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特許7372713ヤツメウナギＬＩＰタンパク質の肥満治療及び耐寒性向上のための食品及び薬品の製造における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-24
(45)【発行日】2023-11-01
(54)【発明の名称】ヤツメウナギＬＩＰタンパク質の肥満治療及び耐寒性向上のための食品及び薬品の製造における使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/46 20060101AFI20231025BHJP
A23L 33/17 20160101ALI20231025BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20231025BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20231025BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20231025BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20231025BHJP
A61K 9/16 20060101ALI20231025BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20231025BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20231025BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20231025BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20231025BHJP
【ＦＩ】
C07K14/46
A23L33/17 ZNA
A61P3/04
A61K38/17
A61K9/20
A61K9/08
A61K9/16
A61K9/48
A61P3/10
A61P3/06
C12N15/12
【請求項の数】
10
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023033797
(22)【出願日】2023-03-06
(65)【公開番号】P2023133207
(43)【公開日】2023-09-22
【審査請求日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】202210225097.0
(32)【優先日】2022-03-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】521518714
【氏名又は名称】遼寧師範大学
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(74)【代理人】
【識別番号】100148633
【弁理士】
【氏名又は名称】桜田 圭
(74)【代理人】
【識別番号】100147924
【弁理士】
【氏名又は名称】美恵 英樹
(72)【発明者】
【氏名】▲パン▼ 越
(72)【発明者】
【氏名】李 慶偉
(72)【発明者】
【氏名】杜 沢宇
(72)【発明者】
【氏名】韓 英倫
(72)【発明者】
【氏名】李 軍
(72)【発明者】
【氏名】盧 佳麗
【審査官】高山 敏充
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０３５５４２４２（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０９９１２７０７（ＣＮ，Ａ）
【文献】Cell Communication and Signaling，2017年，15:42，pp.1-16
【文献】Front. Cell Dev. Biol.，2021年，Vol. 9, Article 674939，pp.1-14
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ
Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＦＳＴＡ／ＡＧＲＩＣＯＬＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＢＩＯＴＥＣＨＮＯ／ＣＡＢＡ／ＣＡＰＬＵＳ／ＳＣＩＳＥＡＲＣＨ／ＴＯＸＣＥＮＴＥＲ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヤツメウナギＬＩＰタンパク質の肥満治療と耐寒性向上のための食品及び／又は薬品の製造における使用であって、前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質のアミノ酸配列が配列番号２である、ことを特徴とする使用。
【請求項2】
前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列が配列番号１である、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項3】
前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質は、異種発現系を用いて得られたもの、又はヤツメウナギのリー小体の培養液から分離されたものである、ことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項4】
前記異種発現系は、大腸菌発現系、酵母発現系、植物発現系、昆虫発現系及び哺乳類細胞発現系を含む、ことを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項5】
前記薬品は、前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項6】
前記薬学的に許容可能な担体は、充填剤、希釈剤、粘着剤、崩壊剤、乳化剤、薬物担持担体を含む、ことを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項7】
