβ１に結合性を示すが、ＳＩＲＰαのＶ２タイプとＳＩＲＰγには結合性を示さない。ＫＷＡＲ２３はＩｇＧ１Ｎ２７９Ａ型の抗体であり、１０種類のＳＩＲＰαバリアント並びにＳＩＲＰβ１及びＳＩＲＰγに結合性を示す。ＡＤＵ－１８０５はＩｇＧ２型の抗体であり、１０種類のＳＩＲＰαバリアントとＳＩＲＰγへの結合性を示す。いずれの抗体が医薬として最も適切か未解明であり、優れた抗体を取得する努力が続けられている。

【0007】

更に、抗ＣＤ４７抗体を用いた検討では、前述のような抗体医薬以外に従来からＳＯＣ（標準療法：Ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｃａｒｅ）として広く用いられている化学療法剤、放射線療法との併用でも、十分な抗腫瘍効果、延命効果を示すことが報告されている。特に、化学療法剤との併用事例では、化学療法剤を事前に投与し、続いて抗ＣＤ４７抗体を投与することで、化学療法剤と抗ＣＤ４７抗体の同時投与よりも強い抗腫瘍効果、延命効果を示すことから（非特許文献７）、化学療法剤の前投与により腫瘍抗原を取り込み易いような環境を準備することで、ＳＩＲＰα－ＣＤ４７相互作用の阻害による抗原取り込み能（免疫賦活化能）の効果を増強できる可能性を示している。

【0008】

以上のことから、抗ＳＩＲＰα抗体は種々の抗腫瘍剤との併用により、より強い腫瘍免疫応答を誘導しうる薬剤であると推測できる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】国際公開第WO2017/178653号

【文献】国際公開第WO2018/026600号

【文献】国際公開第WO2018/190719号

【非特許文献】

【0010】

【文献】Matozaki et al. Trends in cell biol. 2009(19) 2, 72-80

【文献】Takenaka et al. Nat Immunol. 2007(8)12, 1313-1323

【文献】Matozaki et al. Trends in cell biol. 2009(19) 2, 72-80

【文献】Liu et al. Plos One, 2015 (10) 9

【文献】Yanagita et al. JCI Insight, 2017 (2) 1, 1-15

【文献】Ring et al. PNAS, 2017 (114) 49, E10578-E10585

【文献】Liu et al, Nat Med. 2015 (21) 10, 1209-1215

【文献】Lee et al. The Oncologist, 2017（22）11, 1392-1399

【文献】Weinstock et al. Clin Can Res. 2017（23）16, 4534-4539

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本発明は、抗腫瘍剤として用いることができる抗ＳＩＲＰα抗体、及び該抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤の提供を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明者らは、貪食能を有する貪食細胞に発現しているＳＩＲＰαと腫瘍細胞に発現しているＣＤ４７との相互作用を抗ＳＩＲＰα抗体により阻害し、腫瘍細胞から貪食細胞に“Ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ－ｍｅ”シグナルが伝達されるのを阻害し、貪食細胞による腫瘍細胞の貪食作用を増強する方法について検討を行った。本発明者らは、ＳＩＲＰαに対する親和性がより高く、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との相互作用の阻害効果が高い抗体の作製を試みるとともに、抗ＳＩＲＰα抗体がＡＤＣＣ又はＡＤＣＰといったエフェクター機能を有している場合に、自己の免疫細胞を攻撃してしまう可能性があることを考え、エフェクター機能を有しない抗ＳＩＲＰα抗体の作製についても検討を行った。エフェクター機能を低減させるために、抗体のサブクラスをＩｇＧ４とし、さらに、エフェクター機能を低減させる変異を抗体のＦｃ領域に導入した。その結果、ＳＩＲＰαとＣＤ４７との相互作用を強く阻害するが、エフェクター機能が低減されている抗ＳＩＲＰα抗体を作製することができた。この抗体は、エフェクター細胞のＦｃ受容体に結合せずエフェクター機能を発揮しないので、単独では十分な抗腫瘍作用がない。そこで、エフェクター機能を有する他の抗体医薬や免疫チェックポイント阻害作用を有する他の抗体医薬と併用したところ、良好な抗腫瘍効果を発揮することが確認され、本発明を完成させるに至った。

【0013】

すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]（a）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（b）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
（c）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
（d）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（e）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
（f）配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３
を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[２] 重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、[１]の抗体。
[３] 重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[１]又は[２]の抗体。
[４] 重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[３]の抗体。

【0014】

[５] (ai)配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域若しくは
(aii)配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖可変領域、並びに
(bi)配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域若しくは
(bii)配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖可変領域
を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[６] 重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[５]の抗体。
[７] 重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[６]の抗体。

【0015】

[８]（a）配列番号７で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（b）配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
（c）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
（d）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（e）配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
（f）配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３
を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[９] 重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、[８]の抗体。
[１０] 重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[８]又は[９]のヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[１１] 重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２９の１３９～４６５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[１０]の抗体。

【0016】

[１２] (ai)配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域若しくは
(aii)配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖可変領域、並びに
(bi)配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域若しくは
(bii)配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖可変領域
を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[１３] 重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[１２]のヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[１４] 重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２９の１３９～４６５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[１３]の抗体。

【0017】

[１５]（a）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ１、
（b）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ２、
（c）配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲＬ３、
（d）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ１、
（e）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ２、及び
（f）配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲＨ３
を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[１６] 重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、[１５]の抗体。
[１７] 重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[１５]又は[１６]のヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[１８] 重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号３３の１４４～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[１７]の抗体。

【0018】

[１９] (ai)配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域若しくは
(aii)配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖可変領域、並びに
(bi)配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域若しくは
(bii)配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖可変領域
を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[２０] 重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[１９]のヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[２１] 重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号３３の１４４～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[２０]の抗体。

【0019】

[２２] 以下の（１）～（８）のいずれかの、[１]～[４]のいずれかの抗体：
（１）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（２）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（３）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３９の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（４）配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３９の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（５）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３５の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（６）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３５の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；
（７）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体；及び
（８）配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有する軽鎖からなるヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[２３] ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性が低減されている、[２２]の抗体。

【0020】

[２４] 配列番号５７で表されるヒトＳＩＲＰαの８２番目のＧｌｎ、８３番目のＬｙｓ、８４番目のＧｌｕ、８５番目のＧｌｙを含むエピトープに結合する、ヒトＳＩＲＰαに特異的に結合し、ヒトＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する抗体。
[２５] 重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす変異を含む、[２４]の抗体。
[２６] 重鎖定常領域がヒトＩｇＧ４の重鎖定常領域であり、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンがアラニンへ置換され、２３５位のロイシンがアラニンに置換され、さらに２２８位のセリンがプロリンへ置換されている、[２４]又は[２５]の抗体。
[２７] 重鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である、[２６]の抗体。
[２８] マクロファージの貪食作用を増強する[１]～[２７]のいずれかの抗体。
[２９] [１]～[２８]のいずれかの抗体であって、重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体。

【0021】

[３０] [１]～[２９]のいずれかの抗体の抗原結合性断片。
[３１] Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びｓｃＦｖからなる群から選択される、[３０]の抗体の抗原結合性断片。
[３２] [１]～[２９]のいずれかの抗体又は[３０]若しくは[３１]の抗体の抗原結合性断片を有効成分として含む医薬組成物。
[３３] 抗腫瘍剤である、[３２]の医薬組成物。
[３４] 抗腫瘍剤の有効成分として、さらに免疫チェックポイント阻害剤及び／又はがん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬を含む、[３３]の医薬組成物。
[３５] [１]～[２９]のいずれかの抗体又は[３０]若しくは[３１]の抗体の抗原結合性断片を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はがん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬と併用される医薬組成物。
[３６] 免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤である、[３４]又は[３５]の医薬組成物。
[３７] がん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＥＧＦＲ抗体からなる群から選択される、[３４]又は[３５]の医薬組成物。
[３８] 腫瘍が、がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、胚細胞腫、脳腫瘍、カルチノイド、神経芽腫、網膜芽細胞腫及び腎芽腫からなる群から選択される一種又は複数種の腫瘍である、[３３]～[３７]のいずれかの医薬組成物。
[３９] 腫瘍が、腎がん、メラノーマ、有棘細胞がん、基底細胞がん、結膜がん、口腔がん、喉頭がん、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、虫垂がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん、膣がん、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、未分化多型肉腫、粘液型線維肉腫、悪性末梢性神経鞘腫、後腹膜肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、類上皮肉腫、B細胞リンパ腫、Ｔ・ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、精巣がん、卵巣がん、神経膠腫及び髄膜腫からなる群から選択される一種又は複数種の腫瘍である、[３８]の医薬組成物。
[４０] [１]～[２９]のいずれかの抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
[４１] [４０]のポリヌクレオチドを含むベクター。
[４２] [４０]のポリヌクレオチド又は[４１]のベクターを含む宿主細胞。
[４３] [４２]の宿主細胞を培養し、培養物から抗体を精製することを含む、[１]～[２９]のいずれかの抗体の製造方法。
[４４] [４３]の方法によって製造された抗体。

【0022】

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-131116号の開示内容を包含する。

【発明の効果】

【0023】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、貪食細胞に発現しているＳＩＲＰαと腫瘍細胞に発現しているＣＤ４７との相互作用を強く阻害し、腫瘍細胞から貪食細胞に“Ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ－ｍｅ”シグナルが伝達されるのを阻害する一方で、エフェクター機能を有していないので自己の免疫細胞を攻撃することはないので安全である。

【0024】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、エフェクター機能を有する他の抗体医薬や免疫チェックポイント阻害作用を有する他の抗体医薬と併用することにより、優れた抗腫瘍効果を発揮することができる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1A】抗ＳＩＲＰＡ抗体のエピトープ解析に用いたＳＩＲＰＡコンストラクトの構造（Ａ）及びラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の各コンストラクトに対する反応性を示す図（Ｂ）である。

【図1B】抗ＳＩＲＰＡ抗体のエピトープ解析に用いたｈｍＳＩＲＰＡコンストラクトに対するヒト化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の反応性を示す図（ｉ）-（ｉｖ）、及び抗ＳＩＲＰＡ抗体のエピトープ解析に用いたＳＩＲＰＡコンストラクトのアミノ酸配列（ｖ）を示す図である。

【図2】抗ＳＩＲＰＡ抗体のＦａｂ断片とＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶの複合体全体のリボンモデルを示す図である。

【図3】ヒトＳＩＲＰＡのｂｅｔａ５以前（Ａ）とｂｅｔａ５以降（Ｂ）の領域と抗体ＳＩＲＰＡ抗体（抗体Ｄ１３）との相互作用を示す図である。

【図4】ヒトＳＩＲＰＡのｂｅｔａ５‐６ループ部分の各バリアントのアミノ酸配列の比較を示す図である。

【図5】抗ＳＩＲＰＡ抗体単剤で用いた場合（Ａ）と抗ＳＩＲＰＡ抗体とＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂを併用した場合（Ｂ）の胃癌細胞株に対するＡＤＣＰ活性を示す図である。

【図6】ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３）のヒトＳＩＲＰＡに対する結合性評価の結果を示す図である。

【図7】ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３）のサルＳＩＲＰＡに対する結合性評価の結果を示す図である。

【図8A】ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３）のヒト又はサルＳＩＲＰＡとＣＤ４７の結合阻害活性評価の結果を示す図である（(i):ＳＩＲＰＡ_Ｖ１、(ii)：ＳＩＲＰＡ_Ｖ２、(iii)：サルＳＩＲＰＡ）。

【図8B】ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＦ４４の各アイソタイプ）のヒト又はサルＳＩＲＰＡとＣＤ４７の結合阻害活性評価の結果を示す図である（(i):ＳＩＲＰＡ_Ｖ１、(ii)：ＳＩＲＰＡ_Ｖ２、(iii)：サルＳＩＲＰＡ）。

【図9】抗ＳＩＲＰＡ抗体単剤で用いた場合（Ａ）と抗ＳＩＲＰＡ抗体とＲｉｔｕｘｉｍａｂを併用した場合（Ｂ）のＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株に対するＡＤＣＰ活性を示す図である。

【図10】ヒトキメラ化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体のＰＢＭＣ及びマクロファージに対する毒性評価の結果を示す図である。ＡはｃＤ１３、ｃＦ４４及びｃＦ６３のＰＢＭＣに対するＡＤＣＰ活性を示し、Ｂは定常領域の異なるｃＦ４４抗体のＡＤＣＰ活性を示し、Ｃはマクロファージの存在比を示す。

【図11】抗体Ｄ１３の重鎖可変領域とヒト化抗体重鎖ｈＨ１の可変領域とヒト化抗体重鎖ｈＨ２の可変領域のアミノ酸配列の比較を示す図である。

【図12】抗体Ｄ１３の軽鎖可変領域とヒト化抗体軽鎖ｈＬ２の可変領域とヒト化抗体軽鎖ｈＬ３の可変領域とヒト化抗体軽鎖ｈＬ４の可変領域のアミノ酸配列の比較を示す図である。

【図13A】ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＡのバリアント((i)：Ｖ１、(ii)：Ｖ２、(iii)：Ｖ３及び(iv)：Ｖ４）に対する結合活性を示す図である。

【図13B】ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＡのバリアント((i)：Ｖ５、(ii)：Ｖ６、(iii)：Ｖ７及び(iv)：Ｖ８）に対する結合活性を示す図である。

【図13C】ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＡのバリアント((i)：Ｖ９、(ii)：Ｖ１０、(iii)：サルＳＩＲＰＡ及び(iv)：Ｍｏｃｋ）に対する結合活性を示す図である。

【図14A】ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のマウスＳＩＲＰＡ（(i)：Ｃ５７ＢＬ／６、(ii)：Ｂａｌｂ／ｃ、(iii)：１２９ｓｖ）に対する結合活性を示す図である。

【図14B】ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のマウスＳＩＲＰＡ（(i)：ＮＯＤ、(ii)：Ｍｏｃｋ）に対する結合活性を示す図である。

【図15】ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒト（Ａ及びＢ）、又はサルＳＩＲＰＡ（Ｃ）とＣＤ４７の結合の阻害活性評価の結果を示す図である。

【図16】ヒト化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体単剤で用いた場合（Ａ及びＣ）とヒト化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体とＲｉｔｕｘｉｍａｂを併用した場合（Ｂ及びＤ）の癌細胞株（Ａ及びＢ：Ｒａｊｉ株、Ｃ及びＤ：Ｒａｍｏｓ株）に対するＡＤＣＰ活性を示す図である。

【図17】ｃＤ１３軽鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＤ１３軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。

【図18】ｃＤ１３重鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＤ１３重鎖のアミノ酸配列を示す図である。

【図19】ｃＦ４４軽鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＦ４４軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。

【図20】ｃＦ４４重鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＦ４４重鎖のアミノ酸配列を示す図である。

【図21】ｃＦ６３軽鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＦ６３軽鎖のアミノ酸配列を示す図である。

【図22】ｃＦ６３重鎖をコードするヌクレオチド配列及びｃＦ６３重鎖のアミノ酸配列を示す図である。

【図23】ｈＬ２をコードするヌクレオチド配列及びｈＬ２のアミノ酸配列を示す図である。

【図24】ｈＬ３をコードするヌクレオチド配列及びｈＬ３のアミノ酸配列を示す図である。

【図25】ｈＬ４をコードするヌクレオチド配列及びｈＬ４のアミノ酸配列を示す図である。

【図26】ｈＨ１をコードするヌクレオチド配列及びｈＨ１のアミノ酸配列を示す図である。

【図27】ｈＨ２をコードするヌクレオチド配列及びｈＨ２のアミノ酸配列を示す図である。

【図28】抗体Ｄ１３のＣＤＲ配列を示す図である。

【図29】抗体Ｆ４４のＣＤＲ配列を示す図である。

【図30】抗体Ｆ６３のＣＤＲ配列を示す図である。

【図31】各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体によるヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１／ＣＤ４７結合阻害活性評価の結果（Ａ）、各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体によるヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２／ＣＤ４７結合阻害活性評価の結果（Ｂ）、並びに各種抗体によるヒトＳＩＲＰＡ抗体によるヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１／ＣＤ４７若しくはＳＩＲＰＡ＿Ｖ２／ＣＤ４７結合活性阻害のＩＣ５０値を示す図である。

【図32】各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＢ（Ａ）、ヒトＳＩＲＰＧ（Ｂ）、に対する結合性評価の結果、並びにＡ及びＢの陰性対照となる試験の結果（Ｃ）を示す図である。

