特許 7369276 重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する発現ベクター

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-17

(45)【発行日】2023-10-25

(54)【発明の名称】重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対する発現ベクター

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/861 20060101AFI20231018BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20231018BHJP

   A61K 39/215 20060101ALI20231018BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20231018BHJP

   C12N 15/50 20060101ALN20231018BHJP

【ＦＩ】

C12N15/861 Z ZNA

A61K35/761

A61K39/215

A61P31/14

C12N15/50

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2022513579

(86)(22)【出願日】2020-11-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-02-14

(86)【国際出願番号】 RU2020000589

(87)【国際公開番号】W WO2021076009

(87)【国際公開日】2021-04-22

【審査請求日】2022-08-04

(31)【優先権主張番号】2020127979

(32)【優先日】2020-08-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】RU

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】522075140

【氏名又は名称】フェデラル ステート バジェタリー インスティテューション“ナショナル リサーチ センター フォー エピデミオロジー アンド マイクロバイオロジー ネームド アフター ザ オナラリー アカデミシャン エヌ．エフ．ガマレヤ”オブ ザ ミニストリー オブ ヘルス オブ ザ ロシアン フェデレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ズブコワ，オルガ ヴァディモヴナ

(72)【発明者】

【氏名】オザロフスカイア，タチアナ アンドレーヴナ

(72)【発明者】

【氏名】ドルジコワ，インナ ヴァディモヴナ

(72)【発明者】

【氏名】ポポーワ，オルガ

(72)【発明者】

【氏名】シチェブリアコフ，ドミトリー ウィークトロヴィチ

(72)【発明者】

【氏名】グロウソワ，ダリア ミハイロヴナ

(72)【発明者】

【氏名】ザルラエワ，アリーナ シャミロヴナ

(72)【発明者】

【氏名】ツカバツリン，アミール イルダロビヴィチ

(72)【発明者】

【氏名】ツカバツリーナ，ナタリア ミハイロヴナ

(72)【発明者】

【氏名】シシェルビニン，ドミトリー ニコラエヴィチ

(72)【発明者】

【氏名】エスマガムベトフ，イリアス ブラトビッチ

(72)【発明者】

【氏名】トカルスカヤ，エリザヴェータ アレクサンドロヴナ

(72)【発明者】

【氏名】ボティコフ，アンドレイ ジェンナデビッチ

(72)【発明者】

【氏名】エロコワ，アリーナ セルゲーヴナ

(72)【発明者】

【氏名】ニキテンコ，ナタリア アナトレヴナ

(72)【発明者】

【氏名】セミキン，アレクサンドル セルゲーヴィチ

(72)【発明者】

【氏名】ボリセヴィチ，セルゲイ ウラジーミロヴィチ

(72)【発明者】

【氏名】ナロディツキー，ボリス サベリエビッチ

(72)【発明者】

【氏名】ログノフ，デニス ユーリエヴィチ

(72)【発明者】

【氏名】ギンツブルク，アレクサンドル レオニドヴィチ

【審査官】藤山 純

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１１１２１８４５９（ＣＮ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０１４３３０２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１４－５１６５３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】Abbink P, et al.，Comparative seroprevalence and immunogenicity of six rare serotype recombinant adenovirus vaccine vectors from subgroups B and D，J Virol，81(9)，2007年05月，p.4654-63

【文献】LOGUNOV, D. Y. et al.，Safety and immunogenicity of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine in two formulations: two open, non-randomised phase 1/2 studies from Russia，Lancet，396(10255)，2020年09月26日，pp.887-897

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／８６１

Ｃ１２Ｎ １５／５０

Ａ６１Ｋ ３５／７６１

Ａ６１Ｋ ３９／２１５

Ａ６１Ｐ ３１／１４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｅ１及びＥ３領域が欠失され、且つＯＲＦ６－Ａｄ２６領域がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクター。

【請求項2】

ヒトアデノウイルス血清型２６の親配列として配列番号５が使用されたことを特徴とする、請求項１に記載の発現ベクター。

【請求項3】

Ｅ１及びＥ３領域が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムを含有し、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクター。

【請求項4】

サルアデノウイルス血清型２５の親配列として配列番号６が使用されたことを特徴とする、請求項３に記載の発現ベクター。

【請求項5】

Ｅ１及びＥ３領域が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを含有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクター。

