知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2023-10-27
(45)【発行日】2023-11-07
(54)【発明の名称】ペンタペプチド化合物
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20231030BHJP
A23L 33/18 20160101ALI20231030BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20231030BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20231030BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20231030BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
A23L33/18
A61K38/08
A61P43/00 111
A61P17/16
【請求項の数】
6
(21)【出願番号】P 2019175810
(22)【出願日】2019-09-26
(65)【公開番号】P2021050184
(43)【公開日】2021-04-01
【審査請求日】2022-09-02
(73)【特許権者】
【識別番号】000177508
【氏名又は名称】三和酒類株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100123984
【弁理士】
【氏名又は名称】須藤 晃伸
(74)【代理人】
【識別番号】100102314
【弁理士】
【氏名又は名称】須藤 阿佐子
(74)【代理人】
【識別番号】100206689
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 恵理子
(74)【代理人】
【識別番号】100159178
【弁理士】
【氏名又は名称】榛葉 貴宏
(72)【発明者】
【氏名】丸岡 生行
(72)【発明者】
【氏名】外薗 英樹
【審査官】松原 寛子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１６－１２８４０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００６－２７３８２２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－０８４５３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１９－０８５３８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－０７８０４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開昭６４－０１３００８（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ ７／０６
Ａ２３Ｌ ３３／１８
Ａ６１Ｋ ３８／０８
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｐ １７／１６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉの構造式を有するペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。【化1】
【請求項2】
ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列からなるペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項3】
アミノ酸配列を構成するアミノ酸がＬ体である、請求項２に記載のペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項4】
請求項１ないし３のいずれかに記載のペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ヒアルロン酸合成促進剤。
【請求項5】
ヒアルロン酸合成酵素の発現を促進する、請求項４に記載のヒアルロン酸合成促進剤。
【請求項6】
飲食品、サプリメント、または医薬品である、請求項４または５に記載のヒアルロン酸合成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、焼酎製造において副成する焼酎蒸溜残液から得られる、生物学的に活性で新規なペンタペプチド化合物に関する。本発明においてペンタペプチドとは、５アミノ酸残基がペプチド結合によって連結された化合物をいう。
【背景技術】
【0002】
焼酎を製造する際に副成する焼酎蒸溜残液については、大麦焼酎蒸溜残液から精製した特定の画分が有する脂肪肝抑制効果（特許文献１）、抗酸化作用（特許文献２）、血圧降下作用（特許文献３）等の種々の生理活性作用を有する画分が報告されている。また、黒糖焼酎蒸溜残液からは、特定の精製画分のチロシナーゼ阻害活性（特許文献４）が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【文献】特開２００１－１４５４７２号公報
【文献】特許第４６９４０９９号明細書
