特許 7372957 アミノピリミジンＳＳＡＯ阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-24

(45)【発行日】2023-11-01

(54)【発明の名称】アミノピリミジンＳＳＡＯ阻害剤

(51)【国際特許分類】

   C07D 401/04 20060101AFI20231025BHJP

   C07D 403/04 20060101ALI20231025BHJP

   C07D 239/34 20060101ALI20231025BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20231025BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20231025BHJP

【ＦＩ】

C07D401/04

C07D403/04

C07D239/34 CSP

A61K31/506

A61P1/16

A61P43/00 111

【請求項の数】 15

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021149451

(22)【出願日】2021-09-14

(62)【分割の表示】P 2019507302の分割

【原出願日】2017-08-04

(65)【公開番号】P2022003049

(43)【公開日】2022-01-11

【審査請求日】2021-10-13

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2016/094833

(32)【優先日】2016-08-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】594197872

【氏名又は名称】イーライ リリー アンド カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(74)【代理人】

【識別番号】100176474

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 信彦

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド・アンドリュー・コーツ

(72)【発明者】

【氏名】チン・ルオ・ヘン

(72)【発明者】

【氏名】ウェイ・イー

(72)【発明者】

【氏名】ジョウ・ジンイェ

【審査官】水島 英一郎

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１０－５３３６５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１２／１２４６９６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１５－５２１１６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００７／１２０５２８（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｄ

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

【化1】

からなる群から選択される化合物またはその薬学的に許容される塩を製造する方法であって、
工程ａ）

【化2】

と式

【化3】

〔式中、Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルである。〕
の化合物をＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンおよび炭酸カリウムから選択される塩基の存在下で反応させて式

【化4】

〔式中、Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルである。〕
の化合物を製造する工程；および
工程ｂ）式

【化5】

〔式中、Ｂｏｃはｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルである。〕
の化合物と酸を反応させて

【化6】

からなる群から選択される化合物またはその薬学的に許容される塩を製造する工程
を含む方法。

【請求項2】

【化7】

からなる群から選択される化合物の薬学的に許容される塩と塩基を反応させて

【化8】

からなる群から選択される化合物を製造することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

【化9】

からなる群から選択される化合物と酸を反応させて

【化10】

からなる群から選択される化合物の別の薬学的に許容される塩を製造することをさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

塩基がＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンまたは炭酸カリウムである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

工程ａ）が１，４－ジオキサンを溶媒として使用する、請求項１～４の何れかに記載の方法。

【請求項6】

工程ｂ）で使用される酸が塩酸またはトリフルオロ酢酸である、請求項１～５の何れかに記載の方法。

【請求項7】

工程ａ）の式

【化11】

の化合物がｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－２－(ブロモメチル)－３－フルオロ－アリル]カルバメートと２－クロロピリミジン－５－オールを反応させることによって製造される、請求項１～６の何れかに記載の方法。

【請求項8】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－２－(ブロモメチル)－３－フルオロ－アリル]カルバメートと２－クロロピリミジン－５－オールの反応が炭酸カリウムの存在下で行われる、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－２－(ブロモメチル)－３－フルオロ－アリル]カルバメートと２－クロロピリミジン－５－オールの反応がジメチルホルムアミドを溶媒として使用する、請求項７または８に記載の方法。

【請求項10】

【化12】

からなる群から選択される化合物またはその薬学的に許容される塩が(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－(４－メトキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－イル]オキシメチル]プロプ－２－エン－１－アミン、二塩酸塩である、請求項１～３の何れかに記載の方法。

【請求項11】

【化13】

からなる群から選択される化合物またはその薬学的に許容される塩が(２Ｅ)－３－フルオロ－２－({[２－(４－メトキシピペリジン－１－イル)ピリミジン－５－イル]オキシ}メチル)プロプ－２－エン－１－アミン４－メチルベンゼンスルホン酸塩である、請求項１～３の何れかに記載の方法。

【請求項12】

式

【化14】

の化合物。

【請求項13】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－２－(ブロモメチル)－３－フルオロ－アリル]カルバメートと２－クロロピリミジン－５－オールを塩基の存在下で反応させることを含む、請求項１２の化合物を製造する方法。

【請求項14】

反応が炭酸カリウムの存在下で行われる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

反応がジメチルホルムアミドを溶媒として使用する、請求項１３または１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はアミノピリミジン化合物、該化合物の薬学的に許容される塩ならびに該化合物および塩の治療用途に関する。

【背景技術】

【0002】

セミカルバジド感受性アミノオキシダーゼ／血管接着タンパク質－１(ＳＳＡＯ)／ＶＡＰ－１)は、セミカルバジド感受性アミノオキシダーゼファミリーのメンバーである。ＳＳＡＯ／ＶＡＰ－１はＶＡＰ－１またはＳＳＡＯとも称されている。ＳＳＡＯ／ＶＡＰ－１は、膜結合および可溶性両方のアイソフォームとして存在する酵素であり、内皮細胞表面、血管平滑筋および脂肪細胞から主に発現される。ＳＳＡＯ／ＶＡＰ－１は、グルコース動態、炎症応答および白血球動員を含む多くの細胞プロセスに関与する。この酵素の高い活性レベルは、数ある障害の中で、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、卒中、慢性腎疾患およびアルツハイマー病と関係する。最近ＳＳＡＯ／ＶＡＰ－１は、脂肪性肝疾患などの肝疾患の病因と関連付けられている。Weston, C.J. et al., J Neural. Transm. 2011, 118, 1055-1064。脂肪性肝疾患(ＦＬＤ)は、肝臓における脂肪蓄積が過剰量であり、炎症を伴う一連の疾患状態を包含する。ＦＬＤは、インスリン抵抗性により特徴付けられる非アルコール性脂肪性肝疾患(ＮＡＦＬＤ)に至り得る。野放しのＮＡＦＬＤは持続性炎症性応答または非アルコール性脂肪性肝炎(ＮＡＳＨ)、進行性肝線維症、そして最終的に硬変に進行する。現在、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨなどの肝疾患のための新たな処置治療剤を提供する必要がある。

【発明の概要】

【0003】

ＳＳＡＯ／ＶＡＰ－１阻害剤は、肝臓の炎症および線維症を減少させ、それにより肝疾患の処置、特に、ＮＡＦＬＤおよび／またはＮＡＳＨの処置を提供すると考えられる。本発明は、ＳＳＡＯ／ＶＡＰ－１酵素を阻害し、このニーズの１以上に対処する、化合物を提供する。