【図33】各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体にＲｉｔｕｘｉｍａｂを併用した際のＢｕｒｋｉｔｔ‘ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株（Ｒａｊｉ）に対するＡＤＣＰ活性：１０μg／ｍＬにおけるドナー毎の反応性比較結果のうち、反応時間２時間（Ａ）、反応時間１６時間（Ｂ）、反応時間２時間における濃度依存性比較結果（Ｃ）、及び各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体による、マクロファージ同士が貪食するＳｅｌｆ－ＡＤＣＰ活性（Ｄ）を示す図である。各図中の「Ａｂ－」は抗体を添加しない陰性対照を示し、「＋ Ｒｍａｂ」はＲｉｔｕｘｉｍａｂを同時添加していることを示している。

【図34】ＯＳＥ－１７２抗体重鎖（ＯＳＥ－１７２＿ｈＧ４Ｐｒｏ）及び軽鎖（ＯＳＥ－１７２＿ｈＫ）のアミノ酸配列を示す図である。

【図35】ＫＷＡＲ２３抗体重鎖（ＫＷＡＲ２３＿ｈＧ４Ｐｒｏ）及び軽鎖（ＫＷＡＲ２３＿ｈＫ）のアミノ酸配列を示す図である。

【図36】ＡＤＵ－１８０５抗体重鎖（ＡＤＵ－１８０５＿ｈＧ２）及び軽鎖（ＡＤＵ－１８０５＿ｈＫ）のアミノ酸配列を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0027】

抗ＳＩＲＰα抗体の特性
本発明は、ＳＩＲＰα蛋白質の細胞外ＩｇＶドメインを認識し結合する抗ＳＩＲＰα抗体である。

【0028】

ＳＩＲＰα（ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ α）は、マクロファージ、樹状細胞、好中球などのミエロイド細胞、及びグリア細胞に存在するＩｇスーパーファミリーの１回膜貫通型分子である。細胞外領域は１つのＩｇＶドメインと２つのＩｇＣドメインからなり、ＣＤ４７との結合部位であるＩｇＶドメインについては、ヒトではＶ１～Ｖ１０の１０種類のバリアントが報告されている。ＳＩＲＰα蛋白質の細胞外ＩｇＶドメインは、ＳＩＲＰα蛋白質を構成する３つの細胞外Ｉｇ様ドメインのうちの１つのＩｇＶドメインである。このうち、Ｖ１及びＶ２がメジャーなバリアントであり、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、メジャーなバリアントであるＶ１及びＶ２を含むすべてのバリアントに結合する。本発明において、「ＳＩＲＰα」を「ＳＩＲＰＡ」と称する場合がある。

【0029】

ヒトＳＩＲＰα蛋白質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．：ＮＰ＿００１０３５１１１に開示されている。

【0030】

本発明で用いるモノクローナル抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ウマ、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳動物をＳＩＲＰα又はその断片を免疫原として免疫し、脾臓細胞等とミエローマとを融合し、ハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマが産生分泌する抗体として得ることができる。ハイブリドーマは公知の方法で作製することができる。

【0031】

免疫原としてのＳＩＲＰαは配列情報に基づいて化学合成することもでき、またタンパク質をコードするＤＮＡ配列情報に基づいて公知の方法でリコンビナントタンパク質として得ることもできる。

【0032】

抗体のスクリーニングは任意の方法で行うことができるが、好ましくは、ＳＩＲＰαをコードするＤＮＡでトランスフェクトした動物細胞を用いたＣｅｌｌ－ＥＬＩＳＡによりスクリーニングすればよい。ヒトＳＩＲＰαのＶ１蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５６に、ヒトＳＩＲＰαのＶ２蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５７に示す。

【0033】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害する。
腫瘍細胞はＣＤ４７を高発現しており、貪食能を有する貪食細胞に発現しているＳＩＲＰαとＣＤ４７が結合し相互作用することにより、貪食細胞に“Ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ－ｍｅ”シグナルを伝達し、貪食細胞による貪食から逃れている。抗ＳＩＲＰα抗体は、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害することにより、腫瘍細胞から貪食細胞に“Ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ－ｍｅ”シグナルが伝達されるのを阻害し、貪食細胞による腫瘍細胞の貪食作用を増強する。その結果、抗腫瘍効果を発揮し得る。貪食能を有する貪食細胞として、Ｍ１型、Ｍ２型マクロファージなどのマクロファージやｉｍＤＣ（未成熟樹状細胞）などの樹状細胞等が挙げられる。

【0034】

この際、抗ＳＩＲＰα抗体がエフェクター機能を有し、マクロファージ等の貪食細胞やナチュラルキラー細胞やＴ細胞等のエフェクター細胞のＦｃγレセプター等のＦｃレセプターに結合すると、ＡＤＣＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：抗体依存性細胞傷害）やＡＤＣＰ（Ａｎｔｉｄｏｂｙ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ：抗体依存性細胞貪食能）によりＰＢＭＣ（末梢血単核球）やマクロファージ等の自己のエフェクター細胞を攻撃してしまう。

【0035】

自己の細胞への攻撃を避けるため、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、エフェクター機能が低減されている。その結果、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、単にＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を抑制する作用のみを有し、エフェクター細胞のＦｃレセプターには結合せず、エフェクター機能を発揮しない。

【0036】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、自己の免疫細胞を攻撃することがないため、副作用なしに医薬として安全に用いることができる。

【0037】

ただし、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、エフェクター機能が低減されているため、単独では十分な抗腫瘍効果を発揮しない。そのため、後記するように他の抗腫瘍剤と併用して用いる。

【0038】

エフェクター機能を低減させるためには、抗ＳＩＲＰα抗体のＦｃ部分がマクロファージやＴ細胞のＦｃレセプターに結合しないことが必要である。このため、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体のサブクラスはＩｇＧ４由来のものに置換してある。一般的にヒトＩｇＧサブクラスの中で、ＩｇＧ４はＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＰ活性等のエフェクター機能が低いサブクラスとして知られている（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３５１－１３６１，１９８７）。治療用抗体で正常臓器に発現する分子を標的とする場合にエフェクター機能を介した細胞障害による毒性を回避するためのＩｇＧフォーマットの一つとして利用される（オプジーボなど）。ただし、ＩｇＧ４サブクラスのエフェクター機能が低いといっても、全く無いわけではない。そこで、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は重鎖定常領域にエフェクター機能をさらに低減させるような変異、すなわちＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性の低減をもたらす１アミノ酸以上の置換等の変異を導入している。そのような変異として、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックス（Ｋａｂａｔ ｅｔ．ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，１９９１ Ｆｉｆｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）により示される２３４位のフェニルアラニンのアラニンへの置換（Ｆ２３４Ａ）及び２３５位のロイシンのアラニンへの置換（Ｌ２３５Ａ）が挙げられる（Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，３１０－３１８，２０１２）。このような抗体の変異をＦＡＬＡ変異と呼ぶ。ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンをＥＵナンバリング２３４のフェニルアラニンということもある。

【0039】

また、ＩｇＧ４は抗体重鎖間のＳＳ結合の形成が安定していないので、安定性を高めるために、抗体重鎖間のＳＳ結合の形成を促進させる変異を導入する。このような変異として、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２２８位のセリンのプロリンへの置換（Ｓ２２８Ｐ）が挙げられる（ＡＮＧＡＬ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１０５－１０８，１９９３）。この抗体の変異をＰＲＯ変異と呼ぶ。

【0040】

本発明の抗体の定常領域には、上記のＦＡＬＡ変異及びＰＲＯ変異が同時に導入されていても良い（Ｖａｆａ ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，１１４－１２６，２０１４）。ＦＡＬＡ変異及びＰｒｏ変異の両方の変異を有するＩｇＧ４重鎖を「ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡ」タイプ重鎖、「ＩｇＧ４ＰＦＡＬＡ」タイプ重鎖又は「ＩｇＧ４ｐｆ」タイプ重鎖とも呼ぶ。

【0041】

抗体重鎖定常領域はＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域からなり、ＣＨ１は、ＥＵインデックス１１８から２１５、ヒンジはＥＵインデックス２１６から２３０、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１から３４０、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１から４４６と定義される。ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２３４位のフェニルアラニンから置換されたアラニンは抗体Ｄ１３の重鎖アミノ酸配列を示す配列番号２５の第２５３番目のアラニン、抗体Ｆ４４の重鎖アミノ酸配列を示す配列番号２９の第２５２番目のアラニン及び抗体Ｆ６３の重鎖アミノ酸配列を示す配列番号３３の第２５７番目のアラニンに相当し、２３５位のロイシンから置換されたアラニンは配列番号２５の第２５４番目のアラニン、配列番号２９の第２５３番目のアラニン及び配列番号３３の第２５８番目のアラニンに相当する。また、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスにより示される２２８位のセリンから置換されたプロリンは配列番号２５の第２４７番目のプロリン、配列番号２９の第２４６番目のプロリン及び配列番号３３の第２５１番目のプロリンに相当する。

【0042】

「ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡ」タイプ重鎖の定常領域のアミノ酸配列は、配列番号２５の１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号２９の１３９～４６５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列及び配列番号３３の１４４～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。

【0043】

ヒトＩｇＧ１は、ヒトＩｇＧ サブクラスの中で、補体結合を介したＣＤＣ活性、抗体依存的な細胞障害活性といったエフェクター機能が非常に強く（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３５１－１３６１，１９８７）、治療用抗体で癌に高発現する分子を標的とする場合に、エフェクター機能を介した細胞障害による癌細胞の細胞死誘導を促すことで治療効果を示すＩｇＧフォーマットとして利用される（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、ｒｉｔｕｘｉｍａｂなど）。本発明の抗体のアイソタイプとしてＩｇＧ１を用いる場合は、定常領域のアミノ酸残基の一部を置換することによって、エフェクター機能を調整することが可能である（ＷＯ８８／００７０８９、Ｗ０９４／２８０２７、Ｗ０９４／２９３５１参照）。エフェクター機能を減弱させたＩｇＧ１の変異体としては、ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、IｇＧ１ ＬＡＧＡ（ＩｇＧ１－Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ）等が挙げられる。本発明の抗体の定常領域として、これらの変異が導入されたＩｇＧ１重鎖定常領域を使用することも可能である。

【0044】

ヒトＩｇＧ２は、ヒトＩｇＧ サブクラスの中で、補体結合を介したＣＤＣ活性、抗体依存的な細胞障害活性といったエフェクター機能が非常に弱く（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３５１－１３６１，１９８７）、治療用抗体で正常臓器に発現する分子を標的とする場合にエフェクター機能を介した細胞障害による毒性を回避するためのＩｇＧフォーマットの一つとして利用される（ｄｅｎｏｓｕｍａｂ、ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ、ｂｒｏｄａｌｕｍａｂなど）。本発明の抗体の定常領域として、ＩｇＧ２重鎖定常領域を使用することも可能である。
種交差性については、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、ヒトＳＩＲＰα及びサル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）に結合するが、マウスＳＩＲＰαには結合しない。

【0045】

ヒトキメラ化抗体及びヒト化抗体
本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、ヒトに対する異種抗原性を低下させるために改変したヒトキメラ化抗体及びヒト化抗体も含む。ヒト化抗体はＣＤＲ移植抗体ともいう。

【0046】

ヒトキメラ化抗体
ヒトキメラ化抗体は、ヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域とからなる抗体をいう。ヒトキメラ化抗体は、抗ＳＩＲＰα抗体を産生するハイブリドーマより軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡ及び重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを採取し、ヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡを有する発現ベクターに挿入してヒトキメラ化抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入して発現させることにより作製することができる。

【0047】

重鎖定常領域は、３個のドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３から構成されている。本発明においては、上記のように、キメラ抗体のヒト重鎖定常領域は、ＩｇＧ４サブクラスの重鎖定常領域であってＰｒｏ変異及びＦＡＬＡ変異を有する重鎖定常領域ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡである。また、軽鎖定常領域としてはヒトＩｇに属すればよく、κ又はλ定常領域である。

【0048】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体のヒトキメラ化抗体の例として、ラット抗ヒトＳＩＲＰαモノクローナル抗体Ｄ１３、Ｆ４４及びＦ６３の可変領域を有するヒトキメラ化抗体、抗体ｃＤ１３、抗体ｃＦ４４及び抗体ｃＦ６３が挙げられる。これら３つの抗体は、ヒトＳＩＲＰαとの結合性が高い抗体であり、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合の阻害活性が高い抗体である。この中でも、高い活性を有している抗体ｃＤ１３及び抗体ｃＦ６３が好ましい。

【0049】

抗体ｃＤ１３
抗体ｃＤ１３の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２２の６１～３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図１７）、抗体ｃＤ１３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図１７）。

【0050】

また、抗体ｃＤ１３の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２４の５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図１８）、抗体ｃＤ１３の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図１８）。

【0051】

すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、ヒトＳＩＲＰαに結合する抗ヒトＳＩＲＰα抗体である。

【0052】

また、上記の配列番号２２の６１～３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号２４の５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列とCLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているヌクレオチド配列からなるＤＮＡであって、抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。

【0053】

また、上記の配列番号２２の６１～３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号２４の５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。

【0054】

また、上記の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域も含む。

【0055】

このような配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と、CLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。

【0056】

このような配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。

【0057】

さらに、抗体ｃＤ１３は、軽鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）として、配列番号１で表されるアミノ酸配列（ＧＡＳＫＳＶＲＴＹＭＨ）からなるＣＤＲＬ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列（ＳＡＳＮＬＥＡ）からなるＣＤＲＬ２、配列番号３で表されるアミノ酸配列（ＱＱＳＮＥＰＰＹＴ）からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号４で表されるアミノ酸配列（ＧＦＴＦＳＤＹＧＭＩ）からなるＣＤＲＨ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列（ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹ）からなるＣＤＲＨ２、配列番号６で表されるアミノ酸配列（ＲＹＹＧＦＮＹＰＦＤＹ）からなるＣＤＲＨ３を含む（図２８）。

【0058】

すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む抗体である。

【0059】

上記の各ＣＤＲは、それぞれに表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲも含む。

【0060】

キメラ又はヒト化Ｄ１３抗体は、配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなるＳＩＲＰα変異体には結合するが、配列番号７４又は７５で表されるアミノ酸配列からなるＳＩＲＰα変異体には結合しない。配列番号７３で表されるアミノ酸配列中のＮＱＫＥＧ配列（配列番号７６）は、配列番号７４ではＮＱＫＥＥ配列（配列番号７７）に、配列番号７５ではＳＦＴＥＧ配列（配列番号８０）に置換されており、キメラ又はヒト化Ｄ１３抗体とＳＩＲＰαの結合にＮＱＫＥＧ配列（配列番号７６）が必要であることが明らかになった。なお、Ｘ線結晶構造解析により、抗体ｃＤ１３は配列番号５７で表されるヒトＳＩＲＰαバリアント２のアミノ酸残基Ｇｌｎ８２、Ｌｙｓ８３、Ｇｌｕ８４、Ｇｌｙ８５、Ｈｉｓ８６、Ｐｈｅ８７（各アミノ酸残基の位置は、配列表の配列番号５７に対応している）を介してＳＩＲＰαと結合することが示唆されており、Ｇｌｎ８２、Ｌｙｓ８３、Ｇｌｕ８４、Ｇｌｙ８５からなる配列が、上記ＮＱＫＥＧ配列中のＱＫＥＧ部分に相当する。従って、ＮＱＫＥＧ配列はＤ１３抗体とヒトＳＩＲＰαの結合に必須なエピトープである。ＮＱＫＥＧ配列（配列番号７６）を特異的に認識する抗体、すなわちＮＱＫＥＧ配列（配列番号７６）を有する配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなるＳＩＲＰα変異体には結合するが該配列を有さない配列番号７４又は７５で表されるアミノ酸配列からなるＳＩＲＰα変異体には結合しない抗体を選択することにより、Ｄ１３抗体と同一のエピトープを有する抗体を選択することができる。

【0061】

抗体ｃＦ４４
抗体ｃＦ４４の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２６の６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図１９）、抗体ｃＦ４４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図１９）。

【0062】

また、抗体ｃＦ４４の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号２８の５８～４１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図２０）、抗体ｃＦ４４の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図２０）。

【0063】

すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、ヒトＳＩＲＰαに結合する抗ヒトＳＩＲＰα抗体である。

【0064】

また、上記の配列番号２６の６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号２８の５８～４１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列とCLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているヌクレオチド配列からなるＤＮＡであって、抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。

【0065】

また、上記の配列番号２６の６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号２８の５８～４１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。

【0066】

また、上記の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域も含む。

【0067】

このような配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と、CLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。

