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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-18
(45)【発行日】2023-10-26
(54)【発明の名称】豚感染ウイルスの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 7/00 20060101AFI20231019BHJP
C12N 7/02 20060101ALI20231019BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20231019BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20231019BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20231019BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20231019BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20231019BHJP
【ＦＩ】
C12N7/00
C12N7/02
C12N5/10
C12Q1/02
A61K35/76
A61P31/14
A61P37/04
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019187751
(22)【出願日】2019-10-11
(65)【公開番号】P2021061773
(43)【公開日】2021-04-22
【審査請求日】2022-04-28
(73)【特許権者】
【識別番号】501203344
【氏名又は名称】国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
(73)【特許権者】
【識別番号】000229519
【氏名又は名称】日本ハム株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】竹之内 敬人
(72)【発明者】
【氏名】上西 博英
(72)【発明者】
【氏名】木谷 裕
(72)【発明者】
【氏名】両角 岳哉
(72)【発明者】
【氏名】西山 泰孝
【審査官】小田 浩代
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／１１２１６９（ＷＯ，Ａ２）
【文献】特開２００５－０７５７５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５０００２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】TAKENOUCHI, T. et al.，Front. Vet. Sci.，2017年，Vol. 4:132，pp. 1-9
【文献】DELRUE, I. et al.，BMC Biotechnol.，2010年，Vol. 10:48，pp. 1-12
【文献】TAKENOUCHI, T. et al.，Results Immunol，2014年，Vol. 4，pp. 62-67
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ａ６１Ｋ ３９／１２
Ａ６１Ｐ １１／００
Ａ６１Ｐ １５／０６
Ａ６１Ｐ ３１／１４
Ａ６１Ｐ ３７／０４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
不死化豚腎臓マクロファージと、豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程を含み、前記不死化豚腎臓マクロファージが、豚腎臓由来の初代培養マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素をコードするレンチウイルスを導入して成る、不死化マクロファージ（ＩＰＫＭ）であり、かつ
前記豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）が、ＰＲＲＳウイルスである、豚に感染するウイルスの製造方法。
【請求項2】
不死化豚腎臓マクロファージと、豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程、増殖した豚に感染するウイルスを単離する工程、及び
単離した豚に感染するウイルスを薬理学上許容される担体又は媒体と混合する工程
を含み、
前記不死化豚腎臓マクロファージが、豚腎臓由来の初代培養マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素をコードするレンチウイルスを導入して成る、不死化マクロファージ（ＩＰＫＭ）であり、かつ
前記豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）が、ＰＲＲＳウイルスである、豚に感染するウイルスを含むワクチンの製造方法。
【請求項3】
豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）に感染している不死化豚腎臓マクロファージであって、
前記不死化豚腎臓マクロファージが、豚腎臓由来の初代培養マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素をコードするレンチウイルスを導入して成る、不死化マクロファージ（ＩＰＫＭ）であり、かつ
前記豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）が、ＰＲＲＳウイルスである、不死化豚腎臓マクロファージ。
【請求項4】
豚に感染するウイルスに対する中和抗体を検出する方法であって、
被検豚から単離された生体試料の存在下、不死化豚腎臓マクロファージと豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにて増殖させる工程、
増殖した前記ウイルス数を検出する工程、及び
前記工程にて検出されたウイルス数が、前記生体試料非存在下、不死化豚腎臓マクロファージにて増殖したウイルス数と比して、少ない場合、前記生体試料は前記ウイルスに対する中和抗体を含有していると判定する工程を含み、
前記不死化豚腎臓マクロファージが、豚腎臓由来の初代培養マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素をコードするレンチウイルスを導入して成る、不死化マクロファージ（ＩＰＫＭ）であり、かつ
前記豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）が、ＰＲＲＳウイルスである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、豚に感染するウイルスの製造方法に関し、より詳しくは、不死化豚腎臓マクロファージを用いた、豚感染ウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）の製造方法に関する。また、本発明は、不死化豚腎臓マクロファージを用いた、豚感染ウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）を含むワクチンの製造方法に関する。さらに、本発明は、不死化豚腎臓マクロファージを用いた、豚感染ウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）に対する中和抗体の検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
豚繁殖・呼吸障害症候群（ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＲＲＳ）は、ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）を病原体とする疾病で、育成・肥育段階の豚の呼吸器症状、妊娠中の母豚の死流産等の繁殖障害を引き起こす。日本国内においても、多くの農場に浸潤しており、年間２８０億円という甚大な被害を養豚産業に及ぼすと推計されている。
【0003】
ＰＲＲＳＶに対するワクチンとして生弱毒化ワクチンが日本国内では上市されているが、症状の軽減を期待して用いられることが多く、完全な予防はできていない。このような背景から感染予防が期待できるワクチン開発が望まれている。
【0004】
生弱毒化ワクチンや不活化ワクチンの製造においては、当該病原体が増殖する環境が必要であり、ウイルスのように宿主依存的に増殖する病原体ではウイルスの感染増殖が成立しやすい、ウイルス感受性が高い細胞が必要となる。ＰＲＲＳＶは肺胞マクロファージを用いて分離され（非特許文献１）、生体から回収したばかりの腹腔マクロファージや末梢血単核球には感染せず、肺胞マクロファージのみが高い感受性を示す（非特許文献２）。このため研究目的のウイルスの分離増殖では、と殺された豚の肺から回収した肺胞マクロファージが用いられている。
【0005】
しかしながら、肺胞由来マクロファージは、と殺した豚の肺から回収するための手間、技術、設備が必要となり、また回収した肺胞マクロファージの状態に個体差が大きく影響することも多かった。
【0006】
一方、ＰＲＲＳＶが適応すれば別種の細胞でも増殖し、日本国内で使用可能なＰＲＲＳＶの生弱毒化ワクチンの製造には、霊長類細胞（ＭＡ１０４，Ｍａｒｃ１４５）又はＰＲＲＳＶの宿主側受容体（ＣＤ１６３）を強制発現させたげっ歯類細胞が用いられている。
【0007】