【0004】

本発明は、式１

【化1】

〔式中、ｎは１または２であり；そしてＲ１はＨまたは－ＣＨ_３である。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【化2】

として示すフッ素への結合は、フッ素原子とメトキシピリミジン基が互いにＺ(zusammen、同方向)またはＥ(entgegen、逆方向)であることを示す(Brecher, J., et al., “Graphical Representation of Stereochemical Configuration”, Pure and Appl. Chem, 2006, 78(10) 1897, at 1959)。式１により示される構造は、Ｚ立体化学配置、Ｅ立体化学配置の化合物またはＺもしくはＥ立体化学配置の化合物の混合物を含む。好ましい本発明の化合物はＥ立体化学配置を有する。

【0005】

ある形態において、本発明は、遊離塩基としての式１の化合物を提供する。他の形態において、本発明は、一または二ＨＣｌ付加塩またはスルホン酸塩、好ましい４－メチルベンゼンスルホン酸塩(トシル酸塩)などの酸付加塩としての式１の化合物を提供する。

【0006】

ある形態において、本発明は、式２

【化3】

〔式中、ｎは１または２であり；そしてＲ１はＨまたは－ＣＨ_３である。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0007】

他の形態において、本発明は、式３

【化4】

〔式中、ｎは１または２であり；そしてＲ１はＨまたは－ＣＨ_３である。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0008】

ある実施態様において、本発明は、ｎが１である式１、２および３の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。他の実施態様において、本発明は、ｎが２である式１、２および３の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0009】

他の実施態様において、本発明は、Ｒ１がＨである式１、２および３の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。さらに他の実施態様において、本発明はＲ１が－ＣＨ_３である式１、２および３の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0010】

他の形態において、本発明は式４

【化5】

〔式中、Ｒ１はＨまたは－ＣＨ_３である。〕
の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0011】

他の形態において、本発明は、式５

【化6】

の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。ある実施態様において、式５の化合物は酸付加塩として提供される。好ましくは、酸付加塩は一または二ＨＣｌ付加塩またはスルホン酸塩、例えばメチルスルホン酸または４－メチルベンゼンスルホン酸付加塩であり、メシル酸塩または４－メチルベンゼンスルホン酸(トシル酸)塩を提供する。

【0012】

他の形態において、本発明は、式１～５の何れかの化合物またはその薬学的に許容される塩および薬学的に許容される担体、希釈剤または添加物を含む、医薬組成物を提供する。ある実施態様において、医薬組成物は式５の化合物またはその薬学的に許容される塩を含む。好ましくは、塩の薬学的に許容されるアニオンは、一または二塩化物、メシル酸または４－メチルベンゼンスルホン酸(トシル酸)である。

【0013】

他の形態において、本発明は、肝障害の処置を必要とする患者を処置する方法を提供する。本方法は、患者に有効量の式１～５の何れかの化合物またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物を投与することを含む。

【0014】

他の形態において、本発明は、肝障害の処置を必要とする患者を処置する方法を提供する。本方法は、患者に有効量の式１～５の何れかの化合物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。肝障害の例は、肝炎症、線維症および脂肪性肝炎を含む。ある実施態様において、肝障害が肝線維症、アルコール誘発線維症、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患(ＮＡＦＬＤ)および非アルコール性脂肪性肝炎(ＮＡＳＨ)からなる群から選択される、肝障害の処置を必要とする患者を処置する方法を提供する。特に好ましい実施態様において、方法は、非アルコール性脂肪性肝炎(ＮＡＳＨ)の処置を必要とする患者の処置を含む。

【0015】

他の形態において、本発明は、(２Ｅ)－３－フルオロ－２－({[２－(４－メトキシピペリジン－１－イル)ピリミジン－５－イル]オキシ}メチル)プロプ－２－エン－１－アミン４－メチルベンゼンスルホン酸(１：１)塩である、式６の化合物を提供する。

【化7】

【0016】

ある実施態様において、(２Ｅ)－３－フルオロ－２－({[２－(４－メトキシピペリジン－１－イル)ピリミジン－５－イル]オキシ}メチル)プロプ－２－エン－１－アミン４－メチルベンゼンスルホン酸(１：１)塩は、ＣｕＫα源(λ＝１.５４０５６Å)から得た、ａ)２シータで１８.６、１９.１、２１.０、２１.９および２２.４±０.２°またはｂ)２シータで１７.６、１１.０、１６.８、１８.６、１９.１、２１.０、２１.９、２２.４および２６.１±０.２°にピークを含むＸ線粉末回折パターンにより特徴付けられる結晶形態で提供される。

【0017】

他の形態において、本発明は、治療に使用するための式１～６の何れかの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。好ましい実施態様において、治療は肝障害に対してである。好ましくは、治療は、肝線維症、アルコール誘発線維症、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎から選択される肝障害に対してである。ある実施態様において、治療は肝線維症の処置のためである。他の実施態様において、治療は、非アルコール性脂肪性肝疾患に対してである。なおさらに別の実施態様において、治療は非アルコール性脂肪性肝炎に対してである。

【0018】

他の形態において、本発明は、肝障害の処置に使用するための、式１～６の何れかの化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。ある実施態様において、肝障害は、肝線維症、アルコール誘発線維症、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎から選択される。他の実施態様において、肝障害は非アルコール性脂肪性肝疾患または非アルコール性脂肪性肝炎である。特に好ましい実施態様において、肝障害は非アルコール性脂肪性肝炎(ＮＡＳＨ)である。

【0019】

さらに他の実施態様において、本発明は、肝障害の処置のための医薬の製造における、式１～６の何れかの化合物の使用を提供する。好ましい実施態様において、肝障害は、肝線維症、アルコール誘発線維症、アルコール性脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎から選択される。

【0020】

ここで使用する用語“薬学的に許容される塩”は、臨床的および／または獣医学的使用に許容されると考えられる、本発明の化合物の塩をいう。薬学的に許容される塩の例およびそれを製造する一般的方法は、“Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use” P. Stahl, et al., 2nd Revised Edition, Wiley-VCH, 2011 and S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, 1977, 66(1), 1-19に見られる。