【0068】

このような配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。

【0069】

さらに、抗体ｃＦ４４は、軽鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）として、配列番号７で表されるアミノ酸配列（ＫＡＳＫＳＩＳＫＹＬＡ）からなるＣＤＲＬ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列（ＳＧＳＴＬＱＳ）からなるＣＤＲＬ２、配列番号９で表されるアミノ酸配列（ＱＱＨＮＥＹＰＰＴ）からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号１０で表されるアミノ酸配列（ＧＦＴＦＳＮＹＹＭＡ）からなるＣＤＲＨ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列（ＹＩＴＴＧＧＧＳＴＹ）からなるＣＤＲＨ２、配列番号１２で表されるアミノ酸配列（ＡＮＹＧＧＳＹＦＤＹ）からなるＣＤＲＨ３を含む（図２９）。

【0070】

すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む抗体である。

【0071】

上記の各ＣＤＲは、それぞれに表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲも含む。

【0072】

抗体ｃＦ６３
抗体ｃＦ６３の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３０の６１～３９０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図２１）、抗体Ｆ６３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図２１）。

【0073】

また、抗体ｃＦ６３の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列番号３２の５８～４２９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列であり（図２２）、抗体ｃＦ６３の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である（図２２）。

【0074】

すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域及び配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む、ヒトＳＩＲＰαに結合する抗ヒトＳＩＲＰα抗体である。

【0075】

また、上記の配列番号３０の６１～３９０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号３２の５８～４２９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列とCLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているヌクレオチド配列からなるＤＮＡであって、抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。

【0076】

また、上記の配列番号３０の６１～３９０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列又は配列番号３２の５８～４２９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列と相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡに含まれる。

【0077】

また、上記の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域は、配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のみならず、該アミノ酸配列において、１若しくは数個、例えば、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなり、抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の活性、すなわちヒトＳＩＲＰαへの結合活性を有するタンパク質からなる軽鎖可変領域又は重鎖可変領域も含む。

【0078】

このような配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列として、配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と、CLUSTAL W(アラインメントツール）等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータ）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上の配列同一性を有しているものが挙げられる。

【0079】

このような配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質は配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列又は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同一である。

【0080】

さらに、抗体ｃＦ６３は、軽鎖可変領域のＣＤＲ（相補性決定領域）として、配列番号１３で表されるアミノ酸配列（ＥＲＳＳＧＤＩＧＤＳＹＶＳ）からなるＣＤＲＬ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列（ＡＤＤＱＲＰＳ）からなるＣＤＲＬ２、配列番号１５で表されるアミノ酸配列（ＱＳＹＤＳＫＩＤＩ）からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号１６で表されるアミノ酸配列（ＧＦＳＬＡＳＹＳＬＳ）からなるＣＤＲＨ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列（ＲＭＹＹＤＧＤＴＡ）からなるＣＤＲＨ２、配列番号１８で表されるアミノ酸配列（ＤＲＳＭＦＧＴＤＹＰＨＷＹＦＤＦ）からなるＣＤＲＨ３を含む（図３０）。

【0081】

すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含み、さらに、重鎖可変領域のＣＤＲとして、配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、配列番号１８で表されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む抗体である。

【0082】

上記の各ＣＤＲは、それぞれに表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個、好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなるＣＤＲも含む。

【0083】

ヒト化抗体
ヒト化抗体（ＣＤＲ移植抗体）は、ヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の適切な位置に移植した抗体をいう。

【0084】

本発明のヒト化抗ＳＩＲＰα抗体は、ヒトＳＩＲＰαに結合し、かつ、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害することにより、マクロファージの貪食能を増強するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のフレームワーク（ＦＲ：ｆｒａｍｅ ｗｏｒｋ）領域に移植した可変領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体の軽鎖定常領域及び重鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。

【0085】

具体的には、抗体Ｄ１３、抗体Ｆ４４又は抗体Ｆ６３のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域とを連結するように設計したＤＮＡ配列を合成すればよい。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲが良好な抗原結合部位を形成するように選択される。また、必要な場合は、ヒト化抗体のＣＤＲが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい。ＣＤＲを移植したヒト化抗体の作製は、公知のＣＤＲグラフティング技術により行うことができる。

【0086】

上記の方法で、抗体Ｄ１３の重鎖可変領域のＣＤＲ（配列番号１～６に示すアミノ酸からなる６つのＣＤＲ）を有するヒト化抗体の重鎖であって、可変領域のフレームワーク領域の一部のアミノ酸が置換された重鎖として、ヒト化抗体重鎖ｈＨ１及びヒト化抗体重鎖ｈＨ２が挙げられる。また、抗体Ｄ１３の軽鎖可変領域のＣＤＲを有するヒト化抗体の軽鎖であって、可変領域のフレームワーク領域の一部のアミノ酸が置換された軽鎖として、ヒト化抗体軽鎖ｈＬ２、ヒト化抗体軽鎖ｈＬ３及びヒト化抗体軽鎖ｈＬ４が挙げられる。

【0087】

ヒト化抗体重鎖ｈＨ１の全長ヌクレオチド配列を配列番号４０に、アミノ酸配列を配列番号４１に示す。また、ヒト化抗体重鎖ｈＨ２の全長ヌクレオチド配列を配列番号４２に、アミノ酸配列を配列番号４３に示す。配列番号４０及び４２において、１～５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、４１８～１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。また、配列番号４１及び４３において、１～１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列、２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域、１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域のアミノ酸配列である。図１１に抗体Ｄ１３の重鎖可変領域とヒト化抗体重鎖ｈＨ１の可変領域とヒト化抗体重鎖ｈＨ２の可変領域のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）の比較を示す。

【0088】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号４１又は４３の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域と１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖定常領域を有する抗体を含む。

【0089】

ヒト化抗体軽鎖ｈＬ２の全長ヌクレオチド配列を配列番号３４に、アミノ酸配列を配列番号３５に示す。また、ヒト化抗体軽鎖ｈＬ３の全長ヌクレオチド配列を配列番号３６に、アミノ酸配列を配列番号３７に示す。さらに、ヒト化抗体軽鎖ｈＬ４の全長ヌクレオチド配列を配列番号３８に、アミノ酸配列を配列番号３９に示す。配列番号３４、３６及び３８において、１～６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、３８２～７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。配列番号３５、３７及び３９において、１～２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列、２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域、１２８～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域のアミノ酸配列である。図１２に抗体Ｄ１３の軽鎖可変領域とヒト化抗体軽鎖ｈＬ２の可変領域とヒト化抗体軽鎖ｈＬ３の可変領域とヒト化抗体軽鎖ｈＬ４の可変領域のアミノ酸配列（シグナル配列を含む）の比較を示す。

【0090】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、配列番号３５、３７及び３９の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなる可変領域と１２８～２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖定常領域を有する抗体を含む。

【0091】

ヒト化抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ４サブクラスの重鎖定常領域であってＰｒｏ変異及びＦＡＬＡ変異を有する重鎖定常領域ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡである。

【0092】

ヒトＳＩＲＰαとの結合性が高い抗体であり、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合の阻害活性が高い抗体として、ヒト化抗体重鎖ｈＨ１及びヒト化抗体軽鎖ｈＬ３からなる抗体（ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３抗体）、ヒト化抗体重鎖ｈＨ１及びヒト化抗体軽鎖ｈＬ４からなる抗体（ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４抗体）、ヒト化抗体重鎖ｈＨ２及びヒト化抗体軽鎖ｈＬ２からなる抗体（ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２抗体）及びヒト化抗体重鎖ｈＨ２及びヒト化抗体軽鎖ｈＬ３からなる抗体（ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３抗体）が挙げられる。

【0093】

ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３抗体は、配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖を有する抗体である。

【0094】

ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４抗体は、配列番号４１の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び配列番号３９の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖を有する抗体である。

【0095】

ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２抗体は、配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び配列番号３５の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖を有する抗体である。

【0096】

ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３抗体は、配列番号４３の２０～４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖及び配列番号３７の２１～２３４番目のアミノ酸残基からなる軽鎖を有する抗体である。

【0097】

なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られている（Ｔｓｕｂａｋｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ，１３９－１４７，２０１３）。しかし、この重鎖配列の欠失は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用など）には影響を及ぼさない。従って、本発明には重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失した抗体も含まれる。

【0098】

その他の抗体
本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合性断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の抗原結合性断片と呼ぶことができる。抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞傷害活性、補体依存性細胞傷害活性及び補体依存性細胞性細胞傷害活性を挙げることができる。本発明における抗体の抗原結合性断片が保持する機能は、ＳＩＲＰαに対する結合活性である。

【0099】

例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、可変領域（Ｆｖ）、又は重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の断片に含まれる。

【0100】

さらに、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は２種類の抗原に結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、又はそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７－５３９）。

【0101】

本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９－３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６－１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖ断片を二重特異性抗体として使用することもできる。

【0102】

一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９－５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２～１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。

【0103】

ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。

【0104】

また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。

【0105】

本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン－へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗ＳＩＲＰα抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４号参照）。

【0106】

抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。

【0107】

本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７－１１４６）。

【0108】

また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方法も知られている（Ｌｅｅ，Ｈ－Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１－７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１－４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９－３５，Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６－８）。上記の抗体は、本発明における抗体の抗原結合性断片の一種と解釈することも可能である。

【0109】

抗体の産生方法
本発明の抗体は、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、発現用の宿主細胞を該ベクターを用いて形質転換し、宿主細胞を培養することにより、リコンビナント抗体として細胞に産生させることができる。

【0110】

抗体をコードするＤＮＡは、重鎖可変領域をコードするＤＮＡと重鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結することにより重鎖をコードするＤＮＡが得られ、さらに軽鎖可変領域をコードするＤＮＡと軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結することにより軽鎖をコードするＤＮＡが得られる。

【0111】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、上記の重鎖をコードするＤＮＡ及び軽鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、宿主細胞を該ベクターを用いて形質転換し、該宿主細胞を培養して産生させることができる。この際、上記の重鎖をコードするＤＮＡ及び軽鎖をコードするＤＮＡを同じ発現ベクターに導入し、該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換してもよいし、重鎖をコードするＤＮＡと軽鎖をコードするＤＮＡを別々のベクターに挿入し、２つのベクターを用いて宿主細胞を形質転換してもよい。この際、重鎖定常領域をコードするＤＮＡ及び軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを予め導入したベクターに重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを導入してもよい。また、該ベクターは宿主細胞からの抗体の分泌を促進するシグナルペプチドをコードするＤＮＡを含んでいてもよい、この場合、シグナルペプチドをコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡをインフレームで連結しておく。抗体が産生された後にシグナルペプチドを除去することにより、抗体を成熟タンパク質として得ることができる。

【0112】

この際、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡ、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ及び重鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡ、軽鎖可変領域をコードするＤＮＡと軽鎖定常領域をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡをプロモータ、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等のエレメントと機能的に連結してもよい。ここで機能的に連結とは、エレメントがその機能を果たすように連結することをいう。

【0113】

発現ベクターは、動物細胞、細菌、酵母等の宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、公知のプラスミド、ファージ等が挙げられる。発現ベクターの構築に用いられるベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、Ｆｌｅｘｉ（登録商標）ベクター（プロメガ社）、ｐＵＣ１９、ｐＵＥＸ２（アマシャム社製）、ｐＧＥＸ－４Ｔ、ｐＫＫ２３３－２（ファルマシア社製）、ｐＭＡＭ－ｎｅｏ（クロンテック社製）等が挙げられる。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞も酵母、動物細胞等の真核細胞も用いることができるが、真核細胞を用いることが好ましい。例えば、動物細胞として、ヒト胎児腎細胞株であるＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズ・ハムスター・卵巣（ＣＨＯ）細胞等を用いればよい。発現ベクターは公知の方法で宿主細胞に導入し、宿主細胞を形質転換すればよい。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション法等が挙げられる。産生された抗体は、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用して精製することができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィー、その他のクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択し、組み合わせればよい。

【0114】

抗腫瘍剤
本発明は、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤を包含する。ただし、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ４サブクラスの重鎖定常領域であってＰｒｏ変異及びＦＡＬＡ変異を有する重鎖定常領域ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡであり、エフェクター機能を有しておらず、ＳＩＲＰαとＣＤ４７の結合を阻害することにより、“Ｄｏｎ’ｔ－ｅａｔ－ｍｅ”シグナル伝達を阻害する機能のみを有している。そのため、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体のみでは、腫瘍細胞を十分に傷害することはできない。そこで、本発明はエフェクター機能を有し、腫瘍細胞を攻撃し傷害し得る他の抗腫瘍剤や腫瘍細胞による免疫細胞の免疫チェックポイントを阻害する他の抗腫瘍剤と併用する。併用に用いる他の抗腫瘍剤は、腫瘍細胞に結合し、腫瘍細胞とマクロファージ等の貪食細胞とを接触させることができる。そのときに本発明の抗ＳＩＲＰα抗体が腫瘍細胞のＣＤ４７と貪食細胞のＳＩＲＰαとの結合を阻害することにより、貪食細胞の腫瘍細胞の貪食能を増強するので、腫瘍細胞は傷害される。すなわち、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体と他の抗腫瘍剤を併用することにより、相乗的な抗腫瘍効果を発揮することができる。

【0115】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体と併用する抗腫瘍剤として、免疫チェックポイント阻害剤、がん抗原に特異的に結合してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬が挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤としては、ＰＤ－１と、そのリガンドであるＰＤ－Ｌ１との結合阻害剤、又はＣＴＬＡ４阻害剤などが挙げられ、具体的には抗ＰＤ－１抗体（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ、ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ、ＰＤＲ－００１、ＢＩ ７５４０９１）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、ａｖｅｌｕｍａｂ、ｄｕｒｂａｒｕｍａｂ）、抗ＣＴＬＡ４抗体（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ、ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）等が挙げられる。また、がん抗原に特異的に反応してＡＤＣＣ及び／又はＡＤＣＰ活性を有する抗体医薬としては、抗ＣＤ２０抗体（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、抗ＨＥＲ２抗体（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、抗ＥＧＦＲ抗体（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、抗ＣＤ５２抗体（ａｌｅｍｕｔｕｚｕｍａｂ）等が挙げられる。

【0116】

ＡＤＣＣは、Ｆｃγレセプターを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばＮＫ細胞、好中球、及びマクロファージ等）が標的細胞上に結合した抗体を認識して、その後にターゲット細胞の溶解を起こす細胞介在性反応をいう。ＡＤＣＣを担うプライマリー細胞であるＮＫ細胞ではＦｃγＲＩＩＣとＦｃγＲＩＩＩＡが発現しており、単球ではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ及びＦｃγＲＩＩＩＡを発現している。一方、ＡＤＣＰは、Ｆｃレセプターを発現する貪食細胞（例えばマクロファージ、好中球等）が標的細胞上に結合した抗体を認識して、その後、ターゲット細胞を細胞内に貪食する細胞介在性反応をいう。ＡＤＣＰを担うプライマリー細胞である単球ではＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ及びＦｃγＲＩＩＩＡが発現している。

【0117】

本発明は、抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤であって、上記の他の抗腫瘍剤と併用される抗腫瘍剤を含む。

【0118】

さらに、本発明は抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤と上記の他の抗腫瘍剤の両方を含む抗腫瘍剤又はキットを含む。

【0119】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤と上記の他の抗腫瘍剤は同時に投与しても、逐次に投与してもよい。また、投与順は限定されず、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤を投与した後に他の抗腫瘍剤を投与してもよく、他の抗腫瘍剤を投与した後に、本発明の抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む抗腫瘍剤を投与してもよい。

【0120】

本発明の抗腫瘍剤は、がん腫、肉腫、リンパ腫、白血病、骨髄腫、胚細胞腫、脳腫瘍、カルチノイド、神経芽腫、網膜芽細胞腫、腎芽腫から選択される一種又は複数種に対して使用することができる。具体的には、がん腫では、腎がん、メラノーマ、有棘細胞がん、基底細胞がん、結膜がん、口腔がん、喉頭がん、咽頭がん、甲状腺がん、肺がん、乳がん、食道がん、胃がん、十二指腸がん、小腸がん、大腸がん、直腸がん、虫垂がん、肛門がん、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、副腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん、膣がんなどが挙げられ、肉腫では、脂肪肉腫、血管肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、未分化多型肉腫、粘液型線維肉腫、悪性末梢性神経鞘腫、後腹膜肉腫、滑膜肉腫、子宮肉腫、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、類上皮肉腫などが挙げられ、リンパ腫では、B細胞リンパ腫、Ｔ・ＮＫ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫などが挙げられ、白血病では、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群などが挙げられ、骨髄腫では、多発性骨髄腫などが挙げられ、胚細胞腫では、精巣がん、卵巣がんなどが挙げられ、脳腫瘍では、神経膠腫、髄膜腫などが挙げられる。

