特許 7369393 非破壊的な細胞解析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-18

(45)【発行日】2023-10-26

(54)【発明の名称】非破壊的な細胞解析方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20231019BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20231019BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20231019BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20231019BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20231019BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20231019BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 V

G01N21/64 G

G01N21/64 F

G01N33/48 M

G01N37/00 102

G01N33/543 595

C12Q1/02

【請求項の数】 2

(21)【出願番号】P 2019024097

(22)【出願日】2019-02-14

(65)【公開番号】P2020134179

(43)【公開日】2020-08-31

【審査請求日】2021-11-11

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「再生医療の産業化に向けた評価基盤技術開発事業、再生医療等の産業化に向けた評価手法等の開発、再生医療等製品（脂肪細胞医薬品）の糖鎖プロファイリングを用いた品質管理システムの構築」の委託事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】510136312

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立成育医療研究センター

(73)【特許権者】

【識別番号】000115991

【氏名又は名称】ロート製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100108947

【弁理士】

【氏名又は名称】涌井 謙一

(74)【代理人】

【識別番号】100117086

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 典弘

(74)【代理人】

【識別番号】100124383

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 一永

(74)【代理人】

【識別番号】100173392

【弁理士】

【氏名又は名称】工藤 貴宏

(74)【代理人】

【識別番号】100189290

【弁理士】

【氏名又は名称】三井 直人

(72)【発明者】

【氏名】梅澤 明弘

(72)【発明者】

【氏名】岡村 浩司

(72)【発明者】

【氏名】柴田 眞侑

(72)【発明者】

【氏名】野中 秀紀

(72)【発明者】

【氏名】山田 雅雄

(72)【発明者】

【氏名】横田 京子

【審査官】大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１７－１８４７１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１２／０２８２６２８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２００９－１４８２３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】SHIMODA, A. et al.，Glycan profiling analysis using evanescent-field fluorescence-assisted lectin array: Importance of sugar recognition for cellular uptake of exosomes from mesenchymal stem cells，Biochemical and Biophysical Research Communications，2017年，Vol.491，pp.701-707

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８

Ｇ０１Ｎ ２１／６４

Ｇ０１Ｎ ３７／００

Ｃ１２Ｑ １／０２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

糖鎖結合性タンパク質を固定化したマイクロアレイを用いて、培地中にヒト細胞から分泌される糖タンパク質からその糖鎖プロファイルをエバネッセント波蛍光励起装置を用いて取得し、解析することで９０％を超える認識精度で間葉系幹細胞であることを識別する細胞種の判定を行う方法。

【請求項2】

前記培地が無血清培地である請求項１記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞の状態を非破壊的に検査する検査装置と解析方法に関する。本発明の検査、解析は、分化細胞、幹細胞など多能性細胞等の細胞種の分類及び解析に関する。また、本発明の検査、解析はする細胞の状態としては、老化と活性度、多能性、分化指向性、有効性などがある。

【背景技術】

【0002】

細胞の状態を非破壊的に検査する検査装置、解析方法に関しては従来から種々の検査装置、解析方法が知られている。

【0003】

特許文献１には、細胞や生体組織の遺伝子発現態様や、抗原抗体反応を解析する試料チップ解析装置及び解析方法に関して、蛍光物質の励起光や外乱光に影響されることなく試料に結合された被検試料に標識された蛍光物質からの発光を確実、かつ高精度に検出して被検試料の解析作業を効率化できる試料チップ解析装置及び解析方法が記載されている。

【0004】

特許文献２には、レクチンアレイの実用化に道を開く、タンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法が提案されている。レクチン、糖結合ドメインを有する酵素タンパク質、糖鎖に親和性を有するサイトカイン、または糖鎖に相互作用を示す抗体など、糖鎖に相互作用を示すタンパク質を固定化した基板に蛍光標識した被検糖鎖または被検複合糖質を接触させ、前記基板を洗浄せず、励起光（エバネッセント波）を作用させ、励起される蛍光の強度を測定することで、タンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法が記載されている。