【0021】

本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される添加物を使用して、製造され得る。医薬組成物についてここで使用する用語“薬学的に許容される添加物”は、組成物または製剤の他の添加物と適合性であり、かつ患者に有害ではない１以上の担体、希釈剤および添加物をいう。医薬組成物およびその製造法の例は、“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, Loyd, V., et al. Eds., 22^nd Ed., Mack Publishing Co., 2012に見ることができる。薬学的に許容される担体、希釈剤および添加物の非限定的例は、次の食塩水、水、デンプン、糖、マンニトールおよびシリカ誘導体；カルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチンおよびポリビニル－ピロリドンなどの結合剤；カオリンおよびベントナイト；ポリエチルグリコールを含む。

【0022】

ここで使用する用語“有効量”は、肝炎症、線維症および脂肪性肝炎を含む肝疾患などの障害の処置に有効である用量である量をいう。担当医師は、当業者として、慣用の方法を使用してかつ、類似の状況で得た結果の観察により、有効量を容易に決定できる。化合物の有効量または用量の決定に際し、化合物またはその塩を投与するか否か；使用するならば、他の薬剤の共投与；哺乳動物の種；その大きさ、年齢および一般的健康状態；障害の関与の程度または重症度；個々の患者の応答；投与方式；投与する製剤のバイオアベイラビリティ特徴；選択する投与レジメン；他の併用薬の使用；および他の関連状況を含む、多数の因子が考慮される。

【0023】

ここで使用する用語“処置する”、“処置のため”または“処置”は、存在する症状、障害、状態または疾患の進行または重症度の遅延、軽減または回復を含み、肝炎症、線維症および脂肪性肝炎などの肝疾患の処置を含み得る。

【0024】

ここで使用する用語“患者”は、哺乳動物、家禽または魚をいう。好ましくは、患者はヒトまたはコンパニオン哺乳動物、例えば、イヌまたはネコまたは他の家畜哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウサギおよびヤギである。

【0025】

処置する医師、獣医師または他の医療従事者は、必要とする患者の処置のための化合物の有効量を決定できる。好ましい医薬組成物は、経口投与用錠剤またはカプセル剤、経口用液剤または注射可能溶液として製剤化される。錠剤、カプセル剤または溶液剤は、処置を必要とする患者の処置に有効な量の本発明の化合物を含み得る。

【0026】

ここで使用する略語は、Daub G.H., et al., “The Use of Acronyms in Organic Chemistry” Aldrichimica Acta, 1984, 17(1), 6-23により定義される。他の略語は次のとおりである：“ＡＣＮ”はアセトニトリルをいう；“ＡＵＣ”は曲線下面積をいう；“Ｂｏｃ”はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルをいう；“ＤＣＭ”はジクロロメタンをいう；“ＤＩＰＥＡ”はＮ,Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンをいう；“ＤＭＦ”はジメチルホルムアミドをいう；“ＤＭＳＯ”はジメチルスルホキシドをいう；“ＥＤＴＡ”はエチレンジアミンテトラ酢酸をいう；“ＥＧＴＡ”はエチレングリコールテトラ酢酸をいう；“ＥＳ／ＭＳ”はエレクトロスプレー質量分析をいう；“ＥｔＯＡｃ”は酢酸エチルをいう；“ＨＥＰＥＳ”は４－(２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジンエタンスルホン酸をいう；“ＨＰＬＣ”は高速液体クロマトグラフィーをいう；“ｈｒまたはｈｒｓ”は時間をいう；“ＨＲＰ”はホースラディッシュペルオキシダーゼをいう；“ＩＣ_５０”はその薬剤で可能な最大阻害性応答の５０％を生じる薬剤の濃度(相対的ＩＣ_５０)またはプラセボ対照と比較して標的活性の５０％阻害を生じる薬剤の濃度(絶対的ＩＣ_５０)をいう；“ＭＡＯａおよびＭＡＯｂ”はそれぞれモノアミンオキシダーゼａおよびｂアイソフォームをいう；“ＭｅＯＨ”はメチルアルコールまたはメタノールをいう；“ｍｉｎ”は分をいう；“ＭＳ”は質量分析をいう；“ＰＥ”は石油エーテルをいう；“Ｒ_ｔ”は保持時間をいう；“ＳＳＡＯ”はセミカルバジド感受性アミンオキシダーゼ；および“ｈＳＳＡＯ”はヒトＳＳＡＯをいう。

【0027】

本発明の化合物またはその塩は、多様な方法で製造でき、そのいくつかは、下記製造例および実施例に示す。下記方法における各工程の生成物を、抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、摩砕および結晶化を含む常法により取得できる。特に断らない限り、反応材および出発物質は容易に入手可能である。

【0028】

ここに記載する製造例において、ヒドロキシルおよびアミノ官能基を、ここに記載する化合物の合成を促進するために保護し得る。保護官能基の例は、“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis,” Wuts, P.G.M., et al., Eds. 5th Ed., John Wiley and Sons, 2014に見ることができる。ヒドロキシル基またはアミノ基に容易に変換される他の官能基を使用し得る。これらの基のこのような官能基、その製造および変換は、“Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations” by Larock. R.C., Wiley VCH, 1999および“March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure,” Smith, M.B., Ed., 7th Ed., Wiley-Interscience, 2013に見ることができる。

【0029】

化学合成セクション
次の製造例および実施例は、本発明をさらに説明し、本発明の化合物の典型的合成を示す。

【0030】

製造例１
ｔｅｒｔ－ブチル(３Ｓ)－３－メトキシピロリジン－１－カルボキシレート
ヨードメタン(０.３９８ｇ、２.８０mmol)を、ｔｅｒｔ－ブチル(３Ｓ)－３－ヒドロキシピロリジン－１－カルボキシレート(０.５００ｇ、２.６７mmol)および水素化ナトリウム(鉱油中６０重量％)(０.１６０ｇ、４.０１mmol)のＤＭＦ(５mL)中の混合物に加える。得られた混合物を室温で２時間撹拌する。飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液(３０mL)で反応停止させ、ＥｔＯＡｃ(３×３０mL)で抽出する。水層を廃棄する。有機抽出物を合わせ、塩水で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濾液を蒸発乾固して、表題化合物(４７５mg、０.４７５ｇ、８８.４％)を得る。粗製物質をさらに精製することなく次工程で使用できる。ES/MS (m/z): 224.2 (M+Na)