【0121】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、他の抗腫瘍剤と併用することにより細胞性免疫を増強する。本発明は、抗ＳＩＲＰα抗体を有効成分として含む細胞性免疫増強剤も包含する。該細胞性免疫増強剤においては、ナチュラルキラー細胞及び／又はＴ細胞の機能増強に伴う細胞性免疫を増強する。

【0122】

本発明の抗腫瘍剤は、治療に有効量の抗ＳＩＲＰα抗体と薬学上許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤、補助剤等を含めることができる。「薬学上許容可能な担体」等は、対象疾患の種類や薬剤の投与形態に応じて広い範囲から適宜選択することができる。本発明の抗腫瘍剤の投与方法は適宜選択することができるが、例えば注射投与することができ、局所注入、腹腔内投与、選択的静脈内注入、静脈注射、皮下注射、臓器灌流液注入等を採用することができる。また、注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、又は塩水とグルコース溶液の混合物、各種の緩衝液等からなる担体を用いて製剤化することができる。また粉末状態で製剤化し、使用時に前記液体担体と混合して注射液を調整するようにしてもよい。

【0123】

他の投与方法についても、製剤の開発と共に適宜選択することができる。例えば経口投与の場合には、経口液剤や散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤等を適用することができる。経口液剤の場合には、懸濁剤及びシロップ剤等のような経口液体調整物として、水、シュークロース、ソルビトール、フラクト－ス等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、ごま油、大豆油等の油類、アルキルパラヒドロキシベンゾエート等の防腐剤、ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造することができる。散剤、丸剤、カプセル剤及び錠剤は、ラクト－ス、グルコース、シュークロース、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギニン酸ソーダ等の崩壊剤、マグネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の表面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製剤化することができる。錠剤及びカプセル剤は、投与が容易であるという点において、この発明の組成物における好ましい単位投与形態である。錠剤やカプセル剤を製造する際には、固体の製造担体が用いられる。

【0124】

治療に用いるに有効な抗体の量は、治療する病状の性質、患者の年齢や状態により変更され、最終的には医師が決めればよい。例えば、１回体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ～１００ｍｇである。所定の投与量は１～１８０日に１回投与してもよいし、１日当たり２回、３回、４回又はそれ以上の分割投与とし適当な間隔で投与してもよい。

【実施例】

【0125】

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

【0126】

実施例１．ラット抗ＳＩＲＰＡ抗体の作製
１）‐１ 発現コンストラクト調製
１）‐１‐１ ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ発現ベクターの構築
ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１（ＮＣＢＩの蛋白データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号：ＮＰ＿００１０３５１１１）のアミノ酸配列の１乃至３７３番目のＣ末端側にＨＨＨＨＨＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡと制限酵素ＸｂａＩとＰｍｅＩで消化したベクターｐｃＤＮＡ３．３－ＴＯＰＯ／ＬａｘＺ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いて結合することにより、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ発現ベクターを作製した。ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤのアミノ酸配列を配列表の配列番号４５に、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号４４に示す。

【0127】

１）‐１‐２ ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ発現ベクターの構築
ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１（ＮＣＢＩの蛋白データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿００１０３５１１１）のアミノ酸配列の１乃至１４９番目のＣ末端側にＨＨＨＨＨＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて１）‐１‐１と同様の方法でＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ発現ベクターを作製した。ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶのアミノ酸配列を配列表の配列番号４７に、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号４６に示す。

【0128】

１）‐１‐３ ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ発現ベクターの構築
ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２（Ｖ１配列、ＪＢＣ Ｖｏｌ.２８９，Ｎｏ１４，１００２４（２０１４）を元に改変）のアミノ酸配列の１乃至３７２番目のＣ末端側にＨＨＨＨＨＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて１）‐１‐１と同様の方法でＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ発現ベクターを作製した。ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤのアミノ酸配列を配列表の配列番号４９に、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号４８に示す。

【0129】

１）‐１‐４ ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ発現ベクターの構築
ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２のアミノ酸配列の１乃至１４８番目のＣ末端側にＨＨＨＨＨＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて１）‐１‐１と同様の方法でＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ発現ベクターを作製した。ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶのアミノ酸配列を配列表の配列番号５１に、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号５０に示す。

【0130】

１）‐１‐５ ｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤ発現ベクターの構築
ｃＳＩＲＰＡ（ＮＣＢＩの蛋白データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿００１７６８）のアミノ酸配列の１乃至３７２番目のＣ末端側にＨＨＨＨＨＨＨを連結したポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて１）‐１‐１と同様の方法でｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤ発現ベクターを作製した。ｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤのアミノ酸配列を配列表の配列番号５３に、ｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号５２に示す。

【0131】

１）‐１‐６ ＣＤ４７‐Ｆｃ発現ベクターの構築
ヒトＣＤ４７（ＮＣＢＩの蛋白データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿００１２７１６７９）のポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて１）‐１‐１と同様の方法でＣＤ４７‐Ｆｃ発現ベクターを作製した。ＣＤ４７‐Ｆｃのアミノ酸配列を配列表の配列番号５５に、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤをコードするヌクレオチド配列を配列表の配列番号５４に示す。

【0132】

１）‐２ リコンビナント蛋白質の調製
１）‐２‐１ ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤの調製
１）‐１‐１で作製したＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ ｃｅｌｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）にトランスフェクションすることで一過性に発現させた。培養上清を３×ＰＢＳで平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）に添加したのち、３×ＰＢＳでカラムを洗浄した。次に３×ＰＢＳ、５００ ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ ７．５で溶出した。回収したＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ画分からＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤを精製した。

【0133】

１）‐２‐２ ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶの調製
１）‐１‐２で作製したＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ ｃｅｌｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）にトランスフェクションすることで一過性に発現させた。培養上清を３×ＰＢＳで平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）に添加したのち、３×ＰＢＳでカラムを洗浄した。次に３×ＰＢＳ、５００ ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ ７．５で溶出した。回収したＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ画分からＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｇ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶを精製した。

【0134】

１）‐２‐３ ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤの調製
１）‐１‐３で作製したＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ発現ベクターを用いて１）‐２‐１と同様の方法でＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤを精製した。

【0135】

１）‐２‐４ ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶの調製
１）‐１‐４で作製したＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ発現ベクターを用いて１）‐２‐２と同様の方法でＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤを精製した。

【0136】

１）‐２‐５ ｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤの調製
１）‐１‐５で作製したｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤ発現ベクターを用いて１）‐２‐１と同様の方法でｃＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤを精製した。

【0137】

１）‐２‐６ ＣＤ４７‐Ｆｃの調製
ＣＤ４７‐Ｆｃ発現ベクターをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ ｃｅｌｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）にトランスフェクションすることで一過性に発現させた。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）にすべて入れたのち、ＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、ＣＤ４７‐Ｆｃの含まれる画分を集めた。回収したＣＤ４７‐Ｆｃ画分からＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ ｐｇ（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）を用いてＣＤ４７‐Ｆｃを精製した。

【0138】

１）‐３ 免疫
免疫にはＷＫＹ／Ｉｚｍラットの雌（日本エスエルシー社）を使用した。１）‐２で作製した抗原蛋白ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶそれぞれとＦｒｅｕｎｄ‘ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬社）を混合したものを尾根部に投与したラットのリンパ節及び脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。

【0139】

１）‐４ ハイブリドーマ作製
リンパ節細胞あるいは脾臓細胞とマウスミエローマＳＰ２／０‐ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ‐１５８１）をＬＦ３０１‐Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ｕｎｉｔ（ＢＥＸ社）を用いて電気細胞融合し、Ｃｌｏｎａ Ｃｅｌｌ‐ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＭｅｄｉｕｍＤ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清を用いて抗ＳＩＲＰＡ抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを実施した。

【0140】

１）‐５ 抗原結合性抗体スクリーニング用発現ベクターの構築
１）‐５‐１ ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１及びＶ２発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ及びＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＥＣＤ）の構築
ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１蛋白質（ＮＰ＿００１０３５１１１）、又はヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２蛋白質［ＮＰ＿００１０３５１１１、ＪＢＣ Ｖｏｌ.２８９，Ｎｏ１４，１００２４(２０１４)を元に改変］をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴベクターにクローニングし、それぞれを発現するベクターｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＥＣＤ、Ｖ２＿ＥＣＤ（又はｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２）を構築した。ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５６に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２蛋白質のアミノ酸配列を配列表の配列番号５７にそれぞれ示す。

【0141】

１）‐５‐２ サルＳＩＲＰＡ及びマウスＳＩＲＰＡ発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ又はｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐マウスＳＩＲＰＡ）の構築
サルＳＩＲＰＡ蛋白質（ＮＰ＿００１２７１６７９）又はマウスＳＩＲＰＡ蛋白質（Ｃ５７ＢＬ６：ＮＰ＿０３１５７３、ＢＡＬＢ／ｃ：ＢＡＡ２０３７６、１２９：Ｐ９７７９７、ＮＯＤ ＳＣＩＤ：Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４３，６１－６７，２０１４を元に改変）をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５－ＤＥＳＴベクター、又はｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴベクターにクローニングし、それぞれの蛋白質を発現するベクターｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ及びｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐マウスＳＩＲＰＡ（Ｃ５７ＢＬ６、ＢＡＬＢ／ｃ、１２９、ＮＯＤ）を構築した。サルＳＩＲＰＡのアミノ酸配列を配列表の配列番号５８に、マウスＳＩＲＰＡ＿Ｃ５７ＢＬ／６のアミノ酸配列を配列表の配列番号５９に、マウスＳＩＲＰＡ＿ＢＡＬＢ／ｃのアミノ酸配列を配列表の配列番号６０に、マウスＳＩＲＰＡ＿１２９のアミノ酸配列を配列表の配列番号６１に、マウスＳＩＲＰＡ＿ＮＯＤのアミノ酸配列を配列表の配列番号６２にそれぞれ示す。

【0142】

１）‐６ ハイブリドーマスクリーニング
１）‐６‐１ Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ用抗原遺伝子発現細胞の調製
ＨＥＫ２９３α細胞（インテグリンαｖ及びインテグリンβ３を発現するＨＥＫ２９３由来の安定発現細胞株）を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中７．５×１０^５細胞／ｍＬになるよう調製した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた形質移入手順に従い、ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１若しくはｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２、又はコントロールとしてｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴを導入後、９６‐Ｈａｌｆ ａｒｅａ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に５０μＬずつ分注、又は９６‐ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１００μＬずつ分注し、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で２４から２７時間培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡに使用した。

【0143】

１）‐６‐２ ヒトＳＩＲＰＡに対する結合性評価（Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ）
実施例１）‐６‐１で調製した発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２又はｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５００倍に希釈したＡｎｔｉ‐Ｒａｔ ＩｇＧ‐Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ（ＳＩＧＭＡ社）を加えて、４℃で１時間静置した。ｗｅｌｌ中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５ Ｍ クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム・１２水 ｐＨ４．５）にｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ ＨＣＬを５０μＬ／ｗｅｌｌで添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＥＮＶＩＳＩＯＮ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するＳＩＲＰＡに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞と比較し、ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５－ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１及びＳＩＲＰＡ＿Ｖ２発現ベクター導入２９３α細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ＳＩＲＰＡ抗体産生陽性として選択した。

【0144】

１）‐６‐３ ＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性評価
実施例１）‐６‐１で調製した発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２又はｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、直後に終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ＣＤ４７‐Ｆｃを５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５ Ｍ クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム・１２水 ｐＨ４．５）にｏ‐フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社製）、Ｈ２Ｏ２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を１００μＬ／ウェルで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ ＨＣｌを１００μＬ／ウェルを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するＳＩＲＰＡとＣＤ４７‐Ｆｃの結合を特異的に阻害する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールの培地添加群と比較し、ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、又はＳＩＲＰＡ＿Ｖ２発現ベクター導入２９３α細胞において、より低い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを、リガンド結合阻害活性を持つ抗ＳＩＲＰＡ抗体産生陽性として選択した。

【0145】

１）‐６‐４ マウス、サルＳＩＲＰＡに対する種交差性評価
実施例１）‐５‐２で調製したｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、又はマウスＳＩＲＰＡ発現ベクター導入２９３α細胞、及びｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ヒトＳＩＲＰＡの結合活性評価と同じ方法でサル、又はマウスＳＩＲＰＡに対する結合性を評価した。上記のヒト、及び動物種への結合活性、並びにＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性をもとに、Ｄ１３、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｆ４７、Ｆ６０、Ｆ６３、及びＦ８６抗体の計７クローンを選抜した。

【0146】

１）‐７ 抗体のアイソタイプ決定
取得したラット抗ＳＩＲＰＡ抗体産生ハイブリドーマの中から、強く特異的にヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１及びＳＩＲＰＡ＿Ｖ２並びにサルＳＩＲＰＡに結合し、高いＳＩＲＰＡ－ＣＤ４７結合阻害活性能を有することが示唆されたＤ１３、Ｆ４２、Ｆ４４、Ｆ４７、Ｆ６０、Ｆ６３、及びＦ８６抗体を産生するハイブリドーマを選抜し、抗体アイソタイプを同定した。アイソタイプは、Ｒａｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）により決定された。その結果、ラット抗ＳＩＲＰＡモノクローナル抗体Ｄ１３、Ｆ４２、Ｆ６０、及びＦ８６のアイソタイプはＩｇＧ１／κ鎖、Ｆ４４、Ｆ４７のアイソタイプはＩｇＧ２ａ／κ鎖、Ｆ６３のアイソタイプはＩｇＧ２ａ／λ鎖であることが確認された。

【0147】

１）‐８ モノクローナル抗体の調製
１）‐８‐１ 培養上清の調製
７種類のラット抗ＳＩＲＰＡモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。まず各抗体産生ハイブリドーマをＣｌｏｎａＣｅｌｌ‐ＨＹ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で十分量まで増殖させた後、Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を２０％添加した、５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）含有Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に培地交換し、７日間培養した。本培養上清を回収し、０．２２μｍのフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を通して滅菌した。

【0148】

１）‐８‐２ 抗体の精製
実施例１）‐８‐１で調製したハイブリドーマの培養上清から抗体をＰｒｏｔｅｉｎ Ｇアフィニティークロマトグラフィーで精製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に抗体を吸着させ、ＰＢＳでカラムを洗浄後に０．１Ｍ グリシン／塩酸水溶液（ｐＨ２．７）で溶出した。溶出液に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えてｐＨ７．０～７．５に調整した後に、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ３０Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）にてＰＢＳへのバッファー置換を行うとともに抗体の濃縮を行い、抗体濃度を２ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ‐Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。

【0149】

実施例２．ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体（７種）のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
２）‐１ 抗原結合性抗体スクリーニング用発現ベクターの構築
２）‐１‐１ ＦＬＡＧ‐ヒトＳＩＲＰＡ発現ベクター（ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１‐Ｖ１０）の構築
１０種類のヒトＳＩＲＰＡバリアント蛋白質（Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８，１３１３‐１３２３，２００７より抜粋）をコードするｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴベクターにクローニングし、それぞれのバリアント蛋白質を発現するベクターｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１‐Ｖ１０を構築した。
ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ３のアミノ酸配列を配列表の配列番号６３に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ４のアミノ酸配列を配列表の配列番号６４に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ５のアミノ酸配列を配列表の配列番号６５に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ６のアミノ酸配列を配列表の配列番号６６に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ７のアミノ酸配列を配列表の配列番号６７に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ８のアミノ酸配列を配列表の配列番号６８に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ９のアミノ酸配列を配列表の配列番号６９に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１０のアミノ酸配列を配列表の配列番号７０に、それぞれ示す。

【0150】

２）‐１‐２‐１ ヒトＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤ、ＩｇＶ、及びＩｇＶ＿ＩｇＣ１発現ベクター（ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤ、及びＩｇＶＩｇＶ＿ＩｇＣ１）の構築
ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２の全長アミノ酸（１乃至５０４番）、及び１６５乃至３７１番の領域の欠損体（以下「ＩｇＶ体」と記す）、２２５乃至３７１番の領域の欠損体（以下「ＩｇＶ＿ＩｇＣ体」と記す）をコードするｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴベクターにクローニングし、それぞれの変異体蛋白質を発現するベクターを構築した。

【0151】

ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ体のアミノ酸配列を配列表の配列番号７１に、ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ＿ＩｇＣ１体のアミノ酸を配列表の配列番号７２に示す。