前記薬品は、薬学的に許容可能な剤型に製造され、前記剤型は、錠剤、注射剤、顆粒剤及びカプセル剤を含む、ことを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項8】
一回分の薬品は、１～１０６μｇの前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質を含有する、ことを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項9】
前記注射剤の投入方法は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射を含む、ことを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項10】
前記薬品は、ＩＩ型糖尿病、肥満、高脂血症に適用される、ことを特徴とする請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬技術分野に関し、特に、ヤツメウナギＬＩＰタンパク質の肥満治療及び耐寒性向上のための食品及び薬品の製造における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
脂肪組織は、人間にとって非常に重要なエネルギー貯蔵組織であり、一般に白色脂肪組織、褐色脂肪組織、誘導性褐色脂肪組織またはベージュ脂肪組織の３種類を含む。白色脂肪組織の主な機能はエネルギーを蓄えることで、褐色脂肪組織とベージュ脂肪組織の主な機能は熱を産生し、生体のエネルギーバランスを維持することである。肥満とは、多くの要因によるメタボリックシンドロームであり、生体内で白色脂肪細胞のサイズと数が増加し、褐色脂肪細胞の数と活性が低下する。白色脂肪をベージュ脂肪や褐色脂肪に褐色化させることで、褐色脂肪の量と活性を高めるだけでなく、白色脂肪の量を減らすこともできるので、ダイエットの目的を達成することができる。
【0003】
現在、肥満の治療方法として、主に手術治療と薬物治療が用いられている。手術治療は、手術による痛み、傷口、潜在的な感染症などの副作用があるため、非重症肥満の患者には適してない（特許文献１を参照）。現在、肥満治療のための薬物は、その副作用がかなり顕著である。例えば、特許文献２（ＣＮ２０２２１００５３６９２．０）には肥満治療用組成物が開示されているが、該組成物には多種の漢方薬が含まれているため、肝臓の損傷を引き起こしやすい。特許文献３には、オルリスタットで胃腸管の吸収を抑制して肥満治療の目的を達成することが開示されているが、オルリスタットによる脂肪便や大便失禁などの潜在的な副作用が受け入れられにくい。そのため、白色脂肪の褐色化を誘導して生体自身の代謝を高めて熱を産生することは、より安全で効果的な肥満治療の新たな方法になっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特許第６９５４９９７号公報
【文献】中国特許出願公開第１１４３０６４２４号明細書
【文献】欧州特許出願公開第３９４３０７６号サーチレポート
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、上記従来技術の課題に鑑みてなされたものであり、ヤツメウナギＬＩＰタンパク質の白色脂肪の褐色化を誘導して、肥満を治療し、耐寒性を向上させる等の作用に基づいて、ヤツメウナギＬＩＰタンパク質の肥満治療と耐寒性向上のための食品・薬品の製造における使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の目的は、以下の手段で実現される。
【0007】
本発明は、ヤツメウナギＬＩＰタンパク質の肥満治療と耐寒性向上のための食品及び／又は薬品の製造における使用を提供し、ヤツメウナギＬＩＰタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。
【0008】
さらに、前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である。
【0009】
さらに、ヤツメウナギＬＩＰタンパク質は、異種発現系を用いて得られたもの、又はヤツメウナギのリー小体の培養液から分離されたものである。
【0010】
さらに、前記異種発現系は、大腸菌発現系、酵母発現系、植物発現系、昆虫発現系、哺乳類細胞発現系を含む。
【0011】
さらに、前記薬品は、前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む。
【0012】
さらに、前記薬学的に許容可能な担体は、充填剤、希釈剤、粘着剤、崩壊剤、乳化剤、薬物担持担体を含む。
【0013】
さらに、前記薬品は、薬学的に許容可能な剤型に製造される。
【0014】
さらに、前記剤型は、錠剤、注射剤、顆粒剤、カプセル剤を含む。
【0015】
さらに、１回分の薬品は、１～１０６μｇの前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質を含有する。
【0016】
さらに、前記注射剤の投与方法は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射を含む。
【0017】
さらに、前記薬品は、ＩＩ型糖尿病、肥満、高脂血症またはメタボリックシンドロームの治療に用いられる。
【0018】
さらに、前記薬品は、生体の耐寒と熱産生の能力を高めることができる。
【発明の効果】
【0019】
従来技術に対して本発明は以下の有益な効果を有する。
【0020】
１．本発明は、ヤツメウナギＬＩＰタンパク質が白色脂肪の褐色化を誘導して、肥満を治療し、及び耐寒性を向上させる等の作用に基づいて、ヤツメウナギＬＩＰタンパク質の肥満治療と耐寒性向上のための食品と薬品の製造における使用を提供し、品質制御で合格したＬＩＰタンパク質を皮下注射により投与し、ＬＩＰタンパク質は、皮下白色脂肪組織を標的として、皮下白色脂肪組織の褐色化を正確に誘導させることで、生体の耐寒と熱産生の能力、インスリン感受性及び肥満治療の機能を向上させることができ、生物学的安全性が高く、有効性が強いとの特徴があり、臨床的応用が期待されている。
【0021】
２．本発明は、肥満症を治療するための新たな標的を提供し、本発明によれば、ヤツメウナギＬＩＰが白色脂肪を褐色化させる機能を持っていることを発見し、内因性ＬＩＰを過剰発現させたり、外因性ＬＩＰを注射したりすることで、脂肪細胞の耐寒と熱産生の能力を向上させることができる。ＲＮＡシークエンシングの結果から分かるように、ＬＩＰは褐色脂肪の分子マーカーＵＣＰ１などの発現を向上させることができ、肥満症と代謝性疾患に対して新たな治療標的を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0022】