【0031】

製造例２
(３Ｓ)－３－メトキシピロリジン
ｔｅｒｔ－ブチル(３Ｓ)－３－メトキシピロリジン－１－カルボキシレート(４７５mg、２.３６mmol)およびトリフルオロ酢酸(１mL、１３.２３mmol)のＤＣＭ(３mL)溶液を、室温で１時間撹拌する。反応混合物を減圧下濃縮して、表題化合物(２４０mg、２.３５mmol、９９.５％)を得て、これをさらに精製することなく次工程で使用できる。

【0032】

製造例３
１－(５－ベンジルオキシピリミジン－２－イル)ピペリジン－４－オール

【化8】

５－ベンジルオキシ－２－クロロ－ピリミジン(２.３０ｇ、９.９０mmol)、ピペリジン－４－オール(１.２３ｇ、１１.９mmol)およびＤＩＰＥＡ(３.８８mL、２９.７mmol)のＤＭＦ(３０mL、３８８mmol)中の混合物を、１００℃でＮ_２雰囲気下、１７時間撹拌する。混合物を水(２００mL)で希釈し、ＥｔＯＡｃ(３×５０mL)で抽出する。有機抽出物を合わせ、塩水(３×５０mL)で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮する。残留物を６０％ＥｔＯＡｃおよび４０％ＰＥの混合物で溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーに付して、表題化合物(２.００ｇ、６.３１mmol、６３.７％)を白色固体として得る。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.40-1.60 (m, 2H), 1.90-1.99 (m, 2H), 3.17-3.29 (m, 2H), 3.85-3.95 (m, 1H), 4.25-4.39 (m, 2H), 5.09 (s, 2H), 7.38-7.52 (m, 5H), 8.14 (s, 2H)

【0033】

製造例４
２－(４－ヒドロキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－オール

【化9】

パラジウム(炭素上１０質量％、６００mg、０.５６４mmol)を１－(５－ベンジルオキシピリミジン－２－イル)ピペリジン－４－オール(２.００ｇ、６.３１mmol)のＭｅＯＨ(４０mL、９８９mmol)溶液に加える。得られた混合物を、１５℃で水素雰囲気(１０３kPa)下、２時間撹拌する。得られた混合物を珪藻土で濾過する濾液を濃縮して、表題化合物(０.７０ｇ、３.５９mmol、５６.８％)を黄色固体として得る。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 1.23-1.38 (m, 2H), 1.60-1.77 (m, 2H), 2.65-2.90 (m, 2H), 3.00-3.25 (m, 2H), 3.50-3.70 (m, 2H), 4.05-4.16 (m, 1H), 7.90 (s, 2H)

【0034】

製造例５
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－２－[(２－クロロピリミジン－５－イル)オキシメチル]－３－フルオロ－アリル]カルバメート

【化10】

Ｋ_２ＣＯ_３(５.７１ｇ、４１.３mmol)を２－クロロピリミジン－５－オール(５.０１ｇ、３８.３mmol)およびｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－２－(ブロモメチル)－３－フルオロ－アリル]カルバメート(３.６７ｇ、１３.７mmol)のＤＭＦ(２５mL)溶液に加える。得られた溶液を室温で１２時間撹拌する。水(８０mL)およびＥｔＯＡｃ(１００mL)を加えて、反応停止させる。有機相と水相を分離する。水相をＥｔＯＡｃ(３×１００mL)で抽出する。全有機抽出物を合わせる。合わせた有機物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下濃縮して、残留物を得る。残留物を３０％ＥｔＯＡｃのヘキサン中の混合物で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに付して、表題化合物を白色固体として得る(４.１５ｇ、１３.１mmol、９６％収率)。ES/MS (m/z): 340 (M+Na)

【0035】

製造例６
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｚ)－３－フルオロ－２－[[２－(４－ヒドロキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート

【化11】

２－(４－ヒドロキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－オール(４００mg、２.０５mmol)、ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｚ)－２－(ブロモメチル)－３－フルオロ－アリル]カルバメート(１.１０ｇ、４.０２mmol)およびＫ_２ＣＯ_３(０.８５８ｇ、６.１５mmol)のＤＭＦ(１０mL)の中の混合物を６０℃で３時間撹拌する。得られた混合物をＥｔＯＡｃ(５０mL)で希釈する。混合物を水(１００mL)、次いで塩水(２×５０mL)で連続的に洗浄する。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮して、残留物を得る。残留物をＰＥ中の６５～７５％ＥｔＯＡｃ勾配で溶出するシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーに付して、表題化合物(５５８mg、１.４６mmol、７１.２％)を黄色ガム状物として得る。¹H NMR (400 M Hz, CDCl₃) δ 1.25 (s, 9H), 1.40-1.65 (m, 4H), 1.89-1.98 (m, 2H), 3.23-3.30 (m, 2H), 3.91 (s, 1H), 3.89-3.97 (m, 1H), 4.36-4.40 (m, 2H), 4.64 (s, 2H), 4.76 (br, 1H), 6.62 (d, J = 84.0 Hz, 1H) 8.10 (s, 2H)

【0036】

製造例７
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－３－Ｆ－２－[[２－(４－ヒドロキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート

【化12】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－２－[(２－クロロピリミジン－５－イル)オキシメチル]－３－フルオロ－アリル]カルバメート(２１.３ｇ、６７.０mmol)、ピペリジン－４－オール(２５.０ｇ、２３５mmol)およびＤＩＰＥＡ(４１mL、２３５mmol)を１,４－ジオキサン(２００mL)中で合わせる。得られた混合物をＮ_２雰囲気下、１０５℃で７時間加熱する。混合物を濃縮し、水(１００mL)およびＥｔＯＡｃ(１５０mL)に分配し、相を分離する。水相をＥｔＯＡｃ(１００mL)で抽出する。全有機相を合わせる。塩水(１００mL)で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、濾液を濃縮して、残留物を得る。残留物をＥｔＯＡｃ(２１mL)に溶解し、ヘプタン(１２６mL)を滴下する。得られた混合物を室温で２０時間撹拌する。混合物を濾過して固形物を集め、固形物をＥｔＯＡｃ／ヘプタン(５：１、２１mL)で濯ぐ。固形物を減圧下乾燥させて、表題化合物(２３.５ｇ、６１.５mmol、９１.７％)を得る。ES/MS (m/z): 383 (M+H)

【0037】

製造例８
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－(４－メトキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート

【化13】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－２－[(２－クロロピリミジン－５－イル)オキシメチル]－３－フルオロ－アリル]カルバメート(４.１０ｇ、１２.９mmol)を２等分し(２.０５ｇ＋２.０５ｇ)、それぞれ別々のマイクロ波バイアル(２０mL)に入れる。各バイアルに、４－メトキシピペリジン(４.３１ｇ、３７.３mmol)、１,４－ジオキサン(３０mL、１５mL)およびＤＩＰＥＡ(６mL、３４.４mmol、３mL)を加える。バイアルをＮ_２ガスでフラッシュし、密封し、マイクロ波により１２０℃で１２時間加熱する。２つの反応混合物を合わせ、減圧下で濃縮して、残留物を得る。残留物を３０％ＥｔＯＡｃのヘキサン中の混合物で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに付して、表題化合物を黄色油状物として得る(４.２４ｇ、１０.２mmol、７９％)。ES/MS (m/z): 397 (M+H)

【0038】

製造例９
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－[(３Ｓ)－３－メトキシピロリジン－１－イル]ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート

【化14】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－２－[(２－クロロピリミジン－５－イル)オキシメチル]－３－フルオロ－アリル]カルバメート(４００mg、１.２６mmol)を、(３Ｓ)－３－メトキシピロリジン(２４０mg、２.３７mmol)およびＫ_２ＣＯ_３(０.６９６ｇ、５.０４mmol)の１,４－ジオキサン(５mL)中の混合物に加える。得られた混合物を、マイクロ波条件下、１２０℃で１２時間撹拌する。混合物を減圧下濃縮して、表題化合物を粗製物質として得て、これをさらに精製することなく次工程で使用できる(４８１mg、１.２６mmol、９９.９％)。ES/MS (m/z): 383.2 (M+H)

【0039】

製造例１０
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－[(３Ｓ)－３－ヒドロキシピロリジン－１－イル]ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート

【化15】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－２－[(２－クロロピリミジン－５－イル)オキシメチル]－３－フルオロ－アリル]カルバメート(５９４.３mg、１.８７mmol)および(３Ｓ)－ピロリジン－３－オール(４８８.９mg、５.６１mmol)を１,４－ジオキサン(１５mL)およびＤＩＰＥＡ(３mL、１７.２mmol)に溶解する。溶液をＮ_２ガスでフラッシュし、容器を密封し、マイクロ波により混合物を１２０℃で１２時間加熱する。得られた混合物を減圧下濃縮して、残留物を得る。残留物をヘキサン中８０～９０％ＥｔＯＡｃ勾配で溶出するシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーに付して、表題化合物を黄色泡状物として得る(６０８.８mg、１.５７mmol、８４％)。ES/MS (m/z): 369 (M+H)

【0040】

実施例１
１－[５－[(Ｚ)－２－(アミノメチル)－３－フルオロ－アリルオキシ]ピリミジン－２－イル]ピペリジン－４－オール塩酸塩

【化16】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｚ)－３－フルオロ－２－[[２－(４－ヒドロキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート(５５８mg、１.４６mmol)をＨＣｌ(４mol／Ｌ)およびＭｅＯＨ(１０mL)に加える。得られた混合物を１.５時間、１０℃で撹拌する。混合物を減圧下濃縮して、残留物を得る。残留物をＡＣＮ中１０～１５％０.０５％水性ＨＣｌ勾配；流速：２５mL／分、Ｒ_ｔ：５.９５分で溶出する分取ＨＰＬＣカラム：(Phenomenex Synergi C18 １５０ ３０mm、４μm)に付して、２０：１より大きなＺ：Ｅ比の表題化合物(４５６mg、１.４３mmol、９８.０％)を黄色固体として得る。ES/MS (m/z): 283.1 (M+H), ¹H NMR (400 MHz , d₄-MeOD) δ 1.56-1.78 (m, 2H), 1.92-2.13 (m, 2H), 3.61-3.72 (m, 2H), 3.75 (s, 2H), 3.95-4.06 (m, 1H), 4.11-4.25 (m, 2H), 4.89-4.93 (m, 2H), 7.19 (d, J = 80.4 Hz, 1H), 8.47 (s, 2H)

【0041】

実施例２
１－[５－[(Ｅ)－２－(アミノメチル)－３－フルオロ－アリルオキシ]ピリミジン－２－イル]ピペリジン－４－オール二塩酸塩

【化17】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－(４－ヒドロキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート(３１ｇ、８１.０７mmol)、ＭｅＯＨ(２０mL、４９４mmol)およびＨＣｌをＭｅＯＨ(１２０mL、４mol／Ｌ、４８６.４mmol)中で合わせる。得られた混合物を、３０時間、Ｎ_２雰囲気下、室温で撹拌する。ＥｔＯＡｃ(２５０mL)を滴下し、混合物を３０分撹拌する。混合物を濾過して固形物を集め、固形物をＥｔＯＡｃ(２０mL)で濯ぎ、固形物を減圧下乾燥させて、２０：１より大きなＥ：Ｚ比の表題化合物(２６.４ｇ、７２.８mmol、８９.８％)を得る。ES/MS (m/z): 283 (M+H), ¹H NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 1.28-1.36 (m, 2H), 1.73-1.76 (m, 2H), 3.18-3.25 (m, 2H), 3.55-3.60 (m, 2H), 3.68-3.75 (m, 1H), 4.18 (dt, J = 13.5, 4.5 Hz, 2H), 4.65 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 6.55-7.10 (br, 2H), 7.27 (d, J = 82.0 Hz, 1H), 8.27 (s, 2H), 8.32-8.45 (br, 3H), ¹⁹F NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 122.2 (s)

【0042】

実施例３
(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－(４－メトキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－イル]オキシメチル]プロプ－２－エン－１－アミン、二塩酸塩

