特許 7374497 全血からの血漿分離の効率を判定する方法およびキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2023-10-27

(45)【発行日】2023-11-07

(54)【発明の名称】全血からの血漿分離の効率を判定する方法およびキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/686 20180101AFI20231030BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20231030BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20231030BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20231030BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/686 Z ZNA

C12Q1/6851 Z

C12Q1/6876 Z

C12N15/11 Z

【請求項の数】 31

(21)【出願番号】P 2020540351

(86)(22)【出願日】2019-02-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-06-17

(86)【国際出願番号】 IL2019050201

(87)【国際公開番号】W WO2019162941

(87)【国際公開日】2019-08-29

【審査請求日】2022-02-17

(31)【優先権主張番号】62/633,094

(32)【優先日】2018-02-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517435261

【氏名又は名称】ニュークレイクス リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】フルムキン，ダニー

(72)【発明者】

【氏名】ヴァッサストロム，アダム

(72)【発明者】

【氏名】ニルシュ，レヴィタル

【審査官】斉藤 貴子

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１８６２３９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】DIAZ, I. M. et al.，Performance of Streck cfDNA Blood Collection Tubes for Liquid Biopsy Testing，PloS one，2016年，11 (11)，e0166354，doi.org/10.1371/journal.pone.0166354

【文献】NORTON, S. E. et al.，A stabilizing reagent prevents cell-free DNA contamination by cellular DNA in plasma during blood sample storage and shipping as determined by digital PCR，Clinical Biochemistry，2013年，Vol. 46，P. 1561-1565

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｎ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

全血からの血漿分離の効率を判定する方法であって、前記方法が、
（ａ）血漿サンプルからＤＮＡを取得することと、
（ｂ）リアルタイムＰＣＲ共増幅によって、
（ｉ）第１のプライマー対を使用した第１のゲノム遺伝子座からの７０～１５０塩基対の第１の増幅産物と、
（ｉｉ）第２のプライマー対を使用した第２のゲノム遺伝子座からの少なくとも３５０塩基対の第２の増幅産物とを生成することと、
（ｃ）前記第１および第２の増幅産物の各々について信号強度を計算することと、
（ｄ）前記信号強度間の差が所定の閾値を超えるときに前記血漿サンプルが分離されていると判定することと、を含み、
前記第１および第２の増幅産物が、血漿ＤＮＡおよび全血ＤＮＡについての明確な信号強度差を生成する、方法。

【請求項2】

前記方法が、前記第１および第２の増幅産物を特異的に検出する蛍光プローブを加えることをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記信号強度が定量化サイクル（Ｃｑ）であり、前記血漿サンプルが、前記第１および第２の増幅産物のＣｑ値間の差（ΔＣｑ）に基づいて分離されていると判定される、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ΔＣｑ（Ｃｑ（第２）－Ｃｑ（第１））が所定の閾値ΔＣｑを超えるときに、前記血漿サンプルが分離されていると判定される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記第１および第２のプライマー対が同等の効率のものである、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の増幅産物が１００～１５０塩基対のものである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記第２の増幅産物が３５０～７００塩基対のものである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記第２の増幅産物が３５０～５５０塩基対のものである、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記第１の増幅産物が、配列番号１および配列番号１０からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記第１の増幅産物が、配列番号１または配列番号１０に示される配列からなる、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記第２の増幅産物が、配列番号２、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記第２の増幅産物が、配列番号２、配列番号７、配列番号８または配列番号９に示される配列からなる、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記第１および第２の増幅産物が、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記第１および第２の増幅産物が、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される配列からなる、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記血漿サンプルがヒト血液サンプルに由来する、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

全血からの血漿分離の効率を判定するキットであって、
（ｉ）第１のゲノム遺伝子座からの７０～１５０塩基対の第１の増幅産物をリアルタイムＰＣＲによって生成するための第１のプライマー対であって、前記第１の増幅産物が、配列番号１および配列番号１０からなる群から選択される配列を含む、第１のプライマー対と、
（ｉｉ）第２のゲノム遺伝子座からの少なくとも３５０塩基対の第２の増幅産物をリアルタイムＰＣＲによって生成するための第２のプライマー対であって、前記第２の増幅産物が、配列番号２、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される配列を含む、第２のプライマー対と、
（ｉｉｉ）前記第１および第２の増幅産物を検出して、各増幅産物についての信号強度を判定するためのプローブと、を含み、
前記第１および第２の増幅産物が、血漿ＤＮＡおよび全血ＤＮＡについての明確な信号強度差を生成する、キット。

【請求項17】

信号強度差と分離レベルとの間の相関を指示する取扱説明書をさらに含む、請求項１６に記載のキット。

【請求項18】

前記取扱説明書が、前記第１の増幅産物と前記第２の増幅産物との間の閾値信号強度差を提供し、それを超えると血漿サンプルが分離されていると判定される、請求項１７に記載のキット。

【請求項19】

前記取扱説明書が、閾値ΔＣｑ（Ｃｑ（第２）－Ｃｑ（第１））を提供し、それを超えると血漿サンプルが分離されていると判定される、請求項１８に記載のキット。

【請求項20】

前記プローブが蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブである、請求項１６に記載のキット。

【請求項21】

前記第１および第２のプライマー対が同等の効率のものである、請求項１６に記載のキット。

【請求項22】

前記第１の増幅産物が１００～１５０塩基対のものである、請求項１６に記載のキット。

【請求項23】

前記第２の増幅産物が３５０～７００塩基対のものである、請求項１６に記載のキット。

【請求項24】

前記第２の増幅産物が３５０～５５０塩基対のものである、請求項１６に記載のキット。

【請求項25】

前記第１の増幅産物が、配列番号１または配列番号１０に示される配列からなる、請求項１６に記載のキット。

【請求項26】

前記第２の増幅産物が、配列番号２、配列番号７、配列番号８または配列番号９に示される配列からなる、請求項１６に記載のキット。

【請求項27】

前記第１および第２の増幅産物が、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される配列を含む、請求項１６に記載のキット。

【請求項28】

前記第１および第２の増幅産物が、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される配列からなる、請求項１６に記載のキット。

【請求項29】

前記第１のプライマー対が配列番号３（順方向）および配列番号４（逆方向）である、請求項１６に記載のキット。

【請求項30】

前記第２のプライマー対が配列番号５（順方向）および配列番号６（逆方向）である、請求項１６に記載のキット。

【請求項31】

前記第１のプライマー対が配列番号３（順方向）および配列番号４（逆方向）であり、前記第２のプライマー対が配列番号５（順方向）および配列番号６（逆方向）である、請求項１６に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血漿サンプルが全血の細胞画分から十分に分離されているかどうかを評価するためのリアルタイムＰＣＲアッセイに関する。本発明は、循環無細胞ＤＮＡの利用を必要とする診断試験に有利である。

【背景技術】

【0002】

循環無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、正常細胞と腫瘍細胞の両方から血液循環に放出されるＤＮＡである。血液中のｃｆＤＮＡの起源は完全には解明されていないが、アポトーシス、壊死、細胞からの活発な放出に関連していると考えられている。血液中のｃｆＤＮＡの存在は数十年前から知られていたが、その真の診断能力は近年になって初めて理解され、ｃｆＤＮＡの検出と分析への関心が高まっている。例えば、母体血中に存在する胎児ｃｆＤＮＡは現在、非侵襲的な出生前診断に使用されていて、癌患者の代理マーカーとして腫瘍由来ｃｆＤＮＡを使用した臨床研究が進行中である。

【0003】

ｃｆＤＮＡの分析では、まず全血から血漿（ｃｆＤＮＡを含む）を分離する必要がある。従来、血漿は遠心分離またはろ過によって血液から分離されていた。新しいマイクロ流体法が現在浮上している。分離後、ｃｆＤＮＡは、さらなる分析の前に、抽出によってさらに精製することができる。