以下、本発明の実施例をより一層明確に説明するために、実施例に係る図面を簡単に説明する。
【0023】
【図1】ＬＩＰを過剰発現するＬＩＰ遺伝子組み換えゼブラフィッシュＴｇ（ＴＲＥ：ＥＧＦＰ－ｌｉｐ）の作成過程及び検証図。Ａ：遺伝子組み換えゼブラフィッシュの作成の技術手段経路を示す図、Ｂ：Ｔｇ（ＴＲＥ：ＥＧＦＰ－ｌｉｐ）遺伝子組み換えゼブラフィッシュ（ａ＃及びｂ＃）の尾びれゲノムを同定した図、Ｃ：ＷＢ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ）法でゼブラフィッシュのＬＩＰとＥＧＦＰの発現を分析した図、Ｄ：ｌｉｐ遺伝子のＴｇ（ＴＲＥ：ＥＧＦＰ－ｌｉｐ）遺伝子組み換えゼブラフィッシュにおける発現プロフィール（縮尺は２５０μｍ）を示す図、Ｅ：共焦点顕微鏡法で遺伝子組み換えゼブラフィッシュにおけるＬＩＰの発現を分析した図（縮尺は１００μｍ）。
【図2】過剰発現したＬＩＰがゼブラフィッシュの胚の４つの時期（１９ｈｐｆ、３６ｈｐｆ、６０ｈｐｆ、９６ｈｐｆ）のトランスクリプトームへの影響を示す図。
【図3】ｓｉＲＮＡ干渉試験により、ｌｉｐ遺伝子が転写レベルで褐色関連分子を阻害することを検証した図。
【図4】高脂肪マウスのモデルを作成した図である。Ａ：高脂肪マウスの体重変化を示す図、ＨＤは普通食を示し、ｎ＝３０であり、ＨＦＤは高脂肪食を示し、ｎ＝１３０である、Ｂ：高脂肪マウスの体型変化を示す図、Ｃ：マウスの血中トリグリセリド量を示す図（ｎ＝３０）、Ｄ：マウスの血中総コレステロール量を示す図（ｎ＝３０）。
【図5】ＬＩＰタンパク質の異なる投与方法と投与量の組み合わせによる高脂肪マウスの体重変化を示す図。
【図6】異なる投与方法により異なる投与量のＬＩＰタンパク質を注射した後の、マウスのインスリン感受性の測定結果を示す図、Ａ：ブドウ糖負荷試験、Ｂ：インスリン負荷試験。
【図7】皮下注射により１０μｇのＬＩＰタンパク質を投与した後の、マウスの寒冷暴露試験結果を示す図。Ａ：勾配寒冷暴露過程中のマウスの直腸温の測定結果を示す図、Ｂ：４℃での寒冷暴露におけるマウスの生存曲線を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0024】
以下、実施例に関連して本発明を詳細に説明するが、本発明の実施形態は、これに限定されず、以下の説明における実施例は、本発明の実施例の一部にすぎず、当業者にとって、創造的な労働を行わない前提で得られる他の類似する実施例は、いずれも本発明の請求の範囲に属するべきである。
【0025】
（実施例１）
本発明に係る薬物誘導性過剰発現ヤツメウナギＬＩＰ遺伝子組み換えゼブラフィッシュＴｇ（ＴＲＥ：ＥＧＦＰ－ｌｉｐ）は、発明者らにより実験室で作成され、その作成、安定系の確立及び同定の手順は以下の通りである。
本発明に係る薬物誘導性過剰発現ヤツメウナギＬＩＰ遺伝子組み換えゼブラフィッシュＴｇ（ＴＲＥ：ＥＧＦＰ－ｌｉｐ）は、発明者らにより実験室で作成され、その作成、安定系の確立及び同定の手順は以下の通りである。
【0026】
（１）プラスミドＴｏｌ２－ａｃｔｂ２－ｒｔＴＡＭ２－ＴＲＥＰ－ＥＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ｌｉｐの作成：
ｌｉｐ遺伝子配列を化学合成し、その配列を、商品化したプラスミド（具体的には、Ｇｕ Ｑ， Ｙａｎｇ Ｘ， Ｈｅ Ｘ， Ｌｉ Ｑ， Ｃｕｉ Ｚ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１３ Ｏｃｔ ２０；４０（１０）：５２３－３１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｇｇ．２０１３．０６．００８を参照）に結合させて得る。ここで、Ｔｏｌ２はＩＩ類トランスポゾン配列で、ａｃｔｂ２はβ－ａｃｔｉｎ配列で、ｒｔＴＡＭ２はテトラサイクリンにより制御される転写活性化因子で、ＴＲＥＰはｔｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒプロモーター配列で、ＥＧＦＰは緑色蛍光タンパク質配列で、Ｐ２Ａは一類自己スプライシング配列である。ｌｉｐのヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、ｌｉｐのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。
作成された遺伝子組み換えプラスミドをＡＢ系のゼブラフィッシュの受精卵に顕微注射する。
ｌｉｐ遺伝子配列を化学合成し、その配列を、商品化したプラスミド（具体的には、Ｇｕ Ｑ， Ｙａｎｇ Ｘ， Ｈｅ Ｘ， Ｌｉ Ｑ， Ｃｕｉ Ｚ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｊ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１３ Ｏｃｔ ２０；４０（１０）：５２３－３１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｇｇ．２０１３．０６．００８を参照）に結合させて得る。ここで、Ｔｏｌ２はＩＩ類トランスポゾン配列で、ａｃｔｂ２はβ－ａｃｔｉｎ配列で、ｒｔＴＡＭ２はテトラサイクリンにより制御される転写活性化因子で、ＴＲＥＰはｔｒｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒプロモーター配列で、ＥＧＦＰは緑色蛍光タンパク質配列で、Ｐ２Ａは一類自己スプライシング配列である。ｌｉｐのヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、ｌｉｐのアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。
作成された遺伝子組み換えプラスミドをＡＢ系のゼブラフィッシュの受精卵に顕微注射する。
【0027】
（２）３０μｇ／ｍＬのＤｏｘ（塩酸ドキシサイクリン）でゼブラフィッシュ胚でのＬＩＰを過剰発現を誘発させ、陽性胚を緑色蛍光により選別する。
【0028】