【化18】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－(４－メトキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート(４.２３７４ｇ、１０.６９mmol)をＨＣｌのＭｅＯＨ溶液(１００mL、５０mmol、０.５mol／Ｌ)に溶解する。得られた透明溶液を６０℃で４時間加熱する。混合物を減圧下濃縮して、残留物(３.９５ｇ)を得る。残留物をＭｅＯＨ(７mL)に懸濁し、混合物を還流して、透明溶液を得る。溶液を室温に冷却し、針状結晶を得て、混合物を－２０℃に冷却する。混合物を濾過して固形物を集め、固形物を冷ＭｅＯＨで洗浄して、表題化合物を淡黄色結晶として得る(２.７３ｇ、７.０１mmol、６６％)。得られた黄色結晶を上記と同じ操作で再結晶して、表題化合物を、２０：１より大きなＥ：Ｚ比の無色、結晶物質として得る。ES/MS (m/z): 297 (M+H), ¹H NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 1.33-1.40 (m, 2H), 1.84-1.89 (m, 2H), 3.26 (dt, J = 13.5, 9.5 Hz, 2H), 3.27 (s, 3H), 3.40-3.45 (m, 1H), 3.56-3.62 (m, 2H), 4.11 (dt, J = 13.5, 5.0 Hz, 2H), 4.62 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 5.26-5.94 (br, 1H), 7.27 (d, J = 82.0 Hz, 1H), 8.26 (s, 2H), 8.21-8.31 (br, 3H), ¹⁹F NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 122.1 (s)

【0043】

実施例４
(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－(４－メトキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－イル]オキシメチル]プロプ－２－エン－１－アミン

【化19】

Ｎ－[(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－(４－メトキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート(１６７.０mg、０.４２mmol)を０.９５Ｍ ＨＣｌの１８mL ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ(１０：１ｖ／ｖ)溶液に溶解する。混合物を一夜撹拌する。得られた懸濁液を減圧下濃縮し、残留物を水に溶解する。残留物を分取ＨＰＬＣ(ＬＣカラム：XBridge(登録商標)C18 ３０×１５０mm ５μm；０～１１分のＡＣＮ中１４～２４％１０mM ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液の勾配で溶出；カラム温度：室温；流速：３５mL／分、Ｒ_ｔ＝７.８分、１７分後停止。ＵＶでモニター)に付す。適切なフラクションを合併し、濃縮して、残留物を油状物として得る。残留物を水に溶解し、凍結乾燥させて、２０：１より大きなＥ：Ｚ比の表題化合物を白色固体として得る(９７mg、０.３１mmol、７４％、９５％純度)。ES/MS (m/z): 297 (M+H), ¹H NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 1.33-1.41 (m, 2H), 1.52-1.69 (br, 1H), 1.83-1.89 (m, 2H), 3.23-3.29 (m, 4H), 3.27 (s, 3H), 3.30-3.35 (br, 1H), 3.38-3.44 (m, 1H), 4.11 (dt, J = 13.5, 4.5 Hz, 2H), 4.55 (d, J = 4.5 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 85.0 Hz, 1H), 8.22 (s, 2H), ¹⁹F NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 131.8 (s)

【0044】

実施例４ａ
(２Ｅ)－３－フルオロ－２－({[２－(４－メトキシピペリジン－１－イル)ピリミジン－５－イル]オキシ}メチル)プロプ－２－エン－１－アミン４－メチルベンゼンスルホン酸塩(１：１)

【化20】

(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－(４－メトキシ－１－ピペリジル)ピリミジン－５－イル]オキシメチル]プロプ－２－エン－１－アミン(２.３１６ｇ、７.８１mmol)を酢酸メチル(３mL)に溶解し、１０００rpmで室温で撹拌して、淡黄色溶液を得る。４－トルエンスルホン酸一水和物(１.６２ｇ、８.４３mmol)の酢酸メチル(４mL)溶液を加える。混合物は濁り始め、濃い黄色スラリーが急速に形成される。固形物を濾紙で吸引濾過する。フィルターケーキを酢酸メチル(４mL)で濯ぎ、白色フィルターケーキを得る。固形物を、減圧気流下１０分、次いで真空オーブン中室温で一夜乾燥させて、表題化合物(３.００ｇ、８１.８％)を得る。

【0045】

実施例４ａ化合物のＸ線粉末回折
結晶(２Ｅ)－３－フルオロ－２－({[２－(４－メトキシピペリジン－１－イル)ピリミジン－５－イル]オキシ}メチル)プロプ－２－エン－１－アミン４－メチルベンゼンスルホン酸塩のＸ線粉末回折(ＸＲＤ)パターンを、ＣｕＫａ源(λ＝１.５４０６０Å)およびVantec検出器を備え、３５kVおよび５０mAで操作するBruker D4 Endeavor Ｘ線粉末回折計で得る。サンプルを、２θで４～４０°の間走査し、ステップサイズは２θで０.００９°であり、走査速度は０.５秒／ステップであり、０.６mm発散、５.２８固定散乱線除去および９.５mm検出器スリットである。乾燥粉末を石英サンプルホルダーに詰め、スライドグラスを使用して、表面を滑らかにする。結晶形態回折パターンを環境温度および相対湿度で得る。ある結晶形態について、回折ピークの相対強度は結晶形態および晶癖などの因子によりもたらされる好ましい配向により、変わり得ることは結晶学分野では周知である。好ましい配向の影響が存在するとき、ピーク強度は変わるが、多形の特徴的ピーク位置は変わらない。例えば、The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995参照。さらに、ある結晶形態について、角度ピーク位置がわずかに変わり得ることも結晶学分野では周知である。例えば、ピーク位置はサンプルを分析する時点での温度または湿度の差、サンプル移動または内部標準の存在または非存在によりシフトし得る。本件の場合、２θで±０.２のピーク位置変動性を、当該結晶形態の明確な同定を妨げることなく、これらの可能性のある変動を考慮に入れる。結晶形態の確認は、識別可能なピーク(２θ°単位)で、一般により顕著なピークの何れかの特有の組み合わせに基づいてなし得る。結晶形態回折パターンを環境温度および相対湿度で取り、８.８５３°および２６.７７４°２シータでのＮＩＳＴ ６７５標準ピークに基づき調節する。

【0046】

(２Ｅ)－３－フルオロ－２－({[２－(４－メトキシピペリジン－１－イル)ピリミジン－５－イル]オキシ}メチル)プロプ－２－エン－１－アミン４－メチルベンゼンスルホン酸塩の製造サンプルは、ＣｕＫａ照射を使用して、下記表１に記載の回折ピーク(２シータ値)、特に２２.４、１９.１および２１.０から選択されるピークの１以上と組み合わさった１８.６のピークを有するとしてＸＲＤパターンにより特徴付けられ、２シータでの±０.２°の回折角の許容範囲で、あるいは塩は、２シータで１８.６、１９.１、２１.０、２１.９および２２.４±０.２°または２シータで１７.６、１１.０、１６.８、１８.６、１９.１、２１.０、２１.９、２２.４および２６.１±０.２°の１以上のピークを有するＸＲＤパターンとして特徴付けられ得る。