しかしながら、Ｍａｒｃ１４５はＰＲＲＳＶ野外株の分離や増殖が困難であるという欠点があった。また、２種類の豚肺胞マクロファージ由来の細胞株に関し、ＺＭＡＣ１株については細胞の培養が困難であり、また３Ｄ４／３１株についてはウイルス感染を否定する報告がある（非特許文献３）。
【0008】
このように、ＰＲＲＳＶに対し、高い感染感受性を有し、増殖が可能となる豚マクロファージ由来の不死化細胞が求められているが、未だ十分なものは見出されていない。さらに、ＰＲＲＳＶ以外にも、野外株の分離増殖が困難であるとされる豚疾病関連ウイルスも多く、複数のウイルス種の野外株に関し、効率の良い分離増殖が期待できる細胞株が希求されているが、そのような細胞もこれまでなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｃｏｌｌｉｎｓ ＪＥ．ら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９２年４月、４；２：１１７－１２６
【文献】Ｄｕａｎ Ｘ．ら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９７年、１４２；１２：２４８３－２４９７．
【文献】Ｗｅｉｎｇａｒｔｌ ＨＭ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２００２年７月、１０４；２：２０３
【文献】Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ Ｔ．ら、Ｆｒｏｎｔ Ｖｅｔ Ｓｃｉ．、２０１７年８月、２１；４：１３２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、ＰＲＲＳＶ等の豚に感染するウイルスに対して感染感受性が高い、豚由来の不死化マクロファージ細胞を見出し、当該細胞を用いた前記ウイルスの増殖方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ね、様々な細胞に対する、様々な豚感染ウイルス株を用いた感染試験を行なった。
【0012】
その結果、先ず、本発明者が従前開発した不死化豚腎臓マクロファージ（Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＩＰＫＭ、非特許文献４ 参照）は、様々なＰＲＲＳＶ株に対して感受性を有し、これらウイルス株の増殖が可能であることが明らかになった。
【0013】
マクロファージは体内の様々な箇所に存在しており、それぞれは性質が少しずつ異なっている。また、上述のとおり、これまで、ＰＲＲＳＶは宿主と細胞指向性が高く豚の肺胞マクロファージにのみ感染するとされていた。そのため、腎臓マクロファージにＰＲＲＳＶが感染できるということは到底予期できない驚くべきことであった。
【0014】
さらに、野外株の分離増殖が困難とされ、またマクロファージへの感染は不明であった、豚流行性下痢ウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス、豚パルボウイルス、日本脳炎ウイルス、オーエスキーウイルス、豚サーコウイルス２型のいずれについても、不死化豚腎臓マクロファージに感染し、増殖できることが明らかになった。
【0015】
このように、様々なタイプの豚感染ウイルスに対し、豚腎臓マクロファージ由来の不死化細胞は、高い感染感受性を有し、また当該ウイルスの増殖が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0016】
すなわち、本発明は、不死化豚腎臓マクロファージを用いた、豚感染ウイルス又はワクチンの製造方法に関する。さらに、本発明は、不死化豚腎臓マクロファージを用いた、豚感染ウイルスに対する中和抗体の検出方法に関し、具体的には以下のとおりである。
＜１＞ 不死化豚腎臓マクロファージと、豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程を含む、豚に感染するウイルスの製造方法。
＜２＞ 不死化豚腎臓マクロファージと、豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程、
増殖した豚に感染するウイルスを単離する工程、及び
単離した豚に感染するウイルスを薬理学上許容される担体又は媒体と混合する工程
を含む、豚に感染するウイルスを含むワクチンの製造方法。
＜３＞ 前記不死化豚腎臓マクロファージは、豚由来の腎臓マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素をコードするレンチウイルスを導入して成る、不死化マクロファージである、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞ 豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）に感染している不死化豚腎臓マクロファージ。
＜５＞ 豚由来の腎臓マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素をコードするレンチウイルスを導入して成り、豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）に感染している不死化豚腎臓マクロファージ。
＜６＞ 豚に感染するウイルスに対する中和抗体を検出する方法であって、下記工程を含む方法
被検豚から単離された生体試料の存在下、不死化豚腎臓マクロファージと豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにて増殖させる工程、
増殖した前記ウイルス数を検出する工程、及び
前記工程にて検出されたウイルス数が、前記生体試料非存在下、不死化豚腎臓マクロファージにて増殖したウイルス数と比して、少ない場合、前記生体試料は前記ウイルスに対する中和抗体を含有していると判定する工程。
＜１＞ 不死化豚腎臓マクロファージと、豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程を含む、豚に感染するウイルスの製造方法。
＜２＞ 不死化豚腎臓マクロファージと、豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程、
増殖した豚に感染するウイルスを単離する工程、及び
単離した豚に感染するウイルスを薬理学上許容される担体又は媒体と混合する工程
を含む、豚に感染するウイルスを含むワクチンの製造方法。
＜３＞ 前記不死化豚腎臓マクロファージは、豚由来の腎臓マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素をコードするレンチウイルスを導入して成る、不死化マクロファージである、＜１＞又は＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞ 豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）に感染している不死化豚腎臓マクロファージ。
＜５＞ 豚由来の腎臓マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素をコードするレンチウイルスを導入して成り、豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）に感染している不死化豚腎臓マクロファージ。
＜６＞ 豚に感染するウイルスに対する中和抗体を検出する方法であって、下記工程を含む方法
被検豚から単離された生体試料の存在下、不死化豚腎臓マクロファージと豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにて増殖させる工程、
増殖した前記ウイルス数を検出する工程、及び
前記工程にて検出されたウイルス数が、前記生体試料非存在下、不死化豚腎臓マクロファージにて増殖したウイルス数と比して、少ない場合、前記生体試料は前記ウイルスに対する中和抗体を含有していると判定する工程。
【発明の効果】
【0017】
本発明によれば、豚に感染するウイルスに対して高い感染感受性を有する不死化豚腎臓マクロファージを用いることにより、様々な豚感染ウイルス株を増殖させることが可能となり、当該ウイルスに対するワクチンの開発、製造が可能となる。また、不死化豚腎臓マクロファージを用いることにより、豚感染ウイルスに対する中和抗体の存在の有無を判定することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】豚腎臓細胞（ＰＫ１５）、ミドリザル腎臓細胞（Ｍａｒｃ１４５）、不死化豚腎臓マクロファージ（ＩＰＫＭ）、豚肺胞マクロファージ（３Ｄ４／３１）、マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）、マウス腎臓マクロファージ（ＫＭ１）に、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の野外株１～５、並びにワクチン株 インゲルバック及びフォステラを各々感染させ、２４時間後のウイルスを、免疫蛍光染色にて検出した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。図中において、ウイルスが増殖した細胞は、白く検出されている。
【図2】ＰＲＲＳＶ 野外株２及びインゲルバックを各々、ＩＰＫＭ、Ｍａｒｃ１４５に感染させ、溶解した細胞中のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにて分離した後、ＰＲＲＳウイルスＮタンパク質抗体を用いたウェスタンブロット解析にて解析した結果を示す、写真である。ウイルスと細胞の組み合わせは３連で行った。図中、「＋」は感染区を示し、「―」は非感染区を示す。