【0005】

特許文献３には、ＩｇＭクラスに属する糖鎖認識抗体やレクチンなどの糖鎖結合性タンパク質を複数種配置固定した導光性材料からなる基板と、該基板の側部端面に光を導入し、該基板表面にエバネッセント波を発生させて蛍光標識を励起する手段と、該手段により生じた蛍光の強度を上記糖鎖結合性タンパク質の配置位置毎に測定する蛍光強度測定手段とを有する、糖鎖あるいは複合糖質の解析装置が記載されている。

【0006】

一方、品質管理項目としての間葉系幹細胞の必要最低評価条件としては、次の３項目が規定されている（非特許文献１）。
１．プラスティックへ接着し培養可能であること
２．細胞表面マーカーの発現について、CD73, CD90, CD105が陽性、CD45, CD34, CD14 or CD11b, CD79a or CD19, HLA-DRが陰性であること
３．骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化能を有すること

【0007】

しかしながら、分化能試験は試験実施に非常に時間を要する。また、細胞表面マーカーの試験はフローサイトメーターで実施ができるため比較的容易であるが、これらのマーカーの特異性は高いとは言えず、識別可能な細胞に限界があることが指摘されている。具体的には、間葉系幹細胞と繊維芽細胞の判別は困難を極める（非特許文献２）。

【0008】

また、国際細胞治療学会が推奨する間葉系幹細胞製剤の評価方法には、免疫調整機能の評価があり、IFNγ、TNFαらのサイトカイン刺激と遺伝子発現解析が推奨されている（非特許文献３）。

【0009】

これは、間葉系幹細胞の抗炎症作用は、サイトカイン刺激によりどのような因子がどの位誘導されるかである程度予測可能とされており、間葉系幹細胞を用いた再生医療等製品において、その有効性に結び付くものと考えられているからである（非特許文献４）。

【0010】

免疫調整機能評価においても、サイトカイン刺激及び細胞のさらなる培養行う事が必要であるため試験時間を要し、試験のコスト増を伴うことが課題として指摘されている。なお、本評価は核酸抽出が必要であるため、細胞の破壊を行うこととなる。培養上清からエクソソームを回収して糖鎖プロファイリングを行う方法が知られているが（非特許文献５）、エクソソームの回収には超遠心を用いた濃縮作業が必要であり、簡便性高い方法とは言えない。

【0011】

従って、間葉系幹細胞を用いた再生医療等製品の開発において、その「品質管理」方法には、時間や費用等の面で改善の余地が残されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【文献】特開２００３－１７２７０１公報

【文献】国際公開第２００５／０６４３３３号公報

【文献】特開２００７－３３５７号公報

【非特許文献】

【0013】

【文献】M. Dominici, K. Le Blanc, I. Mueller, I. Slaper-Cortenbach, F. Marini, D. Krause, R. Deans, A. Keating, Dj. Prockop, E. Horwitz, Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement, Cytotherapy, 2006; 8(4), pp315-317

【文献】E. Alt, Y. Yan, S. Gehmert, YH Song, A. Altman, S Gehmert, D. Vykoukai, X. Bai, Fibroblasts share mesenchymal phenotypes with stem cells, but lack their differentiation and colony-forming potential, Biol. Cell., 2011 Apr;103(4)pp.198-208

【文献】Cytotherapy, 2016 February; 18(2):151-159. doi:10.1016/j/jcyt.2015.11.008

【文献】Galipeau et al., 2016 Cytotherapy； ＆ Chinnadurai et al., 2018 CellReports

【文献】A. Shimoda et al., BBRC 491 (2017), pp.701-707

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明は、分化細胞、間葉系幹細胞など多能性細胞等の細胞種等を非破壊的に検査及び解析する方法を提供することを目的とする。また、本発明は細胞の状態、例えば、老化、活性度、多能性、分化指向性、有効性等を非破壊的に検査及び解析する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0015】

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、糖鎖結合性タンパク質を固定化したマイクロアレイを用いて、細胞から分泌される機能因子からその糖鎖プロファイルを取得して解析することにより、細胞を破壊することなく細胞種もしくは細胞状態を解析することができることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成されたものである。すなわち、上記課題を解決するためになされた発明は、以下の通りである。