【0152】

２）‐１‐２‐２ ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０、Δ１、及びΔ２＿マウスＳＩＲＰＡ発現ベクター（ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０、Δ１、及びΔ２）の構築
配列番号６０に記載のマウスＳＩＲＰＡの８１乃至８５番目のアミノ酸残基からなるＳＦＴＧＥ配列（配列番号７８）をＮＱＫＥＧ配列（配列番号７６）に置換し、１２６乃至１３０番目のアミノ酸残基からなるＲＧＳＳＥ配列（配列番号７９）をＫＧＳ配列に置換したＳＩＲＰＡ変異体をｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０と命名した。配列番号６０に記載のマウスＳＩＲＰＡの８１乃至８５番のアミノ酸残基からなるＳＦＴＧＥ配列（配列番号７８）をＮＱＫＥＥ配列（配列番号７７）に置換したＳＩＲＰＡ変異体をｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ１と命名した。さらに、配列番号６０に記載のマウスＳＩＲＰＡの８１乃至８５番のアミノ酸残基からなるＳＦＴＧＥ配列(配列番号７８）をＳＦＴＥＧ配列（配列番号８０）に置換したＳＩＲＰＡ変異体をｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ２と命名した。これらのＳＩＲＰＡ変異体をコードするｃＤＮＡをｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴベクターにクローニングし、それぞれのＳＩＲＰＡ変異体を発現するベクターを構築した。
ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０のアミノ酸配列を配列表の配列番号７３に、ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ１のアミノ酸を配列表の配列番号７４に、ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ２のアミノ酸を配列表の配列番号７５にそれぞれ示す。

【0153】

２）‐２ ヒトＳＩＲＰＡバリアントＶ１～Ｖ１０に対する結合性評価
実施例２）‐１‐１で調製した１０種類のバリアント蛋白質の発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１～Ｖ１０又はｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対し終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したラット抗ヒトＳＩＲＰＡ精製抗体を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。また、各ＳＩＲＰＡバリアント発現検出用のウェルには、終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下は１）‐６‐２に示すヒトＳＩＲＰＡの結合活性評価と同じ方法で、１０種類のヒトＳＩＲＰＡバリアント体に対する結合性を評価した。各バリアントに対するラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の結合性はＦＬＡＧタグの発現をもとに標準化した。
表１に示すように何れのクローンも全てのバリアントに対し結合性を示した。

【0154】

【表1】

【0155】

２）‐３ マウス、サルＳＩＲＰＡに対する種交差性評価
実施例１）‐５‐２で調製したｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、又はｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐マウスＳＩＲＰＡ発現ベクター導入２９３α細胞、及びｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ヒトＳＩＲＰＡの結合活性評価と同じ方法でサル、又はマウスＳＩＲＰＡに対する結合性を評価した。
表２に示す通り、ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体はいずれもサルＳＩＲＰＡには結合性を示したが、マウスＳＩＲＰＡには結合性を示さなかった。

【0156】

【表2】

【0157】

２）‐４ エピトープ解析
２）‐４‐１‐１ Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ法によるエピトープ解析（１）
２）‐１‐２‐１で調製したｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＥＣＤ体、ＩｇＶ体、並びにＩｇＶ＿ＩｇＣ１体発現ベクター導入２９３α細胞、及びｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞の培養上清を除去後、それぞれの細胞に対し終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したラット抗ヒトＳＩＲＰＡ精製抗体を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。また、各ＳＩＲＰＡコンストラクト発現検出用のウェルには、終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下はヒトＳＩＲＰＡの結合活性評価と同じ方法で精製抗体７クローンの各ドメイン体への結合性を評価した。各コンストラクトに対するラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の結合性はＦＬＡＧタグの発現をもとに標準化した。
図１Ａに示す通り、ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体は何れのコンストラクトに対しても結合を示すことから、ＩｇＶドメインを認識することが示唆された。

【0158】

２）‐４‐１‐２ Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ法によるエピトープ解析（２）
２）‐１‐２‐２で調製したｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０、Δ１、並びにΔ２発現ベクター導入２９３α細胞、及びｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞の培養上清を除去後、それぞれの細胞に対し終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したＤ１３ヒト化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体４種、及びキメラ化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体をそれぞれ５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。また、各ＳＩＲＰＡコンストラクト発現検出用のウェルには、終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下はヒトＳＩＲＰＡの結合活性評価と同じ方法で各コンストラクトへの結合性を評価した。各コンストラクトに対する抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の結合性はＦＬＡＧタグの発現をもとに標準化した。
図１Ｂに示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３、又はｃＤ１３はＮＱＫＥＧ配列を持つｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０に対しては、添加した抗体濃度依存的な結合性を示したが、Δ１、及びΔ２に対しては、いずれの濃度においても結合性を示さなかった。
以上のことから、ｈＤ１３及びcＤ１３の結合にはＮＱＫＥＧの配列が必要であることが示唆された。

【0159】

２）‐４‐２ Ｘ線結晶構造解析によるエピトープ解析
２）‐４‐２‐１ 複合体の結晶化
全長型のｃＤ１３抗体を弱酸性下でＬｙｓｙｌ Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（Ｗａｋｏ）により限定的に切断し、ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ Ｓ陽イオン交換カラム（東ソー）を用いてｃＤ１３抗体のＦａｂ断片を分離した。実施例１）‐２で取得したＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶとｃＤ１３のＦａｂ断片をモル比１：１で混合し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５，１０／３００ＧＬゲルろ過カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で複合体画分を分離した後、限外ろ過により１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ ８．２）に緩衝液を置換し、３ｇ／Ｌに濃縮した。複合体溶液を蒸気拡散法により結晶化した。タンパク質溶液０．５μＬに沈殿剤溶液（０．２Ｍ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｂａｓｉｃ、２０％（ｗ／ｖ） Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ ３３５０、ｐＨ ９．２)を等量加えた溶液を、０．０５ｍＬの沈殿剤溶液を入れた密閉容器に両溶液が触れ合わないように収め、２５℃で静置した。１週間後に０．２ｍｍ×０．２ｍｍ×０．０５ｍｍの棒状晶が得られた。得られた結晶を、Ｇｌｙｃｏｌで沈殿剤溶液を約１．４倍希釈した溶液に浸し、続いて液体窒素で凍結した。放射光施設フォトンファクトリー（つくば）のビームラインＰＦ ＢＬ‐１７ＡにてＸ線回折データを収集した。得られた回折像からソフトウェアＸＤＳ（Ｍａｘ Ｐｌａｎｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて回折強度を数値化し、結晶構造因子を求めた。結晶は六方晶系で空間群はＲ３２、結晶の単位格子はａ＝ｂ＝１４９．６１Å、ｃ＝１５５．６１Å、ａｌｐｈａ＝ｂｅｔａ＝９０°、ｇａｍｍａ＝１２０°であった。

【0160】

２）‐４‐２‐２ 複合体の構造解析
得られた構造因子とＦａｂ断片のホモロジーモデル及びヒトＳＩＲＰＡのＩｇＶドメインの既知構造（ＰＤＢＩＤ：２ＪＪＳ）の三次元構造座標を用いて分子置換法を行い、位相を決定した。計算にはソフトウェアｐｈａｓｅｒ（ＣＣＰ４：Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．４）を使用した。結晶は非対称単位に１つの複合体を含んでいた。ソフトウェアＲｅｆｍａｃ５（ＣＣＰ４：Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｎｏ．４）を用いて構造の精密化を行い、ソフトウェアｃｏｏｔを用いてモデルの修正を行った。この操作を繰り返し行い、２．４Å分解能で最終のＲ値２２％、ｆｒｅｅ Ｒ値２５％を得た。最終のモデルはｃＤ１３のＦａｂ断片のＬ鎖アミノ酸残基１‐２１３、Ｈ鎖アミノ酸残基１‐２２５、及び、ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のアミノ酸残基３３‐１４３を含む。

【0161】

２）‐４‐２‐３ 複合体の構造解析Ｄ１３のエピトープの同定
ｃＤ１３のＦａｂ断片から４Å以内にあるヒトＳＩＲＰＡのアミノ酸残基（各アミノ酸残基の位置は、配列表の配列番号５７に対応している）は以下の通りである：Ｇｌｙ６４、Ｐｒｏ６５、Ｌｅｕ７８、Ｇｌｎ８２、Ｌｙｓ８３、Ｇｌｕ８４、Ｇｌｙ８５、Ｈｉｓ８６、Ｐｈｅ８７、Ｔｈｒ９１、Ｔｈｒ９２、Ｇｌｕ９５、Ｔｈｒ９７、Ｌｙｓ９８、Ｌｙｓ１２６。図２に複合体全体のリボンモデルと表面を、図３にヒトＳＩＲＰＡのｂｅｔａ５以前（Ａ）とｂｅｔａ５以降（Ｂ）の領域とｃＤ１３との相互作用を示した。ｃＤ１３がヒトＳＩＲＰＡにおいて配列多様性の低いｂｅｔａ４‐５ループ、つまり残基番号８２‐８７を強く認識することが、様々なバリアントに強く結合することを可能としていることが示唆された（図４）。一方で、ｂｅｔａ５‐６ループつまり残基番号９２‐１０５の領域での相互作用は弱い。例えば、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸に置換されたバリアントが存在するＧｌｕ９５はＦａｂ近傍に存在するが、その側鎖の電子密度が観測されず相互作用に大きく寄与していないことが示唆される。なお、図４の配列において「・」はＳＩＲＰＡ＿Ｖ１と同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は異なるアミノ酸残基を示す。

【0162】

２）‐５ ヒトＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性評価
１）‐５‐１で調製したヒトＳＩＲＰＡ発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２又はｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対し、終濃度で０乃至１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したラット抗ヒトＳＩＲＰＡ精製抗体を５０μＬ／ウェル添加した。直後に終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ＣＤ４７‐Ｆｃを５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下は１）‐６‐３と同様の方法で結合阻害活性を評価した。
表３に示すとおり、ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体は、何れもヒトＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７に対して結合阻害活性を示した。

【0163】

【表3】

【0164】

２）‐６ ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の癌細胞株に対するＡＤＣＰ活性
２）‐６‐１ 標的細胞の調製
ヒト胃癌細胞株ＡＧＳ細胞はＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し、３７℃ ５分間反応後、剥離した。１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、ＰＢＳで２回洗浄後、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測した。４×１０^７細胞を分取、遠心後、ＰＫＨ２６ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ社製）付属のＤｉｌｌｕｅｎｔＣ ２ｍＬで細胞を懸濁した。標識溶液として１ｍＭ ＰＫＨ２６ ＬｉｎｋｅｒをＤｉｌｌｕｅｎｔＣで１０μＭに希釈後、ただちに、細胞懸濁液と等量のＰＫＨ２６ Ｌｉｎｋｅｒ溶液を混合し、室温５分間静置した。２５ｍＬの１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、２×１０^６細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。

【0165】

２）‐６‐２ ＰＢＭＣ細胞の調製
２０ｍＬ Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ社製）に２５ｍＬ健常人血液をゆっくり重層後、室温１５００ｒｐｍ×３０分間遠心した。血漿とＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓの中間に位置する細胞層をスポイトで回収し、２０ｍＬ １０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）に懸濁した。１５００ｒｐｍ×５分間遠心、上清除去後、２０ｍＬ １０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、２回洗浄した。１ｍＬのＲｏｂｏｓｅｐ ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）に懸濁したのち、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測しエフェクター細胞として用いた。

【0166】

２）‐６‐３ エフェクター細胞の調製
実施例２）‐６‐２で調製したＰＢＭＣ細胞はＲｏｂｏＳｅｐ ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製）にて５×１０^７細胞／ｍＬになるように調製した。Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ Ｗｉｔｈｏｕｔ ＣＤ１６ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製）付属のＥａｓｙＳｅｐ ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｏｃｋｔａｉｌをＰＢＭＣ細胞懸濁液１ｍＬあたり５０μＬ添加した。４℃ １０分間反応後、ＥａｓｙＳｅｐ Ｍａｇｎｅｔｉｃ ＰａｒｔｉｃｌｅｓをＰＢＭＣ細胞懸濁液１ｍＬあたり５０μＬ添加した。４℃ ５分間反応後、２．５ｍＬになるようにＲｏｂｏＳｅｐ ｂｕｆｆｅｒ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社製）を添加し、ＥａｓｙＳｅｐ Ｍａｇｎｅｔにセットした。２分３０秒後に上清を回収した後１２００ｒｐｍ×５分間遠心し、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ画分を分取した。１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し１回洗浄後、１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ‐ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣ社製）を含む１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し、浮遊用２２５ｃｍ²フラスコ（住友ベークライト社製）に播種した。３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で１０日間培養した。培養上清を除き、１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ‐１０、１０ｎｇ／ｍＬ Ｍ‐ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣ社製）を含む１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し、さらに２日間培養した。１２日後、分化誘導されたマクロファージはＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し、３７℃ ４０分間反応後、剥離した。１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、５×１０^５細胞／ｍＬになるように、１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）に再懸濁し、エフェクター細胞として用いた。

【0167】

２）‐６‐４ ＡＤＣＰ活性の評価
実施例２）‐６‐１の方法で調製した標的細胞５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度で０乃至１００００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体７クローン、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４（抗ヒトＣＤ４７抗体：ＰｌｏＳ ＯＮＥ １０[９]：ｅ０１３７３４５、ＵＳ２０１５１８３８７４を元に調製）、ＴＴＩ‐６２１（ヒトＳＩＲＰＡ‐Ｆｃ：ＷＯ２０１４／０９４１２２を元に調製）又は各種コントロールＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。単剤群では１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、併用群では終濃度で２５０ｎｇ／ｍＬになるよう１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｒｏｃｈｅ社製）を５０μＬ／ウェル添加した。実施例２）‐６‐３で調製した、１×１０^６細胞／ｍＬ、５０μＬ／ウェルのエフェクター細胞を添加後、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で１６時間静置した。４℃ １２００ｒｐｍ×５分間遠心、上清除去後、２００μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄した。細胞に４５μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳ、５μＬ／ウェルのＡＰＣ ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ｂ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）を添加し、４℃、１５分間静置した。２００μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した。１００μＬ／ウェルの１×ＢＤ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）で懸濁し、４℃、一晩静置した。翌日フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）にて測定した。データ解析にはＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いた。ＦＳＣ（前方散乱光）／ＳＳＣ（側方散乱光）で展開したのち、ＰＥ陽性（Ａ）、ＡＰＣ、ＰＥ共に陽性（Ｂ）となる細胞数を算出した。ＡＰＣ、ＰＥ共に陽性（Ｂ）となった細胞をマクロファージにより標的細胞が貪食されたものとした。ＡＤＣＰ活性による細胞貪食率は次式で算出した。
細胞貪食率（％）＝Ｂ／（Ａ＋Ｂ）×１００
図５に示す通り、ＣＤ４７陽性ヒト胃癌細胞株ＡＧＳに対し、ラット抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体単剤では、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４（抗ヒトＣＤ４７抗体）、及びＴＴＩ‐６２１（ヒトＳＩＲＰＡ‐Ｆｃ）と比較し低いＡＤＣＰ活性を示した（図５Ａ）。一方で、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ併用時は、Ｈｕ５Ｆ９‐Ｇ４、及びＴＴＩ‐６２１と同等程度のＡＤＣＰ活性を示した（図５Ｂ）。よって、抗ＳＩＲＰＡ抗体によりＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７の結合を阻害することで、マクロファージの貪食能が増強することが示唆された。

【0168】

実施例３．ラット抗ＳＩＲＰＡ抗体（Ｄ１３、Ｆ４４、Ｆ６３）可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
３）‐１ Ｄ１３の可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
３）‐１‐１ Ｄ１３生産ハイブリドーマのｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製
Ｄ１３の可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅するため、Ｄ１３産生ハイブリドーマよりＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。

【0169】

３）‐１‐２ ５’‐ＲＡＣＥ ＰＣＲによるＤ１３の軽鎖可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅は、実施例３）‐１‐１で調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡの約１μｇとＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。Ｄ１３の軽鎖遺伝子の可変領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ （Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔに付属）、及び公知のラット軽鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
５’‐ＲＡＣＥ ＰＣＲで増幅した軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをプラスミドにクローニングし、次に軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＤ１３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号２３の２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。Ｄ１３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１乃至３に示す。これらのＣＤＲのアミノ酸は図２８にも示されている。
各ＣＤＲのアミノ鎖配列は、ＡｂＭの定義 （Ｍａｒｔｉｎ， Ａ． Ｃ． Ｒ．， Ｃｈｅｅｔｈａｍ， Ｊ． Ｃ． ａｎｄ Ｒｅｅｓ， Ａ． Ｒ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６，９２６８－９２７２）に基づき記載されている。