【図3】インゲルバックを、Ｍａｒｃ１４５（黒塗り四角）、ＩＰＫＭ（中抜き丸）に接種し、経時的に培養上清を集め、上清中のウイルス量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す、グラフである。横軸は感染後の経過時間、縦軸はゲノム相当数（対数）を示す。
【図4】ＰＲＲＳＶ 野外株３を、Ｍａｒｃ１４５（黒塗り四角）、ＩＰＫＭ（中抜き丸）に接種し、経時的に培養上清を集め、上清中のウイルス量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す、グラフである。横軸は感染後の経過時間、縦軸はゲノム相当数（対数）を示す。
【図5】オーエスキーウイルスの生ワクチンウイルス液をＩＰＫＭに接種し、８時間後と４８時間後に上清を集め（図中「８時間」、「４８時間」）、４８時間後は細胞を溶解して（図中「ライセート」）、上清と細胞に含まれるウイルス量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す、グラフである。縦軸はサイクル数を示し、数字が小さくなるほどＰＣＲの鋳型量が多いことを表す。
【図6】日本脳炎ウイルスの生ワクチンウイルス液をＩＰＫＭに接種し、８時間後と４８時間後に上清を集め（図中「８時間」、「４８時間」）、４８時間後は細胞を溶解して（図中「ライセート」）、上清と細胞に含まれるウイルス量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す、グラフである。縦軸はサイクル数を示し、数字が小さくなるほどＰＣＲの鋳型量が多いことを表す。
【図7】豚サーコウイルス２型のウイルス液をＩＰＫＭに接種し、８時間後と４８時間後に上清を集め（図中「８時間」、「４８時間」）、４８時間後は細胞を溶解して（図中「ライセート」）、上清と細胞に含まれるウイルス量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す、グラフである。縦軸はサイクル数を示し、数字が小さくなるほどＰＣＲの鋳型量が多いことを表す。
【図8】豚流行性下痢ウイルスの生ワクチンウイルス液をＩＰＫＭに接種し、８時間後と４８時間後に上清を集め（図中「８時間」、「４８時間」）、４８時間後は細胞を溶解して（図中「ライセート」）、上清と細胞に含まれるウイルス量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す、グラフである。縦軸はサイクル数を示し、数字が小さくなるほどＰＣＲの鋳型量が多いことを表す。
【図9】豚パルボウイルスの生ワクチンウイルス液をＩＰＫＭに接種し、８時間後と４８時間後に上清を集め（図中「８時間」、「４８時間」）、４８時間後は細胞を溶解して（図中「ライセート」）、上清と細胞に含まれるウイルス量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す、グラフである。縦軸はサイクル数を示し、数字が小さくなるほどＰＣＲの鋳型量が多いことを表す。
【図10】豚伝染性胃腸炎ウイルスの生ワクチンウイルス液をＩＰＫＭに接種し、８時間後と４８時間後に上清を集め（図中「８時間」、「４８時間」）、４８時間後は細胞を溶解して（図中「ライセート」）、上清と細胞に含まれるウイルス量をリアルタイムＰＣＲで測定した結果を示す、グラフである。縦軸はサイクル数を示し、数字が小さくなるほどＰＣＲの鋳型量が多いことを表す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
後述の実施例に示すとおり、不死化豚腎臓マクロファージは、様々な豚に感染するウイルス（豚感染ウイルス）株に対して高い感染感受性を示し、当該ウイルスを増殖させることが可能となる。
【0020】
したがって、本発明は、不死化豚腎臓マクロファージと、豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程を含む、豚に感染するウイルスの製造方法を提供する。また、本発明は、豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）に感染している不死化豚腎臓マクロファージを提供する。
【0021】
（不死化豚腎臓マクロファージ）
本発明において、豚感染ウイルスが感染し、増殖の場となる「不死化豚腎臓マクロファージ」は、豚（哺乳綱鯨偶蹄目イノシシ科の動物）の腎臓に存在するマクロファージが不死化した細胞を意味する。
本発明において、豚感染ウイルスが感染し、増殖の場となる「不死化豚腎臓マクロファージ」は、豚（哺乳綱鯨偶蹄目イノシシ科の動物）の腎臓に存在するマクロファージが不死化した細胞を意味する。
【0022】
不死化される「豚腎臓マクロファージ」は、当業者であれば公知の手法に沿って調製することができる。例えば、Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ Ｔ．ら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１４年８月、１巻、４号、６２～６７ページに記載のとおり、豚新生仔から採取した腎臓から、腎繊維被膜を除去し、腎皮質を単離する。そして、単離した腎皮質をミンチして培養する過程において生じる、単層の細胞シートに緩く接着し、増殖活性を示すマクロファージ様細胞を単離することによって調製することができる。
【0023】
豚腎臓マクロファージを不死化する方法については特に制限はないが、不死化遺伝子を少なくとも１種導入することにより行うことができる。不死化遺伝子としては、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０Ｔ抗原）、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、Ｍｙｃ、Ｒａｓが挙げられるが、ＳＶ４０Ｔ抗原及びＴＥＲＴを導入することが好ましく、豚マクロファージの不死化効率を高めるという観点から、ＳＶ４０Ｔ抗原及び豚由来のＴＥＲＴを導入することがより好ましい。
【0024】
不死化遺伝子の導入は、当該遺伝子をコードするベクターを用いることによって行うことができる。ベクターとしては直鎖状でも環状でもよく、例えば、ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター、トランスポゾンベクターが挙げられる。
【0025】
ウイルスベクターとしては、例えば、レンチウイルス等のレトロウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクターが挙げられる。プラスミドベクターとしては、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等の、動物細胞発現用プラスミドベクターが挙げられる。これらベクターにおいて、豚マクロファージへの遺伝子導入効率を高めるという観点から、レトロウイルスベクターが好ましく、レンチウイルスがより好ましい。
【0026】
本発明に係るベクターには、不死化遺伝子の他に、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等の発現制御配列、複製開始点や複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、５’キャップ構造、シャイン・ダルガノ配列、コザック配列等を含む５’非翻訳領域、ポリアデニレーションシグナル、ＡＵリッチエレメント、ＧＵリッチエレメント等を含む３’非翻訳領域、他のタンパク質をコードするヌクレオチド等を含んでいてもよい。
【0027】
不死化遺伝子は、プロモーターの下流に作動可能に配置することで、各ポリヌクレオチドを効率よく転写することが可能となる。かかる「プロモーター」としては、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ＭＳＣＶプロモーター、ｈＴＥＲＴプロモーター、βアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーターメタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等が挙げられる。
【0028】
「他のタンパク質をコードするヌクレオチド」としては、例えば、レポーター遺伝子、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を挙げることができる。
【0029】
また、複数種の不死化遺伝子を導入する場合には、これら遺伝子を、単一のベクターに組み込んでもよく、各々別々のベクターに組み込んでもよいが、発現効率を高めるという観点から、別々のベクターに組み込むことが望ましい。また、単一のベクターに組み込む際には、例えば、ＩＲＥＳ、２Ａペプチド配列等を該ベクターに挿入することにより、ポリシストロニックに複数種の不死化遺伝子を発現させることが可能となる。
【0030】