【0016】

［１］
糖鎖結合性タンパク質を固定化したマイクロアレイを用いて、培地中に細胞から分泌される機能因子からその糖鎖プロファイルを取得し、解析する方法。

【0017】

［２］
前記細胞がヒト細胞である［１］の解析方法。

【0018】

［３］
糖鎖プロファイルを取得する工程がエバネッセント波蛍光励起装置を用いて行われる［１］又は［２］の解析方法。

【0019】

［４］
前記培地が無血清培地である［１］乃至［３］のいずれかの解析方法。

【0020】

［５］
前記機能因子が糖タンパク質である［１］乃至［４］のいずれかの解析方法。

【発明の効果】

【0021】

本発明によれば、分化細胞、間葉系幹細胞など多能性細胞等の細胞種を非破壊的に検査及び解析方法を提供することができる。また、本発明は細胞の状態、例えば、老化、活性度、多能性、分化指向性、有効性等を非破壊的に検査及び解析方法を提供することができる。本発明の検査及び解析方法では、一切の前処理を行なわず検査及び解析することができるため、細胞を用いた再生医療等製品の開発において、品質管理にかかる時間の短縮や費用の軽減をすることができる。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】糖鎖プロファイリングの比較図

【図2】使用した深層学習の入力層から出力層への流れを説明する図

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下に、本発明の解析方法について詳細に説明する。

【0024】

本発明の検査及び解析方法は、細胞培養の培地中に分泌される糖タンパク質のレクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリングを用いることで、細胞の持つ特徴を非破壊的に解析するものである。

【0025】

「細胞の持つ特徴を非破壊的に解析する」とは、細胞を破壊することなく細胞種もしくは細胞状態を解析するものである。

【0026】

本発明の検査及び解析方法によれば、検査対象となる細胞を用いることなく、本来培地交換等で廃棄する培地を用いることで、低コストで細胞の持つ特徴を解析することができる。

【0027】

本発明の検査及び解析方法では、細胞の状態を、糖鎖結合性タンパク質を固定化したマイクロアレイを用いて、培地中に分泌される機能因子からその糖鎖プロファイルを取得し、非破壊的に解析する。

【0028】

本発明の解析方法において、糖鎖プロファイルを取得する工程は、エバネッセント波蛍光励起装置を用いて行うことができる。

【0029】

エバネッセント波蛍光励起装置とは、糖鎖結合性タンパク質が固定化されたマイクロアレイの表面にエバネッセント波（近接場）を発生させ、解析対象になっている前記細胞から前記培地中に分泌される機能因子と、前記糖鎖結合性タンパク質との相互作用を、前記マイクロアレイ表面の洗浄や乾燥操作を行わず、非破壊で検出できる装置である。

【0030】

エバネッセント波蛍光励起装置としては、株式会社グライコテクニカのGlycoStation ReaderやGlycoLite等が例示される。

【0031】

本発明において、検査及び解析を行う細胞は、本発明の効果が得られる限り特に限定されるものではないが、例えば、ヒト細胞が挙げられる。本発明において、検査及び解析を行う細胞種としては、本発明の効果が得られる限り特に限定されるものではないが、例えば、分化細胞、間葉系幹細胞などの多能性細胞が挙げられる。

【0032】

本発明において、検査及び解析する細胞の状態としては、本発明の効果が得られる限り特に限定されるものではないが、例えば、老化と活性度、多能性、分化指向性、有効性が挙げられる。

【0033】

本発明で用いる培地は細胞を培養できる培地であれば、特に限定されないが、例えば、無血清培地が挙げられる。

【0034】

本発明で用いる機能因子は、本発明の効果が得られる限り特に限定されるものではないが、糖タンパク質が挙げられる。

【0035】

無血清培地とは、血清を含まない動物細胞培養用の培地であり、動物細胞を人工的に培養する場合に、必要な増殖因子等の成分を補うため、培地中に５～２０％程度の血清を添加した培地に対比して、血清を添加せずに同様な効果を実現したものである。

【0036】

本発明において、解析には機械学習の中でも特に教師あり学習を使用することができる。「教師あり学習」とは、ソフトウェアに目的の結果を導き出す手順をハードコーディングすることなく、データから反復的に学習し、そこに潜むパターンから独自の手順を見つけ出す学習方法である。

