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特許7369893グルテン不耐症及びそれから生じる障害を治療するための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-19
(45)【発行日】2023-10-27
(54)【発明の名称】グルテン不耐症及びそれから生じる障害を治療するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/48 20060101AFI20231020BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20231020BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20231020BHJP
A61K 36/18 20060101ALI20231020BHJP
A61K 9/22 20060101ALI20231020BHJP
C12N 9/48 20060101ALN20231020BHJP
C12N 15/57 20060101ALN20231020BHJP
【ＦＩ】
A61K38/48
A61P1/00
A61P37/02
A61K36/18
A61K9/22
C12N9/48 ZNA
C12N15/57
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2021007953
(22)【出願日】2021-01-21
(62)【分割の表示】P 2016573565の分割
【原出願日】2015-06-16
(65)【公開番号】P2021073236
(43)【公開日】2021-05-13
【審査請求日】2021-02-15
(31)【優先権主張番号】62/012,865
(32)【優先日】2014-06-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/118,396
(32)【優先日】2015-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】506408933
【氏名又は名称】コーディクシス， インク．
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＤＥＸＩＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】シュリーマー，デービッド
(72)【発明者】
【氏名】レイ，マーシャル
【審査官】横田 倫子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／０７８９３５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０１４０９８０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】中国特許出願公開第１５５７４０２（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０１７３２５０４（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２００２－５０３６９９（ＪＰ，Ａ）
【文献】Nat Rev Immunol., 2013, Vol.13 No.4, p.1-18 (doi:10.1038/nri3407)
【文献】J Immunol Methods., 2011, Vol.363, p.177-186
【文献】Eur J Immunol., 1994, Vol.24, p.1013-1016
【文献】農耕と園芸, 1998, Vol.53 No.2, p.138
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００
Ａ６１Ｐ
Ａ６１Ｋ ３６／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
セリアック病の発現の減弱または予防に使用されるための、ネプロシンまたはその変異体及び任意選択でネペンテシンＩ酵素、ネペンテシンＩＩ酵素、それらの変異体、またはそれらの混合物の有効量を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物の有効量は部分的に加水分解されたコムギタンパク質を非抗原ペプチドに切断するのに十分な量であって、それによって、セリアック病の発現を減弱または予防し、前記ネプロシンまたはその変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１の２５番目～３８０番目のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むタンパク質であって、プロリルエンドプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、
前記ネペンテシンＩ及び／またはネペンテシンＩＩまたはその変異体が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、グルテナーゼ活性を有するタンパク質である、
セリアック病の発現の減弱または予防に使用されるための医薬組成物。
【請求項2】
ネプロシンタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１の２５番目～３８０番目のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記部分的に加水分解されたコムギタンパク質が部分的に加水分解されたグルテンタンパク質である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記医薬組成物が持続性放出製剤である、請求項１～３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記医薬組成物がＮｅｐｅｎｔｈｅｓの嚢状葉液の抽出物を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシンまたはそれらの変異体の少なくとも１つが組換えタンパク質である、請求項１～４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記医薬組成物が約ｐＨ５～約ｐＨ８の間である、請求項１～６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
医薬組成物は、グルテン含有食品の摂取より前に、摂取の間に、または摂取の直後に、経口的に投与される、請求項１～７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
それを必要とする患者の腸におけるグルテンの存在が原因の上皮内のリンパ球増加の減弱または予防に使用されるための、ネプロシンまたはその変異体及び任意選択でネペンテシンＩ酵素、ネペンテシンＩＩ酵素、それらの変異体、またはそれらの混合物の有効量を含む医薬組成物であって、前記使用は、前記腸における上皮内のリンパ球増加を減弱または予防するために、前記グルテンが分解される条件下で、有効量の前記医薬組成物を前記患者に投与することを含み、
前記ネプロシンまたはその変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１の２５番目～３８０番目のアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むタンパク質であって、プロリルエンドプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、
前記ネペンテシンＩ及び／またはネペンテシンＩＩまたはその変異体が、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であって、グルテナーゼ活性を有するタンパク質である、
上皮内のリンパ球増加の減弱または予防に使用されるための医薬組成物。
【請求項10】
ネプロシンタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１の２５番目～３８０番目のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記医薬組成物がＮｅｐｅｎｔｈｅｓの嚢状葉液の抽出物を含む、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシンまたはそれらの変異体の少なくとも１つが組換えタンパク質である、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記医薬組成物が約ｐＨ５～約ｐＨ８の間である、請求項９～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記医薬組成物がグルテン含有食品の摂取より前に、摂取の間に、または摂取の直後に、経口的に投与される、請求項９～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記グルテン含有食品が固体である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記グルテン含有食品が液体である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記患者が、グルテン過敏症、セリアック病、注意欠陥多動性障害、自閉症、関節リウマチ、線維筋痛症及びヘルペス状皮膚炎からなる群から選択される疾患を罹患している、請求項９～１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記医薬組成物の有効量が約１ｍｇ～約１ｇの間である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年６月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／０１２８６５号、及び２０１５年２月１９日に出願された第６２／１１８３９６号に対して優先権を主張するものである。各先行出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１４年６月１６日に出願された米国特許仮出願第６２／０１２８６５号、及び２０１５年２月１９日に出願された第６２／１１８３９６号に対して優先権を主張するものである。各先行出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
グルテン不耐症及び関連する状態、例えば、セリアック病またはグルテン過敏症を治療するための組成物及び方法が、本明細書で提供される。さらに、腸に食品タンパク質抗原が存在することによって誘導される上皮内リンパ球（ＩＥＬ）浸潤を減弱または予防するための組成物及び方法が本明細書で提供される。そのような食品タンパク質抗原は、グルテンを含むコムギ、オオムギ、ライムギなどに見出されるタンパク質などのプロリンリッチな食品を消化するのが困難であることを含む。特にグルテンは、消化管で部分的に加水分解され、ＩＥＬ浸潤ならびに筋内膜ＩｇＡ及び抗組織トランスグルタミナーゼを含めた抗体の産生を導く可能性がある。本発明の組成物及び方法は、腸内のそのような食品タンパク質抗原の量の低減、次に、腸のＩＥＬ浸潤量の低減を提供する。
【背景技術】
【0003】
いくつかの疾患は、高感受性個体において、抗原性食品タンパク質への反応によって媒介される。例えば、抗原性食品タンパク質（例えば、グルテン）を含むコムギ、オオムギ及びライムギの摂取は、グルテン不耐症個体において、異常な自己免疫応答、例えば、セリアック病、コムギアレルギー及びヘルペス状皮膚炎を引き起こし得る。グルテンは、グルタミン－及びプロリン－リッチなグルテニン及びプロラミンタンパク質分子の混合物である。
【0004】
セリアック病は、小腸に影響を及ぼす自己免疫障害である。セリアック病に特有な異常な自己免疫応答を有する個体の大部分は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ＤＱ２またはＤＱ８分子を発現する。この疾患の症状は、グルテンタンパク質への反応によって引き起こされ、摂取される穀物製品中の他の貯蔵タンパク質（例えば、セルピン、プリニン（ｐｕｒｉｎｉｎｓ））も含み得る。臨床的に、この疾患は、グルテン及び組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）に対して特異的な抗体の定量化を通じてある程度検出可能である。自己免疫応答は、陰窩過形成及び粘膜炎症をともなう小腸粘膜絨毛萎縮を発生させる。セリアック病の症状は、個体によって異なる可能性があり、疲労、慢性的な下痢、便秘、栄養素の吸収不良、体重減少、腹部膨満、貧血、及び骨粗鬆症及び腸の悪性腫瘍（リンパ腫及び癌腫）の発生の危険性増大の１つまたは複数を含み得る。
【0005】
Ｉ型糖尿病は、セリアック病の危険因子である。自閉症もセリアック病と関係があり、グルテンフリーの食事は、自閉症のいくつかの症状の軽減に役立ち得る。同様に、注意欠陥多動性障害の人の中には、グルテンが食事から除去される場合に、より少ない症状しか示さない人もいると考えられている。食事のグルテン排除から恩恵を受け得る他の状態としては、関節リウマチ及び線維筋痛症が挙げられる。
【0006】
グルテン不耐症、特にセリアック病の治療は、一般に、一生続く厳重なグルテンフリーの食事を必要とする。しかし、グルテンフリーの食事は不便で、制限が多く、グルテンを避けるのは困難である。したがって、グルテン不耐症及びセリアック病の有効な代替治療が必要とされる。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、本明細書に記載の１種または複数のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素を含む医薬組成物を、抗原性の可能性がある食品タンパク質と組み合わせて投与することが、腸内の上皮内リンパ球の浸潤及び／または生成の低下を含めた、摂取後の抗原性食品タンパク質への免疫応答を低下させるという発見に関する。上皮内リンパ球は、大腸及び小腸の上皮細胞の間に散在しているＴ細胞である。Ｔ細胞数の増加は炎症の初期の指標であり、セリアック病を含めたグルテン不耐症と関係がある可能性がある。
【0008】
グルテンタンパク質（例えば、グリアジン及びグルテニン）の毒性は、（ペプシンを含めた）ヒト消化酵素によるタンパク質の不完全な分解の間に生成される、プロリン－及びグルタミン－リッチペプチドが原因であると考えられている。胃及び膵臓のエンドプロテアーゼは、不完全分解の、これらの有毒なまたは免疫原性のペプチド副生成物を切断することができず、これは、少なくとも部分的には、そのような酵素がプロリン及び／またはグルタミンに対する特異性を欠くという事実が原因である。このペプチドは、感受性個体において、上皮内のリンパ球増加、絨毛萎縮及び／または炎症を含めた、腸の多数の症状を引き起こすと考えられている。セルピン、プリニン、アルファ－アミラーゼ／プロテアーゼ阻害因子、グロブリン及びファリニンを含めた、コムギ中に存在する他のタンパク質も自己免疫応答に関与し得る。
【0009】
Ｔ細胞は、感受性個体における抗原性発作（すなわち、有毒な食品ペプチドの存在）に対する最初のレスポンダーである。Ｔ細胞は抗原発作にすばやく反応し、炎症、時として腸の劣化を引き起こす。したがって、腸におけるＴ細胞の低減は、免疫応答の低下を示し、感受性個体における、免疫原性食品（例えば、グルテン）の摂取に関係がある症状の低減または排除の潜在的な指標である。
【0010】
理論に拘束されないが、グルテン（または他の抗原性タンパク質）を本明細書に記載の医薬組成物に接触させることによって、免疫応答を低減または排除する（すなわち、有毒でないまたは毒性が低い）小さなポリペプチドフラグメントにタンパク質が破壊されると考えられる。
【0011】
本明細書に記載の医薬組成物を、消化管酵素によって効果的に分解されない食物タンパク質、特にプロリン－及び／またはグルタミン－リッチタンパク質を分解するのに使用できることが予期される。そのような分解がタンパク質の吸収を増大させる及び／または免疫原性を低下させるであろうことがさらに予期される。そのような結果は、腸の疾患及び障害（例えば、セリアック病、グルテン不耐症、過敏性腸症候群、結腸炎、クローン病、食品アレルギーなど）の症状に対して有益効果を有し得る。一実施形態では、医薬組成物の投与は、栄養素の吸収を向上させる。
【0012】
熱帯地方において、モンキーカップ（ｍｏｎｋｅｙ ｃｕｐｓ）として一般に知られている食虫性嚢状葉植物であるＮｅｐｅｎｔｈｅｓの嚢状葉分泌物は、いくつかのプロテアーゼを含む。Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓの濃縮された嚢状葉液は、プロリン－及びグルタミン－リッチグルテンペプチドに対して高い特異性を有する。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０１８６３３０号及び第２０１４／０１４０９８０号は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓの濃縮された嚢状葉液及び組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素の活性及び特異性を記載している。嚢状葉液は酸性であり、その中の酵素は、一般に、酸性ｐＨで最も活性である。
【0013】
ネペンテシン（ＥＣ３．４．２３．１２）は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓの嚢状葉分泌物及び様々な他の植物源から単離または濃縮され得るアスパラキン酸プロテアーゼである。Ｔｏｋｅｓら，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ Ｐｌａｎｔ Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍａｃｆｅｒｌａｎｅｉ Ｌ．，Ｐｌａｎｔａ（Ｂｅｒｌ．）１１９，３９－４６（１９７４）。ネペンテシンの活性は、食品タンパク質のペプチドへの分解に部分的に関与する、ヒトの胃に存在する酵素であるペプシン（ＥＣ３．４．２３．１）より高いことが見出された。ネペンテシンは、既知の２つのアイソタイプ：ネペンテシンＩ（２つの変異体：ネペンテシンＩａ及びネペンテシンＩｂを有することが知られている）ならびにネペンテシンＩＩを有する。
【0014】
一態様では、本発明は、新規なプロリルエンドペプチダーゼ、ネプロシン（ｎｅｐｒｏｓｉｎ）の発見に関し、これは、プロリンリッチなタンパク質及びオリゴペプチド（例えば、グルテンタンパク質）の切断について、高いタンパク質分解活性を持つ。ネプロシンは、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓの嚢状葉分泌物から単離または濃縮され得、広いｐＨ範囲で活性であり、特に低ｐＨ（例えば、約３～５）で活性である。ネプロシンタンパク質の配列は、ゲノムデータベース中のいかなるの他の既知のタンパク質にも相同でない。ネプロシンは、プロリンのカルボキシ（Ｃ）末端側でペプチドを効率的に切断することができる。この切断は、非常に特異的であるように思われる。
【0015】
ネプロシン、ネペンテシンＩ及びネペンテシンＩＩは、単独でまたは一緒に、有毒な食品ペプチドを、より小さな無毒のペプチドに切断することができる。これらの酵素は広い酸性ｐＨ範囲で活性であるので、これらの酵素による消化は、胃の酸性環境で惹起することができる。
【0016】
本発明はさらに、そのような酵素組成物は、食品と組み合わせて使用される場合に、ＩＥＬ浸潤によって測定した場合の腸における免疫応答が減弱または排除されるレベルまで食品タンパク質抗原を分解することができるという発見に基づく。ペプチド性食品抗原（複数可）の存在が原因のＩＥＬ浸潤は、食品抗原（例えば、グルテン）に対する感受性の初期の生物学的指標である。したがって、一態様では、本発明は、哺乳動物の腸における食品タンパク質抗原に対する免疫応答を減弱または予防する方法に関し、この方法は、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素を含む有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体またはそれらの混合物である。一実施形態では、医薬組成物の量は、ペプチド性食品抗原（複数可）の存在が原因の腸のＩＥＬ浸潤を減弱または予防するのに有効である。一実施形態では、ＩＥＬ浸潤は、胃及び／または腸の内在性酵素による抗原性の可能性がある食品タンパク質の不完全な消化が原因である。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品またはタンパク質の摂取より前に、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品またはタンパク質の摂取とともに、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品またはタンパク質の摂取の後に、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品またはタンパク質の摂取に関係なく、哺乳動物に投与される。一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質はグルテンである。一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質は、１種または複数のコムギタンパク質である。
【0017】
一実施形態では、腸の炎症は、腸におけるｌＥＬの浸潤及び／または増殖を特徴とする。したがって、一態様では、本発明は、哺乳動物の腸におけるペプチド性食品抗原（複数可）の存在が原因の腸の炎症を減弱または予防する方法に関し、この方法は、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素を含む有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体またはそれらの混合物である。一実施形態では、医薬組成物の量は、ペプチド性食品抗原（複数可）の存在が原因の腸の炎症を減弱または予防するのに有効である。一実施形態では、腸の炎症は、胃及び／または腸の内在性酵素による抗原性の可能性がある食品タンパク質の不完全な消化が原因である。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品またはタンパク質の摂取より前に、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品またはタンパク質の摂取とともに、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品またはタンパク質の摂取の後に、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品またはタンパク質の摂取に関係なく、哺乳動物に投与される。一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質はグルテンである。一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質は、１種または複数のコムギタンパク質である。
【0018】