【請求項6】

ヒトアデノウイルス血清型５の親配列として配列番号７が使用されたことを特徴とする、請求項５に記載の発現ベクター。

【請求項7】

重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための免疫生物学的薬剤を作製するための、請求項１～６のいずれか一項に記載の発現ベクターの利用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、バイオテクノロジー、免疫学及びウイルス学に関する。本発明は、重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための免疫生物学的薬剤を開発するために製薬産業において使用することができる組換えベクターを包含する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
２０１９年１２月に、湖北省（Hubei）の省都である武漢（Wuhan）において、新型コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる疾患が見出された。この疾患によって、迅速な診断法及び患者の臨床管理を含む、公衆衛生の専門家及び医師が対処すべき複雑な作業がもたらされた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスは急速に世界中に広がり、史上最大規模のパンデミックに発展した。２０２０年８月１９日までに、症例数は２２百万を超え、死者数は－７９１千人であった。

【0003】

これまでのところ、この疾患の疫学、臨床徴候、予防及び処置について、限られたデータしか入手できない。知られているように、肺炎は、新型コロナウイルスが引き起こす感染症の最も一般的な臨床症状であり、相当数の患者において急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の発症が報告されている。ウイルスは、同じ科の他のウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ）と同様に、危険病原体のＩＩ類に割り当てられる。現在、新型コロナウイルス疾患の特異的予防又は原因療法処置のための薬剤は入手できない。

【0004】

高い死亡率、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の急速な地理的拡散、及びこの病気の原因が完全には定義されていないという事実により、このウイルスが引き起こす疾患の予防及び処置に有効な製品を開発する緊急の必要性が生じた。

【0005】

ワクチン学における有望な分野の１つは、疾患の予防のためのウイルスベクターに基づく薬剤の開発に焦点を合わせている。これに関連して、ヒトアデノウイルス血清型５に基づいた系は、製薬産業において最も広く使用されている手段である。

【0006】

このタイプのベクターは、例えば、高い安全性、異なる細胞型に侵入する能力、高いパッケージング能力、高い力価を有する産物を生じる可能性などの利点を有する。

【0007】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスＳタンパク質配列を含有する組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づいた、重症急性呼吸器症候群に対するワクチンを使用することを提言する解決策がある（ＣＮ１２７６７７７Ｃ号）。

【0008】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスの全長Ｓ防御抗原の配列、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスのＳ抗原のＳ１ドメイン、若しくはＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスのＳ抗原のＳ２ドメイン、若しくは両方のドメインを含む配列を含有する組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づいた重症急性呼吸器症候群に対するワクチンについて記載する、米国特許出願公開第２００８０２６７９９２Ａ１号の発明の特許請求の範囲に従う解決策がある。加えて、発現カセット内のこの組換えウイルスは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ－プロモーター）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂｇｈ－ＰｏｌｙＡ）シグナルを含有する。

【0009】

Ｅ１及びＥ３領域が欠失されたヒトアデノウイルス血清型５に基づき、Ｓタンパク質遺伝子を含有する発現ベクターの開発について記載する、ＣＮ１１１２１８４５９号に従う解決策がある。このベクターは、ＣＯＶＩＤ－１９に対するワクチンを設計するために使用される。

【0010】

同時に、一部の人々は既存の免疫応答を有するので、ヒトアデノウイルス血清型５に基づいたベクターの広範な用途は限られている。したがって、遺伝的変異、例えば他の血清型のアデノウイルスに基づくものを有する複数のベクターの開発に焦点が向けられる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

発明の実行
特許請求される発明群の技術的目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質に対する持続的な免疫応答を誘導すること、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質に対する生物学的に有効な防御抗体力価の存在を保証することである。重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための免疫生物学的薬剤を作製することが可能になる。

【課題を解決するための手段】

【0012】

技術的結果は、Ｅ１及びＥ３領域が欠失され、且つＯＲＦ６－Ａｄ２６領域がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが配置された発現ベクター（変異型１）の作製である。それに関して、配列番号５の配列をヒトアデノウイルス血清型２６の親配列として使用した。

【0013】

さらに、技術的結果は、Ｅ１及びＥ３領域が欠失された組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムを含有し、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが配置された発現ベクター（変異型２）の作製である。それに関して、配列番号６の配列をサルアデノウイルス血清型２５の親配列として使用した。

【0014】

そしてさらに、技術的結果は、Ｅ１及びＥ３領域が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを含有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが配置された発現ベクター（変異型３）の作製である。それに関して、配列番号７の配列をヒトアデノウイルス血清型５の親配列として使用した。