【0004】

血液の細胞画分からのｃｆＤＮＡの効果的な分離は、ｃｆＤＮＡ分析の品質にとって非常に重要である。採血から血漿処理までの間に白血球から放出されたＤＮＡにより血漿が汚染されると、サンプル中のｃｆＤＮＡの割合が減少し、ｃｆＤＮＡ分析のノイズおよび不正確さが増加する。分離効率を評価するには、通常、血球計算装置を使用して手動でまたはフローサイトメーターを使用して自動的に、血球数を測定する。しかしながら、そのような方法には多くの欠点があり、一部は面倒で高価であり、他は精度が不十分である。

【0005】

循環ｃｆＤＮＡはほとんど、長さが３００塩基対未満、２００塩基対未満でさえある断片であることが研究で示されている一方（Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５０（１）：８８－９２）、白血球由来のＤＮＡはほとんど、１０ｋｂｓ以上の長い断片である。

【0006】

分子サイズに基づいてＤＮＡを分離するゲル電気泳動法は、長いＤＮＡ断片対短いＤＮＡ断片の存在を検出することによって分離効率を判定するために提案されている。しかしながら、そのような方法は大量のＤＮＡを必要とし、これは循環している無細胞ＤＮＡを扱う場合の最大の課題となっている。

【0007】

Ｎｏｒｔｏｎら（２０１３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４６：１５６１－１５６５）は、血液サンプルの保存および発送中に、細胞ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）による無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の汚染を防ぐ安定化剤の能力を研究した。ｇＤＮＡによる汚染は、デジタルＰＣＲを使用して評価された。特に、デジタルＰＣＲ技術を利用して、β－アクチン遺伝子からの４２０塩基対ＤＮＡ断片を増幅することによって汚染しているｇＤＮＡを定量した。第２のデジタルＰＣＲアッセイを使用して、１３６塩基対の短いβ－アクチンアンプリコンを増幅することによってｃｆＤＮＡを定量した。これらのアッセイを使用して、血漿ｃｆＤＮＡサンプルの品質を判定し、ｇＤＮＡ汚染の程度を評価した。

【0008】

操作が簡単で、費用対効果が高く、正確な、全血からの血漿分離の効率を判定する改善された方法およびキットが必要である。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、いくつかの態様によって、２つのアンプリコン、すなわち、例えば、７０～１５０塩基対の短いアンプリコンおよび、例えば、３５０～６００塩基対の長いアンプリコンの定量的ＰＣＲ増幅を使用して、全血からの血漿分離の効率を判定する方法およびキットを提供する。分離効率は、２つのアンプリコンの増幅レベルの差に基づいて判定される。有利には、分離効率は、ＤＮＡの絶対定量および／または任意の遺伝子／遺伝子座のコピー数の判定なしに判定される。

【0010】

血液の血漿画分中のＤＮＡはほとんど、無細胞ＤＮＡの短い断片であり、長さが最大約３００塩基対である。血漿画分が血液の細胞成分から十分に分離されていない場合、血漿は白血球に由来するＤＮＡをさらに含む。後者はほとんど、１０Ｋｂｓ以上の長い断片である。したがって、血漿サンプル中のＤＮＡの長い断片の存在は、全血からの血漿分離の効率に関する指標を提供する。

【0011】

本明細書に開示している方法では、試験した血漿サンプルからの短いアンプリコンおよび長いアンプリコンを共増幅して、増幅パターンを分析する。本明細書に開示している方法によれば、血液の細胞画分から十分に分離された血漿サンプルにおいて、２つのアンプリコンの増幅レベルにおける有意差が観察され、短いアンプリコンは、長いアンプリコンと比較して、より高い効率で増幅される。いずれの理論や作用メカニズムにも拘束されるものではないが、増幅レベルの違いは、試験された血漿サンプル中の白血球からの長いＤＮＡに対する短い無細胞ＤＮＡの比率を反映するため、血漿分離の効率を示す。

【0012】

有利には、増幅レベルの差は、同じ反応混合物中の（すなわち、同じ反応条件下で）同じＤＮＡテンプレートから共増幅されたアンプリコン間で計算される。このセットアップにより、本明細書に開示している方法は、テンプレートＤＮＡ濃度の変化、ＰＣＲ条件および不純物／阻害剤の存在などの様々な「ノイズ」因子の影響を受けなくなる。本発明の方法は、いかなる時点においても、ＤＮＡの絶対定量および／または任意の遺伝子／遺伝子座のコピー数の判定を必要としないことに留意する必要がある。したがって、いかなるゲノム遺伝子座の実際の量、濃度および／またはコピー数も、本発明の方法には関連しない。したがって、本明細書で開示している方法は、絶対定量に含まれる標準曲線および／または追加の面倒なステップの必要性を排除し、それにより、感度、品質および／または精度を損なうことなく、単純で費用対効果の高い手順を提供する。さらに、リアルタイムＰＣＲを採用することによって、テンプレートＤＮＡの任意の濃度に対して有効であり、テンプレートの希釈または他の調節を必要としない。

【0013】

一態様によれば、本発明は、全血からの血漿分離の効率を判定するための方法を提供し、方法が、
（ａ）血漿サンプルからＤＮＡを取得することと、
（ｂ）ＰＣＲ共増幅によって、
（ｉ）第１のプライマー対を使用した第１のゲノム遺伝子座からの７０～１５０塩基対の第１の増幅産物と、
（ｉｉ）第２のプライマー対を使用した第２のゲノム遺伝子座からの少なくとも３５０塩基対の第２の増幅産物と、を生成することと、
（ｃ）該第１および第２の増幅産物の各々について信号強度を計算することと、
（ｄ）信号強度間の差が所定の閾値を超えるときに血漿サンプルが分離されていると判定することと、を含み、
第１および第２の増幅産物は、血漿ＤＮＡおよび全血ＤＮＡについての明確な信号強度差を生成する、方法を提供する。

【0014】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、リアルタイムＰＣＲを使用して実行される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）がリアルタイムＰＣＲを使用して実行されるとき、方法は、第１および第２の増幅産物を特異的に検出するための蛍光プローブを加えることをさらに含む。

【0015】

一部の実施形態では、ステップ（ｂ）がリアルタイムＰＣＲを使用して実行されるとき、信号強度が定量化サイクル（Ｃｑ）であり、血漿サンプルが、第１の増幅産物と第２の増幅産物のＣｑ値間の差（ΔＣｑ）に基づいて分離されていると判定される。いくつかの実施形態では、ΔＣｑ（Ｃｑ（第２）－Ｃｑ（第１））が所定の閾値ΔＣｑを超えるときに血漿サンプルが分離されていると判定される。

【0016】

いくつかの実施形態では、第１および第２のプライマー対は同等の効率のものである。

【0017】

いくつかの実施形態では、第１の増幅産物は１００～１５０塩基対のものである。

【0018】

いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は３５０～７００塩基対のものである。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は３５０～６５０塩基対のものである。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は３５０～５５０塩基対のものである。

【0019】

いくつかの実施形態では、第１の増幅産物は、配列番号１および配列番号１０からなる群から選択される配列を含む。各可能性について、本発明の別個の実施形態により示す。いくつかの実施形態では、第１の増幅産物は、配列番号１に示される配列または
配列番号１０に示される配列からなる。各可能性について、本発明の別個の実施形態により示す。

【0020】

いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号２、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される配列を含む。各可能性について、本発明の別個の実施形態により示す。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号２、配列番号７、配列番号８または
配列番号９に示される配列からなる。各可能性について、本発明の別個の実施形態により示す。

【0021】

いくつかの実施形態では、第１および第２の増幅産物は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、第１および第２の増幅産物は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される配列からなる。

【0022】

いくつかの実施形態では、血漿サンプルはヒト血液サンプルに由来する。

【0023】

さらなる態様によれば、本発明は、全血からの血漿分離の効率を判定するキットであって、
（ｉ）第１のゲノム遺伝子座からの７０～１５０塩基対の第１の増幅産物をＰＣＲによって生成するための第１のプライマー対と、
（ｉｉ）第２のゲノム遺伝子座からの少なくとも３５０塩基対の第２の増幅産物をＰＣＲによって生成するための第２のプライマー対と、
（ｉｉｉ）第１および第２の増幅産物を検出して、各増幅産物についての信号強度を判定するためのプローブと、を含み、
第１および第２の増幅産物は、血漿ＤＮＡおよび全血ＤＮＡについての明確な信号強度差を生成する、キットを提供する。