【文献】特許第４５８４６１１号明細書
【文献】特開２００４－２４８５９２号公報
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０１１）Ｖｏｌ．１８６，Ｎｏ．８，ｐ．４７６２－４７７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、有用な生理活性を有する画分が複数得られている大麦焼酎蒸溜残液から、今まで知られていない新規で有用な化合物を単離精製し、提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、上記課題を解決するために、大麦焼酎蒸溜残液からの既知の有用な画分や、新たな精製工程による画分を種々作成して研究を行った結果、大麦焼酎蒸溜残液に含まれる新規ペンタペプチド化合物を同定し、この化合物がヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ＨＡＳ２）の発現促進効果を有する物質であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0007】
本発明は、以下（１）～（３）のペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩に係るものである。
（１）
式Ｉの構造式を有するペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
（Ｉ）
（２）ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列からなるペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
（３）アミノ酸配列を構成するアミノ酸がＬ体である、上記（２）に記載のペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
（１）
式Ｉの構造式を有するペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化1】
（２）ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏで表されるアミノ酸配列からなるペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
（３）アミノ酸配列を構成するアミノ酸がＬ体である、上記（２）に記載のペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩。
【0008】
また、本発明は、以下（４）～（６）のヒアルロン酸合成促進剤に係るものである。
（４）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ヒアルロン酸合成促進剤。
（５）ヒアルロン酸合成酵素の発現を促進する、上記（４）に記載のヒアルロン酸合成促進剤。
（６）飲食品、サプリメント、または医薬品である、上記（４）または（５）に記載のヒアルロン酸合成促進剤。
（４）上記（１）ないし（３）のいずれかに記載のペンタペプチド化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする、ヒアルロン酸合成促進剤。
（５）ヒアルロン酸合成酵素の発現を促進する、上記（４）に記載のヒアルロン酸合成促進剤。
（６）飲食品、サプリメント、または医薬品である、上記（４）または（５）に記載のヒアルロン酸合成促進剤。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、大麦焼酎蒸溜残液から新規で有用なペンタペプチド化合物を提供することができ、このペンタペプチド化合物は、ヒト線維芽細胞におけるヒアルロン酸合成酵素遺伝子（ＨＡＳ２）の発現促進効果を有することから、ヒアルロン酸の合成促進により皮膚の保湿効果が向上し、また真皮中の水分保持力が増加することで、肌にハリを与え、シワの形成を防ぐことが期待される。
今後、美肌効果等をもたらす食べるスキンケアとしての飲食品、医薬品としての活用が期待される。
今後、美肌効果等をもたらす食べるスキンケアとしての飲食品、医薬品としての活用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】本発明のペンタペプチドの正常ヒト線維芽細胞におけるＨＡＳ２遺伝子発現促進効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明において、ペンタペプチド化合物には、本発明のペンタペプチド化合物が有するＨＡＳ２発現促進活性を失わない範囲で、その薬学的に許容される塩、または誘導体も含まれる。薬学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、硫酸塩、硝酸塩などの有機酸塩、フッ化水素酸塩、塩酸塩などのハロゲン化水素酸塩が例示される。誘導体としては、エステル化、アミド化、アシル化、カルボキシル化、ホルミル化、ホスホリル化、リン酸化、グリコシル化が例示される。
【0012】
本発明のペンタペプチド化合物は、大麦焼酎蒸溜残液から単離精製して製造することができる。また、麹菌の液体及び固体培養からも単離精製して製造することができ、さらに、固相合成法での鎖状ペプチド合成等の公知の方法で化学合成することもできる。