【0170】

３）‐１‐３ ５’-ＲＡＣＥ ＰＣＲによるＤ１３の重鎖可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅は、実施例３）‐１‐１で調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡの約１μｇとＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。Ｄ１３の重鎖遺伝子の可変領域をコードするｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’ Ｋｉｔに付属）、及び公知のラット重鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
５’‐ＲＡＣＥ ＰＣＲで増幅した重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをプラスミドにクローニングし、次に重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＤ１３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号２５の２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。Ｄ１３のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を、配列表の配列番号４乃至６に示す。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は図２８にも示されている。

【0171】

３）‐２ Ｆ４４の可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
実施例３）‐１と同様の方法で実施した。決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＦ４４の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号２７の２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。また、決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＦ４４の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号２９の２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。Ｆ４４のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を、配列表の配列番号７乃至１２に示す。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は図２９にも示されている。

【0172】

３）‐３ Ｆ６３の可変領域のｃＤＮＡのヌクレオチド配列解析とアミノ酸配列の決定
実施例３）‐１と同様の方法で実施した。決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＦ６３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号３１の２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。また、決定されたｃＤＮＡのヌクレオチド配列にコードされるＦ６３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号３３の２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。Ｆ６３のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を、配列表の配列番号１３乃至１８に示す。これらのＣＤＲのアミノ酸配列は図３０にも示されている。

【0173】

実施例４．ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３）の作製
４）‐１ ヒトキメラ化及びヒト化κタイプ軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ－ＬＫの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３‐ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、配列番号１９に示すヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。
ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫからネオマイシン発現ユニットを除去することによりｐＣＭＡ‐ＬＫを構築した。

【0174】

４）‐２ ヒトキメラ化及びヒト化λタイプ軽鎖発現ベクターｐＣＭＡ‐ＬＬの構築
ｐＣＭＡ‐ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたＤＮＡ断片と、配列番号２０で示されるヒト軽鎖シグナル配列及びヒトλ鎖定常領域をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片をＩｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて結合して、ｐＣＭＡ‐ＬＬを構築した。

【0175】

４）‐３ ヒトキメラ化及びヒト化ＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターｐＣＭＡ‐Ｇ４ＰＦＡＬＡの構築
配列番号２１で示されるヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ４ＰＦＡＬＡ定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を用いて、実施例４）‐２と同様の方法でｐＣＭＡ‐Ｇ４ｐｒｏＦＡＬＡを構築した。

【0176】

４）‐４ ｃＤ１３の発現ベクターの構築
４）‐４‐１ ｃＤ１３のＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターの構築
実施例３）‐１で得られたＤ１３重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｉｎ‐ｆｕｓｉｏｎクローニング用に設計したプライマーでＰＣＲを行うことにより重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。ｐＣＭＡ‐Ｇ４ｐｒｏＦＡＬＡを制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に、Ｉｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、増幅したＤＮＡ断片を挿入することによりｃＤ１３重鎖発現ベクターを構築した。ｃＤ１３重鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２４に示す。１～５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、４１８～１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＤ１３重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２５に示す。１～１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号２４及び配列番号２５の配列は図１８にも示されている。

【0177】

４）‐４‐２ ｃＤ１３の軽鎖発現ベクターの構築
実施例３）‐１で得られたＤ１３軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｉｎ‐ｆｕｓｉｏｎクローニング用に設計したプライマーでＰＣＲを行うことにより軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。ｐＣＭＡ‐ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所に、Ｉｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、増幅したＤＮＡ断片を挿入することによりｃＤ１３軽鎖発現ベクターを構築した。ｃＤ１３軽鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２２に示す。１～６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、６１～３７８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、３７９～６９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＤ１３軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２３に示す。１～２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２１～１２６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１２７～２３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号２２及び配列番号２３の配列は図１７にも示されている。

【0178】

４）‐５ ｃＦ４４の発現ベクターの構築
４）‐５‐１ ｃＦ４４のＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターの構築
実施例３）‐２で得られたＦ４４重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、実施例４）‐４‐１と同様の方法でｃＦ４４重鎖発現ベクターを構築した。ｃＦ４４重鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２８に示す。１～５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、５８～４１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、４１５～１３９５番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＦ４４重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２９に示す。１～１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２０～１３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１３９～４６５番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号２８及び配列番号２９の配列は図２０にも示されている。

【0179】

４）‐５‐２ ｃＦ４４の軽鎖発現ベクターの構築
実施例３）‐２で得られたＦ４４軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、実施例４）‐４‐２と同様の方法でｃＦ４４軽鎖発現ベクターを構築した。ｃＦ４４軽鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号２６に示す。１～６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、３８２～７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＦ４４軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２７に示す。１～２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１２８～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号２６及び配列番号２７の配列は図１９にも示されている。

【0180】

４）‐６ ｃＦ６３の発現ベクターの構築
４）‐６‐１ ｃＦ６３のＩｇＧ４ｐｒｏＦＡＬＡタイプ重鎖発現ベクターの構築
実施例３）‐３で得られたＦ６３重鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、実施例４）‐４‐１と同様の方法でｃＦ６３重鎖発現ベクターを構築した。ｃＦ６３重鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３２に示す。１～５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、５８～４２９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、４３０～１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＦ６３重鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号３３に示す。１～１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２０～１４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１４４～４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号３２及び配列番号３３の配列は図２２にも示されている。

【0181】

４）‐６‐２ ｃＦ６３の軽鎖発現ベクターの構築
実施例３）‐３で得られたＦ６３軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡをテンプレートとして、Ｉｎ‐ｆｕｓｉｏｎクローニング用に設計したプライマーでＰＣＲを行うことにより軽鎖の可変領域をコードするｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。ｐＣＭＡ‐ＬＬを制限酵素ＢｓｉＷＩとＨｐａＩで切断した箇所に、Ｉｎ‐Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、増幅したＤＮＡ断片を挿入することによりｃＦ６３軽鎖発現ベクターを構築した。ｃＦ６３軽鎖をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３０に示す。１～６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、６１～３９０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、３９１～７０８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。ｃＦ６３軽鎖のアミノ酸配列を、配列表の配列番号３１に示す。１～２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２１～１３０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１３１～２３６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。配列番号３０及び配列番号３１の配列は図２１にも示されている。

【0182】

４）‐７ ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３の調製
４）‐７‐１ ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３の生産
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の１．２×１０^９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３Ｌ Ｆｅｒｎｂａｃｈ Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ Ｆｌａｓｋ（ＣＯＲＮＩＮＧ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して２．０×１０^６細胞／ｍＬに調製した。４０ｍＬのＯｐｔｉ‐Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に０．２４ｍｇの重鎖発現ベクターと０．３６ｍｇの軽鎖発現ベクターと１．８ｍｇのＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）を加えて穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ_２インキュベーターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に６００ｍＬのＥＸ‐ＣＥＬＬ ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び３０ｍＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ_２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃａｐｓｕｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ（Ａｄｖａｎｔｅｃ ＃ＣＣＳ‐０４５‐Ｅ１Ｈ）でろ過した。

【0183】

４）‐７‐２ ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３の精製
実施例４）‐７‐１で得られた培養上清から抗体をｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの１段階工程で精製した。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅが充填されたカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライしたのちに、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍ アルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ‐Ａ‐Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳ（－）へのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）で抗体を濃縮し、ＩｇＧ濃度を１０ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ‐Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。

【0184】

実施例５．ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３）のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
５）‐１ ヒトＳＩＲＰＡに対する結合性評価
５）‐１‐１ ヒトＳＩＲＰＡに対する結合性評価（Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ）
２９３α細胞［実施例１）‐６に記載］を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中５ｘ１０^５細胞／ｍＬになるよう調製した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２、若しくはｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴを導入し、９６‐ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１００μＬずつ分注したのち、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡに使用した。培養上清を除去後、ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２、若しくはｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入細胞のそれぞれに対し、実施例３及び実施例４で調製したｃＤ１３（ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐｆ）、ｃＦ４４（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐ、ＩｇＧ４ｐｆ）、ｃＦ６３（ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐｆ）抗体を終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェルで添加し、４℃で１時間静置した。また、各ＳＩＲＰＡコンストラクト発現検出用のウェルには、終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１回洗浄後、５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１０００倍に希釈したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ(ａｂ’)_２Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ‐Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、 Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を加えて、４℃で１時間静置した。ウェル中の細胞を５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで５回洗浄した後、ＯＰＤ発色液（ＯＰＤ溶解液（０．０５Ｍ クエン酸３ナトリウム、０．１Ｍ リン酸水素２ナトリウム・１２水 ｐＨ４．５）にｏ‐フェニレンジアミン二塩酸塩（和光純薬社製）、Ｈ_２Ｏ_２をそれぞれ０．４ｍｇ／ｍＬ、０．６％（ｖ／ｖ）になるように溶解）を１００μＬ／ウェルで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、１Ｍ ＨＣｌを１００μＬ／ウェルを添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（ＡＲＶＯ：ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４９０ｎｍの吸光度を測定した。各コンストラクトに対するヒトキメラ化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の結合性はＦＬＡＧタグの発現をもとに標準化した。
図６に示す通り、ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３抗体はＳＩＲＰＡ＿Ｖ１とＳＩＲＰＡ＿Ｖ２両方に結合し（図６Ａ、Ｂ）、各アイソタイプ間で結合性はほぼ同等であった（図６Ｃ、Ｄ）。

【0185】

５）‐１‐２ ヒトキメラ化抗体のヒトＳＩＲＰＡに対する結合性評価
実施例4で作製したｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３の実施例１で作製したヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶに対する解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用し、ヒトキメラ化抗体をリガンドとして捕捉し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、センサーチップとしてＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。チップ上に１μｇ／ｍＬのヒトキメラ化抗体を１０μＬ／分で６０秒間添加した後、抗原としてヒトＳＩＲＰＡ蛋白質の希釈系列溶液（０．５～８μｇ／ｍＬ）を流速３０μＬ／分で１２０秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を流速２０μＬ／分で３０秒間添加した。データの解析には１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。結果を表４に示す。

【0186】

【表4】

【0187】

５）‐２ サルＳＩＲＰＡに対する種交差性評価
２９３α細胞を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中５ｘ１０^５細胞／ｍＬになるよう調製した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、若しくはｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴを導入し、９６‐ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１００μＬずつ分注したのち、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡに使用した。培養上清を除去後、ヒトＳＩＲＰＡに対する結合活性と同様の方法でサルＳＩＲＰＡに対する結合活性を評価した。
図７に示すように、ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３抗体はサルＳＩＲＰＡに結合性を示した。

【0188】

５）‐３ ヒト、又はサルＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性評価
実施例５）－１、５）－２で調製したヒトＳＩＲＰＡ、又はサルＳＩＲＰＡ発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ又はｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対し、終濃度で０乃至１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したｃＤ１３（ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐｆ）、ｃＦ４４（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐ、ＩｇＧ４ｐｆの定常領域４種）、及びｃＦ６３（ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐｆ）を５０μＬ／ウェル添加した。直後に終濃度で１００００ｎｇ／ｍＬになるよう５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ＣＤ４７‐Ｆｃを５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下は１）‐６‐３と同様の方法でＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性を評価した。
図８に示すように、ｃＦ４４、ｃＦ６３、ｃＤ１３はヒト及びサルＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性を示し（図８Ａ(i)、(ii)、(iii)）、各アイソタイプ間でその活性はほぼ同等であった（図８Ｂ(i)、(ii)、(iii）。

【0189】

５）‐４ ヒトキメラ化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の癌細胞株に対するＡＤＣＰ活性
５）‐４‐１ 標的細胞の調製
ＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉ細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄後、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測した。以下は２‐６‐１と同様の方法にて標的細胞を調製した。

【0190】

５）‐４‐２ ＰＢＭＣ細胞の調製
２）‐６‐２と同様の方法にてＰＢＭＣ細胞を調製した。

【0191】

５）‐４‐３ エフェクター細胞の調製
２）‐６‐３と同様の方法にてエフェクター細胞を調製した。

【0192】

５）‐４‐４ ＡＤＣＰ活性の評価
実施例５）－４－１の方法で調製した標的細胞５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度で０乃至１００００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４、ＴＴＩ‐６２１又は各種コントロールＨｕｍａｎ ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。単剤群では１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、併用群では終濃度で４００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したＲｉｔｕｘｉｍａｂ（全薬工業社製）を５０μＬ／ウェル添加した。以下は２‐６‐４と同様の方法にてＡＤＣＰ活性を評価した。
図９に示す通り、ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３は、ＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉ細胞に対し、単剤ではＡＤＣＰ活性を示さず（図９Ａ）、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ併用時において、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４並びにＴＴＩ－６２１と同程度のＡＤＣＰ活性を示した（図９Ｂ）。

【0193】

５）‐５ ヒトキメラ化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体のＰＢＭＣ及びマクロファージに対する毒性評価
５）‐５‐１ 標的細胞としてのＰＢＭＣ、並びにマクロファージの調製
２）‐６‐２（ＰＢＭＣ）、並びに２）‐６‐３（マクロファージ）と同様の方法にて標的細胞を調製した。回収した各細胞は２）‐６‐１と同様の方法で蛍光標識し、標的細胞として用いた。

【0194】

５）‐５‐２ エフェクター細胞の調製
２）‐６‐３と同様の方法にてエフェクター細胞を調製した。

【0195】

５）‐５‐３ ＡＤＣＰ活性の評価
実施例５）－４－２の方法で調製したＰＢＭＣ、又はマクロファージ５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度で０.６４乃至１００００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したｃＤ１３（ＩｇＧ４ｐｆ）、ｃＦ４４（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４ｐ、ＩｇＧ４ｐｆの定常領域４種）、ｃＦ６３（ＩｇＧ４ｐｆ）、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４、ＴＴＩ‐６２１又は各種コントロールＨｕｍａｎ ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を５０μＬ／ウェル添加した。以下は２‐６‐４と同様の方法にてＡＤＣＰ活性を評価した。なお、マクロファージに対するＡＤＣＰ活性の比率は各抗体添加時のマクロファージのカウント数をコントロール抗体添加時のカウント数で除することで算出した。
図１０に示す通り、ｃＤ１３、ｃＦ４４、ｃＦ６３のＰＢＭＣに対するＡＤＣＰ活性はコントロールＩｇＧとほぼ同等であった（図１０Ａ）。また、定常領域の異なるｃＦ４４抗体を比較すると、ＩｇＧ１型、ＩｇＧ４ｐ型では添加した抗体の濃度依存的にＡＤＣＰ活性を示すのに対し、ＩｇＧ２型、ＩｇＧ４ｐｆ型ではＡＤＣＰ活性を示さなかった（図１０Ｂ）。
一方で、抗体添加１６時間後のマクロファージの存在比について定常領域の異なるｃＦ４４抗体を比較すると、ＩｇＧ４ｐｆ型が最もマクロファージの減少率が低いことから、抗体添加により誘導される、ＳＩＲＰＡ陽性細胞に対する毒性が最も低い可能性が示された（図１０Ｃ）。

【0196】

実施例６ ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体の設計
６）‐１ キメラ化抗体ｃＤ１３の可変領域の分子モデリング
ｃＤ１３の可変領域の分子モデリングは、ホモロジーモデリングとして公知の方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１‐１５３（１９９１）］を利用した。ｃＤ１３の重鎖と軽鎖の可変領域に対して高い配列同一性を有するＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ［Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５，Ｄ３０１‐Ｄ３０３（２００７）］に登録されている構造（ＰＤＢ ＩＤ：３ＣＳＹ）を鋳型に、市販のタンパク質立体構造解析プログラムＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社製）を用いて行った。

【0197】

６）‐２ ヒト化アミノ酸配列の設計
ｃＤ１３は、ＣＤＲグラフティング［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９‐１００３３（１９８９）］によりヒト化した。ＩＭＧＴ（ＴＨＥ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に登録されているヒトｇｅｒｍｌｉｎｅ配列のＩＧＨＶ３‐３０＊１３とＩＧＨＪ３＊０１、及びＩＧＫＶ１‐６＊０１とＩＧＫＪ２＊０１、そしてＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）］において既定されるヒトのカッパ鎖サブグループ４のコンセンサス配列がｃＤ１３のフレームワーク領域に対して高い同一性を有することから、アクセプターとして選択された。アクセプター上に移入すべきドナー残基は、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９‐１００３３（１９８９）］によって与えられる基準などを参考に三次元モデルを分析することで選択された。