一態様では、本発明は、哺乳動物の腸におけるペプチド性食品抗原（複数可）の存在が原因の上皮内のリンパ球増加を減弱または予防する方法に関し、この方法は、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素を含む有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体またはそれらの混合物である。一実施形態では、医薬組成物の量は、腸における上皮内のリンパ球増加を阻害するのに有効である。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品またはタンパク質の摂取より前に、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品またはタンパク質の摂取とともに、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品の摂取後に、哺乳動物に投与される。一実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品またはタンパク質の摂取に関係なく、哺乳動物に投与される。一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質はグルテンである。一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質は、１種または複数のコムギタンパク質である。
【0019】
一実施形態では、医薬組成物の有効量は約１ｍｇ～約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、抗原性の可能性がある摂取されるタンパク質の量に依存する。
【0020】
一実施形態では、本発明は、患者の腸におけるグルテンまたは他の抗原性タンパク質の存在に対する免疫応答と関係がある少なくとも１つの症状を治療及び／または改善することに関する。症状としては、限定はされないが、「ぼんやりとした精神状態（ｆｏｇｇｙ ｍｉｎｄ）」、抑うつ、不安、ＡＤＨＤ様行動、腹痛、腹部膨満、下痢、便秘、頭痛、片頭痛、骨または関節の痛み、慢性疲労、小腸の損傷、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）抗体の発生、重度の座瘡、嘔吐、体重減少、被刺激性、鉄欠乏性貧血、関節炎、四肢の刺痛・しびれ、不妊及び口の潰瘍性口内炎が挙げられる。
【0021】
一態様では、本発明は、哺乳動物の腸におけるペプチド性食品抗原（複数可）の存在が原因の絨毛萎縮を減弱または予防する方法に関し、この方法は、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素を含む有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体またはそれらの混合物である。一実施形態では、腸における絨毛萎縮を阻害するために、抗原性の可能性があるタンパク質が医薬組成物によって分解される。一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質はグルテンである。一実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質は、１種または複数のコムギタンパク質である。
【0022】
一態様では、本発明は、ペプチド性食品抗原に対するＴ細胞応答を低減させる方法に関し、この方法は、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素を含む有効量の医薬組成物とペプチド性食品抗原を接触させることを含む。一実施形態では、抗原に対するＴ細胞応答を低減するために前記抗原が分解される条件下で、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体またはそれらの混合物である。一実施形態では、哺乳動物の腸におけるＴ細胞応答が低減される。一実施形態では、抗原は、哺乳動物の胃において医薬組成物と接触する。一実施形態では、抗原はエクスビボで医薬組成物と接触する。一実施形態では、抗原はグルテンである。一実施形態では、抗原は免疫毒性グルテンタンパク質である。
【0023】
一態様では、本発明は、セリアック病を有する患者の腸における部分的に加水分解されたコムギタンパク質の存在から生じるセリアック病の発現を減弱または予防する方法に関し、この方法は、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。一実施形態では、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、セリアック病の発現を減弱または予防するための、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体またはそれらの混合物である。
【0024】
一態様では、本発明は、腸の障害を有する哺乳動物において食品由来タンパク質の消化性を向上させる方法に関し、この方法は、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素を含む有効量の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、食品中のタンパク質が医薬組成物によって分解される条件下で、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体またはそれらの混合物である。一実施形態では、タンパク質の分解は腸におけるタンパク質の吸収を向上させる。一実施形態では、障害の少なくとも１つの症状が減弱または予防される。一実施形態では、腸の障害はクローン病、過敏性腸症候群または結腸炎である。一実施形態では、食品からのタンパク質吸収が増大する。
【0025】
一態様では、本発明は、それを必要とする患者において膵臓の酵素の不全を治療する方法に関し、この方法は、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。一実施形態では、少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体及びそれらの混合物である。一実施形態では、１種または複数の膵臓の酵素が投与される。１種または複数の膵臓の酵素は、医薬組成物と同時に、または異なる時に投与することができる。一実施形態では、膵臓の酵素は、リパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼまたはそれらの混合物である。一実施形態では、膵臓の酵素の不全は、膵炎、嚢胞性線維症、シュワックマン・ボディアン・ダイアモンド症候群、胆石、ループス、セリアックスプルー、膵臓がんまたは膵臓の手術が原因である。一実施形態では、膵炎は慢性膵炎である。
【0026】
一実施形態では、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ植物の嚢状葉液から濃縮、単離または抽出される。一実施形態では、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、組換えネペンテシンＩ、組換えネペンテシンＩＩ、組換えネプロシン、それらの変異体またはそれらの混合物を含む。
【0027】
一実施形態では、それらの変異体は、アミノ酸配列が、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０及び配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列相同性を有する、タンパク質を含む。一実施形態では、それらの変異体は、アミノ酸配列が、配列番号２、配列番号４及び配列番号１４からなる群から選択されるｃＤＮＡにコードされるアミノ酸に対して少なくとも８５％の配列相同性を有する、タンパク質を含む。
【0028】
一実施形態では、食品は液体である。一態様では、食品は固体である。好ましい実施形態では、医薬組成物は、経口的に投与される。
【0029】
患者が厳重なグルテンフリーの食事に忠実である場合でさえも、グルテンを回避するのは難しい。多数の食品、特に加工食品は、少量のグルテンが混入している。微量のグルテンの摂取でさえも、セリアック病を有する患者において症状の再発を引き起こす可能性がある。そのようなことは、他の免疫原性の可能性がある食品についても当てはまる。
【0030】
一実施形態では、医薬組成物は、患者が免疫原性の可能性があるタンパク質を含む食品を摂取した（例えば、承知の上で摂取した）かどうかに関係なく、投与される。一実施形態では、医薬組成物は、必要に応じて、例えば、免疫原性の可能性があるタンパク質が混入している可能性があるまたは免疫原性の可能性があるタンパク質の含量が不明な食事の前、間及び／または後に、投与される。一実施形態では、医薬組成物は定期的に投与される。一実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１日あたり１回投与される。一実施形態では、医薬組成物は、１日あたり２回、３回、４回またはそれ以上投与される。一実施形態では、医薬組成物は、各食事及び／または軽食と併せて（例えば前、間または後に）投与される。一実施形態では、医薬組成物は持続性放出製剤の一部として含まれ、ここでは、酵素（複数可）の継続的な放出があり、これによって、食品の抗原性タンパク質含量を問わず、断続的に軽食をとることなどが可能になる。
【0031】
一実施形態では、医薬組成物は約ｐＨ２の水性系で維持され、ここでは、前記酵素の遊離アミノ基が荷電される。一実施形態では、組成物は、胃の中で酸と接触するより前に、中性ｐＨで維持される。一実施形態では、医薬組成物は医薬的に許容可能な緩衝液を含み、その結果、胃の中で酸に接触した際に、組成物のｐＨがｐＨ５または６にとどまる。
【0032】
一実施形態では、医薬組成物の有効量は約１ｍｇ～約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物の有効量は、１ｇの基質（例えば、グルテンまたは他の免疫原性の可能性があるタンパク質）あたり約１ｍｇ～約１ｇの間である。一実施形態では、医薬組成物は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシンまたはそれらの変異体の１種より多くを含む。
【0033】
一実施形態では、哺乳動物はヒトである。一態様では、ヒトは、グルテン過敏症またはセリアック病を罹患している。一態様では、腸の抗原タンパク質への感受性は、注意欠陥多動性障害、自閉症、関節リウマチ、線維筋痛症及び／またはヘルペス状皮膚炎と直接的または間接的に相関することが予期される。本発明の組成物を使用してそのような抗原性の腸のタンパク質を腸から除去することは、注意欠陥多動性障害、自閉症、関節リウマチ、線維筋痛症及び／またはヘルペス状皮膚炎について陽性結果を有することが、さらに予期される。好ましい実施形態では、ヒトはセリアック病を罹患している。
【0034】
一態様では、本発明は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体またはそれらの混合物を含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態では、医薬組成物は、ネプロシンまたはその変異体及び／または塩を含む。さらなる好ましい実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１種のさらなるＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素をさらに含む。一実施形態では、さらなるＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、それらの変異体及び／またはそれらの塩を含む。
【0035】
理論に拘束されないが、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及びネプロシンは中性から塩基性ｐＨでは活性が低いまたは実質的に不活性であると考えられる。これは、酵素（複数可）による望ましくない消化の可能性がある場合、重要であり得る。例えば、医薬組成物が経口的に投与される場合、ｐＨ６．５以上へ組成物を緩衝することによって、より低い活性型の酵素（複数可）がもたらされる可能性があり、その結果、組成物と接触し得る口腔粘膜、食道粘膜及び他の細胞が、その中の酵素（複数可）によって消化されない。同様に、組成物が食品に加えられる場合、緩衝された酵素（複数可）は、摂取される前に食品を消化することができない（またはしにくい）。そのような状況では、胃の酸性環境への組成物の導入は、ｐＨの低下及び酵素（複数可）の活性化をもたらす。
【0036】
一実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ６．５以上に緩衝される。好ましい実施形態では、組成物は、約ｐＨ６．５～約ｐＨ８．５に緩衝される。一実施形態では、組成物は液体形態である。一実施形態では、組成物は固体形態である。一実施形態では、組成物のｐＨを液体形態において調整し、組成物を乾燥して固体を形成する。
【0037】
一実施形態では、医薬組成物は、１種または複数のさらなるプロテアーゼを含む。一実施形態では、１種または複数のさらなるプロテアーゼは、アスパラキン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼまたはメタロプロテアーゼである。一実施形態では、医薬組成物は、１種または複数のさらなるエキソプロテアーゼ、例えば、ロイシンアミノペプチダーゼ及びカルボキシペプチダーゼを含む。一実施形態では、１種または複数のさらなるプロテアーゼはトリプシンである。好ましい実施形態では、１種または複数のさらなるプロテアーゼは酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ２～６）で活性である。
【0038】
一態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を含む製剤に関し、ここでは、酵素（複数可）が遅延放出ビヒクル中に存在し、その結果、製剤が胃の中に存在する間、酵素（複数可）が継続的に放出される。一実施形態では、製剤は、胃の中で酸と接触するより前に、約５を越えるｐＨを有する。一実施形態では、製剤は生物学的に許容可能な緩衝液を含み、その結果、胃の中で酸に接触した際に、組成物のｐＨは少なくとも一定期間約ｐＨ５または６にとどまる。
【0039】
一実施形態では、本発明は、医薬組成物の単位用量製剤に関する。例えば及び限定はされないが、単位用量は、錠剤、カプセル剤中に存在してもよい。単位用量は、固体、液体、粉末または任意の他の形態でもよい。理論に拘束されないが、医薬組成物の単位用量製剤は、（例えば、免疫原性の摂取タンパク質の量に基づいて）適切な投薬を可能にし、一方で、過剰な量の組成物の投与の潜在的な負の副作用を回避することを可能にすることが想像される。
【0040】
一実施形態では、本発明は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン及び／またはそれらの変異体のプロ酵素形態に関する。一実施形態では、プロペプチドが酵素に存在する。好ましい実施形態では、酸性ｐＨによってプロペプチドを除去し、それによって、酵素を活性化する。一実施形態では、プロペプチドは、酵素についての天然に存在するプロペプチドアミノ酸配列を含む。一実施形態では、プロペプチドは人工プロペプチドまたは異種性のプロペプチド（すなわち、異なるタンパク質及び／または種由来の酸不安定性プロペプチド）である。
【図面の簡単な説明】
【0041】
【図1】Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍｉｒａｈｉｌｉｓ（配列番号５）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ａｌａｔａ（配列番号６）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ（配列番号７）、Ｚｅａ ｍａｙｓ（配列番号１０）及びＯｒｙｍ ｓａｌｉｖａ（配列番号１１）由来のネペンテシンＩ、ならびにＮｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（配列番号８）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ（配列番号９）、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（配列番号１２）及びＺｅａ ｍａｙｓ（配列番号１３）由来のネペンテシンＩＩについてのタンパク質配列のアライメントを示す図である。
【図2】組換えネペンテシンタンパク質のサイズを示す図である。Ａ：ネペンテシンＩのクーマシー染色ゲル。Ｂ：酸活性化ネペンテシンＩのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析。Ｃ：ネペンテシンＩＩのクーマシー染色ゲル。Ｄ：酸活性化ネペンテシンＩＩのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析。
【図3】ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳによる、（２～３種からプールした）天然のネペンテシンＩ及びネペンテシンＩＩのサイズ。
【図4】組換えネペンテシンＩＩ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物またはペプシンで消化後のグルテンフラグメントの分子量を示す、クーマシー染色ゲルのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図5A】ペプシン（４０μｇ）または指示された量の組換えネペンテシンＩまたは組換えネペンテシンＩＩで消化したグルテンタンパク質のスラリーを含む、バイアルの写真である。
【図5B】図５Ｂは、ペプシン（４０μｇ）または指示された量のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物で消化したグルテンタンパク質のスラリーを含むバイアルの写真である。ネペンテシンまたはＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物とともにインキュベートしたバイアルはペプシンのバイアルよりも濁りが少なく、これにより、より活発なグルテン消化が示される。
【図6】３７℃で１、５、１０、１５、３０、６０、１３０、３６０または８１０分後に、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して、濃縮されたＮｅｐｅｎｔｈｅｓ流体によるコムギ由来グリアジンの消化から同定されたすべてのペプチドの平均長を示す図である。偽陽性の同定を減らすために、スコアに対する９５％信頼度カットオフ（ｐ＜０．０５）を使用した。ペプチド長の相対標準偏差を挿入図に示す。
【図9】示される酵素に関して、（Ａ）切断部位のＰ１またはＮ末端側での、及（Ｂ）切断部位のＰ１’またはＣ末端側での切断優先性を示す図である。各残基についての左側のバーはＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物での消化を示し、中央のバーは精製されたＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物での消化を示し、右側のバーは組換えネペンテシンＩでの消化を示す。％切断は、存在するペプチドの総数に対する、所与の残基で観察された切断の数を表す。データは、グリアジンの消化物から得た。
【図10】Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ流体についてのイオン交換精製のプロファイルを示す図である。ネプロシン及びネペンテシンに対応するピークを矢印で示す。囲まれた領域は、収集画分を示す。
【図11】処理過程におけるマウスの体重を示す図である。陰性対照（●）の動物はグリアジンで負荷しなかった。陽性対照（■）の動物はペプシンで消化したグリアジンで負荷した。処理１（▲）の動物はＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物で消化したリアジンで負荷した。処理２（▼）の動物は組換えネペンテシンＩＩで消化したグリアジンで負荷した。
【図12】処理したマウスの腸におけるＣＤ３陽性ＩＥＬに関する免疫組織化学的検査の写真である。
【図13】各処理群に関して、腸中の腸細胞１００個あたりのＣＤ３陽性上皮内リンパ球（ＩＥＬ）の平均数を示す図である。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１
【図14】各処理集群に関して、絨毛と陰窩の平均比を示す図である。
【図15A】データ依存型ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで検出した場合の、ネプロシンによって消化されるグリアジン部分のサンプリングを示す図である。
【図15B】ネプロシンで消化後のグリアジンの消化プロファイルを示す図である。ピリオドは切断部位を示す。
【図16】様々な種由来のネプロシンのアミノ酸配列における多型の位置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0042】
本発明は記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、当然ながら変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される術語は特定の実施形態のみを説明することを目的とし、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、制限を意図したものではないことも理解されたい。
【0043】
本発明の詳細な説明は、読者の利便性のためのみに様々なセクションに分けられ、いかなるセクションで見出される開示も別のセクションのものと組み合わせることができる。
【0044】
Ｉ．定義
別段規定されない限りは、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等ないかなる方法及び材料も本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、装置及び材料を次に記載する。本明細書で引用されるすべての技術刊行物及び特許公報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書のいずれの記述も、先行発明によって、本発明がそのような開示に先行する権利が与えられないことを認めると解釈されるものではない。
別段規定されない限りは、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または均等ないかなる方法及び材料も本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法、装置及び材料を次に記載する。本明細書で引用されるすべての技術刊行物及び特許公報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書のいずれの記述も、先行発明によって、本発明がそのような開示に先行する権利が与えられないことを認めると解釈されるものではない。
【0045】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において別段明記しない限り、複数形を含む。
【0046】
本明細書で使用する場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、組成物及び方法が、列挙される要素を含むが、他を除外しないことを意味することを意図する。組成物及び方法を定義するために使用される場合、「Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ」は、組み合わせにとって本質的に重要な任意の他の要素を除外することを意味するものとする。例えば、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、特許請求される発明の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさない他の要素を除外しないはずである。「Ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ」は、微量より多い他の成分及び列挙される実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は本発明の範囲内である。