【0015】

この技術的結果は、重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫を誘導するための免疫生物学的薬剤の作製のための、開発された発現ベクターの利用方法が開発されることによっても達成される。

【発明を実施するための形態】

【0016】

発明の実施形態
組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含有する発現ベクターを得る方法では、第１段階でヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムの２つの相同領域を含むプラスミドが構築され、これは次に、制限エンドヌクレアーゼを用いて直線化され、ヒトアデノウイルス血清型２６のウイルス粒子から単離されたＤＮＡと混合され、大腸菌（E. coli）細胞において相同組換えが行われる。結果として、Ｅ１領域が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを保有するプラスミドが得られる。次に、遺伝子操作法を用いて、オープンリーディングフレーム６（ＯＲＦ６）が、ヒトアデノウイルス血清型５のＯＲＦ６によって置換される。そして、パッケージング能力を拡張するためにＥ３領域が欠失される。最終的に、発現カセットがベクターに挿入される。

【0017】

組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムを含有する発現ベクターを得る方法は、次の通りである：第１段階で、サルアデノウイルス血清型２５のゲノムの２つの相同領域を含むプラスミドが構築され、これは次に、制限エンドヌクレアーゼを用いて直線化され、サルアデノウイルス血清型２５のウイルス粒子から単離されたＤＮＡと混合され、大腸菌（E. coli）細胞において相同組換えが行われる。結果として、Ｅ１領域が欠失されたサルアデノウイルス血清型２５のゲノムを保有するプラスミドが得られる。次に、パッケージング能力を拡張するためにＥ３領域が欠失される。最終的に、発現カセットがベクターに挿入される。

【0018】

組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを含有する発現ベクターを得る方法は、次の通りである：第１段階で、ヒトアデノウイルス血清型５のゲノムの２つの相同領域を含むプラスミドが構築され、これは次に、制限エンドヌクレアーゼを用いて直線化され、ヒトアデノウイルス血清型５のウイルス粒子から単離されたＤＮＡと混合され、大腸菌（E. coli）細胞において相同組換えが行われる。結果として、Ｅ１領域が欠失されたヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを保有するプラスミドが得られる。次に、遺伝子操作法を用いて、パッケージング能力を拡張するためにＥ３領域が欠失される。最終的に、発現カセットがベクターに挿入される。

【0019】

免疫反応の誘導の有効性を最大にするために、著者らは、発現カセットの複数の変異型を特許請求した。

【0020】

全てのカセットにおいて、哺乳類細胞における発現のために最適化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイク（Ｓ）タンパク質を抗原として使用した。Ｓタンパク質は、コロナウイルス構造タンパク質の１つである。Ｓタンパク質はウイルス粒子表面に露出され、ＡＣＥ２（アンジオテンシン変換酵素２）受容体に結合させることに関与している。完了した研究の結果により、Ｓタンパク質に対するウイルス中和抗体の産生が実証され、従って、医薬品の開発のために有望な抗原であると考えられる。

【0021】

発現カセット配列番号１は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有する。

【0022】

発現カセット配列番号２は、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有する。

【0023】

発現カセット配列番号３は、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有する。

【0024】

発現カセット配列番号４は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有する。

【0025】

本発明の有効性を確認するために、開発発現ベクターが重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する動物の免疫応答を誘導する能力を評価した。

【0026】

発明の実行は、以下の実施例によって証明される。

【実施例】

【0027】

実施例１
組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含有する発現ベクターの製造
第１段階で、ヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムと相同の２つの領域（２つの相同性アーム）、及びアンピシリン耐性遺伝子を保有するプラスミド構築物ｐＡｄ２６－Ｅｎｄｓを設計した。相同性アームの一方は、ヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムの開始部分（左側逆位末端反復配列からＥ１領域まで）、及びｐＩＸタンパク質を含むウイルスゲノムの配列である。他方の相同性アームは、ゲノムの末端を介してＯＲＦ３ Ｅ４領域の後に位置するヌクレオチド配列を含有する。ｐＡｄ２６－Ｅｎｄｓ構築物の合成は、Moscow企業「Eurogen」ZAOにより実施した。