【0013】
大麦焼酎蒸溜残液を用いる場合には、大麦焼酎蒸溜残液を固液分離して液体分を得てから、該液体分を合成吸着剤に吸着させる。その吸着した成分のうち２０％エタノールで溶出後、４０％エタノール溶出液で溶出する画分から、本発明のペンタペプチド化合物を単離精製することができる。
【0014】
大麦焼酎蒸溜残液は、代表的には歩留まり６０乃至７０％の精白大麦を原料として大麦麹及び蒸麦を製造し、得られた大麦麹及び蒸麦中に含まれるでんぷんを該大麦麹の麹により糖化し、それらを酵母によるアルコール発酵に付して焼酎熟成もろみを得、得られた焼酎熟成もろみを減圧蒸溜または常圧蒸溜等の単式蒸溜装置を用いて蒸溜する際に蒸溜残渣として副生する大麦焼酎の蒸溜残液である。
【0015】
大麦焼酎の製造に用いる大麦麹は、通常の大麦焼酎製造において行われている製麹条件で製造すればよく、用いる麹菌株としては、一般的に大麦焼酎製造で使用する白麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）が好ましい。泡盛製造で使用する黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）などのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の菌株を用いることもできる。また大麦焼酎の製造に用いる酵母は、一般的に焼酎製造の際に使用する各種の焼酎醸造用酵母を使用することができる。
【0016】
大麦焼酎蒸溜残液から固液分離して液体分を得ることにより、原料大麦または大麦麹由来の水不溶性の発酵残渣等を除去して清澄液を得る。固液分離は、スクリュープレス方式やローラープレス方式の固液分離方法により行うことができる。次いで、その液体分を合成吸着剤を用いる吸着処理に付して吸着させる。合成吸着剤としては、芳香族系、芳香族系修飾型、あるいはメタクリル系の合成吸着剤を用いることができ、好適な例としては、ダウ・ケミカル社製のアンバーライトＦＰＸ６６、三菱化学社製のセパビーズＳＰ８５０、及び同三菱化学社製のダイヤイオンＨＰ２０等が挙げられる。
【0017】
その後、その合成吸着剤吸着画分を２０容量％エタノールと４０容量％エタノール溶出液により順次溶出させて、得られた溶出画分を有機溶媒抽出してから、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかける。ＨＰＬＣクロマトグラフの分子量５９８の画分をさらに精製するために、凍結乾燥させてから水に溶解させ、遠心分離後再び水で洗浄してからアセトニトリル溶液に溶解させて、再びＨＰＬＣにかけて精製することにより、本発明の分子量５９８のペンタペプチド化合物を単離精製することができる。
【0018】
本発明のペンタペプチド化合物は、皮膚の保湿効果の向上や、肌にハリを与えシワの形成を防ぐ美肌のための飲食品、サプリメント、医薬品として様々な形態で利用することができる。「飲食品」には、通常の飲食品の他、経腸栄養食品、栄養機能食品、機能性表示食品、特定保健用食品などが含まれる。また、「飲食品」および「医薬品」の対象はヒトに限定されるのもではなく、ペットや家畜のような哺乳動物用の医薬品および飼料も包含する。
【0019】
本発明のペンタペプチド化合物は、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤などの経口用組成物とすることができる。種々の剤型の経口用組成物を製造するための各種成分および製造法は、サプリメント、医薬品等の製造分野で公知な成分から適宜選択することができる。本実施形態の錠剤には、錠剤を形成するための各種の添加剤として、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、その他の栄養素等を添加することができる。
【0020】
経口用以外にも注射剤、点滴剤、外用剤、座薬剤等の非経口用投与剤としての各種製剤形態で使用できる。また、製剤中の本発明のペンタペプチド化合物の有効投与量は、治療もしくは予防すべき症状の程度、投与対象の状態（年齢、性別を含む）、剤型などによって異なる。ペンタペプチド化合物の１日投与量が約１０～１０００ｍｇ程度になる量とすればよい。
【0021】
以下の実施例に供する目的で大麦焼酎の製造を行った。原料としては、大麦（７０％精白）を用いた。
［大麦焼酎及び大麦焼酎蒸溜残液の製造］
大麦を４０％（ｗ／ｗ）吸水させ４０分間蒸した後、４０℃まで放冷し、大麦トンあたり１ｋｇの種麹（白麹菌）を接種し、３８℃、ＲＨ９５％で２４時間、３２℃、ＲＨ９２％で２０時間保持することにより、大麦麹を製造した。１次仕込みでは、この大麦麹（大麦として３トン）に、水３．６ｋＬ及び酵母として焼酎酵母の培養菌体１ｋｇ（湿重量）を加えて１次もろみを得、得られた１次もろみを５日間の発酵（１段目の発酵）に付した。次いで、２次仕込みでは、上記１段目の発酵を終えた１次もろみに、水１１．４ｋＬと蒸麦（大麦として７トン）を加えて１１日間の発酵（２段目の発酵）に付した。発酵温度は１次仕込み、２次仕込みとも２５℃とした。上記２段目の発酵を終えた２次もろみを常法により単式蒸溜に付し、大麦焼酎１０ｋＬと大麦焼酎蒸溜残液１５ｋＬを得た。該大麦焼酎蒸溜残液を以下の実施例に用いた。
以下に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