【0047】
本明細書で使用する場合、「抗原性の可能性がある食品またはタンパク質」は、感受性個体の腸において免疫及び／または炎症応答を引き起こし得る任意の食品またはタンパク質である。好ましい実施形態では、個体はヒトであり、食品はヒトによる摂取を目的とする食品である。抗原性の可能性がある食品としては、限定はされないが、コムギ、ライムギ、オオムギ、ピーナッツ、ナッツ及び種子が挙げられる。一実施形態では、これらの食品由来の抗原性の可能性があるタンパク質としては、プロラミンタンパク質、２Ｓアルブミン、非特異的脂質輸送タンパク質、二機能性アルファ－アミラーゼ／プロテアーゼ阻害剤、ダイズ疎水性タンパク質、インドリン、グルテン、セルピン、プリニン、アルファ－アミラーゼ／プロテアーゼ阻害因子、グロブリン及びファリニンが挙げられる。好ましい実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質（またはペプチド）は、プロリン及び／またはグルタミン残基に富む。特に好ましい実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質はグルテンである。別の好ましい実施形態では、抗原性の可能性があるタンパク質はコムギタンパク質である。
【0048】
本明細書で使用する場合、用語「グルテン」は、一般に、特定の個体に潜在的な有害作用を有する、コムギまたはオオムギ及びライムギを含めた近縁穀物種中に存在するタンパク質を指す。グルテンタンパク質は、単量体タンパク質である、α－グリアジン、β－グリアジン、γ－グリアジン及びω－グリアジンなどのグリアジン、ならびにジスルフィド結合によって結合した高分子量及び低分子重サブユニット凝集体の非常に不均一な混合物である、グルテニンを含む。多くの小麦グルテンタンパク質が特徴付けされている。例えば、Ｗｏｙｃｈｉｋら，Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｗｈｅａｔ Ｇｌｕｔｅｎ，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ ９（４），３０７－３１０（１９６１）を参照されたい。本明細書で使用する場合、用語グルテンは、グルテン含有食品由来グルテンタンパク質の通常のヒト消化から生じ得、異常な免疫応答を引き起こし得るオリゴペプチドも含む。これらのオリゴペプチドの中には、通常の消化酵素に抵抗性であるものもある。上記のタンパク質及びオリゴペプチドを含めたグルテンは、グルテン不耐症（例えば、セリアックスプルー）の患者において、Ｔ細胞（例えば、ＩＥＬ）に対する抗原として作用すると考えられている。用語グルテンは、例えばベイクド製品で見られるであろう変性したグルテンも指す。
【0049】
本明細書で使用する場合、用語「グルテン過敏症及び関連する状態」は、グルテンタンパク質またはペプチドに対する不耐性または感受性に起因する任意の状態を指す。これらとしては、限定はされないが、セリアックスプルー（セリアック病）、コムギアレルギー、グルテン過敏症、グルテン過敏性腸症、特発性グルテン過敏症及びヘルペス状皮膚炎が挙げられる。関連する状態としては、限定はされないが、自閉症、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）、関節リウマチ、線維筋痛症、クローン病、栄養素の吸収不良（ｍａｌａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）及び過敏性腸症候群（ＩＢＳ）も挙げられる。
【0050】
用語「ネプロシン」は、およそ２９キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有するプロリルエンドプロテアーゼを指す。ネプロシンは、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ種の嚢状葉分泌物から単離することができる。ネプロシンは、高い特異性で、タンパク質のカルボキシ末端をプロリンに切断する。この酵素は、約ｐＨ２～約ｐＨ６で活性である。一実施形態では、ネプロシンは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。ネプロシンのアミノ酸配列は、いかなる他の既知タンパク質にも相同でない。一実施形態では、ネプロシンは、配列番号２のｃＤＮＡ配列にコードされる。一実施形態では、ネプロシンはシグナル配列を含む。一実施形態では、シグナル配列は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ネプロシンはシグナル配列を含まない。
【0051】
ネプロシンは、すべてのアイソフォーム、アイソタイプ及びネプロシンの変異体、組換えネプロシンならびにそれらの塩を含む。塩は、遊離ネプロシンの生物学的効果及び特性を保持し、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではない、１種または複数の塩基または１種または複数の酸とともにネプロシンによって形成される塩を指す。無機塩基に由来する塩としては、限定されないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムの塩などが挙げられる。有機塩基に由来する塩としては、限定されないが、第１級、第２級及び第３級アミン、天然に存在する置換アミンを含めた置換アミン、環状アミン及び塩基性イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの塩が挙げられる。塩を形成することができる酸としては、限定されないが、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸など、及び有機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ ａｃｉｄ）などが挙げられる。
【0052】
プロテアーゼの例としては、限定はされないが、アスパラキン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ及びメタロプロテアーゼが挙げられる。本発明で有用であり得るプロテアーゼとしては、限定はされないが、ＢＡＣＥ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、キモシン（または「レンニン」）、ナプシン、ペプシン、プラスメプシン、プレセニリン、レニン、トリプシン、ケモトリプシン（ｃｈｅｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、エラスターゼ及びシステインエンドプロテアーゼ（ＥＰ）Ｂ２（ＥＰＢ２としても知られる）が挙げられる。プロテアーゼは、例えば、米国特許第７，３２０，７８８号；第７，３０３，８７１号；第７，３２０，７８８号；第７，６２８，９８５号；第７，９１０，５４１号；及び第７，９４３，３１２号；ＰＣＴ特許公開第２００５／１０７７８６号；第２００８／１１５４２８号；第２００８／１１５４１１号；第２０１０／０２１７５２号；第２０１０／０４２２０３号；第２０１１／０９７２６６号（これらのそれぞれは、参照により本明細書に明確に組み込まれる記載される）に記載されるものを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つのさらなるプロテアーゼは、酸性ｐＨ、例えば胃で見られるもの（例えば、ｐＨ１．５～３．５）で活性である。
【0053】
用語「ネペンテシン」は、酵素番号ＥＣ３．４．２３．１２を有するアスパラキン酸プロテアーゼを指し、ネペンテシンのすべてのアイソフォーム、アイソタイプ及び変異体、例えば、ネペンテシンＩ及びネペンテシンＩＩ、ネペンテシンアイソフォーム及び組換えネペンテシン、ならびにそれらの塩を含む。ネペンテシン（ＥＣ３．４．２３．１２）は、様々な植物源、例えば、熱帯地方においてモンキーカップとして一般に知られている食虫性嚢状葉植物であるＮｅｐｅｎｔｈｅｓの嚢状葉分泌物から単離または濃縮され得る、植物起源のアスパラキン酸プロテアーゼである。ネペンテシンは、２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８４３，３６９号に詳細に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。既知のネペンテシンタンパク質配列（及び推定上のネペンテシンタンパク質配列）の配列アラインメントを図１に示す。
【0054】
一実施形態では、「有効量」は、対象における症状の阻害若しくは改善または所望の生物学的な転帰、例えば、臨床徴候の向上、疾患の発症の遅延などをもたらす組成物量を指す。有効量は、当業者が決定することができる。選択される投薬量レベルは、治療を受ける状態の重症度ならびに治療を受ける哺乳動物の状態及び以前の病歴に依存し得る。しかし、所望の治療効果を達成するのに必要とされるより低いレベルで組成物の用量を開始すること、及び投所望の効果が達成されるまで薬量を次第に増大させることは、当技術分野の範囲内である。
【0055】
用語「セリアック病の発現」は、セリアック病の症状または臨床像のうちのいずれかを指す。そのような発現としては、限定はされないが、腸の炎症、「ぼんやりとした精神状態」、抑うつ、不安、ＡＤＨＤ様行動、腹痛、腹部膨満、下痢、便秘、頭痛、片頭痛、骨または関節の痛み、慢性疲労、小腸の損傷、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴＧ）抗体の発生、重度の座瘡、嘔吐、体重減少、被刺激性、鉄欠乏性貧血、関節炎、四肢の刺痛・しびれ、不妊及び口の潰瘍性口内炎が挙げられる。発現は、陰窩過形成をともなう小腸粘膜絨毛萎縮、腸の粘膜炎症、栄養素の吸収不良、腹部膨満、ならびに骨粗鬆症及び腸の悪性腫瘍（リンパ腫及び癌腫）の発生に対する危険性の実質的な高まりをさらに含む。
【0056】
本明細書で使用する場合、「同時投与」または「共治療」は、一緒のまたは互いに前後する薬剤の投与を含む。
【0057】
用語「調節する」、「減弱する」または「改善する」は、哺乳動物などの対象における疾患または障害の任意の治療を意味し、
・疾患若しくは障害を予防する若しくは疾患若しくは障害から保護すること、すなわち、異常な生物学的反応若しくは症状を発生させないようにすること；
・疾患若しくは障害を阻害すること、すなわち、異常な生物学的反応及び／若しくは臨床症状の発生を抑止または抑制すること；ならびに／または
・疾患または障害を軽減すること、すなわち、異常な生物学的反応及び／若しくは症状を後退させること
を含む。
・疾患若しくは障害を予防する若しくは疾患若しくは障害から保護すること、すなわち、異常な生物学的反応若しくは症状を発生させないようにすること；
・疾患若しくは障害を阻害すること、すなわち、異常な生物学的反応及び／若しくは臨床症状の発生を抑止または抑制すること；ならびに／または
・疾患または障害を軽減すること、すなわち、異常な生物学的反応及び／若しくは症状を後退させること
を含む。
【0058】
本明細書で使用する場合、用語「予防する」または「阻害する」は、それらを必要とする対象の予防的治療を指す。予防的治療は、病気を罹患する危険性がある対象に適切な用量の治療剤を与え、それによって、病気の発症を実質的に防ぐことによって達成することができる。
【0059】
本明細書で使用する場合、用語「状態」は、本明細書に提供される化合物、組成物及び方法が使用されている病態を指す。
【0060】
本明細書で使用する場合、用語「患者」または「対象」は哺乳動物を指し、ヒト及びヒト以外の哺乳動物を含む。本明細書の特定の実施形態では、患者または対象はヒトである。
【0061】
数値の前で使用される場合、用語「約」は、値が合理的な範囲、すなわち±５％、±１％または±０．２％内で変化し得ることを示す。
【0062】
別の配列に対して特定のパーセンテージ（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチド若しくはポリペプチド領域）とは、整列させた場合に、塩基（またはアミノ酸）のパーセンテージが、その２つの配列の比較において同一であることを意味する。アライメント及びパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で既知のソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編１９８７）補遺３０，セクション７．７．１８，表７．７．１に記載されているものを使用して決定することができる。好ましくは、アライメントについてデフォルトパラメーターを使用する。アライメントプログラムの１つは、デフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴである。プログラムの例としては、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰが挙げられ、これは、以下のデフォルトパラメーターを使用する：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；ソートバイ（ｓｏｒｔ ｂｙ）＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝ｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴで見出すことができる。
【0063】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較目的で整列され得る各配列における位置を比較することによって決定することができる。比較される配列における位置が同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合は、これらの分子はその位置で相同である。配列間の相同性の程度は、これらの配列に共通の一致する位置または相同な位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同な」配列は、本開示の配列のうちの１つと４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を有する。
【0064】
ＩＩ．方法
一態様では、本発明は、患者においてグルテン不耐症によってもたらされる状態を調節する方法であって、有効量のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素含有医薬組成物を患者に投与することを含む方法に関する。好ましい実施形態では、状態はセリアック病またはコムギアレルギーである。
一態様では、本発明は、患者においてグルテン不耐症によってもたらされる状態を調節する方法であって、有効量のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素含有医薬組成物を患者に投与することを含む方法に関する。好ましい実施形態では、状態はセリアック病またはコムギアレルギーである。
【0065】
別の態様では、本発明は、哺乳動物の腸におけるペプチド性食品抗原の存在が原因の、腸におけるＩＥＬの生成及び／または漸増を、減弱または予防する方法に関する。一実施形態では、方法は、有効量のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素含有医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、腸におけるＩＥＬの生成及び／または漸増を減弱または予防するために、グルテンタンパク質が医薬組成物によって分解される。
【0066】
一態様では、本発明は、哺乳動物の腸におけるペプチド性食品抗原の存在が原因の腸の炎症を減弱または予防する方法に関する。一実施形態では、方法は、有効量のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素含有医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、腸の炎症を減弱または予防するために、酵素（複数可）によってペプチド性食品抗原が分解される。
【0067】
一態様では、本発明は、哺乳動物の腸におけるペプチド性食品抗原の存在が原因の上皮内のリンパ球増加を減弱または予防する方法に関する。一実施形態では、方法は、有効量のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素含有医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、腸における上皮内のリンパ球増加を減弱または予防するために、ペプチド性食品抗原が医薬組成物によって分解される。
【0068】
一態様では、本発明は、哺乳動物の腸におけるペプチド性食品抗原の存在が原因の絨毛萎縮を減弱または予防する方法に関する。一実施形態では、方法は、有効量のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素含有医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。一実施形態では、腸における絨毛萎縮を減弱または予防するために、ペプチド性食品抗原が医薬組成物によって分解される。一実施形態では、絨毛萎縮は腸の炎症の結果である。
【0069】
一実施形態では、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体またはそれらの混合物である。好ましい実施形態では、医薬製剤は持続性放出製剤である。
【0070】
一実施形態では、変異体は、配列番号１、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０または配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、変異体は、配列番号５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、変異体は、配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、変異体は、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、変異体は、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、変異体は、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、変異体は、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。一実施形態では、変異体は、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【0071】
一実施形態では、医薬組成物はＮｅｐｅｎｔｈｅｓの嚢状葉液の抽出物を含む。一実施形態では、医薬組成物は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓの嚢状葉液の抽出物から精製されたネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及び／またはネプロシンを含む。一実施形態では、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシンまたはそれらの変異体の少なくとも１つは、組換えタンパク質である。一実施形態では、医薬組成物は、投与より前に約ｐＨ５～約ｐＨ８の間である。本明細書に記載の方法で使用するための医薬組成物をより詳細に以下で述べる。
【0072】
好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。一実施形態では、ヒトは、グルテン不耐症、セリアック病、注意欠陥多動性障害、自閉症、関節リウマチ、線維筋痛症及びヘルペス状皮膚炎からなる群から選択される疾患に罹患している。一実施形態では、ヒトは、食品アレルギーに罹患している。
【0073】
一実施形態では、医薬組成物は、グルテン含有食品の摂取より前に、摂取の間に、または摂取の直後に、経口的に投与される。
【0074】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、グルテンを含むか、グルテンを含む疑いがある食品を対象が摂取するより前に、対象に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象が摂取する食品中のグルテンの分解に酵素が少なくとも部分的に有効（例えば、本来の活性の少なくとも約１０％、２０％、５０％、７０％、９０％）である期間内に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象が食品を摂取するより前の約４時間、３時間、２時間、１時間または３０分以内に投与される。
【0075】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、免疫原性の可能性がある食品を対象が摂取するのと同時に対象に投与される。いくつかの実施形態では、酵素組成物は、食品とともに投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、食品とは別に投与される。
【0076】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、免疫原性の可能性がある食品を対象が摂取した直後に対象に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、食品中の抗原（複数可）の少なくとも一部（例えば、少なくとも約１０％、２０％、５０％、７０％、９０％）がまだ対象の胃の中にある期間内に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象が食品を摂取した後の４時間、３時間、２時間、１時間または３０分以内に投与される。
【0077】
一般的には、医薬組成物は、安全であり、ペプチド性食品抗原（複数可）の解毒という所望の効果をもたらすのに十分である量で投与される。医薬組成物の投薬量は、多くの因子、例えば、投与される特定の酵素、食品に対する対象の感受性、摂取される抗原含有食品の量及び種類、酵素の薬力学的特性、投与様式、受容者の年齢、健康及び体重、症状の性質及び程度、治療の頻度及びもしあれば併用療法の種類ならびに酵素のクリアランス速度によって変動し得る。当業者は、上記の因子に基づいて、適切な投薬量を決定することができる。組成物は、臨床応答に応じて、必要に応じて調整することができる適切な投薬量で、最初に投与することができる。至適な投薬量範囲を特定するのを支援するために、インビトロアッセイを場合により用いることができる。製剤に用いられることになる正確な用量は、投与経路及び／または疾患若しくは障害の重症度にも依存し、医師の判断及び各対象の状況に従って決定されるべきである。
【0078】
成人対象の投薬または投与のレジメンを、小児及び幼児用に比例的に調整することができ、また、例えば分子量または免疫応答に応じて、他の投与または他の型式用に調整することができる。医師の裁量で、投与または治療を適切な間隔で反復することができる。
【0079】
一般に、医薬組成物は、必要な場合に、例えば、抗原性タンパク質を含むか、抗原性タンパク質を含む疑いがある食品を対象が摂取するであろう、または摂取している、または摂取した場合に、投与される。いずれにせよ、これは、１日につきｋｇ体重あたり約０．００１ｍｇ～約１０００ｍｇの酵素の投薬量で、または平均的な人に対して、投与あたり約１ｍｇ～約１００ｇの投薬量で投与することができる。いくつかの実施形態では、酵素は、１日あたり０．００１、０．０１、０．１、１、５、１０、５０、１００、５００または１０００ｍｇ／ｋｇ体重で、及びこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲（端点を含む）で投与することができる。いくつかの実施形態では、酵素は、投与あたり１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、２０ｇ、５０ｇ、７０ｇ、１００ｇで、及びこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲（端点を含む）で、投与することができる。いくつかの実施形態では、これは、対象が抗原性タンパク質を含む食品を摂取する回数及び／またはそのような食品のどのくらいが摂取されるかに応じて、１日にあたり１回、２回、３回など投与することができる。本明細書に記載される酵素の量は、組成物中の全酵素または各酵素に関し得る。