【0024】

いくつかの実施形態では、キットは、信号強度差と分離レベルとの間の相関を指示する取扱説明書をさらに含む。いくつかの実施形態では、取扱説明書は、第１の増幅産物と第２の増幅産物との間の閾値信号強度差を提供し、それを超えると血漿サンプルが分離されていると判定される。いくつかの特定の実施形態では、取扱説明書は、閾値ΔＣｑ（Ｃｑ（第２）－Ｃｑ（第１））を提供し、それを超えると血漿サンプルが分離されていると判定される。

【0025】

いくつかの実施形態では、プローブは、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブである。

【0026】

いくつかの実施形態では、第１および第２のプライマー対は同等の効率のものである。

【0027】

いくつかの実施形態では、第１の増幅産物は１００～１５０塩基対のものである。

【0028】

いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は３５０～７００塩基対のものである。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は３５０～６５０塩基対のものである。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は３５０～５５０塩基対のものである。

【0029】

いくつかの実施形態では、第１の増幅産物は、配列番号１および配列番号１０からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅産物は、配列番号１または配列番号１０に示される配列からなる。

【0030】

いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号２、配列番号７、配列番号８および配列番号９からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号２、配列番号７、配列番号８または配列番号９に示される配列からなる。

【0031】

いくつかの実施形態では、第１および第２の増幅産物は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、第１および第２の増幅産物は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される配列からなる。

【0032】

いくつかの実施形態では、第１のプライマー対は配列番号３（順方向）および配列番号４（逆方向）である。

【0033】

いくつかの実施形態では、第２のプライマー対は配列番号５（順方向）および配列番号６（逆方向）である。

【0034】

いくつかの実施形態では、第１のプライマー対は配列番号３（順方向）および配列番号４（逆方向）であり、第２のプライマー対は配列番号５（順方向）および配列番号６（逆方向）である。

【0035】

本発明のこれらのおよびさらなる態様および特徴は、以下の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1A-C】血漿（Ａ）、白血球で汚染された血漿（Ｂ）、および全血からのＤＮＡ（Ｃ）からのＤＮＡサンプルにおける短い（「ＪＯＥ」）および長い（「ＦＡＭ」）増幅産物の例示的な定量的ＰＣＲプロット。

【発明を実施するための形態】

【0037】

本発明は、２つのアンプリコン、すなわち、７０～１５０塩基対の短いアンプリコンおよび少なくとも３５０塩基対の長いアンプリコンのリアルタイムＰＣＲ増幅を使用して、全血の細胞画分からの血漿分離の効率を判定することに関する。

【0038】

血漿中に含まれるＤＮＡ（「血漿ＤＮＡ」）はほとんど、無細胞ＤＮＡであり、通常は３００塩基対未満の長さを有するＤＮＡ断片を含む。対照的に、全血中のＤＮＡ（「全血ＤＮＡ」）はほとんど、白血球から放出されたＤＮＡであり、通常は１０Ｋｂ以上のＤＮＡ断片を含む。短いＤＮＡ断片対長いＤＮＡ断片の比率に関する血漿と全血とのＤＮＡ内容物の違いは、短いアンプリコンと長いアンプリコンの異なる増幅パターンを確立し、血液の細胞成分からの血漿サンプルの分離効率を判定することを可能にする。

【0039】

本明細書で使用する場合、「無細胞ＤＮＡ」および「循環無細胞ＤＮＡ（「ｃｆＤＮＡ」と略される）という用語は、互換的に使用され、血液中を自由に循環するＤＮＡ分子を指す。無細胞ＤＮＡ分子はほとんど、長さが４００塩基対未満、３００塩基対未満でさえ、または長さが２００塩基対未満でさえある。

【0040】

本明細書で使用する場合、「白血球由来のＤＮＡ」、「白血球ＤＮＡ」、「汚染している白血球ＤＮＡ」などの用語は、白血球から放出されたＤＮＡを指す。白血球ＤＮＡはほとんど、長さが１０ｋｂ以上のＤＮＡ断片で構成されている。

【0041】

本明細書で使用する場合、「血漿分離効率の判定」、「血漿サンプルが分離されていることの判定」、「血漿サンプルが十分に／効率的に分離されていることの判定」などの語句は交換可能であり、血漿中の汚染している白血球ＤＮＡのレベルが無細胞ＤＮＡの分析を妨害しないようなものであると判定することを指す。無細胞ＤＮＡの分析を含む様々な診断用途では、様々なレベルの血漿の純度が必要になる場合がある（すなわち、許容される様々なレベルの白血球ＤＮＡの汚染によって特徴付けられる場合がある）。したがって、本発明により増幅された短いアンプリコンと長いアンプリコンとの間の閾値ΔＣｑなど、超えると血漿サンプルが分離されると判定される閾値は、様々なアッセイに対して異なる場合がある。閾値は、特定の診断アッセイの要件に基づいて設定されてもよい。

【0042】

第１のゲノム遺伝子座および第２のゲノム遺伝子座の選択ならびに短いアンプリコンおよび長いアンプリコンを生成するためのプライマーの設計
本明細書に開示している血漿分離の品質を評価するアッセイは、第１のゲノム遺伝子座からの短いアンプリコン（例えば、約１００塩基対）および第２のゲノム遺伝子座からの長いアンプリコン（例えば、約５００塩基対）を生成するプライマーを用いたデュプレックスＰＣＲを含む。短いアンプリコンおよび長いアンプリコンは、血漿ＤＮＡおよび全血ＤＮＡについての異なるΔＣｑ値などの血漿ＤＮＡおよび全血ＤＮＡについての異なる信号強度差を生成する。

【0043】

血漿中のＤＮＡは単に断片化されたゲノムＤＮＡではなく、ゲノムの偏った表現であり、一部のゲノム遺伝子座は過小に表され、他のゲノム遺伝子座は全血ＤＮＡに関して過大に表される。血漿ＤＮＡおよび全血ＤＮＡについての異なるΔＣｑ値を生成する短いアンプリコンおよび長いアンプリコンの対には、血漿ＤＮＡで同等に表されるゲノム遺伝子座からの短いアンプリコンおよび長いアンプリコンの対、ならびに、長いアンプリコンが、短いアンプリコンのゲノム遺伝子座と比較して、血漿ＤＮＡにおいて過小に表されるゲノム遺伝子座からのものである、短いアンプリコンおよび長いアンプリコンの対が含まれる。

【0044】

そのような遺伝子座の対が同じ効率を有するプライマーで増幅されるとき、それらの増幅レベルの違いは、サンプル中の長いＤＮＡ断片に対する短いＤＮＡ断片の比率を反映し、長いアンプリコンの増幅レベルが低いほど、サンプル中の長いＤＮＡ断片の量は小さくなり、それに応じて血漿の分離は良好になる。

【0045】

したがって、いくつかの実施形態では、第１および第２のゲノム遺伝子座は、血漿ＤＮＡにおいて同等に表される。追加の実施形態では、第２の遺伝子座は、第１の遺伝子座と比較して、血漿ＤＮＡにおいて過小に表される。いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は、（ａ）血漿サンプルからＤＮＡを得ることと、（ｂ）ＰＣＲ共増幅によって、第１のプライマー対を使用した第１のゲノム遺伝子座からの７０～１５０塩基対の第１の増幅産物と、第２のプライマー対を使用した第２のゲノム遺伝子座からの少なくとも３５０塩基対の第２の増幅産物とを生成することであって、該第１および第２のゲノム遺伝子座が、血漿ＤＮＡにおいて同等に表されるか、または第２のゲノム遺伝子座が、第１の遺伝子座と比較して、血漿ＤＮＡにおいて過小に表される、生成することと、（ｃ）該第１および第２の増幅産物の各々について信号強度を計算することと、ｄ）信号強度間の差が所定の閾値を超えるときに、血漿サンプルが分離されていると判定することと、を含む。