前記ベクターを細胞に導入する方法としては、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、エレクトロポーレーション法、パーティクルガン法等を挙げることができる。また、本発明のベクターがレトロウイルスベクターである場合、ベクターが有しているＬＴＲ配列及びパッケージングシグナル配列に基づいて適切なパッケージング細胞を選択し、これを使用してレトロウイルス粒子を調製してもよい。パッケージング細胞としては、例えば、ＰＧ１３、ＰＡ３１７、ＧＰ＋Ｅ－８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２、Ｐｓｉ－Ｃｒｉｐが挙げられる。さらに、トランスフェクション効率の高い２９３細胞や２９３Ｔ細胞をパッケージング細胞として用いることもできる。また、このようにして調製されたウイルス粒子は、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ法、Ｐｒｏｔａｍｉｎｅ法、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ法等によって細胞に導入することができる。
【0031】
このように不死化遺伝子を導入して樹立される不死化豚腎臓マクロファージは、少なくとも１カ月以上の増殖性を示し、好ましくは３カ月以上の増殖性を示し、より好ましくは５カ月以上の増殖性を示す。不死化豚腎臓マクロファージの倍加時間は、少なくとも６日間であり、好ましくは４日間であり、より好ましくは２日間である。また、不死化豚腎臓マクロファージはマクロファージの特性を維持していることが好ましく、例えば、マクロファージ特異的遺伝子 ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１６、Ｉｂａ－１、ＭＳＲ－Ａ、ＭＨＣ－ＩＩ及びＣＤ１６３のうちの少なくとも１の遺伝子が発現しており、好ましくは２の遺伝子が発現しており、より好ましくは４の遺伝子が発現しており、特に好ましくは全ての遺伝子が発現している。また、本発明に係る不死化豚腎臓マクロファージは、マクロファージの特性として、貪食作用、ＬＰＳ刺激による炎症性サイトカインの産生及びインフラマソーム活性に伴うＩＬ－１β成熟化のうちの少なくとも１の機能を保持しており、好ましくは２の機能を保持しており、さらに好ましくは全ての機能を保持している。本発明においては、上記全ての性質を備え得る、Ｔａｋｅｎｏｕｃｈｉ Ｔ．ら、Ｆｒｏｎｔ Ｖｅｔ Ｓｃｉ．、２０１７年８月、２１；４：１３２．（非特許文献４）に記載の方法によって作製される、豚由来の腎臓マクロファージに、ＳＶ４０ラージＴ抗原及び豚由来のテロメラーゼ逆転写酵素をコードするレンチウイルスを導入して成る、不死化マクロファージが、特に好適に用いられる。なお、非特許文献４に記載の方法によって得られる不死化豚腎臓マクロファージは、初代培養の豚マクロファージとは異なり、密に展開して（シート状になって）増殖する。したがって、当該マクロファージは、形態の変化を検出し易いため、後述の感染細胞の変性を指標とする感染試験（ＣＰＥ試験）においても、有用である。
【0032】
（豚に感染するウイルス）
後述の実施例において示したとおり、豚腎臓マクロファージ由来の不死化細胞は、様々な豚に感染するウイルスに対して高い感染感受性を示し、当該ウイルスを増殖させることができる。したがって、本発明において、「豚に感染するウイルス（豚感染ウイルス）」は、少なくとも豚に感染し得るウイルスであればよく、ＤＮＡウイルス（二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡウイルス、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡウイルス、ｓｓ及びｄｓＤＮＡ領域の両方を含有するＤＮＡウイルス）であってもよく、ＲＮＡウイルス（一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルス（プラス鎖ＲＮＡウイルス又はマイナス鎖ＲＮＡウイルス）、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡウイルス）であってもよい。
後述の実施例において示したとおり、豚腎臓マクロファージ由来の不死化細胞は、様々な豚に感染するウイルスに対して高い感染感受性を示し、当該ウイルスを増殖させることができる。したがって、本発明において、「豚に感染するウイルス（豚感染ウイルス）」は、少なくとも豚に感染し得るウイルスであればよく、ＤＮＡウイルス（二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡウイルス、一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡウイルス、ｓｓ及びｄｓＤＮＡ領域の両方を含有するＤＮＡウイルス）であってもよく、ＲＮＡウイルス（一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡウイルス（プラス鎖ＲＮＡウイルス又はマイナス鎖ＲＮＡウイルス）、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡウイルス）であってもよい。
【0033】
ｄｓＤＮＡウイルスとしては、例えば、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科に属するウイルスが挙げられる。ヘルペスウイルス科に属するウイルスとしては、オーエスキー病ウイルス（ヘルペスウイルス科、アルファヘルペスウイルス亜科、ヴァリセロウイルス属に属する）等が挙げられる。ポックスウイルス科に属するウイルスとしては、豚痘ウイルス（ポックスウイルス科、スイポックスウイルス属に属する）、ワクシニアウイルス（ポックスウイルス科に属し、オルソポックスウイルス属に属する）等が挙げられる。
【0034】
ｓｓＤＮＡウイルスとしては、例えば、サーコウイルス科、パルボウイルス科に属するウイルスが挙げられる。サーコウイルス科に属するウイルスとしては、豚サーコウイルス１型、２型（サーコウイルス科、サーコウイルス属に属する）等が挙げられる。パルボウイルス科に属するウイルスとしては、パルボウイルス（パルボウイルス科、パルボウイルス属に属する）等が挙げられる。
【0035】
ｓｓＲＮＡ（＋）ウイルスとしては、コロナウイルス科、アルテリウイルス科、フラビウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科、ヘペウイルス科に属するウイルスが挙げられる。コロナウイルス科に属するウイルスとしては、豚流行性下痢ウイルス（ＴＧＥ）（コロナウイルス科、アルファコロナウイルス属に属する）、豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＰＥＤ）（コロナウイルス科、アルファコロナウイルス属に属する）等が挙げられる。アルテリウイルス科に属するウイルスとしては、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（アルテリウイルス科、ポラルテウイルス（Ｐｏｒａｒｔｅｖｉｒｕｓ）属（旧名称：アルテリウイルス属）に属する）等が挙げられる。フラビウイルス科に属するウイルスとしては、日本脳炎ウイルス（フラビウイルス科、フラビウイルス属に属する）、豚コレラウイルス（フラビウイルス科、ペスチウイルス属に属する）等が挙げられる。ピコルナウイルス科に属するウイルスとしては、脳心筋炎ウイルス（ピコルナウイルス科、カルディオウイルス属に属する）、口蹄疫ウイルス（ピコルナウイルス科、アフトウイルス属に属する）、豚水胞病ウイルス（ピコルナウイルス科、エンテロウイルス属に属する）、豚テシオウイルス（ピコルナウイルス科、テシオウイルス属に属する）、豚サペロウイルス（ピコルナウイルス科、サペロウイルス属に属する）、豚エンテロウイルスＢ（ピコルナウイルス科、エンテロウイルス属に属する）等が挙げられる。カリシウイルス科に属するウイルスとしては、豚水泡疹ウイルス（カリシウイルス科、ベシウイルス属に属する）等が挙げられる。ヘペウイルス科に属するウイルスとしては、Ｅ型肝炎ウイルス（ヘペウイルス科、ヘペウイルス属に属する）等が挙げられる。
【0036】
ｓｓＲＮＡ（－）ウイルスとしては、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ラブドウイルス科に属するウイルスが挙げられる。パラミクソウイルス科に属するウイルスとしては、ニパウイルス（パラミクソウイルス科、へニパウイルス属に属する）、リンデルウイルス（パラミクソウイルス科、モルビリウイルス属に属する）等が挙げられる。オルトミクソウイルス科に属するウイルスとしては、豚インフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルスが挙げられる。ラブドウイルス科に属するウイルスとしては、水疱性口炎ウイルス（ラブドウイルス科、ベシクロウイルス属に属する）、狂犬病ウイルス（ラブドウイルス科、リッサウイルス属に属する）等が挙げられる。
【0037】
上記例のとおり、豚に感染し得るウイルスであれば、その感染症状（例えば、消化器官症状、呼吸器症状）に限定されることなく、また感染経路（例えば、粘膜）も限定されるものではない。
【0038】
また、「アフリカ豚コレラウイルス」は、アスファウイルス科アスフィウイルス属に属する二本鎖ＤＮＡをゲノムに有するウイルス（Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ Ａｓｆｉｖｉｒｕｓ）を意味する。
【0039】
（豚感染ウイルスの製造方法）
本発明の豚感染ウイルスの製造方法（増殖方法、増幅方法）は、不死化豚腎臓マクロファージと、豚感染ウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程を含む、方法である。
本発明の豚感染ウイルスの製造方法（増殖方法、増幅方法）は、不死化豚腎臓マクロファージと、豚感染ウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程を含む、方法である。
【0040】