【0028】

ウイルス粒子から単離されたヒトアデノウイルス血清型２６のＤＮＡをｐＡｄ２６－Ｅｎｄｓと混合した。ｐＡｄ２６－ＥｎｄｓとウイルスＤＮＡとの間の相同組換えプロセスによって、Ｅ１領域が欠失されたヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを保有するプラスミドｐＡｄ２６－ｄｌＥ１が得られた。

【0029】

次に、得られたプラスミドｐＡｄ２６－ｄｌＥ１において、標準的なクローニング技術を用いて、ヒトアデノウイルス血清型２６がＨＥＫ２９３細胞培養物において効果的に複製できることを保証するために、オープンリーディングフレーム６（ＯＲＦ６－Ａｄ２６）を含有する配列を、ヒトアデノウイルス血清型５のゲノムからの同様の配列で置換した。結果として、プラスミドｐＡｄ２６－ｄｌＥ１－ＯＲＦ６－Ａｄ５が得られた。

【0030】

さらに、ベクターのパッケージング能力を拡張するために、標準的な遺伝子操作技術を用いて、アデノウイルスゲノムのＥ３領域（遺伝子ｐＶＩＩＩとＵ－エクソンの間の約３３２１塩基対）を構築プラスミドｐＡｄ２６－ｄｌＥ１－ＯＲＦ６－Ａｄ５から欠失させた。最終的に、ヒトアデノウイルス血清型５のオープンリーディングフレームＯＲＦ６を有し、且つＥ１及びＥ３領域が欠失されたヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムに基づいた組換えベクターｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ｎｕｌｌが得られた。配列番号５の配列をヒトアデノウイルス血清型２６の親配列として使用した。

【0031】

また、著者らは、複数の発現カセット設計を開発した：
－ 発現カセット配列番号１は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有し、
－ 発現カセット配列番号２は、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有し、
－ 発現カセット配列番号３は、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有する。

【0032】

プラスミド構築物ｐＡｄ２６－Ｅｎｄｓに基づき、遺伝子操作技術を用いて、発現カセット配列番号１、配列番号２、又は配列番号３をそれぞれ含有すると共に、アデノウイルス血清型２６のゲノムの相同性アームを保有する構築物ｐＡｒｍｓ－２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２が得られた。次に、相同性アーム間の唯一の加水分解部位により、構築物ｐＡｒｍｓ－２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を直線化した。プラスミドのそれぞれを組換えベクターｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ｎｕｌｌと混合した。相同組換えにより、ヒトアデノウイルス血清型５のオープンリーディングフレームＯＲＦ６と、Ｅ１及びＥ３領域の欠失とを有する組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを保有し、発現カセット配列番号１、配列番号２又は配列番号３をそれぞれ有する、プラスミドｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を得ることができた。

【0033】

第４段階の間に、プラスミドｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ２６－ｏｎｌｙ－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を特定の制限エンドヌクレアーゼにより加水分解して、ベクター部分を除去した。得られたＤＮＡ産物をＨＥＫ２９３細胞培養物のトランスフェクションのために使用した。

【0034】

したがって、Ｅ１及びＥ３領域が欠失され、且つＲＦ６－Ａｄ２６領域がＯＲＦ６－Ａｄ５により置換された組換えヒトアデノウイルス血清型２６のゲノムを含有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターが得られた。

【0035】

実施例２
組換えサルアデノウイルス血清型２５のゲノムを含有する発現ベクターの製造
第１段階で、サルアデノウイルス血清型２５のゲノムと相同の２つの領域（２つの相同性アーム）を保有するプラスミド構築物ｐＳｉｍ２５－Ｅｎｄｓを設計した。相同性アームの一方は、サルアデノウイルス血清型２５のゲノムの開始部分（左側逆位末端反復配列からＥ１領域まで）、及びＥ１領域の末端からｐＩＶａ２タンパク質までの配列である。他方の相同性アームは、右側逆位末端反復配列を含むアデノウイルスゲノムの末端部分の配列を含有する。ｐＳｉｍ２５－Ｅｎｄｓ構築物の合成は、Moscow企業「Eurogen」ZAOにより実施した。

【0036】

ウイルス粒子から単離されたサルアデノウイルス血清型２５のＤＮＡをｐＳｉｍ２５－Ｅｎｄｓと混合した。ｐＳｉｍ２５－ＥｎｄｓとウイルスＤＮＡとの間の相同組換えプロセスによって、Ｅ１領域が欠失されたサルアデノウイルス血清型２５のゲノムを保有するプラスミドｐＳｉｍ２５－ｄｌＥ１が得られた。