（３）選別したＦ０世代の陽性ゼブラフィッシュ胚を、Ｄｏｘが含まれていない１×Ｅ３培地に移して３ｍｐｆまで飼育し、２株が得られ、それぞれａ株（ａ＃）、ｂ株（ｂ＃）と命名する。
【0029】
（４）２株のゼブラフィッシュ成魚の尾びれからゲノムＤＮＡを分離し、２組のｌｉｐ遺伝子のプライマーを設計してＰＣＲ同定を行い、その結果、特異的バンドを有することが示され、これは２株のゼブラフィッシュゲノムＤＮＡはいずれもｌｉｐ遺伝子を有すること、即ち、ｌｉｐ遺伝子が単一の染色体遺伝子座に組み込まれた（ｂ＃株のゼブラフィッシュは、バンドの明るさと緑色蛍光強度が弱く、その後の安定系の確立にはすべてａ＃株を使用した）ことを示している。
【0030】
（５）Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法で遺伝子組み換えゼブラフィッシュのＥＧＦＰとＬＩＰのタンパク質の発現レベルを分析し、その結果、ＬＩＰを過剰発現させたゼブラフィッシュでは明らかなバンドが現れ、これは、遺伝子組み換えゼブラフィッシュＴｇ（ＴＲＥ：ＥＧＦＰ－ｌｉｐ）の作成が成功したことを示している。
【0031】
（６）蛍光イメージング技術によりｌｉｐ遺伝子の時空的な発現プロフィールを確定し、その結果からわるように、ＬＩＰタンパク質はまず遺伝子組み換えゼブラフィッシュの体節期の脊髄で発現し、その後、脊髄から脳や周囲の筋肉組織へと徐々に発現する。
【0032】
（７）陽性ゼブラフィッシュの連続的な自殖と戻し交配によって安定なｌｉｐ遺伝子発現を有する遺伝子組み換えゼブラフィッシュ株を選別し、具体的に、Ｆ０ゼブラフィッシュは自殖によって２５８枚のＦ１世代のゼブラフィッシュ胚、３６匹の陽性Ｆ１世代のゼブラフィッシュが得られ、陽性率は１３．９５％である。
【0033】
（８）Ｆ１世代の胚を孵化して成体まで飼育し、その後、Ｆ１世代の陽性ゼブラフィッシュを自殖することで、より安定な蛍光発現を有するＦ２世代が得られ、Ｆ２世代のゼブラフィッシュの陽性率は５６．０２％である。
【0034】
（９）技術手段経路に従って、遺伝子組み換えゼブラフィッシュ株を継続的に最適化させ、かつゼブラフィッシュゲノムにおけるｌｉｐ遺伝子のコピー数を安定化させ、最終にＦ４世代で遺伝子組み換えゼブラフィッシュＴｇ（ＴＲＥ：ＥＧＦＰ－ｌｉｐ）の安定系を成功に確立した。
【0035】
（実施例２）
本実施例は、４つの時期（１９ｈｐｆ、３６ｈｐｆ、６０ｈｐｆ、９６ｈｐｆ）のゼブラフィッシュ胚に対して、トランスクリプトームのシーケンシングを行った。ｒａｗ ｒｅａｄｓをフィルタリングして、計５８．８９ＧのＣｌｅａｎＤａｔａを得、各サンプルの有効的なデータ量は６．９９－７．９１Ｇに分布し、Ｑ３０塩基は９２．０４－９２．５０％に分布され、平均ＧＣ含有量は４６．４３％であった。この結果は、シーケンシング過程において、ＡＴとＧＣの分離が発生せず、ＧとＣの塩基及びＡとＴの塩基の含有量は各シーケンシングサイクルにおいてそれぞれ等しく、全体のシーケンシング過程で安定していることを示している。野生型と遺伝子組み換えゼブラフィッシュの対応する発育時期のＦＰＫＭは比較的に類似していることから、シーケンシングのデータの標準化の程度が高く、その後の分析に活用することができることを示している。主成分分析（ＰＣＡ）により、胚で発現されたｌｉｐ遺伝子（１９ｈｐｆ）の、胚発育終了（９６ｈｐｆ）までの連続的な発育過程における発現を示している。同じ発育段階のデータセットがサンプルの空間的配置で非常に近く、これはサンプルの均一化の程度が高く、その後の分析に活用することができることを示している。｜ｌｏｇ２ＦＣ｜≧２及びＦＤＲ≦０．０５を、差次的発現遺伝子の選別基準として、ゼブラフィッシュのｌｉｐ遺伝子の過剰発現に伴う主要な応答遺伝子を選別した。５３７個のアップ調節の遺伝子（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ）と６０３個のダウン調節の遺伝子（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ）を含む２２０４個の差次的発現遺伝子（ＤＥＧｓ）が得られた。ＬＩＰの過剰発現による発現変動遺伝子は、主に脂質代謝経路に（例えば、ＰＰＡＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ、Ｓｔｅｒｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓステロイド生合成、及びＦａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ脂肪酸生合成等）存在する。また、ＬＩＰの過剰発現により褐色脂肪の分子マーカーｕｃｐ１等がアップ調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）され、この結果は、ＬＩＰが転写レベルで白色脂肪の褐色化を誘導することを示している。
本実施例は、４つの時期（１９ｈｐｆ、３６ｈｐｆ、６０ｈｐｆ、９６ｈｐｆ）のゼブラフィッシュ胚に対して、トランスクリプトームのシーケンシングを行った。ｒａｗ ｒｅａｄｓをフィルタリングして、計５８．８９ＧのＣｌｅａｎＤａｔａを得、各サンプルの有効的なデータ量は６．９９－７．９１Ｇに分布し、Ｑ３０塩基は９２．０４－９２．５０％に分布され、平均ＧＣ含有量は４６．４３％であった。この結果は、シーケンシング過程において、ＡＴとＧＣの分離が発生せず、ＧとＣの塩基及びＡとＴの塩基の含有量は各シーケンシングサイクルにおいてそれぞれ等しく、全体のシーケンシング過程で安定していることを示している。野生型と遺伝子組み換えゼブラフィッシュの対応する発育時期のＦＰＫＭは比較的に類似していることから、シーケンシングのデータの標準化の程度が高く、その後の分析に活用することができることを示している。主成分分析（ＰＣＡ）により、胚で発現されたｌｉｐ遺伝子（１９ｈｐｆ）の、胚発育終了（９６ｈｐｆ）までの連続的な発育過程における発現を示している。同じ発育段階のデータセットがサンプルの空間的配置で非常に近く、これはサンプルの均一化の程度が高く、その後の分析に活用することができることを示している。｜ｌｏｇ２ＦＣ｜≧２及びＦＤＲ≦０．０５を、差次的発現遺伝子の選別基準として、ゼブラフィッシュのｌｉｐ遺伝子の過剰発現に伴う主要な応答遺伝子を選別した。