【0046】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、（ａ）血漿サンプルからＤＮＡを得ることと、（ｂ）リアルタイムＰＣＲ増幅により、第１のプライマー対を使用した第１のゲノム遺伝子座からの７０～１５０塩基対の第１の増幅産物と、第２のプライマー対を使用した第２のゲノム遺伝子座からの少なくとも３５０塩基対の第２の増幅産物とを生成することであって、該第１および第２のゲノム遺伝子座が、血漿ＤＮＡにおいて同等に表されるか、または第２のゲノム遺伝子座が、第１の遺伝子座と比較して、血漿ＤＮＡにおいて過小に表される、生成することと、（ｃ）該第１および第２の増幅産物の各々についてＣｑ値を計算することと、ｄ）ΔＣｑ（Ｃｑ（第２）－Ｃｑ（第１）が所定の閾値ΔＣｑを超えるときに、血漿サンプルが分離されていると判定されることと、を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、（ａ）血漿サンプルからＤＮＡを得ることと、（ｂ）リアルタイムＰＣＲ増幅により、第１のプライマー対を使用した第１のゲノム遺伝子座からの７０～１５０塩基対の第１の増幅産物と、第２のプライマー対を使用した第２のゲノム遺伝子座からの少なくとも３５０塩基対の第２の増幅産物とを生成することであって、該第１および第２のゲノム遺伝子座が、血漿ＤＮＡにおいて同等に表されるか、または第２のゲノム遺伝子座が、第１の遺伝子座と比較して、血漿ＤＮＡにおいて過小に表される、生成することと、（ｃ）該第１および第２の増幅産物の各々についてＣｑ値を判定することと、任意に、（ｄ）ΔＣｑ（Ｃｑ（第２）－Ｃｑ（第１））を計算することであって、第１および第２の増幅産物が、血漿ＤＮＡおよび全血ＤＮＡについて異なるΔＣｑを生成する、計算することと、を含む、血漿サンプルを分析する方法を本明細書で提供している。

【0048】

無細胞血漿ＤＮＡで同等に表される２つのゲノム遺伝子座の選択、およびこれらの遺伝子座からの短いアンプリコンおよび長いアンプリコンの設計を、例えば、次のように実行できる。
１．ゲノム遺伝子座のランダムな対を選択する。例えば、ＧＣ含有量が３０～６０％の遺伝子座を選択してもよい。
２．短い（約１００塩基対）アンプリコンを生成する増幅のためのプライマー対を設計する。
３．シングルプレックス（個別）反応における全血ＤＮＡに関してＰＣＲにおけるプライマー対の効率を判定する。
プライマーの効率を判定する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、プライマー対の効率は、（ｉ）プライマーの特定の濃度を選択し、（ｉｉ）テンプレートＤＮＡ（例えば、全血ＤＮＡ）の連続希釈でリアルタイムＰＣＲ反応を行い（例えば、各反応（各希釈）についてのＣｑ値を判定し、（ｉｉ）各希釈についてのテンプレートの開始量の対数に対してＣｑ値をプロットすることにより標準曲線を作成し、（ｉｖ）標準曲線の勾配を計算し、（ｖ）勾配に基づいて反応効率を判定することにより実行し得る。通常、効率は、式：効率＝１０^{－１／勾配}を使用して計算される。増幅効率は、百分率、すなわち、各サイクルで増幅されたテンプレートのパーセントとしても頻繁に示される。百分率を計算するには、式：％効率＝（効率－１）ｘ１００を適用する。
４．プライマーの効率が同等でないゲノム遺伝子座の対を削除し、プライマーの効率が同等のゲノム遺伝子座の対で続行する。
５．ゲノム遺伝子座の各対について、血漿ＤＮＡ内の遺伝子座のコピー数を比較し、異なるコピー数を有する対を排除する（換言すると、遺伝子座の１つが、他と比較して血漿ＤＮＡにおいて過大に表されている血漿ＤＮＡ内に表現バイアスを有する対を排除し、血漿ＤＮＡにおいて同等の表現を有する対を選択する）。
血漿ＤＮＡのコピー数の差の評価を、例えば、（ｉ）同等の効率を有する各遺伝子座からの短いアンプリコンを増幅する前のステップで選択されたプライマーを使用して、血漿ＤＮＡからのおよび全血ＤＮＡからのゲノム遺伝子座を定量的に増幅し、（ｉｉ）各ＤＮＡサンプル（血漿ＤＮＡまたは全血ＤＮＡ）について、２つの遺伝子座間のΔＣｑを計算し、（ｉｉｉ）血漿ＤＮＡ中のΔＣｑ対全血ＤＮＡ中のΔＣｑにしたがってコピー数の差を判定することにより実行してもよい。
６．前のステップで血漿ＤＮＡにおいて同等に表されていることが判明した選択されたゲノム遺伝子座の対について、対におけるゲノム遺伝子座の１つに対する長い（＞３５０塩基対）アンプリコン用のプライマーを設計する。
７．上記のように、全血ＤＮＡに関して長いアンプリコンのプライマーの効率を判定する。
８．同じ効率が達成されるまで、短いアンプリコンのプライマーおよび長いアンプリコンのプライマーの効率を校正する。例えば、プライマーの５´または３´末端に塩基を追加／そこから塩基を削除することによって、プライマーの配列をわずかに変えることで効率を変更し得る。代替的にまたは付加的に、同等の効率を達成するために、プライマー濃度を調製し得る。

【0049】

得られたプライマーは、血漿ＤＮＡにおいて同等に表される２つのゲノム遺伝子座を同じ効率で増幅する（サイズが異なるアンプリコンを使用するが）。

【0050】

長いアンプリコンが、短いアンプリコンのゲノム遺伝子座と比較して血漿ＤＮＡで過小に表されるゲノム遺伝子座に由来する、短いアンプリコンおよび長いアンプリコンの対の設計は、例えば、次のように実行できる。
１．ゲノム遺伝子座のランダムな対を選択する。
２．短い（約１００塩基対）アンプリコンを生成する増幅のためのプライマー対を設計する。
３．上記のように、シングルプレックス（個別）反応における全血ＤＮＡに関してＰＣＲにおけるプライマーの効率を判定する。
４．プライマーの効率が同等でないゲノム遺伝子座の対を削除し、プライマーの効率が同等のゲノム遺伝子座の対で続行する。
５．ゲノム遺伝子座の各対について、血漿ＤＮＡ内の遺伝子座のコピー数を比較し（上記のように）、遺伝子座の１つが、他と比較して血漿ＤＮＡにおいて過小に表されている異なるコピー数の対を選択する。
６．選択された遺伝子座の対について、他と比較して過小に表されていることが判明したゲノム遺伝子座についての長い（＞３５０塩基対）アンプリコン用のプライマーを設計する。
７．上記のように、全血ＤＮＡに関して長いアンプリコンのプライマーの効率を判定する。
８．同じ効率が達成されるまで、短いアンプリコンのプライマーおよび長いアンプリコンのプライマーの効率を校正する。例えば、プライマーの５´または３´末端に塩基を追加／から塩基を削除することによって、プライマーの配列をわずかに変えることで効率を変更し得る。代替的にまたは付加的に、同等の効率を達成するために、プライマー濃度を調製し得る。

【0051】

上で詳述したように、プライマー／ＰＣＲ反応の効率は、既知の方法によって（例えば、標準曲線を生成し、標準曲線の勾配に基づいて効率を計算することによって）測定でき、数値または百分率として表すことができる。本明細書で使用する場合、増幅効率／プライマー効率に関する用語「同等の効率」は、正確に同じ効率（例えば、同じ百分率効率）を指し、効率が最大５％の差も指す。「同等の効率のプライマー」は、同等の効率を達成するための、反応におけるプライマー配列および／または濃度の調整を包含する。効率が同等のプライマーは、プライマー効率による結果の偏りを有利に回避する。