不死化豚腎臓マクロファージに接触させる豚感染ウイルスについては、上述のとおりであるが、単離された当該ウイルス自体のみならず、前記ウイルスを含み得る試料であってもよい。かかる「試料」としては、豚由来の組織、細胞、それらの培養物、洗浄液、若しくは抽出物、又は豚の飼育環境（飼育施設等）の採取物、洗浄液若しくはそれらの培養物が挙げられる。
【0041】
「接触」は、不死化豚腎臓マクロファージを培養する培地に、豚感染ウイルスを添加することによって、通常行われる。かかる「培地」としては、不死化豚腎臓マクロファージを維持できる培地であれば特に制限はなく、公知の基礎培地を基に周知慣用の培地添加物を適宜添加することによって調製することができる。「基礎培地」としては、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地（高グルコース）、ＤＭＥＭ培地（低グルコース）、ＲＰＭＩ １６０培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、ハムＦ１２培地、ＫＳＯＭ培地、イーグルＭＥＭ培地、グラスゴーＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハム培地、フィッシャーズ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、ＭＥＭ Ｚｉｎｃオプション改善培地、ＩＭＤＭ培地、メヂィウム１９９培地、及びこれら任意の混合培地が挙げられる。「培地添加物」としては、例えば、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン等）、抗真菌薬、機能性タンパク質（インスリン、トランスフェリン、ラクトフェリン等）、還元剤（２－メルカプトエタノール、モノチオグリセロール、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｎ－アセチルシステイン等）、脂肪酸以外の脂質（コレステロール等）、アミノ酸（アラニン、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸等）、ペプチド（グルタチオン、還元型グルタチオン等）、ヌクレオチド等（ヌクレオシド、シチジン、アデノシン５’－一リン酸、ヒポキサンチン、チミジン等）、金属塩（硝酸鉄（III）、硫酸鉄（II）、硫酸銅、硫酸亜鉛等）、無機塩類（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素等）、炭素源（グルコース、ガラクトース、フルクトース、スクロース等）、ビタミン、無機化合物（亜セレン酸）、有機化合物（パラアミノ安息香酸、エタノールアミン、コルチコステロン、プロゲステロン、リポ酸、プトレシン、ピルビン酸、乳酸、トリヨードチロニン等）、緩衝化合物（ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム等）、ｐＨ指示薬（フェノールレッド等）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0042】
豚感染ウイルスの「増殖」は、当該ウイルスが接触し、感染した不死化豚腎臓マクロファージを培養することによって行うことができる。培養温度としては、特に限定されるものではないが、通常３０～４０℃、好ましくは３７℃である。培地に接触する気体中の二酸化炭素の濃度としては、特に限定されるものではないが、通常１～１０体積％であり、好ましくは２～５体積％である。豚感染ウイルスと接触させてからの培養期間としては、特に限定されるものではないが、通常１～１０日間、好ましくは２～７日間、より好ましくは３～５日間である。
【0043】
豚感染ウイルスが増殖したかどうかは、当業者であれば公知の方法により判断することができる。かかる方法としては、例えば、後述の実施例に示すような、細胞変性効果（ＣＰＥ）を指標とするＣＰＥ試験、さらには、ＣＰＥに伴う細胞内ＡＴＰ枯渇の程度を検出する方法（例えば、プロメガ社が提供するＶｉｒａｌ ＴｏｘＧｌｏアッセイ）が挙げられる。また、豚感染ウイルスに由来する遺伝子又はその発現を検出する方法も利用することができる。ここで、遺伝子の発現は、転写レベル（ＲＮＡレベル）であっても翻訳レベル（タンパク質レベル）であってもよい。遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ）又はＲＮＡを検出する方法としては、例えば、ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ）、シーケンシング、ＤＮＡマイクロアレイ解析法、ノーザンブロッティング又はサザンブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ドットブロット、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ法、質量分析法が挙げられる。また、所謂次世代シークエンシング法においてリード数をカウントすることにより、遺伝子又はＲＮＡレベルを定量的に検出することができる。また、タンパク質を検出する方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法、抗体アレイ、イムノブロッティング、イメージングサイトメトリー、フローサイトメトリー、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降法、免疫組織化学的染色法等の抗体を用いて検出する方法（免疫学的手法）や、質量分析法が挙げられる。
【0044】
（ワクチンの製造方法）
本発明の豚感染ウイルスを含むワクチンの製造方法は、不死化豚腎臓マクロファージと、豚感染ウイルスを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程、
増殖した豚感染ウイルスを単離する工程、及び
単離した豚感染ウイルスを薬理学上許容される担体又は媒体と混合する工程
を含む、方法である。
本発明の豚感染ウイルスを含むワクチンの製造方法は、不死化豚腎臓マクロファージと、豚感染ウイルスを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程、
増殖した豚感染ウイルスを単離する工程、及び
単離した豚感染ウイルスを薬理学上許容される担体又は媒体と混合する工程
を含む、方法である。
【0045】
当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにおいて増殖する工程については上述のとおりである。増殖した豚感染ウイルスの「単離」とは、前記不死化豚腎臓マクロファージ及び／又は当該細胞の培養培地からの分離、精製及び／又は濃縮を意味する。前記ウイルスの単離方法としては、例えば、培養培地のろ過、細胞の破砕（超音波処理、低張液処理、凍結融解等）、遠心分離（超遠心法、密度勾配遠心法等）、濃縮（硫酸アンモニウム、樹脂カラム、ポリエチレングリコール塩析等）が挙げられる。
【0046】
このようにして単離された豚感染ウイルスは、そのままワクチン（所謂、生ワクチン）として用いてもよく、弱毒化生形態（所謂、生弱毒化ウイルス）で用いてよく、不活化形態でワクチンとして用いてもよい。さらに、免疫原性を有する限り、これら単離された豚感染ウイルスの一部（タンパク質、ポリペプチド、糖、糖タンパク質、脂質、核酸等）をワクチンとして用いてもよい。
【0047】
生弱毒化ウイルスは、野外から分離されたウイルスと比較して低減した毒性レベルを有するウイルスである。弱毒化ウイルスは、公知の方法、例えば、突然変異誘発物質の存在下での増殖、インビトロでの連続〈長期間）継代による培養細胞への馴化、自然生育環境から逸脱した条件下（例えば、高温条件下）での増殖に豚感染ウイルスを供することによって得ることができる。また、ゲノム編集、遺伝子改変技術等を用いて、ウイルスの特定遺伝子を欠損又は組み換えることによっても、生弱毒化ウイルスを得ることができる。
【0048】
ウイルスの不活化も、当業者であれば、公知の方法を用いて行うことができる。かかる不活化の方法としては、ホルムアルデヒド処理、ＵＶ照射、Ｘ線照射、電子線照射、ガンマ線照射、アルキル化処理、エチレン－イミン処理、チメロサール処理、β－プロピオラクトン処理、グルタルアルデヒド処理が挙げられる。
【0049】
単離した豚感染ウイルスに混合する「薬理学上許容される担体」としては、例えば、安定剤、賦形剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、結合剤が挙げられる。「薬理学上許容される媒体」としては、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液が挙げられる。これら担体及び媒体は、当業者であれば、ワクチンの剤型、使用方法に応じて、当該分野に用いられる公知の物を適宜又は組み合わせて選択して用いることができる。また、ワクチンの形態としては、特に制限はなく、例えば、懸濁液の形態であってもよく、凍結乾燥された形態であってもよい。
【0050】
ワクチン効果を増強するという観点から、更にアジュバントを混合してもよい。アジュバントとしては、例えば、アルミニウムゲルアジュバント等の無機物質、微生物若しくは微生物由来物質（ＢＣＧ、ムラミルジペプチド、百日せき菌、百日せきトキシン、コレラトキシン等）、界面活性作用物質（サポニン、デオキシコール酸等）、油性物質（鉱油、植物油、動物油等）のエマルジョン、ミョウバン等が挙げられる。
【0051】
（中和抗体の検出方法）
本発明の豚に感染するウイルスに対する中和抗体を検出する方法は、
被検豚から単離された生体試料の存在下、不死化豚腎臓マクロファージと豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにて増殖させる工程、