５３７個のアップ調節の遺伝子（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ）と６０３個のダウン調節の遺伝子（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ）を含む２２０４個の差次的発現遺伝子（ＤＥＧｓ）が得られた。ＬＩＰの過剰発現による発現変動遺伝子は、主に脂質代謝経路に（例えば、ＰＰＡＲ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ、Ｓｔｅｒｏｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓステロイド生合成、及びＦａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ脂肪酸生合成等）存在する。また、ＬＩＰの過剰発現により褐色脂肪の分子マーカーｕｃｐ１等がアップ調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）され、この結果は、ＬＩＰが転写レベルで白色脂肪の褐色化を誘導することを示している。
【0036】
（実施例３）
本実施例に使用された雷氏ヤツメウナギ（Ｌａｍｐｅｔｒａ ｒｅｉｓｓｎｅｒｉ）を遼河流域で採獲し、遼寧師範大学のヤツメウナギ研究センターで一時時に飼育した。
雷氏ヤツメウナギｌｉｐ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ干渉は次のステップで行った。
本実施例に使用された雷氏ヤツメウナギ（Ｌａｍｐｅｔｒａ ｒｅｉｓｓｎｅｒｉ）を遼河流域で採獲し、遼寧師範大学のヤツメウナギ研究センターで一時時に飼育した。
雷氏ヤツメウナギｌｉｐ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ干渉は次のステップで行った。
【0037】
（１）性徴が明らかな雷氏ヤツメウナギを取って、オスのヤツメウナギの表面の水分を吸い取ってから固定し、エラに沿って排出腔に向けて腹部を絞って、オスのヤツメウナギの精液を乾燥した平皿に排出させ、メスのヤツメウナギに対して同じ処理を行い、精液と卵子を均一に混合させてから、水を含んだゼブラフィッシュの飼育水槽に入れ、数回洗浄した。
【0038】
（２）飼育水槽内の胚の粘着度合いに基づいてヤツメウナギ受精卵の品質を初期判断し、粘着性が大きいほど（水を捨てると、ほとんどの受精卵が飼育水槽の底部に付着する）受精卵の品質が良く、受精後の卵黄膜が急速に膨張し、１０分程度で注射することができた。
【0039】
（３）ｌｉｐ遺伝子の第３０８位での遺伝子サイレンシングは、効果がよく、ｌｉｐのＧｅｎＢａｎｋ番号はＭＧ５７２９７７．１である。ｓｉＲＮＡ－ＬＩＰは、ｌｉｐ ｍＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖とで、二本鎖ＲＮＡを生成して、特異的な分解を引き起こし、ｌｉｐ遺伝子の発現をサイレンシングさせた。本発明におけるｌｉｐ遺伝子のノックダウンに使用されたｓｉＲＮＡ－ＬＩＰは、化学合成により製造され、合成配列は以下の通りである（５’から３’）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：ＣＣＧＣＡＡＣＣＧＵＧＡＧＵＵＣＵＵＵＴＴ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＡＡＡＧＡＡＣＵＣＡＣＧＧＵＵＧＣＧＧＴＴ
合成後のｓｉＲＮＡ－ＬＩＰを４０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、クリーンベンチ中において、１２５μＬのＤＥＰＣ水でＯＤ２６０が１になるようにｓｉＲＮＡを溶解させて、ＰＣＲ管に分注し－８０℃で保存した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３：ＣＣＧＣＡＡＣＣＧＵＧＡＧＵＵＣＵＵＵＴＴ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＡＡＡＧＡＡＣＵＣＡＣＧＧＵＵＧＣＧＧＴＴ
合成後のｓｉＲＮＡ－ＬＩＰを４０００ｒｐｍで１分間遠心分離して、クリーンベンチ中において、１２５μＬのＤＥＰＣ水でＯＤ２６０が１になるようにｓｉＲＮＡを溶解させて、ＰＣＲ管に分注し－８０℃で保存した。
【0040】
（４）マイクロピペット引抜き装置（Ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ Ｐｕｌｌｅｒ）により毛細管を引っ張って、長さが等しく、注射部が細長い２本の注射針を形成し、注射針をボックスに置いて紫外線照射により２０分間滅菌した後、５倍の顕微鏡下に置いてピンセットで針の先端を切った。
【0041】
（５）スポイトにより、注射予定の胚をスライドの片側に吸着させ、スライドの反対側で水をスポイトで吸い込んだ。このように排卵針で胚をスライドの片側に配列させて吸着させることができ、水はちょうど胚を超えるようにした。
【0042】
（６）マイクロピペットで５μＬの注射液（ｓｉＲＮＡ－ＬＩＰ）を吸い込み、ｓｉＲＮＡ－ＬＩＰをガラス管の針の先端部分に加えた。
【0043】
（７）収集した胚を実体顕微鏡の下に置き、低倍率対物レンズで胚に焦点を合わせ、注射針先を軽く落として視野の中心に押し込み、注射針先がはっきり見えるまでマイクロ操作システムの微調整により注射針の位置を調整し、さらに、胚と注射針先の両方が最もはっきりしたレベルになるように顕微鏡の焦点距離、注射針と胚の位置を調整し、胚と注射針の先端の両方が最高の透明度になるようにした。操作レバーを押し、注射針先が胚に入るように慎重に針を挿入し、スイッチを踏んでサンプルを胚に注入した。
【0044】
（８）注射が完了した後、胚をスポイトで養殖水に軽く吹きつけて養殖し、養殖環境中のイオン濃度、ｐｈ値、溶存酸素を一定に保つように毎日、１／３の水を交換した。
【0045】
（９）胚が神経胚に発達した後、ＲＮＡを抽出し、合格したサンプルのライブラリーの構築を行い、データを取得してデータ品質管理、比較組立、差次的発現、機能注釈などの純化分析を行った。その結果から分かるように、ヤツメウナギｌｉｐ遺伝子の発現をサイレンシングすることにより褐色脂肪の分子マーカーＵＣＰ１等の発現が抑制され、これはＬＩＰが白色脂肪の褐色化に対してアップ調節作用を持っていることを示している。
【0046】
（実施例４）