［大麦焼酎及び大麦焼酎蒸溜残液の製造］
大麦を４０％（ｗ／ｗ）吸水させ４０分間蒸した後、４０℃まで放冷し、大麦トンあたり１ｋｇの種麹（白麹菌）を接種し、３８℃、ＲＨ９５％で２４時間、３２℃、ＲＨ９２％で２０時間保持することにより、大麦麹を製造した。１次仕込みでは、この大麦麹（大麦として３トン）に、水３．６ｋＬ及び酵母として焼酎酵母の培養菌体１ｋｇ（湿重量）を加えて１次もろみを得、得られた１次もろみを５日間の発酵（１段目の発酵）に付した。次いで、２次仕込みでは、上記１段目の発酵を終えた１次もろみに、水１１．４ｋＬと蒸麦（大麦として７トン）を加えて１１日間の発酵（２段目の発酵）に付した。発酵温度は１次仕込み、２次仕込みとも２５℃とした。上記２段目の発酵を終えた２次もろみを常法により単式蒸溜に付し、大麦焼酎１０ｋＬと大麦焼酎蒸溜残液１５ｋＬを得た。該大麦焼酎蒸溜残液を以下の実施例に用いた。
以下に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例1】
【0022】
大麦焼酎製造の蒸溜工程で得られた前記大麦焼酎蒸溜残液を８０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎの条件で遠心分離して大麦焼酎蒸溜残液の液体分を得、得られた液体分２．５Ｌを三菱化学社製の合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０を充填したカラム（樹脂容量１Ｌ）に接触させ、当該カラムに吸着する合成吸着剤吸着画分を得た。さらに。この合成吸着剤吸着画分を吸着したカラムに脱イオン水６．２５Ｌを接触させて得られた溶出液を除去後、該カラムに２０（ｖ／ｖ）％ｎエタノール溶液２．５Ｌ、４０(ｖ／ｖ)％のエタノール溶液２．５Ｌを順次接触させることにより、溶出液をそれぞれ２．５Ｌ分取した。
【0023】
この溶出液を有機溶媒抽出するために、溶出液２０ｇをクロロホルム：メタノール＝８０：２０の溶媒１００ｍＬに混和し、ろ紙濾過した。残存した不溶物に同溶媒を５０ｍＬ混和し、再度抽出後ろ紙濾過してから、ろ液をエバポレーターで減圧乾燥させた。
減圧乾燥させた有機溶媒抽出サンプルを０．１ｇ／ｍＬとなるように脱イオン水に溶解し、３．５ｍＬを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ ４μｍ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰ ８０Ａカラム（２１．２×２５０ｍｍ）を用いる大容量ＨＰＬＣにかけた。溶媒Ａに０．０５％ＴＦＡ水溶液、溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液を用いた。分離条件は、流速は１０ｍＬ／ｍｉｎ、溶出は溶媒Ａ：溶媒Ｂ＝８５：１５の無勾配とし、検出波長は２１０ｎｍとした。
減圧乾燥させた有機溶媒抽出サンプルを０．１ｇ／ｍＬとなるように脱イオン水に溶解し、３．５ｍＬを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ ４μｍ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰ ８０Ａカラム（２１．２×２５０ｍｍ）を用いる大容量ＨＰＬＣにかけた。溶媒Ａに０．０５％ＴＦＡ水溶液、溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液を用いた。分離条件は、流速は１０ｍＬ／ｍｉｎ、溶出は溶媒Ａ：溶媒Ｂ＝８５：１５の無勾配とし、検出波長は２１０ｎｍとした。
【0024】
得られたＨＰＬＣクロマトグラフの分子量５９８付近の画分を分取して、減圧濃縮、凍結乾燥させてから、再度凍結乾燥サンプルを０．１ｇ／ｍＬとなるように脱イオン水に溶解させ、２００μＬを大容量ＨＰＬＣにかけた。カラムは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ ４ μｍ Ｈｙｄｒｏ－ＲＰ ８０Ａカラム（２１．２×２５０ｍｍ）を用いた。溶媒Ａに０．０５％ＴＦＡ水溶液、溶媒Ｂに０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液を用い、流速は１０ｍＬ／ｍｉｎとした。溶出は溶媒Ａから溶媒Ｂへ直接的濃度勾配で、１５分間で溶媒Ｂの濃度が２０％から４０％になるように行った。検出波長は２１０ｎｍとした。
【0025】
１回目の大容量ＨＰＬＣの分子量５９８のピーク付近を、２回目の大容量ＨＰＬＣによりメインピークを分画した結果、１ピークまで精製することができ、白色のサンプルを得た。このサンプルを液体クロマトグラフ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）で分析したところ、分子量が５９８であったため、この精製サンプルについて、核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）、液体クロマトグラフ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）及びアミノ酸分析を行った。
ＬＣ／ＭＳ分析