【0080】
いくつかの実施形態では、投与される医薬組成物の量は、摂取された／摂取されることになる基質（例えば、グルテン及び／若しくは他のタンパク質または抗原性の可能性があるタンパク質）の量（またはおおよその量）に依存する。一実施形態では、１ｇの基質あたり約１ｍｇ～約１ｇの酵素が投与される。一実施形態では、１ｇの基質あたり約５ｍｇ～約１ｇの酵素が投与される。一実施形態では、１ｇの基質あたり約１０ｍｇ～約１ｇの酵素が投与される。一実施形態では、１ｇの基質あたり約１００ｍｇ～約１ｇの酵素が投与される。一実施形態では、１ｇの基質あたり約１ｍｇ～約５００ｍｇの酵素が投与される。一実施形態では、１ｇの基質あたり約１ｍｇ～約２５０ｍｇの酵素が投与される。一実施形態では、１ｇの基質あたり約１ｍｇ～約１００ｍｇの酵素が投与される。一実施形態では、１ｇの基質あたり約１ｍｇ～約１０ｍｇの酵素が投与される。これは、これらの範囲（端点を含む）及びこれらの値のうちの任意の２つの間の部分範囲の任意の値を含む。
【0081】
一実施形態では、基質と投与される酵素の比は、約１：１～約１００００：１の間である。好ましい実施形態では、基質と酵素の比は、約１０：１～約１０００：１の間である。一実施形態では、基質と酵素の比は、約１０：１～約１００：１の間である。
【0082】
本発明の医薬組成物は、単独の活性薬剤として投与することができ、または他の薬剤と組み合わせて（同時に、連続的に若しくは別々に、または共製剤によって）投与することができ、他の薬剤には、同じ若しくは同様の治療活性を示し、そのような併用投与に安全且つ効果的であると判定された他の化合物が含まれる。
【0083】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、さらなる酵素、例えば、胃のプロテアーゼ、アスパラキン酸プロテアーゼ（ペプシン、ペプシノーゲンまたはＣｈｅｎら，Ａｓｐａｒｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ ｒｉｃｅ：Ｇｅｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ ４４２：１０８－１１８（２００９）によって記載されるものなど）ならびに別のプロリルエンドペプチダーゼ（ＰＥＰ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）及びジペプチジルカルボキシペプチダーゼ（ＤＣＰ）またはシステインプロテイナーゼＢ（米国特許第７，９１０，５４１号に記載されている）などの酵素とともに投与される。一実施形態では、他の酵素は、さらなる酵素を生成及び／または分泌する細菌の形態で投与される。一実施形態では、細菌は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン及び／またはそれらの変異体を生成及び／または分泌するように遺伝子操作される。
【0084】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は別の薬剤とともに対象に投与される。医薬組成物とともに投与することができる薬剤の非限定例としては、組織トランスグルタミナーゼの阻害剤、抗炎症剤、例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、エンドペプチダーゼ、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、コンパクチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン及びアトルバスタチン）、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト（例えば、モンテルカスト及びザフィルルカスト）、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、セレコキシブ及びロフェコキシブ）、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＲＢ－７９６）；肥満細胞安定化剤、例えば、クロモグリク酸ナトリウム（クロモリン）、ペミロラスト、プロキシクロミル、レピリナスト、ドキサントラゾール、アンレキサノクス ネドクロミル及びプロビクロミル、抗潰瘍剤、抗アレルギー剤、例えば、抗ヒスタミン剤（例えば、アクリバスチン、セチリジン、デスロラタジン、エバスチン、フェキソフェナジン、レボセチリジン、ロラタジン及びミゾラスチン）、トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）の阻害剤、抗ＴＮＦａ剤ならびに抗生物質が挙げられる。一実施形態では、さらなる薬剤はプロバイオティクである。プロバイオティクとしては、限定はされないが、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、酵母、ｂａｃｉｌｌｕｓまたはｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの種及び系統が挙げられる。一実施形態では、他の薬剤はエラフィンである。一実施形態では、他の薬剤は、さらなる薬剤を生成及び／または分泌する細菌の形態で投与される。
【0085】
いくつかの実施形態では、他の薬剤は、腸で活性である酵素（例えば、プロテアーゼ）を含む。理論によって制限されるものでないが、そのような酵素は、医薬組成物の酵素（複数可）と相乗的に作用して、さらに免疫原性タンパク質を分解することができると考えられる。
【0086】
前述の状態及び疾患のうちの１つを治療または予防するための医薬の製造における、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体及び／またはそれらの塩を含む酵素組成物の使用も本明細書で提供される。
【0087】
ＩＩＩ．医薬組成物
医薬組成物は、様々な組成物で、単独で、または適切な医薬的に許容可能な担体、賦形剤若しくは希釈剤とともに、投与することができる。
医薬組成物は、様々な組成物で、単独で、または適切な医薬的に許容可能な担体、賦形剤若しくは希釈剤とともに、投与することができる。
【0088】
したがって、別の態様では、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体及び／またはそれらの塩を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物は医薬組成物である。組成物は、固体、半固体または液体形態、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、注射剤、ゲル剤及びマイクロスフェアに製剤化することができる。組成物の投与は、様々な方法で、例えば経口投与によって達成することができる。
【0089】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体またはそれらの混合物及び医薬的に許容可能な担体を含む。特定の実施形態では、用語「医薬的に許容可能な」は、動物及びより詳細にはヒトで使用するために、連邦または州政府の規制当局によって承認されているか、米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に収載されていることを意味する。用語「担体」は、希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクル（治療剤がこれらとともに投与される）を指す。そのような医薬担体は、滅菌した液体、例えば、水ならびに石油、動物、植物または合成起源のものを含めた油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などでもよい。生理食塩水ならびにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液も液状担体として用いることができる。
【0090】
適切な医薬品賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて、少量の加湿若しくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤も含むことができる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続性放出製剤などの形態をとることができる。適切な医薬担体の例は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。そのような組成物は、対象に適切に投与するための形態を提供するために、好ましくは精製された形態の治療有効量の酵素（複数可）を適切な量の担体とともに含む。製剤は、投与様式に適していなければならない。
【0091】
経口投与については、医薬組成物を、単独で、または適切な添加剤と組み合わせて使用して、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤などを作製することができる。例えば、組成物の固体経口形態は、従来の添加剤、崩壊剤、潤滑剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤及び着香剤を用いて調製することができる。賦形剤の非限定例としては、ラクトース、マンニトール、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、香料及び着色剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、製剤は、対象の胃の中に酵素（複数可）を放出し、その結果、酵素（複数可）によってペプチド性食品抗原（複数可）が分解され得る。
【0092】
組成物を、場合により適切な緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、ヒスチジン、イミダゾール緩衝液）及び賦形剤（例えば、ショ糖、ラクトース、トレハロースなどの抗凍結剤）の存在下で、水溶液から凍結乾燥することができる。凍結乾燥ケークを、場合により賦形剤と混ぜることができ、様々な形態にすることができる。
【0093】
別の態様では、それを必要とする患者において、グルテン不耐症または関連する状態、例えば、セリアック病、コムギアレルギー、グルテン過敏症及びヘルペス状皮膚炎を治療する方法であって、グルテンを含むか、グルテンを含む疑いがある食品を、患者が摂取するより前に有効量の組成物で処理することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、食品は、その調製の間に有効量の組成物と混ぜ合わされる。一実施形態では、組成物は、食品調製の任意の加熱ステップの後に加えられる。一実施形態では、組成物は、食品調製の１つまたは複数の加熱ステップの前に加えられる。
【0094】
ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及びネプロシンは、活性化前に、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ中にプロ酵素として存在する。すなわち、これらのタンパク質は、嚢状葉液中で酵素を活性化するために切断されるプロペプチドを含む。一実施形態では、組成物は、プロペプチドを含む、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン、それらの変異体及び／またはそれらの塩を含む。一実施形態では、プロペプチドは酵素のＮ末端に隣接する。一実施形態では、プロペプチドは、天然に存在する、酵素のプロペプチドである。一実施形態では、プロペプチドは、（例えば、異なるタンパク質若しくは種に由来する、または合成的な）異種のプロペプチドである。一実施形態では、プロペプチドは酸性条件によって切断される。一実施形態では、プロペプチドは酵素によって切断される。一実施形態では、プロペプチドの存在は、（例えば、プロペプチドを除去し、成熟酵素を生成するのに必要とされる時間が原因で）、胃において酵素の活性を遅らせる。一実施形態では、プロペプチドは、胃において酵素の活性を遅らせるために、よりゆっくりと除去されるように遺伝子操作される。一実施形態では、プロペプチドは、胃において酵素の活性を迅速化するために、よりすばやく除去されるように遺伝子操作される。
【0095】
好ましい実施形態では、製剤は制御放出製剤である。用語「制御放出製剤」は、持続性放出製剤及び徐放性製剤を含む。制御放出製剤は当技術分野で周知である。これらは、薬物の持続性放出、周期的放出、パルス放出または遅延放出を可能にする賦形剤を含む。制御放出製剤は、限定はされないが、マトリックス中に薬物を包埋すること、腸溶性コーティング、マイクロカプセル化、ゲル及びヒドロゲル、ならびに薬物の制御放出を可能にする任意の他の製剤を含む。
【0096】
いくつかの実施形態では、組成物は、抗原性の可能性がある食品タンパク質を含むか、含む疑いがある食品とともに、食品添加剤として投与される。一実施形態では、食品はグルテンを含むか、含む疑いがあり、例えば、コムギ、ライムギ及びオオムギなどから作られたパン、パスタ、シリアルなどである。いくつかの実施形態では、組成物は、そのような食品に成分として加えられる。いくつかの実施形態では、組成物は、場合により組成物が不活性なｐＨで、例えば約５以上のｐＨで、摂取前に食品中に分散される。いくつかの実施形態では、組成物を、患者が食品を摂取する場合にその食品に加えることができる、粉末、スプレッド、スプレー、ソース、ディップ、ホイップクリームなどにする、またはこれらに組み込むことができる。いくつかの実施形態では、容易な投与のために、組成物をヒトの食欲に訴える形態、例えば、キャンディー、チューインガム、栄養補助食品咀嚼物、シロップなどにすることができる。いくつかの実施形態では、組成物を一般的な食料品、例えば、砂糖、塩、サラダドレッシング、香辛料、チーズ、バター、マーガリン、スプレッド、バター、揚げ用ショートニング、マヨネーズ、乳製品、ナッツバター、種子バター、カーネルバター、ピーナッツバターなどと混合することができる。好ましくは、組成物を含む食料品または添加剤は、患者が摂取する前に加熱を必要とせず、その結果、高温による酵素（複数可）活性喪失の可能性を最小限にすることができる。
【0097】
一実施形態では、組成物中の酵素（複数可）は、酸に接触する際に（すなわち、胃の中で）活性化される。
【0098】
別の態様では、ネプロシン、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、それらの変異体またはそれらの組み合わせを含む食品製品が提供される。いくつかの実施形態では、食品製品は、グルテンを含むか、グルテンを含む疑いがあり、例えば、コムギ、ライムギ及びオオムギから作られたベーカリ製品（例えば、ケーキ、マフィン、ドーナツ、ペーストリー、ロールパン及びパン）、パスタ、クラッカー、トルティーヤチップス、シリアルなどである。いくつかの実施形態では、食品製品は、グルテンを含むか、グルテンを含む疑いがある別の食品製品とともに摂取され得る。そのような食品の非限定例としては、粉末、スプレッド、スプレー、ソース、ディップ、ホイップクリーム、キャンディー、チューインガム、シロップ、砂糖、塩、サラダドレッシング、香辛料、チーズ、バター、マーガリン、スプレッド、バター、揚げ用ショートニング、マヨネーズ、乳製品、ナッツバター、種子バター、カーネルバター、ピーナッツバターなどが挙げられる。
【0099】
いくつかの実施形態では、ネプロシン、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、それらの変異体またはそれらの組み合わせを含む組成物は、食品と混合されるか、グルテンを含む食材を前処理するのに使用される。食品中に存在する組成物は、摂取より前にまたは摂取の間に食品中のグルテンレベルを低減するように、酵素的に活性であり得る。
【0100】
本発明の一態様では、ネプロシン、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、それらの変異体またはそれらの組み合わせを含む組成物は、食品が摂取される前に食品に加えられる。一実施形態では、本発明は、グルテンを消化するために内部賦形剤及び有効量の医薬組成物を含むディスペンサーに関する。一実施形態では、医薬組成物及び／または内部賦形剤は、食品が摂取される前に食品に加えられる。一実施形態では、食品はグルテンを含むか、グルテンを含むことが疑われる。一実施形態では、内部賦形剤は、塩化ナトリウムまたはヨウ化ナトリウムまたはそれらの混合物を含む。一実施形態では、医薬組成物及び／または内部賦形剤は、前記ディスペンサーから効率的に分配するようにサイズを合わせられた、顆粒形態である。
【0101】
いくつかの実施形態では、組成物（医薬組成物または食用に適する組成物など）または食品製品は、約０．１％～約９９％、約０．５％～約９５％、約１％～約９５％、約５％～約９５％、約１０％～約９０％、約２０％～約８０％、約２５％～約７５％の酵素（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、組成物（医薬組成物または食用に適する組成物など）または食品製品中の酵素の量は、組成物または食品製品の全体の約０．０１％、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％、またはこれらの値のうちの任意の２つの間の範囲（端点を含む）である。
【0102】
いくつかの実施形態では、組成物は、ネプロシン及びネペンテシンまたはそれらの変異体を含む。いくつかの実施形態では、ネペンテシンは、ネペンテシンＩ及び／またはネペンテシンＩＩまたはそれらの変異体である。いくつかの実施形態では、ネペンテシンは、組換えネペンテシンＩ及び／または組換えネペンテシンＩＩまたはそれらの変異体である。いくつかの実施形態では、ネペンテシンは、組換えネペンテシンＩ及び組換えネペンテシンＩＩまたはそれらのそれぞれの変異体である。いくつかの実施形態では、ネプロシンは、組換えネプロシンまたはその変異体である。好ましい実施形態では、組成物は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ種由来のネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及び／若しくはネプロシンのアミノ酸配列（複数可）を含む、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及び／若しくはネプロシンまたはそれらの変異体（複数可）を含む。
【0103】
ネペンテシンＩのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列は、いくつかのＮｅｐｅｎｔｈｅｓ種、例えば、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ４９４４０１）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１１４９１４）及びＮｅｐｅｎｔｈｅｓ ａｌａｔａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ２６６８０３）から記載されている。ネペンテシンＩＩのｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ配列は、いくつかのＮｅｐｅｎｔｈｅｓ種、例えば、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ４９４４０２）及びＮｅｐｅｎｔｈｅｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１１４９１５）から記載されている。
【0104】
ネペンテシンＩのタンパク質配列は、いくつかのＮｅｐｅｎｔｈｅｓ種、例えば、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＶ２６０２４；配列番号５）、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＤ０７４７４；配列番号７）及びＮｅｐｅｎｔｈｅｓ ａｌａｔａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＦ９８９１５；配列番号６）から記載されている。ネペンテシンＩＩのタンパク質配列は、いくつかのＮｅｐｅｎｔｈｅｓ種、例えば、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦＶ２６０２５；配列番号８）及びＮｅｐｅｎｔｈｅｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＤ０７４７５；配列番号９）から記載されている。これらの配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０１８６３３０号にも見出される。
【0105】
本明細書で提供されるＧｅｎＢａｎｋ受託番号によって表される配列のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0106】
いくつかの実施形態では、ネペンテシンは、ネペンテシンＩのアミノ酸配列（例えば、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号２１）に対して少なくとも約８５％の配列相同性を有する、ネペンテシンの変異体である。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９６％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９７％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９８％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９９％の配列相同性を有する。一実施形態では、ネペンテシンは、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【0107】
いくつかの実施形態では、ネペンテシンは、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列（例えば、配列番号８、配列番号９または配列番号２２）に対して少なくとも約８５％の配列相同性を有する、ネペンテシンの変異体である。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９６％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９７％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９８％の配列相同性を有する。いくつかの実施形態では、変異体は、ネペンテシンＩＩのアミノ酸配列に対して少なくとも約９９％の配列相同性を有する。一実施形態では、ネペンテシンは、配列番号８、配列番号９または配列番号２２のアミノ酸配列を含む。
【0108】
本発明の一態様では、組成物中のネプロシンとネペンテシンＩ及び／またはＩＩの比は、グルテン不耐症、セリアック病、コムギアレルギー、若しくはヘルペス状皮膚炎、対象の腸における炎症、ＩＥＬの増殖若しくは漸増、上皮内のリンパ球増加、及び／若しくは絨毛萎縮、またはそれらの任意の症状を予防するために、ペプチド性食品抗原が十分に小さな及び／または無害のフラグメントに切断されるような比である。いくつかの実施形態では、ネプロシン：ネペンテシンの比は、約１：１００～約１００：１の間である。