１３０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２週齢）を高脂肪飼料（高脂肪食）で１６週間飼育し、体重の変化を毎週観測する。基礎飼料（普通食）は、２５％の小麦粉、２５％のオートミール、２５％のトウモロコシ粉、１０％の大豆粉、８％の魚粉、４％の骨粉、２％のイースト、１％の精塩からなる。高脂肪飼料は、９０％の基礎飼料、１．５％のコレステロ－ル、８．２％の豚脂、０．３％の豚の胆汁酸塩（Ｂｉｌｅ ｓａｌｔ，ｐｉｇ）からなる。高脂肪マウスの体重が同期の普通食マウスの体重の２倍になることを基準として、マウス尾血のトリグリセリドとコレステロールを測定した。その結果、トリグリセリドとコレステロールはいずれも対照群（普通食）マウスよりも有意に高く、高脂肪モデルの作成が成功したことが示された。
１３０匹のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（２週齢）を高脂肪飼料（高脂肪食）で１６週間飼育し、体重の変化を毎週観測する。基礎飼料（普通食）は、２５％の小麦粉、２５％のオートミール、２５％のトウモロコシ粉、１０％の大豆粉、８％の魚粉、４％の骨粉、２％のイースト、１％の精塩からなる。高脂肪飼料は、９０％の基礎飼料、１．５％のコレステロ－ル、８．２％の豚脂、０．３％の豚の胆汁酸塩（Ｂｉｌｅ ｓａｌｔ，ｐｉｇ）からなる。高脂肪マウスの体重が同期の普通食マウスの体重の２倍になることを基準として、マウス尾血のトリグリセリドとコレステロールを測定した。その結果、トリグリセリドとコレステロールはいずれも対照群（普通食）マウスよりも有意に高く、高脂肪モデルの作成が成功したことが示された。
【0047】
（実施例５）
本実施例に使用されるヤツメウナギの免疫タンパク質ＬＩＰの製造については、特許番号が２０１３１０５０１３６６．２、名称が「ヤツメウナギのリータンパク質、製造方法及び腫瘍疾患の予防と治療のための薬物の製造における使用」という中国特許を参照する。
ヤツメウナギのリー小体の培養液からヤツメウナギの免疫タンパク質ＬＩＰを分離する手順は、以下の通りである。
ａ．新鮮なヤツメウナギのリー小体を取って、トリプシンに置いて４℃で一晩消化する。
ｂ．消化した細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄する。
ｃ．無血清の１６４０培養液に移し、７２時間培養する。
ｄ．ヤツメウナギのリー小体の細胞の培養液を収集し、最終濃度が２ｍｍｏｌ／Ｌであるフッ化フェニルメチルスルホニルを加える。
ｅ．０．１Ｍ ＫＣｌ／緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＫＰＢ、５％グリセロール、ｐＨ７．０）を透析液とし、４℃の条件で、収集された細胞培養液を２ｈｒ～Ｏ／Ｎで３回透析する。
ｆ．透析したサンプルを０．４５μｍのフィルターで濾過する。
ｇ．濾過したサンプルを、カラム体積が１０ｍＬであるＭａｃｒｏ－Ｐｒｅｐセラミック ヒドロキシアパタイト タイプＩ ８０μｍのヒドロキシアパタイト吸着のカラムクロマトグラフィーにローデイングし、０～２５０ｍＭ ＫＰＢ ｐＨ７．０／０．１Ｍ ＫＣｌ／緩衝液Ａで線性勾配溶離を行い、流速が１．０ｍＬ／分であり、２．５ｍＬ／管で分注し全部で８０管を収集する。
ｈ．第８～第２３管の溶離液を混合し、１Ｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５％グリセロール、ｐＨ８．０）に置いて４℃で透析を行い、２ｈｒ～Ｏ／Ｎで透析液を交換し、３回透析する。
ｉ．透析した後のサンプルを０．４５μｍのフィルターで濾過する。
ｊ．２０ｍＬのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアから購入）を取ってカラムクロマトグラフィーに注ぎ入れてカラムを充填し、前の手順中のサンプルに対してイオン交換クロマトグラフィーを行う。具体的に、ろ過した後のサンプルをすべてカラムにローディングし、０～０．３Ｍ ＫＣＬ／緩衝液Ｂで線性勾配溶離を行い、流速が１．０ｍＬ／分であり、２．５ｍＬ／管で分注し全部で８０管を収集する。
ｋ．第２９～第３５管を収集し、ＰＢＳを用いて２ｈｒ～Ｏ／Ｎで計３回透析し、純化されたヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰである生成物を得る。
本実施例に使用されるヤツメウナギの免疫タンパク質ＬＩＰの製造については、特許番号が２０１３１０５０１３６６．２、名称が「ヤツメウナギのリータンパク質、製造方法及び腫瘍疾患の予防と治療のための薬物の製造における使用」という中国特許を参照する。
ヤツメウナギのリー小体の培養液からヤツメウナギの免疫タンパク質ＬＩＰを分離する手順は、以下の通りである。
ａ．新鮮なヤツメウナギのリー小体を取って、トリプシンに置いて４℃で一晩消化する。
ｂ．消化した細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄する。
ｃ．無血清の１６４０培養液に移し、７２時間培養する。
ｄ．ヤツメウナギのリー小体の細胞の培養液を収集し、最終濃度が２ｍｍｏｌ／Ｌであるフッ化フェニルメチルスルホニルを加える。
ｅ．０．１Ｍ ＫＣｌ／緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＫＰＢ、５％グリセロール、ｐＨ７．０）を透析液とし、４℃の条件で、収集された細胞培養液を２ｈｒ～Ｏ／Ｎで３回透析する。
ｆ．透析したサンプルを０．４５μｍのフィルターで濾過する。
ｇ．濾過したサンプルを、カラム体積が１０ｍＬであるＭａｃｒｏ－Ｐｒｅｐセラミック ヒドロキシアパタイト タイプＩ ８０μｍのヒドロキシアパタイト吸着のカラムクロマトグラフィーにローデイングし、０～２５０ｍＭ ＫＰＢ ｐＨ７．０／０．１Ｍ ＫＣｌ／緩衝液Ａで線性勾配溶離を行い、流速が１．０ｍＬ／分であり、２．５ｍＬ／管で分注し全部で８０管を収集する。
ｈ．第８～第２３管の溶離液を混合し、１Ｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５％グリセロール、ｐＨ８．０）に置いて４℃で透析を行い、２ｈｒ～Ｏ／Ｎで透析液を交換し、３回透析する。
ｉ．透析した後のサンプルを０．４５μｍのフィルターで濾過する。