ＨＰＬＣ装置は、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いた。質量分析装置は、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓ型（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いた。その結果、推定分子式は、Ｃ２９Ｈ３８Ｎ６Ｏ８であることがわかった。
アミノ酸分析
ＨＰＬＣ装置は、Ｎｅｘｅｒａ（島津製作所製）、検出器は、蛍光検出器ＲＦ－２０Ａｘａ (島津製作所製)を用いた。酸加水分解処理を行い、構成アミノ酸を調べた結果、プロリン：グルタミン酸：フェニルアラニン＝２：２：１の比率で検出された
ＮＭＲ分析
１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲはＡｖａｎｃｅ ５００型（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ社製）を使用し、重ＤＭＳＯに溶解して測定した。内部標準として、トリメチルシランを使用した。推定分子式とアミノ酸分析の情報を組み合わせて、目的の成分はピログルタミン酸、グルタミン、プロリン２分子、フェニルアラニンが脱水縮合により結合した化合物であると推定された。その結果、ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏの順で結合していることが分かった。（配列番号１：Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ）
ＮＭＲ分析結果を表１に示す。
ＬＣ／ＭＳ分析
ＨＰＬＣ装置は、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いた。質量分析装置は、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓ型（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いた。その結果、推定分子式は、Ｃ２９Ｈ３８Ｎ６Ｏ８であることがわかった。
アミノ酸分析
ＨＰＬＣ装置は、Ｎｅｘｅｒａ（島津製作所製）、検出器は、蛍光検出器ＲＦ－２０Ａｘａ (島津製作所製)を用いた。酸加水分解処理を行い、構成アミノ酸を調べた結果、プロリン：グルタミン酸：フェニルアラニン＝２：２：１の比率で検出された
ＮＭＲ分析
１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ－ＮＭＲはＡｖａｎｃｅ ５００型（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ社製）を使用し、重ＤＭＳＯに溶解して測定した。内部標準として、トリメチルシランを使用した。推定分子式とアミノ酸分析の情報を組み合わせて、目的の成分はピログルタミン酸、グルタミン、プロリン２分子、フェニルアラニンが脱水縮合により結合した化合物であると推定された。その結果、ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏの順で結合していることが分かった。（配列番号１：Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏ）
ＮＭＲ分析結果を表１に示す。
【0026】
【表1】
【0027】
直接導入-質量分析（ＤＩ－ＭＳ）
質量分析装置は、ｒａｐｉｆｌｅＸ ＴＯＦ／ＴＯＦ型（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃ社製）を用いた。サンプルをマトリクス（ＣＨＣＡ：α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸) と混合し、分析に供した。目的成分中のアミノ酸の結合順序を同定するために、ＤＩ－ＭＳ解析を行ったところ、５９９．３[Ｍ＋Ｈ]＋と６２３．１[Ｍ＋Ｎａ]＋のマススペクトルが見られた。このうち、５９９．３イオンのＭＳ解析を行った結果、ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏの順で結合していることが分かった。
アミノ酸の絶対立体配置決定法（改良Ｍａｒｆｅｙ法）
アミノ酸の絶対立体配置を決定するために、サンプルの酸加水分解を行った。まず試料５ｍｇを秤量し、６Ｎ塩酸１ｍＬを加えて密封し、１０５℃で１６時間加熱した。その後、４００μＬを減圧乾固し、蒸溜水２００μＬに再溶解させた。標品も同様に処理した。酸加水分解サンプル５０μＬに１Ｍ ＮａＨＣＯ３ ２０μＬ及び１％Ｎα－（５－Ｆｌｕｏｒｏ－２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｌ－ｌｅｕｃｉｎａｍｉｄｅ（Ｌ－ＦＤＬＡ）アセトン溶液１００μＬを加え、３７℃で１時間加温した。加温後、１Ｎ塩酸２０μＬを加え、アセトニトリル３９０μＬで希釈して、ＨＰＬＣに供した。
分子量５９８を酸加水分解し、改良Ｍａｙｆｅｙ法でＨＰＬＣ分析した結果、構成しているアミノ酸は、全てＬ体であることが判明した。
以上の解析結果から、本発明の新規物質は、分子量が５９８、アミノ酸配列がＬ－ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌ－Ｇｌｎ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｈｅ―Ｌ－Ｐｒｏである、下記式（Ｉ）の新規なペンタペプチド化合物であることが判明した。