【0109】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１００：１のネプロシンとネペンテシン（ネペンテシンＩ及び／またはＩＩ）の比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約９０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約７０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約６０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約５０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約４０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約３０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約２０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約５：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約４：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約３：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約２：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：２のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：３のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：４のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：５のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：１０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：２０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：３０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：４０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：５０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：６０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：７０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：８０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：９０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：１００のネプロシンとネペンテシンの比を含む。
【0110】
本発明の一態様では、組成物中のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比は、対象の腸における、炎症、ＩＥＬの増殖若しくは漸増、上皮内のリンパ球増加、及び／または絨毛萎縮を予防するために、ペプチド性食品抗原が十分に小さな及び／または無害のフラグメントに切断されるような比である。いくつかの実施形態では、ネペンテシンＩ：ネペンテシンＩＩの比は、約１：１００～約１００：１の間である。
【0111】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１００：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約９０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約７０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約６０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約５０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約４０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約３０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約２０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約５：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約４：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約３：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約２：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：２のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：３のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：４のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：５のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：１０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：２０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：３０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：４０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：５０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：６０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：７０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：８０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：９０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも約１：１００のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。
【0112】
ＩＶ．調製方法
ネペンテシン及び／またはネプロシンを、当技術分野で既知の方法、例えば（限定されないが）、濾過または固定化されたペプスタチンに基づく親和性精製によって、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓなどの植物の嚢状葉分泌物を含めた天然源から、濃縮（若しくは抽出）または精製できることが予期される。伝統的なタンパク質クロマトグラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル浸透クロマトグラフィーとしても知られる）及び／またはクロマトフォーカシングクロマトグラフィーを使用して、ネペンテシン及び／またはネプロシンを濃縮（若しくは抽出）または精製することもできる。クロマトフォーカシングは、サイズ排除より前に使用してもよいし、後に使用してもよい。ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及びネプロシンは、天然の植物分泌物中に比較的小量で見出される。ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及び／またはネプロシンの生成は、例えば、増大した量の所望の酵素（複数可）またはその変異体を発現及び／または分泌するトランスジェニック植物を作出するための生物工学技術を使用して、増大させることができる。
ネペンテシン及び／またはネプロシンを、当技術分野で既知の方法、例えば（限定されないが）、濾過または固定化されたペプスタチンに基づく親和性精製によって、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓなどの植物の嚢状葉分泌物を含めた天然源から、濃縮（若しくは抽出）または精製できることが予期される。伝統的なタンパク質クロマトグラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル浸透クロマトグラフィーとしても知られる）及び／またはクロマトフォーカシングクロマトグラフィーを使用して、ネペンテシン及び／またはネプロシンを濃縮（若しくは抽出）または精製することもできる。クロマトフォーカシングは、サイズ排除より前に使用してもよいし、後に使用してもよい。ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及びネプロシンは、天然の植物分泌物中に比較的小量で見出される。ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及び／またはネプロシンの生成は、例えば、増大した量の所望の酵素（複数可）またはその変異体を発現及び／または分泌するトランスジェニック植物を作出するための生物工学技術を使用して、増大させることができる。
【0113】
植物源から単離されることに加えて、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはその変異体は、化学合成によって調製され得る。化学合成は、所望の酵素または変異体の配列に従ってアミノ酸をカップリングすることによって達成することができる。ペプチドまたはタンパク質を合成するのに、様々なペプチドカップリング方法及び市販のペプチド合成機器が利用可能であり、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．、Ｂｅｃｋｍａｎ及び他の製造者による自動合成機である。
【0114】
別の態様では、細胞が酵素（複数可）を生成することができるように、酵素（複数可）のＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）及び／または伝令ＲＮＡで細胞を形質転換すること、またはこれらを細胞にトランスフェクトすることによる、組換え生成系を使用して、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはその変異体を調製する方法が提供される。例えば、ネペンテシンは、生物体、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ及び植物細胞培養、例えばタバコ細胞などにおいて、宿主－ベクター系を確立することによって生成することができる。
【0115】
ポリヌクレオチドを含むベクター及びＥ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞、及び本明細書に記載の及びポリヌクレオチドまたはポリペプチドのうちのいずれかを含む組成物も提供される。
【0116】
別の態様では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素（ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及び／若しくはネプロシンまたはそれらの変異体）を生成する方法であって、前記酵素をコードする核酸配列を選択された宿主生物中で発現すること、及び適切に設計されたベクターに核酸配列を挿入することを含む方法が提供される。一態様では、組換え酵素はネペンテシンＩまたはその変異体である。一態様では、組換え酵素はネペンテシンＩＩまたはそれらの変異体である。一態様では、組換え酵素はネプロシンまたはその変異体である。一態様では、組換え酵素は、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及び／若しくはネプロシンまたはそれらの変異体の混合物である。
【0117】
別の態様では、ネペンテシンＩ及び／若しくはネペンテシンＩＩまたはそれらの変異体などの組換えネペンテシンを含む組成物が提供される。一態様では、組換えネペンテシンはネペンテシンＩまたはそれらの変異体である。一態様では、組換えネペンテシンはネペンテシンＩＩまたはそれらの変異体である。一態様では、組換えネペンテシンは、ネペンテシンＩ及びネペンテシンＩＩまたはそれらの変異体の混合物である。
【0118】
一態様では、本発明は、本明細書に記載のｃＤＮＡに関する。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のｃＤＮＡを含むベクターに関する。好ましい実施形態では、ベクターは発現ベクターである。一実施形態では、本発明は、組換えネペンテシンＩ、組換えネペンテシンＩＩ、組換えネプロシン、それらの変異体または混合物を発現する細胞に関する。
【0119】
いくつかの実施形態では、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素（複数可）の生合成は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡ、例えば、配列番号４、配列番号５、配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ４９４４０１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢｌ１４９１４またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ２６６８０３）のヌクレオチド配列を含むベクターで細胞を形質転換することによって達成することができる。いくつかの実施形態では、ネペンテシンの生合成は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに相同な配列（この配列は、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする）を含むベクターで細胞を形質転換することによって達成することができる。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約６０％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約７０％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約８０％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約８５％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９０％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９５％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９６％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９７％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９８％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９９％の相同性を有し得る。好ましい実施形態では、配列は、グルテナーゼ活性を保持する、ネペンテシンＩの変異体をコードする。特に好ましい実施形態では、配列は、少なくとも１種の有毒なグルテンペプチドを分解する、ネペンテシンＩの変異体をコードする。
【0120】
いくつかの実施形態では、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素（複数可）の生合成は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡ、例えば配列番号８、配列番号９（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＪＸ４９４４０２またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ１１４９１５）のヌクレオチド配列を含むベクターで細胞を形質転換することによって達成することができる。いくつかの実施形態では、ネペンテシンの生合成は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに相同な配列（この配列は、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする）を含むベクターで細胞を形質転換することによって達成することができる。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約６０％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約７０％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約８０％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約８５％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９０％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９５％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９６％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９７％の相同性を有し得る。、配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９８％の相同性を有し得る。配列は、ネペンテシンＩＩをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９９％の相同性を有し得る。好ましい実施形態では、配列は、グルテナーゼ活性を保持する、ネペンテシンＩＩの変異体をコードする。特に好ましい実施形態では、配列は、少なくとも１種の有毒なグルテンペプチドを分解する、ネペンテシンＩＩの変異体をコードする。
【0121】
いくつかの実施形態では、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素（複数可）の生合成は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡ、例えば、配列番号２のヌクレオチド配列を含むベクターで細胞を形質転換することによって達成することができる。いくつかの実施形態では、ネプロシンの生合成は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに相同な配列（この配列は、プロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードする）を含むベクターで細胞を形質転換することによって達成することができる。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約６０％の相同性を有し得る。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約７０％の相同性を有し得る。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約８０％の相同性を有し得る。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約８５％の相同性を有し得る。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９０％の相同性を有し得る。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９５％の相同性を有し得る。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９６％の相同性を有し得る。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９７％の相同性を有し得る。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９８％の相同性を有し得る。配列は、ネプロシンをコードするｃＤＮＡに対して少なくとも約９９％の相同性を有し得る。好ましい実施形態では、配列は、プロリルエンドプロテアーゼ活性を保持する、ネプロシンの変異体をコードする。特に好ましい実施形態では、配列は、グルテナーゼ活性を保持する、ネプロシンの変異体をコードする。特に好ましい実施形態では、配列は、少なくとも１種の有毒なグルテンペプチドを分解する、ネプロシンの変異体をコードする。
【0122】
理論に拘束されないが、罹患者の腸におけるグルテンに対する炎症応答は、有毒な（免疫毒性の）グルテンペプチドの形成をもたらす、グルテンタンパク質の不完全な加水分解が原因であると考えられる。いくつかの免疫毒性の及び／または免疫毒性の可能性があるグルテンペプチドが既知である。これらとしては、限定されないが、α－グリアジン由来の３３－ｍｅｒ（配列番号１５、ＬＱＬＱＰＦ（ＰＱＰＱＬＰＹ）３ＰＱＰＱＰＦ）及びｐ３１－４９（配列番号１６、ＬＧＱＱＱＰＦＰＰＱＱＰＹＰＱＰＱＰＦ）；低分子量グルテニン由来のＧｌｙ－１５６（配列番号１７、ＱＱＱＱＰＰＦＳＱＱＱＱＳＰＦＳＱＱＱＱ）；ならびに高分子量グルテニン由来のノナペプチドリピート（配列番号１８、ＧＹＹＰＴＳＰＱＱ）及びヘキサペプチドリピート（配列番号１９、ＰＧＱＧＱＱ）が挙げられる。
【0123】
いくつかの実施形態では、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン及び／またはそれらの変異体は、所望の各酵素のｃＤＮＡ配列を含む１種または複数のベクターを細胞にトランスフェクトする、これらを細胞に感染させる、またはこれらで細胞を形質転換することによって合成される。すなわち、２種以上の酵素を生成するように、単一細胞、細胞系統また生物体を遺伝子操作することができる。いくつかの実施形態では、所望の酵素は、別々の細胞によって合成され、医薬組成物中で組み合わされる。好ましい実施形態では、組換えネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン及び／またはそれらの変異体は、グリコシル化されない。一実施形態では、組換えネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ、ネプロシン及び／またはそれらの変異体は、天然の酵素（すなわち、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ植物から単離したネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩまたはネプロシン）とは異なるグリコシル化パターンを有する。
【0124】
合成（例えば、組換え）Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素（複数可）は、既知の方法、例えば、植物の嚢状葉液体からＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素（複数可）を単離する方法に従って、濃縮または精製することができる。