ｊ．２０ｍＬのＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアから購入）を取ってカラムクロマトグラフィーに注ぎ入れてカラムを充填し、前の手順中のサンプルに対してイオン交換クロマトグラフィーを行う。具体的に、ろ過した後のサンプルをすべてカラムにローディングし、０～０．３Ｍ ＫＣＬ／緩衝液Ｂで線性勾配溶離を行い、流速が１．０ｍＬ／分であり、２．５ｍＬ／管で分注し全部で８０管を収集する。
ｋ．第２９～第３５管を収集し、ＰＢＳを用いて２ｈｒ～Ｏ／Ｎで計３回透析し、純化されたヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰである生成物を得る。
【0048】
ヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰは異種発現系を利用して獲得してもよく、例えば、大腸菌原核発現系、好ましくはｐＣｏｌｄ Ｉ発現ベクターであり、遺伝子組換えのタンパク質のｒＬｉタンパク質を効率よく獲得できる。ヤツメウナギ免疫タンパク質ＬＩＰのヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である。
【0049】
（実施例６）
マウスＬＩＰタンパク質の体内注射実験
（Ａ）ＬＩＰタンパク質による高脂肪マウスの肥満治療
実施例４で得られた高脂肪マウス（体重が４０±２ｇ）にＬＩＰタンパク質を投与し、投与量が１０μｇ、２０μｇ、４０μｇで、投与方式が皮下注射（ＩＣ）、筋肉内注射（ＩＭ）、静脈内注射（ＩＶ）である。陽性対照群に対しては、オルリスタット（１５５ｍｇ／ｋｇで、飲み水に連続投与）を投与し、陰性対照群に対しては、３０分間煮沸して不活性化させたＬＩＰタンパク質を投与し、異なる投与群に対して継続的に投与する（３日に１回投与）ことで、マウスの飲食による肥満を顕著に抑制することができた（図５）。３種の注射方式を比べると、皮下注射による投与は、体重の減量効果が最もよいことが認められた。３種の投与量の皮下注射による体重の減量効果を比べると、有意差がない。同様の効果であれば、より低い用量で投与するため、１０μｇのＬＩＰタンパク質を投与する方がより安全である。以上により、皮下注射により１０μｇのＬＩＰタンパク質を投与することが、最も効果的である。
マウスＬＩＰタンパク質の体内注射実験
（Ａ）ＬＩＰタンパク質による高脂肪マウスの肥満治療
実施例４で得られた高脂肪マウス（体重が４０±２ｇ）にＬＩＰタンパク質を投与し、投与量が１０μｇ、２０μｇ、４０μｇで、投与方式が皮下注射（ＩＣ）、筋肉内注射（ＩＭ）、静脈内注射（ＩＶ）である。陽性対照群に対しては、オルリスタット（１５５ｍｇ／ｋｇで、飲み水に連続投与）を投与し、陰性対照群に対しては、３０分間煮沸して不活性化させたＬＩＰタンパク質を投与し、異なる投与群に対して継続的に投与する（３日に１回投与）ことで、マウスの飲食による肥満を顕著に抑制することができた（図５）。３種の注射方式を比べると、皮下注射による投与は、体重の減量効果が最もよいことが認められた。３種の投与量の皮下注射による体重の減量効果を比べると、有意差がない。同様の効果であれば、より低い用量で投与するため、１０μｇのＬＩＰタンパク質を投与する方がより安全である。以上により、皮下注射により１０μｇのＬＩＰタンパク質を投与することが、最も効果的である。
【0050】
（Ｂ）ＬＩＰタンパク質の、高脂肪マウスのインスリン感受性に対する作用
高脂肪マウスを１２ｈ断食させた後、翌日午前８：００に異なる群のマウスの尾静脈血を採取し、空腹時血糖値を測定した。その後、胃内投与により１５％のブドウ糖溶液を１匹あたり０．２ｍＬ投与し、胃内投与後の５、１０、１５、３０、６０、１２０分の６つの時点で血糖値を測定した（図６Ａ）。高脂肪対照群は普通食群より血糖値が高く、この結果は、高脂肪で飼育された肥満マウスにインスリン抵抗性が現れたことを示している。同じ投与方法で、異なる投与量のＬＩＰタンパク質を投与する場合、高用量の曲線が最も低くなり、ＬＩＰの投与量の増加に伴い、高脂肪マウスのインスリン抵抗性が著しく低下し、さらに消失する（皮下注射による４０μｇ投与は、正常マウス及び陽性対照マウスと比べると、曲線が強く重なった）。３種の注射方式の効果をさらに比較するために、２０μｇの用量を投与したマウスを比べると、皮下投与による曲線が筋肉内注射及び静脈内注射より低く、これは、ＬＩＰタンパク質により白色脂肪を褐色化させる最適な投与方法は皮下注射であることをある程度示している。
高脂肪マウスを１２ｈ断食させた後、翌日午前８：００に異なる群のマウスの尾静脈血を採取し、空腹時血糖値を測定した。その後、胃内投与により１５％のブドウ糖溶液を１匹あたり０．２ｍＬ投与し、胃内投与後の５、１０、１５、３０、６０、１２０分の６つの時点で血糖値を測定した（図６Ａ）。高脂肪対照群は普通食群より血糖値が高く、この結果は、高脂肪で飼育された肥満マウスにインスリン抵抗性が現れたことを示している。同じ投与方法で、異なる投与量のＬＩＰタンパク質を投与する場合、高用量の曲線が最も低くなり、ＬＩＰの投与量の増加に伴い、高脂肪マウスのインスリン抵抗性が著しく低下し、さらに消失する（皮下注射による４０μｇ投与は、正常マウス及び陽性対照マウスと比べると、曲線が強く重なった）。３種の注射方式の効果をさらに比較するために、２０μｇの用量を投与したマウスを比べると、皮下投与による曲線が筋肉内注射及び静脈内注射より低く、これは、ＬＩＰタンパク質により白色脂肪を褐色化させる最適な投与方法は皮下注射であることをある程度示している。
【0051】
高脂肪マウスを１２ｈ断食させた後、翌日午前８：００に異なる群のマウスの尾静脈血を採取し、空腹時血糖値を測定する。その後、腹腔内注射によりインスリン（０．５Ｕ／ｋｇ）を投与し、胃内投与した後の１５分、３０分、４５分、１２０分の４つの時点で血糖値を測定した。インスリン負荷試験（図６Ｂ）では、高脂肪対照群は普通食群より血糖値が高く、この結果は、高脂肪で飼育された肥満マウスにインスリン抵抗性が現れたことを示している。同じ投与方法で、異なる投与量のＬＩＰタンパク質を投与する場合、高用量の曲線が最も低くなり、ＬＩＰの投与量の増加に伴い、高脂肪マウスのインスリン抵抗性が著しく低下する。３種の注射方式の効果をさらに比較するために、２０μｇの用量を投与したマウスを比べると、皮下投与による曲線が筋肉内注射及び静脈内注射より低く、これは、前のブドウ糖負荷試験の結果と合致する。
【0052】