増殖した前記ウイルス数を検出する工程、及び
前記工程にて検出されたウイルス数が、前記生体試料非存在下、不死化豚腎臓マクロファージにて増殖したウイルス数と比して、少ない場合、前記生体試料は前記ウイルスに対する中和抗体を含有していると判定する工程を、含む方法である。
本発明の豚に感染するウイルスに対する中和抗体を検出する方法は、
被検豚から単離された生体試料の存在下、不死化豚腎臓マクロファージと豚に感染するウイルス（但し、アフリカ豚コレラウイルスを除く）とを接触させ、当該ウイルスを前記不死化豚腎臓マクロファージにて増殖させる工程、
増殖した前記ウイルス数を検出する工程、及び
前記工程にて検出されたウイルス数が、前記生体試料非存在下、不死化豚腎臓マクロファージにて増殖したウイルス数と比して、少ない場合、前記生体試料は前記ウイルスに対する中和抗体を含有していると判定する工程を、含む方法である。
【0052】
本発明にかかる「中和抗体」とは、豚感染ウイルスの感染又は増殖を抑制する抗体を意味する。また、かかる抗体は、免疫グロブリンの全てのクラス及びサブクラスを含む。また、「被検豚」については、豚感染ウイルスの感染経験を問わず、豚であれば特に制限はない。被検豚から単離された「生体試料」としては、豚由来の試料（例えば、血液（血清、血漿等）、粘液（唾液、鼻汁、乳汁、消化管分泌液等）、及びそれらから精製された抗体）が挙げられる。
【0053】
「接触」については上述のとおりである。増殖の条件に関し、培養温度としては、特に限定されるものではないが、通常３０～４０℃、好ましくは３７℃である。培地に接触する気体中の二酸化炭素の濃度としては、特に限定されるものではないが、通常１～１０体積％であり、好ましくは２～５体積％である。生体試料存在下又は非存在下における培養期間としては、特に限定されるものではないが、通常１～１０日間、好ましくは２～７日間、より好ましくは３～５日間である。また、増殖したウイルスは、上述のとおり、ＣＰＥ試験等や、豚感染ウイルスに由来する遺伝子又はその発現を検出することにより、検出することができる。このように、本発明の検出方法においては、ウイルス数自体のみならず、ウイルス数を反映する前記遺伝子（ゲノムＤＮＡ量等）又はその発現レベルを指標として、中和抗体の存在の有無を判定してもよい。
【実施例】
【0054】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0055】
（実施例１）
不死化豚腎臓マクロファージ（ＩＰＫＭ）及びマウス腎臓マクロファージ（ＫＭ１）を、ＭＧ培地（組成：ＤＭＥＭ（シグマ社製）、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％ウシ・インシュリン（シグマ社製）、０．５％メルカプトエタノール（和光株式会社製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、２００ｍｇ／Ｌ ゲンタマイシン（和光株式会社製））にて維持した。豚腎臓細胞（ＰＫ１５）を、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて、ミドリザル腎臓細胞（Ｍａｒｃ１４５）を、５％ＦＢＳを含むＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて、各々維持した。豚肺胞マクロファージ（３Ｄ４／３１）を、シグマ社製のＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ グルタミン、４．５ｇ／Ｌ グルコース、１．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸 含有）にて維持した。マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて維持した。
不死化豚腎臓マクロファージ（ＩＰＫＭ）及びマウス腎臓マクロファージ（ＫＭ１）を、ＭＧ培地（組成：ＤＭＥＭ（シグマ社製）、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）、０．１％ウシ・インシュリン（シグマ社製）、０．５％メルカプトエタノール（和光株式会社製）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、２００ｍｇ／Ｌ ゲンタマイシン（和光株式会社製））にて維持した。豚腎臓細胞（ＰＫ１５）を、１０％ＦＢＳを含むＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて、ミドリザル腎臓細胞（Ｍａｒｃ１４５）を、５％ＦＢＳを含むＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて、各々維持した。豚肺胞マクロファージ（３Ｄ４／３１）を、シグマ社製のＲＰＭＩ１６４０（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ グルタミン、４．５ｇ／Ｌ グルコース、１．５ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸 含有）にて維持した。マウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にて維持した。
【0056】
そして、ＩＰＫＭ、ＫＭ１及びＲＡＷ２６４．７は、各々２ｘ１０５細胞／ウェルになるよう、Ｍａｒｃ１４５、ＰＫ１５及び３Ｄ４／３１は、各々２ｘ１０４細胞／ウェルになるよう、８ウェルチャンバースライドに播種して３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で培養した。
【0057】
播種翌日に、農場由来でクラスターの異なる、ＰＲＲＳＶ野外株１（クラスターII）、ＰＲＲＳＶ野外株２（クラスターIII）、ＰＲＲＳＶ野外株３（クラスターIV）、ＰＲＲＳＶ野外株４（クラスターIV）及びＰＲＲＳＶ野外株５（クラスターIV）のウイルス液１０μＬを各々前記細胞に接種した。また、ワクチン株としてベーリンガーインゲルハイム社のインゲルバック（クラスターII）及びゾエティス社のフォステラ（クラスターI）の生弱毒化ワクチンウイルス液１０μＬを各々前記細胞に接種した。そして、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で培養した。
【0058】
ウイルス接種から２０～２４時間後に、前記ウイルスを感染させた細胞を、８０％アセトン（２０％ リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で固定した。次いで、ＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００含有ＰＢＳ）とＰＢＳで洗浄し、イムノブロック（ＤＳファーマ社製）でブロッキングした後、一次抗体として、抗ＰＲＲＳウイルスＭタンパク質抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）を用い、二次抗体として、ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８標識ヤギ由来抗ウサギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用い、前記細胞を免疫染色した。そして、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ社製）で細胞を撮影し、免疫蛍光染色により、ウイルス感染増殖が起きた細胞を緑色蛍光陽性細胞として検出した。得られた結果を図１に示す。
【0059】
図１に示した結果から明らかなように、各種細胞と複数のＰＲＲＳＶ株の組み合わせによる感染試験のうち、全ての株について感染を示す陽性細胞が検出されたのはＩＰＫＭのみであった。
【0060】
一方、豚肺胞マクロファージとして米国の細胞バンクに登録されている３Ｄ４／３１では全ての株に対して陽性細胞が検出されなかった。Ｈ．Ｍ．Ｗｅｉｎｇａｒｔｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０４：２０３－２１６（２００２）においても同様の報告がされており、自然環境において、ＰＲＲＳＶは豚肺胞マクロファージへの細胞指向性を示すものの、３Ｄ４／３１にはＰＲＲＳＶは感染しないことが確認された。
【0061】
また、豚腎臓細胞（ＰＫ１５）や２つのマウスマクロファージ〈ＫＭ１、ＲＡＷ２６４．７）においても陽性細胞は検出されなかった。
【0062】
さらに図には示していないが、全てのＰＲＲＳＶ株が、不死化された豚血液マクロファージに感染したが、同じ細胞数に同じウイルス量を感染させたにも関わらず陽性細胞数はＩＰＫＭよりも少なかった。
【0063】
Ｍａｒｃ１４５においては、ワクチン株インゲルバックと一部の野外株においては陽性細胞が検出されたが、前述のとおり、使用した野外株全てにおいて最も良好な感染増殖を示したのはＩＰＫＭであった。また、ＰＲＲＳＶのクラスターを問わず、ＩＰＫＭで増殖することが明らかとなり、ＩＰＫＭにおいて、ＰＲＲＳＶの分類に依らず、感染増殖が可能となることが示唆された。
【0064】
（実施例２）
ＩＰＫＭ又はＭａｒｃ１４５を、２４ウェルプレートに、３ｘ１０５細胞／ウェル／２ｍＬになるよう各々播種し、翌日にインゲルバック（生ワクチンウイルス液 ２００μＬ）、野外株２（ウイルス液 １００μＬ）を接種し、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で１時間静置した。