【0125】
いくつかの実施形態では、天然源または合成（例えば、組換え）源から単離したタンパク質生成物は、少なくとも２０重量％の少なくとも１種のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、単離したタンパク質生成物は、少なくとも約５０％、約７５％、約９０％、約９５重量％のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、単離したタンパク質生成物は、少なくとも９９重量％のＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはその変異体を含む。
【0126】
いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはその変異体は、組換えネペンテシンまたはその変異体のみを実質的に含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンまたはその変異体は、組換えネペンテシンＩまたはそれらの変異体のみを実質的に含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンまたはその変異体は、ネペンテシンＩＩまたはその変異体のみを実質的に含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンまたはその変異体は、ネペンテシンＩ及びネペンテシンＩＩまたはそれらの変異体を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンまたはその変異体は、少なくとも約１００：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩ（またはそれらのそれぞれの変異体）の比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約９０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約７０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約６０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約５０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約４０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約３０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約２０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１０：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約５：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約４：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約３：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約２：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：１のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：２のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：３のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：４のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：５のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：１０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：２０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：３０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：４０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：５０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：６０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：７０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：８０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：９０のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えネペンテシンは、少なくとも約１：１００のネペンテシンＩとネペンテシンＩＩの比を含む。
【0127】
いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはそれらの変異体は、組換えネプロシンまたはその変異体のみを実質的に含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはその変異体は、ネプロシン及びネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはその変異体は、ネプロシン及びネペンテシンＩまたはそれらの変異体を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはその変異体は、ネプロシン及びネペンテシンＩＩまたはそれらの変異体を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはその変異体は、ネプロシン、ネペンテシンＩ及びネペンテシンＩＩまたはそれらの変異体を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素またはその変異体は、少なくとも約１００：１のネプロシンとネペンテシン（またはそれらのそれぞれの変異体）の比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約９０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約７０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約６０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約５０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約４０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約３０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約２０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１０：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約５：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約４：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約３：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約２：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：１のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：２のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：３のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：４のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：５のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：１０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：２０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：３０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：４０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：５０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：６０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：７０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：８０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：９０のネプロシンとネペンテシンの比を含む。いくつかの実施形態では、組換えＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は、少なくとも約１：１００のネプロシンとネペンテシンの比を含む。
【0128】
いくつかの実施形態では、天然源または合成源から単離したタンパク質生成物は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩのアミノ酸配列（例えば、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号２１）に対して少なくとも約７０％相同なアミノ酸を含む。一実施形態では、タンパク質生成物はプロテアーゼ活性を保持する。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩに対して少なくとも約８０％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩに対して少なくとも約８５％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩに対して少なくとも約９０％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩになくとも約９５％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩに対して少なくとも約９６％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩに対して少なくとも約９７％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩに対して少なくとも約９８％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩに対して少なくとも約９９％相同であり得る。
【0129】
いくつかの実施形態では、天然源または合成源から単離したタンパク質生成物は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩＩ（例えば、配列番号８、配列番号９、配列番号２０）に対して少なくとも約７０％相同なタンパク質を含む。一実施形態では、タンパク質生成物はプロテアーゼ活性を保持する。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩＩに対して少なくとも約８０％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩＩに対して少なくとも約８５％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩＩに対して少なくとも約９０％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩＩに対して少なくとも約９５％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩＩに対して少なくとも約９６％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩＩに対して少なくとも約９７％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩＩに対して少なくとも約９８％相同であり得る。タンパク質は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩＩに対して少なくとも約９９％相同であり得る。
【0130】
いくつかの実施形態では、天然源または合成源から単離したタンパク質生成物は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓのネプロシン（例えば、配列番号１）に対して少なくとも約７０％相同なタンパク質を含む。一実施形態では、タンパク質生成物はプロテアーゼ活性を保持する。タンパク質は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓのネプロシンに対して少なくとも約８０％相同であり得る。タンパク質は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓのネプロシンに対して少なくとも約８５％相同であり得る。タンパク質は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓのネプロシンに対して少なくとも約９０％相同であり得る。タンパク質は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓのネプロシンに対して少なくとも約９５％相同であり得る。タンパク質は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓのネプロシンに対して少なくとも約９６％相同であり得る。タンパク質は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓのネプロシンに対して少なくとも約９７％相同であり得る。タンパク質は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓのネプロシンに対して少なくとも約９８％相同であり得る。タンパク質は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓのネプロシンに対して少なくとも約９９％相同であり得る。
【0131】
いくつかの実施形態では、天然源または合成源から単離したタンパク質生成物は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約１０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約２０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約３０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約４０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約５０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約６０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約７０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約８０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約９０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩの本来のプロテアーゼ活性の約１００％越を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。
【0132】
いくつかの実施形態では、天然源または合成源から単離したタンパク質生成物は、ＮｅｐｅｎｔｈｅｓのネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約１０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約２０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約３０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約４０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約５０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約６０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約７０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約８０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約９０％を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネペンテシンＩＩの本来のプロテアーゼ活性の約１００％越を有するネペンテシンまたはその変異体を含む。
【0133】
いくつかの実施形態では、天然源または合成源から単離したタンパク質生成物は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓのネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約１０％を有するネプロシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約２０％を有するネプロシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約３０％を有するネプロシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約４０％を有するネプロシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約５０％を有するネプロシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約６０％を有するネプロシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約７０％を有するネプロシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約８０％を有するネプロシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の少なくとも約９０％を有するネプロシンまたはその変異体を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質生成物は、ネプロシンの本来のプロテアーゼ活性の約１００％越を有するネプロシンまたはその変異体を含む。
【0134】
別段の記載がない限り、本明細書全体にわたって使用される省略形は、以下の意味を有する：
ｇ＝グラム
ｋＤａ＝キロダルトン
ｋｇ＝キログラム
Ｌ＝リットル
ＬＣ＝液体クロマトグラフィー
ｍｇ＝ミリグラム
ｍｉｎ＝分
ｍＬ＝ミリリットル
ｍＭ＝ミリモル
ＭＳ＝質量分析
ｎＭ＝ナノモル
ｐＭ＝ピコモル
ｓ．ｄ．＝標準偏差
μＣｉ＝マイクロキュリー
μｇ＝マイクログラム
μＬ＝マイクロリットル
μＭ＝マイクロモル
μｍ＝マイクロメートル
℃＝セルシウス度
ｇ＝グラム
ｋＤａ＝キロダルトン
ｋｇ＝キログラム
Ｌ＝リットル
ＬＣ＝液体クロマトグラフィー
ｍｇ＝ミリグラム
ｍｉｎ＝分
ｍＬ＝ミリリットル
ｍＭ＝ミリモル
ＭＳ＝質量分析
ｎＭ＝ナノモル
ｐＭ＝ピコモル
ｓ．ｄ．＝標準偏差
μＣｉ＝マイクロキュリー
μｇ＝マイクログラム
μＬ＝マイクロリットル
μＭ＝マイクロモル
μｍ＝マイクロメートル
℃＝セルシウス度
【0135】
これらの１文字記号は、アミノ酸を表す場合、以下の意味を有する：
Ａ＝アラニン
Ｒ＝アルギニン
Ｎ＝アスパラギン
Ｄ＝アスパラギン酸
Ｃ＝システイン
Ｅ＝グルタミン酸
Ｑ＝グルタミン
Ｇ＝グリシン
Ｈ＝ヒスチジン
Ｉ＝イソロイシン
Ｌ＝ロイシン
Ｋ＝リジン
Ｍ＝メチオニン
Ｆ＝フェニルアラニン
Ｐ＝プロリン
Ｓ＝セリン
Ｔ＝トレオニン
Ｗ＝トリプトファン
Ｙ＝チロシン
Ｖ＝バリン
Ａ＝アラニン
Ｒ＝アルギニン
Ｎ＝アスパラギン
Ｄ＝アスパラギン酸
Ｃ＝システイン
Ｅ＝グルタミン酸
Ｑ＝グルタミン
Ｇ＝グリシン
Ｈ＝ヒスチジン
Ｉ＝イソロイシン
Ｌ＝ロイシン
Ｋ＝リジン
Ｍ＝メチオニン
Ｆ＝フェニルアラニン
Ｐ＝プロリン
Ｓ＝セリン
Ｔ＝トレオニン
Ｗ＝トリプトファン
Ｙ＝チロシン
Ｖ＝バリン
【実施例】
【0136】
実施例１．ネペンテシン抽出物の調製
化学物質
Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ ＪａｃｋｓｏｎのＨＰＬＣグレードの水及びアセトニトリルをＶＷＲから購入した。ギ酸、トリス及びグリシンをＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
化学物質
Ｂｕｒｄｉｃｋ ａｎｄ ＪａｃｋｓｏｎのＨＰＬＣグレードの水及びアセトニトリルをＶＷＲから購入した。ギ酸、トリス及びグリシンをＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【0137】
植物培養
Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｒａｆｆｌｅｓｉａｎａ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ａｍｐｕｌａｒｉａ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＮｅｐｅｎｔｈｅｓ ｇｌｏｂｏｓａの移植体をＫｅｅｈｎｓ Ｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ（ｗｗｗ．ｋｅｅｈｎｓｃａｍｉｖｏｒｅｓ．ｃａ）から購入した。これらを、木材の樹皮、パーライト、ピートモス及び腐植土（それぞれ、４０、３５、１０、５％）を用いて鉢植した。生育条件は、１日あたり１４時間の光、湿度８０％及び２３℃～２８℃の範囲の温度を要し、週に２～３回灌水した。嚢状葉が成熟すると、嚢状葉あたり１または２匹のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａを植物に与え、１週間後に嚢状葉液を採取した。嚢状葉及びその分泌物をそのままにして１週間回復させてから、２回目の給餌及び抽出を行った。
Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｒａｆｆｌｅｓｉａｎａ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ａｍｐｕｌａｒｉａ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ及びＮｅｐｅｎｔｈｅｓ ｇｌｏｂｏｓａの移植体をＫｅｅｈｎｓ Ｃａｒｎｉｖｏｒｅｓ（ｗｗｗ．ｋｅｅｈｎｓｃａｍｉｖｏｒｅｓ．ｃａ）から購入した。これらを、木材の樹皮、パーライト、ピートモス及び腐植土（それぞれ、４０、３５、１０、５％）を用いて鉢植した。生育条件は、１日あたり１４時間の光、湿度８０％及び２３℃～２８℃の範囲の温度を要し、週に２～３回灌水した。嚢状葉が成熟すると、嚢状葉あたり１または２匹のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａを植物に与え、１週間後に嚢状葉液を採取した。嚢状葉及びその分泌物をそのままにして１週間回復させてから、２回目の給餌及び抽出を行った。
【0138】
抽出物の調製
４種の植物すべてから嚢状葉液を収集し、混ぜ合わせた。この粗嚢状葉液を、最初に、０．２２μｍフィルターを通して清澄化し、次いで、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心１０ｋＤａ分子量カットオフフィルターを使用して、８０～１００倍に濃縮した（両方ともＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）。消化に使用する前に、この濃縮物を、１００ｍＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．５）で３時間酸活性化し、次いで、洗浄ごとに１０倍の流体量を使用して、濾過装置中で、１００ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で３回洗浄した。次いで、嚢状葉液の元のサンプリングに基づいて、最終的な単離物を１１倍の濃度に再び希釈した。
４種の植物すべてから嚢状葉液を収集し、混ぜ合わせた。この粗嚢状葉液を、最初に、０．２２μｍフィルターを通して清澄化し、次いで、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心１０ｋＤａ分子量カットオフフィルターを使用して、８０～１００倍に濃縮した（両方ともＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）。消化に使用する前に、この濃縮物を、１００ｍＭグリシンＨＣｌ（ｐＨ２．５）で３時間酸活性化し、次いで、洗浄ごとに１０倍の流体量を使用して、濾過装置中で、１００ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．５）で３回洗浄した。次いで、嚢状葉液の元のサンプリングに基づいて、最終的な単離物を１１倍の濃度に再び希釈した。
【0139】
嚢状葉液抽出物の特徴づけ
嚢状葉植物の分泌液を濃縮し、ｐＨを低下（ｐＨ２．５）させることにより、消化酵素を活性化した。プロテオミクス法を使用して、流体プロテオームに対する濃縮プロセス及び活性化の影響を決定した。最初に、ネペンテシン酵素の存在を確認するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって不活性濃縮物を分離した。非常に弱くクーマシー染色された７つの連続的なゲル領域をトリプシンで消化し、標準的な方法を使用して、ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。これは、活性化された流体プロテオームの完全なカタログであることは期待されないが、この分析によって、アスパラキン酸プロテアーゼのネペンテシンＩ／ＩＩの存在、ならびに植物起源のグルカナーゼ、キチナーゼ、カルボキシペプチダーゼ及びペルオキシダーゼ、これらに加えてショウジョウバエ及び細菌の中程度のレベルの混入物が確認された。流体プロテオーム複雑性の低さは、最近の分析、Ｈａｔａｎｏ Ｎ，Ｈａｍａｄａ Ｔ（２０１２）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｐｒｅｙ ｉｎ ｐｉｔｃｈｅｒ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ ｐｌａｎｔ Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ａｌａｔａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ３；７５（１５）：４８４４－５２（Ｅｐｕｂ Ｊｕｎ．１５，２０１２）と矛盾がないが、本分析において、ネペンテシン－Ｉがより広い質量範囲（４０～７０ｋＤａ）にわたって分布していることが分かった。
嚢状葉植物の分泌液を濃縮し、ｐＨを低下（ｐＨ２．５）させることにより、消化酵素を活性化した。プロテオミクス法を使用して、流体プロテオームに対する濃縮プロセス及び活性化の影響を決定した。最初に、ネペンテシン酵素の存在を確認するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって不活性濃縮物を分離した。非常に弱くクーマシー染色された７つの連続的なゲル領域をトリプシンで消化し、標準的な方法を使用して、ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。これは、活性化された流体プロテオームの完全なカタログであることは期待されないが、この分析によって、アスパラキン酸プロテアーゼのネペンテシンＩ／ＩＩの存在、ならびに植物起源のグルカナーゼ、キチナーゼ、カルボキシペプチダーゼ及びペルオキシダーゼ、これらに加えてショウジョウバエ及び細菌の中程度のレベルの混入物が確認された。流体プロテオーム複雑性の低さは、最近の分析、Ｈａｔａｎｏ Ｎ，Ｈａｍａｄａ Ｔ（２０１２）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｐｒｅｙ ｉｎ ｐｉｔｃｈｅｒ ｆｌｕｉｄ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ ｐｌａｎｔ Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ ａｌａｔａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ３；７５（１５）：４８４４－５２（Ｅｐｕｂ Ｊｕｎ．１５，２０１２）と矛盾がないが、本分析において、ネペンテシン－Ｉがより広い質量範囲（４０～７０ｋＤａ）にわたって分布していることが分かった。
【0140】
次いで、酸活性化した流体を同様の方式で処理し、分析した。活性化プロセスは、全タンパク質の収量を低減し、また、組成物を単純化するように思われた。ネペンテシン－Ｉの他には、ケラチン及びアクチン由来の微量な混入物のみが見られた。これらの分析は、濃縮された流体の複雑性が低く、ここでは、ネペンテシンが主要な成分であることを指摘する。活性化及び８０倍に濃縮された流体の全タンパク質の濃度は、ＢＣＡアッセイによって２２ｎｇ／μＬと測定された。この値は、流体の濃縮を記載する以前の研究と矛盾がない。Ｔｏｋｅｓ ＺＡら，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ Ｃａｒｎｉｖｏｒｏｕｓ Ｐｌａｎｔ Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ－Ｍａｃｆｅｒｌａｎｅｉ－Ｌ．Ｐｌａｎｔａ １１９（１）：３９－４６（１９７４）。
【0141】
実施例２：ネペンテシン抽出物の精製
抽出物の精製
５０×２ｃｍのＩＤカラム中のセファロース固定化ペプスタチンを、２０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．５～３中で平衡化した。濾過した嚢状葉液（実施例１に記載されているように調製）を、カラムを通して２回循環させ、このカラムを１００ｍＬの平衡化緩衝液（２０ｍＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ２．５）で洗浄した。このカラムを１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムｐＨ８．７で溶出し、画分を収集した。最大酵素活性を保つために、画分を収集した直後に、２ＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ２．５でｐＨを４に低下させた。消化アッセイを使用して活性を確認し、最も活性な画分を混ぜ合わせ、元の流体量に基づいて、およそ８０倍に濃縮した。
抽出物の精製
５０×２ｃｍのＩＤカラム中のセファロース固定化ペプスタチンを、２０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．５～３中で平衡化した。濾過した嚢状葉液（実施例１に記載されているように調製）を、カラムを通して２回循環させ、このカラムを１００ｍＬの平衡化緩衝液（２０ｍＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ２．５）で洗浄した。このカラムを１００ｍＭ炭酸水素アンモニウムｐＨ８．７で溶出し、画分を収集した。最大酵素活性を保つために、画分を収集した直後に、２ＭグリシンＨＣｌ、ｐＨ２．５でｐＨを４に低下させた。消化アッセイを使用して活性を確認し、最も活性な画分を混ぜ合わせ、元の流体量に基づいて、およそ８０倍に濃縮した。
【0142】
Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓの流体及び／または抽出物において検出可能レベルで発見された唯一のエンドプロテアーゼは、アスパラキン酸プロテアーゼ及びプロリルエンドプロテアーゼである。
【0143】
実施例３：組換えネペンテシンＩ
ネペンテシンＩ（配列番号４；植物のシグナル配列を有さない、Ｎ．ｇｒａｃｉｌｉｓ由来のアミノ酸残基２０～４１３をコードする））の遺伝子をネペンテシンＩのｃＤＮＡから調製し、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限部位の間に配置した。この配列を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ、ＮＥＢ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、ＡＴＰ（０．５ｍＭ）（ＮＥＢ）、０．５μｇのｐＥＴ２１ａベクター及び２μｇのネペンテシンＩのｃＤＮＡを使用して、ｐＥＴ２１ａにクローニングした。これを１８℃で４時間インキュベートした。このライゲーション混合物（５μＬ）を２００μＬのＮｏｖａＢｌｕｅコンピテントセルに加え、氷上で１５分間インキュベートした。細胞をヒートショック（４２℃で４５秒、次いで、１ｍｌのＬＢ培地とともに直ちに氷上）によって形質転換し、３７℃で１時間インキュベートし、抗生物質（テトラサイクリン及びアンピシリン）とともにプレーティングした。いくつかの白コロニーにおいて遺伝子の存在を確認した後に、代表的なコロニーを選択して、マキシプレップを行った。得られた組換えプラスミドｐＥＴ２１ａ／Ｒ．ＮｅｐＩを上記のようにヒートショックによってＥ．ｃｏｌｉ Ｃ４１に形質転換し、ＩＰＴＧによる誘導下で発現させた。ここでは、０．６のＯＤ６６０まで細胞を増殖させ、０．１ｍＭのＩＰＴＧで、３７℃で４時間誘導した。発現したタンパク質は封入体となった。
ネペンテシンＩ（配列番号４；植物のシグナル配列を有さない、Ｎ．ｇｒａｃｉｌｉｓ由来のアミノ酸残基２０～４１３をコードする））の遺伝子をネペンテシンＩのｃＤＮＡから調製し、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限部位の間に配置した。この配列を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ、ＮＥＢ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、ＡＴＰ（０．５ｍＭ）（ＮＥＢ）、０．５μｇのｐＥＴ２１ａベクター及び２μｇのネペンテシンＩのｃＤＮＡを使用して、ｐＥＴ２１ａにクローニングした。これを１８℃で４時間インキュベートした。このライゲーション混合物（５μＬ）を２００μＬのＮｏｖａＢｌｕｅコンピテントセルに加え、氷上で１５分間インキュベートした。細胞をヒートショック（４２℃で４５秒、次いで、１ｍｌのＬＢ培地とともに直ちに氷上）によって形質転換し、３７℃で１時間インキュベートし、抗生物質（テトラサイクリン及びアンピシリン）とともにプレーティングした。いくつかの白コロニーにおいて遺伝子の存在を確認した後に、代表的なコロニーを選択して、マキシプレップを行った。得られた組換えプラスミドｐＥＴ２１ａ／Ｒ．ＮｅｐＩを上記のようにヒートショックによってＥ．ｃｏｌｉ Ｃ４１に形質転換し、ＩＰＴＧによる誘導下で発現させた。ここでは、０．６のＯＤ６６０まで細胞を増殖させ、０．１ｍＭのＩＰＴＧで、３７℃で４時間誘導した。発現したタンパク質は封入体となった。
【0144】
封入体を以下のように単離した。細胞を遠心分離し、ショ糖溶解バッファー（２５％サッカロース、５０ｍＭトリスＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＮａＮ３及びプロテアーゼ阻害剤）を加え、細胞を４ラウンドの凍結／融解及び超音波処理にかけた。これに続いて、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを加えて、室温で３０分間インキュベートした。この調製物を遠心分離（５０００×ｇで約１５分）して、封入体及び膜フラグメントをペレットにした。このペレットをトリトン緩衝液（５０ｍＭトリスＣｌ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ β－メルカプトエタノール、１ｍＭ ＮａＮ３、０．５％トリトンＸ１００＋プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、氷上で超音波処理を行った。これを再度遠心分離して、封入体をペレットにし、このペレットを、トリトンを含んでいない緩衝液（５０ｍＭトリスＣｌ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ β－メルカプトエタノール、１ｍＭ ＮａＮ３、プロテアーゼ阻害剤）中で、（混合及び超音波処理を行いながら）氷上で２回洗浄した。
【0145】
次いで、タンパク質ペレットをリフォールディングにかけた。１ｇの封入体を、１Ｌの５０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１０．５、８Ｍ尿素、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭグリシン、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ β－メルカプトエタノールに懸濁し、１時間振盪した。この懸濁液を、５０ｍＭトリス、ｐＨ１１に対して、１回に１時間で２回透析し、続いて、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５に対して１日透析し、最後に、３００ｍＭ ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液、ｐＨ７．０に対して透析した。
【0146】
溶液を高速（１００００×ｇ、１５分間）で遠心分離して、いかなるリフォールディングされていないタンパク質も除去し、上清を、０．２２μｍの膜を通して濾過した。ネペンテシンＩを、ｐＨ２．５（グリシン－ＨＣｌ）で、４℃で一晩活性化した。収量は、１Ｌの細胞培養から出発して、１０～１００ｍｇのフォールディングされた活性化タンパク質の範囲にわたる。
【0147】
実施例４：組換えネペンテシンＩＩ
植物のシグナル配列を有さない、Ｎ．ｇｒａｃｉｌｉｓ由来のネペンテシンＩＩのｃＤＮＡ（配列番号１４を参照されたい）を使用して、ネペンテシンＩＩのｃＤＮＡを調製した。この配列を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ、ＮＥＢ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、ＡＴＰ（０．５ｍＭ）（ＮＥＢ）、０．５μｇのｐＥＴ２１ａベクター及び２μｇのネペンテシンＩＩのｃＤＮＡを使用して、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限部位の間でｐＥＴ２１ａにクローニングした。これを１８℃で４時間インキュベートした。このライゲーション混合物（５μＬ）を２００μＬのＮｏｖａＢｌｕｅコンピテントセルに加え、氷上で１５分間インキュベートした。細胞をヒートショック（４２℃で４５秒、次いで、１ｍｌのＬＢ培地とともに直ちに氷上）によって形質転換し、３７℃で１時間インキュベートし、抗生物質（テトラサイクリン及びアンピシリン）とともにプレーティングした。いくつかの白コロニーにおいて遺伝子の存在を確認した後に、代表的なコロニーを選択して、マキシプレップを行った。得られた組換えプラスミドｐＥＴ２１ａ／Ｒ．ＮｅｐＩを上記のようにヒートショックによってＥ．ｃｏｌｉ Ｃ４１に形質転換し、ＩＰＴＧによる誘導下で発現させた。ここでは、０．６のＯＤ６６０まで細胞を増殖させ、０．１ｍＭのＩＰＴＧで、３７℃で４時間誘導した。発現したタンパク質は封入体となった。
植物のシグナル配列を有さない、Ｎ．ｇｒａｃｉｌｉｓ由来のネペンテシンＩＩのｃＤＮＡ（配列番号１４を参照されたい）を使用して、ネペンテシンＩＩのｃＤＮＡを調製した。この配列を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（１Ｕ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ、ＮＥＢ）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）、ＡＴＰ（０．５ｍＭ）（ＮＥＢ）、０．５μｇのｐＥＴ２１ａベクター及び２μｇのネペンテシンＩＩのｃＤＮＡを使用して、ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限部位の間でｐＥＴ２１ａにクローニングした。これを１８℃で４時間インキュベートした。このライゲーション混合物（５μＬ）を２００μＬのＮｏｖａＢｌｕｅコンピテントセルに加え、氷上で１５分間インキュベートした。細胞をヒートショック（４２℃で４５秒、次いで、１ｍｌのＬＢ培地とともに直ちに氷上）によって形質転換し、３７℃で１時間インキュベートし、抗生物質（テトラサイクリン及びアンピシリン）とともにプレーティングした。いくつかの白コロニーにおいて遺伝子の存在を確認した後に、代表的なコロニーを選択して、マキシプレップを行った。得られた組換えプラスミドｐＥＴ２１ａ／Ｒ．ＮｅｐＩを上記のようにヒートショックによってＥ．ｃｏｌｉ Ｃ４１に形質転換し、ＩＰＴＧによる誘導下で発現させた。ここでは、０．６のＯＤ６６０まで細胞を増殖させ、０．１ｍＭのＩＰＴＧで、３７℃で４時間誘導した。発現したタンパク質は封入体となった。
【0148】
封入体を以下のように単離した。細胞を遠心分離し、ショ糖溶解バッファー（２５％サッカロース、５０ｍＭトリスＣｌ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＮａＮ３及びプロテアーゼ阻害剤）を加え、細胞を４ラウンドの凍結／融解及び超音波処理にかけた。これに続いて、ＤＮＡｓｅ及びＲＮＡｓｅを加えて、室温で３０分間インキュベートした。この調製物を遠心分離（５０００×ｇで約１５分）して、封入体及び膜フラグメントをペレットにした。このペレットをトリトン緩衝液（５０ｍＭトリスＣｌ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ β－メルカプトエタノール、１ｍＭ ＮａＮ３、０．５％トリトンＸ１００＋プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、氷上で超音波処理を行った。これを再度遠心分離して、封入体をペレットにし、このペレットを、トリトンを含んでいない緩衝液（５０ｍＭトリスＣｌ ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ β－メルカプトエタノール、１ｍＭ ＮａＮ３、プロテアーゼ阻害剤）中で、（混合及び超音波処理を行いながら）氷上で２回洗浄した。
【0149】
次いで、タンパク質ペレットをリフォールディングにかけた。１ｇの封入体を、１Ｌの５０ｍＭ ＣＡＰＳ ｐＨ１０．５、８Ｍ尿素、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭグリシン、５００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ β－メルカプトエタノール中に懸濁し、１時間振盪した。この懸濁液を、５０ｍＭトリスｐＨ１１に対して、１回に１時間で２回透析し、続いて、５０ｍＭトリスｐＨ７．５に対して１日透析し、最後に、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含むリン酸緩衝液に対して透析した。
【0150】
溶液を高速（１００００×ｇ、１５分間）で遠心分離して、いかなるリフォールディングされていないタンパク質も除去し、上清を、０．２２μｍの膜を通して濾過した。ネペンテシンＩＩを、ｐＨ２．５（グリシン－ＨＣｌ）で、４℃で一晩活性化した。収量は、１Ｌの細胞培養から出発して、１０～１００ｍｇのフォールディングされた活性化タンパク質の範囲にわたる。
【0151】
実施例５．Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素のグリコシル化
精製されたＥ．ｃｏｌｉ封入体のリフォールディングからのネペンテシンＩ（Ａ）及びＩＩ（Ｃ）の組換え体の生成を図２に示す。リフォールディング手順の各ステップをモニターし、精製されたＥ．ｃｏｌｉ封入体由来の全可溶化タンパク質（レーン１）、最終的な透析後にリフォールディングされたネペンテシン（レーン２）、リフォールディング生成物の２４時間酸活性化（１００ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．５）（レーン３）として示す。２４時間酸活性化したネペンテシンＩ（Ｂ）及びＩＩ（Ｄ）酵素に対してＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を行った。酸活性化したバンド（Ａ及びＣ、レーン３）のゲル内消化物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって、それぞれ、純粋なネペンテシンＩ及びＩＩの存在が確認された。
精製されたＥ．ｃｏｌｉ封入体のリフォールディングからのネペンテシンＩ（Ａ）及びＩＩ（Ｃ）の組換え体の生成を図２に示す。リフォールディング手順の各ステップをモニターし、精製されたＥ．ｃｏｌｉ封入体由来の全可溶化タンパク質（レーン１）、最終的な透析後にリフォールディングされたネペンテシン（レーン２）、リフォールディング生成物の２４時間酸活性化（１００ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．５）（レーン３）として示す。２４時間酸活性化したネペンテシンＩ（Ｂ）及びＩＩ（Ｄ）酵素に対してＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を行った。酸活性化したバンド（Ａ及びＣ、レーン３）のゲル内消化物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって、それぞれ、純粋なネペンテシンＩ及びＩＩの存在が確認された。
【0152】
（２～３種からプールした）天然のネペンテシンのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析を行った。図３に結果を示す。３７，２００の質量はネペンテシンＩＩであると考えられ、３８，９５１の質量はネペンテシンＩであると考えられる。どちらにしても、これらは、表１で示すように、組換え酵素の質量と異なる。