ブドウ糖及びインスリン負荷試験から、（１）ＬＩＰタンパク質を投与すると、高脂肪マウスのインスリン感受性が顕著に向上し、向上の程度はＬＩＰタンパク質の投与量と正の相関があること、（２）皮下注射は、ＬＩＰタンパク質により白色脂肪を褐色化させる最適な投与経路であり、またＬＩＰタンパク質による褐色化は皮下白色脂肪組織に直接作用することを示していることが分る。
【0053】
（Ｃ）ＬＩＰタンパク質注射マウスの寒冷暴露試験
実験群：対照群マウス（皮下注射によりＰＢＳを投与）、実験群マウス（皮下注射によりＬＩＰタンパク質を１０μｇ投与）。皮下投与は、鼠径部に、左右５０μＬずつ計１００μＬを皮下注射した。
実験群：対照群マウス（皮下注射によりＰＢＳを投与）、実験群マウス（皮下注射によりＬＩＰタンパク質を１０μｇ投与）。皮下投与は、鼠径部に、左右５０μＬずつ計１００μＬを皮下注射した。
【0054】
毎日午前／午後、それぞれ９時と２１時に、マウスの直腸温を２回測定する。直腸温の測定はマウス直腸用の検温器を用い、パラフィンオイルで潤滑した検温器をマウスの直腸に１．５～２ｃｍほど挿入させた。なお、挿入の深さが一致するように、ゴムスリップを「止め輪」として検温器にはめて置く。検温器を直腸内に入れて３分間保持した。その結果、皮下注射によりＬＩＰタンパク質を投与したマウスは、寒さに対する抵抗力がより強く、４－８℃でのマウスの直腸温はいずれもＰＢＳ群のマウスよりも有意に高いことが示された（図７Ａ）。
【0055】
寒冷暴露に慣れたマウスを４℃の環境に長時間にわたって寒冷暴露させ、生存曲線を作成した。１かごに１匹のマウスを入れ、厚さが１ｃｍのクッションを置いた。４℃での寒冷暴露下で１０μｇのＬＩＰタンパク質を注射したマウスは、その死亡率が有意に低下した（図７Ｂ）。この結果は、皮下注射によりＬＩＰタンパク質を投与することで、耐寒性が有意に向上したことを示している。
【0056】
最後に以下のことを説明すべきである。以上の各実施例は本発明の技術的手段を説明するためのものにすぎず、それを限定するものではない。上述した各実施例を参照しながら本発明を詳細に説明したが、上述した各実施例に記載の技術的手段を修正するか、またはその技術的特徴の一部または全部に同等な取り替えを実施することも可能であり、それらの修正や取り替えによって、対応する技術的手段の本質が本発明の各実施例の技術的手段の範囲から逸脱しないことは当業者に理解されるべきである。
【0057】
（付記）
（付記１）
ヤツメウナギＬＩＰタンパク質の肥満治療と耐寒性向上のための食品及び／又は薬品の製造における使用であって、前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である、ことを特徴とする使用。
（付記１）
ヤツメウナギＬＩＰタンパク質の肥満治療と耐寒性向上のための食品及び／又は薬品の製造における使用であって、前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２である、ことを特徴とする使用。
【0058】
（付記２）
前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である、ことを特徴とする付記１に記載の使用。
前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１である、ことを特徴とする付記１に記載の使用。
【0059】
（付記３）
前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質は、異種発現系を用いて得られたもの、又はヤツメウナギのリー小体の培養液から分離されたものである、ことを特徴とする付記１に記載の使用。
前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質は、異種発現系を用いて得られたもの、又はヤツメウナギのリー小体の培養液から分離されたものである、ことを特徴とする付記１に記載の使用。
【0060】
（付記４）
前記異種発現系は、大腸菌発現系、酵母発現系、植物発現系、昆虫発現系及び哺乳類細胞発現系を含む、ことを特徴とする付記３に記載の使用。
前記異種発現系は、大腸菌発現系、酵母発現系、植物発現系、昆虫発現系及び哺乳類細胞発現系を含む、ことを特徴とする付記３に記載の使用。
【0061】
（付記５）
前記薬品は、前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む、ことを特徴とする付記１～４のいずれか１つに記載の使用。
前記薬品は、前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む、ことを特徴とする付記１～４のいずれか１つに記載の使用。
【0062】
（付記６）
前記薬学的に許容可能な担体は、充填剤、希釈剤、粘着剤、崩壊剤、乳化剤、薬物担持担体を含む、ことを特徴とする付記５に記載の使用。
前記薬学的に許容可能な担体は、充填剤、希釈剤、粘着剤、崩壊剤、乳化剤、薬物担持担体を含む、ことを特徴とする付記５に記載の使用。
【0063】
（付記７）
前記薬品は、薬学的に許容可能な剤型に製造され、前記剤型は、錠剤、注射剤、顆粒剤及びカプセル剤を含む、ことを特徴とする付記６に記載の使用。
前記薬品は、薬学的に許容可能な剤型に製造され、前記剤型は、錠剤、注射剤、顆粒剤及びカプセル剤を含む、ことを特徴とする付記６に記載の使用。
【0064】
（付記８）
一回分の薬品は、１～１０６μｇの前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質を含有する、ことを特徴とする付記７に記載の使用。
一回分の薬品は、１～１０６μｇの前記ヤツメウナギＬＩＰタンパク質を含有する、ことを特徴とする付記７に記載の使用。
【0065】
（付記９）
前記注射剤の投入方法は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射を含む、ことを特徴とする付記７に記載の使用。
前記注射剤の投入方法は、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射を含む、ことを特徴とする付記７に記載の使用。
【0066】
（付記１０）
前記薬品は、ＩＩ型糖尿病、肥満、高脂血症に適用される、ことを特徴とする付記９に記載の使用。
前記薬品は、ＩＩ型糖尿病、肥満、高脂血症に適用される、ことを特徴とする付記９に記載の使用。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】