【0037】

さらに、ベクターのパッケージング能力を拡張するために、標準的な遺伝子操作技術を用いて、アデノウイルスゲノムのＥ３領域（遺伝子１２，５Ｋの開始部分から遺伝子１４．７Ｋまでの約３９２１塩基対）を構築プラスミドｐＳｉｍ２５－ｄｌＥ１から欠失させた。最終的に、Ｅ１及びＥ３領域が欠失されたサルアデノウイルス血清型２５の全長ゲノムをコードするプラスミド構築物ｐＳｉｍ２５－ｎｕｌｌが得られた。配列番号６の配列をサルアデノウイルス血清型２５の親配列として使用した。

【0038】

また、著者らは、複数の発現カセット設計を開発した：
－ 発現カセット配列番号４は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有し、
－ 発現カセット配列番号２は、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有し、
－ 発現カセット配列番号３は、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有する。

【0039】

次に、プラスミド構築物ｐＳｉｍ２５－Ｅｎｄｓに基づき、遺伝子操作技術を用いて、発現カセット配列番号４、配列番号２、又は配列番号３をそれぞれ含有すると共に、サルアデノウイルス血清型２５のゲノムからの相同性アームを保有する構築物ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２が得られた。次に、相同性アーム間の唯一の加水分解部位により、構築物ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ｓｉｍ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を直線化した。プラスミドのそれぞれを組換えベクターｐＳｉｍ２５－ｎｕｌｌと混合した。相同組換えの結果として、Ｅ１及びＥ３領域が欠失されたサルアデノウイルス血清型２５の全長ゲノムを含有し、そして発現カセット配列番号４、配列番号２、又は配列番号３をそれぞれ含有する組換えプラスミドベクターｐＳｉｍ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＳｉｍ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＳｉｍ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２が得られた。

【0040】

第３段階の間に、プラスミドｐＳｉｍ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＳｉｍ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＳｉｍ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を特定の制限エンドヌクレアーゼにより加水分解して、ベクター部分を除去した。得られたＤＮＡ産物をＨＥＫ２９３細胞培養物のトランスフェクションのために使用した。製造した物質を使用して、調製量（preparative amount）の組換えアデノウイルスを生成した。

【0041】

結果として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子を含有する組換えヒトアデノウイルス血清型２５が得られた：ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号４を含有する）；ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号２を含有する）；ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号３を含有する）。

【0042】

したがって、Ｅ１及びＥ３領域が欠失された組換えサルアデノウイルス２５のゲノムを含有し、配列番号４、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターが得られた。

【0043】

実施例３
組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを含有する発現ベクターの製造
第１段階で、ヒトアデノウイルス血清型５のゲノムと相同の２つの領域（２つの相同性アーム）を保有するプラスミド構築物ｐＡｄ５－Ｅｎｄｓを設計した。相同性アームの一方は、ヒトアデノウイルス血清型５のゲノムの開始部分（左側逆位末端反復配列からＥ１領域まで）、及びｐＩＸタンパク質を含むウイルスゲノムの配列である。他方の相同性アームは、ゲノムの末端を介してＥ４領域ＯＲＦ３の後にヌクレオチド配列を含有する。ｐＡｄ５－Ｅｎｄｓ構築物の合成は、Moscow企業「Eurogen」ZAOにより実施した。

【0044】

ウイルス粒子から単離されたヒトアデノウイルス血清型５のＤＮＡをｐＡｄ５－Ｅｎｄｓと混合した。ｐＡｄ５－ＥｎｄｓとウイルスＤＮＡとの間の相同組換えによって、Ｅ１領域が欠失されたヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを保有するプラスミドｐＡｄ５－ｄｌＥ１が得られた。

【0045】

さらに、ベクターのパッケージング能力を拡張するために、標準的な遺伝子操作技術を用いて、アデノウイルスゲノムのＥ３領域（遺伝子１２．５Ｋの末端からＵ－エクソンの配列の開始までの２６８５塩基対）を構築プラスミドｐＡｄ５－ｄｌＥ１から欠失させた。最終的に、ゲノムのＥ１及びＥ３領域が欠失されたヒトアデノウイルス血清型５のゲノムに基づく組換えプラスミドベクターｐＡｄ５－ｔｏｏ－ｎｕｌｌが得られた。配列番号７の配列をヒトアデノウイルス血清型５の親配列として使用した。