【0047】

【表1】

【0048】

実施例５
(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－[(３Ｓ)－３－メトキシピロリジン－１－イル]ピリミジン－５－イル]オキシメチル]プロプ－２－エン－１－アミン

【化21】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－[(３Ｓ)－３－メトキシピロリジン－１－イル]ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート(４８１mg、１.２６mmol)およびトリフルオロ酢酸(１mL、１３.２３mmol)のＤＣＭ(３mL)溶液を、室温で１時間撹拌する。混合物を減圧下濃縮する。残留物を、分取ＨＰＬＣ(ＬＣカラム：XBridge(登録商標)C18 ３０×１５０mm ５μm；ＡＣＮ中５％１０mM ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液で０～２分、次いで、２～１２分でＡＣＮ中６～１１％１０mM ＮＨ_４ＨＣＯ_３水溶液の勾配で溶出；１８分で停止；カラム温度：室温；流速：３５mL／分、Ｒ_ｔ＝１０.６分；ＵＶで検出)に付して、２０：１より大きなＥ：Ｚ比の表題化合物(２２６mg、６１.７％)を白色固体として得る。ES/MS (m/z): 283.1 (M+H), ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 1.12-1.78 (br, 2H), 2.07-2.16 (m, 2H), 3.37 (s, 3H), 3.53-3.68 (m, 6H), 4.07 (m, 1H), 4.44 (s, 2H), 6.57 (d, J = 83.0 Hz, 1H), 8.12 (s, 2H)

【0049】

実施例６
(３Ｓ)－１－[５－[(Ｅ)－２－(アミノメチル)－３－フルオロ－アリルオキシ]ピリミジン－２－イル]ピロリジン－３－オール；二塩酸塩

【化22】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－[(３Ｓ)－３－ヒドロキシピロリジン－１－イル]ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート(６０５.９mg、１.６５mmol)を、ＨＣｌのＭｅＯＨ溶液(３０mL、１５mmol、０.５mol／Ｌ)とＨＣｌの水溶液(５mL、６０mmol、１２mol／Ｌ)の混合物に溶解する。得られた透明溶液を一夜撹拌する。反応混合物を減圧下濃縮して、残留物を得る。残留物を分取ＨＰＬＣ(ＬＣカラム：XBridge(登録商標)C18 ３０×１５０mm ５μm；Ｈ_２Ｏ １０nM ＮＨ_４ＨＣＯ_３；室温；２％ＡＣＮで０～２分、次いで２～１０％ＡＣＮ勾配で２～１０分、流速：３５mL／分で溶出、Ｒ_ｔ＝８.０分(ＵＶ検出でモニター)；１６分で停止)に付す。適切なフラクションを集め、濃縮して、表題化合物の遊離塩基を得る。遊離塩基化合物を０.５Ｍ ＨＣｌのＭｅＯＨ溶液(１５mL)に溶解する。溶液を濃縮し、水を加え、凍結乾燥して、２０：１より大きなＥ：Ｚ比の表題生成物を淡黄色固体として得る(３５２.７mg、０.９８２mmol、５９％)。ES/MS (m/z): 269 (M+H), ¹H NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 1.87-1.94 (m, 1H), 1.98-2.05 (m, 1H), 3.44 (d, J = 11.5 Hz 1H), 3.51-3.61 (m, 5H), 4.39-4.42 (m, 1H), 4.66 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 5.33-5.90 (br, 2H), 7.28 (d, J = 82.0 Hz, 1H), 8.35 (s, 2H), 8.35-8.44 (br, 3H), ¹⁹F NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 121.9 (s)

【0050】

実施例６の別製造例
ｔｅｒｔ－ブチルＮ－[(Ｅ)－３－フルオロ－２－[[２－[(３Ｓ)－３－ヒドロキシピロリジン－１－イル]ピリミジン－５－イル]オキシメチル]アリル]カルバメート(１.１６０１ｇ、３.１５mmol)をＨＣｌのＥｔＯＡｃ溶液(５０mL、５０mmol、１.０mol／Ｌ)(０.５mol／Ｌ ＨＣｌとＭｅＯＨ、５mLを予め混合)に溶解する。得られた溶液を一夜撹拌する。白色懸濁液を減圧下濃縮して、白色粉末を得る。白色粉末を水に溶解し、溶液を凍結乾燥して、表題化合物を淡黄色固体(８６０.７mg、２.４２mmol、７７％)として得る。

【0051】

実施例６として製造された物質を水(５mL)に溶解し、別実施例６の水(５mL)溶液と合わせる。混合物を凍結乾燥して、２０：１より大きなＥ：Ｚ比の表題化合物(１.１５１ｇ、３.２７mmol)を得る。ES/MS m/z: 269 (M+H), ¹H NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 1.87-1.94 (m, 1H), 1.98-2.05 (m, 1H), 3.44 (d, J = 11.5 Hz 1H), 3.51-3.61 (m, 5H), 4.39-4.42 (m, 1H), 4.66 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 5.33-5.90 (br, 2H), 7.28 (d, J = 82.0 Hz, 1H), 8.35 (s, 2H), 8.35-8.44 (br, 3H), ¹⁹F NMR (500 MHz, d₆-DMSO) δ 121.9 (s)

【0052】

生物学的アッセイ
ＳＳＡＯ／ＶＡＰ－１インビトロ活性
組み換えＳＳＡＯ、ＭＡＯａおよびＭＡＯｂアイソフォームのアミンオキシダーゼ活性を、PromegaのMAO-Glo^ＴＭアッセイキット(Ｖ１４０２)を使用して測定する。試験化合物(ＳＳＡＯについて媒体としてＤＭＳＯ、０.５％ｖ／ｖ)および酵素を、１０分、室温でインキュベートして、発光基質を加える。基質濃度はヒト組み換えＳＳＡＯについて１０μMである。アッセイを、ｐＨ７.４緩衝液(５０mM ＨＥＰＥＳ、１２０mM ＮａＣｌ、５mM ＫＣｌ、２mM ＣａＣｌ_２、１.４mM ＭｇＣｌ_２、０.００１％Ｔｗｅｅｎ－２０)でウェルプレートで行う。基質酸化を２時間行い、製造業者のプロトコールに従い、検出試薬を加える。試験化合物のＩＣ_５０値を、用量応答曲線を４パラメータ非線形回帰ルーティンに適合させることにより、計算する。実施例３、５および６の化合物のＩＣ_５０値を表２に記載する。