【0037】

本発明の解析方法の機械学習として、深層学習（ディープラーニング）を使用することができる。「深層学習」とは、神経細胞間の情報伝達を参考にしたニューラルネットワークを何層も重ねることにより、データの学習をへて分析を行う教師あり学習の一手法である。

【0038】

本発明の検査及び解析方法には糖鎖との弱い結合を漏れなく検出するためのエバネッセント波蛍光励起スキャナー、試料チップ解析装置、糖鎖プロファイルを取得するためのエバネッセント波蛍光励起装置を用いることができる。

【0039】

本発明の検査及び解析方法には特許文献１、２、３に記載されたタンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法を用いることができる。本発明の検査及び解析方法には特許文献１、２、３に記載された糖鎖あるいは複合糖質の解析装置を用いることができる。本発明の検査及び解析方法にはその他の従来技術を使用することができる。

【0040】

以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は上述した実施の形態、以下の実施例に限られるものではなく、特許請求の範囲の記載から把握される技術的範囲において種々に変更可能である。

【実施例】

【0041】

ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（以下「AD」と言う）、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（以下「UC」と言う）、ヒト肺線維芽細胞（以下「Lung」と言う）、ヒト肝由来線維芽細胞（以下「Liver」と言う）、ヒト動脈由来細胞（以下「Aorta」と言う）を間葉系幹細胞用無血清培地（ロート製薬製）で培養した。

【0042】

培養後２日及び４日において20μLの培養上清を回収し、下記のプロトコルに従って試料の前処理を行った。

【0043】

１．各試料20μLとCy3 Mono-Reactive dye 100μg labeling（GE Healthcare, PA23001を100μg labelingずつ子分けたもの）を混合し、室温、暗所で1時間反応させた。

【0044】

２．脱塩カラム（Zeba（商標）Spin Desalting Columns, 7K MWCO (Thermo SCIENTIFIC, 89882)を1,500×g、1分間、4℃で遠心した。

【0045】

３．脱塩カラムにTBS=300μLをアプライし、1,500×g、1分間、4℃で遠心する (カラム洗浄) 。この工程を2回繰り返した。

【0046】

４．脱塩カラムに各試料全量とT= 25μLをアプライして、1,500×g、2分間、4℃で遠心し、未反応のCy3を除いた。

【0047】

５．各試料にProbing Solution 450μLをアプライし、500μL/tubeにメスアップした。

【0048】

６．LecChip（登録商標）（GlycoTechnica製レクチンマイクロアレイ）をProbing Solution(100μL/ウェル)（GlycoTechnica製 LecChip用プロービング液）で3回洗浄後、各試料(100μL/ウェル)をアプライし、LecChip（登録商標）を20℃で、17時間以上反応させた。

【0049】

７．試料を反応させたままの液相状態のLecChip（登録商標）をGlycoStation（登録商標）Reader 1200 （GlycoTechnica製 エバネッセント波蛍光励起スキャナー）で測定した（測定条件,積算回数: 4回、露光時間: 133msec、カメラゲイン: 75, 85, 95, 105, 115, 125）。

【0050】

８．GlycoStaion（登録商標）Tools Pro Suite 1.5 （GlycoTechnica製 糖鎖解析ソフトウェア）による数値化、データ統合（ゲイン統合） を行った。

【0051】

９．データ統合（ゲイン統合）した数値データについて、すべての数値化データをMicrosoft（登録商標） Excelのシートにエキスポートした。なお、表計算ソフトウェアのスプレッドシートにエキスポートしてもよい。

【0052】

以上のように前処理を行った試料について、４５種類のレクチンが搭載されたレクチンマイクロアレイ（LecChip（登録商標））を用いて糖鎖プロファイラー（GlycoStation（登録商標）Reader 1200）でスキャンして得られる蛍光強度（糖鎖プロファイル）に基づく糖鎖プロファイリングを行った。その結果の比較図を図１に示した。図１中、Beforeは、細胞を培養していない培地であり、Afterは、細胞培養後２日の培地中の糖鎖プロファイリングを示した。