【0052】

本明細書で使用する場合、ゲノム遺伝子座に関して「血漿ＤＮＡにおいて同等に表される」という用語は、血漿ＤＮＡにおいて同じコピー数を有するゲノム遺伝子座を指す。この用語は、正確に同じ表現（すなわち、正確なコピー数）を含み、表現で最大５％の違いも含む。別の遺伝子座と比較して特定の遺伝子座を指す「血漿ＤＮＡにおいて過小に表された」という用語は、この特定の遺伝子座が他の遺伝子座と比較して血漿ＤＮＡにおけるコピー数が少ないことを指す。この用語は、表現における５％を超える差を示す。

【0053】

コピー数は、例えば、上で詳述しているように、既知の方法で測定され得る。

【0054】

本発明の方法で使用するための短いおよび長い増幅産物を設計するとき、増幅された配列のＣＧ含有量を考慮に入れてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、各増幅産物のＣＧ含有量は５０％より小さい。

【0055】

血漿サンプル処理
本明細書で使用する場合、「全血」および「血液」という用語は、分画されておらず、細胞成分（赤血球、白血球、および血小板）ならびに流体成分の両方を含む血液サンプルを指す。

【0056】

「血漿」という用語は、全血サンプルが血球を除去するための分離プロセスにかけられた後に残る液体を指す。

【0057】

いくつかの実施形態によれば、本発明の方法を使用して分析される血漿サンプルはヒト対象に由来する。いくつかの実施形態によれば、血漿サンプルは、特定のタイプの癌などの悪性疾患を有する対象、または１つ以上のタイプの癌などの悪性疾患を有することが疑われる対象に由来する。追加の実施形態によれば、血漿サンプルは健康な対象に由来する。本明細書で使用する「健康な対象」という用語は、特定のタイプの癌などの悪性疾患を有すると診断されていない対象、および／または癌を有する疑いのない対象、および／または癌を罹患しにくい対象を指す。

【0058】

血漿サンプルは、任意の分離方法を使用して全血から分離されたサンプルであってもよい。例示的な手順については、以下の実施例の節に記載している。血漿サンプルは、新たに単離されたサンプル、または分析前に一定期間保存されたサンプルであってもよい。

【0059】

「からのＤＮＡ」、「から得られたＤＮＡ」などの用語は、血漿サンプルから単離された（例えば、当該技術分野で既知の方法を使用して血漿から抽出された）ＤＮＡ、およびそのままの血漿サンプル、すなわち、ＤＮＡを含む血漿サンプルを指す。

【0060】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、血漿サンプルを提供することを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、血漿サンプルからのＤＮＡを提供することを含む。

【0061】

増幅産物の生成
本明細書に開示している方法は、いくつかの実施形態によれば、第１のプライマー対を使用した第１のゲノム遺伝子座からの７０～１５０塩基対アンプリコンおよび第２のプライマー対を使用した第２のゲノム遺伝子座からの３５０～６５０塩基対アンプリコンを共増幅することを含む。

【0062】

本発明の第１および第２の増幅産物は、各増幅産物を特異的に生成するために当該技術分野で既知である設計された逆方向および順方向のプライマーの対を使用する増幅によって生成される。

【0063】

第１の（短い）増幅産物の長さは通常、７０～１５０塩基対、例えば、８０～１５０塩基対、１００～１５０塩基対、１００～１３０塩基対である。各可能性について、本発明の別個の実施形態により示す。

【0064】

第２の（長い）増幅産物の長さは、少なくとも３５０塩基対、通常、３５０～７５０塩基対、３５０～６５０塩基対、３５０～６００塩基対、３５０～５５０塩基対または４００～５００塩基対である。各可能性について、本発明の別個の実施形態により示す。

【0065】

いくつかの実施形態では、第１の増幅産物は、配列番号１に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅産物は、配列番号１に示される配列からなる。いくつかの実施形態では、第１の増幅産物は、配列番号１０に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の増幅産物は、配列番号１０に示される配列からなる。

【0066】

いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号２に示される配列からなる。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号７に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号７に示される配列からなる。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号８に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号８に示される配列からなる。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号９に示される配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の増幅産物は、配列番号９に示される配列からなる。

【0067】

いくつかの実施形態では、第１および第２の増幅産物は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される配列を含む。さらなる実施形態では、第１および第２の増幅産物は、それぞれ配列番号１および配列番号２に示される配列からなる。

【0068】

いくつかの実施形態では、第１の増幅産物を増幅するプライマー対は配列番号３（順方向）および配列番号４（逆方向）である。

【0069】

いくつかの実施形態では、第２の増幅産物を増幅するプライマー対は配列番号５（順方向）および配列番号６（逆方向）である。

【0070】

高レベルの白血球ＤＮＡで汚染された血漿サンプルでは、サンプル中に短いＤＮＡ断片および長いＤＮＡ断片の両方が見つかり、短い増幅産物および長い増幅産物の両方の効率的な増幅が得られる。血液の細胞画分から十分に分離された血漿サンプルには、主に（または唯一）短い無細胞ＤＮＡ断片が存在する。そのようなサンプルでは、短い増幅産物が長い増幅産物と比較してより高い効率で増幅される。血漿サンプルの分離が良好になればなるほど、長い増幅産物と比較して短い増幅産物の増幅が良好になることが、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲの後の長いアンプリコンのＣｑと短いアンプリコンのＣｑの間のデルタＣｑ値（Ｃｑ（長い）－Ｃｑ（短い））の増加に反映される。

【0071】

本明細書で使用する「ゲノム遺伝子座」または「遺伝子座」という用語は交換可能であり、染色体上の特定の位置にあるＤＮＡ配列を指す。特定の位置は、分子の位置、すなわち、染色体上の開始および終了塩基対の数によって識別されてもよい。所与のゲノム位置にあるＤＮＡ配列の変異体は対立遺伝子と呼ばれる。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体上の同一部位に位置する。遺伝子座には、遺伝子配列および他の遺伝的要素（例えば、遺伝子間配列）が含まれる。

【0072】

本明細書中で使用する場合、「増幅」とは、目的の１つ以上の核酸配列のコピー数の増加をいう。増幅は通常、当該技術分野で知られているＤＮＡテンプレート、ポリメラーゼ（通常はＴａｑポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ、プライマー、およびプローブ（必要に応じて）を補充した適切なバッファーを含んでもよいＰＣＲ反応混合物の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる。

【0073】

本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体のいずれかの長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、通常は長さが１００塩基までのヌクレオチドのポリマー形態を含むように本明細書で使用される。

【0074】

「増幅産物」および「アンプリコン」という用語は交換可能に使用され、増幅反応で生成および蓄積される特定の標的配列の核酸分子を集合的に指す。この用語は一般に、所与の増幅プライマーのセットを使用してＰＣＲによって生成される核酸分子を指す。

【0075】

本明細書で使用する場合、「プライマー」は、標的配列をアニール（ハイブリダイズ）し得、それにより適切な条件下でＤＮＡ合成の開始点として機能し得る二本鎖領域を生成し得るオリゴヌクレオチドを定める。「プライマー対」という用語は、本明細書では、複数のタイプの増幅プロセスの１つ、好ましくはＰＣＲによって、選択された核酸配列を増幅する際に一緒に使用されるように選択されるオリゴヌクレオチドの対を指す。当該技術分野で一般に知られているように、選択された条件下で相補的配列に結合するようにプライマーを設計してもよい。

【0076】

プライマーは、特定のアッセイ形式および特定のニーズに応じて、任意の適切な長さのものであってもよい。いくつかの実施形態では、プライマーは、少なくとも長さ１５ヌクレオチド、好ましくは、長さ１９～２５ヌクレオチドを含んでもよい。選択された核酸増幅システムに特に適するようにプライマーを適合させてもよい。当該技術分野で一般に知られているように、オリゴヌクレオチドプライマーを、それらの標的配列とのそのハイブリダイゼーションの融解点を考慮に入れることによって設計してもよい。