ＩＰＫＭ又はＭａｒｃ１４５を、２４ウェルプレートに、３ｘ１０５細胞／ウェル／２ｍＬになるよう各々播種し、翌日にインゲルバック（生ワクチンウイルス液 ２００μＬ）、野外株２（ウイルス液 １００μＬ）を接種し、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で１時間静置した。
【0065】
ウイルス接種から１時間後に細胞表面を無血清培地で１回洗い、２ｍＬのＭＥＭ（１％ＦＢＳ）を加えて３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で培養した。インゲルバックは２４時間後に、野外株２は２４時間後に、各細胞を２００μＬの哺乳類タンパク質抽出バッファー（ＧＥヘルスケア社製）で溶解し、遠心して不溶物を除去した。
【0066】
遠心後の上清に１／４量のＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを添加してボイルし、Ｍａｒｃ１４５については５μＬ、ＩＰＫＭについては２５μＬを各々、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。泳動後、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜（製品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ、ＧＥヘルスケア社製）に転写した。転写した膜をブロッキング（製品名：ブロッキングワン、ナカライテスク社製）し、一次抗体として、抗ＰＲＲＳウイルスＮタンパク質抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ社製）を用い、二次抗体として、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用い、反応させた。抗体を反応させた膜を化学発光試薬（製品名：ＥＣＬ ｓｅｌｅｃｔ、ＧＥヘルスケア社製）で処理し、化学発光スキャナー（製品名：Ｃ－ＤｉＧｉｔ ｂｌｏｔ ｓｃａｎｎｅｒ、ＬＩ－ＣＯＲバイオサイエンス社製）を用い、ウェル中の全細胞を溶かした溶液中のウイルスタンパク質を検出した。得られた結果を図２に示す。なお、図２に示すとおり、いずれの細胞とウイルスの組み合わせも３連で実施し、検出されたバンドの濃度はほぼ均一であることから結果の信頼性は高い。
【0067】
図２に示した結果から明らかなように、Ｍａｒｃ１４５の細胞溶解液からは野外株２のＮタンパク質を検出できなかった。一方、インゲルバック感染後２４時間のＭａｒｃ１４５において、検出可能なレベルのＮタンパク質産生が認められた。インゲルバックは、Ｍａｒｃ１４５の親株であるＭＡ１０４で増殖させたウイルスであるため、インゲルバックがＭａｒｃ１４５で良好な増殖を示すのは当然の結果といえる。
【0068】
一方、上記免疫染色では、検出感度が高いため、感染が認められていたものの（図１参照）、ＩＰＫＭの細胞溶解液からはインゲルバック由来のＮタンパク質を検出できなかった。しかしながら、播種した細胞数や感染させたウイルス量が同じであるにも関わらず、驚くべきことに、インゲルバック感染例とは逆に、野外株２はウイルス接種から４８時間後にＩＰＫＭで検出可能なレベルのＮタンパク質産生が認められた。
【0069】
これらのことから、ＩＰＫＭはＰＲＲＳＶ野外株の増殖効率が良いことが明らかになった。
【0070】
（実施例３）
ＩＰＫＭ又はＭａｒｃ１４５を、６ウェルプレートに、３ｘ１０５細胞／ウェル／２ｍＬになるように播種し、翌日に、インゲルバック（生ワクチンウイルス液 １００μＬ）、野外株３（ウイルス液 １００μＬ）を接種して３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で１時間静置した。ウイルス接種から１時間後に細胞表面をＰＢＳで３回洗い、２．２ｍＬの１％ＭＥＭを加え、直ちに０．２ｍＬの培地を回収した。感染後１４、１６、２０、２４、３８．５時間に０．２ｍＬの培地を加えて良く混合した後、０．２ｍＬの培養上清を回収した。
ＩＰＫＭ又はＭａｒｃ１４５を、６ウェルプレートに、３ｘ１０５細胞／ウェル／２ｍＬになるように播種し、翌日に、インゲルバック（生ワクチンウイルス液 １００μＬ）、野外株３（ウイルス液 １００μＬ）を接種して３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で１時間静置した。ウイルス接種から１時間後に細胞表面をＰＢＳで３回洗い、２．２ｍＬの１％ＭＥＭを加え、直ちに０．２ｍＬの培地を回収した。感染後１４、１６、２０、２４、３８．５時間に０．２ｍＬの培地を加えて良く混合した後、０．２ｍＬの培養上清を回収した。
【0071】
回収した培地から、核酸精製キット（製品名：Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ウイルストータル核酸精製キット、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて核酸を抽出し、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とランダムプライマー及びｄＴプライマーとを用い、逆転写反応を行った。得られた逆転写産物を鋳型とし、ＳｉｐｏｓらＶｉｒａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６；３３５－３４６（２００３）及びＥｓｃｈｂａｕｍｅｒらＣａｎａｄｉａｎ ｊｏｕｎａｌ ｏｆ ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ７９；１７０－１７９（２０１５）に記載のプライマーを用い、ＳＹＢＲ（登録商標）プレミックスＥｘＴａｑII（Ｔａｋａｒａ社製）の反応液をマニュアルに従って調製し、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ ＷｅｌｌリアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用い、ＰＲＲＳＶ遺伝子の検出を行った。すなわち、リアルタイムＰＣＲで培養上清中のＰＲＲＳウイルス遺伝子を検出することにより、培地中に放出された子孫ウイルス量をモニターした。得られた結果を図３及び４に示す。
【0072】
図３及び４に示すとおり、ＩＰＫＭ及びＭａｒｃ１４５共に、感染直後に回収した培地に比べ、時間の経過と共に培養上清中のウイルス遺伝子量の増加が認められた。
【0073】
インゲルバックを感染させたＭａｒｃ１４５の培養上清中には、子孫ウイルス由来の遺伝子が経時的に増加していた。上述のとおり、インゲルバックはＭａｒｃ１４５の親株で増殖させたウイルスであるため、インゲルバックがＭａｒｃ１４５で良好な増殖を示すのは当然であるが、驚くべきことに、ＩＰＫＭにおいて、そのＭａｒｃ１４５同様のインゲルバック増殖が可能であることが明らかとなった。
【0074】
一方、野外株３はＭａｒｃ１４５においてほぼ増殖しなかった。しかしながら、ＩＰＫＭにおいては、野外株３の経時的な増殖が認められた。
【0075】
これらのことから、ＩＰＫＭでは野外株の子孫ウイルスが効率良く増殖できることが明らかとなった。
【0076】
（実施例４）
ＩＰＫＭ又はＭａｒｃ１４５を、９６ウェルプレートに、８ｘ１０４細胞／ウェル／０．１ｍＬになるよう播種し、翌日に常法の分離操作を行った３２株のウイルス培養上清を１０μＬ接種して３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で４８時間静置した。なお、３２株の内訳は、肺乳剤から分離した株が６株、血清から分離した株が２４株、ワクチン株インゲルバックが１株、日本標準株が１株となる。ウイルス接種から４８時間後に目視で細胞の形態の変化（細胞変性効果）の有無を判定した。得られた結果を表１に示す。なお、表１において、細胞変性効果が観察された株を＋（プラス）とし、変化が見られなかった株を―（マイナス）としてカウントした。
ＩＰＫＭ又はＭａｒｃ１４５を、９６ウェルプレートに、８ｘ１０４細胞／ウェル／０．１ｍＬになるよう播種し、翌日に常法の分離操作を行った３２株のウイルス培養上清を１０μＬ接種して３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で４８時間静置した。なお、３２株の内訳は、肺乳剤から分離した株が６株、血清から分離した株が２４株、ワクチン株インゲルバックが１株、日本標準株が１株となる。ウイルス接種から４８時間後に目視で細胞の形態の変化（細胞変性効果）の有無を判定した。得られた結果を表１に示す。なお、表１において、細胞変性効果が観察された株を＋（プラス）とし、変化が見られなかった株を―（マイナス）としてカウントした。
【0077】
【表1】
【0078】
表１に示すとおり、ワクチン株インゲルバックを含む３２株の感染に対し、ＩＰＫＭは１１株で細胞変性効果が見られた。一方、Ｍａｒｃ１４５への感染で細胞変性効果を示したのは６株であった。より具体的には、ＩＰＫＭとＭａｒｃ１４５とにおいて、共通して細胞変性効果が示された株は５株（血清から分離した４株、肺乳剤から分離した１株）あり、ＩＰＫＭのみにおいて、細胞変性効果が示された株は６株（血清から分離した５株、肺乳剤から分離した１株）あり、Ｍａｒｃ１４５のみにおいて、細胞変性効果が示された株はワクチン株の１株のみであった。したがって、ＩＰＫＭは、Ｍａｒｃ１４５よりも約２倍の株数で細胞変性効果を示したことになり、ＩＰＫＭの野外株分離増殖効率の高さが示された。
【0079】
（実施例５）