【0046】

また、著者らは、複数の発現カセット設計を開発した：
－ 発現カセット配列番号１は、ＣＭＶプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有し、
－ 発現カセット配列番号２は、ＣＡＧプロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有し、
－ 発現カセット配列番号３は、ＥＦ１プロモーター、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含有する。

【0047】

次に、プラスミド構築物ｐＡｄ５－Ｅｎｄｓに基づき、遺伝子操作技術を用いて、発現カセット配列番号１、配列番号２、又は配列番号３をそれぞれ含有すると共に、ヒトアデノウイルス血清型５のゲノムからの相同性アームを保有する構築物ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２が得られた。

【0048】

次に、相同性アーム間の唯一の加水分解部位により、構築物ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｒｍｓ－Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を直線化した。プラスミドのそれぞれを組換えベクターｐＡｄ５－ｔｏｏ－ｎｕｌｌと混合した。相同組換えの結果として、Ｅ１及びＥ３領域が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムと、それぞれ発現カセット配列番号１、配列番号２又は配列番号３とを保有するプラスミドｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＧＡＣ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２が得られた。

【0049】

第４段階の間に、プラスミドｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＧＡＣ－Ｓ－ＣｏＶ２、ｐＡｄ５－ｔｏｏ－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２を特定の制限エンドヌクレアーゼにより加水分解して、ベクター部分を除去した。得られたＤＮＡ産物をＨＥＫ２９３細胞培養物のトランスフェクションのために使用した。製造した物質を使用して、調製量の組換えアデノウイルスを生成した。

【0050】

結果として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子を含有する組換えヒトアデノウイルス血清型５が得られた：Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号１を含有する）；Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号２を含有する）；Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２（発現カセット配列番号３を含有する）。

【0051】

したがって、Ｅ１及びＥ３領域が欠失された組換えヒトアデノウイルス血清型５のゲノムを含有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３から選択される発現カセットが組み込まれた発現ベクターが得られた。

【0052】

実施例４
ＨＥＫ２９３細胞における開発発現ベクターによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子の発現の検証
この実験の目的は、構築された組換えアデノウイルスが哺乳類細胞において重症急性呼吸器症候群ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳタンパク質遺伝子を発現する能力を検証することであった。

【0053】

３７℃及び５％ＣО_２のインキュベータにおいて、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地中でＨＥＫ２９３細胞を培養した。細胞を３５ｍｍ^２培養ペトリ皿に入れ、７０％コンフルエンスに達するまで２４時間インキュベートした。次に、研究される発現ベクターの調製物を１つずつ添加した。したがって、以下の群を形成した：
１）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２；
２）Ａｄ２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２；
３）Ａｄ２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２；
４）Ａｄ２６－ｎｕｌｌ；
５）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２；
６）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２；
７）ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２；
８）ｓｉｍＡｄ２５－ｎｕｌｌ；
９）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２；
１０）Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２；
１１）Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２；
１２）Ａｄ５－ｎｕｌｌ；
１３）リン酸緩衝食塩水。

【0054】

形質導入の２日後に細胞を集め、０．５ｍｌの通常強度の緩衝液ＣＣＬＲ（Promega）中で溶解させた。溶解物を炭酸－重炭酸緩衝液で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートウェルに入れた。プレートを＋４℃で一晩インキュベートした。

【0055】

次に、ウェル当たり２００μｌの量の通常強度の洗浄緩衝液でプレートウェルを３回洗浄し、それから１００μｌのブロッキング緩衝液を各ウェルに添加し、プレートを蓋で覆い、４００ｒｐｍの振とう機において３７℃で１時間インキュベートした。次に、ウェル当たり２００μｌの量の通常強度の緩衝液でプレートウェルを３回洗浄し、１００μｌの回復期血清を全てのウェルに添加した。プレートを蓋で覆い、４００ｒｐｍの振とう機において室温で２時間インキュベートした。次に、ウェル当たり２００μｌの量の通常強度の洗浄緩衝液でプレートウェルを３回洗浄し、ビオチンと結合した１００μｌの二次抗体を添加した。プレートを蓋で覆い、４００ｒｐｍの振とう機において室温で２時間インキュベートした。次に、西洋わさびペルオキシダーゼと結合したストレプトアビジンの溶液を調製した。このために、５．９４ｍｌのアッセイ緩衝液中に６０μｌの量の結合体を希釈した。ウェル当たり２００μｌの量の通常強度の洗浄緩衝液でプレートウェルを２回洗浄し、１００μｌの西洋わさびペルオキシダーゼと結合したストレプトアビジン溶液をプレートウェルのそれぞれに添加した。４００ｒｐｍの振とう機においてプレートを室温で１時間インキュベートした。次に、ウェル当たり２００μｌの量の通常強度の洗浄緩衝液でプレートウェルを２回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質をプレートウェルのそれぞれに添加し、暗所において室温で１０分間インキュベートした。次に、１００μｌの停止溶液をプレートウェルのそれぞれに添加した。４５０ｎｍの波長でプレート分光光度計（Multiskan FC, Thermo）を用いて光学濃度の値を測定した。実験結果は表１に提示される。