【0077】

本明細書に開示している方法は、同じ反応混合物中の複数の標的配列（第１および第２の増幅産物）の同時増幅、多重増幅または共増幅として知られるプロセスを含む。このプロセスでは、２つのプライマー対を同時に使用する必要がある。当該技術分野で知られているように、増幅中に同じアニール温度で機能し得るようにプライマーを設計してもよい。いくつかの実施形態では、類似の融解温度（Ｔｍ）を有するプライマーが、本明細書で開示している方法で使用される。約３～５℃のＴｍ変動は、プールで使用されるプライマーに許容可能であると見なされる。

【0078】

いくつかの実施形態によれば、ゲノム遺伝子座の増幅は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）としても知られているリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して実行され、増幅産物の同時増幅および検出が行われる。

【0079】

いくつかの実施形態では、ＲＴ－ＰＣＲにおける増幅産物の検出は、ポリヌクレオチドプローブ、通常は、蛍光標識されたポリヌクレオチドプローブを使用して達成されてもよい。

【0080】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドプローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」は交換可能であり、目的の遺伝子座の核酸配列内の、例えば、本明細書に記載している第１（短い）および第２の（長い）ゲノム遺伝子座内の特定の部分配列に相補的である標識化ポリヌクレオチドを指す。一部の実施形態では、検出は、組み合わされたレポーター分子およびクエンチャー分子（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）に基づくＴａｑＭａｎアッセイを使用することによって達成される。そのようなアッセイにおいて、ポリヌクレオチドプローブは、それらの５´末端に結合された蛍光部分（フルオロフォア）および３´末端に結合されたクエンチャーを有する。ＰＣＲ増幅中、ポリヌクレオチドプローブはテンプレート上の標的配列に選択的にハイブリダイズし、ポリメラーゼがテンプレートを複製するときに、ポリメラーゼの５´－ヌクレアーゼ活性によりポリヌクレオチドプローブも切断する。ポリヌクレオチドプローブが無傷であるとき、クエンチャーと蛍光部分が近接しているために、通常、バックグラウンドの蛍光レベルが低くなる。ポリヌクレオチドプローブが切断されるとき、クエンチャーは蛍光部分から分離されて、蛍光強度が増加する。蛍光信号は、増幅産物の量と相関し、すなわち、その信号は増幅産物が蓄積するにつれて増加する。

【0081】

本明細書で使用する場合、「選択的にハイブリダイズする」（および「選択的ハイブリダイゼーション」、「特異的にハイブリダイズする」、および「特異的ハイブリダイゼーション」）は、ストリンジェントな条件下で特定の相補的ヌクレオチド配列に対して優先的に核酸分子（プライマーまたはプローブなど）を結合、二重化、またはハイブリダイズさせることを指す。「ストリンジェントな条件」という用語は、核酸分子が、その標的配列に対して優先的に、かつ他の非標的配列より少ない程度でハイブリダイズし、または他の非標的配列には全くハイブリダイズしない条件を指す。核酸ハイブリダイゼーションの文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は配列依存的であり、当該技術分野で公知であるように、異なる条件下では異なる。

【0082】

ポリヌクレオチドプローブは長さが異なってもよい。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは１５～３０塩基を含んでもよい。追加の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは２５～３０塩基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、２０～３０塩基、例えば、２０基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基を含んでもよい。各可能性について、本発明の別個の実施形態により示す。

【0083】

テンプレートのどちらかの鎖に結合するようにポリヌクレオチドプローブを設計してもよい。追加の考慮事項には、プライマーのプローブと互換性のあるポリヌクレオチドのプローブのＴｍが含まれる。プライマーおよびプローブを設計するためにコンピュータソフトウェアを使用してもよい。

【0084】

上記のように、本明細書に開示している方法は、同じ反応混合物中の複数の標的配列の同時増幅を含む。並行して増幅される複数の標的配列を区別するために、異なる蛍光色で標識されたポリヌクレオチドプローブを使用してもよい。

【0085】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、当該技術分野で知られているフルオロフォア／クエンチャー対を形成し、例えば、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ－ＢＨＱ１、ヤキマイエロー－ＢＨＱ１、ＡＴＴＯ５５０－ＢＨＱ２およびＲＯＸ－ＢＨＱ２を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、色素の組み合わせは、選択したＲＴ－ＰＣＲサーモサイクラーに適合してもよい。

【0087】

いくつかの実施形態では、蛍光は、サイクル数の関数としてプローブからの蛍光信号の変化を示す増幅プロットを提供する各ＰＣＲサイクル中に監視されてもよい。

【0088】

ＲＴ－ＰＣＲの文脈においては、次の用語が使用される。
「定量化サイクル」（「Ｃｑ」）は、ソフトウェアによって自動的にまたはユーザが手動で設定した、閾値蛍光を超えて蛍光が増加するサイクル数を指す。いくつかの実施形態では、閾値蛍光は、すべてのアンプリコンについて一定であってもよく、増幅および検出を実行する前に、事前に設定されてもよい。他の実施形態では、閾値蛍光は、増幅サイクル中にこのアンプリコンについて検出された最大蛍光レベルに基づいて、実行後の各アンプリコンについて別々に定義されてもよい。いくつかの実施形態では、閾値蛍光は、ベースライン蛍光を超えるおよび／またはバックグラウンドノイズを超える、ならびに増幅プロットの指数増殖期内値であってもよい。「ベースライン」は、蛍光の変化がほとんどない、またはまったくないＰＣＲの初期サイクルを指す。

【0089】

コンピュータソフトウェアを使用して、増幅プロットを分析し、ベースライン、閾値およびＣｑを判定してもよい。

【0090】

細胞成分から十分に分離された、細胞ＤＮＡがないまたは細胞ＤＮＡの残量がある血漿成分において、長いアンプリコンを増幅するためのテンプレートＤＮＡは実質的に存在しない。第１および第２のプライマー対を使用したＰＣＲの後、短いアンプリコンは高効率で増幅されるが、長いアンプリコンについては存在する場合には、かなり少量の増幅産物が形成される。増幅プロットは、短いアンプリコン（比較的少数の増幅サイクル後に増幅産物が検出される）についてのＣｑ値が低く、長いアンプリコン（比較的多数の増幅サイクル後に増幅産物が検出される）についてのＣｑ値が高い。

【0091】

細胞ゲノムＤＮＡで汚染された血漿サンプルでは、汚染度が高いほど、長いアンプリコンのＣｑ値は低くなる。

【0092】

短いアンプリコンのＣｑと長いアンプリコンのＣｑの差は血漿サンプルの分離の品質を示す。

【0093】

分離の効率の判定
血漿分離の効率は、リアルタイムＰＣＲ後の短い増幅産物と長い増幅産物の間のＣｑ値の差などの信号強度の差に基づいて判定される。

【0094】

本明細書で使用する「信号強度」という用語は、標的配列の最初のコピーの量に対応する、配列特異的増幅産物の量を反映する尺度を指す。しかしながら、信号強度は、増幅産物／標的配列の実際の量を示さない場合があり、増幅産物／標的配列の絶対量の計算を含まない場合がある。したがって、いくつかの実施形態では、増幅産物の信号強度を計算するために、実際のＤＮＡ量自体を計算する必要がないため、標準曲線または参照ＤＮＡを使用しない。

【0095】

いくつかの実施形態では、増幅産物の増幅および検出は、特定の増幅産物の信号強度がこの増幅産物について計算されたＣｑによって表されるＲＴ－ＰＣＲによって実行される。

【0096】

いくつかの実施形態では、増幅がないか、または増幅がごくわずかである場合、Ｃｑは「無限大」と判定される。一部の実施形態では、そのような場合、デルタＣｑの数値は１４に設定される。

【0097】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡサンプル中の第１および第２の増幅産物の信号強度間の差を計算することは、各遺伝子座のＣｑを判定すること、およびＣｑ値間の差（ΔＣｑ）を計算することを含む。いくつかの実施形態では、２つの増幅産物の信号強度間の差を計算することは、Ｃｑ（長い）－Ｃｑ（短い）を計算することによって実行される。