【表2】

データをアッセイ数(ｎ)に対する平均±ＳＥＭ(ＳＥＭ＝平均の標準誤差)で表す。
実施例化合物は、ｈＳＳＡＯに対して６０nM未満のＩＣ_５０を示す。実施例化合物は、それぞれ５０μMおよび２００μMを超えるｈＭＡＯａおよびｈＭＡＯｂに対するＩＣ_５０を示し、実施例化合物がｈＭＡＯａまたはｈＭＡＯｂの何れよりもｈＳＳＡＯに選択的であることが示される。

【0053】

ＳＳＡＯ標的結合
ラット血漿および肝臓組織でのＳＳＡＯ活性を、PromegaからのMAO-Glo^ＴＭアッセイキット(Ｖ１４０２)を使用して測定する。化合物処置後のラットにおける残存ＳＳＡＯ活性を、ＭＡＯ阻害剤クロルギリンおよびパルギリン存在に非感受性である、血漿または肝臓ライセート中の総アミンオキシダーゼ活性の測定により概算する。ラットに、実施例化合物２を１５mg／kg、３mg／kg、０.６mg／kg、０.１２mg／kg、０.０２５mg／kg、０.００５mg／kg用量で投与する。対照群に等量(２ml／kg)の投与媒体(ヒドロキシエチルセルロース１％ｗ／ｖ、０.２５％Ｔｗｅｅｎ ８０)を投与する。化合物処置２時間または２４時間後の血漿および肝臓を採取し、分析まで－７８℃で保存する。組織ライセートを、溶解緩衝液(２０mM ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、１mM ＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および１×Roche Complete protease inhibitor錠)中で均質化することにより調製する。組織片を、１２,０００rpmで、４℃で３０分の遠心分離により除く。４０μlの血漿または肝臓ライセートをクロルギリン(１０μM)およびパルギリン(１０μM)と、２０分、室温でインキュベートし、発光基質(５０μM)を６０分加える。生成物を、製造業者のプロトコールにより定量する。ＭＡＯ阻害剤の存在に非感受性である活性画分を残存ＳＳＡＯ活性のサロゲートとして使用する。実施例化合物２を、本質的に上記プロトコールで、種々の用量で投与して評価した。結果を表３に記載する。

【表3】

データを平均±ＳＥＭ、ｎ＝６で表す
結果は、実施例化合物２がラット血漿および肝臓両者におけるＳＳＡＯ活性を用量依存性に阻害することを示す。

【0054】

３Ｈ餌により誘発されたＮＡＳＨおよび線維症のマウスモデル
雄Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスにD09100301餌(Research Diets、４０％脂肪、２％コレステロール、２４％フルクトース(高脂肪、高コレステロールおよび高フルクトース、“３Ｈ餌”))を１５０日間与える。各マウスを、順応期間の５日間の後、一匹ずつで飼育する。血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)およびサイトケラチン１８(ＣＫ１８)を測定する。１週間の回復後、マウスをＡＬＴ値、ＣＫ１８値および体重に基づき５群に無作為化する。各群の動物に、媒体(蒸留水中０.５％メチルセルロース(ＭＣ)＋０.２５％Ｔｗｅｅｎ ８０)または実施例６化合物(０.０６mg／kg、２mg／kg、６mg／kgおよび２０mg／kg用量)を、１日１回、５ml／kg容積で１１週間与える。
実施例６化合物で７６日処置マウスを、最終投与２時間後に採血する。血漿中の化合物レベルを質量分析で分析する。結果を下の表４に示す。処置マウスは、血漿化合物レベルの用量依存的増加を示す。実施例６で処置した全群のマウスは、ＡＬＴの有意な減少を示し、これらの動物における肝臓病変減少を示す。６mg／kgおよび２０mg／kgの実施例６化合物で処置した動物も、血中トリグリセリドレベルの減少を示す。

【0055】

試験の最後に、動物を屠殺し、肝臓を摘出する。左葉および右葉の２切片を中性緩衝化１０％ホルマリンに固定する。肝臓組織スライドをヘマトキシリンおよびエオシン(Ｈ＆Ｅ)、シリウスレッドおよびマッソントリクロームで染色して、組織分析用スライドを調製する。全切片を顕微鏡で試験し、修飾Brunt score NASH Activity Scoreとして採点する。採点は、Brunt E. M, et al., “Histopathology of nonalcoholic fatty liver disease,” World J. of Gastroenterol, 2010, 16(42), 5286-5296に記載の等級付けスキームおよびエンドポイントに基づく。次いで群平均を、各個々のエンドポイントについて計算する。次のエンドポイントを使用して、ＮＡＳＨエンドポイントから改変された、マウスにおけるＮＡＳＨのファーストフードモデルを特徴付ける(Brunt, E. M. “Histopathology of nonalcoholic fatty liver disease,” Clin Liver Dis., 2009, 13, 533-544 and Brunt, E. M, et al., “Nonalcoholic steatohepatitis: A proposal for grading and staging the histological lesions”, Am J Gastroenterology, 1999, 94(9), 2467-2474参照)。
実施例６化合物処置マウスからの肝臓の組織病理学的分析を表４に示す。結果は、２０mg／kgの実施例化合物６で処置されたマウスにおいて、肝炎症、大滴性空胞化および類洞周囲線維症の有意な減少があることを示す。

【0056】

【表4】

^１ＭＩＸＥＤモデルを適用して、化合物処置群と媒体群間のベースラインにより調節したベースラインからの変化倍率を比較する(“Generalized, Linear, and Mixed Models,” McCulloch, C.E., and Searle, S.R., Eds. John Wiley and Sons, 2000 and “Mixed-Effects Models in S and S-PLUS”, Pinheiro J.C., and Bates, D. M., Eds. Springer, 2000.参照)データを平均±ＳＥＭで示す。^＊ ｐ＜０.０５；^＊＊ｐ＜０.０１；^＊＊＊ ｐ＜０.００１

【0057】

【表5】

^１ ノンパラメトリック検定を適用して、化合物処置群と媒体群の間のスコアを比較する。左側方および右側方のスコアを別々に比較する。データを平均±ＳＥＭで示す。^＊ ｐ＜０.０５；^＊＊ｐ＜０.０１；^＊＊＊ ｐ＜０.００１