【0198】

６）‐３ ｃＤ１３重鎖のヒト化
設計された２種の重鎖をｈＨ１及びｈＨ２と命名した。ｈＨ１の重鎖全長アミノ酸配列を、配列表の配列番号４１に記載する。配列番号４１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４０に記載する。ｈＨ２の重鎖全長アミノ酸配列を、配列表の配列番号４３に記載する。配列番号４３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号４２に記載する。配列番号４１及び４３において、１～１９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２０～１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１４０～４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。また、配列番号４０及び４２において、１～５７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、５８～４１７番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、４１８～１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。配列番号４０及び配列番号４１の配列は図２６にも、配列番号４２及び配列番号４３の配列は図２７にも、示されている。
ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体ｃＤ１３の重鎖であるｃＤ１３＿Ｈ、ヒト化抗体重鎖ｈＨ１、及びｈＨ２のアミノ酸配列の比較を図１１に示す。ｈＨ１及びｈＨ２の配列において「・」はｃ０１３＿Ｈと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。

【0199】

６）‐４ ｃＤ１３軽鎖のヒト化
設計された３種の軽鎖をｈＬ２、ｈＬ３、及びｈＬ４と命名した。ｈＬ２の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列表の配列番号３５に記載する。配列番号３４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列表の配列番号３４に記載する。ｈＬ３の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列表の配列番号３７に記載する。配列番号３７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号３６に記載する。ｈＬ４の軽鎖全長アミノ酸配列を、配列表の配列番号３９に記載する。配列番号３９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、配列番号３８に記載する。配列番号３５、３７及び３９において、１～２０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列に、２１～１２７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域に、１２８～２３４番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域に、それぞれ相当する。また、配列番号３４、３６及び３８において、１～６０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はシグナル配列を、６１～３８１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は可変領域を、３８２～７０２番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列は定常領域を、それぞれコードしている。配列番号３４及び配列番号３５の配列は図２３にも、配列番号３６及び配列番号３７の配列は図２４にも、配列番号３８及び配列番号３９の配列は図２５にも、それぞれ示されている。
ヒトキメラ化抗ＳＩＲＰＡ抗体ｃＤ１３の軽鎖であるｃＤ１３＿Ｌ、ヒト化抗体軽鎖ｈＬ２、ｈＬ３及びｈＬ４のアミノ酸配列の比較を図１２に示す。ｈＬ２、ｈＬ３、及びｈＬ４の配列において、「・」はｃＤ１３＿Ｌと同一のアミノ酸残基を示し、アミノ酸残基が記載されている箇所は置換されたアミノ酸残基を示す。

【0200】

６）‐５ 重鎖及び軽鎖の組み合わせによるヒト化抗体の設計
ｈＨ１及びｈＬ３からなる抗体を「Ｈ１Ｌ３抗体」又は「Ｈ１Ｌ３」と称する。ｈＨ１及びｈＬ４からなる抗体を「Ｈ１Ｌ４抗体」又は「Ｈ１Ｌ４」と称する。ｈＨ２及びｈＬ２からなる抗体を「Ｈ２Ｌ２抗体」又は「Ｈ２Ｌ２」と称する。ｈＨ２及びｈＬ３からなる抗体を「Ｈ２Ｌ３抗体」又は「Ｈ２Ｌ３」と称する。

【0201】

実施例７．ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体の作製
７）－１ ヒト化抗体の重鎖発現ベクターの構築
７）－１－１ ｈＨ１発現ベクターの構築
配列表の配列番号４０に示すｈＨ１のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３４に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐＣＭＡ－Ｇ４ｐｒｏＦＡＬＡを制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に合成したＤＮＡ断片を挿入することによりｈＨ１発現ベクターを構築した。

【0202】

７）－１－２ ｈＨ２発現ベクターの構築
配列表の配列番号４２に示すｈＨ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３６乃至４３４に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例７）－１－１と同様の方法でｈＨ２発現ベクターを構築した。

【0203】

７）－２ ヒト化抗体の軽鎖発現ベクターの構築
７）－２－１ ｈＬ２発現ベクターの構築
配列表の配列番号３４に示すｈＬ２のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐＣＭＡ－ＬＫを制限酵素ＢｓｉＷＩで切断した箇所に合成したＤＮＡ断片を挿入することによりｈＬ２発現ベクターを構築した。

【0204】

７）－２－２ ｈＬ３発現ベクターの構築
配列表の配列番号３６に示すｈＬ３のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例７）－２－１と同様の方法でｈＬ３発現ベクターを構築した。

【0205】

７）－２－３ ｈＬ４発現ベクターの構築
配列表の配列番号３８に示すｈＬ４のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号３７乃至４０２に示されるＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。実施例７）－２－１と同様の方法でｈＬ４発現ベクターを構築した。

【0206】

７）‐３ ヒト化抗体の調製
７）－３－１ ヒト化抗体の生産
実施例４）－７－１と同様の方法で生産した。実施例６）‐５に示したＨ鎖とＬ鎖の組み合わせに対応したＨ鎖発現ベクターとＬ鎖発現ベクターの組み合わせで、各種ヒト化抗体を取得した。

【0207】

７）－３－２ ヒト化抗体の調製
実施例７）－３－１で得られた培養上清をｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーとセラミックハイドロキシアパタイトの２段階工程で精製した。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅが充填されたカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライした後に、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２ Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で抗体を溶出した。抗体の含まれる画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳへのバッファー置換を行い、５ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＭＥＳ／ｐＨ７．０のバッファーで５倍希釈した後に、５ｍＭ ＮａＰｉ／５０ｍＭ ＭＥＳ／３０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ７．０のバッファーで平衡化したセラミックハイドロキシアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ－Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ Ｔｙｐｅ―１ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＨＢＳｏｒ（２５ｍＭ ヒスチジン／５％ ソルビトール、ｐＨ６．０）へのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）にて抗体を濃縮し、ＩｇＧ濃度を５０ｍｇ／ｍＬに調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ－Ｐｌｕｓ ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、精製サンプルとした。

【0208】

実施例８．ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体（ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３）のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
８）‐１ ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒト、サル、マウスＳＩＲＰＡに対する結合活性
８）‐１－１ ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒト、サル、マウスＳＩＲＰＡに対する結合活性（Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡ）
２９３α細胞［実施例１］‐６に記載］を１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中５ｘ１０^５細胞／ｍＬになるよう調製した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１‐Ｖ１０、ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ、ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐マウスＳＩＲＰＡ若しくはｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴを導入し、９６‐ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１００μＬずつ分注したのち、１０％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で一晩培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Ｃｅｌｌ‐ＥＬＩＳＡに使用した。培養上清を除去後、各種ＳＩＲＰＡ遺伝子導入細胞のそれぞれに対し、実施例６及び実施例７で調製したｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３、又はｃＤ１３及びコントロール抗体を終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬ、５０μＬ／ウェル添加し、４℃で１時間静置した。以下は実施例５－１と同様の方法にてヒトＳＩＲＰＡへの結合性を評価した。
図１３Ａ～Ｃに示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３抗体はＳＩＲＰＡバリアント（Ｖ１‐Ｖ１０）、サルＳＩＲＰＡに対しｃＤ１３抗体と同等以上の結合性を示した。一方で、図１４Ａ及びＢに示す通りマウスＳＩＲＰＡに対しては、ヒト化抗体、ヒトキメラ化抗体共に結合性を示さなかった。

【0209】

８）‐１－２ ヒト化抗体のＳＩＲＰＡに対する結合性評価
実施例７で作製したｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２及びｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３の、実施例１で作製したヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ及びサルＳＩＲＰＡ＿ＥＣＤに対する解離定数測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用し、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて固定化したＡｎｔｉ‐Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）ａｎｔｉｂｏｄｙにヒト化抗体をリガンドとして捕捉し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、センサーチップとしてＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。チップ上に１μｇ／ｍＬのヒト化抗体を１０μＬ／分で６０秒間添加した後、抗原としてヒトＳＩＲＰＡ蛋白質の希釈系列溶液（０．５～８μｇ／ｍＬ）又はサルＳＩＲＰＡ蛋白質の希釈系列溶液（１～１６μｇ／ｍＬ）を流速３０μＬ／分で１２０秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を流速２０μＬ／分で３０秒間添加した。データの解析には１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。結果を表５に示す。

【0210】

【表5】

【0211】

８）－２ ヒト化抗ＳＩＲＰＡ抗体のヒト、又はサルＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性評価
実施例８）－１で調製したヒトＳＩＲＰＡ、又はサルＳＩＲＰＡ発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２、ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐サルＳＩＲＰＡ又はｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ導入２９３α細胞のそれぞれに対し、終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬとなるように５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈したｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３を５０μＬ／ウェル添加し、直後に５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ＣＤ４７‐Ｆｃを加えて、４℃で１時間静置した。以下は１）‐６‐３と同様の方法でＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性を評価した。
図１５に示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３抗体は、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１（図１５Ａ）、ＳＩＲＰＡ＿Ｖ２（図１５Ｂ）、サルＳＩＲＰＡ（図１５Ｃ）に対しｃＤ１３抗体と同等以上の結合阻害活性を示した。

【0212】

８）‐３ ヒト化抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の癌細胞株に対するＡＤＣＰ活性
８）‐３‐１ 標的細胞の調製
ＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉ細胞、又はＲａｍｏｓ細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄後、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測した。４×１０^７細胞を分取、遠心後、ＣｅｌｌＶｕｅ Ｃｌａｒｅｔ Ｆａｒ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｋｅｒ Ｋｉt（Ｓｉｇｍａ社製）付属のＤｉｌｌｕｅｎｔＣ ２ｍLで細胞を懸濁した。標識溶液として１ｍＭ ＣｅｌｌＶｕｅ Ｃｌａｒｅｔ ＤｙｅをＤｉｌｌｕｅｎｔＣで１０μＭに希釈後、ただちに、細胞懸濁液と等量のＣｅｌｌＶｕｅ Ｃｌａｒｅｔ Ｄｙｅ溶液を混合し、室温１５分間静置した。２５ｍＬの１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、２×１０^６細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。以下は２）‐６‐１と同様の方法にて標的細胞を調製した。

【0213】

８）‐３‐２ ＰＢＭＣ細胞の調製
２）‐６‐２と同様の方法にてＰＢＭＣ細胞を調製した。

【0214】

８）‐３‐３ エフェクター細胞の調製
２）‐６‐３と同様の方法にてエフェクター細胞を調製し、ＰＢＳで２回洗浄後、１×１０^６細胞／ｍＬになるようにＰＢＳに再懸濁した。標識溶液として１μＬ／１０^６細胞／ｍＬのＣＦＳＥ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を添加し、室温１０分間静置した。２０ｍｌの１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、１×１０^６細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものをエフェクター細胞として用いた。

【0215】

８）‐３‐４ ＡＤＣＰ活性の評価
実施例８）－３－１の方法で調製した標的細胞５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬとなるように１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３、又はｃＤ１３抗体、Ｈｕ５Ｆ９Ｇ４、ＴＴＩ‐６２１又は各種コントロールＨｕｍａｎ ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。単剤群では１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を５０μＬ／ウェル添加し、併用群では終濃度で４００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したＲｉｔｕｘｉｍａｂ（全薬工業社製）を５０μＬ／ウェル添加した。実施例８‐３‐３で調製した、１×１０^６細胞／ｍＬ、５０μＬ／ウェルのエフェクター細胞を添加後、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で１６時間静置した。４℃ １２００ｒｐｍ×５分間遠心、上清除去後、２００μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄した。１００μＬ／ウェルの１×ＢＤ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）で懸濁し、４℃、一晩静置した。翌日フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）にて測定した。データ解析にはＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いた。ＦＳＣ（前方散乱光）／ＳＳＣ（側方散乱光）で展開したのち、ＡＰＣ陽性（Ａ）、ＡＰＣ、ＦＩＴＣ共に陽性（Ｂ）となる細胞数を算出した。ＡＰＣ、ＦＩＴＣ共に陽性（Ｂ）となった細胞をマクロファージにより標的細胞が貪食されたものとした。ＡＤＣＰ活性による細胞貪食率は次式で算出した。
細胞貪食率（％）＝Ｂ／（Ａ＋Ｂ）×１００
図１６に示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ４ｈ、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ２、ｈＤ１３＿Ｈ２Ｌ３、又はｃＤ１３抗体添加群はＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉ、及びＲａｍｏｓ細胞に対し、単剤ではＡＤＣＰ活性を示さず（図１６Ａ、Ｃ）、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ併用時において、添加した抗体濃度依存的なＡＤＣＰ活性を示した（図１６Ｂ、Ｄ）。なお、ヒト化抗体クローンはヒトキメラ化抗体クローンと同等以上のＡＤＣＰ活性を示した。

【0216】

実施例９．各種抗ＳＩＲＰＡ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
９）‐１ 各種抗ＳＩＲＰＡ抗体のＳＩＲＰＡに対する結合性評価
実施例７で作製したｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３抗体、及びＯＳＥ‐１７２（国際公報第ＷＯ１７／１７８６５３号を参照して調製）、ＫＷＡＲ２３（国際公報第ＷＯ１８／０２６６００号を参照して調製）、又はＡＤＵ‐１８０５（国際公報第ＷＯ１８／１９０７１９号を参照して調製）の、実施例１で作製したヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１＿ＩｇＶ及びヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶに対する解離定数を測定した。なお、ＯＳＥ‐１７２の重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号８１に、ＯＳＥ‐１７２の軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８２に、ＫＷＡＲ２３の重鎖のアミノ酸配列は配列番号８３に、ＫＷＡＲ２３の軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８４に、ＡＤＵ‐１８０５の重鎖のアミノ酸配列は配列番号８５に、ＡＤＵ‐１８０５の軽鎖のアミノ酸配列は配列番号８６に、それぞれ示されている。解離定数の測定には、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を使用し、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて固定化したＡｎｔｉ‐Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｆｃ）ａｎｔｉｂｏｄｙに各抗体をリガンドとして捕捉し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、センサーチップとしてＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いた。チップ上に２μｇ／ｍＬの各種抗体を１０μＬ／分で３０秒間添加した後、抗原としてヒトＳＩＲＰＡ蛋白質の希釈系列溶液（０．２５～１６ｎＭ）を流速３０μＬ／分で１２０秒間添加し、引き続き６００秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、３Ｍ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を流速２０μＬ／分で３０秒間添加した。データの解析には１：１結合モデルを用いて、結合速度定数ｋａ、解離速度定数ｋｄ及び解離定数（ＫＤ；ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を算出した。結果を表６に示す。

【0217】

【表6】

【0218】

９）－２ 各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性評価
実施例９）－１で調製したヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ１又はＶ２発現ベクター導入２９３α細胞の培養上清を除去後、ｐｃＤＮＡ３．２ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ＳＩＲＰＡ＿Ｖ１、Ｖ２導入２９３α細胞のそれぞれに対し、終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬとなるように５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで希釈した各種抗ＳＩＲＰＡ抗体、又は各種コントロールＨｕｍａｎ ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加し、直後に５％ ＦＢＳ含有ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調製したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ＣＤ４７‐Ｆｃを５０μＬ／ウェル加えて、４℃で１時間静置した。以下は１）‐６‐３と同様の方法でＳＩＲＰＡ‐ＣＤ４７結合阻害活性を評価した。
図３１Ａに示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＯＳＥ‐１７２、ＫＷＡＲ２３、及びＡＤＵ‐１８０５抗体はＳＩＲＰＡ＿Ｖ１‐ＣＤ４７に対し結合阻害活性を示した。一方で、図３１Ｂに示す通りヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２‐ＣＤ４７に対して、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＫＷＡＲ２３、及びＡＤＵ‐１８０５は結合性を示したが、ＯＳＥ‐１７２は結合阻害活性を示さなかった。また、図３１Ｃで示されるように、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３が最も低濃度で結合を阻害した。