【0098】

例えば、第１の増幅産物の第１の（短い）Ｃｑが「２５」であり、第２の（長い）増幅産物の第２のＣｑが「３０」であると仮定すると、
Ｃｑ（長い）－Ｃｑ（短い）は「５」である。

【0099】

いくつかの実施形態では、増幅産物のＣｑ間の差を計算するためにコンピュータソフトウェアが使用される。

【0100】

いくつかの実施形態では、計算されたデルタＣｑは、計算されたデルタＣｑが所定の閾値デルタＣｑを超える場合に、試験された血漿サンプルが全血から十分に分離されていることを示す。

【0101】

「閾値デルタＣｑ」は、十分に分離された血漿サンプルと、不十分に分離されたまたは分離されていない血漿サンプルとを区別するデルタＣｑを指す。閾値は通常、無細胞ＤＮＡの分析を妨害しない、特定の量または百分率を下回る白血球ＤＮＡの汚染を反映するように設定される。上記のように、無細胞ＤＮＡの分析を含む様々な診断用途では、様々なレベルの血漿の純度が必要になる場合がある（すなわち、許容される様々なレベルの白血球ＤＮＡ汚染によって特徴付けられる場合がある）。例えば、いくつかの実施形態では、分離された血漿サンプルは、５０％未満の汚染白血球ＤＮＡ、４０％未満の汚染白血球ＤＮＡ、３０％未満の汚染白血球ＤＮＡ、２０％未満の汚染白血球ＤＮＡ、１０％未満の汚染白血球ＤＮＡ、５％未満の汚染白血球ＤＮＡ、１％未満の汚染白血球ＤＮＡを含む血漿サンプルである。各可能性について、本発明の別個の実施形態により示す。

【0102】

超えると血漿サンプルが分離されていると判定される閾値ΔＣｑは、特定の診断アッセイの要件に基づいて設定されてもよい。

【0103】

例えば、いくつかの実施形態では、閾値ΔＣｑは１サイクルであり、サンプル中の汚染白血球ＤＮＡと無細胞ＤＮＡとの間の５０：５０の比を反映している。

【0104】

一部の実施形態では、閾値ΔＣｑは約１サイクルである。いくつかの実施形態では、閾値ΔＣｑは少なくとも１サイクルである。追加の実施形態では、閾値ΔＣｑは少なくとも２サイクルである。さらに追加の実施形態では、閾値ΔＣｑは少なくとも３サイクルである。さらに追加の実施形態では、閾値ΔＣｑは少なくとも４サイクルである。

【0105】

いくつかの実施形態では、閾値ΔＣｑを判定することは、（ｉ）様々な量のバフィーコートまたは全血ＤＮＡの血漿サンプルをスパイクして、様々な程度の白血球ＤＮＡ汚染を有する一連の血漿サンプルを得ること、（ｉｉ）各サンプルの短いアンプリコンおよび各サンプルの長いアンプリコンの対に対してリアルタイムＰＣＲを実行し、各サンプルの各アンプリコンのＣｑを判定すること、（ｉｉｉ）各サンプル（白血球ＤＮＡ汚染の各程度）についてのΔＣｑを計算し、特定のアッセイ／用途が許可する最大汚染にしたがって閾値を判定することを含む。

【0106】

一部の実施形態では、本発明の方法は、閾値デルタＣｑを提供することを含む。

【0107】

いくつかの実施形態では、閾値は統計的に有意な値である。多くの場合、統計的有意性は、２つ以上の母集団を比較し、信頼区間（ＣＩ）および／またはｐ値を判定することによって判定される。一部の実施形態では、統計的に有意な値は、約９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および９９．９９％の信頼区間（ＣＩ）を指し、好ましいｐ値は、約０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１未満、または０．０００１未満である。各可能性について、本発明の別個の実施形態により示す。いくつかの実施形態によれば、閾値のｐ値は最大で０．０５である。

【0108】

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、測定可能な値を指す場合、指定値からの＋／－１０％、より好ましくは＋／－５％、さらにより好ましくは＋／－１％、さらにより好ましくは＋／－０．１％の変動を含むことを意味する。

【0109】

キットおよびシステム
いくつかの実施形態では、本発明の方法により、全血からの血漿分離の効率を判定するためのキットを本明細書で提供する。

【0110】

追加の実施形態では、本発明の方法により、全血からの血漿分離の効率を判定するためのシステムを本明細書で提供する。

【0111】

一部の実施形態では、キットは、第１のゲノム遺伝子座からの７０～１５０塩基対の第１の増幅産物および第２のゲノム遺伝子座からの少なくとも３５０塩基対の第２の増幅産物を増幅するための一対のプライマーと、第１および第２の増幅産物を検出するための手段と、本明細書に開示している方法により血漿分離効率の判定を実行するための取扱説明書と、を含む。一部の実施形態では、取扱説明書は、電子取扱説明書であってもよい。

【0112】

いくつかの実施形態では、取扱説明書は、超えると血漿サンプルが分離されていると判定される閾値デルタＣｑを提供してもよい。

【0113】

いくつかの実施形態では、取扱説明書は、本明細書に記載されている方法ステップを実行するための指示を含んでもよい。

【0114】

一部の実施形態では、取扱説明書は、デルタＣｑと分離との間の相関を指示するための指示を含んでもよい。

【0115】

いくつかの実施形態では、取扱説明書は、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータソフトウェアを使用して血漿分離の判定を実行するための指示を含んでもよく、コンピュータソフトウェアは、第１および第２の増幅産物の信号強度の差に基づいて血漿分離を判定するようにコンピュータプロセッサに指示する。

【0116】

いくつかの実施形態では、キットは、第１および第２の増幅産物の信号強度の差に基づいて血漿分離を判定するようにコンピュータプロセッサに指示するコンピュータソフトウェアを格納するコンピュータ可読媒体をさらに含んでもよい。

【0117】

いくつかの実施形態では、本発明のシステムは、（ｉ）第１のゲノム遺伝子座から７０～１５０塩基対の第１の増幅産物をＰＣＲによって生成するための第１のプライマー対、（ｉｉ）第２のゲノム遺伝子座から少なくとも３５０塩基対の第２の増幅産物をＰＣＲによって生成するための第２のプライマー対、（ｉｉｉ）第１および第２の増幅産物を検出して、各増幅産物の信号強度を判定するためのプローブ、ならびに（ｉｖ）第１および第２の増幅産物の信号強度の差に基づいて血漿分離を判定するようにコンピュータプロセッサに指示するコンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータソフトウェアを含む。

【0118】

いくつかの実施形態では、本発明のコンピュータソフトウェアは、第１および第２の増幅産物の各々についての信号強度を判定するステップと、信号強度間の差を計算するステップと、をコンピュータプロセッサに実行させる。いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアはさらに、計算された差を所定の閾値と比較し、比較に基づいて、血漿サンプルが分離されているかどうかを出力するようにコンピュータプロセッサに指示する。いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアは、ＣｑおよびデルタＣｑのうちの少なくとも１つを計算するようにコンピュータプロセッサに指示するコンピュータソフトウェアであってもよい。

【0119】

いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアは、リアルタイムＰＣＲ実行の入力パラメータまたは生データを受け取る。いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアは、リアルタイムＰＣＲ実行を分析して信号強度（Ｃｑｓ）および信号強度差（ΔＣｑ）を判定するようにコンピュータプロセッサに指示する。

【0120】

コンピュータソフトウェアは、非一時的なコンピュータ可読媒体に格納されたプロセッサ実行可能命令を含む。コンピュータソフトウェアはまた、格納されたデータを含んでもよい。コンピュータ可読媒体は、コンパクトディスク（ＣＤ）、磁気記憶装置、光学記憶装置、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、または任意の他の有形媒体などの有形コンピュータ可読媒体である。