質量分析装置は、ｒａｐｉｆｌｅＸ ＴＯＦ／ＴＯＦ型（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃ社製）を用いた。サンプルをマトリクス（ＣＨＣＡ：α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸) と混合し、分析に供した。目的成分中のアミノ酸の結合順序を同定するために、ＤＩ－ＭＳ解析を行ったところ、５９９．３[Ｍ＋Ｈ]＋と６２３．１[Ｍ＋Ｎａ]＋のマススペクトルが見られた。このうち、５９９．３イオンのＭＳ解析を行った結果、ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｐｒｏの順で結合していることが分かった。
アミノ酸の絶対立体配置決定法（改良Ｍａｒｆｅｙ法）
アミノ酸の絶対立体配置を決定するために、サンプルの酸加水分解を行った。まず試料５ｍｇを秤量し、６Ｎ塩酸１ｍＬを加えて密封し、１０５℃で１６時間加熱した。その後、４００μＬを減圧乾固し、蒸溜水２００μＬに再溶解させた。標品も同様に処理した。酸加水分解サンプル５０μＬに１Ｍ ＮａＨＣＯ３ ２０μＬ及び１％Ｎα－（５－Ｆｌｕｏｒｏ－２，４－ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－Ｌ－ｌｅｕｃｉｎａｍｉｄｅ（Ｌ－ＦＤＬＡ）アセトン溶液１００μＬを加え、３７℃で１時間加温した。加温後、１Ｎ塩酸２０μＬを加え、アセトニトリル３９０μＬで希釈して、ＨＰＬＣに供した。
分子量５９８を酸加水分解し、改良Ｍａｙｆｅｙ法でＨＰＬＣ分析した結果、構成しているアミノ酸は、全てＬ体であることが判明した。
以上の解析結果から、本発明の新規物質は、分子量が５９８、アミノ酸配列がＬ－ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｌ－Ｇｌｎ－Ｌ－Ｐｒｏ－Ｌ－Ｐｈｅ―Ｌ－Ｐｒｏである、下記式（Ｉ）の新規なペンタペプチド化合物であることが判明した。
【0028】
【化1】
【実施例2】
【0029】
本発明のペンタペプチド化合物には、角層水分含量を高めること、また経皮水分蒸散量を下げる効果が確認されている。ヒアルロン酸は皮膚の水分保持や粘弾性に関与する細胞外マトリックス成分であり、加齢と共に減少あるいは変性する。そのため、ヒアルロン酸合成を促進することで、皮膚の水分含量の上昇および経皮水分蒸散量の低下が期待される。
そこで、正常ヒト線維芽細胞において、ヒアルロン酸合成を主に調整するヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ２）をターゲットとし、本発明のペンタペプチド化合物が及ぼす影響を調べた。
そこで、正常ヒト線維芽細胞において、ヒアルロン酸合成を主に調整するヒアルロン酸合成酵素（ＨＡＳ２）をターゲットとし、本発明のペンタペプチド化合物が及ぼす影響を調べた。
【0030】
正常ヒト線維芽細胞の培養
凍結保存した正常ヒト線維芽細胞（成人由来 クラボウ）を２×１０５cells/ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に混和し、５ｍｌシャーレに播種して、３７℃、５％ＣＯ２、４日間培養した。トリプシンで剥離後、１×１０５cells/ｍＬになるように無血清ＤＭＥＭ培地に混和し、０．５ｍＬを２４穴シャーレに播種して、３７℃、５％ＣＯ２、２４時間培養した。２４時間後、ＤＭＳＯに溶解したサンプルを加え、更に３７℃、５％ＣＯ２、２４時間培養した。
凍結保存した正常ヒト線維芽細胞（成人由来 クラボウ）を２×１０５cells/ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ培地に混和し、５ｍｌシャーレに播種して、３７℃、５％ＣＯ２、４日間培養した。トリプシンで剥離後、１×１０５cells/ｍＬになるように無血清ＤＭＥＭ培地に混和し、０．５ｍＬを２４穴シャーレに播種して、３７℃、５％ＣＯ２、２４時間培養した。２４時間後、ＤＭＳＯに溶解したサンプルを加え、更に３７℃、５％ＣＯ２、２４時間培養した。
【0031】
ＲＮＡ抽出
培養細胞からの全ＲＮＡ抽出は、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標） Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。操作手順は、メーカーのプロトコールに従った。抽出したＲＮＡは－８０℃で保存した。
逆転写反応
抽出したＲＮＡは、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）にて逆転写反応を行った。ＲＮＡ鋳型６０ｎｇにＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加して６μＬとした反応液を６５℃、５分で反応させ、その後、４℃で反応を停止した。次に、２μＬ ４×ＤＮ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを加え、３７℃、５分反応後、４℃で反応を停止した。最後に、２μＬ ５×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘＩＩを加え、３７℃ １５分、５０℃ ５分、９８℃ ５分で反応した。反応液は－２０℃で保存した。