ＩＰＫＭ又はＭａｒｃ１４５を、６ウェルプレートに、３ｘ１０５細胞／ウェル／２ｍＬになるよう播種した。その翌日に、農場由来でクラスターの異なる、野外株１（クラスターII）、野外株２（クラスターIII）、野外株３（クラスターIV）及び野外株４（クラスターIV）のウイルス液１００μＬを各々前記細胞に接種した。また、ワクチン株としてベーリンガーインゲルハイム社のインゲルバック（クラスターII）及びゾエティス社のフォステラ（クラスターI）の生ワクチンウイルス液１００μＬを各々前記細胞に接種した。そして、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で１時間静置した。
ＩＰＫＭ又はＭａｒｃ１４５を、６ウェルプレートに、３ｘ１０５細胞／ウェル／２ｍＬになるよう播種した。その翌日に、農場由来でクラスターの異なる、野外株１（クラスターII）、野外株２（クラスターIII）、野外株３（クラスターIV）及び野外株４（クラスターIV）のウイルス液１００μＬを各々前記細胞に接種した。また、ワクチン株としてベーリンガーインゲルハイム社のインゲルバック（クラスターII）及びゾエティス社のフォステラ（クラスターI）の生ワクチンウイルス液１００μＬを各々前記細胞に接種した。そして、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で１時間静置した。
【0080】
ウイルス接種から１時間後に、細胞表面を無血清培地で１回洗い、２ｍＬのＭＥＭ（１％ＦＢＳ含有）を加えて３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で培養した。感染から３～４日後にそれぞれのウェルの培地を回収し、そのうちの１００μＬを、回収元と接種先の細胞とウイルスの組み合わせが対応するように、前日に６ウェルプレートに播種したＩＰＫＭ又はＭａｒｃ１４５に接種した。
【0081】
回収した培地を接種してから１時間静置後に、細胞表面を無血清培地で１回洗い、ＭＥＭ（１％ＦＢＳ含有）に培地を置換し、３～４日間、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で培養した。そして、当該培養を１０回まで繰り返した。
【0082】
そして、各継代の際に回収した培地から、核酸精製キット（製品名：Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ウイルストータル核酸精製キット、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて核酸を抽出し、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とランダムプライマー及びｄＴプライマーとを用い、逆転写反応を行った。得られた逆転写産物を鋳型とし、ＥｘＴａｑII（Ｔａｋａｒａ社製）の反応液をマニュアルに従って調製し、Ｔ１００サーマルサイクラー（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用い、ＰＲＲＳＶ遺伝子の増幅を行った。
【0083】
得られたＰＣＲ産物を、１ｘＴｒｉｓ－ｂｏｒａｔｅ－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）バッファー（８９ｍＭ Ｔｒｉｓ、８９ｍＭ ホウ酸及び２ｍＭ ＥＤＴＡ含有緩衝液）中の１％アガロースゲルにおける電気泳動に供し、ゲルレッド（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）にて染色した。次いで、トランスイルミネーター下でＰＣＲ産物由来のバンドを可視化し、目的サイズのＰＣＲ産物の有無を判定した。
【0084】
なお、６株のＰＲＲＳＶそれぞれについて２つのプライマーセットでＰＣＲによる増幅の有無を検出した。そして、１２種類のＰＣＲ産物中、増幅が確認された産物数の割合（百分率）を算出した。得られた結果を表２に示す。
【0085】
【表2】
【0086】
表２に示した結果から明らかなように、ＩＰＫＭに接種したウイルス株全てにおいて、全ての継代段階で２種類のＰＣＲ産物が検出された。一方、ＩＰＫＭと同様に接種したＭａｒｃ１４５では、全ての継代段階でＰＣＲ産物が検出されたのはインゲルバックのみであった。また、Ｍａｒｃ１４５において５継代目で検出された２つの野外株由来のＰＣＲ産物について塩基配列を解読したところ、図表には示さないが、ストップコドンが出現する変異が検出された。
【0087】
（実施例６）
ＩＰＫＭを、６ウェルプレートに、３ｘ１０５細胞／ウェル／２ｍＬになるよう、播種した。翌日に豚流行性下痢ウイルス（日生研ＰＥＤ生ワクチン、日生研）、豚伝染性胃腸炎ウイルス（豚伝染性胃腸炎生ウイルス乾燥予防液、化血研）、豚パルボウイルス（“京都微研”豚パルボ生ワクチン、京都微研）、日本脳炎ウイルス（“京都微研”日本脳炎ワクチン、京都微研）、オーエスキーウイルス（ポーシリス Ｂｅｇｏｎｉａ ＤＦ・５０、インターベット）の生ワクチンウイルス液又は豚サーコウイルス２型のウイルス液を各々１００μＬ接種し、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で２時間静置した。
ＩＰＫＭを、６ウェルプレートに、３ｘ１０５細胞／ウェル／２ｍＬになるよう、播種した。翌日に豚流行性下痢ウイルス（日生研ＰＥＤ生ワクチン、日生研）、豚伝染性胃腸炎ウイルス（豚伝染性胃腸炎生ウイルス乾燥予防液、化血研）、豚パルボウイルス（“京都微研”豚パルボ生ワクチン、京都微研）、日本脳炎ウイルス（“京都微研”日本脳炎ワクチン、京都微研）、オーエスキーウイルス（ポーシリス Ｂｅｇｏｎｉａ ＤＦ・５０、インターベット）の生ワクチンウイルス液又は豚サーコウイルス２型のウイルス液を各々１００μＬ接種し、３７℃、５％ＣＯ２、飽和水蒸気下で２時間静置した。
【0088】
各ウイルス接種から２時間後に、細胞表面を無血清培地で１回洗い、２ｍＬのＭＥＭ（１％ＦＢＳ含有）を加えた。そして、感染後８時間、４８時間において、０．２ｍＬずつ培地を回収した。
【0089】
感染後４８時間においては、細胞を哺乳類タンパク質抽出バッファー（ＧＥヘルスケア社製）で溶解した。次いで、得られた細胞溶解液と、回収した培地から、核酸精製キット（製品名：Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ウイルストータル核酸精製キット、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて核酸を抽出し、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とランダムプライマー及びｄＴプライマーとを用い、逆転写反応を行った。得られた逆転写産物を鋳型とし、各ウイルスに対応したプライマーセットを用い、ＳＹＢＲ（登録商標）プレミックスＥｘＴａｑII（Ｔａｋａｒａ社製）の反応液をマニュアルに従って調製し、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ ＷｅｌｌリアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ－ＲＡＤ社製）を用い、各ウイルスの遺伝子検出を行った。得られた結果を図５～１０に示す。
【0090】
なお、豚流行性下痢ウイルス及び豚伝染性胃腸炎ウイルスの遺伝子は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４６（１－２）１７２－１７７に記載のプライマーセットを用いて増幅した。豚パルボウイルスの遺伝子は、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２００３） Ｊ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ６５（６）：７４１－７４４に記載のプライマーセットを用いて増幅した。日本脳炎ウイルスの遺伝子は、病原体検出マニュアル（国立感染症研究所）６３６ページに記載のプライマーセットを用いて増幅した。オーエスキーウイルスの遺伝子は、Ｂｅｌａｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ：１０８，２７９－２８６に記載のプライマーセットを用いて増幅した。また、豚サーコウイルス２型の遺伝子は、Ｔａｋａｈａｇｉ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２００８） Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ：７０，６０３－６０６に記載のプライマーセットを用いて増幅した。
【0091】
図５～１０に示した結果から明らかなように、いずれの生ワクチンウイルスにおいても、接種後８時間で回収した培養上清中のウイルス遺伝子よりも、接種後４８時間のそれのＣｔ値は小さくなっており、ウイルスの増加が認められた。また、ウイルス液接種後２時間で細胞表面を洗っているにも関わらず、培養上清よりも多量のウイルスが細胞溶解液に検出されたことからも、全てのウイルスがＩＰＫＭに感染して増殖できることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0092】
以上説明したように、本発明によれば、豚感染ウイルスに対して高い感染感受性を有する不死化豚腎臓マクロファージを用いることにより、様々な豚感染ウイルス株を増殖させることが可能となり、当該ウイルスに対するワクチンの製造、開発が可能となる。また、不死化豚腎臓マクロファージを用いることにより、豚感染ウイルスに対する中和抗体の存在の有無を判定することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