【0056】

【表1】

【0057】

得られたデータにより示されるように、開発発現ベクターにより形質導入された全ての細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の標的Ｓタンパク質の発現が観察された。

【0058】

実施例５
開発発現ベクターによる動物免疫化の有効性の評価
免疫化の有効性の主な特徴の１つは抗体力価である。実施例は、免疫化後２１日目のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質に対する抗体力価の変化に関するデータを提示する。

【0059】

体重１８ｇのメスの哺乳類種－ＢＡＬＢ／ｃマウスを実験で使用した。全ての動物を１群当たり５匹で１３群に分け、開発発現ベクターを１０^８ウイルス粒子／１００μｌの用量で筋肉内注射した。したがって、以下の動物群を形成した：
１）Ａｄ２６－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２；
２）Ａｄ２６－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２；
３）Ａｄ２６－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２；
４）Ａｄ２６－ｎｕｌｌ；
５）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２；
６）ｓｉｍＡｄ２５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２；
７）ｓｉｍＡｄ２５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２；
８）ｓｉｍＡｄ２５－ｎｕｌｌ；
９）Ａｄ５－ＣＭＶ－Ｓ－ＣｏＶ２；
１０）Ａｄ５－ＣＡＧ－Ｓ－ＣｏＶ２；
１１）Ａｄ５－ＥＦ１－Ｓ－ＣｏＶ２；
１２）Ａｄ５－ｎｕｌｌ；
１３）リン酸緩衝食塩水。

【0060】

３週間後に、動物の尾静脈から血液サンプルを採取し、血清を分離した。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用し、以下のプロトコルに従って抗体力価を測定した：
１）９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルにタンパク質（Ｓ）を＋４℃で１６時間吸着させた。
２）次に、非特異的な結合を防止するために、１ウェル当たり１００μｌの量のＴＰＢＳ中に溶解させた５％の乳によりプレートを「ブロック」した。それを３７℃の振とう機において１時間インキュベートした。
３）２倍希釈法を用いて、免疫化マウスからの血清サンプルを希釈した。全体として、各サンプルの１２の希釈物を調製した。
４）希釈した血清サンプルのそれぞれの５０μｌをプレートウェルに添加した。
５）次に、３７℃で１時間のインキュベーションを実施した。
６）インキュベーションの後、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７）さらに、西洋わさびペルオキシダーゼと結合されたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８）次に、３７℃で１時間のインキュベーションを実施した。
９）インキュベーションの後、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０）次に、西洋わさびペルオキシダーゼの基質としての役割を果たし、反応によって着色化合物に変換されるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を添加した。硫酸の添加により１５分後に反応を停止させた。次に、分光光度計を用いて、各ウェルにおいて４５０ｎｍの波長で溶液の光学濃度（ＯＤ）を測定した。

【0061】

抗体力価は、溶液の光学濃度が負の対照群よりも有意に高い最後の希釈度として決定した。得られた結果（幾何平均）は、表１に提示される。

【0062】

【表2】

【0063】

提示されるデータに示されるように、開発発現ベクターは全て、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質への持続的な免疫応答と、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質への生物学的に有効な防御抗体力価の存在とを誘導する。したがって、これらは、重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための免疫生物学的薬剤を作製するために使用することができる。

【0064】

それにより、指定された技術的目的、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質への持続的な免疫応答とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質への生物学的に有効な防御抗体力価の存在との誘導は、提供される実施例により証明されるように達成される。

【0065】

産業上の利用可能性
提供される実施例は全て、発現ベクターの有効性、重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための免疫生物学的薬剤を作製するためのその利用可能性、及び産業上の利用可能性を確認する。

【配列表】

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