培養細胞からの全ＲＮＡ抽出は、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標） Ｐｌｕｓ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。操作手順は、メーカーのプロトコールに従った。抽出したＲＮＡは－８０℃で保存した。
逆転写反応
抽出したＲＮＡは、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡）にて逆転写反応を行った。ＲＮＡ鋳型６０ｎｇにＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを添加して６μＬとした反応液を６５℃、５分で反応させ、その後、４℃で反応を停止した。次に、２μＬ ４×ＤＮ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを加え、３７℃、５分反応後、４℃で反応を停止した。最後に、２μＬ ５×ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘＩＩを加え、３７℃ １５分、５０℃ ５分、９８℃ ５分で反応した。反応液は－２０℃で保存した。
【0032】
定量ＲＴ－ＰＣＲ
上記逆転写反応により作成したｃＤＮＡを鋳型として用いた。ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）と各遺伝子に対する特異的なプライマー（表２）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６システムにより解析を行った。遺伝子の発現量はＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ法にて比較定量し、ＧＡＰＤＨを内部標準として相対値として算出した。反応は、９５℃、１０分の反応後、９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で１５秒を４５回繰り返す増幅反応を行い、最後に９５℃で３０秒、６０℃で２０秒、９５℃で２０秒の反応を行った。この時、ＤＮＡに結合するＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光をモニタリングすることによってｍＲＮＡ発現量の増幅を測定した。
上記逆転写反応により作成したｃＤＮＡを鋳型として用いた。ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）と各遺伝子に対する特異的なプライマー（表２）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６システムにより解析を行った。遺伝子の発現量はＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｔ法にて比較定量し、ＧＡＰＤＨを内部標準として相対値として算出した。反応は、９５℃、１０分の反応後、９５℃で１０秒、６０℃で１０秒、７２℃で１５秒を４５回繰り返す増幅反応を行い、最後に９５℃で３０秒、６０℃で２０秒、９５℃で２０秒の反応を行った。この時、ＤＮＡに結合するＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光をモニタリングすることによってｍＲＮＡ発現量の増幅を測定した。
【0033】
【表2】
統計解析には、Welchのt検定による有意差検定を行い、有意差水準はp＜０.０５とした。
【0034】
結果
正常ヒト線維芽細胞に対する本発明のペンタペプチド化合物の効果を図１に示す。その結果、本発明のペンタペプチド化合物を１００μｇ／ｍＬ添加した区は、コントロール区に比べてＨＡＳ２発現量が４倍以上にも顕著に増加することが示された。
正常ヒト線維芽細胞に対する本発明のペンタペプチド化合物の効果を図１に示す。その結果、本発明のペンタペプチド化合物を１００μｇ／ｍＬ添加した区は、コントロール区に比べてＨＡＳ２発現量が４倍以上にも顕著に増加することが示された。
【0035】
実施例２の試験によって、正常ヒト線維芽細胞において、本発明のペンタペプチド化合物がヒアルロン酸合成酵素ヒアルロン酸合成酵素ＨＡＳ２遺伝子の発現を顕著に促進する効果が確認された。
この本発明のペンタペプチド化合物のＨＡＳ２発現促進効果によれば、ヒアルロン酸の合成促進により、皮膚の保湿効果が向上し、真皮中の水分保持力が増加することで、肌にハリを与え、シワの形成を防ぐことが期待される。
今後、美肌効果等をもたらす食べるスキンケアとしての飲食品、医薬品としての活用が期待される。
この本発明のペンタペプチド化合物のＨＡＳ２発現促進効果によれば、ヒアルロン酸の合成促進により、皮膚の保湿効果が向上し、真皮中の水分保持力が増加することで、肌にハリを与え、シワの形成を防ぐことが期待される。
今後、美肌効果等をもたらす食べるスキンケアとしての飲食品、医薬品としての活用が期待される。
【産業上の利用可能性】
【0036】
本発明によれば、大麦焼酎蒸溜残液から新規で有用なペンタペプチド化合物を単離、提供することができる。この化合物は、ヒアルロン酸合成の促進作用を有するため、皮膚の保湿機能を改善して美肌効果をもたらすための飲食品、サプリメント、医薬品等の様々な用途、形態で利用できる可能性がある。
【図1】
【配列表】