【0053】

細胞を培養していない培地の上清からは、STL、 UDA以外の信号は検出されず、細胞培養後２日の培地の上清からは数多くのレクチンの信号が検出された。また、図としては示していないが、細胞培養後４日の培地の上清からは、細胞培養後２日の培地の上清に比べて検出されるレクチンの信号が増加しており、細胞培養後に見られる数多くのレクチンからの信号は、培地中に細胞から分泌された因子であることが確認された。

【0054】

図１に示されるような４５種類のレクチンが搭載されたレクチンマイクロアレイ（LecChip（登録商標））を用いて糖鎖プロファイラー（GlycoStation（登録商標）Reader 1200）でスキャンして得られる蛍光強度（糖鎖プロファイル）から、教師なし学習および教師あり学習の両方に共通して用いるための４５要素からなる特徴ベクトルを作成した。

【0055】

蛍光強度に１．０を足して常用対数を取ることで、小さな蛍光強度の差を強調し、大きな蛍光強度の差を縮小させた上で、その最小値を０に、最大値が１になるように正規化を行った。

【0056】

正規化法（x：測定された蛍光強度、x_min：測定された最小蛍光強度、x_max：測定された最大蛍光強度、y：規格化後）
y = (log(x + 1.0) - log(x_min + 1.0)) / (log(x_max + 1.0) - log(x_min + 1.0))

【0057】

教師あり学習は、オンライン機械学習向け分散処理フレームワークJubatus (http://jubat.us/) に含まれる多値分類機能Classifierを利用して線形分類、さらに深層学習に対応したフレームワーク TensorFlow (http://tensorflow.org/) およびそのインターフェースであるKeras (http://keras.io/) を利用して深層学習を行った。

【0058】

これらにおけるハイパーパラメータの最適化には、サンプル数が多くないため、一個抜き交差検証により行った。サンプル数の数だけ分類機の認識精度を出力し、最終的な認識精度を高めるための設定変更を重ねた。

【0059】

線形分類では深層学習ほどの認識精度を望むことができないが、各レクチンの蛍光強度がどの程度分類に寄与したかを知ることができるため、この目的で利用した。認識精度を最大限高めるためにClassifierで利用するAROW等アルゴリズムの選択を行い、さらにそれらのアルゴリズムで設定可能なregularization weight値等の最適化を行った。完成させた線形分類機から、それぞれの分類に寄与したレクチンのランキングを作成し、後述する深層学習で得られた結果を補完するために用いた。

【0060】

深層学習は、affine層（全結合層）による隠れ層の積み重ねで構成した。活性化関数はReLU関数、重みの初期値はHeの初期値を用いた。２分類の場合、出力層の出力は単一ノードのSigmoid関数を用い、０に近いか１に近いかにより２分類を行うことができる。３分類以上の場合は、出力層のノード数を分類数に合わせることにより分類することができる。隠れ層の数は２から７程度、各層におけるノード数は４から６０程度、batchサイズ、batch normalizationの利用、dropoutの値、学習率、SGD以外のパラメータ更新法の検討などのハイパーパラメータ最適化を行った。

【0061】

具体的には、図２に示すような入力層から出力層に至る構成で深層学習を行った。

【0062】

深層学習による細胞種の認識精度は、表１に示す如くとなった。用いているサンプル数は、AD=105、UC=30、Lung=６、Liver=６、Aorta＝６サンプルである。

【表1】

【0063】

表１から、間葉系幹細胞（AD、UD）が９０％を超える精度で認識されており、品質確認の基礎となる細胞種の判定において有意な性能が得られていることがわかった。この結果は、対象となる細胞は非破壊にて、従来捨てられていた培地から特段の前処理なしに得られた結果であることを強調するものである。

【産業上の利用可能性】

【0064】

本発明により、分化細胞、間葉系幹細胞など多能性細胞等の細胞種等を非破壊的に検査及び解析する方法を提供する。また、本発明により細胞の状態、例えば、老化、活性度、多能性、分化指向性、有効性等を非破壊的に検査及び解析する方法を提供する。

【図1】

【図2】