【0219】

９）－３ 各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体のヒトＳＩＲＰＢ、及びヒトＳＩＲＰＧ結合活性評価
ＳＩＲＰβ１（ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ β１：ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＰ＿００６０５６としてアミノ酸配列が公開されている）、及び ＳＩＲＰγ（ｓｉｇｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ γ：ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＰ＿０６１０２６としてアミノ酸配列が公開されている）は、 ＳＩＲＰＡのファミリー分子である。本発明において、「ＳＩＲＰα」を「ＳＩＲＰＡ」、「ＳＩＲＰβ１」を「ＳＩＲＰＢ１」、「ＳＩＲＰγ」を「ＳＩＲＰＧ」と称する場合がある。ＣＨＯ‐Ｋ１細胞を１０％ ＦＢＳ含有Ｈａｍ‘ｓ Ｆ‐１２Ｋ培地中３．３ｘ１０^５細胞／ｍＬになるよう調製し、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で一晩培養した。それに対し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ヒトＳＩＲＰＢ、ｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴ‐ヒトＳＩＲＰＧ、若しくはｐＦＬＡＧ Ｖ５‐ＤＥＳＴを導入し、１０％ ＦＢＳ含有Ｈａｍ‘ｓ Ｆ‐１２Ｋ培地中で３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で２４時間培養した。得られた導入細胞を回収し、９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種した。培養上清を除去後、各種遺伝子導入細胞のそれぞれに対し、各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体、又は各種コントロールＨｕｍａｎ ＩｇＧを終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル添加し、４℃で２５分間静置した。遠心後、上清を除去し、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した。遠心後、上清を除去し、ＰＥ Ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ‐Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社製）の１／４００希釈溶液を５０μＬ／ウェル添加し、４℃で２５分間静置した。遠心後、上清を除去し、５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで２回洗浄した。
遠心後、上清を除去し、１００μＬ／ウェルの１×ＢＤ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）で懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）にて測定した。データ解析にはＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いた。ＦＳＣ（前方散乱光）／ＳＳＣ（側方散乱光）で展開したのち、ＰＥの平均蛍光強度を計測した。二次抗体のみ反応させたサンプルの平均蛍光強度で標準化することで、各種抗体におけるファミリー分子への結合性を算出した。
図３２Ａ及びＢに示す通り、各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体はヒトＳＩＲＰＢ、及びヒトＳＩＲＰＧに対し濃度依存的な結合性を示したが、ＯＳＥ‐１７２はヒトＳＩＲＰＧに対し結合性を示さなかった。

【0220】

９）‐４ 各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体の癌細胞株に対するＡＤＣＰ活性
９）‐４‐１ 標的細胞の調製
ＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉ細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄後、生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測した。１×１０^６細胞／ｍＬになるようにＰＢＳに再懸濁した。標識溶液として１μＬ／１０^６細胞／ｍＬのＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｆａｒ Ｒｅｄ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を添加し、室温１０分間静置した。２５ｍＬの１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、２×１０^６細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものを標的細胞として用いた。以下は２）‐６‐１と同様の方法にて標的細胞を調製した。

【0221】

９）‐４‐２ ＰＢＭＣ細胞の調製
２）‐６‐２と同様の方法にてＰＢＭＣ細胞を調製した。

【0222】

９）‐４‐３ エフェクター細胞の調製
２）‐６‐３と同様の方法にてエフェクター細胞を調製し、ＰＢＳで２回洗浄後、１×１０^６細胞／ｍＬになるようにＰＢＳに再懸濁した。標識溶液として１μＬ／１０^６細胞／ｍＬのＣＦＳＥ溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）を添加し、室温１０分間静置した。２０ｍｌの１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を添加し２回洗浄後、１×１０^６細胞／ｍＬになるよう再懸濁したものをエフェクター細胞として用いた。

【0223】

９）‐４‐４ ＡＤＣＰ活性の評価
実施例８－３－１の方法で調製した標的細胞５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度０乃至１００００ｎｇ／ｍＬとなるように１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈した各種抗ＳＩＲＰＡ抗体、又は各種コントロールＨｕｍａｎ ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。併用群として終濃度で１０００ｎｇ／ｍＬになるよう１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈したＲｉｔｕｘｉｍａｂ（全薬工業社製）を５０μＬ／ウェル添加した。実施例８‐３‐３で調製した、１×１０^６細胞／ｍＬ、５０μＬ／ウェルのエフェクター細胞を添加後、３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で２～１６時間静置した。４℃ １２００ｒｐｍ×５分間遠心、上清除去後、２００μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄した。５０μＬ／ウェルの１×ＢＤ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）で懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）にて測定した。データ解析にはＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いた。ＦＳＣ（前方散乱光）／ＳＳＣ（側方散乱光）で展開したのち、ＡＰＣ陽性（Ａ）、ＡＰＣ、ＦＩＴＣ共に陽性（Ｂ）となる細胞数を算出した。ＡＰＣ、ＦＩＴＣ共に陽性（Ｂ）となった細胞をマクロファージにより標的細胞が貪食されたものとした。ＡＤＣＰ活性による細胞貪食率は次式で算出した。
細胞貪食率（％）＝Ｂ／（Ａ＋Ｂ）×１００
図３３Ａ－Ｃに示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＯＳＥ‐１７２、ＫＷＡＲ２３、及びＡＤＵ‐１８０５抗体添加群は、ＣＤ４７陽性ヒトＢｕｒｋｉｔｔ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ細胞株Ｒａｊｉに対し、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ併用時において、ＡＤＣＰ活性を示した。２時間反応後のＡＤＣＰ増強活性の強さはｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＡＤＵ‐１８０５、ＫＷＡＲ２３、ＯＳＥ‐１７２の順であり（Ａ）、１６時間反応後はＡＤＵ‐１８０５、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＫＷＡＲ２３、ＯＳＥ‐１７２の順だった（Ｂ）。なお、１６時間での反応性は貪食活性の飽和状態にあると推測される。２時間反応後の濃度依存性とＡＤＣＰ活性比較については、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３が最も低濃度から高い活性を示し、ＡＤＵ‐１８０５とＫＷＡＲ２３はほぼ同等、ＯＳＥ‐１７２の順だった。以上の結果より、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３は短時間で最も低濃度からＡＤＣＰ活性を増強した。

【0224】

９）‐４‐５ 各種抗ヒトＳＩＲＰＡ抗体によるマクロファージ同士の貪食活性（Ｓｅｌｆ‐ＡＤＣＰ活性）評価
実施例８‐３‐３の方法で調製したエフェクター細胞５０μＬ／ウェルを超低接着表面９６穴Ｕ底マイクロプレート（住友ベークライト社製）に添加した。そこに終濃度０乃至５０００ｎｇ／ｍＬとなるように１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）で希釈した各種抗ＳＩＲＰＡ抗体、又は各種コントロールＨｕｍａｎ ＩｇＧを５０μＬ／ウェル添加した。１０％ ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を１００μＬ／ウェル添加した。３７℃、５％ ＣＯ_２の条件下で１６～２０時間静置した。４℃ １２００ｒｐｍ×５分間遠心、上清除去後、２００μＬ／ウェルの５％ＦＢＳ含有ＰＢＳで洗浄した。１００μＬ／ウェルの１×ＢＤ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｆｉｘａｔｉｖｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）で懸濁し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ：Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｓｏｎ社製）にて測定した。データ解析にはＦｌｏｗｊｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社製）を用いた。ＦＳＣ（前方散乱光）／ＳＳＣ（側方散乱光）で展開したのち、各ウェルでのＦＩＴＣ陽性となる細胞数を算出した（Ａ）。抗体添加なしのウェルにおけるＦＩＴＣ陽性細胞のカウント（Ｂ）で標準化することで、各サンプルでの減少分はマクロファージ同士の貪食によるものとした。Ｓｅｌｆ‐ＡＤＣＰ活性は次式で算出した。
Ｓｅｌｆ－ＡＤＣＰ（％）＝（Ａ／Ｂ）×１００
図３３Ｂに示す通り、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３、ＯＳＥ‐１７２、ＫＷＡＲ２３、及びＡＤＵ‐１８０５抗体添加により、エフェクター細胞であるマクロファージに対し、Ｓｅｌｆ-ＡＤＣＰ活性を示した。減少率の高さはＯＳＥ‐１７２、ＫＷＡＲ２３、ＡＤＵ‐１８０５、ｈＤ１３＿Ｈ１Ｌ３の順だった。減少率の高さは、抗ＳＩＲＰＡ抗体によるＳｅｌｆ-ＡＤＣＰ活性が高いことを示している。この現象は、各抗ＳＩＲＰＡ抗体の投与によりマクロファージや樹状細胞などＳＩＲＰＡ陽性細胞が減少又は枯渇する可能性を示唆しており、免疫系に対する副作用の指標となる。

【0225】

実施例１０．各種抗ＳＩＲＰＡ抗体のｉｎ ｖｉｖｏ評価
ＳＩＲＰＡは宿主の免疫細胞に発現する標的であることから、ヒトＳＩＲＰＡ抗体による抗腫瘍効果を評価するためには、ヒトＳＩＲＰＡを発現するマウスでの検討が必要となる［Ｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ. ＰＮＡＳ, ２０１７ (１１４) ４９, Ｅ１０５７８‐Ｅ１０５８５］。一方で、抗腫瘍効果における免疫系の寄与を評価するためには、免疫不全マウスではなく、免疫正常なマウスを用いることが重要である［Ｙａｎａｇｉｔａ ｅｔ ａｌ. ＪＣＩ, ２０１７ (２) １, １‐１５］。ヒトＳＩＲＰＡ単独、若しくはヒトＳＩＲＰＡ及びヒトＣＤ４７の両方を免疫正常マウスに導入した遺伝子改変マウスに、ヒトＣＤ４７を遺伝子導入したマウスがん細胞株を移植し、腫瘍体積が１００ｍｍ^３程度になったところで群分けを行う。これらのマウスに対し、各種抗ＳＩＲＰＡ抗体、抗ＣＤ４７抗体又はＳＩＲＰＡ－Ｆｃ融合蛋白質等の抗ＣＤ４７バイオロジクス、又は陰性対照群としてＰＢＳ等を週に１～３回程度、１～３週間投与する。併用薬剤による抗腫瘍効果の上乗せを検討する場合には、これらの各群に対し化学療法剤、抗体医薬、分子標的薬等を併せて投与する。２～３日毎に各投与群における腫瘍径（長径／短径）を電子ノギス等で測定し、腫瘍体積を算出する。各種抗体投与群と陰性対照群の腫瘍体積から腫瘍増殖抑制率を算出することで、各々のｉｎ ｖｉｖｏにおける薬効を比較評価することが出来る。なお、腫瘍体積、及び腫瘍増殖抑制率は次式で示される。
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝（長径×短径×短径）／２
腫瘍増殖抑制率（％）＝（１－各投与群の腫瘍体積／陰性対象群の腫瘍体積）×１００

【産業上の利用可能性】

【0226】

本発明の抗ＳＩＲＰα抗体は、他のエフェクター機能を有する他の抗体医薬や免疫チェックポイント阻害作用を有する他の抗体医薬と併用するための抗体医薬として利用することができる。

【配列表フリーテキスト】

【0227】

配列番号１：Ｄ１３ ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号２：Ｄ１３ ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号３：Ｄ１３ ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号４：Ｄ１３ ＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号５：Ｄ１３ ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号６：Ｄ１３ ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号７：Ｆ４４ ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号８：Ｆ４４ ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号９：Ｆ４４ ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号１０：Ｆ４４ ＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号１１：Ｆ４４ ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１２：Ｆ４４ ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号１３：Ｆ６３ ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号１４：Ｆ６３ ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列
配列番号１５：Ｆ６３ ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列
配列番号１６：Ｆ６３ ＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列
配列番号１７：Ｆ６３ ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列
配列番号１８：Ｆ６３ ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列
配列番号１９：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ軽鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片
配列番号２０：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトλ軽鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片
配列番号２１：ヒト重鎖シグナル配列及びヒトＩｇＧ４ＰｒｏＦＡＬＡ重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片
配列番号２２：ヒトキメラ抗体Ｄ１３の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号２３：ヒトキメラ抗体Ｄ１３の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２４：ヒトキメラ抗体Ｄ１３の重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号２５：ヒトキメラ抗体Ｄ１３の重鎖のアミノ酸配列
配列番号２６：ヒトキメラ抗体Ｆ４４の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号２７：ヒトキメラ抗体Ｆ４４の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２８：ヒトキメラ抗体Ｆ４４の重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号２９：ヒトキメラ抗体Ｆ４４の重鎖のアミノ酸配列
配列番号３０：ヒトキメラ抗体Ｆ６３の軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号３１：ヒトキメラ抗体Ｆ６３の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３２：ヒトキメラ抗体Ｆ６３の重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号３３：ヒトキメラ抗体Ｆ６３の重鎖のアミノ酸配列
配列番号３４：ヒト化Ｄ１３のｈＬ２軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号３５：ヒト化Ｄ１３のｈＬ２軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３６：ヒト化Ｄ１３のｈＬ３軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号３７：ヒト化Ｄ１３のｈＬ３軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３８：ヒト化Ｄ１３のｈＬ４軽鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号３９：ヒト化Ｄ１３のｈＬ４軽鎖のアミノ酸配列
配列番号４０：ヒト化Ｄ１３のｈＨ１重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号４１：ヒト化Ｄ１３のｈＨ１重鎖のアミノ酸配列
配列番号４２：ヒト化Ｄ１３のｈＨ２重鎖をコードするヌクレオチド配列
配列番号４３：ヒト化Ｄ１３のｈＨ２重鎖のアミノ酸配列
配列番号４４：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１のＥＣＤをコードするヌクレオチド配列
配列番号４５：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１のＥＣＤのアミノ酸配列
配列番号４６：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１のＩｇＶをコードするヌクレオチド配列
配列番号４７：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１のＩｇＶのアミノ酸配列
配列番号４８：ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のＥＣＤをコードするヌクレオチド配列
配列番号４９：ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のＥＣＤのアミノ酸配列
配列番号５０：ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のＩｇＶをコードするヌクレオチド配列
配列番号５１：ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のＩｇＶのアミノ酸配列
配列番号５２：サルＳＩＲＰＡのＥＣＤをコードするヌクレオチド配列
配列番号５３：サルＳＩＲＰＡのＥＣＤのアミノ酸配列
配列番号５４：ヒトＣＤ４７－Ｆｃをコードするヌクレオチド配列
配列番号５５：ヒトＣＤ４７－ＦｃのＩｇＶのアミノ酸配列
配列番号５６：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１のアミノ酸配列
配列番号５７：ヒトＳＩＲＰＡバリアント２のアミノ酸配列
配列番号５８：サルＳＩＲＰＡのアミノ酸配列
配列番号５９：Ｃ５７ ＢＬ／６マウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列
配列番号６０：ＢＡＬＢ／ＣマウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列
配列番号６１：１２９マウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列
配列番号６２：ＮＯＤマウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列
配列番号６３：ヒトＳＩＲＰＡバリアント３のアミノ酸配列
配列番号６４：ヒトＳＩＲＰＡバリアント４のアミノ酸配列
配列番号６５：ヒトＳＩＲＰＡバリアント５のアミノ酸配列
配列番号６６：ヒトＳＩＲＰＡバリアント６のアミノ酸配列
配列番号６７：ヒトＳＩＲＰＡバリアント７のアミノ酸配列
配列番号６８：ヒトＳＩＲＰＡバリアント８のアミノ酸配列
配列番号６９：ヒトＳＩＲＰＡバリアント９のアミノ酸配列
配列番号７０：ヒトＳＩＲＰＡバリアント１０のアミノ酸配列
配列番号７１：ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ体のアミノ酸配列
配列番号７２：ヒトＳＩＲＰＡ＿Ｖ２＿ＩｇＶ＿ＩｇＣ１体のアミノ酸配列
配列番号７３：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０のアミノ酸配列
配列番号７４：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ１のアミノ酸配列
配列番号７５：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ２のアミノ酸配列
配列番号７６：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ０のアミノ酸配列中の８１番目～８５番目のアミノ酸配列
配列番号７７：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ１のアミノ酸配列中の８１番目～８５番目のアミノ酸配列
配列番号７８：ＢＡＬＢ／ＣマウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列中の８１番目～８５番目のアミノ酸配列
配列番号７９：ＢＡＬＢ／ＣマウスＳＩＲＰＡのアミノ酸配列中の１２６番目～１３０番目のアミノ酸配列
配列番号８０：マウスＳＩＲＰＡ変異体ｈｍＳＩＲＰＡ＿Δ２のアミノ酸配列中の８１番目～８５番目のアミノ酸配列
配列番号８１：ＯＳＥ－１７２抗体重鎖（ＯＳＥ－１７２＿ｈＧ４Ｐｒｏ）のアミノ酸配列
配列番号８２：ＯＳＥ－１７２抗体軽鎖（ＯＳＥ－１７２＿ｈＫ）のアミノ酸配列
配列番号８３：ＫＷＡＲ２３抗体重鎖（ＫＷＡＲ２３＿ｈＧ４Ｐｒｏ）のアミノ酸配列
配列番号８４：ＫＷＡＲ２３抗体軽鎖（ＫＷＡＲ２３＿ｈＫ）のアミノ酸配列
配列番号８５：ＡＤＵ－１８０５抗体重鎖（ＡＤＵ－１８０５＿ｈＧ２）のアミノ酸配列
配列番号８６：ＡＤＵ－１８０５抗体軽鎖（ＡＤＵ－１８０５＿ｈＫ）のアミノ酸配列

【0228】

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【配列表】

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