【0121】

いくつかの実施形態では、システムは、第１および第２の増幅産物間の計算された信号強度差の閾値信号強度差との比較に基づいて血漿分離を判定するように構成されたプロセッサを含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、システムは、リアルタイムＰＣＲ機械などの、増幅産物の生成を実行する機械を含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、キットまたはシステムは、第１および第２の増幅産物を検出するための、第１および第２の増幅産物内の部分配列に相補的な蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、キットまたはシステムは、本明細書に記載されるように、各々がゲノムのフラグメントを選択的に増幅して第１および第２の増幅産物を生成するように設計された第１および第２のプライマー対を含む。

【0125】

いくつかの実施形態では、第１のプライマー対は、配列番号３（順方向）および配列番号４（逆方向）である。

【0126】

いくつかの実施形態では、第２のプライマー対は、配列番号５（順方向）および配列番号６（逆方向）である。

【0127】

いくつかの実施形態では、キットまたはシステムは、ＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチド混合物などの増幅産物の増幅および検出に必要な少なくとも１つの追加の成分をさらに含んでもよい。

【0128】

いくつかの実施形態では、キットまたはシステムは、アッセイを実行するための適切な反応バッファーおよび書面によるプロトコルをさらに含んでもよい。書面によるプロトコルは、ＰＣＲサイクリングパラメーター、Ｃｑの判定および分析、ならびにデルタＣｑ閾値を含むが、これらに限定されない、本明細書に開示のステップのいずれかを実行するための指示を含んでもよい。

【0129】

本明細書に記載のコンピュータ関連の方法、ステップ、プロセスは、実行されたときに、指示を実行するように構成されているか、またはそれをコンピュータプロセッサもしくはコンピュータに指示する不揮発性または非一時的コンピュータ可読命令に格納されたソフトウェアを使用して実施されることが理解される。

【0130】

本発明の特定の実施形態をより完全に例示するために以下の実施例を提示している。しかしながら、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示している原理の多くの変形および修正を容易に考案することができる。

【実施例】

【0131】

実施例１－血漿サンプルの試験
次の短いアンプリコンおよび長いアンプリコンの対は、血漿サンプル、白血球で汚染された血漿サンプル、および全血サンプルからのＤＮＡを試験するために設計された。
「短い」（１２６塩基対）（配列番号１）：
ＧＴＣＴＴＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＡＧＴＴＡＣＡＧＧＧＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＴＧＧＧＴＣＴＡＡＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣＡＡＡＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＴＣＴＴＡＡＡＣＡＣＴＡＡＣＡＧＣＡＡＴＴＣＡＡＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣ ＡＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＴＡＴ

【0132】

短いアンプリコンは、染色体１の１５５５６５４６７～１５５５６５６０１の位置に対応する（ｈｇ１８による）。短いアンプリコンは、以下のプライマーを使用した増幅用に設計された。
順方向（配列番号３）：ＧＴＣＴＴＴＧＴＧＡＣＡＴＴＧＡＧＴＴＡＣＡＧ
逆方向（配列番号４）：ＡＴＡＴＴＧＧＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣ
「長い」（４５０塩基対）（配列番号２）：
ＧＴＣＡＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＴＧＣＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＧＧＣＴＡＡＡＴＴＴＴＴＧＧＣＡＴＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＴＧＣＣＡＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＡＡＣＡＡＡＴＡＡＴＴＣＡＣＣＴＡＡＧＧＡＡＴＡＧＴＴＣＡＣＴＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＡＣＴＣＡＴＴＧＧＴＴＧＴＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＧＡＧＧＡＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＧＧＴＧＴＡＧＡＴＣＡＡＡＧＡＡＡＡＣＧＧＴＧＡＴＴＣＧＧＴＧＡＴＴＧＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡＣＣＴＡＡＴＧＣＡＴＣＡＴＴＧＴＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＴＡＡＡＧＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＣＡＧＣＡＡＴＣＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＴＴＴＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡＧＴＣＡＴＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＣＡ

【0133】

長いアンプリコンは、染色体７の１２１３８０８１０～１２１３８１２５９の位置に対応する（ｈｇ１８による）。長いアンプリコンは、以下のプライマーを使用した増幅用に設計された。
順方向（配列番号５）：ＧＴＣＡＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＣＡＣＴＴＴＧＣ
逆方向（配列番号６）：ＴＧＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＧ

【0134】

血液サンプルは人間対象から収集され、血漿もしくは血漿＋バフィーコート（白血球および血小板）を得るために処理されるか、または未処理（全血）に保たれた。

【0135】

血漿＋バフィーコートを得るために、血液チューブ（抗凝固剤を含む）を１５００ｇで１０分間遠心分離して、血液成分を分離した。遠心分離後、血漿層をバフィーコート層（白血球および血小板）とともに収集し、新しいチューブに移した。

【0136】

血漿サンプルを得るために、血液チューブ（抗凝固剤を含む）を１５００ｇで１０分間遠心分離して、血液成分を分離した。遠心分離後、血漿層を（バフィーコートに接近させることなく）収集し、新しいチューブに移した。血漿を再度遠心分離し（１５００ｇで１０分間）、純粋な血漿を新しいチューブに移した。

【0137】

ＱＩＡａｍｐ（登録商標）循環核酸キットを使用してサンプルからＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡをリアルタイム（ＲＴ）－ＰＣＲにかけ、各サンプルからの上記の短いアンプリコンおよび長いアンプリコンを増幅した（共増幅）。

【0138】

増幅反応（総量２５マイクロリットル）には、２マイクロリットルの抽出ＤＮＡ（ＤＮＡ濃度は増幅前に測定されなかった）、０．０５～０．５μＭのプライマー、ｄＮＴＰ、および反応バッファーが含まれていた。増幅中の増幅産物の検出を可能にするために、各アンプリコンについての蛍光標識されたポリヌクレオチドプローブ（それぞれ長いアンプリコンおよび短いアンプリコン用のＦＡＭおよびＪＯＥラベル）が反応に追加された。同等の効率を達成するために、各アンプリコンのプライマーおよびプローブ濃度を調整した。ＲＴ－ＰＣＲ反応は、ＡＢＩ ７５００ ＦａｓｔＤｘ装置で、ＰＣＲプログラム、すなわち、９５℃、１０分－＞４５Ｘ（９５℃、１５秒）－＞６０℃、１分を使用して実行した。

【0139】

増幅後、プローブからの蛍光信号の変化をサイクル数の関数として示す定量ＰＣＲプロットを分析して、各アンプリコンについての定量サイクル（Ｃｑ）を計算した。ΔＣｑは、長いアンプリコンのＣｑおよび短いアンプリコンのＣｑ間で計算された（Ｃｑ（長い）－Ｃｑ（短い））。

【0140】

図１Ａ～Ｃは、血漿（図１Ａ、ΔＣｑ＝３）からのＤＮＡサンプル、白血球で汚染された血漿（図１Ｂ、ΔＣｑ＝（－０．４））、および全血からのＤＮＡ（図１Ｃ、ΔＣｑ＝（－０．２））における短いおよび長いアンプリコン増幅産物の例示的な定量ＰＣＲプロットを示す。

【0141】

白血球からのＤＮＡ量が非常に少ない血漿サンプルでは、長いアンプリコンが低効率で増幅された。それは短いアンプリコンより約３～４サイクル遅れて上昇した。

【0142】

白血球で汚染された血漿のサンプルでは、また白血球ＤＮＡレベルが高い全血サンプルでは、長いアンプリコンおよび短いアンプリコンが同様の効率で増幅された。長いアンプリコンは、短いアンプリコンとほぼ同じサイクルで上昇した。

【0143】

前述の特定の実施形態についての説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするため、他の者が、現在の知識を適用することにより、過度の実験なしに、また一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の実施形態の様々な用途に容易に修正および／または適合させることができ、したがって、そのような適合および修正は、開示された実施形態の等価物の意味および範囲内で理解されるように意図されている。本明細書で使用している表現または用語については、説明を目的としたものであり、限定を目的としたものではないことを理解されたい。開示している様々な化学構造および機能を実行するための手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態をとることができる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【配列表】

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