【表1】
【0153】
理論に拘束されないが、本発明者らは、これは、ネペンテシンＩが天然にグリコシル化されていることを確認するものであると考える。組換えネペンテシンＩＩの活性な、成熟酵素は、天然に存在するものより大きい。天然のネペンテシンＩＩはタンパク質配列がさらにより小さいが、ある種の微量なグリコシル化を有するという可能性が残る。本明細書で報告する天然の酵素の質量はＡｔｈａｕｄａらとは異なり、これは、分子の質量の決定に対して、質量分析計がＳＤＳ ＰＡＧＥよりも正確な技法であることが理由であると思われる。
【0154】
実施例６．Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素とペプシンの比較
指示された酵素によって消化したグリアジンについてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、分子量に従ってタンパク質を大まかにプロファイリングする。ペプシン、精製されたＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物または組換えネペンテシンＩＩでのグリアジンの消化は、およそ１００：１の基質と酵素の比で行った。グリアジン（５ｍｇ）を、指示された調製物とともに３７℃で２時間インキュベートした。図４は、組換えネペンテシンＩＩ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物またはペプシンによるグリアジンの消化のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。このゲルは、組換えネペンテシンＩＩによるグリアジンの消化が、ペプシンが行うのと異なる消化パターン及びペプシンが行うより小さなペプチドへの消化をもたらすことを示す。これは、ゲルの囲まれた部分で特に顕著である。Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物はグリアジンの分解において非常に効率的なので、この領域に残留グリアジンタンパク質は観察されない。
指示された酵素によって消化したグリアジンについてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、分子量に従ってタンパク質を大まかにプロファイリングする。ペプシン、精製されたＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物または組換えネペンテシンＩＩでのグリアジンの消化は、およそ１００：１の基質と酵素の比で行った。グリアジン（５ｍｇ）を、指示された調製物とともに３７℃で２時間インキュベートした。図４は、組換えネペンテシンＩＩ、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物またはペプシンによるグリアジンの消化のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。このゲルは、組換えネペンテシンＩＩによるグリアジンの消化が、ペプシンが行うのと異なる消化パターン及びペプシンが行うより小さなペプチドへの消化をもたらすことを示す。これは、ゲルの囲まれた部分で特に顕著である。Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物はグリアジンの分解において非常に効率的なので、この領域に残留グリアジンタンパク質は観察されない。
【0155】
表２は、ペプシン、組換えネペンテシンＩ及びＩＩ及びＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物によるＣ末端切断に対して、好ましい、低確率及び禁制（ｆｏｒｂｉｄｄｅｎ）の残基を示す酵素を分類する古典的な方法であるＣ末端切断の特異性は、タンパク質基質の大規模収集に基づいてまとめられる。ネペンテシンは切断特異性がペプシンと全く異なり、これによって、ネペンテシンとペプシンは非常に異なる酵素であることが示される。表２に示されるペプシンのデータは、文献（例えば、ｂｏｏｋｓ．ｇｏｏｇｌｅ．ｃａ／ｂｏｏｋｓ？ｉｄ＝７Ｏ１ｎＵ４－６Ｔ－ｗＣ＆ｐｒｉｎｔｓｅｃ＝ｆｒｏｎｔｃｏｖｅｒ＃ｖ＝ｏｎｅｐａｇｅ＆ｑ＆ｆ＝ｆａｌｓｅで入手可能な、Ｍｅｌｉｓｓａ Ｐａｌａｓｈｏｆｆによる論文である、“Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｐｓｉｎ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ”）から要約される。Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素のデータは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０１８６３３０号に記載されているものなどの消化研究から要約される。
【表2】
【0156】
ＬＣ－ＭＳアッセイを行って、各酵素が３３－ｍｅｒの有毒なグルテンペプチドを切断する能力を決定した。３３－ｍｅｒを指示された酵素とともに１００：１比（基質：酵素）で０．５時間インキュベートし、一般的な方法に従って、標準に対する未消化の３３－ｍｅｒの量を決定した。データは、対照（酵素添加なしの３３－ｍｅｒ）に対するパーセントとして示す。
【0157】
表３は、「３３－ｍｅｒ」（ＬＱＬＱＰＦＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＬＰＹＰＱＰＱＰＦ）配列番号１５と呼ばれる、グルテンタンパク質由来のペプシン抵抗性フラグメントの消化を示す。この配列は、セリアック病に強く関連しており、有毒なグルテンペプチドと呼ばれることが多い。グルテンタンパク質全体自体と同様に、３３－ｍｅｒは、Ｑ、Ｐ及びＬアミノ酸に富む。単にペプシンだけを使用して消化時間を延ばすことは、このペプチドに大した影響を与えなかった。このペプチドは、ペプシン消化に非常に抵抗性であった。これに対して、ネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及びＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物（流体）の高分子量画分（＞およそ１０ｋＤａ）は、このペプチドを消化する能力を示した。データは、対照（酵素なしの３３－ｍｅｒ）の％として示す。
【表3】
【0158】
グリアジンタンパク質のスラリー（５ｍｇグルテン）を４０若しくは２００μｇの組換えネペンテシンＩ若しくは組換えネペンテシンＩＩまたは４０μｇのペプシンとともにインキュベートし、（関連する溶液の混濁度によって決定した場合の）消化度を調べた。ペプシン量の増大は、スラリーの混濁に影響を与えない（データ非表示）。図５Ａは、グリアジンのスラリー及び指示される量の組換えネペンテシンＩ、組換えネペンテシンＩＩまたはペプシンを含むバイアルの画像である。図５Ｂも同様であるが、５、２０または１００μｇのＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物を使用した。ネペンテシンまたはＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物とともにインキュベートしたバイアルは、ペプシンのバイアルよりも混濁が少なく、これは、より活発なグリアジンの消化を示すものである。
【0159】
これらのデータは、グリアジンタンパク質の消化物は、ゲルレベル（「より大きな」消化産物を示す）、ペプチドレベル（３３－ｍｅｒのプロセシング）及びスラリーレベル（溶液の清澄化）で、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素とペプシンの間で異なることを示す。ペプシン、ネプロシン及びネペンテシンは、特にグルテンタンパク質に関して異なる切断特異性を有する、非常に異なるタンパク質である。簡単に言えば、ペプシンは、グルテン毒性を回避する方法でグルテンを十分に消化しないが、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素は消化する。
【0160】
実施例７．Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物によるグリアジンの消化
水素／重水素交換（ＨＤＸ）用途のために設計されたＬＥＡＰ ＨＴＸ－ＰＡＬオートサンプラー及び分注システムを使用して、ネペンテシンによるグリアジンの消化を溶液中で行った。ＡＢ ＳｃｉｅｘのＴｒｉｐｌｅ－ＴＯＦ ５６００ ＱｑＴＯＦ質量分析計を使用してデータを収集した。Ｍａｓｃｏｔ（ｖ２．３）を使用して、ＭＳ／ＭＳデータからペプチドを同定した。手短に言えば、１２ｐｍｏｌの粗グリアジン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入）を、実施例１に記載されているように生成した２μＬの１００倍濃縮抽出物と混合した。消化後、質量分析計に連結した逆相ＬＣシステムに全量を注入した。ペプチドを７ｃｍの１５０μｍ ｉ．ｄ．Ｍａｇｉｃ Ｃ１８カラムでトラップし、１０分または３０分内に、１０％～４０％のアセトニトリル勾配で溶出した。これらの分析で検出されたペプチドを選択して、ＭＳ／ＭＳスペクトルの複数情報依存的獲得におけるＣＩＤフラグメンテーションを行った。スペクトルを、すべての同定されたコムギグリアジン（α、β、γ、ω）タンパク質に加えて低分子量及び高分子量のグルテニンに関する配列を含む小型のデータベースに対して検索した。
水素／重水素交換（ＨＤＸ）用途のために設計されたＬＥＡＰ ＨＴＸ－ＰＡＬオートサンプラー及び分注システムを使用して、ネペンテシンによるグリアジンの消化を溶液中で行った。ＡＢ ＳｃｉｅｘのＴｒｉｐｌｅ－ＴＯＦ ５６００ ＱｑＴＯＦ質量分析計を使用してデータを収集した。Ｍａｓｃｏｔ（ｖ２．３）を使用して、ＭＳ／ＭＳデータからペプチドを同定した。手短に言えば、１２ｐｍｏｌの粗グリアジン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入）を、実施例１に記載されているように生成した２μＬの１００倍濃縮抽出物と混合した。消化後、質量分析計に連結した逆相ＬＣシステムに全量を注入した。ペプチドを７ｃｍの１５０μｍ ｉ．ｄ．Ｍａｇｉｃ Ｃ１８カラムでトラップし、１０分または３０分内に、１０％～４０％のアセトニトリル勾配で溶出した。これらの分析で検出されたペプチドを選択して、ＭＳ／ＭＳスペクトルの複数情報依存的獲得におけるＣＩＤフラグメンテーションを行った。スペクトルを、すべての同定されたコムギグリアジン（α、β、γ、ω）タンパク質に加えて低分子量及び高分子量のグルテニンに関する配列を含む小型のデータベースに対して検索した。
【0161】
図６は、３７℃で１、５、１０、１５、３０、６０、１３０、３６０または８１０分後に、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して、コムギ由来グリアジンのＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物による消化から同定されたすべてのペプチドの平均長を示す。偽陽性の同定を減らすために、スコアに対する９５％信頼度のカットオフ（ｐ＜０．０５）を使用した。ペプチド長の相対標準偏差を挿入図に示す。
【0162】
【0163】
【0164】
消化物のマッピングのために、基質と酵素の比がおよそ１０００：１であったことを除いては、上記のようにグリアジンの消化を行った。ネペンテシン抽出物、精製されたネペンテシン抽出物または組換えネペンテシンＩで、グリアジンを３７℃で２時間消化した。
【0165】
組換えネペンテシンＩのＰ１切断優先性は、濃縮された流体抽出物及び抽出物の精製画分のものと非常に類似している（図９Ａ）。驚いたことに、抽出物は、精製抽出物または組換えネペンテシンＩのいずれかよりも高いグルタミン優先性を示した。
【0166】
組換えネペンテシンＩのＰ１’の切断優先性は、濃縮された流体抽出物及び抽出物の精製画分のものと非常に類似している（図９Ｂ）。驚いたことに、抽出物は、精製抽出物または組換えネペンテシンＩのいずれかよりも高いプロリン優先性を示した。
【0167】
抽出物はネペンテシンＩ、ネペンテシンＩＩ及びネプロシンを含むが、精製ストラテジーは、他の２つの酵素より多くのネペンテシンＩを回収する。理論に拘束されることを望むものではないが、Ｐ１グルタミン位置及びＰ１’プロリン位置での抽出物による切断の高まりは、ネプロシン、ネペンテシンＩＩ及び／または２つ以上の酵素の間の相乗作用によるものであると考えられる。
【0168】
実施例８．ネプロシン抽出物の調製
ネプロシンをＮｅｐｅｎｔｈｅｓ ｓｐ消化流体から抽出した。凍結したショウジョウバエを与えてから５日後の植物の嚢状葉から流体を収集した。収集した液体を濾過して、死んだ昆虫を除去し、１０ｋＤの分子量カットオフ膜を通す複数の濃縮／濾過サイクルによって、２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ５．０で繰り返して洗浄した。
ネプロシンをＮｅｐｅｎｔｈｅｓ ｓｐ消化流体から抽出した。凍結したショウジョウバエを与えてから５日後の植物の嚢状葉から流体を収集した。収集した液体を濾過して、死んだ昆虫を除去し、１０ｋＤの分子量カットオフ膜を通す複数の濃縮／濾過サイクルによって、２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ５．０で繰り返して洗浄した。
【0169】
ネプロシンを、ｍｏｎｏ Ｐ５／５０ＧＬカラムでネペンテシンから部分的に精製した。５ｍＬの１．５倍濃縮流体を、低イオン強度（２０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ６）で平衡化したｍｏｎｏ Ｐカラムに注入した。タンパク質を、０．５ｍｌ／分で４０分のＮａＣｌ勾配（０～１Ｍ）で溶出した。０．５ｍｌごとに画分を収集した。天然変性プロリンリッチタンパク質、ＡＰＬＦを消化することによって、各画分においてネプロシン活性を試験した。生成されたペプチドをＣ８カラムで分離し、ｔｒｉｐｌｅ ＴｏＦ ５６００（ＡＢ Ｓｃｉｅｘ）でＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。画分１９～２２はネプロシンに関して濃縮されており（図１０）、粗ネプロシン抽出物と呼ぶ。ネプロシンはネペンテシンとは別個のものであり、ネペンテシンは後の画分で濃縮された。
【0170】
実施例９．グルテン不耐性マウスの腸の炎症阻害におけるＮｅｐｅｎｔｈｅｓ酵素の有効性
目的；グリアジン感作化ＮＯＤ－ＤＱ８マウスを使用して、インビボでのグリアジン誘導性損傷の予防における、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物または組換えネペンテシンＩＩを使用するグリアジンのインビトロ消化の有効性を試験すること
目的；グリアジン感作化ＮＯＤ－ＤＱ８マウスを使用して、インビボでのグリアジン誘導性損傷の予防における、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物または組換えネペンテシンＩＩを使用するグリアジンのインビトロ消化の有効性を試験すること
【0171】
実験計画：ＮＯＤ ＤＱ８マウスをコレラ毒素（ＣＴ）及びグリアジンで感作して、グリアジンに対する経口免疫寛容を破壊した。陰性対照は、ＣＴ及びグリアジンで処理したが、その後の経口グリアジン負荷はないままにした。様々な有毒な及び免疫原由来のペプチドを含む、ブタプロテアーゼ（ペプシン）によるグリアジンの消化物で、グリアジン負荷を行った。Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物または組換えネペンテシンＩＩで（３７セルシウス度で９０分間）前もって消化したグリアジンで、処理群を負荷した。Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物または組換えネペンテシンＩＩによるグリアジンの消化物は、ペプシンによるグリアジンの消化物よりもインビボで免疫原性が低いことが仮定される。
【0172】
群；
陽性対照（ｎ＝８）：感作及びグリアジン負荷。マウスをコレラ毒素（ＣＴ）及びペプシングリアジン（Ｐ－Ｇ）で感作した（１週間につき１回で３週間）。実験期間中、マウスをＰ－グリアジンで強制栄養した（１週間につき３回で３週間）。
陽性対照（ｎ＝８）：感作及びグリアジン負荷。マウスをコレラ毒素（ＣＴ）及びペプシングリアジン（Ｐ－Ｇ）で感作した（１週間につき１回で３週間）。実験期間中、マウスをＰ－グリアジンで強制栄養した（１週間につき３回で３週間）。
【0173】
陰性対照（ｎ＝８）：感作（次いで、グリアジンなし）。マウスをコレラ毒素（ＣＴ）及びペプシングリアジン（Ｐ－Ｇ）で感作した（１週間につき１回で３週間）。実験期間中、マウスをビヒクルで強制栄養した（１週間につき３回で３週間）。
【0174】
処理１（ｎ＝８）：Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物。マウスをコレラ毒素（ＣＴ）及びペプシングリアジン（Ｐ－Ｇ）で感作した（１週間につき１回で３週間）。実験期間中、マウスをＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物で消化したグリアジンで強制栄養した（１週間につき３回で３週間）。
【0175】
処理２（ｎ＝８）：マウスをコレラ毒素（ＣＴ）及びペプシングリアジン（Ｐ－Ｇ）で感作した（１週間につき１回で３週間）。実験期間中、マウスをネペンテシンＩＩで消化したグリアジンで強制栄養した（１週間につき３回で３週間）。
【0176】
結果；
４群すべてのマウスを、ペプシン－グリアジンの消化物に加えてコレラ毒素で感作した。陰性対照は、感作後にグリアジン負荷がないままにした。陽性対照及び処理群は、感作後にグリアジンで経口的に負荷した。処理群の違いは、グリアジン負荷物がＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物で前もって消化されるか、またはネペンテシンＩＩで前もって消化されるかである。この方法では、「陰性対照」は、（感作フェーズ間に曝露されたため）全くグリアジンの処理を受けておらず、それにより、グルテンフリーの食事に忠実である間、寛解の状態になるセリアック病患者の臨床状況を模倣した。
４群すべてのマウスを、ペプシン－グリアジンの消化物に加えてコレラ毒素で感作した。陰性対照は、感作後にグリアジン負荷がないままにした。陽性対照及び処理群は、感作後にグリアジンで経口的に負荷した。処理群の違いは、グリアジン負荷物がＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物で前もって消化されるか、またはネペンテシンＩＩで前もって消化されるかである。この方法では、「陰性対照」は、（感作フェーズ間に曝露されたため）全くグリアジンの処理を受けておらず、それにより、グルテンフリーの食事に忠実である間、寛解の状態になるセリアック病患者の臨床状況を模倣した。
【0177】
臨床的／毒性作用：マウスの全体的な様子（動作、開眼、毛づくろい）を評価した。処理または対照群のいずれにおいても悪影響は観察されなかった。実験全体を通して体重を記録し、いずれの群においても体重減少は観察されなかった（図１１）。
【0178】
グリアジン負荷に対する自然免疫の変化：各処理群のマウスの腸に対して、ＣＤ３＋上皮内リンパ球について免疫組織化学検査を行った（図１２）。これは、このモデルにおける腸のグリアジン曝露の迅速且つ初期の自然免疫マーカーである。グリアジン曝露は、陰性対照マウス及びＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物またはネペンテシンＩＩで前もって消化したグリアジンを曝露したマウスと比較して、ＩＥＬ数を増加させた（図１３）。Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物処理群とネペンテシンＩＩ処理群の間でＩＥＬ数の違いは観察されなかった。
【0179】
絨毛と陰窩の比；陽性対照群において、低い絨毛／陰窩（Ｖ／Ｃ）比について有意な傾向は観察されなかった（図１４）。Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物処理群及びネペンテシンＩＩ処理群は、陽性対照及び陰性対照と比較して高い比の傾向があった。
【0180】
解釈／考察：
マウスにおいて、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物またはネペンテシンＩＩで前もって消化したグリアジンでの３週間の負荷は安全であり、体重の短期低下を、またはいかなる臨床的有害事象も誘導しなかった。
マウスにおいて、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物またはネペンテシンＩＩで前もって消化したグリアジンでの３週間の負荷は安全であり、体重の短期低下を、またはいかなる臨床的有害事象も誘導しなかった。
【0181】
マウスにおいて、経口グリアジン負荷は、前もって感作された状態で、小腸のＩＥＬ数の有意な増加をもたらした。ＩＥＬの増加は、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物またはネペンテシンＩＩで前もって消化したグリアジンを負荷したマウスでは観察されなかった。これは、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物またはネペンテシンＩＩで処理したグリアジンの低い管腔抗原性を示唆するものである。
【0182】
Ｖ／Ｃ比の低下は、陽性対照群で非常に緩やかであった。しかし、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物またはネペンテシンＩＩで前もって消化したグリアジンを負荷したマウスにおいて、より高いＶ／Ｃ比について有意な傾向がなかった。この動物モデルにおけるＶ／Ｃ比の低下は中程度であり、グリアジン負荷の継続期間及び用量とともに変動する。陰性対照がグリアジン／グルテンの処理を完全に受けていない（感作されていない）場合、違いは陽性対照と陰性対照の間でより著明である。より長期にわたる設定において、前もって消化したＮｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物若しくはネペンテシンＩＩを使用した場合のＶ／Ｃ比の違い、及び／またはグリアジンの処理を完全に受けていない（感作されていない）マウスと比較した場合のＶ／Ｃ比の違いは、より明白あろうと考えられる。
【0183】
全体的結論：結果は、感作されたＮＯＤ／ＤＱ８マウスの小腸管においてグリアジンペプチドの抗原性を低減することに対する、Ｎｅｐｅｎｔｈｅｓ抽出物またはネペンテシンＩＩでのグリアジンの前消化の効果を示す。
【0184】
実施例１０．ネプロシンによるグリアジンの消化
粗ネプロシン抽出物をグリアジンとともにｐＨ２．５でインキュベートし、得られたペプチドフラグメントをＭＳによって分析した。図１５Ａ及び１５Ｂに結果を示す（ドット［．］は切断部位を示す）。抽出物によるタンパク質配列カバー率は６１％であった。グリアジンの潜在的なプロリン（Ｐ）切断部位（Ｃ末端）のおよそ５７％は粗ネプロシン抽出物によって処理された。理論に拘束されないが、グルタミン切断部位の少なくとも一部は、ネペンテシンタンパク質を含む抽出物の少量の混入のためであると考えられる。
粗ネプロシン抽出物をグリアジンとともにｐＨ２．５でインキュベートし、得られたペプチドフラグメントをＭＳによって分析した。図１５Ａ及び１５Ｂに結果を示す（ドット［．］は切断部位を示す）。抽出物によるタンパク質配列カバー率は６１％であった。グリアジンの潜在的なプロリン（Ｐ）切断部位（Ｃ末端）のおよそ５７％は粗ネプロシン抽出物によって処理された。理論に拘束されないが、グルタミン切断部位の少なくとも一部は、ネペンテシンタンパク質を含む抽出物の少量の混入のためであると考えられる。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B-1】
【図15B-2】
【図15B-3】
【図16】
【配列表】